BAB IPENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG

Pada muka bumi kita, terdapat banyak sekali macam dan golongan mikroorganisme yang hidup. Bahkan jumlah mikroorganisme sekarang melebihi jumlah manusia yang pernah hidup di bumi. Mikroba satu dengan yang lainnya memiliki perbedaan yang spesifik, bahkan sesama golongannya pun tidak sepenuhnya identik. Sama seperti manusia, mikroba pun tidak pernah ada yang identik satu sama lainnya. Karakterisasi mikroorganisme dapat di lakukan dengan beberapa metode seperti pengamatan makroskopik koloni, pewarnaan mikroba untuk mengetahui penampakan mikroskopik sel maupun membedakan golongan-golongan mikroorganisme, serta karakterisasi dengan serangkaian uji-uji biokimia yang mencerminkan aktivitas metabolisme enzimatik. Media pertumbuhan bakteri dapat dimana saja termasuk tidak terlepas dari makanan dan minuman yang kita konsumsi.

Bakteri ada yang bersifat komensal maupun patogen, banyak peranan bakteri dalam kehidupan manusia diantaranya pembusukan sisa-sisa mikroorganisme dan sisa pencernaan makanan, penghasil zat warna, antibiotik, dan peranannya dalam teknologi pangan. Bakteri mempunyai sifat patogen, yaitu bakteri dapat menginfeksi dan menyebabkan penyakit khususnya pada manusia, hal tersebut yang menyebabkan perlunya uji identifikasi terhadap makanan dan minuman khususnya air yang menjadi tempat pertumbuhan bakeri sekaligus sering dipakai untuk keperluan sehari-hari manusia.

Air untuk kepentingan industri farmasi sangat berbeda dengan air yang digunakan untuk keperluan rumah tangga sehari-hari atau untuk kepentingan industri-industri lainya. Fungsi air dalam industri farmasi merupakan salah satu aspek yang penting karena air merupakan bahan baku untuk pembuatan sediaan sirup, infus, injeksi atau untuk produksi, formulasi, pembersih dan kontrol kualitas. Tentunya amat sangat membahayakan hidup kita semua jika air digunakan tidak memenuhi standar atau tercemar.

B. TUJUAN PRAKTIKUM1. Untuk mengetahui metode yang digunakan dalam pemeriksaan kualitas air.2. Untuk mengetahui kualitas air dalam sampel air yang sudah disediakan dari

laboratorium mikrobiologi Fakultas farmasi Universitas Pancasila.

C. MANFAAT PRAKTIKUM

1. Kita dapat melakukan uji penduga terhadap sampel air yang diberikan. 2. Kita dapat mengetahui kualitas suatu air pada sampel walau masih dalam lingkup kecil. 3. Kita dapat mengetahui bahwa air sebagai kebutuhan bagi makhluk hidup penting diuji

kualitasnya. 4. Dapat menambah wawasan agar kita selalu memperhatikan dan menjaga kebersihan

lingkungan sekitar kita untuk meminimalisir tercemarnya air.

D. RUMUSAN MASALAH

1. Bagaimana kualitas air dalam sampel air yang sudah disediakan dari laboratorium mikrobiologi Fakultas farmasi Universitas Pancasila?

1

2. Apakah terdapat cemaran bakteri coliform dalam sampel air yang sudah disediakan dari laboratorium mikrobiologi Fakultas farmasi Universitas Pancasila dengan dilakukan uji penduga?

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

Mikroorganisme dalam air sangatlah berbeda. Jumlah dan tipe bakteri yang ada bergantung kepada jumlah bahan organik yang ada di dalam air, adanya zat racun, kadar garam air, dan faktor lingkungan seperti pH, suhu, dan udara. Mikroorganisme heterotrofik ada di dasar sungai dan danau dimana zat organik mendominasi sedangkan air yang terbuka atau berada di permukaan akan memiliki bakteri autrotrof dengan banyak tipe. Dengan adanya bakteri di dalam air, penyakit seperti kolera dapat menjadi penyakit yang sering menyerang saat kualitas air tidak diperhatikan atau ditangani.

Sebenarnya, air dengan bakteri aman untuk diminum tergantung dari jenis mikroba apa yang terdapat di dalamnya. Air dari mata air dan danau yang mengandung banyak bakteri autotrof dan heterotrof dapat diminum selama tidak patogen terhadap manusia. Meski begitu perhatian masih mengarah kepada mikroba yang patogen. Contohnya yang menyerang usus seperti penyebab disentri dan kolera. Penularan yang diakibatkan oleh sisa-sisa metabolisme manusia menjadi faktor lain penyebaran mikroba patogen sehingga pemeriksaan kualitas air yang konstan diperlukan untuk menjaga kemurnian air agar aman dikonsumsi.

Mikroorganisme dalam air dapat diketahui keberadaannya melalui bakteri-bakteri yang menjadi indicator keberadaannya. Indikator yang umum diketahui adalah Escherichia coli yang diklasifikasikan sebagai bakteri Coliform.

Coliform merupakan suatu grup bakteri yang digunakan sebagai indikator adanya polusi kotoran dan kondisi sanitasi yang tidak baik terhadap air, minuman, atau produksi yang dapat dikonsumsi oleh manusia. Adanya bakteri coliform di dalam makanan atau minuman menunjukkan kemungkinan adanya mikroorganisme yang bersifat enteropatogenik dan toksigenik yang berbahaya bagi kesehatan. Berdasarkan penelitian, bakteri coliform ini menghasilkan zat etionin yang dapat menyebabkan kanker. Selain itu, bakteri pembusuk ini juga memproduksi bermacam-macam racun seperti indol dan skatol yang dapat menimbulkan penyakit bila jumlahnya berlebih di dalam tubuh. Bakteri coliform dapat digunakan sebagai indikator karena destitasnya berbanding lurus dengan tingkat pencemaran air. Bakteri ini dapat mendeteksi pathogen pada air, seperti virus, protozoa, dan parasit. Selain itu, bakteri ini juga memiliki daya tahan yang lebih tinggi daripada patogen serta lebih mudah diisolasi dan ditumbuhkan.

Coliform termasuk kelompok bakteri aerob dan anaerob fakultatif, Gram negative, tidak membentuk endospora, berbentuk batang atau basil yang mempunyai kemampuan memfermentasi laktosa dengan menghasilkan asam dan gas pada suhu 35 - 370C selama 24-48 jam. Coliform juga membentuk koloni berwarna merah dan mengkilap logam dalam suhu 350C selama 24 jam pada media Endo agar yang mengandung laktosa. Coliform dapat ditemukan di saluran pencernaan hewan, tanah, atau secara alami pada lingkungan. Pada kondisi normal Coliform terdapat dalam jumlah normal dan dapat diukur. Namun, apabila terjadi pencemaran air, jumlah Coliform akan menjadi lebih banyak dan dapat melebihi jumlah bakteri patogen lainnya.

Bakteri Coliform dapat dibedakan menjadi dua grup, yaitu koliform fekal (misalnya Escherichia coli dan koliform nonfekal (misalnya Enterobacter aerogenes). Escherichia coli merupakan bakteri yang berasal dari kotoran hewan atau manusia, sedangkan Enterobacter aerogenes biasanya ditemukan di hewan atau tanaman-tanaman yang sudah mati. Jadi, adanya dalam air minum menunjukkan bahwa air minum itu pernah terkontaminasi feses manusia dan mungkin dapat mengandung patogen usus. Oleh karena itu, standar air minum mensyaratkan Escherichia coli harus menunjukkan angka nol dalam 100 mL. Air yang digunakan dalam keperluan farmasi tidak boleh mengandung mikroba dan air yang

2

digunakan untuk sediaan parenteral harus bebas dari pirogen. Air untuk keperluan farmasi dapat dikelompokkan menjadi 4 yaitu :

1. Potable water/drinking water (air minum)Air ini adalah air yang dapat dikonsumsi secara aman oleh manusia. Umumnya berasal dari sungai, sumur, mata air, danau, atau laut.

2. Purified waterAir murni diperoleh dari air minum yang telah melalui proses ultrafiltrasi, deionisasi, ataupun reverse osmosis. Air ini harus memenuhi ketentuan dalam Farmakope terhadap kandungan kimia air dan terlindung dari segala aktivitas mikroba.

3. High purified water (HPW)Hampir sama dengan purified water. Hanya saja air jenis ini harus memenuhi kriteria air untuk injeksi termasuk dalam jumlah endotoksin. Air ini diproduksi dari air minum biasa yang melalui proses kombinasi dari ultrafiltrasi, deionisasi, dan reverse osmosis.

4. Water for injection (WFI)Air ini digunakan untuk sediaan parenteral dan bukan merupakan produk steril atau produk jadi melainkan produk antara yang diperoleh dari air minum yang diolah dengan sistem destilasi.

Ketentuan kemurnian air dari berbagai standar adalah sebagai berikut,

Tahun 2002, Departemen Kesehatan RI menetapkan kriteria kualitas air secara mikrobiologis melalui Keputusan Menteri Kesehatan No. 907 tahun 2002 dan diperbaiki melalui Peraturan Menteri Kesehatan 492/Menkes/Per/IV/2010. Dalam peraturan tersebut dituliskan bahwa air minum tidak diperkenankan mengandung bakteri coliform dan Escherischia coli.

Standar Nasional Indonesia (SNI) No. 01-3553-2006 menyatakan bahwa air minum kemasan tidak boleh mengandung bakteri pathogen yaitu Pesudomonas aeruginosa, dan Salmonella. Selain itu cemaran mikrobanya tidak boleh lebih besar dari 100 koloni/ml.

USP 28 untuk Purified Water (PW) memiliki persyaratan mikrobiologi air adalah 100 CFU/ml dan untuk Water for Injection (WFI) sebesar 10 CFU/ml serta batas cemaran endotoxin 0,25 EU/ml.

Untuk mengetahui jumlah coliform di dalam sebuah sampel digunakan metode Most Probable Number (MPN). Pemeriksaan kehadiran bakteri Escherichia coli dari air dilakukan berdasarkan penggunaan medium kaldu laktosa yang ditempatkan di dalam tabung reaksi berisi tabung Durham (tabung kecil yang letaknya terbalik, digunakan untuk menangkap gas yang terjadi akibat fermentasi laktosa menjadi asam dan gas).

3

Uji Kualitatif Coliform

Uji kualitatif koliform secara lengkap terdiri dari tiga tahap, yaitu uji penduga (presumprtive test), uji penguat (confirmed test), dan uji pelengkap (completed test). Uji penduga juga merupakan uji kuantitatif koliform menggunakan metode MPN.

1. Uji penduga (presumprtive test)Merupakan tes pendahuluan tentang ada tidaknya kehadiran bakteri coliform berdasarkan

terbentuknya asam dan gas disebabkan karena fermentasi laktosa oleh bakteri golongan coli. Terbentuknya asam dilihat dari kekeruhan pada media laktosa dan gas yang dihasilkan dapat dilihat dalam tabung Durham berupa gelembung udara. Mikroba-mikroba ini mempunyai kemampuan menggunakan laktosa sebagai sumber karbon (mikroba enterik lainnya tidak mampu menggunakan sumber laktosa sebagai sumber karbon). Tabung dinyatakan positif jika terbentuk gas sebanyak 10% atau lebih dari volume di dalam tabung Durham. Banyaknya kandungan bakteri dapat dilihat dengan menghitung tabung yang menunjukkan reaksi positif terbentuk asam dan gas dan dibandingkan dengan tabel MPN. Metode MPN dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam sampel yang berbentuk cair. Bila inkubasi 1 x 24 jam hasilnya negative, maka dilanjutkan dengan inkubasi 2 x 24 jam pada suhu 350C. Jika dalam waktu 2 x 24 jam tidak terbentuk gas dalam tabung Durham, dihitung sebagai hasil negatif. Jumlah tabung yang positif dihitung pada masing-masing seri. MPN penduga dapat dihitung dengan melihat tabel MPN.

4

2. Uji penguat (confirmed test)Hasil uji dugaan dilanjutkan dengan uji ketetapan. Uji ini meliputi confirmed test untuk

Coliform dan confirmed test untuk Fecal Coliform dan Escherichia coli. Confirmed test untuk Coliform dilakukan dengan mengkulturkan hasil yang positif dari uji penduga ke dalam media Brilliant Green Lactose Bile (BGLB) broth sebagai media selektif dan diferensial. BGLB merupakan media selektif yang mengandung asam empedu sehingga dapat menghambat bakteri Gram positif selain Coliform.terbentuknya gas dalam media Lactose Broth (LB) atau dalam media BGLB tidak selalu menunjukkan bakteri Coli karena mikroba lainnya mungkin juga ada yang dapat memfermentasikan laktosa dengan membentuk gas, misalnya bakteri asam laktat dan beberapa khamir tertentu. Oleh karena itu, perlu dilakukan uji penguat pada media Eosin Methylene Blue Agar (EMBA) dengan cara gores kuadran. Semua tabung dan cawan Petri di inkubasikan pada suhu 35 – 370C selama 24 jam.

Dalam uji penguat ini juga menggunakan media selektif diferensial seperti Eosin Methylene Blue Agar (EMBA) atau Endo Agar. EMBA berisi indikator methylen blue yang menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif. Keberadaan lingkungan yang asam, indikator ini membentuk senyawa kompleks yang dipresipitasikan ke luar sel kelompok Coliform memproduksi warna hitam dan hijau metalik. Reaksi ini karakteristik untuk Escherichia coli. Apabila terdapat koloni berwarna merah muda dengan lendir, ini merupakan kelompok Coliform lainnya. Endo agar berisi nutrisi dengan indikator Fuchsin yang akan membentuk senyawa kompleks yang dapat mengubah warna media menjadi berwarna merah muda sedikit gelap. Jumlah cawan EMBA atau Endo Agar pada masing-masing pengenceran yang menunjukan adanya pertumbuhan Coliform, baik fekal maupun nonfekal, dihitung, dan MPN penguat dapat dihitung dari tabel MPN.

3. Uji pelengkap (completed test)Pengujian selanjutnya dilanjutkan dengan uji kelengkapan untuk menentukan bakteri

Escherichia coli. Dari koloni yang berwarna pada uji ketetapan diinokulasikan ke dalam medium kaldu laktosa dan medium agar miring Nutrient Agar (NA), dengan jarum Ose inokulasi secara aseptik. Diinkubasi pada suhu 370C selama 1 x 24 jam. Bila hasilnya positif terbentuk asam dan gas pada kaldu laktosa, maka sampel positif mengandung Escherichia coli. Dari media agar miring Nutrient Agar (NA) dibuat pewarnaan Gram dimana bakteri Escherichia coli menunjukan Gram negatif berbentuk batang pendek. Untuk membedakan bakteri golongan coli fekal (berasal dari tinja hewan berdarah panas), pekerjaan dibuat duplo, dimana satu seri diinkubasi pada suhu 370C (untuk golongan koli), dan satu seri diinkubasikan pada suhu 420C (untuk golongan koli fekal). Bakteri golongan koli tidak dapat tumbuh dengan baik pada suhu 42 0C , sedangkan golongan koli fekal dapat tumbuh dengan baik pada suhu 420C.

Standar Nasional Indonesia (SNI) mensyaratkan tidak adanya coliform dalam 100 mL air minum. Akan tetapi, United States Enviromental Protection Agency (USEPA) lebih longgar persyaratan uji coliform nya, mengingat coliform belum tentu menunjukkan adanya kontaminasi feses manusia, apalagi adanya patogen. USEPA mensyaratkan presence/absence test untuk coliform pada air minum, dimana dari 40 sampel air minum yang diambil paling banyak 5% boleh mengandung coliform. Apabila sampel yang diambil lebih kecil dari 40, maka hanya satu sampel yang boleh positif mengandung coliform. Meskipun demikian, USEPA mensyaratkan pengujian indikator sanitasi lain seperti protozoa Giardia lamblia dan bakteri Legionella.

Uji Identifikasi dengan melakukan reaksi IMVIC (Indole, Methyl red, Voges-Proskauer test, penggunaan Citrat)

5

1. IndolAsam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein.

Sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein. Bakteri tertentu seperti misalnya Escherichia coli mampu menggunakan triptofan sebagai sumber karbon. Escherichia coli menghasilkan enzim triptofanase yang mengkatalisasikan penguraian gugus indol dari triptofan. Dalam media biakan, indol menumpuk sebagai produk buangan, sedangkan bagian lainnya dari molekul triptofan (asam piruvat dan NH4

+) dapat digunakan untuk memenuhi kebutuhan zat hara mikroorganisme. Reagens bereaksi dengan indol dan menghasilkan senyawa yang tidak larut dalam air dan berwarna merah pada permukaan medium.

Untuk uji ini digunakan media semi padat yang kaya akan tritofan. Untuk melihat adanya indol dapat digunakan beberapa reagens yaitu Kovacs, Gore, Ehrlich dan Ehrlich-Bohme. Semua reagens tersebut mengandung para-dimetil-aminobenzaldehida. Dalam praktikum digunakan reagens Ehrlich-Bohme yang terdiri reagens A dan reagens B. Media untuk melihat pembentukan indol yang digunakan di laboratorium bersifat semi padat. Oleh karena itu, dapat digunakan juga untuk melihat pergerakan bakteri. Jika bakteri bergerak akan terlihat pertumbuhan di sekitar tusukan dan juga pada permukaan media. Media indol diinokulasikan dengan menusukkan jarum ke dalam media semi padat.

2. Methyl redPada kaldu gula  yang berisi tabung Durham, dapat diketahui kemampuan mikroorganisme

untuk memfermentasikan karbohidrat, tetapi hasil produksi fermentasi tidak diketahui. Dalam praktikum digunakan media MR-VP untuk mengetahui fermentasi asam campuran atau fermentasi butanadiol.

Uji methyl red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam campuran. Beberapa bakteri memfermentasikan glukosa dan menghasilkan berbagai produk yang bersifat asam sehingga akan menurunkan pH media pertumbuhannya menjadi 5.0 atau lebih rendah. Penambahan indikator pH ”methyl red” dapat menunjukkan adanya perubahan pH menjadi asam. Methyl Red berwarna merah pada lingkungan dengan pH 4.4 dan berwarna kuning dalam lingkungan dengan pH 6.2.

Fermentasi asam campuran ditentukan dengan cara menumbuhkan mikroorganisme dalam kaldu yang mengandung glukosa, dan setelah masa inkubasi menambahkan reagens methyl red ke dalam kaldu. Bila terjadi fermentasi asam campuran kaldu biakan akan tetap berwarna merah. Bila tidak terjadi fermentasi asam campuran maka kaldu biakan berubah menjadi kuning setelah penambahan reagens methyl red. Uji ini sangat berguna dalam identifikasi kelompok bakteri yang menempati saluran pencernaan.

3. Voges-ProskauerUji ini digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme yang melaksanakan fermentasi 2,3-

butanadiol. Bila bakteri memfermentasi karbohidrat menjadi 2,3-butanadiol sebagai produk utama, akan terjadi penumpukan bahan tersebut dalam media pertumbuhan. Penambahan 40% KOH dan 5% larutan alphanaphtol dalam ethanol dapat menentukan adanya asetoin (asetilmetilkarbonil), suatu senyawa pemuka dalam sintesis 2,3-butanadiol. Pada penambahan KOH, adanya asetoin ditunjukan adanya perubahan warna kaldu menjadi merah muda. Perubahan warna ini diperjelas dengan penambahan larutan alpha-naphtol. Perubahan warna kaldu biakan lebih jelas pada bagian yang berhubungan dengan udara. Karena sebagian 2,3-butanadiol dioksidasikan kembali menjadi asetoin. Sehingga memperjelas hasil reaksi. Berdasarkan hal ini tabung yang berisi kaldu dikocok sehingga berbuih, kemudian dibuka tutup tabungnya dan dimiringkan di atas meja.

6

Uji Voges-Proskauer sebenarnya merupakan uji tidak langsung untuk mengetahui adanya 2,3-butanadiol dan selalu didapatkan secara serentak, sehingga uji VP absah untuk menentukan adanya 2,3-butanadiol.

4. Penggunaan CitratUji  Sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai

satu-satunya sumber karbon dan energi. Untuk uji ini dapat digunakan medium sitrat – Koser berupa medium cair atau medium sitrat – Simmon berupa medium padat. Simmon’s citrate agar merupakan medium sintetik dengan Na sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon, NH4

+ sebagai sumber N dan brom thymol  blue sebagai indikator pH, sedangkan medium sitrat-Koser tidak mengandung indikator. Bila mikroorganisme mampu menggunakan sitrat, maka asam akan dihilangkan dari medium biakan, sehingga menyebabkan peningkatan pH dan mengubah warna medium dari hijau menjadi biru. Perubahan warna dari hijau menjadi biru menunjukan bahwa mikroorganisme mampu menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. Sedangkan para medium sitrat-Koser kemampuan menggunakan sitrat ditunjukkan oleh kekeruhan yang menandakan adanya pertumbuhan.

7

BAB IIIMETODOLOGI PENELITIAN

A. ALAT DAN BAHAN

Alat :1. Spiritus2. Tabungreaksi3. Jarumose4. Autoklaf5. Laminar Air Flow 6. Incubator 7. Oven 8. Vortex

Bahan:1. Lactose Broth 2. Briliant Green Lactose Bile Broth (BGLB) 3. Eosin Methylene Blue Agar (EMBA)4. Nutrient Agar 5. Nutrient Broth 6. Simmon’s Citrate Agar 7. Salmonella Shigella Agar (SSA)8. Plate Count Agar9. Mannitol Salt Agar (MSA)10. Staphylococcus aureus11. Eschericia coli

B. CARA KERJA

Uji penduga (presumptive test)1. Siapkan media Lactosa Broth dengan indikator merah fenol atau ungu bromkresil, atur

pH 7-7,2. Masukkan media ini ke dalam 10 tabung reaksi masing-masing 5 mL bersama tabung Durham yang terbalik. Catatan : tabung Durham harus berisi media dan tidak boleh ada gelembung udara dalam tabung Durham. Tutup rapat semua tabung dengan kapas dan sterilkan dengan autoklaf pada suhu 1210C, tekanan 1 atm selama 15 menit.

2. Masukkan volume sampel masing-masing 10 mL ke dalam 3 tabung kelompok I.3. Masukkan volume sampel masing-masing 1 mL ke dalam 3 tabung kelompok II.4. Masukkan volume sampel masing-masing 0,1 mL ke dalam 3 tabung kelompok III.5. Masukkan 1 mL air steril ke dalam satu tabung sebagai kontrol sterilitas.6. Dapat juga menggunakan 1 mL kultur E. coli atau 1 mL kultur S. aureus ke dalam 2

buah tabung sisa diatas sebagai kontrol positif dan kontrol negatif.7. Inkubasi semua tabung pada suhu 35-37 ± 0,50C selama 24± 2jam. Amati terbentuknya

asam dan gas pada tabung Durham. Adanya asam dan gas disebabkan karena fermentasi laktosa oleh bakteri coliform, asam dilihat dari perubahan warna ungu menjadi kuning

8

dan gas dapat dilihat dalam tabung Durham berupa gelembung udara. Inkubasi lagi (24 jam sisanya) pada tabung yang tidak terbentuk gas. Banyaknya kandungan bakteri coliform dpat dilihat dengan menghitung tabung yang menunjukkan reaksi positif dan lihat Tabel MPN.

8. Setelah inkubasi hasilnya positif dilanjutkan dengan uji penegasan (confirmed test).

Uji penegasan (confirmed test)1. Siapkan 12 tabung yang telah berisi masing-masing 10 mL Brilliant Green Lactose Bile

(BGLB) Broth dengan tabung Durham didalamnya (dibagi menjadi 3 kelompok masing-masing 3 buah tabung dan 3 buah tabung sebagai kontrol sterilitas, kontrol positif dan kontrol negatif).

2. Masukkan satu ose inokulum dari tiap-tiap tabung hasil uji presumptive test yang menghasilkan uji positif ke dalam tiap-tip tabung media BGLB.

3. Masukkan masing-masing 1 mL air steril atau 1 mL kultur E. coli atau 1 mL kultur S. aureuske dalam 3 buah tabung sisa yang telah berisi BGLB sebagai kontrolsterilitas, kontrol positif dan kontrol negatif.

4. Inkubasi semua tabung pada suhu 35-37 ± 0,50C selama 48±3jam. Amati terbentuknya gas pada tabung Durham dalam waktu 24-48 jam lalu catat hasilnya. Inkubasi lagi (24 jam sisanya) pada tabung yang tidak terbentuk gas (negatif).

5. Interpretasi hasil positif jika media keruh dan terbentuk gas (harus kedua-duanya). Interpretasi hasil negatif jika tidak terdapat pertumbuhan dan tidak terbentuk gas.

6. Hitung kisaran konsentrasi Coliform (MPN/mL) dengan menghitung tabung positif kemudian cocokkan dengan tabel MPN berasarkan dari perhitungan uji dugaan. Perkiraan konsentrasi yang didapat adalah penegasan adanya Coliform.

7. Untuk meyakinkan adanya Escherichia coli, goreskan 1 ose dari kultur tabung positif (mengandung gas) dari media BGLB ke dalam cawan yang berisi media Endo Agar atau Eosin Methylene Blue Agar (EMBA). Inkubasi kultur dalam cawan tersebut pada (inverted Petri dishes)suhu 35-37 ± 0,50C selama 24± 2jam.

8. Interpretasikan sebagai E. coli dalam media EMBA jika memiliki ciri-ciri koloni datar, baerwarna hitam atau bintik biru kehijauan di tengah koloni dengan atau tanpa warna kilat logam (metallic sheen).

Uji lengkap (completed test)1. Inokulasikan satu atau lebih koloni yang tumbuh dalam setiap cawan ke dalam media

Lactose Broth (dengan tabung Durham didalamnya) dan koloni tersebut juga goreskan ke dalam Nutrient Agar atau Tryptone Soy Agar miring.

2. Inkubasi kultur dari cawan dan agar miring tersebut di atas pada suhu 35-37 ± 0,50C selama 24±2jam atau 48±3jam.

3. Intepretasikan hasil dikatakan positif jika media keruh dn terbentuk gas (harus kedua-duanya) baik pada inkubasi 24 jam atau 48 jam pada media Lactose Broth dan merupakan Gram negatif, tidak membentuk spora, bentuk sel bulat memanjang (rod shape) setelah dilakukan pengecatan Gram. Namun jika setelah inkubasi 48 jam, gas baru diproduksi dan setelah dilakukan pengecatan Gram hasilnya Gram positif tetapi tidak berspora, maka hasil ini merupakan hasil positif keberadaan kelompok Coliform dalam uji completed test.

4. Untuk mempertegas hasil, lakukan uji IMVIC.

9

Uji pewarnaan Gram dan morfologi sel1. Buat preparat ulas (smear) yng telah difiksasi dari tabung Nutrient Agar atau Tryptone

Soy Agar yang diduga E. coli.2. Teteskan kristal violet sebagai pewarna utama, usahakan semua ulasan terwarnai dan

tunggu selama ± 1 menit, kemudian cuci dengan air mengalir.3. Teteskan mordant(lugol’s iodine) lalu tunggu ± 1menit, kemudian cuci dengan air

mengalir.4. Beri larutan pemucat (eanol 96%) setetes demi setetes hingga etanol yang jatuh berwarna

jernih. Jangan sampai terlalu banyak (overdecolorized), kemudian cuci dengan air mengalir.

5. Teteskan counterstain (safranin) dan tunggu selama ± 45 detik, kemudian cuci dengan air mengalir.

6. Keringkan preparat dengan kertas tissue yang ditempelkan di sisi belakang ulasan (jangan sampai merusak ulasan) lalu biarkan mengering di udara.

7. Interpretasikan sebagai Gram negatif berwarna merah dan sebagai Gram positif berwarna ungu. Jika kultur dugaan tersebut E. coli maka seharusnya menunjukkan sifat Gram negatif dan sel berbentuk batang pendek. Gunakan kultur Bacillus subtilis sebagai kontrol Gram positif dan kultur E. coli sebagai kontrol Gram negatif.

8. Jika kultur dugaan tersebut sifat Gram negatif dan berbentuk batang, maka diinokulasikan kembali ke media Lactose Broth untuk mengkonfirmasi ulang terbentuknya gas. Kemudian semua kultur dugaan kedua jenis diatas dilakukan uji IMVIC.

Uji IMVIC (produksi indol, uji Methyl Red, uji Voges-Proskauer, uji penggunaan sitrat)1. Uji produksi indol; uji ini akan membedakan bakteri yang mampu atau tidak mampu

memproduksi indol dari Tryptone.a. Inokulasikan kultur dugaan dari hasil ke dalam media Tryptone Broth lalu inkubasi

pada suhu 350C selama 24±2jam.b. Tambahkan 0,2-0,3 mL reagen Kovac’s. jika terbentuk cincin merah pada bagian atas

tabung maka bakteri dapat memproduksi indol (indol positif) dan bila terbentuk cincin kuning maka disimpulkan sebagai indol negatif. Jika kultur dugaan tersebut E. coli maka seharusnya menunjukkan hasil positif dan sel berbentuk batang pendek.Gunakan kultur Bacillus subtilis sebagai kontrol negatif dan kultur E. coli sebagai positif.

2. Uji Methyl Red. Uji ini akan membedakan bakteri yang mampu memproduksi asam dari glukosa dan Methyl Red sebagai indikator penurunan pH (pH < 4,4 = merah; pH 5-5,8 = oranye; pH > 6 = kuning).a. Inokulasikan kultur dugaan tersebut di atas ke MR-VP Broth lalu inkubasi pada suhu

350C selama 48±2jam.b. Tambahkan 5 tetes larutan Methyl Redke dalam tabung. Jika kultur dugaan tersebut

E. coli maka seharusnya menunjukkan hasil positif. Gunakan kultur Enterobacter spp. sebagai kontrol negatif dan kultur E. coli sebagai kontrol positif.

3. Uji Voges-Proskauer. Uji ini dapat membedakan bakteri yang mampu memproduksi acethylmethyl-carbinol atau tidak. Senyawa tersebut dideteksi dengan penambahan potassium hydroxide yang akan membentuk diacethyl yang bereaksi dengan peptone menghasilkan warna merah.

10

a. Inokulasikan kultur dugaan tersebut ke MR-VP Broth lalu inkubasi pada suhu 35 0C selama 48±2jam.

b. Setelah watu 24 jam pindahkan 1 mL kedalam tabung kosong lalu tambahkan 0,6 mL larutan α-naphthol dan 0,2 mL 40% KOH.

c. Tambahkan beberapa kristal creatine. Kocok kemudian biarkan selama 2 jam. Uji VP dinyatakan positif bila warna berubah menjadi merah. Jika kultur dugaan tersebut E. coli maka seharusnya menunjukkan hasil tidak ada perubahan warna (negatif). Gunakan kultur Enterobacter spp. sebagai kontrol negatif dan kultur E. coli sebagai kontrol positif.

4. Uji penggunaan sitrat. Uji ini membedakan bakteri yang mampu menggunakan citrate sebagai sumber nutrisinya. Inokulasikan kultur dugaan tersebut media Simmon Citrate (SC) lalu inkubasi pada suhu 350C selama 96±2jam. Reaksi positif jika terdapat pertumbuhan media yang berwarna hijau berubah menjdi biru, reaksi negatif jika tidak ada pertumbuhan dan media tetap hijau. Jika kultur dugaan tersebut E. coli maka seharusnya menunjukkan hasil tidak ada perubahan warna (negatif). Gunakan kultur Klebsiella pneumoniae sebagai kontrol positif dan kultur E. coli sebagai kontrol negatif.

11

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN

A. HASIL Tabel Uji Penduga

Kelompok tabung Hasil Keterangan Hasil

10 ml

Tidak ada gelembung udara

dalam tabung durham

0

1 ml

Tidak ada gelembung udara

dalam tabung durham

0

0,1 ml

Tidak ada gelembung udara

dalam tabung durham

0

3 Mpn/ml

12

B.PEMBAHASAN

Metode MPN (Most Probable Number) untuk uji kualitas air saat praktikum menggunakan koloform sebagai indikator. Kelompok koliform mencakup bakteri yang aerobik dan anaerobik fakultatif, berbentuk batang atau basil, gram negatif dan tidak membentuk spora. Uji penduga dilakukan dengan menginkubasi air sampel yang telah dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi media lactose broth dan tabung Durham, hasil yang diperoleh yakni pada tabung 10 ml, 1 ml, dan 0,1 ml tidak terbentuk gelembung dalam tabung durham yang mengindikasikan tidak adanya kolifrom pada air sampel dengan indeks MPN 3MPN/mL.

Dari hasil tersebut kemudian di bandingkan dengan hasil masing-masing kelompok ternyata hasilnya sama yaitu semua tabung negatif karena tidak terdapat gas dalam tabung durham, karena sampel hasil negatif maka tidak dilakukan uji penguat.

13

Kontrol Hasil Keterangan

Positif (Escherichia colli)

Terdapat gelembung udara dalam tabung durham

Negatif (Staphylococcus

aureus)

Tidak terdapat gelembung udara dalam tabung durham

BAB VKESIMPULAN

1. Kualitas air (sampel air) yang telah disediakan dari laboratorium mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Pancasila merupakan sampel yang dapat dikatakan baik dan dapat dikonsumsi dengan aman karena dengan uji penduga tidak ditemukan adanya gelembung gas ataupun asam. Dapat disimpulkan bahwa air yg diuji bebas dari mikroba.

2. Tidak terdapat cemaran bakteri coliform dalam sampel air yang sudah disediakan dari laboratorium mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Pancasila dengan dilakukan uji penduga karena tidak ditemukannya gelembung gas dan tidak terjadi perubahan warna yang menunjukan adanya asam yang merupakan hasil fermentasi laktosa yang dilakukan oleh bakteri coliform. Angka Paling Mungkin adanya bakteri dalam sampel adalah 3 MPN/ mL yang berarti mungkin ada bakteri dengan jumlah 3 pada setiap mL sampel.

14

BAB VIDAFTAR PUSTAKA

http://jurnal.fk.unand.ac.id/articles/vol_1no_3/129-133.pdf. Kualitas Air Minum Yang Diproduksi Depot Air Minum Isi Ulang Di Kecamatan Bungus Padang Berdasarkan Persyaratan Mikrobiologi. Rido Wandrivel, Netty Suharti, Yuniar Lestari.

http://www.unhas.ac.id/hasbi/TOT-Atm-eSpr/eSpring%20TTT/background/Air%203.pdf. Analisis Kualitatif Bakteri . Ni Luh Putu Manik Widiyanti dan Ni Putu Ristiati.

Benson. 2001. Microbiological Applications : Laboratory Manual in General Microbiology. The McGraw−Hill Companies.

Kar, Autosh. Pharmaceutical Microbiology. New Delhi : NEW AGE INTERNATIONAL LIMITED PUBLISHERS.

Goldman, Emanuel & Lorrence H. Green (editor). Practical Handbook of Microbiology. CRC Press, Taylor & Francis Group.

15