P 18-22 Torres-Lissarrague-Martínez-Cacho-Lamuela-Escribano DEMÉTER

1

PROYECTO CENIT DEMÉTER. Consorcio Deméter

Empresa líder MIGUEL TORRES

Mireia Torres.

El sector vitivinícola tiene un gran peso en la economía española. España posee el viñedo más extenso en el mundo con 1.174.000 ha (14,85 superficie mundial) y es el tercer país exportador de vinos del mundo con alrededor de 14 millones de hectolitros (17% volumen mundial).

En los últimos años, por parte de algunos viticultores y bodegueros, se vienen

observando ciertos cambios en el proceso de maduración de la uva. Existe una tendencia a que se produzca un desfase entre la madurez en el contenido en azúcares, más temprana y la madurez de aromas y polifenoles, más tardía. De manera que resulta difícil determinar el punto óptimo de cosecha ya que si tenemos el grado probable adecuado, todavía no se ha alcanzado la máxima intensidad aromática y los taninos todavía son verdes. Este desfase supone un reto para los elaboradores ya que el consumidor prefiere vinos de aroma intenso, taninos maduros y menor grado alcohólico.

Los cambios observados se deben a las nuevas condiciones climáticas que coinciden con los resultados que se desprenden del estudio que sobre el cambio climático en España ha elaborado el Ministerio de Medio Ambiente en colaboración con la Universidad de Castilla la Mancha (Moreno 2005). El estudio prevé los cambios siguientes:

1. Tendencia progresiva al incremento de las temperaturas medias a lo largo del siglo, especialmente en los meses de verano.

2. Tendencia generalizada a una menor precipitación acumulada anual. En los gráficos a continuación se muestran las proyecciones en los cambios de temperatura y en el régimen de precipitaciones para el periodo 2010-2040

2

Fig. 1: Proyecciones de cambio de temperatura del aire junto al suelo (a 2 m), promediadas para cada estación del año (DEF invierno, MAM primavera, JJA verano y SON otoño), correspondientes a tres periodos del siglo 21: 2010-2040 2040-2070 y 2070-2100, y a dos escenarios SRES de emisiones (A2 y B2). Las simulaciones se realizaron con el modelo HadCM3 y los resultados se tomaron del IPCC-DDC. En la esquina superior derecha se muestra la malla del modelo sobre la Península Ibérica, donde las cuadrículas sombreadas corresponden en el modelo a superficie continental y las blancas a océano

3

Fig. 2: Proyecciones de cambio de precipitación media (en mm / día), promediadas para cada estación del año (DEF invierno, MAM primavera, JJA verano y SON otoño),correspondientes a tres periodos del siglo 21: 2010-2040 2040-2070 y 2070-2100, y a dos escenarios SRES de emisiones (A2 yB2). Las simulaciones se realizaron con el modelo HadCM3 y los resultados se tomaron del IPCC-DDC.En la esquina superior derecha se muestra la malla del modelo sobre la Península Ibérica, donde las cuadrículas sombreadas corresponden en el modelo a superficie continental y las blancas a océano.

Del análisis de las inquietudes expresadas por las empresas y de las líneas de investigación que los diferentes grupos están desarrollando ha surgido el consorcio DEMETER. “Desarrollo de Estrategias y Métodos vitícolas y Enológicos frente al cambio climático. Aplicación de nuevas Tecnologías que mejoren la Eficiencia de los procesos Resultantes” (Acrónimo “ Cenit Demeter”)

El Consorcio CENIT Demeter está liderado por Bodegas Miguel Torres e

integrado por 25 empresas españolas vinculadas al sector vitivinícola, de las cuales un 56% son bodegas y el 44% restante corresponde a empresas de la industria auxiliar del sector vitivinícola. Las empresas participantes son: Ferrer-Bobet, Agrovin, Matarromera, Bodegas Roda, Juvé & Camps, Aecork, Avanzare, Bodega Castell d’Encús, Dolmar, Dominio de la Vega, Ecovitis, Gramona, Hera Amasa, Intranox, Laffort España, Lallemand Bio, Bodegas Martín Códax, Pago de Carraovejas, Protos, Solfranc, Tecnología Difusión Ibérica, Tonelería Magreñan, Unión de Cosecheros de Labastida, Barbadillo y Bodegas Miguel Torres.

4

ESTUDIO DE ESTRATEGIAS VITÍCOLAS DE ADAPTACIÓN AL CAMBIO CLIMÁTICO EN BASE A ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GÉNICA Y ENSAYOS EN CAMPO Y VIVERO: CLIMA, CALIDAD DE UVA Y TRANSCRIPTÓMICA (LÍNIA TRONCAL VITICULTURA DEL PROYECTO CENIT DEMÉTER) GRUPO DE INVESTIGACIÓN EN VITICULTURA . UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID José Ramón Lissarrague, Patricia Sánchez de Miguel, Rosa Pedrosa Blanco, Sara Sánchez-Élez, Lucia Rodríguez, Emilio Peiro, Cristina López, Eduardo de José, Francisco Iraizoz, Alejandro Gómez, Maria Nieto, Pedro Junquera, Laura Jiménez. 1.- OBJECTIVOS DEL PROYECTO La actividad 2 del Proyecto Cenit Deméter persigue incrementar el conocimiento científico sobre la incidencia que tienen las condiciones climáticas en el proceso de maduración de la uva. El escenario de cambio climático que se plantea en informes medio ambientales publicados por expertos a nivel mundial preocupa al sector vitivinícola español. Además, en las últimas vendimias se han podido constatar los efectos del cambio de clima en el proceso de maduración de la uva. Por esta razón, y aprovechando la diversidad climática de los viñedos de las empresas que forman parte del consorcio, se planteó en la memoria del proyecto el establecimiento de un diseño experimental para realizar un estudio que iba a ser costeado por todos los socios del Consorcio Deméter. El estudio se ha abordado desde dos enfoques: 1) Reduccionista en el que se juega con dos variables consideradas como las más relevantes de las nuevas condiciones climáticas: temperatura y disponibilidad de agua. Ensayo en invernadero. 2) Multifactorial en el que intervienen otras variables además de la temperatura y la disponibilidad de agua. Ensayo en viñedos de referencia. El estudio pretende conocer:

1) La incidencia de los cambios de temperatura y disponibilidad de agua en la expresión génica durante el proceso de desarrollo y maduración de la uva.

2) Relacionar los cambios en la expresión génica con otros marcadores del estado de madurez del fruto de interés vitícola y enológico: fenología, controles enológicos clásicos de la baya, componentes del rendimiento, crecimiento vegetativo, biomasa renovable, composición de aromas y precursores aromáticos, composición polifenólica y caracterización organoléptica de las bayas.

3) Relacionar los parámetros de control del proceso de maduración con la descripción organoléptica del vino y la composición aromática y polifenólica del mismo.

5

2.- DISEÑO EXPERIMENTAL El estudio de la incidencia del Cambio Climático en el proceso de maduración de la uva se estudia desde dos aproximaciones:

- Reduccionista: en el estudio se pretende establecer unas condiciones de ensayo que permitan mantener controladas las condiciones ambientales y que permitan la variación de únicamente dos variables: temperatura y disponibilidad de agua. Para ello se va a trabajar en condiciones de invernadero. - Multifactorial: en este caso se van a estudiar las mismas variables pero en un marco en el que existen otros factores que van a incidir en el proceso de maduración que no estarán controlados. Este ensayo se realiza en el campo.

Se plantea de este modo ya que, al no existir información previa sobre la evolución de la expresión génica durante el proceso de maduración de la uva, se debe trabajar en condiciones controladas que permitan relacionar los cambios con los parámetros que se controlan (temperatura y disponibilidad de agua). Pero por otra parte interesa conocer si es posible trasladar los resultados obtenidos en el vivero a las condiciones reales de crecimiento de la planta en el campo. Se han elegido la temperatura y la disponibilidad de agua por considerar que son los factores climáticos que van a tener una mayor incidencia en la maduración de la uva en un futuro. Se estudiarán tres variedades de referencia españolas: una tinta (Tempranillo) y una blanca (Albariño). El Tempranillo es una variedad tinta muy extendida en España, de ciclo medio-largo, con un rendimiento alto, racimo grande y baya media-grande, muy sensible a las alteraciones ambientales y sanitarias. El Albariño es una variedad blanca autóctona de Galicia, de ciclo medio-corto, con un rendimiento medio-bajo, racimo pequeño y la baya también, relativamente robusta, bien adaptada a condiciones complejas de alta humedad y precipitación. A) Modelo Reduccionista. Invernadero El ensayo reduccionista (invernadero) se ha establecido en los viveros de Miguel Torres S.A. donde se cuenta con dos invernaderos preparados para establecer las condiciones ambientales controladas. Para el estudio se han generado cuatro ambientes que corresponden a: condiciones normales consideradas como aquellas en las que el ciclo de desarrollo y maduración del fruto se lleva a cabo con disponibilidad total de agua (condiciones de capacidad de campo) y temperatura equivalente a la media de los últimos 10 años en la región en la que se realiza el experimento (zona del Penedès). La condición de estrés hídrico se ha fijado en un valor de disponibilidad de agua equivalente a la mitad de las necesidades de la planta; y para la condición de temperatura elevada, las plantas se cultivarán a una temperatura superior en 15-10% a la media de la región en los últimos 10 años. Condiciones de estrés hídrico y de temperatura que sumarán los efectos de ambas.

6

Dada la imposibilidad de controlar el régimen térmico dentro de las condiciones de una nave de invernadero, la variable temperatura se ha establecido separadamente en dos naves diferentes, dentro de las cuales se han dispuesto los otros dos factores en bloques al azar. El dispositivo en cada nave es en split-plot, esto es, un dispositivo factorial en bloques al azar con dos factores experimentales. El dispositivo experimental queda representado de la manera que aparece en la figura 3. Se han fijado, para cada condición climática, tres bloques (o repeticiones) por tratamiento, con 10 cepas/variedad en cada bloque. Las variedades se introdujeron en 2008 con plantas injertadas sobre el mismo patrón. Las cepas se cultivan en lisímetros pesantes de 50 litros. La evaluación del consumo de agua se determina por gravimetría. Figura 3: Esquema de las naves y su dispositivo experimental

NAVE FRÍA NAVE CALIENTE V R T S A R A S T R V S V R T S A R A S T R V S 18 15 14 9 8 3 18 15 14 9 8 3 B

LOQ

UE

1

V S T R T S A R A S V R V S T R T S A R A S V R 17 13 12 7 6 2 17 13 12 7 6 2 B

LOQ

UE

2

V S A R A S T R T S V R V S A R A S T R T S V R 16 11 10 5 4 1 16 11 10 5 4 1 B

LOQ

UE

3

V VERDEJO S SECANO (ESTRESADO) T TEMPRANILLO R RIEGO (NO ESTRESADO)

7

A ALBARIÑO B) Modelo Multifactorial. Viñedos de referencia Al plantear el ensayo en condiciones de campo se buscaron viñedos entre los socios del consorcio que dispusieran de las variedades elegidas y de características térmicas divergentes. Es decir, para una variedad determinada se buscó una parcela en una zona de dominancia continental - atlántica y otra parcela en una zona de dominancia mediterránea. Los ensayos se han establecido en dos localizaciones térmicas específicas, tal y como muestra la tabla 1.

Tabla 1. Viñedos de referencia Zona mediterránea Zona continental -

atlántica Tempranillo Miguel Torres, S.A Bodegas Roda S.A.

Albariño Miguel Torres, S.A B. Martín Códax S.A.U. Para cada zona térmica se han fijado dos condiciones de disponibilidad de agua (moderada y restringida). Las necesidades de riego se estiman a través de la demanda atmosférica y la aplicación de dos coeficientes de riego. El dispositivo experimental en cada viñedo de referencia consta de un diseño experimental en bloques al azar, con tres bloques (o repeticiones) por tratamiento. Se ensayan dos tratamientos, denominados “riego” y “secano” basados en el régimen hídrico. Ver figura 4.

Cada parcela elemental de la repetición de cada tratamiento dispone como mínimo 120 cepas control (sin contar las necesidades de bordadura) de este modo el tamaño de la muestra es suficiente para soportar los muestreos posteriores como el de bayas y permite realizar las microvinificaciones individuales de la repetición. Todas las cepas de

Riego Mínimo 120 cepas

Secano Mínimo

120 cepas


Secano Mínimo 120 cepas


Secano Mínimo 120 cepas

BLOQUE 1 BLOQUE 2 BLOQUE 3

Figura 4. Diseño experimental del viñedo de referencia

8

la misma variedad, en los distintos bloques y viñedos, se someten a los mismos tratamientos y operaciones de cultivo En todas las zonas se ha realizado una caracterización exhaustiva del viñedo, con un estudio de los datos generales de la finca y de los particulares de cada parcela de referencia. 3.- PRESENTACION RESULTADOS GRUPOS DE INVESTIGACIÓN 3.1.- RESULTADOS GRUPO DE INVESTIGACIÓN EN VITICULTURA UPM CONDICIONES EXPERIMENTALES Modelo Reduccionista-Vivero Durante la anualidad 2009 se ha trabajado en el mantenimiento de las condiciones experimentales fijadas en la memoria del proyecto, tanto de régimen de temperaturas como de disponibilidad de agua. Régimen de Temperaturas Tabla 2: Régimen de temperaturas a establecer en las cabinas de régimen cálido y frío en las diferentes franjas horarias y en los diferentes intervalos fenológicos

Temperaturas (ºC) en intervalos horarios CÁLIDA 1:00-8:00 8:00-12:00 12:00-19:00 19:00-1:00

brotación-floración 11 19 25 19 floración-cuajado 14 22 29 22 cuajado-envero 18 27 33 27 envero-vendimia 18 26 31 26 vendimia-caída de hoja 13 20 25 20

Temperaturas (ºC) en intervalos horarios FRÍO 1:00-8:00 8:00-12:00 12:00-19:00 19:00-1:00

brotación-floración 10 17 24 17 floración-cuajado 13 20 28 20 cuajado-envero 16 23 31 23 envero-vendimia 16 22 29 22 vendimia-caída de hoja 11 16 23 16

Disponibilidad de agua Se establecen dos disponibilidades hídricas: Tratamiento 1: total disponibilidad de agua o no estrés. Se aporta la cantidad de agua que consume. La cantidad de agua a aportar es: ConsumoNo estrés (Litros/semana) = Ps-1 - Ps + R - D donde: Ps-1 : peso del lisímetro de la semana anterior (Kg.) Ps : peso del lisímetro de esta semana (kg)

9

R : cantidad de agua aplicada durante la semana (L) D : cantidad de agua que drena durante la semana (L) Tratamiento 2: restricción en la disponibilidad de agua o estrés hídrico. Se aporta el 50% del consumo de la planta. Esta cantidad se corrige con un factor k que depende del área foliar desarrollada. El factor se calcula semanalmente como cociente entre la longitud del brote principal en condiciones de estrés y en condiciones de no estrés hídrico. Se usan las longitudes por ser más sencillas de medir y por existir una relación lineal entre estas y las áreas foliares. La cantidad de agua a aportar es: Consumo Estrés = Consumo No Estrés x (0,5 x l/L), Siendo, para una variedad concreta en un régimen térmico determinado: l: longitud del brote principal en estrés hídrico. L: longitud del brote principal en no estrés hídrico. Modelo Multifactorial-Viñedos de Referencia Régimen de temperaturas El régimen de temperaturas de los viñedos de referencia viene marcado por la climatología. Disponibilidad de agua En el año 2008 solo se pudieron realizar algunos ensayos de riego en la parcela Pe-Redondo, Albariño de la zona Atlántico-Continental. En 2009, todos los viñedos de referencia ya disponen de sistemas de riego que han permitido iniciar los ensayos programados en la memoria del proyecto. Además, el régimen de precipitaciones y la evapotranspiración han permitido establecer diferencias entre los ensayos de riego y no riego. MEDIDAS REALIZADAS Modelo Reduccionista 1. PARÁMETROS CLIMÁTICOS Régimen térmico, humedad relativa e iluminación. 2. FENOLOGÍA En presencia de racimos: Eichhorn y Lorenz (1977), modificados por Coombe (1995). Una vez eliminados los racimos: agostamiento de la madera �Número de nudos agostados. �Longitud de brote agostado. 3. CONSUMO DE AGUA Semanal. Por variedad, régimen hídrico y ambiente de forma separada. �Peso del lisímetro �Agua de riego aplicada �Agua de drenaje recogida �Longitud del pámpano (tarea 4) �Nº nudos (tarea 4) 4. CRECIMIENTO VEGETATIVO: Medida semanal. �Longitud del pámpano: de la base a la extremidad del pámpano hasta despunte. Tras despunte, desde la base hasta extremidad del nieto superior.

10

�Número de nudos: de la base a la extremidad del pámpano hasta despunte. Tras despunte, desde la base hasta extremidad del nieto superior. �Estado del ápice del pámpano o del nieto superior. �Estado de las hojas basales. 5. PESO DE MADERA DE PODA: 5 macetas por tratamiento y repetición �PMP (kg/m2) �Carga: nº pámpanos/cepa �Peso del sarmiento (g) Modelo Multifactorial 1. CLIMA Informes diarios, semanales, mensuales, anuales. �Temperaturas (°C): media, mínima y máxima �Precipitación: total P (mm) y efectiva Pe (mm) �Radiación solar: Rg (w/m2) �Humedad Relativa: HR (%) �Velocidad del viento (m/s) �Evapotranspiración potencial: ET0

(mm) �Integral térmica eficaz: GDD (grado·día) 2. SUELO Estudio de las características físico-químicas del suelo de los viñedos de referencia mediante calicatas. Evolución del contenido de agua en el suelo: �Informes diarios, semanales, mensuales, anuales. �Valores absolutos, variaciones temporales, tendencias. �Por profundidad. 3. FENOLOGÍA Eichhorn y Lorenz (1977), modificados por Coombe (1995): Estado mayor más frecuente. 4. CRECIMIENTO VEGETATIVO: En 3 pámpanos por tratamiento y repetición. Medida semanal. �Longitud del pámpano: de la base a la extremidad. �Velocidad de crecimiento: cm/día. cm/grados·día. �Número de nudos. �Estado del ápice. �Estado de las hojas basales. 5. CRECIMIENTO DE LA BAYA: 50 bayas por tratamiento y repetición. Desde 3 mm de diámetro de la baya (a partir del inicio de envero, está incluido en la tarea 6). Medida semanal. �Peso de la baya. Evolución. 6. SEGUIMIENTO DE MADURACIÓN DE LA BAYA: 100 bayas por tratamiento y repetición. Desde primeras bayas enveradas (< 5% envero). Medida semanal. �Evolución semanal de: Peso de la baya, ATT, pH, Brix. �En pre-envero (< 5% envero): polifenoles totales, taninos y nitrógeno. �En vendimia se completó el análisis de mosto: polifenoles, cationes, ácidos orgánicos, nitrógeno, etc. Y se calculó el porcentaje de pulpa, pepita, hollejo en la baya, y de raspón en el racimo. 7. FISIOLOGÍA: 6 hojas por tratamiento y repetición.

11

7.1. INTERCAMBIO DE GASES. IRGA. En la etapa de maduración Horas: Hora de máxima actividad; Mediodía solar (12hs); 14-15 horas solares. Acompañada de la medida del potencial hídrico foliar. 7.2. ESTADO HÍDRICO FOLIAR. CÁMARA DE PRESIÓN. 2 hojas por tratamiento y repetición. * Fecha: - MÍNIMO: En estados fenológicos determinados: �Floración-Cuajado �Cierre del racimo �Pre-envero �Mitad de maduración �Final de maduración - DESEABLE: Quincenal * Horas de medida: - MÍNIMO: �Hora de máxima actividad; �Mediodía solar (12hs). - DESEABLE: �Antes del amanecer; �Hora de máxima actividad; �Mediodía solar (12hs); �14-15 horas solares. 8. ÁREA FOLIAR: 2 cepas por tratamiento y repetición. Fecha: 2-3 semanas después del envero �Índice de área foliar: LAI (m2· m-2) �Superficie foliar externa: SA (m2· m-2) 9. BIOMASA: �Peso fresco y seco de tallos, hojas y racimos/as. �% del peso fresco y seco de los diferentes órganos respecto del peso total del sarmiento 10. RENDIMIENTO: 5 cepas + 5 cepas por tratamiento y repetición �Rendimiento (kg/m2) �Fertilidad : nº racimos/pámpano �Carga: nº pámpanos/cepa �Peso del racimo (g) fresco y seco �Peso de la baya (g): fresco (peso del hollejo, de las semillas y de la pulpa) y seco. �Peso del raspón (g) fresco y seco �Número de bayas/racimo �Cata. 11. PESO DE MADERA DE PODA: 5 cepas + 5 cepas por tratamiento y repetición �PMP (kg/m2) �Carga: nº pámpanos/cepa �Peso del sarmiento (g) fresco y seco 12. MICROVINIFICACIÓN. ANÁLISIS QUÍMICO Y SENSORIAL: Mínimo dos repeticiones por tratamiento. 13. EVALUACIÓN SEMANAL DEL ESTADO DEL ENSAYO Semanal. Síntesis de la información obtenida semanalmente (tareas de la 1 a la 12, anteriormente citadas) para detectar problemas y para la toma de decisiones razonada. RESULTADOS

12

El grupo de investigación en viticultura de la UPM ha realizado en los dos años de ejecución del proyecto una importante labor en la puesta en funcionamiento del diseño experimental del proyecto. En el caso del vivero se ha encargado de la gestión de la disposición de las plantas y el establecimiento del diseño experimental, tanto en el caso de la temperatura como la disponibilida de agua. En el caso de los viñedos de referencia ha realizado la puesta a punto de los ensayos de riego en las diferentes parcelas. Ha llevado a cabo una completa caracterización de los viñedos en el año 2008 y, durante el 2009, ha realizado las acciones oportunas para mitigar, en lo posible, la variabilidad natural de las parcelas. Se exponen seguidamente los resultados climáticos de las dos primeras anualidades del proyecto que han presentado diferencias importantes. Mientras 2008 fue un año atípicamente frío, con lluvias importantes en primavera, 2009 presento algunas características de cambio climático, como el importante golpe de calor de finales de agosto o la falta de agua durante el proceso de maduración de la uva en alguna de las parcelas experimentales. Régimen de Temperaturas En términos generales 2009 ha sido un año más cálido que 2008. Este hecho se constata con la comparación de la escala de Winkler y Amerine. Tabla 3: Escala de Winkler y Amerine. Comparación años 2008 y 2009

Albariño Tempranillo

Atlan.-Cont. Mediterranea Atlan.-Cont. Mediterranea

2008 1.474 (II) 1.436 (II) 1.084 (I) 1.761 (III)

2009 1.496 (II) 1.676 (III) 1.531 (II) 2.024 (IV)

En todos los viñedos, a excepción del Albariño de la zona Atlántico-Continental, se produce un cambio en la escala de Winkler y Amerine por la mayor acumulación de grados-día. También se observa como se mantienen las diferencias más acusadas a nivel de régimen de temperatura para el caso del Tempranillo. Para el Albariño son menos acusadas pero en el 2009 las diferencias son más marcadas que en 2008. Disponibilidad de agua

En el año 2008 no se pudieron establecer los ensayos de riego. En el caso del Tempranillo porque los viñedos de referencia no disponían de las instalaciones adecuadas, en el caso del Albariño, si bien las parcelas disponían de instalación de riego, el verano fue especialmente fresco y no se dieron las condiciones necesarias para establecer el tratamiento. En 2009 se ha podido realizar el ensayo en todas las parcelas. El inicio de riego se determinó principalmente a través de las manifestaciones de la

13

parada de crecimiento en la cepa y del potencial hídrico foliar medido a mediodía solar (se tomó como valor umbral un potencial hídrico foliar de -1,1 MPa). Tabla 4: Fecha de inicio del riego, cantidad de agua de riego aportada y precipitación durante el ciclo 2009 (Brotación-Vendimia). Inicio del Riego Riego (mm) Precipitación (mm)

Tempranillo

Atlántico-Continental 20 julio

Guisante-Envero 143 143

Mediterráneo 27 julio

Envero 160 229

Albariño

Atlántico.Continental 9 julio

Guisante 109 455

Mediterráneo 24 agosto

Envero 66 174

En el caso del Tempranillo, aunque la precipitación es mayor en la zona Mediterránea el aporte de riego debe ser mayor por la mayor Eto. En el caso del Albariño sorprende que, si bien la precipitación en la zona Atlántico-Continental es superior el riego aplicado también debe ser mayor debido a las características del suelo. 3.2.- ANÁLISIS TRANSCRIPTÓMICO DURANTE EL DESARROLLO Y MADURACIÓN DE LA UVA. RESULTADOS DEL AÑO 2009

Carbonell Bejerano P1; Grimplet J2; Rodríguez V1; Martínez Zapater JM1,2

1Departamento de Genética Molecular de Plantas, Centro Nacional de Biotecnología, CSIC, C/ Darwin 3,

28049 Madrid (www.cnb.csic.es)

2Departamento de Viticultura, Instituto de Ciencias de la Vid y del Vino (CSIC, Universidad de La Rioja,

Gobierno de La Rioja), CCT, C/ Madre de Dios 51, 26006 Logroño (La Rioja) (www.icvv.es)

La viticultura se enfrenta al reto del cambio climático que afecta fundamentalmente a parámetros físicos como la concentración de CO2, la temperatura, el nivel de radiación o la disponibilidad de agua. Entre ellos, la temperatura y la disponibilidad de agua alteran el desarrollo del fruto modificando la cantidad y calidad de las uvas y en consecuencia la calidad del vino. Así, el aumento de temperatura afecta al sabor del vino (acidez), a su aspecto (color) y a su aroma (síntesis de precursores aromáticos). Por ello, el calentamiento global representa un riesgo para la sostenibilidad de la viticultura en muchas regiones vitivinícolas. El conocimiento del proceso de desarrollo y maduración de la baya a nivel genético y molecular y de sus componentes de susceptibilidad y tolerancia a los efectos del cambio climático puede permitir desarrollar nuevas

http://www.cnb.csic.es/

http://www.icvv.es/

14

estrategias de producción, o seleccionar nuevos clones o variedades más adaptadas a las nuevas condiciones climáticas.

Nuestro objetivo en el proyecto DEMÉTER es analizar el efecto de la temperatura y de la disponibilidad de agua en la expresión génica durante el proceso de desarrollo y maduración de la baya. Para ello, estudiamos el comportamiento de las variedades Tempranillo y Albariño en invernadero, bajo condiciones controladas de temperatura y disponibilidad de agua, y en bloques con riego y sin riego en viñedos de referencia en condiciones de clima mediterráneo y atlántico.

MATERIAL Y MÉTODOS En lo que respecta a la puesta en marcha de las herramientas, se ha procedido a la anotación manual de los 23096 juegos de sondas de que consta el GeneChip de GrapeGen (Figura 5) y la información de anotación junto con los links necesarios para acceder a información adicional en bases de datos públicas se ha instalado en una base de datos de acceso web dentro del servidor del CNB-CSIC (http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/grapedb). Concretamente, de los 23096 juegos de sondas o unigenes analizados, se han podido anotar a nivel de función molecular un 76%, mientras que el 24% restante no se ha podido clasificar. Esta herramienta permitirá la rápida recolección de información sobre los genes que cambien de expresión en los experimentos que realicemos con los GeneChips, permitiendo su rápido análisis funcional.

Figura 5

Por otra parte, se ha construido un fichero de anotación en base a cuatro bins o cuatro niveles de agrupación que agrupa las funciones génicas de todos los juegos de sondas anotados en el GrapeGen GeneChip (Figura 6).

http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/grapedb/

15

Figura 6

Figura 7

16

Este tipo de anotación permite el análisis estadístico de los datos funcionales a distintos niveles y su representación gráfica mediante el programa MapMan como se muestra en la Figura 7. Esta información aún no se ha colgado de la página web pero se hará una vez que se valide con datos experimentales.

Los logros obtenidos son por tanto de tipo herramientas de análisis y ha implicado también al Instituto de Investigación Príncipe Felipe.

A lo largo del año 2009 se ha puesto a punto un sistema de muestreo de bayas basado en su estratificación por densidad, se han muestreado uvas en los viñedos de referencia y se ha valorado el sistema de muestreo y el efecto de las condiciones experimentales de riego y no riego en los viñedos. Los resultados indican que el desarrollo y la maduración sacarimétrica de la baya se aceleran en los bloques de déficit hídrico tanto en Tempranillo como en Albariño lo que hace relevante el muestreo estratificado. Los resultados permiten también identificar diferencias de expresión entre bayas de distinto estado de maduración separadas por una media de 2º Brix, clasificadas como pre-maduras, maduras y sobremaduras.

Finalmente, se presentan los primeros resultados del efecto del déficit hídrico en la expresión génica de Tempranillo y Albariño.

En conjunto los resultados muestran la complejidad de las respuestas que pueden observarse en la baya como consecuencia de los múltiples factores de variación que existen en el viñedo y ponen de manifiesto la necesidad de llevar a cabo experimentos en ambientes controlados. Además, las diferencias genéticas existentes entre distintas variedades pueden impedir la extrapolación de conclusiones de unos genotipos a otros y requerir el estudio específico de cada respuesta varietal.

17

Figura 8.- Muestreo 2009. Bayas en el mismo punto de desarrollo fisiológico

MUESTREO

Punto de cosecha

EnveroPreenvero

Sobremadurez

Precosecha

Segunda fecha de muestreo

Primera fecha de muestreo

Tempranillo Z.Atlántico-ContinentalZ. Mediterránea

AlbariñoZ. Atlántico-ContinentalZ. Mediterránea

Figura 9.- Muestreo 2009. Validación del sistema de muestreo por estratificación

ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GÉNICA ABORDADOS SOBRE LAS MUESTRAS DE LA TEMPORADA 2009

Validación del método de muestreo:

Cosecha I (150‐170)Preenvero (< 50)Envero (80‐100)

Precosecha I (130‐150)

Sobremadurez I (170‐190)

Muestreo de envero29‐7‐09

Muestreo de cosecha I25‐8‐09

Muestreo de cosecha II16‐9‐09

4 réplicas biológicas por

estadioR1, R2, S1, S2

32 hibridaciones

• Análisis de la serie de desarrollo y maduración en Tempranillo• Cosecha I (25-8-09) vs Cosecha II (16-9-09)

Cosecha I (150‐170)Precosecha I (130‐150)

Sobremadurez I (170‐190)

Tempranillo Zona Mediterránea

18

Figura 10: Distribución de frecuencias por densidades de bayas de Tempranillo en los bloques de riego y no riego de los viñedos de referencia en el momento de madurez

TEMPRANILLO

Densidad (g NaCl / L)

Frec

uenc

ia (%

)

Viñe

do y

régi

men

híd

rico

Comparación de la distribución de densidades en distintos viñedos de la misma variedad en el momento de madurez

Figura 16: Distribución de frecuencias por densidades de bayas de Albariño en los bloques de riego y no riego de los viñedos de referencia en el momento de madurez

ALBARIÑO

Densidad (g NaCl / L)

Frec

uenc

ia (%

)

Viñe

do y

régi

men

híd

rico

Comparación de la distribución de densidades en distintos viñedos de la misma variedad en el momento de madurez

19

3.3.- RESULTADOS LABORATORIO DEL AROMA Y ENOLOGIA. UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Juan Cacho, Purificación Hernández Orte, Almudena Peña, Natalia Loscos, Laura Mateo, Vicente Ferreira, Paula Herrero y Jorge Cebollada La aplicación de distintas técnicas químico-sensoriales ha permitido en los últimos años, distinguir los compuestos aromáticos con relevancia en el aroma del vino de aquellos otros volátiles que no la tienen (Guth 1997; López et al. 2003) y establecer que como la uva es la mayor fuente de aromas responsables de la calidad y especificidad del vino. Entre los aromas más importantes directamente procedentes de la uva nos encontramos terpenos, particularmente el linalol (Arrhenius, Mccloskey y Sylvan 1996) y el óxido de rosa cis (Guth 1997; Ong y Acree 1999) nor-isoprenoides, particularmente la β-damascenona y la β-ionona (Ferreira, Lopez y Cacho 2000), y el TDN [8], mercaptanos volátiles (4-metil-4-mercaptopentanona, 3-mercaptohexanol, y acetato de 3-mercaptohexilo) (Ferreira et al. 2002; López et al. 2003; Murat, Tominaga y Dubourdieu 2001), compuestos derivados de la oxidación de ácidos grasos, como el conocido c-3-hexenol pero también compuestos como la 1-octen-3-ona y algunas γ y δ-lactosas (Ferreira, Lopez y Cacho 2000; Culleré et al. 2004), distintos derivados del ácido shikímico, como el guaiacol, cresol, vainilla o cinamato de etilo, y un conjunto misceláneo de componentes entre los que se encuentran el Furaneol y homofuraneol (Ferreira et al. 2002) y las alquil-metoxipirazinas (Allen et al. 1998). A diferencia de lo que ocurre en el caso de los terpenos, que son particularmente importantes en las uvas moscatel, el resto de componentes se encuentran en mayor o menor proporción en todas las variedades, como lo demuestran recientes estudios (Ferreira et al. 2002; López et al. 2003; Murat, Tominaga y Dubordeau 2001; Culleré et al. 2004). Los mostos de uvas normales no muestran aromas intensos y definidos, salvo que hayan sufrido procesos de oxidación o de contaminación microbiológica. Sin embargo, en el transcurso de la vinificación y crianza del vino se generan numerosos aromas, muchos de los cuales proceden de una forma relativamente directa de precursores inodoros presentes en la uva. La existencia en frutas de precursores aromáticos que pueden actuar como fuentes de aroma potencial o latente es un hecho reconocido científicamente hace muchos años (Hewitt et al. 1956; Weurman 1961). La glicosidación es la forma más habitual en la que se acumulan los aromas en las frutas, lo que está relacionado con el hecho bioquímico de que la glicosidación es usualmente el último paso de los procesos biosintéticos (Hösel 1981), y la existencia en las uvas de este tipo de precursores está muy bien documentada (Williams et al. 1982; Schneider 2001). Sin embargo, la uva no sólo contiene precursores glicosídicos, sino que contiene formas polihidroxiladas no glicosídicas (Williams, Strauss y Wilson 1980; Puglisi et al. 2001) y más recientemente se han descrito además precursores ligados a la cisteina o al glutatión (Tominaga, Masneuf y Dubordieu 1995; Peyrot des Gachons, Tominaga y Dubordieu 2002). Otras dos importantes familias de aromas son las metoxipirazinas y las lactonas-enolonas polares como Furaneol y homofuraneol. La existencia de metoxipirazinas libres en las uvas es bien conocida (Allen et al. 1998) pero existe un fuerte desfase olfato-gustativo entre la intensidad aromática de estos compuestos en la uva y la que

20

pueden alcanzar en el vino, lo que sugiere la presencia de alguna forma de precursor inodoro. En el caso del Furaneol y homofuraneol, a pesar de haber sido señalados recientemente como moléculas clave en el aroma y sabor de ciertos vinos jóvenes (Ferreira 2002), no se ha señalado su presencia en la uva. Aunque, por analogía con otros productos vegetales como la fresa o el mango, en los que se ha señalado la existencia de un precursor glicosídico (Sakho, Chassagne y Crouzet 1997; Roscher et al. 1996), podría postularse también la presencia de estos precursores en las uvas. La localización y distribución de los precursores en la uva es muy diversa. Los terpenos se acumulan durante la maduración, preferentemente en forma de precursores inodoros (Wilson, Strauss y Williams 1984). La mayor parte de ellos se encuentran en los hollejos (hasta un 70% dependiendo de la variedad), y en su mayor parte lo hacen en forma de precursores, si bien los patrones varían en función de la naturaleza del componente (Gunata et al. 1985; Wilson, Strauss y Williams 1986). La distribución varía en función de la variedad de uva y de la maduración. Algunos autores estimaron que la piel y la pulpa acumulan el 31 y el 59%, respectivamente, del total de monoterpenos de la uva bajo forma de precursores (Park e tal. 1991). Los componentes nor-isoprenoides también se acumulan junto con el azúcar a lo largo de la maduración (Marais et al. 1992; Strauss et al. 1987). Los carotenoides de la uva, de los que proceden, van por el contrario disminuyendo a lo largo de la maduración, como consecuencia de su transformación a precursores nor-isoprénicos, y en el momento de la vendimia, se encuentran concentrados en la piel, no estando presentes en la pulpa [68,69]. Los pocos estudios referentes a la distribución en las distintas partes de la baya de los precursores cisteínicos muestran que también se encuentran preferentemente concentrados en los hollejos. La concentración por unidad de masa es entre 10 y 20 veces superior en el hollejo, lo que en términos absolutos indica que el 60% del total se encuentra en los hollejos (Murat, Tominaga y Dubourdieu 2001b). Respecto a la localización de los aromas en la planta, se sabe que los componentes terpénicos se sintetizan y acumulan de forma mayoritaria en la hoja (Gunata et al. 1986). El patrón de distribución de estos componentes difiere, tal y como han puesto de manifiesto algunos autores (Wirth et al. 2001). En el caso de los terpenos la cantidad de precursores presentes en las hojas es entre 8 y 30 veces más grande que la que se encuentra en la baya. Además, en las hojas predominan formas polihidroxiladas. En el caso de derivados del ácido shikímico la cantidad de precursores en las hojas es hasta 150 veces superior a la encontrada en las bayas, y finalmente, en el caso de los nor-isoprenoides, la cantidad acumulada en las hojas llega a ser 400 veces superior a la encontrada en las bayas. No existe información acerca del contenido de las hojas en precursores cisteínicos. MATERIAL Y MÉTODO El grupo del Laboratorio del Aroma y Enologia realiza el análisis de los grupos de compuestos que figuran en las tabla siguiente: Tabla 4.- Conjunto de determinaciones en uva realizadas por el Laboratorio del Aroma y Enología de la Universidad de Zaragoza PRECURSORES GLICOSÍDICOS

21

Compuestos analizados tras hidrólisis ácida de los precursores

Terpenos (16)

α-terpinoleno, (Z)-óxido de rosa, óxidos de linalol (Z y E), linalol, α-terpineol, β-citronelol, nerol, geraniol, farnesol, óxido nerol, acetato linalol, terpinen-4-ol, 2,6-dimetil-1,7-octadien-3,6-diol, δ-terpineol, ácido nérico.

Norisoprenoides (11)

β-damascenona, β-ionona, vitispiranos A y B, Riesling acetal, TDN, TPB, 3-oxo-β-ionona, actinidoles, norisoprenoide 1*, 3-oxo-α-ionol.

Fenoles volátiles (12)

Guaiacol, o-cresol, 4-etilguaiacol, m-cresol, 4-propilguaiacol, eugenol, 4-etilfenol, 4-vinilguaiacol, 2,6-dimetoxifenol, (E)-isoeugenol, 4-vinilfenol, 4-alil-2,6-dimetoxifenol.

Compuestos analizados tras hidrólisis ácida de los precursores

Vainillas (9)

Vainilla, vanillato metilo, vanillato etilo, acetovanillona, zingerona, homovanillil alcohol, siringaldehido, acetosiringona, ácido homovanillínico.

Bencenos (10)

Benzaldehído, fenilacetaldehido, acetato feniletilo, alcohol bencílico, dihidrocinamato etilo, β-feniletanol, cinamato etilo, 2-fenoxietanol, ácido benzoico, dihidrometileugenol.

Lactonas (6)

(E)-whiskylactona, δ-octalactona, γ-nonalactona, nonalactona, γ-decalactona, δ-decalactona.

Misceláneos (7)

(Z)-3-hexen-1-ol, (E)-2-hexen-1-ol, decanoato etilo, ácidos 2- y 3-metilbutíricos, ácido 2-etilhexanoico, pantolactona.

AMINOÁCIDOS Asparagina, Ácido Aspártico, Serina, Glutatión, Histidina, Glutamina, Glicina Arginina, Treonina, Alanina, Prolina, Ácido g-aminobutírico, Cisteina, Tirosina Valina, Metionina, Ornitina, Lisina, Isoleucina, Leucina, Fenilalanina. RESULTADOS VENDIMIA 2008 MUESTREO DE UVA

22

En la vendimia 2008 el muestreo se realizó según el criterio de las bodegas. Las muestras analizadas por los grupos de investigación en aromas y en polifenoles son las que figuran en la tabla siguiente: Tabla 5.- Relación de muestras de uva enviadas a los grupos de investigación de aromas y polifenoles por las empresas de la línea troncal TEMPRANILLO Zona Atlántico-Continental Zona Mediterránea

punto 1 pre-cosecha 26-9-08 cosecha 30-9-08 punto 2 cosecha 8-10-08 sobremadurez 27-10-08

ALBARIÑO

Martín Códax Miguel Torres pre-cosecha 30-9-08 cosecha 7-10-08

punto 1 30-9-08 R1 7-10-08 BQ1 R cosecha

punto 2 4-10-08 R1 4-10-08 Destacar que a nivel de precursores del aroma no se han encontrado diferencias importantes debidas al grado de madurez de las uvas, ni para el Tempranillo ni para el Albariño. Únicamente en el caso de dos aminoácidos, la isoleucina y la leucina, se observan valores superiores en la uva más madura en la zona Mediterránea. Por otra parte, el año 2008 presentó un periodo de maduración especialmente frío. Tal vez podamos atribuir a esta circunstancia el hecho de que no se encuentren diferencias en el tempranillo de la zona Atlántico-Continental. Figura 6: Evolución de los aminoácidos lisina e isoleucina en el tempranillo de la zona Mediterránea

Tempranillo: Lisina y Isoleucina

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

Lisina IsoleucinaCompuesto

Con

cent

raci

ón (m

g/l)

30 - sep

27 - oct

Comparando zonas sí se encuentran diferencias tanto para el Tempranillo como para el Albariño. En el caso del Tempranillo se encuentran valores superiores de compuestos de la familia de los terpenos en la zona Atlántico-Continental, mientras que en el caso de la zona Mediterránea se encuentran valores superiores de norisoprenoides. También se encuentran diferencias en el contenido de aminoácidos. Para el Tempranillo la mayoría se encuentran en mayor concentración en la zona Atlántico-Continental mientras que, en

23

el caso del Albariño no existen tantas diferencias, encontrándose valores superiores en la zona Mediterránea de glutamina, alanina y prolina. Figura 13.- Análisis de componentes principales para uvas de Tempranillo vendimia 2008 Grupo de Quimiometría de la Universitat Autònoma de Barcelona Figura 14.- Análisis de componentes principales para uvas de Tempranillo vendimia 2008 Grupo de Quimiometría de la Universitat Autònoma de Barcelona

0: verdes 1: maduras 2: sobremaduras

ZONA ATLÁNTICA

ZONA MEDITERRÁNEA

ZONA ATLÁNTICA

ZONA MEDITERRÁNEA

24

3.4.- RESULTADOS GRUPO ANTIOXIDANTES NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DE BARCELONA: UVA ALBARIÑO R. M. Lamuela_Raventos; A. Tresserra; P. Quifera; G. Di Leccec; A. Medina; S. Arranz; C. Andres-Lacuevad; J. Coelloe

aNutrition and Food Science Department, XaRTA, INSA. Pharmacy School, University of Barcelona, Barcelona, Spain; bCIBER CB06/03 Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición, (CIBEROBN), and RETICS RD06/0045/0003. Instituto de Salud Carlos III, Spain; cDipartimento SAIFET, Sez. Scienze e Tecnologie Alimentari, Università Poilitecnica delle Marche, Ancona, Italy.. dIngenio-CONSOLIDER program, FUN-C-FOOD, Barcelona, Spain; e Applied Chemometric Research. Universitat Autònoma de Barcelona. Durante la maduración de la uva, los polifenoles siguen una evolución paralela a los

grados Brix (Keller y Hrazdina, 1998), disminuye la extractabilidad de los taninos,

especialmente los presentes en los hollejos, con la consecuente pérdida de la

astringencia y el amargor a medida que madura la uva (Downey et al, 2006), causada

principalmente por los flavonoides. Sin embargo, la acumulación de los compuestos

fenólicos es más susceptible a las condiciones medioambientales que la de los azúcares

(Keller y Hrazdina, 1998). El efecto varía según la subclase de flavonoides que estemos

evaluando. Se ha observado que los compuestos más sensibles a las condiciones

externas en las variedades blancas son los flavonoles, en el caso de las tintas serán los

antocianos y los mencionados flavonoles.

Diversos factores afectan a la biosíntesis de flavonoides en la planta, tales como la luz,

temperatura, altitud, tipo de suelo, riego, etc..Se ha observado que si la uva, durante la

maduración, está sometida a unas condiciones climáticas demasiado extremas puede

ocurrir que la baya tenga una nivel de azúcares adecuado (grados Brix ), en cambio los

polifenoles no presentan una maduración óptima, dando lugar a vinos con unas

características sensoriales de vino poco maduro o verde.

Efecto de la temperatura:

El efecto de la temperatura parece ser mayor en los flavonoles. La exposición a la

radiación UV incrementa los niveles de flavonol-glicósidos en los tejidos vegetativos y

reproductivos. Incluso no se llegan a detectar dichos compuestos (Downey et al 2006)

cuando provocamos intencionadamente que no haya exposición a la luz solar

25

El riego

La disminución del riego aumenta la concentración de flavonoles, antocianinos y

procianidinas en la piel de la uva

En este trabajo nos centraremos en el efecto de la temperatura o zona climática (T –

zona cálida- y MC –zona fría-) y en el efecto del riego en una variedad blanca española,

el Albariño, durante dos vendimias 2008 y 2009.

MATERIAL Y MÉTODOS

Polifenoles totales

Los polifenoles totales fueron determinados siguiendo la metodología propuesta por

Roura et al 2004; Medina-Remón et al., 2009 convenientemente modificada para el

análisis de polifenoles en las diferentes partes de la baya (piel, pulpa y semilla).

Determinación de polisacáridos

Siguiendo los métodos propuestos por Segarra et al. (1995), los polisacáridos son

precipitados con etanol y medio ácido y, posteriormente, los ácidos y los totales son

cuantificados espectrofotométricamente. Los neutros se obtienen por diferencia

Determinación de proteínas

Para la determinación del contenido en proteína se utilizó el método de Bradford, el cual

se basa en la unión de las proteínas con el colorante Coomassie Blue, con un máximo de

absorción a 595 nm, y cuyo valor de absorbancia es directamente proporcional a la

cantidad de proteínas de la muestra. Las concentraciones de proteínas de las muestras se

extrapolan de la recta de calibrado y se expresan en mg de albúmina/L de muestra.

Pérfil fenólico

Los compuestos fenólicos determinaron y cuantificaron mediante cromatografía líquida

de alta eficacia (HPLC) en muestras de uvas de la variedad Albariño, procedentes de

dos zonas climáticas distintas (T– zona cálida- y MC –zona fría) y con distinto grado de

maduración.

Los compuestos fenólicos de las diferentes partes (pieles, pulpas y semillas) de las

muestras de bayas fueron separados por cromatografía en fase reversa de alta resolución

26

y detectados e identificados por ultravioleta mediante la comparación del espectro de

absorción y el tiempo de retención de cada uno de los patrones que forman el perfil

fenólico del vino. La cuantificación se realizó a partir de las rectas de calibrado

construidas previamente con los patrones utilizando concentraciones conocidas. Los

compuestos que no tenían solución patrón se cuantificaron por extrapolación, utilizando

las rectas de calibrado de compuestos semejantes. Todos los compuestos identificados

fueron previamente referenciados bibliográficamente (Betés-Saura et al. 1996; Ibern-

Gómez et al, 2002).

Las longitudes de onda (λ) características de cada una de las distintas familias de

compuestos fenólicos facilitaron la identificación y cuantificación de los compuestos

fenólicos. Así, los ácidos benzoicos (ácido gálico), los flavanoles (epicatequina,

catequina y epicatequín galato) y sus oligómeros las procianidinas fueron analizadas a

280nm; los ácidos hidroxicinámicos (cafeico, cumárico, ferúlico y derivados) a 320nm

y los flavonoles (quercetina, kanferol y sus conjugados ) a 365nm.

RESULTADOS

Respecto a la zona climática (vendimia 2008) En la Figura 1a y 1b se muestran los

resultados de polifenoles totales obtenidos para la variedad Albariño, en las dos zonas

vitivinícolas consideradas. Las semillas presentan unos valores más elevados de

polifenoles que las pieles y las pulpas, que son las que presentan menor contenido

polifenólico. En la Figura 1a se muestran los resultados de las tres partes estudiadas,

mientras que en la figura1b solo resultados de las pieles y pulpas para poder observar la

diferencias entre ambas zonas climáticas. En la zona Atlántico-Continental disponemos

de dos puntos de muestreo, con dos grados de maduración diferentes.

27

Se realizó una prueba de Levene para la igualdad de varianzas y una prueba T para la

igualdad de medias con un 95% de intervalo de confianza, utilizando el programa

estadístico SPSS versión 14.0.

Según la prueba de Levene (P>0.05) solo existen diferencias significativas entre las

varianzas en el caso de las pieles, por lo tanto, en estas muestras no se asumen varianzas

iguales en la prueba T para la comparación de medias para muestras independientes,

Zona memediterránea Zona atlántico-continental

Figura 1a - Polifenoles totales en piel, pulpa y semilla

Zona mediterránea Zona atlantico-continental

Figura 1b - Polifenoles totales en piel y pulpa

28

mientras que para el resto (pulpa y semilla), se asumen varianzas iguales en la prueba T

para la comparación de medias para muestras independientes.

Una vez realizada la prueba T para la comparación de medias; en las pieles y semillas

P<0.05 por lo tanto existen diferencias estadísticamente significativas entre el

contenido de polifenoles totales en las muestras de la zona cálida y las de la zona fría.

La zona fría presenta un mayor contenido de polifenoles en pieles y pepitas; mientras

que en las pulpas P>0.05 por lo tanto no existen diferencias estadísticamente

significativas en el contenido de polifenoles de las mismas. Sin embargo tal como

detallaremos más adelante al analizar los polifenoles individualmente si que se observan

diferencias eentre zonas climáticas.

Se han buscado diferencias entre las concentraciones de los compuestos de la uva de

zona mediterránea T y zona fría MC

La comparación entre los valores de clima mediterráneo versus clima continental, se ha

realizado con una prueba t, teniendo en cuenta si las desviaciones estándar (s) de cada

grupo de datos eran iguales o diferentes. Se ha utilizado un nivel de significación α =

0,05

Mientras que con la concentración de polifenoles totales en pulpa no se observaban

diferencias estadísticamente significativas, en MC la concentración de polifenoles

individuales es significativamente mayor que en T.

Polisacáridos:

El contenido de polisacáridos es significativamente mayor en la pulpa de uva de T

que en la de MC.

Prótidos:

No hay diferencias significativas entre T y MC.

Polifenoles individuales:

También se ha realizado el análisis multivariable de los polifenoles individuales. Datos

autoescalados. Dos componentes principales explican el 90% de la variabilidad (ver

figura 2a y 2b).

29

Figura 2a

Figura 2b

30

Los datos de la Zona Atlántica están claramente separados de los de la Zona Mediterránea y con una dispersión mucho mayor. En la Figura “B se muestran las variables (compuestos polifenólicos) que han tenido una mayor peso en esta diferenciación. Efectos del riego en los polifenoles (vendimia 2009) El comportamiento de los fenoles no es igual para las partes sólidas que para la uva; sin embargo se observa una mayor contenido de fenoles totales en la zona de riego que en la de no riego. Figura 3a- Efecto del riego (vendimia 2009). Resultados de la suma de fenoles totales

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

e n m ad sm ad e n m ad sm ad

n o r ie g o r ie go

p u lp a

µg uva‐

1

Conclusiones

- La zona climática influye en el contenido de polifenoles de la uva de la variedad Albariño

31

- El riego afecta al contenido de polifenoles. - Es necesario repetir esta experiencia en varias vendimias para observar si los

resultados son reproducibles

Agradecimientos: Al proyecto CENIT-DEMETER, Subvencionado por CDTI y a las empresas colaboradoras. Bibliografía Betés-Saura C, Andrés-Lacueva C, Lamuela-Raventós RM. Phenolics in white free run juices and wines from Penedès by high-performance liquid chromatography: changes during vinification. J. Agric.Food Chem 1996; 44:3040 Downey MO, Dokoozlian, NK, Krstic MP. Cultural practices and environmental impacts on the flavonoid composition of grapes and wines. A review of recent reserach Am. J. Enol. Vitic. 2006 57:257 Ibern-Gómez M, Andrés-Lacueva C, Lamuela-Raventós R.M., Waterhouse A.L. Rapid HPLC analysis of phenolic compounds in red wines. Am. J. Enol. Vitic. 2002 53:3. Keller, M., Hrazdina, G.Interaction of nitrogen availability during bloom and light intensity during veraison. II. Effects on anthocyanin and phenolic development during grape ripening. Am. J. Enol. Vitic.. 1998, 48: 341-349. Medina-Remón A, Barrionuevo-González A, Zamora-Ros R et al. Rapid Folin-Ciocalteu method using microtiter 96-well plate cartridges for solid phase extraction to assess urinary total phenolic compounds, as a biomarker of total polyphenols intake. Analytica Chimica Acta 2009; 634:54-60. Roura E, Andres-Lacueva C, Estruch R, Lamuela-Raventos RM. Total polyphenol intake estimated by a modified Folin-Ciocalteu assay of urine. Clin Chem 2006; 52:749-52. Segarra I, Lao C, Lopez-Tamames E, De La Torre-Boronat MC. Spectrophotometric methods for the analysis of polysaccharide levels in winemaking products. Am J Enol Vitic 1995;46:564-70.

32

3.5.- RESULTADOS GRUPO DE INVESTIGACIÓN EN POLIFENOLES DE LA UNIVERSIDAD DE SALAMANCA. TEMPRANILLO 2008

M. T. Escribano-Bailón; M. García-Marino; J. C. Rivas-Gonzalo

Grupo de Investigación en Polifenoles. Laboratorio de Nutrición y Bromatología. Facultad de Farmacia.

Universidad de Salamanca. Campus Miguel de Unamuno. 37007 Salamanca, España. e-mails:

[email protected] ; [email protected] ; [email protected]

RESUMEN Los análisis llevados a cabo en las uvas permiten determinar el potencial fenólico disponible, si bien la técnica de vinificación será lo que finalmente establezca el contenido fenólico de los vinos. Según los resultados obtenidos, el potencial fenólico de las muestras de uva procedentes del viñedo VR (zona Atlántico-Continental), en el punto de recogida de madurez, es mayor que el de las muestras procedentes del viñedo VT (zona Mediterránea). No obstante, el menor contenido en flavanoles de las primeras podría conducir a vinos con menor astringencia. Las muestras recogidas en el segundo punto de muestreo en ambos viñedos se caracterizan por una pérdida de material fenólico, marcada por el importante descenso en el contenido en antocianos. El comportamiento desde el punto de vista fenólico de las muestras de uva recogidas en madurez en el viñedo VR es muy próximo al comportamiento de las muestras de uva recogidas en sobremadurez en el viñedo VT.

El perfil antociánico y la eficacia del efecto de la copigmentación se revelan de gran importancia a la hora de definir las características cromáticas de los vinos. Así, las muestras de vino obtenidas partir de las uvas VRM ( zona Atlántico-Contiental, punto de madurez tecnológica) presentan mayor contenido en antocianos, en concordancia con el mayor potencial antociánico observado en las uvas; pero la cromaticidad (cantidad de color) de los mismos es menor de lo que cabía esperar de acuerdo con este contenido. Esto se pone especialmente de manifiesto en las medidas teóricas de cromaticidad que corresponderían a los vinos en ausencia de copigmentación. La elevada tasa de copigmentación que presentan estos vinos (más del 50%) aumenta considerablemente la cantidad de color de los mismos, mostrando así su eficacia. Las muestras de vino obtenidas a partir de las uvas VTM (zona Mediterránea, punto de madurez tecnológica) presentan menor contenido en antocianos pero mayor cromaticidad que las muestras obtenidas partir de las uvas VRM. Proponemos como la causa más probable, las diferencias en el perfil antociánico observadas. Asimismo, en estas muestras el efecto de la copigmentación tiene menor repercusión sobre la cromaticidad, ya que no se observan diferencias significativas entre la cromaticidad teórica de los vinos sin copigmentar y de los vinos copigmentados.

INTRODUCCIÓN

mailto:[email protected]



33

La determinación de la fecha óptima de vendimia sigue siendo hoy motivo de preocupación en las bodegas. El seguimiento de la madurez tecnológica permite disponer de información sobre el grado alcohólico probable y acidez; pero la elaboración de vinos de calidad precisa no sólo de una adecuada proporción de azúcares y ácidos, sino también niveles apropiados de compuestos fenólicos y aromáticos. Los compuestos fenólicos de la uva son responsables del color, flavor, cuerpo y estructura de los vinos tintos. Estos compuestos no evolucionan de la misma manera que los azúcares durante la maduración y generalmente su concentración máxima no coincide con la máxima concentración de azúcares (Maujean et al., 1983).

Además, este desfase entre madurez tecnológica y fenólica se hace cada vez más marcado como consecuencia del cambio climático, dando lugar a vinos desequilibrados, demasiado amargos o astringentes, con colores pobres o irregulares (Zamora, 2006, Bergqvist et al., 2001). Se han llevado a cabo numerosos estudios que describen las modificaciones que sufre la uva durante la maduración en cuanto a contenido en azúcar, ácidos y compuestos fenólicos (Harbertson et al., 2002; Ryan y Revilla, 2003). En general, en estos estudios se realizan determinaciones poco específicas de polifenoles totales (método de Folin-Ciocalteau, determinación de la absorbancia a 280 nm, etc.) junto con la determinación espectrofotométrica del contenido en antocianos. No obstante, durante la maduración existen patrones de evolución desiguales para las diferentes familias fenólicas por lo que se hace necesario seguir profundizando en el tema con el objetivo de llegar a conocer cómo incide el cambio climático en la composición fenólica de las uvas y del vino y las repercusiones sobre la estabilidad del color.

El color de un vino tinto joven depende, en gran medida, de su composición en antocianos, cuya inestabilidad constituye un factor intrínseco que afecta con el tiempo al color, el cual cambia desde el rojo-azulado de los tintos jóvenes hasta el anaranjado-pardo de los muy envejecidos. Como consecuencia de su reactividad, los antocianos del vino desaparecen gradualmente, a la vez que se forman nuevos pigmentos más estables, que son los responsables finales del color del vino envejecido. En este sentido, los procesos de copigmentación pueden favorecer una posterior asociación covalente que daría lugar a la formación de compuestos de condensación entre antocianos y las moléculas que actúan como copigmento (Brouillard y Dangles, 1994). Asimismo, estos procesos podrían afectar a la mayor o menor extracción de compuestos fenólicos durante las primeras etapas de la vinificación (Boulton 2001).

En disoluciones acuosas o hidroalcohólicas, como es el vino, los antocianos existen bajo diversas formas estructurales en equilibrio condicionado por el pH (Figura 1). Dentro de éstas, sólo los cationes flavilio, predominantes a pH muy ácidos, poseen color rojo (Brouillard, 1982), por lo que al pH del vino (3,2 a 4,0) la mayor proporción de antocianos se encuentra en formas incoloras o débilmente coloreadas.

34

Figura 1.- Equilibrios de los antocianos en función del pH.

Sin embargo, el vino no es simplemente una disolución hidroalcólica a un pH relativamente ácido, y por consiguiente poco coloreada. La existencia de procesos de copigmentación explica el mantenimiento del color rojo en los vinos tintos jóvenes, donde los antocianos son todavía los responsables primarios del color.

35

Este fenómeno comporta la asociación preferencial y no covalente de las formas coloreadas de los antocianos (cationes flavilio rojos y/o bases anhidras azuladas) con otros compuestos, fenólicos o no, para formar complejos de apilamiento vertical, mantenidos por enlaces de baja energía (Van der Waals, interacciones hidrofóbicas) y que se estabilizan por disposición de las moléculas de azúcar en la parte externa, entre las cuales se establecen uniones por puentes de hidrógeno (Figura 2).

Figura 2. Esquema de los complejos de copigmentación

Las moléculas de agua no pueden acceder al interior de estos complejos y, de este modo, se evita la hidratación de los antocianos y su decoloración, haciendo que los equilibrios se desplacen hacia las formas coloreadas de los antocianos. Esto tiene como consecuencia normalmente el incremento de color, que se vuelve algo más violáceo. Como copigmentos pueden actuar sustancias de origen diverso: flavonoides (incluyendo los propios antocianos), aminoácidos, ácidos orgánicos, polisacáridos, etc., que no tienen que ser necesariamente coloreadas, pero que deben poseer o poder adoptar una configuración planar para poder asociarse con los antocianos (Brouillard et al., 1990; Dangles y Brouillard, 1992).

Este tipo de interacciones de baja energía explica la intensidad de color y variedad de matices que presentan flores y frutos, en intervalos de pH donde los antocianos son normalmente incoloros, pero se pensaba que no eran importantes en el vino, debido a la relativamente baja concentración de antocianos (en comparación con la existente en medios vacuolares) y al efecto destructor que el alcohol posee sobre los complejos de copigmentación. Sin embargo, numerosos ensayos experimentales han comprobado su viabilidad en sistemas modelo que reproducen las condiciones físico-químicas del vino.

El objetivo del trabajo que se presenta es el estudio de la composición fenólica detallada de uvas y vinos de la variedad Tempranillo procedentes de viñedos situados en dos zonas climáticas diferentes, zona continental y zona mediterránea, que podrían ser representativas del cambio climático. Este trabajo se enmarca dentro de la propuesta CENIT-DEMETER que plantea conocer el efecto del cambio climático en el proceso de maduración de la baya y en la calidad del vino de manera integral y evaluar el efecto paliativo que pueden tener distintas técnicas vitivinícolas.

antocianoGlu

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

antociano Glu

copigmento

copigmento

copigmento

antocianoGlu

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

antociano Glu

copigmento

copigmento

copigmento

copigmentocopigmento



36

MATERIALES Y MÉTODOS Muestras. Se disponía de muestras de uvas Vitis vinifera de la variedad Tempranillo procedentes de viñedos de Bodegas Roda y de Bodegas Torres, situados en zona climática continental (VR) y en zona climática mediterranea (VT) respectivamente. En el viñedo VT se realizaron dos tomas de muestra: en el momento de madurez tecnológica (30/09/2008) (VTM) y en sobremadurez (27/10/2008) (VTS). En el viñedo VR las muestras se recogieron antes de madurar (26/09/2008) (VRP) y en madurez tecnológica (08/10/2008) (VRM). Las muestras de uva se recogieron por triplicado.

Asimismo, se disponía de muestras de vino correspondientes a la vinificación por triplicado de las uvas recogidas en el momento óptimo de madurez en los dos viñedos anteriormente señalados. Las muestras se obtuvieron al final de la fermentación alcohólica, se sulfitaron y estabilizaron en nevera durante tres semanas antes de proceder a su análisis.

Extracción y aislamiento de compuestos fenólicos. En las uvas, las semillas y los hollejos se separaban manualmente. Los compuestos fenólicos del hollejo se extrajeron mediante una disolución MeOH/HCl (0.1%). Las semillas fueron extraídas con MeOH/H2O (75:25). El aislamiento de flavanoles y ácidos fenólicos del hollejo y de los vinos se llevó a cabo de acuerdo con García-Marino et al., 2006.

Análisis HPLC-DAD-MS. El análisis de compuestos fenólicos se llevó a cabo en un cromatógrafo líquido de alta eficacia Hewlett-Packard serie 1100, y la detección se hizo mediante un detector de diodos. En la separación cromatográfica de los flavanoles y de los ácidos fenólicos se utilizó una columna C18 de fase reversa Spherisorb® S3 ODS-2, 3 μm, 150 × 4,6 mm (Waters, Ireland) termostatizada a 25ºC. En la de antocianos y flavonoles se usó una columna C18 de fase reversa Aqua®, 5 μm, 150 × 4.6 mm (Phenomenex, Torrance, CA, USA) termostatizada a 35ºC.

Las condiciones cromátográficas utilizadas en el análisis de flavanoles y ácidos fenólicos fueron las siguientes. Eluyentes: (A) ácido acético 2,5%, (B) ácido acético 2,5%-acetonitrilo (90:10, v:v), y (C) acetonitrilo de grado HPLC (Merck, Darmstad, Germany). Se estableció el siguiente gradiente de elución: desde 0 a 100% de B durante 5 min, desde 0 a 15% de C durante 25 min, desde 15 a 50% durante 5 min, e isocrático 50% de C durante 5 min, con un flujo de 0,5 mLmin-1. La detección se llevó a cabo a 280 nm (flavanoles) y 330 nm (ácidos fenólicos).

Las condiciones cromátográficas utilizadas para el análisis de antocianos y flavonoles fueron las siguientes. Eluyentes: (A) una solución acuosa (0,1%) de ácido trifluoroacético (TFA) (Merck, Darmstad, Germany) y (B) acetonitrilo 100% de grado HPLC, estableciendo el siguiente gradiente de elución: isocrático 10% de B durante 3 min, desde 10 a 15% de B durante 12 min, isocrático 15% de B durante 5 min, desde 15 a 18% de B durante 5 min, desde 18 a 30% de B durante 20 min, y desde 30 a 35% de B durante 5 min, a un flujo de 0,5 mLmin-1. La detección se llevó a cabo a una longitud de onda de 520 nm (antocianos) y 360 nm (flavonoles).

El análisis por ESI-MS se realizó con un detector de masas FinniganTM (Thermoquest, San Jose, CA, USA) equipado con una fuente API mediante ionización por electroespray (ESI). El sistema HPLC estaba conectado al espectrómetro de masas a través de la célula de salida del DAD. Tanto el gas envolvente como el gas auxiliar eran

37

nitrógeno. Las condiciones del espectrómetro para la identificación de los diferentes polifenoles se recogen en la tabla 1. Los espectros fueron almacenados en modo positivo y negativo entre m/z 120 y 1500. El espectrómetro de masas fue programado para hacer series de 3 registros consecutivos: un espectro de masas completo, un registro MS2 del ión más abundante en el primer espectro y un MS3 del ión más abundante en el espectro MS2. La energía de colisión utilizada era de 45%.

Tabla 1. Condiciones de análisis del espectrómetro de masas para la identificación de los compuestos fenólicos de los vinos estudiados.

Condiciones del método para la identificación de compuestos

fenólicos en vinosANTOCIANOS FLAVANOLES ÁCIDOS

FENÓLICOS

Flujo del gas envolvente (Lmin-1) 1.2 1.2 1.2Flujo del gas auxiliar (Lmin-1) 6 6 6

Fuente de voltage (kV) 4.50 4.50 2.50Voltaje del capilar (V) 26 11 -10

Temperatura del capilar (ºC) 195 200 175

La cuantificación se llevó a cabo a partir de rectas de calibrado obtenidas a partir de patrones de: antocianos (monoglucósidos de delfinidina, cianidina, petunidina, peonidina y mavidina), flavonoles (miricetina, quercetina y kampferol), flavanoles ((+)-catequina, (+)-galocatequina, dímero B2, trímero (epicatequina-4,8-epicatequina-4,8-catequina) y ácidos fenólicos (ácido 3,4-dihidroxibenzoico, ácido 4-hidroxicinamico). Los antocianos fueron adquiridos en Polyphenols Labs., Sandnes, Noruega. Miricetina, kamferol y (+)-galocatequina en Extrasynthèse, Genay, Francia. Quercetina, (+)-catequina, ácido 3,4-dihidroxibenzoico y ácido 4-hidroxicinamico en Sigma, Steinheim, Alemania. Las procianidinas dímera y trímera fueron obtenidas en nuestro laboratorio siguiendo Escribano-Bailón et al., 1992.

El contenido total de los diferentes grupos de compuestos fenólicos fueron calculados a partir de las suma de las concentraciones obtenidas para cada compuesto individualmente.

Cálculo de la extensión del efecto de copigmentación. La contribución del fenómeno de la copigmentación a la absorbancia a 520 nm de los vinos (% copigmentación) fue calculada según el método propuesto por Boulton 2001, usando un espectrofotómetro Hewlett Packard UV-vis HP-3853.

Análisis colorimétrico de los vinos. Se obtuvo el espectro de absorción de cada vino entre las longitudes de onda 380-770 nm, con intervalo de 1nm utilizando células de cuarzo de 2 mm de paso óptico. Para obtener los valores triestimulares recomendados por la Comission Internationale de l'Éclairage (Melgosa et al., 1997) se utilizó el observador standard CIE 1964 10º y el iluminante CIE D65. Los parámetros CIELAB de Luminosidad (L*), Tono (hab), coordenadas rojo-verde (a*, -a*) y amarillo-azúl (b*, -b*) y Croma (C*

ab) se obtuvieron mediante el software CromaLab® Heredia et al., 2004.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En la figura 3 se presenta el contenido global de antocianos (mg/Kg uva) en los hollejos de las muestras de uva analizadas. Las muestras maduras correspondientes al viñedo

38

situado en la zona climática continental (VRM) tienen mayor contenido en antocianos que las procedentes del viñedo situado en la zona climática mediterranea (VTM). Por otra parte, en los dos viñedos se observa la misma tendencia, disminución del contenido de antocianos, en la segunda fecha de recogida (VTS y VRM) respecto a la primera fecha de recogida (VTM y VRP, respectivamente).

Figura 3. Contenido global de antocianos (mg/Kg uva) en los hollejos de las muestras de uva analizadas.

En relación al contenido en flavonoles, también las muestras procedentes del viñedo VR presentan mayor contenido que las muestras procedentes del viñedo VT y al igual que en los antocianos, existe la misma tendencia en el segundo muestreo, en relación al primero, en los dos viñedos. Si bien en el caso de los flavonoles, la tendencia no era la misma que la observada en los antocianos ya que el contenido en flavonoles tiende a aumentar (Figura 4).

Figura 4. Contenido global de flavonoles (mg/Kg uva) en los hollejos de las muestras de uva analizadas.

Uvas-Ensayos Clima Mediterraneo/ Continental

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

Total Glucosilados Acilados

mg/

kgd

e uv

a (P

igm

ento

s)

VTM VTS VRP VRM


0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500


mg/

kgd

e uv

a (P

igm

ento

s)

VTM VTS VRP VRM

0

100

200

300

400

500

600

Total D. Miricetina D. Quercetina D. Isorhamnetina

mg/

kgd

e uv

a (F

lavo

nole

s)


VTM VTS VRP VRM

0

100

200

300

400

500

600


mg/

kgd

e uv

a (F

lavo

nole

s)


VTM VTS VRP VRM

39

El contenido de ácidos fenólicos y flavanoles no parece evidenciar el mismo comportamiento. Por una parte, son las muestras procedentes del viñedo de clima mediterráneo (VT) las que presentan mayor contenido. Por otra, la tendencia observada en ambos viñedos en relación a las distintas fechas de muestreo no es la misma (Figura 5).

Figura 5. Contenido global de ácidos fenólicos (superior) y flavanoles (inferior) expresados en mg/Kg uva presentes en los hollejos de las muestras de uva analizadas.

No obstante, cuando se lleva a cabo un análisis de componentes principales (PCA) normalizado, con las variaciones de los valores correspondientes a los contenidos de flavanoles y de ácidos fenólicos de los hollejos de las muestras analizadas, se observa que las muestras recogidas en madurez en el viñedo representativo de clima continental se encuentran muy próximas, incluso

superpuestas, a las muestras recogidas en sobremadurez en el viñedo representativo de clima mediterráneo (marcado en la figura 6 con flechas). Esto parece indicar que el comportamiento desde el punto de vista fenólico de las muestras de uva recogidas en madurez en el viñedo VR es muy próximo al comportamiento de las muestras de uva recogidas en sobremadurez en el viñedo VT.

0

20

40

60

80100

120140

160

Total H. benzoicos H. cinámicos

mg/

kgde

uva

(Á

cido

s Fen

ólic

os) H

olle

jo


VTM VTS VRP VRM

0

50

100

150

200

250

Total Procianidinas Prodelfinidinas

mg/

kgde

uva

(Fl

avan

-3-o

les)

Hol

lejo


VTM VTS VRP VRM

0

20

40

60

80100

120140

160


mg/

kgde

uva

(Á

cido

s Fen

ólic

os) H

olle

jo


VTM VTS VRP VRM

0

20

40

60

80100

120140

160


mg/

kgde

uva

(Á

cido

s Fen

ólic

os) H

olle

jo


VTM VTS VRP VRM

0

50

100

150

200

250


mg/

kgde

uva

(Fl

avan

-3-o

les)

Hol

lejo


VTM VTS VRP VRM

0

50

100

150

200

250


mg/

kgde

uva

(Fl

avan

-3-o

les)

Hol

lejo


VTM VTS VRP VRM

40

Figura 6. Representación de las muestras de hollejo analizadas en relación al contenido de ácidos fenólicos (izquierda) y de flavanoles (derecha) en el plano definido por las

componentes principales PC1 y PC2.

También el contenido en flavanoles de las semillas de uva apunta en el mismo sentido. Como se observa en la figura 7, la tendencia en ambos viñedos en el segundo muestreo con relación al primero, es la misma. Asimismo, al igual que ocurría con los flavanoles de los hollejos, las muestras maduras procedentes del viñedo VT tienen mayor contenido que las procedentes del viñedo VR.

Figura 7. Contenido global de flavanoles expresados en mg/Kg uva presentes en las semillas de las muestras de uva analizadas.

Como se muestra en la figura 8, de acuerdo con el mayor contenido en antocianos presente en las uvas procedentes del viñedo VR, los vinos elaborados a partir de estas uvas presentan mayor contenido en antocianos que los vinos elaborados con las uvas del viñedo VT. Asimismo, el contenido medio de monoglucósido de malvidina en aquellos vinos es sensiblemente mayor.

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

Total No Galoilados Galoilados

mg

/kg

de

uva

(Fla

van-

3-ol

es)

Sem

illa


VTM VTS VRP VRM

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

Total No Galoilados Galoilados

mg

/kg

de

uva

(Fla

van-

3-ol

es)

Sem

illa


VTM VTS VRP VRM

41

Figura 8. Contenido de antocianos (mg/L de vino) en las muestras de vino analizadas. 1: delfinidina 3-glucósido. 2: cianidina 3-glucósido. 3: petunidina 3-glucçosido. 4: peonidina 3-glucósido. 5: malvidina 3-glucósido. 6: acetato de malvidina 3-glucósido. 7: cumarato de delfinidina 3-glucósido. 8: cumarato de petunidina 3-glucósido. 9: cumarato de peonidina 3-glucósido. 10: cumarato de malvidina 3-glucósido.

El resto de familias de compuestos fenólicos analizados (flavonoles, flavanoles y ácidos fenólicos) tienden a encontrarse en mayor cantidad en los vinos procedentes de las uvas VTM que en los procedentes de las uvas VRM (Figura 9). Hay que señalar que en las catas llevadas a cabo, los vinos procedentes de las uvas VTM presentaban mayor astringencia (datos no mostrados) que los procedentes de las uvas VRM, lo que está en concordancia con el mayor contenido en flavanoles encontrado en aquellos vinos.

Figura 9. Contenido de flavonoles (superior izquierda), flavanoles (superior derecha) y ácidos fenólicos (inferior) expresado en mg/L de vino, en las muestras de vino

analizadas.

Los resultados obtenidos en la determinación del grado de copigmentación (% Copigmentación) se encuentran en la figura 10. Destaca el mayor valor en el porcentaje

0

200

400

600

800

1000

1200

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mg/

L d

e vi

no (P

igm

ento

s)Vinos-Ensayos Clima Mediterraneo/ Continental

VTM VRM

0

500

1000

1500

2000

2500


mg/

L d

e vi

no (P

igm

ento

s)

Vinos-Ensayos Clima Mediterraneo/ Continental

VTM VRM

0

200

400

600

800

1000

1200

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mg/

L d

e vi

no (P

igm

ento


VTM VRM

0

200

400

600

800

1000

1200

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mg/

L d

e vi

no (P

igm

ento


VTM VRM

0

500

1000

1500

2000

2500


mg/

L d

e vi

no (P

igm

ento

s)


VTM VRM

0

500

1000

1500

2000

2500


mg/

L d

e vi

no (P

igm

ento

s)


VTM VRM

0

50

100

150

200

250


mg/

L d

e vi

no (F

lavo

nole

s)


VTM VRM

020406080

100120140160180200220


mg/

L d

e vi

no (Á

cid

os F

enól

icos

)


VTM VRM

0

100

200

300

400

500

600

700

800


mg/

L d

e vi

no (F

lava

nole

s)


VTM VRM

0

50

100

150

200

250


mg/

L d

e vi

no (F

lavo

nole

s)


VTM VRM

0

50

100

150

200

250


mg/

L d

e vi

no (F

lavo

nole

s)


VTM VRM

020406080

100120140160180200220


mg/

L d

e vi

no (Á

cid

os F

enól

icos

)


VTM VRM

020406080

100120140160180200220


mg/

L d

e vi

no (Á

cid

os F

enól

icos

)


VTM VRM

0

100

200

300

400

500

600

700

800


mg/

L d

e vi

no (F

lava

nole

s)


VTM VRM

0

100

200

300

400

500

600

700

800


mg/

L d

e vi

no (F

lava

nole

s)


VTM VRM

42

de copigmentación obtenido para las muestras de vino procendentes de las uvas VRM. Este hecho apunta en el sentido de una posible mayor estabilidad del color durante la maduración y envejecimiento del vino.

Figura 10. Porcentaje de copigmentación en las muestras de vino analizadas.

Hay que señalar, que estos vinos mostraban mayor contenido de antocianos totales aunque menor contenido de flavanoles (considerados los principales copigmentos de los antocianos en los vinos). Esto nos hace pensar que la copigmentación observada en estos vinos (en la etapa en la que se ha llevado a cabo el estudio, es decir, fin de fermentación alcohólica) sea en gran medida consecuencia de un fenómeno de autoasociación (copigmentación homomolecular) entre los propios antocianos más que de un fenómeno de copigmentación heteromolecular (como sería el caso de la copigmentación antociano-flavanol). En este sentido, en ensayos previos realizados en nuestro laboratorio (González Manzano 2007), se puso de manifiesto que malvidina 3-monoglucósido autoasocia mejor que otros antocianos presentes en el vino. Hay que recordar que este antociano se encontrtaba en mayor proporción en los vinos procedentes de uvas VRM que en los procedentes de uvas VTM.

En relación a los parámetros de color CIELAB, como se puede observar en la figura 11, las muestras presentan una tonalidad (hab) rojo-azulada. El valor del croma (C*ab), parámetro que puede ser interpretado como cantidad de color, es más elevado en las muestras de vino procedentes de las uvas VTM. Hay que señalar que aunque estos vinos presenten un contenido en antocianos menor, el pH ligeramente inferior de los mismos, podría explicar este dato. En concordancia con la mayor cantidad de color, estos vinos son más oscuros (menor valor de L*).

0

10

20

30

40

50

60

% C

opig

men

taci

ón


VRMVTM

0

10

20

30

40

50

60

% C

opig

men

taci

ón


VRMVTM

43

Figura 11. Parámetros colorimétricos CIELAB L*, hab y C*ab, correspondientes a las

muestras de vino estudiadas.

En la siguiente gráfica (Figura 12) se presentan los parámetros colorimétricos obtenidos igualando el pH de los vinos a pH 3,6. Cab*20 es el valor teórico de croma que correspondería a esos vinos si no existiera copigmentación. Como puede observarse, los vinos procedentes de las uvas VRM y VTM tienen, en las mismas condiciones de pH, la misma cantidad de color (C*ab). Sin embargo, el croma que correspondería a esos vinos si no existiera copigmentación, es significativamente menor en los procedentes de uva VRM que en los que proceden de la uva VTM. Esto explicaría por qué, a pesar de que el valor obtenido en el cálculo de la copigmentación es mayor en los vinos procedentes de uva VRM que en los procedentes de uva VTM, no existen diferencias significativas en el valor del croma a pH 3,6.

Figura 12. Parámetros colorimétricos CIELAB L*, hab y C*ab, correspondientes a las

muestras de vino a pH 3,6. Cab*20 es el valor teórico de cromaticidad que correspondería a los vinos sin copigmentación.

AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen al MICINN la financiación a través del protecto Cenit DEMETER. Asimismo, agradecen al Dr. Jordi Coello la realización del análisis de componentes principales.

-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

L*

C*ab

hab

Parámetros colorimétricos al valor de pH del vino


VTM pH 3,7 VRM pH 3,8

-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

L*

C*ab

hab

Parámetros colorimétricos al valor de pH del vino


VTM pH 3,7 VRM pH 3,8

-10

0

10

20

30

40

50

60

L* C*ab Cab*20 hab

Col

or p

H3,

6


VTMVRM

-10

0

10

20

30

40

50

60

L* C*ab Cab*20 hab

Col

or p

H3,

6


VTMVRM

44

REFERENCIAS - Bergqvist, J., Dokoozlian, N., Ebisuda, N. 2001. Sunlight exposure and temperature

effects on berry growth and composition of Cabernet Sauvignon and Grenache in the Central San Joaquin Valley of California. Am. J. Enol. Vitic. 52: 1-7.

- Boulton, R. 2001. The copigmentation of anthocyanins and its role in the color of red wine: A critical. Review. Am J Enol Vitic. 2001. 52: 67-87.

- Brouillard, R. (1982). Chemical structure of anthocyanidins. En Anthocyanins as food colors (Markakis, P., ed.). Academic Press, N. York. p. 1-40.

- Brouillard, R.; Dangles, O. 1994. Anthocyanin molecular interactions: the first step in the formation of new pigments during wine aging? Food Chem., 51, 265-271.

- Brouillard, R.; Wigand, M.C.; Cheminat, A.1990. Loss of colour, a prerequisite to plant pigmentation by flavonoids. Phytochemistry, 29, 3457-3460.

- Dangles, O.; Brouillard, R. 1992. A spectroscopic method based on the anthocyanin copigmentation interaction and applied to the quantitative study of molecular complexes. J. Chem Soc. Perkin Trans 2, 247-257.

- Escribano-Bailón, M.T.; Gutierrez-Fernandez, Y.; Rivas-Gonzalo, J.C.; Santos-Buelga, C. 1992. Characterization of procyanidins of Vitis vinifera variety Tinta del Pais grape seeds. J. Agric. Food Chem. 40: 1794-1799.

- García-Marino, M.; Rivas-Gonzalo, J.C.; Ibanez, E.; Garcia-Moreno, C. 2006. Recovery of catechins and proanthocyanidins from winery by-products using subcritical water extraction. Anal. Chim Acta. 563: 44-50.

- González Manzano, S. 2007. Antocianos y flavanoles en uvas y vino. Influencia de la composición en los procesos de copigmentación y estabilidad del color. Tesis doctoral. Universidad de Salamanca.

- Harbertson, J.F.; Kennedy, J.A.; Adams, D.O. 2002. Tannin in skins and seeds of Cabernet Sauvignon, Syrah, and Pinot noir berries during ripening. Am. J. Enol. Vitic. 53:54-59.

- Heredia, F.J. Álvarez, C. Gonzalez-Miret, M.L. Ramirez, A. 2004. En, CromaLab, análisis de color. Registro General de la Propiedad Intelectual SE-1052-04, Sevilla, Spain.

- Maujean, A., Brun, O. Vesselle, G., Bureau, G Boucher, J.M. Cousin, M. 1983. Etude de la maturation des cépages champenois. Modèles de prévision de la date de vendange. Vitis. 22: 137–150.

- M. Melgosa, M. Hita, E. Poza, A.J. Alman, D.H. Berns, R.S. 1997. Suprathreshold color-difference ellipsoids for surface colors Color Res. Appl., 22: 148-155.

- Ryan, J.M.; Revilla, E 2003. Anthocyanin composition of Cabernet Sauvignon and. Tempranillo grapes at different stage of ripening. J. Agric. Food Chem. 51: 3372-3378.

- Zamora, F. 2006. El cambio climático; una amenaza para nuestra vitivinicultura. Enólogos. 39: 28-31.

45

AGRADECIMIENTOS Este trabajo forma parte de la línea troncal del Proyecto CENIT-DEMÉTER financiado por el CDTI dentro del Programa Ingenio 2010.

Documents

P 18-22 Torres-Lissarrague-Martínez-Cacho-Lamuela-Escribano DEMÉTER