1

เอกสารประกอบการสอนวชา เคมคลนก 1 (Clinical Chemistry) เรอง Oxidative stress and adverse human health effects สาหรบนกศกษาคณะเทคนคการแพทย มหาวทยาลยรงสต

โดย อ. ปราณรตน แสงเกษตรชย

วตถประสงค เพอใหนกศกษา 1. ทราบถงความหมาย ทมาของภาวะถกออกซไดซเกนสมดลโดยอนมลอสระ 2. ทราบถงภาวะถกออกซไดซเกนสมดลโดยอนมลอสระตอการเกดโรค 3. ทราบถงกระบวนการปองกนอนตรายและความเสยหายทเกดจากภาวะถกออกซไดซเกน สมดลโดยอนมลอสระ 4. ทราบถงคาบงชหรอดชนชวภาพสาหรบชวดภาวะถกออกซไดซเกนสมดลโดยอนมลอสระ

  2

ภาวะถกออกซไดซเกนสมดลโดยอนมลอสระตอการเกดโรค Oxidative stress (ภาวะถกออกซไดสเกนสมดล) ภาวะถกออกซไดสเกนสมดล คอ ภาวะของความไมสมดลระหวางการเกดอนมลอสระ และกระบวนการปองกนอนตรายจากอนมลอสระในเซลลหรอรางกายโดยเอนไซมและสารตานออกซเดชน ทาใหมอนมลอสระและสารเกยวของทเปนผลตผลของอนมลอสระอนมความไวและอนตรายสงในปรมาณทสงมากเกนกวาทกระบวนการปองกนจะตานทานไวได ทาใหเซลล เนอเยอ เมมเบรนถกคกคาม จากการถกออกซไดส และเมอถกออกซไดสเซลลจะบาดเจบและถกทาลาย สาเหตสาคญททาใหเกดภาวะถกออกซไดสเกนสมดลม 2 สาเหต คอ 1) ความบกพรองของกระบวนการปองกนอนตรายจากการเกดออกซเดชน โดยมสาร

antioxidants ลดลง, เอนไซมททาหนาตานการเกดปฏกรยาออกซเดชนมปรมาณลดลง หรอการ

ทางานผดไปจากปกต ซงสาเหตของการเกดความบกพรอง ไดแก การกลายพนธซงมผลทาให

ความสามารถของเอนไซมในการทาหนาทตานออกซเดชน เชน Superoxide dismutases,

Glutathione peroxidase ทางานบกพรองหรอสญเสยการทางาน หรอมการใชหรอสญเสยสาร

antioxidants ทอยในกระบวนการปองกนอนมลอสระ เชน กลตาไทโอน(GSH) วตามนซ วตามนอ

ลดลงหรอหมดไปดวยสาเหตตางๆ รวมถงการขาดสารอาหาร และแรธาต เชน Zn2+ Mg2+ Fe2+

Co2+ Se2+ และสารตานออกซเดชนจากธรรมชาต เชน สารประกอบโพลฟนอลและฟลาโวนอยส

  2) มการเกดหรอผลตอนมลอสระและสารเกยวของทเปนผลตผลของอนมลอสระเพม

มากขน เชน การทรางกายไดรบออกซเจนมากเกนไป หรอมการกระตนระบบทสรางอนมลอสระ

เชน ในภาวะทมการอกเสบแบบเรอรง (phagocyte จะถกกระตนทาใหเกดอนมลอสระและผลตผลท

เกยวของจานวนมากมผลทาใหเกดความเสยหายและการถกทาลาย)

อนตรายจากภาวะถกออกซไดสเกนสมดล สามารถแบงเปนระดบตามความรนแรงจากนอยไป หามากไดดงน

ก) การปรบตวของเซลล ซงมไดหลายกรณ ตงแตสามารถปองกนและซอมแซมความ

เสยหายไดสมบรณ หรอปองกนไดในระดบหนงแตไมสมบรณ หรออาจเกดการปองกนมากเกนไป

เชน เซลลปรบตวทนตอภาวะออกซเดชนสงๆ ได

ข) การบาดเจบของเซลลและเนอเยอ ชวโมเลกลเปาหมายทไวตอการถกออกซไดสโดย

อนมลอสระและสารเกยวของ และมผลกระทบสง ไดแก ลพด โปรตน และดเอนเอ

  3

ค) การตายของเซลลและเนอเยอ ในสภาวะการเกดออกซเดชนหากเซลลไมสามารถ

ซอมแซมและมชวตอยได เซลลจะตายในทสด โดยมกลไกการตายทงในแบบ apoptosis และ

necrosis

ภาวะถกออกซไดซเกนสมดลโดยอนมลอสระตอการเกดโรค

การทรางกายไมสามารถกาจดอนมลอสระภายในรางกายไดหรอกาจดไดไมเพยงพอจนเกดภาวะ“oxidative stress” กเปนสาเหตกอใหเกดโรคตางๆมากมาย เชน ภาวะผนงเสนเลอดแดงหนาและมความยดหยนนอยลงเนองจากการสะสมไขมนทผนงหลอดเลอด ทาใหหลอดเลอดตบตนเกดภาวะขาดเลอดชวขณะทสมอง และหวใจ, โรคมะเรง, โรคซงเกยวกบการเสอมของประสาท เชน โรคอลไซเมอรและโรคพารกนสน, ภาวะแทรกซอนจากโรคเบาหวาน, ภาวะการตดเชอททาใหเกดกระบวนการอกเสบ และกระบวนการชราภาพ (aging process) เปนตน

1) โรคหวใจและสมองขาดเลอด

อนมลอสระทาใหเกดภาวะหวใจและสมองขาดเลอดจากการเกด lipidperoxidation แลวทาใหหลอดเลอดผดปกตอกเสบและอดตน เกดภาวะขาดเลอดชวขณะในระยะแรก และเมอมเลอดกลบไปเลยงใหมทาใหสภาพทางชวเคมของเซลลเปลยนไปทาใหมอนมลอสระเกดขนทวคณ และทาหนาทสอสญญาณในวถทางตางๆททาใหเซลลตายอนเปนสาเหตของการเกดโรค - ภาวะขาดเลอดชวขณะในระยะแรก การทเซลลขาดออกซเจนและพลงงานอนเนองจากภาวะหลอดเลอดตบตนมผลใหมการหลง glutamate เพมขน แลวจบกบ NMDA/ AMPA receptor จะทาใหมแคลเซยมเขาสเซลลเพมขน ทาใหเกด nitric oxide เพมสงขนมาก, ไมโตคอนเดรยถกทาลาย นอกจากนยงกระตนเอนไซม protease และ phospholipase ซงทาใหเกดอนมลอสระดงรป

รปแสดงภาวะขาดเลอดชวขณะในระยะแรก (Ischemia)

  4

- ภาวะมเลอดและออกซเจนกลบมาเลยงเซลลใหม (Reperfusion) ก) กระตนใหมการสรางอนมลซปเปอรออกไซดแอนอออนจานวนมาก เนองจากการใช ATP ไปเปนจานวนมากในขณะขาดเลอดและไมสามารถเปลยนกลบคนเปน ATP ไดจงทาใหถกเผาผลาญกลายเปนไฮโปแซนทนและแซนทน ซงสารทง 2 ชนดนเปนออกซเจนซบสเตรท ข) กระตนกระบวนการอกเสบทาใหเซลลในระบบภมคมกนหลดลอดจากหลอดเลอด และปลอยสาร cytokines (TNF, IL-1) และทาใหเกดอนมลอสระขนได

รปแสดงภาวะมเลอดและออกซเจนกลบมาเลยงเซลลใหม (Reperfusion)

2) โรคมะเรง

โรคมะเรงเปนโรคทเกดจากความไมสมดลของรางกายระหวางการแบงตวและเปลยนสภาพของเซลลกบการตายและการมอายของเซลล กลไกสาคญ 2 กลไกทเหนยวนาใหเกดมะเรงคอ (ก) สารกอมะเรงทาใหมการสรางดเอนเอและการแบงตวเพมขนเปนสาเหตใหเกดการกอการกลาย

พนธในการแบงตวของเซลลเนองจากเกดการซอมแซมทบกพรอง (ข) ความไมสมดลระหวางการเจรญเตบโตและการตายของเซลลเมอเซลลมดเอนเอทเสยหายจะมกระบวนการกาจดเซลลนนๆ ท

เรยกวา apoptosis (กลไกการฆาตวตายตามโปรแกรมทวางไว) โดยม โปรตน p53 ททาหนาทสาคญในการตรวจสอบความถกตองของดเอนเอทสรางขนในระหวางการแบงเซลล หากพบวาเซลลมความผดปกต โปรตน p53 จะสงสญญาณใหเกด apoptosis เพอทาลายเซลลทผดปกตนนๆ ซงถาหาก apoptosis ผดปกต เชน ในกรณทกระบวนการตายไมทางานกจะเกดการแบงตวของเซลลเกดเปนเซลลจานวนมากอนเปนสาเหตของโรคมะเรง กลาวไดวาโรคมะเรงเกดจากความบกพรองในระบบควบคมระหวางแฟกเตอรทควบคมการทาหนาทของ โปรตน p53 และแฟกเตอร

ททาหนาทยบยง ผปวยมะเรงสวนมากมความผดปกตของยนสทควบคมการทาหนาทของ โปรตน

  5

p53 และแฟกเตอรททาหนาทยบยง นอกจากเรองแฟกเตอรตางๆซงเปนสอสญญาณแลว ในดานชวโมเลกลพบวามยนส 2 ประเภท คอ ยนสทกระตนการแบงเซลล หรอ อองโคยนส (oncogene) และยนสทยบยงมะเรง (tumor suppressor gene) อนมลอสระสามารถทาใหเกดการกลายพนธของ

โปรตน p53 ซงการกลายพนธของ โปรตน p53 พบมากกวาครงในคนทเปนมะเรง และจากการทอนมลอสระมบทบาทสาคญในการเกดมะเรง จงมการใชสารตานอนมลในการปองกนและรกษามะเรง สารตานอนมลปองกนและรกษามะเรงดวยกลไกตางๆ ไดแก (ก) ชวยใหการควบคมวงจร

ของเซลลเปนไปอยางปกต (ข) ยบยงการเพมจานวนของเซลลและกระตนการทาลายเซลล (ค)

ยบยงการแพรกระจายและการสรางเสนเลอดของเซลลมะเรง (ง) ลดกระบวนการอกเสบ

รปแสดงความสมพนธระหวางระยะการเกดมะเรงกบระดบของภาวะถกออกซไดส เกนสมดล

3) โรคความผดปกตในระบบประสาท

โรคทางสมองและระบบประสาททสาคญทเปนผลเนองมาจากอนมลอสระ และภาวะบบคนจากการถกออกซไดส ไดแก

- โรคอลไซเมอร (Alzheimer’s disease, AD) เกดจากการทเซลลประสาทในสมองถกทาลายซงมสาเหตสาคญ 2 ประการคอ (ก) เนองมาจากการสะสมของเสนใยฝอยประสาท (NFT) ทเซลลประสาทโดยโปรตน tau ถกเตมฟอสเฟตมากเกนไปทาใหเกด microtubules ทผดปกตแยกออกจากกนแลวโปรตน tau จงหลดออกจาก microtubules และพนรวมตวกนเปนแผน neurofibrillary tangles (NFT) ทาใหไมสามารถทางานสอประสาทได (ข) การสะสมรวมตวของ

  6

โปรตนเบตาเอมลอยด(Aβ) ทเกดจากการทโปรตนเอพพ (amyloid precursor protein (APP)) ถกเอนไซม secretase ยอย แลว Aβ รวมกลมกนเปนเปนแผนของเสนใยไฟเบอร

รปแสดงสาเหตของการเกดโรคอลไซเมอร

บทบาทของอนมลอสระ (ROS) ททาใหเซลลประสาทตายในโรคอลไซเมอร โดยอนมลอสระทเกดจากสาเหตตางๆ เชน ความแก สมองบาดเจบ และไมโตคอนเดรยผดปกต สามารถกระตนเอนไซม secretase ใหยอยโปรตน APP เปนAβ แลวเมอมารวมกลมกนจะเกดเปนแผนเสนใยโปรตนขดขวางการสอประสาท และไปจบทเมมเบรนของไมโตคอนเดรย ทาใหไมโตคอนเดรยทางานผดปกตกอใหเกดอนมลอสระ ROS ทเกดขนจากหลายปจจยไปทาปฏกรยากบชวโมเลกลในเซลล ทาใหโปรตน ลพด และดเอนเอ เสยหายและตาย นอกจากน ROS ยงกระตนเอนไซม protein kinases ทาใหเกดการเตมหมฟอสเฟตแกโปรตน tau มากขน ทาให microtubules แตกออก โปรตน tau หลดออกมาจบรวมตวเปนเสนใยประสาท (NFT)

รปแสดงบทบาทของอนมลอสระ (ROS) ในโรคอลไซเมอร

  7

จากการท Aβ กระตนทาใหมอนมลอสระเกดขน อนมลอสระจะเกดปฏกรยากบโมเลกลทเปนองคประกอบสาคญในเซลลไดแก ลปด โปรตนและดเอนเอ โดยเฉพาะเมอเกดออกซเดชนทดเอนเอ ทาใหดเอนเอเปลยนแปลงไปหรอเกดการกลายพนธ ในผปวยโรคอลไซเมอรพบวามการกลายพนธของดเอนเอทใชในการสงเคราะหเอนไซม SOD-1 ซงเปนเอนไซมททาหนาทกาจดอนมลอสระโดยเปลยนอนมลซปเปอรออกไซแอนอออนใหเปนไฮโดรเจนเปอรออกไซด การกลายพนธทาใหมเอนไซม SOD-1 ในปรมาณทมากกวาปกต ไมสมดลกบเอนไซมคาตะเลส และเอนไซมกลตาไทโอนเปอรออกซเดส ททาหนาทสลายไฮโดรเจนเปอรออกไซดใหเปนนาทาใหมการสะสมของไฮโดรเจนเปอรออกไซด และเกดปฏกรยา Fenton ไดอนมลไฮดรอกซทมพษแรงขน ดงรป

นอกจากน เอนไซม รเซพเตอร และสารสอประสาทลวนมโครงสรางเปนโปรตน เมอถกออกซไดสหรอไดรบอเลกตรอนทาใหโครงสรางโปรตนเปลยนไปมผลทาใหการทางานผดปกต กรณของผปวยอลไซเมอรในกระบวนการสรางเอนไซมโคลนอะซตลทรานซเฟอเรสทพบบรเวณซนแนพมคณสมบตเปลยนแปลงไป จากความผดปกตทกลาวมาทาใหปรมาณสารสอประสาทอะซตลโคลนในผปวยอลไซเมอรลดลง เปนผลทาใหเกดอาการความจาเสอม

ตารางแสดงเอนไซมตานออกซเดชนและดชนชวดภาวะถกออกซไดสเกนสมดลในผปวยอลไซเมอร

เอนไซมตานออกซเดชนและดชนชวด Plasma Superoxide dismutase

Glutathione peroxidase Thiobarbituric acid – reactive substances Malondiadehyde 4 – Hydroxynonenal Isoprostanes

↓ ↓

↔, ↑

↑, ↔

↑ ↑↔

Urine Isoprostanes ↑ ↑ = เพมขนเมอเปรยบเทยบกบกลมควบคม ↓ = ลดลงเมอเปรยบเทยบกบกลมควบคม ↔ = ไมเปลยนแปลง

  8

- โรคพารกนสน (Parkinson’s disease, PD) เกดจากการตายของเซลลประสาทและการเกด Lewy bodies ซงเปนโปรตนททบถมในเซลลประสาท ทาใหไปรบกวนการทางานของสมองรวมถงการสงผานสารสอประสาท เชน อะซตลโคลน และ โดพามน และยงพบวาในเซลลสมองบรเวณซบสแตนเชยไนกรา ของผปวยโรคพารกนสนขาดกลตาไทโอนและปรมาณธาตเหลกเพมขน การขาดกลตาไทโอนทาใหไนตรกออกไซดเกดปฏกรยากบโปรตนคอมเพลก-1 ในไมโตคอนเดรย ทาใหไมโตคอนเดรยทางานไดลดลง มการสรางเอทพลดลง เอทพมความสาคญในการสอสารระหวางเซลลบรเวณซนแนพ เมอมปรมาณเอทพลดลงจงทาใหสญเสยการทางานของเซลลประสาทบรเวณซนแนพและทาใหเซลลประสาทตาย สวนการเพมขนของเหลกทบรเวณไนการทาใหเกดปฏกรยาออกซเดชนทผดปกตของโดปามน เกดการสราง 6-hydroxy dopamine หรอ dopamine – quinone ขนมาสารทงสองเปนพษตอเซลลประสาทโดยทาใหเกดภาวะบบคนจากการถกออกซไดสเมอเกดภาวะบบคนจากการถกออกซไดสทาใหกระบวนการทางชวเคมเปลยนไปทาใหเกดการตายของเซลลประสาท

4) ภาวะแทรกซอนเนองจากโรคเบาหวาน ผปวยสวนใหญทเปนโรคเบาหวานมกจะมอาการ peripheral neuropathy ซงอาจเกดจากภาวะ oxidative stress ทาใหเกดสารพษคอ advanced lipoxidation end products ซงเรยกวา glycotoxin ซงสามารถเขาไปจบกบโปรตนฮโมโกลบนซงอยในเมดเลอดทาใหทางานไมได เมดเลอดนนกจะไมสามารถนาพากาซออกซเจนไปใหเซลลตางๆของรางกายทาใหเกดการทาลาย sensitive tissues นอกจากนยงเขาไปสะสมในหลอดเลอดทดวงตาทาใหจอประสาทตาเสอม ถาเขาไปสะสมในเสนประสาททาใหเสนประสาทเสอม และเขาไปสะสมในเนอเยอของไตทาใหหนวยไตทางานไมได เปนตน

  9

5) ภาวะการตดเชอททาใหเกดกระบวนการอกเสบ

องคประกอบในเมดเลอดขาวจะจบกบเอนไซม NADPH oxidase ทาใหเกดอนมลอสระภายนอกเซลลเพมมากขน สวนการเกดอนมลอสระภายในเซลลเปนผลตอเนองมาจากการสราง

cytokines ในกระบวนการอกเสบ การรวออก และการเกดพษจากα-TNF, IL-1 ซงการเกดอนมลในปรมาณมากสงผลทาใหเนอเยอเสยหายอยางมาก ในภาวะชอก cytokines จะถกกระตนกอใหเกดอนมลอสระ เชน O2

- แลว O2-ทาปฏกรยา

กบไนตรกออกไซด ทเกดจาก phagocytes ในระบบภมคมกนไดเปนสารพษ ONOO- (เปอรออกซไนไตรท) ความเปนพษของ ONOO- ไดแก 1)ไทโรซนตาแหนงท 34 ของ MnSOD ถกเตมหมไนโตรทาใหหนาทในการสลายอนมล O2

-เสยไป มผลทาใหมอนมลเพมขน 2)glutamate transporter ถกเตมหมไนโตรทาใหเสยหายไมสามารถขนสงจากซนเนปไปยงเซลลประสาทซงมเอนไซมสลาย glutamate ใหเปน glutamine ซงไมเปนพษ 3)ไทโรซนตาแหนงท 430 ของเอนไซมพรอสตาไซคลน ถกเตมหมไนโตรทาใหการทางานของเอนไซมนเสยไป ซงเอนไซมนมบทบาทสาคญในกระบวนการสรางสารยอยลมเลอด และสารสอททาใหหลอดเลอดคลายตว

6) กระบวนการชราภาพ

อนมลอสระมบทบาทใน cell signaling หรอ cell transduction ซงเปนกลไกทางชววทยาในการทเซลลจะตดตอกนเพอประสานกนในการทางานหรอเกดสงสญญาณใหรถงสภาวะภายนอกเซลล อนทาใหเกดการตอบสนองคอสงเรา เชน สารพษ สารสอประสาท และเชอโรค หรอควบคมการทางานของเซลลหรอรางกายเพอใหเกดความสมดล อนเปนกลไกในการปองกนโรคและแกไขความผดปกตทเกดขนในเซลลและรางกาย พบวาเซลลหลายชนดเมอถกกระตนโดย cytokines,

  10

growth factor และ hormone จะเกดการสรางอนมลอสระในปรมาณตาๆใชในการเหนยวนาและสอสญญาณเกยวกบการเจรญเตบโต การแบงเซลลและการเปลยนแปลงของเซลลเพอไปทาหนาทตางๆ โดยเฉพาะมความสาคญในวถการสอสญญาณ MAPK (mitogen-activated protein kinase) ซงอนมลมบทบาทสาคญในการควบคม MAPK ซงแบงเปน 4 ชนด คอ ERK (extracellular regulated kinase) JNK (c-jun-NH2-terminal kinase) p38MAPK และ B MAPK-1 โดยอนมลอสระจะไปกระตนเอนไซม MAPK ทเกยวของในการสงสญญาณของ cytokines และ growth factor เพอจบกบ receptor แลวเกดการสรางอนมลซงทาหนาทเปนสารสอทสองทาหนาทสอสารขอมลจากสภาวะภายนอกเซลลไปยง cytoplasm และ nucleus ทาใหเกดการทางานและกระบวนการตางๆ ภายในเซลล เชน การแบงเซลล การเปลยนสภาพของเซลลเพอไปทาหนาทตางๆ การทาลายตวเองหรอกระบวนการอกเสบ เปนตน

รปแสดงบทบาทของอนมลอสระตอการสอสญญาณในวถ MAPK

  11

กระบวนการตายแบบ apoptosis ม 3 กลไก คอ 1) เกดจากการสอสญญาณภายใน 2) เกดจากการสอสญญาณจากภายนอก และ 3) เกดจากการสอสญญาณโดน AIF-1 (apoptosis inducing factor-1) ซงอนมลเกยวของกบกระบวนการตายโดยกลไกแบบแรก คอ เกดจากการสอสญญาณภายใน เมอเกดความเสยหายภายในเซลลโดยอนมลจะสงผลใหโปรตน Bcl-2 ซงอยท mitochondria membrane ดานนอกกระตนโปรตน Bax ทาใหเกดรท mitochondria membrane ดานนอกเปนสาเหตให cytochrome C ไหลออกมาและไปจบกบโปรตน APAF-1 (apoptotic protease activating factor-1) ทาใหเกดการรวมกลมกนเปน apoptosome ไปจบและกระตนการทางานของเอนไซม protease คอ เอนไซมคาสเปส-9 ซงไปกระตนเอนไซมคาสเปส-3 และคาสเปส-7 ทาใหเกดการยอยโปรตนทเปนโครงสรางของเซลลและการทาลายดเอนเอ และการกลนกนของเซลลตามลาดบ กระบวนการปองกนอนตรายทเกดจากภาวะถกออกซไดซเกนสมดลโดยอนมลอสระ โดยธรรมชาตแลวจะมอนมลอสระเกดขนในเซลลและรางกายหลายชนด มทงทเปนประโยชนและใหโทษ เซลลและรางกายจะเปนอนตรายและเสยหายหากมอนมลอสระในปรมาณมากเกนสมดลซงเรยกวาภาวะ “oxidative stress” ดงนนรางกายจงมกลไกเพอควบคมปรมาณอนมลอสระไมใหสงจนเกดอนตราย กลไกสาคญททาหนาทควบคมปรมาณอนมลอสระมกลไกหลกอย 3 กลไกททาหนาทลดผลกระทบทเปนอนตรายของอนมลอสระตอเซลลโดยในสภาวะปกตกลไกเหลานถอวาเพยงพอตอการรกษาปรมาณอนมลอสระใหอยในสมดลได แตอยางไรกตามหากเกดภาวะผดปกตททาใหกลไกการปองกนเหลานบกพรองไมสามารถทจะควบคมภาวะสมดลได จะนาไปสการเกดโรคตางๆขนในรางกาย กลไกทสาคญททาหนาทควบคมปรมาณอนมลอสระใหอยสมดลมดงนคอ

1. เอนไซม ในระดบเซลลเอนไซมเปนกลไกสาคญขนแรกทาหนาทควบคมปรมาณอนมลอสระใหอยในสมดล เอนไซมทสาคญ ไดแก

- เอนไซมซปเปอรออกไซดดสมวเตส (SOD) เอนไซม SOD จะทาหนาทขจดอนมลอสระ

เรมตนทเกดขนในรางกาย คออนมลซปเปอรออกไซดแอนอออน (O2-) โดยเรงปฏกรยาดสมวเตส

ในการเปลยนอนมล O2- ใหเปนไฮโดรเจนเปอรออกไซด

2 O2-+ 2H+ SOD H2O2 + O2

ไฮโดรเจนเปอรออกไซดจะถกกาจดตอโดยเอนไซมคาตาเลส และเอนไซมกลตาไทโอนเปอรออกซเดส เอนไซม SOD ในรางกายมหลายไอโซฟอรม (Mn-SOD, CuZn-SOD) แตลกษณะโครงสรางทสาคญของเอนไซม SOD ทกชนดคอ มโลหะทรานซชนทใชจบ substrate ทาใหเกด

  12

วงจรของปฏกรยา oxidation และ reduction นอกจากนเอนไซม SOD ยงทาหนาทปกปองเอนไซมในกลมดไฮเดรส ไดแก เอนไซมไดไฮโดรแอซดดไฮเดรส, เอนไซมอะโคไนเตส, เอนไซมฟอสโฟกลโคเนตดไฮเดรส, เอนไซมฟมาเรส-เอ และ เอนไซมฟมาเรส-บ ไมใหเอนไซมเหลานถกอนมลซปเปอรออกไซดแอนอออนทาลาย

- เอนไซมคาตาเลส (CAT) ทาหนาทเปลยนไฮโดรเจนเปอรออกไซดเปนโมเลกลของนาและออกซเจน โดยใน 1 นาทสามารถเปลยนไฮโดรเจนเปอรออกไซด 1 ลานโมเลกลเปนนาและออกซเจน

2 H2O2 + 2H+ CAT 2 H2O + O2

- เอนไซมกลตาไทโอนเปอรออกซเดส (GPx) จะมธาตซลเนยมเปนองคประกอบสาคญอยในโครงสรางของเอนไซมทาหนาทเรงปฏกรยา reduction ของสารประกอบไฮโดรเปอรออกไซด ซงไดแก ลพดเปอรออกไซด (ROOH) และไฮโดรเจนเปอรไซด โดยมการ oxidized กลตาไทโอน

(GSH) รวมในปฏกรยาดวยเปนการสลายไฮโดรเจนเปอรออกไซดไมใหเกด fenton reaction ซง

เปนปฏกรยาลกโซ เอนไซมนปกปองเซลลของสตวเลยงลกดวยนมไมใหถกทาลายหรอเสยหายจากภาวะทรางกายถกออกซไดสหรอมอนมลอสระมากเกนไป

2 H2O2 + 2GSH GPx GSSG + H2O

ROOH + 2GSH GPx ROH + GSSG + H2O เอนไซม GPx ทสาคญในสตวเลยงลกดวยนมมอย 5 ไอโซฟอรม ไดแก GPx1, GPx2,

GPx3, GPx4 และGPx5 แตระดบปรมาณของแตละไอโซฟอรมจะแตกตางในเนอเยอแตละชนดและ GPx ทง 4 ไอโซฟอรมแรกทกลาวมาเปน GPx ททางานขนกบซลเนยม ยกเวน GPx5 พบเฉพาะททอนากามและเปนไอโซฟอรมทการทางานไมขนกบซลเนยม

-เอนไซมไทโอรดอกซนรดกเตส (TR) ทาหนาทเปลยนไทโอรดอกซนใหอยในรปรดวซโดยม NADPH เปนตวใหอเลกตรอน ไทโอรดอกซนมบทบาทในการควบคมแฟกเตอรทเกยวของกบการถอดรหสเชนเดยวกบกลตาไทโอนซงมผลตอการเพมจานวนและการตายของเซลล

TR – S2 + NADPH + H+ → TR – (SH)2 + NADP+ (1)

Thioredoxin – S2 + TR (SH)2 → thioredoxin – (SH)2 + TR – S2 (2)

NET Thioredoxin – S2 → thioredoxin – (SH)2

  13

2. สารตานอนมลอสระ

สารตานอนมลอสระ เปนคาศพททแปลมาจากคาวา antiradical ซงปจจบนคาศพทนไดถกบญญตใหมเปนสารขจดหรอกาจดอนมล (radical scavenger) เพอใหถกตองตรงกบการทางาน และอาจใชคาวา antioxidant แทน ตวอยางสารแอนตออกซแดนททพบในรางกายแตไมจดเปนเอนไซม ไดแก Albumin, Bilirubin, Uric acid, Glutathione, Ceruloplasmin,

Transferrin, Haptoglobin, Hemopexin และ Cysteine เปนตน สวนสารแอนตออกซแดนททพบในอาหารและไมจดเปนเอนไซม ไดแก Ascorbic acid, Tocopherols, β-carotene และ polyphenolics เชน Flavonoids เปนตน

- สารแอนตออกซแดนททพบในรางกายแตไมจดเปนเอนไซม สวนใหญสามารถทาปฏกรยากบอนมลอสระโดยตรงเพอกาจดอนมลใหหมดไป

- สารแอนตออกซแดนททพบในอาหารและไมจดเปนเอนไซม เชน วตามนซ, วตามนอ, เบตาแคโรทน และฟลาโวนอยด เปนตนวตามนซเบตาแคโรทน จะสามารถหยดปฏกรยาลกโซของการเกดอนมล โดยเฉพาะมบทบาทสาคญในการทาใหลพดเปอรออกซเดชนสนสดลง ตวอยางสารแอนตออกซแดนททสาคญ

- วตามนซ (Ascorbic acid) มคณสมบตละลายนาไดด จงทาหนาทตานอนมลอสระในเซลลและอวยวะทมนาเปนองคประกอบหลก วตามนซมความสมพนธกบวตามนอโดยทาหนาทเปลยนวตามนอในรปอนมลใหกลบเปนวตามนอดงเดม ดงนนวตามนซในรางกายทอยในรป AscH จะใหอเลกตรอน 1 ตว เมอใหอเลกตรอนไปแลวจะอยในรปอนมลแอสคอรเบท (AscH-) ซงมคา pK เทากบ -0.86 ซงตากวา pH ของรางกายจงไมถกโปรโตเนต แตจะใหไฮโดรเจนและเปลยนเปนอนมลเซมดไฮโดรแอสคอรเบท (Asc-) ปฏกรยาโดยรวมคอการใหอเลกตรอน 1 ตว รวมกบอะตอมไฮโดรเจนแกอนมลอสระ เปนการกาจดหรอสลายอนมลอสระคอ R ใหเปน RH จากการกาจดนจะไดอนมลอสระตวใหมทมความไวตาคอ Asc-

แหลงอาหารทพบวตามนซ สามารถพบไดในผลไม เชน ฝรง สม มะขามปอม และผลไมทมรสเปรยวอนๆ

ผลขางเคยงจากการไดรบวตามนซในปรมาณสงๆ ขนาดทใชสวนใหญจะเปนขนาด 250-1000 มลลกรมตอวน การรบประทานวตามนซ ในปรมาณสงๆ ควรปรกษาแพทยเนองจากมขอควรระวงใน หญงตงครรภ ผทเปนโรคเกาต นวในไต และโดยเฉพาะผทเปนโรคไต อาจเกดอาการทองเสย ปวดทอง

  14

รปแสดงคณสมบตของวตามนซและกลไกการตานอนมลอสระ

- วตามนอ (Tocopherols) เปนวตามนทดดซมพรอมไขมนและละลายในไขมน (fat

soluble compound) ซง α-tocopherol เปนไอโซเมอรทมฤทธตานอนมลอสระสงสดของวตามนอ โดยวตามนอจะยบยงกระบวนการ lipidperoxidation ของ membrane ซงม lipid เปนองคประกอบ ดวยการใหไฮโดรเจนแก lipid ทอยในรปอนมลอสระหรออนมลลพดเปอรออกซ ทาให lipid พนสภาพอนมลแลวอนมลวตามนอจะถกวตามนซรดวซกลบไปสภาพเดมเพอใชงานใหม แหลงอาหารทพบวตามนอ มมากในธญพช, พชตระกลถว, ขาวซอมมอ, นามนพช, เนยเทยม, จมกขาว, ไข และผกใบเขยว

ผลขางเคยงจากการไดรบวตามนอในปรมาณสงๆ การใชวตามนอควรใชในขนาดไมเกน 400-600 IU ตอวน และควรระวงอาการขางเคยงจากการใชขนาดสงๆเปนระยะเวลานานดวย สวนใหญอาการทพบเมอใชขนาดสงๆ คอ คลนไส ทองอด ทองเสย นอกจากนการใหถง 800

IU ตอวน ตองมขอควรระวงในเรองการมเลอดออกในสมอง ดงนนการไดรบในปรมาณทสงๆจะตองอยภายใตการควบคมดแลของแพทย

- เบตาแคโรทน (β-carotene) เปนสารสสมหรอสเหลองทจะพบไดในผกผลไมทมสสม เหลอง หรอแดง เมอเบตาแคโรทนเขาสรางกาย จะถกเปลยนใหเปนวตามนเอโดยเอมไซมในลาไสในปรมาณทรางกายตองการ เบตาแคโรทนนนมประโยชนตอรางกายเปนสารตานอนมลอสระซงคอยกาจดอนมลอสระ กอนทจะไปทาปฏกรยาทาลายสวนประกอบภายในเซลล จนทาใหเซลลนนม

  15

การเจรญเตบโตทผดปกตซงเปนตนเหตใหเกดโรคมะเรง นอกจากนชวยใหมองเหนในทมดไดด, ชวยปองกนผวทอาจเกดจากอนตรายของรงสอลตราไวโอเลตทาใหผวพรรณมสขภาพดและลดรวรอยแกกอนวย, ชวยรกษาสภาพปกตของเซลลเยอบตาขาว กระจกตา ชองปาก ทางเดนอาหาร ทางเดนหายใจใหเปนปกต และยงชวยใหระบบภมคมกนของรางกายทางานไดดอกดวย

แหลงอาหารทพบเบตาแคโรทน จะพบไดในผก และผลไมทมสสม เหลอง หรอ แดง เพราะเบตาแคโรทนเปนสารทจะทาใหพชผก และผลไมมสสน เชน แครอท มะละกอสก ฟกทอง แตงโม แคนตาลป ขาวโพดออน และผกทมสเขยว เชน บรอคโคล มะระ ผกตาลง ผกบง ตนหอม ผกคะนา เปนตน

ผลขางเคยงจากการไดรบเบตาแคโรทน ในปจจบนยงไมมการรายงานใดทยนยนแนชดถงพษของเบตาคาโรทนถาไดรบในปรมาณสงๆ แตการไดรบเบตาแคโรทนปรมาณสงมากเกนจะทาใหผวหนงมสเหลอง ซงการไดรบเบตาแคโรทนจากการรบประทานผกและผลไมนาจะเพยงพอและยงไดรบคณคาสารอาหารอยางอนเพมเตมดงนนควรเลอกทจะบรโภคผกและผลไม แทนการไดรบเบตาแคโรทนจากผลตภณฑเสรมอาหาร - กลตาไทโอน (GSH) เปนสารตานอนมลในกลมทมหมไทออลมโครงสรางทประกอบดวยกรดอะมโน 3 ตวดงรป

ในรางกายมกลตาไทโอนอยใน 2 รปแบบ คอ กลตาไทโอนในรปรดวซ (GSH) และ กลตาไทโอนในรปออกซไดส คอ กลตาไทโอนไดซลไฟด (GSSG) โปรตนทมหมซลฟไฮดรลเมอถกออกซไดสโดยไดรบอเลกตรอน 1 ตว หรอ 2 ตว หมซลฟไฮดรลจะเปลยนเปนอนมลไทอล (protein-S) และกรดซลฟนก (protein – SOH) ตามลาดบ ซงการถกออกซไดสในขนตอนน รางกายสามารถซอมแซมโปรตนทเสยหายทงสองใหกลบเปนปกตโดยใช GSH รวมกบการรดวซตอโดยแอนไซม GPx หากไมม GSH โปรตนทเสยหายทงสองจะถกออกซไดสตอโดยหมซลฟไฮดรลแลวเปลยนเปน sulphinic acid และ sulphonic acid ตามลาดบ ซงความเสยหายในขนตอนนจะเปนความเสยหายทไมสามารถซอมแซมกลบได

  16

รปแสดงบทบาทของ GSH ในการปกปองหมซลฟไฮดรล (-SH) ในโครงสรางโปรตนจากการออกซเดชน

นอกจากนกลตาไทโอนมบทบาทสาคญในการปองกนเซลลจากภาวะถกออกซไดสคอ (ก) เปน cofactor ของเอนไซมหลายชนดททาหนาทกาจดอนมลและการเกดออกซเดชน ไดแก เอนไซมกลตาไทโอนเปอรออกซเดส และเอนไซมกลตาไทโอนทรานซเฟอเรส เปนตน (ข) ชวยในการขนสงกรดอะมโนผานพลาสมาเมมเบรน (ค) ขจดหรอสลายอนมลไฮดรอกซโดยตรง และเรงการทางานของเอนไซมในการกาจดอนมลลพดเปอรออกไซด และไฮโดรเจนเปอรออกไซดโดยตรง (ง) รดวซอนมลวตามนซ และอนมลวตามนอในกลบอยในรปทออกฤทธตานอนมลอสระ - ไทโอรดอกซน (TRX) เปนโปรตนทประกอบดวยมกรดอะมโน 3 ตว (Cys – Gly – Pro – Cys) TRX ในรปรดวซมหมไทออล (-SH) 2 หมจากกรดอะมโนซสเทอน 2 ตว ทอยใกลกนทาใหหมไทออลทง 2 หม ถกออกซไดสไดเปนไดซลไฟดหรอ TRX ในรปออกซไดส

thioredoxin – (SH)2 + protein – S2 → thioredoxin – S2 + protein – (SH)2

- กรดอลฟาไลโพอก (ALA) เปนสารทมนาหนกโมเลกลตา ซงสามารถถกดดซมจากอาหารเขาสรางกายไดอยางรวดเรว สารนเมอเขาถกดดซมเขาสเซลลแลวกจะถกรดวซไปเปนไดไฮโดรไลโพเอท (DHLA) ซงสามารถถกขนสงหรอลาเลยงไปยงภายนอกเซลล

บทบาทของ ALA ในการตานออกซเดชน ไดแก (ก) ขจดหรอสลายอนมลอสระ (ข) เปลยนสารตานอนมล ไดแก วตามนซ วตามนเอ และ กลตาไทโอนใหกลบมาอยในรปรดวซ (ค) คเลทโลหะทรานซชน Cu2+ และ Fe2+

  17

(ง) ทาหนาทเปลยนสารตานอนมลตางๆ ทอยในรปอนมลภายหลงทางานใหกลบคนไปอยใน รปรดวซเพอทางานใหม - สารตานอนมลอนๆ ทมตามธรรมชาตในอาหาร เชน ผลไม ผก และสมนไพร ทมโพลฟนอลเปนองคประกอบสาคญจะมฤทธตานอนมลอสระ ไดแก caffeic acid ในกาแฟ, resveratrol ในไวนแดง, curcumin ในขมน, capsaicin ในพรกขหน รวมทง lycopene ในมะเขอเทศ

รปแสดงสารตานอนมลอสระในในอาหาร ผลไม ผก และสมนไพร

ฤทธทางเภสชวทยา กลไกหลกในการออกฤทธของสารกลมนม 3 กลไก คอ

1) เปนสารคเลต (chelating agent) โดยเฉพาะสารโพลฟนอลทมโครงสรางเปนออรโธไดไฮดรอกซฟนอลก ทาหนาทจบหรอฟอรมพนธะโคออรดเนตกบโลหะหนก เชน ทองแดง และเหลก ซงมบทบาทสาคญในการกระตนการสราง รวมทงปฏกรยาลกโซของอนมลอสระ

2) เปนสารตานออกซเดชนโดยหยดปฏกรยาลกโซ(chain breaking antioxidant)ในการยบยงหรอขจดอนมลอสระ เชน lipid alkoxyl และ peroxyl radicals เปนตน โดยทาหนาทเปนตวใหไฮโดรเจนแกอนมลเหลานน ดงแสดงในปฏกรยา(1) หลงจากทฟลาโวนอยดถกออกซไดสแลวจะไดอนมลของฟลาโวนอยดฟนอกซลเปนผลตผล และอนมลทไดนมความเสถยรมากกวา เนองจากโครงสรางของฟลาโวนอยดมการ delocalize ของอเลกตรอนตลอดเวลา ดงนนจากการศกษาฤทธตานออกซเดชนของฟลาโวนอยด จะพบวาฟลาโวนอยดทมโครงสรางซงทาใหเกดการ delocalization ของอเลกตรอนดจะมฤทธดกวา Flavonoid – OH + R• Flavonoid – O• + RH (1)

  18

Flavonoid – OH สารฟลาโวนอยด R• อนมลอสระในรางกาย Flavonoid – O• อนมลฟนอกซล

3) ทาหนาท regenerate วตามนอ (α-tocopherol) โดยจะรดวซอนมล α-tocopheroxyl กลบเปน α-tocopherol เหมอนเดม ทาใหสามารถทาหนาทเปน antioxidant ไดตอไป ดงแสดงในสมการ (2)และ(3) α-tocopheroxyl – OH + R• α-tocopheroxyl – O• + RH (2) α-tocopheroxyl – O• + Flavonoid – OH α-tocopheroxyl – OH + Flavonoid – O• (3)

3. สารคเลทโลหะ (Metal chelator) นอกจากเอนไซมและสารตานอนมลอสระดงกลาวขางตนแลว การขจดโลหะทรานซชนโดยใชสารคเลทโลหะ เปนอกกลไกหนงทใชควบคมปรมาณอนมลอสระใหอยในสมดล ทงนเพราะโลหะทรานซชน เชน ธาตเหลกและทองแดง มสวนสาคญในการเกดอนมลอสระ สารคเลทโลหะในรางกายสวนใหญเปนโปรตนทาหนาทจบโลหะทรานซชนทกอใหเกด •OH เขามารวมไวในโครงสรางโดยอยในรปสารประกอบเชงซอน โลหะจงไมสามารถทาหนาทเรงปฏกรยาการเกดอนมลอสระได โปรตนในรางกายทจบกบโลหะเกดเปนสารประกอบเชงซอนมดงน คอ ทรานเฟอรรน (transferrin) เฟอรรตน(ferritin) แลกโตเฟอรรน (lactoferrin) เซรโลพลาสมน(ceruloplasmin) ฮโมเพลกซน(hemoplexin) แฮบโทโกลบน(haptoglobin) และอลบมน สรป

สารตานอนมลในอดมคตควรมคณสมบตทสาคญดงน (ก) มความเฉพาะเจาะจงสงในการเขาจบกบอนมลอสระโดยตรงและกาจดอนมลใหหมดสนไป (quenching) (ข) สามารถทาปฏกรยาคเลทกบโลหะได (ค) เปนสารตานออกซเดชน และ (ง) ไมมผลกระทบตอการแสดงออกของยนส นอกจากนยงมเกณฑทสาคญอนๆ ทบงชถงความสเปนสารตานอนมลทด ไดแก ความสามารถในการถกดดซมหรอสงผานเขาสทงภายในเซลล ภายนอกเซลล และทเนอเยอตางๆ โดยมความเขมขนเพยงพอทสามารถออกฤทธได

  19

คาบงชหรอดชนชวภาพสาหรบชวดภาวะถกออกซไดซเกนสมดลโดยอนมลอสระ ดชนชวภาพสาหรบชวดภาวะถกออกซไดสเกนสมดล มแนวทางในการวดได 2 แนวทาง คอ การวดปรมาณอนมลอสระโดยตรง และการวดโดยออมซงวดจากระดบความเสยหายทเกดจากอนมลอสระและสารเกยวของทเปนผลตผลของอนมลอสระ แตการวดปรมาณอนมลอสระโดยตรงทาไดยากเพราะอนมลอสระมระยะครงชวตสนมากอยในระดบวนาทนอกจากนการวดระดบอนมลโดยตรงตองใชเครองมอพเศษ คอ electron paramagnetic resonance (EPR) หรอ electron spin resonance (ESR) สามารถตรวจหาสารทมคณสมบตแมเหลก ซงอนมลอสระมอเลกตรอนเดยวไรค การหมนรอบตวเองของอเลกตรอนทาใหมคณสมบตแมเหลก เมอใหพลงงานซงเปนคลนแมเหลกไฟฟาผานความถไมโครเวฟ อเลกตรอนจะดดกลนพลงงานทาใหเปลยนระดบพลงงานไปอยใน excited state ทาใหเกดปรากฏการณ zeeman effect แลวเครองจะทาการวดคาพลงงานทเกดขน ดงนนจงนยมตรวจหาดชนชวภาพทใชวดภาวะถกออกซไดสเกนสมดลโดยออม

อนมลอสระ ESR (EPR)

ความสามารถรวมในการตานออกซเดชน : TRAP, FRAP, ORAC, TEAC

รปแสดงวธการวดดชนชวภาพสาหรบบงชภาวะถกออกซไดสเกนสมดลโดยวธการ ก. – จ.

Oxidative Stress Biomarkers

สารในระบบปองกนอนตรายจากอนมลอสระ ความเสยหายของชวโมเลกล

สารตานออกซเดชน : vitamin C, vitamin E, β-carotene,GSH

เอนไซม : SOD, GPX, Catalase

ลพด : MDA, F2-isoprostane, pentane, ethane,HNE oxidized LDL, Lipofuscin, LOOH

โปรตน : N-formyl kynurenine, dityrosine, DOPA

ดเอนเอ : 8-OHdG

ค) ข) ง)

ก) จ)

ก) วดปรมาณอนมลอสระโดยตรง ข) วดปรมาณสารตานอนมลอสระ

ค) วดปรมาณเอนไซมททาหนาทกาจดอนมลอสระ

ง) วดปรมาณความเสยหายทเกดกบชวโมเลกลทสาคญในรางกาย ไดแก การวดสารทเปนผลตผลจากการทลพด

โปรตน และดเอนเอ ถกออกซไดสโดยอนมลอสระหรอผลตผลจากอนมลอสระ

จ) วดประสทธภาพหรอความสามารถโดยรวมในการตานอนมล (total antioxidation capacity, TAC)

  20

เมอนาดชนชวภาพตางๆ ทแสดงดงรปมาพจารณา จะเหนไดวาปรมาณความเสยหายทเกดจากการถกออกซไดสมความสมพนธกบอบตการณและพฒนาการของโรคมากกวาปรมาณของอนมลอสระ ดงนนดชนชวดในขอ ง) จงเปนดชนชวดทเหมาะสม เพราะสามารถบงชถงอบตการณและพฒนาการของโรคไดถกตองมากกวา แตขอดอยของการวดปรมาณสารเดยวคอไมสะทอนถงภาวะออกซเดชนของรางกายโดยรวม อยางไรกตามในปจจบนยงไมมดชนชวดตวใดทมคณสมบตเพยบพรอมตอบสนองตามความตองการตางๆ ไดครบถวน 1) ดชนชวดความเสยหายจากการเกด lipidperoxidation - Malondialdehyde (MDA) เปนผลผลตจากการเกด lipidperoxidation ระดบ MDA เปนดชนชวดทนยมใชอยางกวางขวางเพราะการหาปรมาณเปนวธทงายไมซบซอน ทาโดยการเตม thiobarbituric acid (TBA) ซง MDA จะทาปฏกรยากบ TBA ไดเปนสารมสเรยกวา TBARS (thiobarbituric acid reactive substances) ดงแสดง แตอยางไรกตาม MDA ไมเปนสารเฉพาะทไดจากการเกด lipidperoxidation โดยอนมล นอกจากนสาร TBARS ทเกดขนอาจเกดเนองจาก TBA เปนปฏกรยาทไมเฉพาะเจาะจงกบ MDA เพราะสาร หลายชนด เชน นาตาล สามารถทาปฏกรยากบกรดไทโอบารบทรกได ในปจจบนมการพฒนาวธวเคราะหใหมความเฉพาะเจาะจงขนโดยการวดแสงฟลออเรสเซนซหรอการใชเครอง LC /LCMS - Isoprostane F2 (F2 – IsoP) เปนดชนสาหรบชวดภาวะรางกายถกออกซไดสและการเกด lipidperoxidation ทดกวาดชนตวอน ขอดของ F2 – IsoP คอมความคงตวทางเคม เปนผลตผลเฉพาะจากการเกดลพดเปอรออกซเดชน ในภาวะปกตมปรมาณทตรวจวดไดไมตาเกนไป แตในภาวะบาดเจบมระดบสงขนอยางเดนชดและสมพนธกบการบาดเจบจากภาวะถกออกซไดส และปรมาณลพดจากอาหารไมมผลกบระดบ F2 – IsoP

  21

Isoprostane เปนสารประกอบในกลมพรอสตาแกลนดน เกดจากกรดอะรกชโดนก (AA) ถกอนมลอสระทาปฏกรยาเปอรออกซเดชนจงใชเปนดชนบงชถงการเกดลพดเปอรออกซเดชน ซงตามปกตแลวกรดอะรกชโดนกจะเปนสารตงตนในการผลตสารพรอสตาแกลนดนในรางกายโดยใชเอนไซมไซโคลออกซจเนส (COX)

รปแสดงวถการเกด ไอโซพรอสเทนเอฟ – 2 และสารเมตาบอไลทในปสสาวะ

การตวรจวดปรมาณ F2 – IsoP ในปสสาวะเปนทนยมกวาการตรวจวดปรมาณในเลอด เนองจากสะดวกในการเกบตวอยาง มความคงตวไมไวตอปฏกรยาออกซเดชน และในคนปกตคา F2 – IsoP จะไมแปรปรวนตามวนและเวลาทเกบ แตเนองจากปรมาณ F2 – IsoP ในปสสาวะมคาสงกวาความเปนจรงเพราะเปนปรมาณโดยรวมทผลตโดยไตดวย ดงนนเพอใหการตรวจวดถกตองเปนปรมาณ F2 – IsoP ทเกดจากลพดเปอรออกซเดชนเทานน จงใชสารเมตาบอไลทของ F2 – IsoP คอ 2, 3 –

dinor – 5, 6 – dihydro – 15 – iso – PGF2α เปนดชนชวดแทน การวเคราะหทาโดยวธ ELISA หรอ GCMS

  22

ตารางแสดงอาการและโรคท ดชน F2 – IsoP บงชถงภาวะรางกายถกออกซไดสเกนสมดล Cardiovascular diseases

Atherosclerosis Cardiopulmonary bypass Coronary artery disease Heart failure Ischemia/reperfusion injury Myocardial Renovascular disease

Risk factors for cardiovascular diseases Diabetes (types 1 and 2) Hypercholesterolemia Hyperhomocysteinemia Male gender Obesity Smoking

Neurological diseases Alzheimer’s disease Chronic kidney disease Cystic fibrosis Down syndrome Huntington’s disease Multiple sclerosis, Creutzfeld – Jacob’s disease

Renal diseases Hemodialysis Rhabomyolysis induced renal injury

Lung diseases Asthma Chronic obstructive pulmonary disease CoPD Cystic fibrosis Interstitial lung disease, Acute lung injury Pulmonary hypertension Respiratory distress syndrome

Liver Diseases Acute and chronic alcoholic liver disease Hepatic cirrhosis Hepatorenal syndrome Liver transplantation Primary biliary cirrhosis

Miscellaneous Acute chest syndrome of sickle cell disease ARDS Crohn’s disease Down’s syndrome Huntington disease Hyperhomocysteinemia Osteoarthritis, Osteoporosis Pancreatitis Psoriatic arthritis, Reactive arthritis Rheumatoid arthritis Scleroderna

  23

2) ดชนชวดความเสยหายทเกดกบดเอนเอ - 8-Hydroxyguanosine (8OHdG) เกดจากอนมลอสระทาปฏกรยากบเบสในสายดเอนเอ ทมโครงสรางของพวรนหรอไพรมดน และนาตาลดออกซไรโบส เบสในสายดเอนเอจะถกออกซไดสไดเปน 8OHdG เบสกวโนซนทถกออกซเดชนหากไมมการซอมแซมโดยเอนไซมจะทาใหการจบคของเบสในดเอนเอเปลยนจากกวนน – ไซโตซน (GC) ไปเปนคไทมดน – อะดนน (TA) การเปลยนของคเบสจาก GC เปน TA พบมากในยนส p53 ในมะเรงปอดและมะเรงตบ การตรวจวดปรมาณ 8OHdG ทาไดโดยใชเครอง HPLC/ GC –MS จากการพบวาการสกดดเอนเอ โดยวธทางเคมทาใหเกดการออกซเดชนระหวางขนตอนการสกด อนมผลทาใหไดคาสงกวาความเปนจรง จงมการพฒนาการตรวจวด 8OHdG ในปสสาวะ โดยใช ELISA ซงมขอดคอสะดวก และอาหารทผปวยรบประทานจะไมมผลกบปรมาณ 8OHdG แตอยางไรกตามการตรวจจะใหคาสงกวาวธการตรวจโดยใชเครอง HPLC/ GC –MS ซงเปนวธทเจาะจงมากกวา 3) ดชนชวดความเสยหายทเกดกบโปรตน - หม คารบอนลของโปรตน กรดอะมโนหลายชนดในสายเปปไทดของโปรตนถกออกซไดสไดเปนอนพนธคารบอนล ทาโดยนาพลาสมาทาปฏกรยากบ 2, 4 – dinitrohenyl hydrazine

(DNPH) ไดเปนสารไฮดราซนมคา λmax ท 360 nm ซงวเคราะหหาปรมาณดวยเครอง spectrophotometer หลงจากทาปฏกรยากบ DNPH แลวจะทาการตกตะกอนโปรตนและลางโปรตนเพอกาจด DNPH ทเหลอใหหมดไปซงทาใหสญเสยโปรตนจงมการพฒนาการวเคราะหโดยใชเครอง HPLC แทน ซงจะเพมความไวของการวเคราะห นอกจากนยงมการพฒนาใชวธ ELISA หรอ Western blot 4) ดชนชวดจากความสามารถรวมในการตานออกซเดชน (Total Antioxidant Capacity, TAC) การหาความสามารถรวมในการตานออกซเดชน ซงเปนการรวมองคประกอบทงหมดหรอภาวะรดอกซโดยรวม และใชเปนดชนชวดภาวะออกซเดชนของรางกายโดยตรวจวดจากเลอด พลาสมาและของเหลวทไดจากรางกาย ในการวเคราะหมหลกการสาคญในการวเคราะห คอ ก) การวเคราะหจากการสงผานอะตอมไฮโดรเจน (hydrogen atom transfer, HAT) เชน

ORAC และ TRAP โดยใชหลกการวดความสามารถของสารตานออกซเดชนในเลอดหรอพลาสมา

ในการขจดอนมลอสระโดยวธการใหอะตอมไฮโดรเจน

X• + AH → XH + A•

- TRAP (total radical-trapping antioxidant parameter) นาไฮโดรเจนเปอรออกไซดทาปฏกรยากระตนเมทไมโอโกลบนเกดเปนอนมลเฟอรรลไมโอโกลบน แลวอนมล

  24

เฟอรรลไมโอโกลบนไปทาปฏกรยากบ ABTS เกดเปนอนมล ABTS•+ ทมส ดงนนเมอเตมเลอดหรอสารทตองการวเคราะหลงไปในสารผสมทใชทดสอบ เลอดหรอสารทมฤทธตานออกซเดชน

จะยบยงปฏกรยาทาใหสทเกดขนลดลง นาไปวดคาดดกลนแสงของ ABTS•+ ซงสามารถวดทจด

เดยวในเวลาทกาหนด หรอวดอตราความเรวในการเกด ABTS•+ โดยบนทกคาดดกลนแสงหลงจากการเตมไฮโดรเจนเปอรออกไซด หรอระบเปนคาระยะเวลาทใชกอนเกดปฏกรยา (lag time) หรอคาระยะเวลาในการทาปฏกรยาโดยปรยบเทยบกบสารมาตรฐานโทรรอก - ORAC (oxygen radical absorbance capacity assay) เปนการวดความสามารถของสารททดสอบหรอเลอดในการยบยงอนมลเปอรออกซไมใหทาปฏกรยาออกซเดชน โดยอนมลเปอรออกซจะทาปฏกรยาเปลยนสารทใหแสงฟลออเรสเซนซกลายเปนสารทไมใหแสงฟลออเรสเซนซ ดงนนเมอเตมเลอดหรอสารตานอนมลลงไปขจดอนมลเปอรออกซ จะทาใหมแสงฟลออกเรสเซนซเพมขนตามปรมาณและความแรงของสารทดสอบทเตมลงไป ปจจบนนยมใช fluorescein (FL) หรอไดคลอโรฟลออเรสซน (H2DCF – dA) ซงมความคงตวและไมไวตอปฏกรยาจนเกนไป ในการวเคราะหจะดผลการเกดปฏกรยาเปนเวลาประมาณ 30 นาท เพอใหไดคา ORAC ทถกตองแลววดความสามารถในการตานอนมลโดยกาหนดจากพนทภายใตเสนกราฟ AUC ของการลดลงของแสงฟลออเรสเซนซ เมอเตมเลอดหรอสารตานอนมลลงไปในสารละลายทดสอบจะทาใหการลดลงของแสงเกดชากวาและลดลงนอยกวา ดงแสดง

รปแสดงการวเคราะหหาดชนความสามารถในการตานอนมลโดยใชวธ ORAC คานวณ จากพนทภายใตเสนกราฟ AUC ของการลดลงของแสงฟลออเรสเซนซ

  25

ข) การวเคราะหจากการสงผานอเลกตรอนเดยว (electron transfer, SET) เชน FRAP

และ TEAC โดยใชหลกการหาความสามารถในการสงผานอเลกตรอนไปรดวซสารอนไดแก โลหะ

และอนมล

X• + AH → X− + A H •− (1)

A H •+ → A• + H3O+ (2)

X− + H3O+ → XH + H2O (3)

- FRAP (ferric reducing ability of plasma assay) มหลกการวาสารตานออกซเดชนในรางกาย ทาหนาทโดยการใหอเลกตรอนจงจดเปนสารรดวซ ดงนนจงกลาวไดวาเปนการวดความสามารถรวมในการรดวซ วธนใชสารประกอบเชงซอนของเหลก Fe3+ - TPTZ (ferric tripyridyl triazine) เปนสารทดสอบ อะตอมเหลกในสารนจะถกรดวซโดยเลอดซงประกอบดวยสารตานออกซเดชนหลายชนด ไดเปนสารประกอบเชงซอนของเหลกเฟอรรส Fe3+ - TPTZ ซงมสนาเงนดดกลนแสงทความยาวคลน 593 nm

  26

- TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity assay) เปนการวด

ความสามารถในการขจดอนมล ABTS•+ ทมความคงตว โดย ABTS จะถกออกซไดสโดยอนมล

เปอรออกซเกดเปนอนมลทมประจบวก ABTS•+ และมส ดงนนเมอเตมเลอด พลาสมา หรอสารตานอนมลลงไปจะทาใหมสลดลง โดยใช แมงกานสไดออกไซด หรอโปตสเซยมเปอรซลเฟตและ

เอนไซมเปอรออกซเตสจาก horseradish ทาใหเกดอนมล ABTS•+ และผสมสารหรอเลอดท

ตองการวเคราะหเปนขนตอนสดทายภายหลงจากการททาใหเกดอนมล ABTS•+ ผลการวเคราะหจะคานวณเปนคาทสมมลกบสารตานอนมลมาตรฐานโทรรอก ตารางแสดงดชนชวดความเสยหายจากการออกซเดชนในโรคตางๆ

โรคมะเรง MDA,GSH/GSSG ratio NO2-Tyr, 8-OH-dG

โรคอลไซเมอร MDA, HNE GSH/GSSG ratio F2-isoprostanes N02-Tyr,AGE

โรคพารกนสน HNE, GSH/GSSG ration Carbonylated proteins

โรคเบาหวาน MDA, F2-isoprostane GSH/GSSG ratio S-glutathionylated proteins NO2-Tyr, AGE

โรครมาทอยดขออกเสบ F2-isoprostanes GSH/GSSG ratio

โรคหวใจและหลอดเลอด HNE, GSH/GSSG ratio Acrolein N02-Tyr F2-isoprostanes

โรคขาดเลอดชวขณะ F2-isoprostanes GSH/GSSG ratio

โรคหลอดเลอดแดงแขง MDA, HNE Acrolein F2-isoprostanes N02-Tyr

MDA = malondialdehyde, HNE = 4-hydroxy-2-nonenal, AGE = advanced glycation end products, 8-OH-dG = 8-hydroxy-20-deoxyguanosine, GSH = reduced glutathione, GSSG = oxidized glutathione, NO2- Tye = 3 – nitro-tyrosine.

  27

เอกสารอางอง

1. โอภา วชระคปตและคณะ. “สารตานอนมลอสระ” ฉบบปรบปรงท 2, 2550. 2. Matill HA (1947). Antioxidants. Annu Rev Biochem 16: 177–192. 3. Knight J (1998). "Free radicals: their history and current status in aging and disease". Ann Clin Lab Sci 28 (6): 331–46. PMID 9846200. 4. Wolf G (2005). "The discovery of the antioxidant function of vitamin E: the contribution of Henry A. Mattill". J Nutr 135 (3): 363–6. PMID 15735064 5. Sies H (1997). "Oxidative stress: oxidants and antioxidants" (PDF). Exp Physiol 82 (2): 291–5. 6. Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin M, Mazur M, Telser J (2007). "Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease". Int J Biochem Cell Biol 39 (1): 44–84. doi:10.1016/j.biocel.2006.07.001. PMID 16978905. 7. Nakabeppu Y, Sakumi K, Sakamoto K, Tsuchimoto D, Tsuzuki T, Nakatsu Y (2006). "Mutagenesis and carcinogenesis caused by the oxidation of nucleic acids". Biol Chem 387 (4): 373–9. doi:10.1515/BC.2006.050. PMID 16606334. 8. Valko M, Izakovic M, Mazur M, Rhodes C, Telser J (2004). "Role of oxygen radicals in DNA damage and cancer incidence". Mol Cell Biochem 266 (1–2): 37–56. 9. Krieger-Liszkay A (2005). "Singlet oxygen production in photosynthesis". J Exp Bot 56 (411): 337–46. doi:10.1093/jxb/erh237. PMID 15310815. 10. Kerfeld CA (October 2004). "Water-soluble carotenoid proteins of cyanobacteria". Arch. Biochem. Biophys. 430 (1): 2–9. doi:10.1016/j.abb.2004.03.018. PMID 15325905. 11. Chaudière J, Ferrari-Iliou R (1999). "Intracellular antioxidants: from chemical to biochemical mechanisms". Food Chem Toxicol 37 (9–10): 949 – 62. doi:10.1016/S0278-6915(99)00090-3. PMID 10541450. 12. Sies H (1993). "Strategies of antioxidant defense". Eur J Biochem 215 (2): 213 – 9. doi:10.1111/j.1432-1033.1993.tb18025.x. PMID 7688300. 13. Khaw K, Woodhouse P (1995). "Interrelation of vitamin C, infection, haemostatic factors, and cardiovascular disease". BMJ 310 (6994): 1559 – 63. PMID 7787643. 14. El-Sohemy A, Baylin A, Kabagambe E, Ascherio A, Spiegelman D, Campos H (2002). "Individual carotenoid concentrations in adipose tissue and plasma as biomarkers of dietary intake". Am J Clin Nutr 76 (1): 172 – 9. PMID 12081831. 15. Head KA. Peripheral Neuropathy: Pathogenic Mechanisms and Alternative Therapies. Altern Med Rev. 2006 Dec;11(4):294-329.