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OVOGENESE
FOLLICULOGENESE
Catherine PoirotUnité de préservation de la fertilitéCHI Poissy-St Germain, site de St Germain en LayeUniversité Pierre et Marie Curie
Indissociables
OVOGENESE
Finalité de l’ovogenèse
Obtenir un gamète féminin de qualitéOVOCYTE IIovocyte mature
OVOCYTE MATURE
� Hautement spécialisée� Porteur de la moitié du patrimoine génétique
féminin� être capable de fusionner avec un SPZ,
décondenser son noyau, d’assurer le début du développement embryonnaire
� sa croissance et sa différenciation grâce aux cellules folliculaires (jonctions perméables)
� « Une cellule souche totipotente » : reprogrammation nucléaire
Ovocyte mature
� Cellule la plus rare de l’organisme
� 350 à 400
� Devenir particulier (fécondation)
� Grande quantité d’ARN
OVOGENESE
� Phénom ène discontinu
OVOGENESE
� 3 phases� Multiplication
� Début méiose
� Croissance� Maturation
� Poursuite méiose
� Ovogonies� Ovocytes I
� Ovocytes I
� Ovocytes I ->Ovocytes II
1- Multiplication
� Division des ovogonies par mitoses� Du 4ème au 7ème mois vie foetale� 2N chromosomes
� Ovogonies : synthèse d’ADN� Entrée en méiose : ovocyte I
Fin de la phase de multiplication
� Début de la méiose réductionnelle1er BLOCAGE EN FIN DE PROPHASE I
� Constitution des follicules primordiaux
Croissance ovocytaire
Phase de croissance
� Volume augmente : 3 à 4 fois sa taille initiale
Phase de croissance
� 35 à 40 µm de diamètre
� ≈ 120 µm � vésicule germinative double
� Synthèses +++
Phase de croissance
� Débute après la naissance
� Très longue
� Se termine au moment de la maturation finale du follicule (ex : follicule tertiaire Ø 10 mm : ovocyte : 80% de sa taille finale)
Croissance ovocytaire
� Transcription intense � Accumulation d’ARN (x 300)� Synthèses spécifiques : ZP1, ZP2 et ZP3,
protéines du cycle cellulaire (compétence méiotique)….
� Modifications cytoplasmiques� mitochondries� golgi (activité)� granules corticaux� zone pellucide (glycoprotéines)
Acquisition des compétences ovocytaires
� Compétence méiotique� Compétence au développement (fin : après la décharge ovulante)
Compétence méiotique
Compétence au développement
Fin de la phase de croissance
� Réorganisation de la chromatine� Périnucléolaire
� Arrêt de la transcription
� Relocalisation de certaines protéines
Maturation ovocytaireétape finale d’une longue évolution
� Maturation nucléaire (méiose « discontinue »)
� Maturation cytoplasmique
� Maturation membranaire
MEIOSE
Toulouse
MEIOSEDiscontinue
OVOCYTE EN PROPHASE I
Ovocyte en métaphase I
OVOCYTE EN METAPHASE 2
Inhibition folliculaire de la reprise de
la méiose
� Extraovocytaire� In vitro : meilleure inhibition lors de coculture :
cellules de la thèque et CG� OMI (oocyte meiotic inhibitor)� Pas connu de façon précise
� Intraovocytaire : � concentration élevée d’AMPc empêche la reprise
de la méiose
Phase finale : maturation ovocytaire
� In vivo : décharge ovulante de LH� Rupture des jonctions perméables� Blocage transmission du signal OMI� Synthèse de stérols activateurs de méiose (MAS) par les
cellules du cumulus� libération de calcium intracellulaire
� AMPc� diminution : reprise de la méiose� cascade phosphorylations/déphosphorylations
Maturation ovocytaire
(nucléaire)� Aspects morphologiques
� Plissement de l’enveloppe nucléaire� disparition des pores nucléaires� rupture de la membrane nucléaire
EN PARALLELE� condensation des chromosomes� organisation du fuseau de division
EXPULSION DU PREMIER GLOBULE POLAIRE
Aspects moléculaires
� Reprise de la m éiose : transition G2/M
� Activité MPF (M -Phase Promoting Factor)
� MPF Hétérodim ère� p34cdc2 sérine/thréonine kinase : CDK1� p 45 : cycline B
*Cyclin B + p34cdc2 + phosphorylation en 161 (Thr) = pré MPF*Déphosphorylation (Thr14 et Tyr15) = MPFactif
ACTIVATION DU MPF
Régulation des déphosphorylations : wee 1 et cdc 25
Modes d’action du MPF : cibles
� Diversité des cibles phosphorylées par le MPF
� MPF a des affinités pour� protéines comme les histones 1� certaines protéines associées aux
microfilaments� ARN polymérase� …...
Actions du MPF
� GVBD� condensation des chromosomes� remodelages du cytosquelette : fuseau
méiotique� induction des modifications de la synthèse
protéique observées lors de la reprise de la méiose
Pas d’interphase
� Activité résiduelle du MPF � maintien de l’état de condensation des
chromosomes
� Autres kinases (MAP kinases)� maintien de la phosphorylation des substrats du
MPF INHIBITION DE L ’INTERPHASE
Niveau d’activité du MPF
VG MI AITI
MII
Activité MPF
* *
Blocage en Métaphase II
� CSF : facteur cytostatique� pas purifié à ce jour� mais produit du proto-oncogène c-mos
participe à l’activité du CSF� kinase bloquant la dégradation des cyclines� maintien d’un taux élevé de MPF� souris mos -/- : activation parthénogénétique
spontanée
Expansion du cumulus
� Présence de cellules du cumulus est importante
� Expansion +++� Production par les cellules d’une matrice
viscoélastique (acide hyaluronique)
� Production d’acide hyaluronique sous dépendance FSH par les cellules du cumulus
� Facteurs ovocytaires (produit du gène GDF 9)
LH : rupture des jonctions perméablesCascades
Phosphorylations-déphosphorylations
MPF inactif MPF actif
Reprise de la méiose VG MI
Pas d’interphase : MPFMAPK
CSF MPF M2
+
+
+
+ +
OVOCYTE MATURE
FOLLICULOGENESE
Succession des différentes étapes du développement folliculaire de la sortie de la réserve jusqu’à l’ovulation ou involution
Introduction
� Production chaque mois : un ovocyte unique� Evolution en grande partie indépendante des
GT� Evolution la plus commune : ATRESIE� Rôles FSH et LH et rétrocontrôles� Système paracrine� Pathologies : mutations
Organisation de l’ovaire
� Cortex
� Médullaire
Follicule primordial> 95%
Réserve
Follicule primaire
Follicule secondaire
Follicule tertiaire
Follicule préantral
Follicule tertiaire
Evolution du nombre de follicules
en fonction du temps
� 7 millions de cellules souches in utero� Naissance : 1 million de follicules� Puberté : 300 000 follicules � Ménopause : 1 000 follicules
� 400 ovulations
� Apoptose (croissance folliculaire de base, recrutement, sélection)
A Gougeon
APOPTOSE
� Responsable de l’épuisement de la réserve ovarienne. � Souris : gène Bax -/- multiplication par 3 du
nombre de follicules ; Bax : facteur proapoptotique
� Souris : gène Bcl2 -/- diminution le nombre de follicules primordiaux ; Bcl2 : facteur antiapoptotique
FOLLICULOGENESE
PHENOMENE CONTINU Ovaire
activité propre et régulation locale où
l’axe hypothalamo - hypophysaire contrôle et module les étapes finales de la
croissance folliculaire et l ’ovulation
Différentes étapes de la
folliculogenèse
5 phases
� Quiescence[Initiation de la croissance folliculaire]
� Croissance folliculaire de base
� Recrutement� Sélection � Dominance
Initiation de la croissance
folliculaire� Primordial ���� Primaire� Nombre sortant de la réserve par jour est
proportionnel à la réserve (� avec l’âge)
� Femme ≈ 20 à 20 ans� Evolution lente des follicules primordiaux vers
le stade primaire� � de la taille de l’ovocyte puis augmentation
du nombre des GC
Initiation de la croissance
folliculaire� Indépendante des gonadotrophines� Facteurs impliqués
� KL : synthétisé par les GC, son récepteur C-kit (au niveau de l’ovocyte)
� Souris KL : plus de transformation des follicules primordiaux
� Administration Ac anti-C-kit : plus de sortie du pool
� KL dans milieu de culture : � sortie du pool
Autres facteurs
� LIF : en culture � production de follicules primaires� anticorps anti-LIF : � nombre de primaires
� AMH, produite par les cellules de la granulosa des follicules primaires et préantraux, inhibe l’initiation de la croissance des primordiaux
5 phases
� Quiescence[Initiation de la croissance folliculaire]
� Croissance folliculaire de base
� Recrutement� Sélection � Dominance
Croissance folliculaire basale
� Indépendante des gonadotrophines� Stade terminal de cette croissance dépend
de l’espèce� Souris : début d’antrum� Brebis : follicules à antrum jusqu’à un diamètre de
2 mm� Femme : stade follicule à antrum : diamètre de 2 à
5 mm
Croissance folliculaire basale
� Facteurs impliqués (paracrine)� GDF9 : Growth Differenciation Factor 9� BMP 15 : Bone Morphogenetique Protein 15� sont nécessaires à la croissance des follicules primaire s
et à la formation des follicules secondaires
� Tous les 2 :� origine ovocytaire� détectables chez la plupart des espèces à
partir du stade primaire
5 phases
� Quiescence[Initiation de la croissance folliculaire]
� Croissance folliculaire de base
� Recrutement� Sélection � Dominance
Développement folliculaire
terminal� Phase dépendante des gonadotrophines � Follicule de 2 mm de diamètre chez la femme
jusqu’à l’ovulation� 2 semaines� Activé dès la régression du corps jaune� 3 événements : * recrutement * sélection * dominance
Régulation
Entre puberté et ménopause
GnRH Hypothalamus(pulsatile)
LH FSH(pulsatile) (pulsatile)
OVAIRE : fonction cyclique
Développement folliculaire
terminal
CARACTERISTIQUES
� Multiplication très importante des cellules de la granulosa
� Phases du développement folliculaire
RECRUTEMENT
RECRUTEMENT
� Les follicules gonado-dépendants présents dans les ovaires entrent en croissance terminale
� COHORTE
� Coïncide avec l’apparition d’une activitéaromatase dans la granulosa
Sélection
SELECTION
� Coïncide avec l’apparition des récepteurs à la LH sur les cellules de la granulosa
� Forte production d’inhibine
DOMINANCE
Dominance
DOMINANCE
� Grande taille� Follicule dominant : seuil de réponse à
FSH le plus bas
� Pendant la dominance : * croissance et maturation du
follicule préovulatoire * régression par atrésie des
autres follicules de la cohorte * blocage du recrutement de
nouveaux follicules
SELECTION et DOMINANCE
Mi-phase folliculaire
R
D
S
Cohorte folliculaire est réduite au nombred’ovulation caractéristiques de l’espèce
Fin de phase folliculaire
Régulation des mécanismes de la
folliculogenèse terminale
2 niveaux
Endocrine FSH - LH et les rétrocontrôles (Stéroïdes et peptides)
Local : affine les messages endocrines (paracrine et autocrine)
OVULATION
� Expulsion de l’ovocyte hors du follicule� Phénomène rare� Réponse à une forte élévation des GT : LH� Cascades d’étapes biochimiques : inflammation� Follicule mature : quand concentration adéquate
de LHr� 35 à 36 heures après décharge ovulante
Remaniements morphologiques
� Thèque externe : oedémateuse� CG : arrêt des divisions cellulaires� Dissociation des cellules du cumulus
oophorus (sécrétion importante d’acide hyaluronique pilotée par l ’ovocyte) sous l’effet du pic de LH (GDF9 et BMP15)
� Corona radiata� Pénétration des VX dans la granulosa
� Cellules de l ’épithélium ovarien s’étirent et s’aplatissent
� Dissociation des cellules sous-jacentes, de la granulosa, des thèques et de l’albuginée.
� Le liquide folliculaire s’échappe� Rupture folliculaire� Contraction du follicule� REMANIEMENTS VASCULAIRES
� augmentation du flux sanguin� augmentation de la perméabilité vasculaire
� CORPS JAUNE
Facteurs intervenant au moment
de l’ovulation
� Stéroïdes : � E2 rétrocontrôle sur GT� Progestérone (récepteur P4)
� Facteurs intervenant sur le système vasculaire� NO (vasodilatateur puissant)� endothéline� Rénine-angiotensine….
� Facteurs intervenant sur la perméabilitédes vaisseaux et l’angiogenèse� VEGF� histamine, bradykinine, prostaglandines ……
� Activités enzymatiques� plasmine� collagénase� métalloprotéinase : ADAM TS-1 (coupe la
matrice extracellualire)
� cathepsine L….
� Facteurs intervenant dans les réactions inflammatoires� IL-1β� TNF α� Bradykinine� histamine…..
Ovulation et corps jaune
Applications cliniques
� Stimulation de l ’ovulation� Fécondation in vitro� ……
� Croissance folliculaire in vitro
� Maturation ovocytaire in vitro (MIV)
Croissance folliculaire in vitro
Croissance folliculaire in vitro
� Connaissance de la folliculogenèse
� Un des modes d ’utilisation du cortex ovarien congelé
� ……….
Croissance folliculaire in vitro
IMPERATIF
Du follicule primordial au
follicule préovulatoire
(25%)
(25%)
Résultats
Isolé CCO
Baker, 1974
Roy, 1993
Zhang, 1995 (fœtus)
Abir, 1997
Hovatta, 1997
Wu, 1998
Wright, 1999
Abir, 1999
Hovatta, 2000
Telfer, 2008
Explant
Primordial I aire II aire Antrum MIV (M2)
10 jours
Telfer E, 2008 : 2 étapes
� Culture in situ (6j) et isolement folliculaire (4j) + Activine : primordial jusqu’à antral
Xu M, 2009 (Hum Reprod)
� Résultats encourageants
Chez l’humain :
PAS encore d’ovocytes matures