Upload
roy
View
77
Download
8
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Oversikt over oppgaven. Forsøk 1. ±RT for å sjekke kvaliteten av RNA. Jurkat celler (T-lymfocytter). HL60 celler (Myeloide celler). HeLa celler (Cervix celler). Forsøk 2. Test av referanse-mRNA (husholdningsgen) PP1. RNA isolering. RT: cDNA-syntese med revers transkriptase. Forsøk 3. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
KJB220
Jurkat celler(T-lymfocytter)
HL60 celler(Myeloide celler)
HeLa celler(Cervix celler)
RNA isolering
RT: cDNA-syntese med revers transkriptase
Kvantitering av spesifikke mRNAs
Forsøk 1
Forsøk 2
Forsøk 3
±RT for å sjekke kvaliteten av RNA
Test av referanse-mRNA (husholdningsgen)
PP1
Test av celletype- spesifikk mRNA
c-myb
Real-timePCR
Lightcycler
Oversikt over oppgaven
KJB220
Ulike mønstre av mRNA uttrykk
Ulike celler uttrykker et spektrum av mRNA Noen er de samme i alle celler og
blir uttrykt i rimelig like mengder overalt (husholdningsgener)
Andre er spesifikke for noen få celletyper og bidrar til disse cellenes særlige egenskaper (celletypespesifikke gener).
I real-time kvantitering av mRNA brukes de første som referanse
mRNA mRNA
cDNAcDNA
Referanse UkjentKvantitering
KJB220
The quantitative assay - step by step
Primer design RNA isolation cDNA synthesis Set up of the experiment Programming and running the LightCycler Optimizing the PCR reaction Interpretation of the results Troubleshooting
1
2
3
4
5
6
7
8
KJB220
Stage 1: Primer design
1
2
3
4
5
6
7
8
Length: 18-24 bp Try to make the two primers equal in length
GC content: Between 40% and 60% with equal GC content in both primers Avoid an unbalanced distribution of G/C and A/T-rich domains
Sequence: 3´-region most important, free of secondary structures, repetive sequences,
palindromes, and highly degenerate sequences Last 5 nucleotides should contain no more than 2 G/C
Melting temperatures Tm = temp at which 50% of the primer-target hybrids are single stranded. Depends on primer sequence and buffer composition Tm between 55-65oC, primers used together should have similar Tm value
KJB220
2. step: RNA isolation
Several methods GTC metoden Trizol metoden Ulike kommersielle kit
Kits for cultured cells 5 x 106 cells/prep, expected yield: 10-20 ug/ 106
cells
1
2
3
4
5
6
7
8
KJB220
Arbeid med RNA er krevendepga RNA lett degraderes RNA er et labilt molekyl
som lett degraderes Pga 2´-OH som deltar i degraderings-
mekanismen Pga RNAser som finnes overalt
(fingre etc) og som er svært robuste enzymer (noen tåler koking).
RNA er derfor langt mer ustabilt enn DNA
I cellene er mRNA beskyttet dels med ende-modifikasjoner, dels via assosiasjon med protein
Arbeid med RNA krever derfor særlig forsiktighet
capAAAAAAAAAAAAA
Pre-mRNA(hnRNA)
mRNA
1
2
3
4
5
6
7
8
KJB220
Tiltak for å unngå RNA degradering
Unngå RNaser (allestedsnærværende) Bruk hansker (men ha ikke blind tiltro til hvor effektive de er) Løsninger behandles med DEPC (diethylpyrocarbonate) Bruk RNase-frie rør og pipettespisser (helst med filter) Elektroforesekar behandles med H2O2
Glass og metall varmebehandles: 180 oC minst 8 timer
Bruk RNase inhibitorer DEPC (diethylpyrocarbonate) er et reaktivt alkyleringsagens Vanadyl ribonucleoside komplekser - ikke-kovalent inhibitors, må
fjernes før RNA skal brukes videre pga inhibering av polymeraser Protein inhibitorer - et ca 50 kDa cytoplasmatisk inhibitor protein
isolert fra placenta binder sterkt til og inhiberer mange Rnaser (kommersielle navn: RNasin, prime inhibitor etc)
1
2
3
4
5
6
7
8
KJB220
Inhibitorer av Rnaser - DEPC
DEPC (diethylpyrocarbonate) DEPC er et reaktivt alkyleringsagens som inaktiverer RNaser
i buffere og på glassutstyr. Modifiserer Histidine grupper med ethoxyformyl DEPC reagerer med RNA og protein generelt, og kan derfor
ikke brukes under isolering. Inaktiveres raskt i vann (halveringstid ca 10 min ved pH 7) og
omdannes til CO2 og etanol. Bør ikke brukes sammen med Tris.
Bruk: 0.1% DEPC i vann overnatt ved rom temp (eller 1 time 37oC) etterfulgt av vask med DEPC-behandlet vann og autoklavering
1
2
3
4
5
6
7
8
C-CH2-CH3
C-CH2-CH3
O
O
O
KJB220
Hvordan isolerer vi RNA? Kit for RNA isolering
The Absolutely RNATM RT-PCR miniprep kit
Prinsipp Celler lyseres i nærvær av guanidin
thiocyanat, en av de sterkeste kjente protein denaturanter, som inaktiverer Rnaser
Pre-filter spin fjerner partikler og noe DNA
RNA blir absorbert til en silika-basert fiber-matriks i nærvær av høye konsentrasjoner chaotropiske salter (mens kontaminanter vaskes ut).
KJB220
Hvordan isolerer vi RNA?
Prinsipp forts. Vask med lav-salt buffer Rester av DNA fjernes med DNase
behandling Videre vask fjerner protein og rester
av DNase Høy-renset RNA isoleres i et lite
volum ved eluering med en buffer med lav ionestyrke og samles opp i mikrosentrifuge-røret
Renset RNA Har lavere DNA-innhold enn mange
metoder Er derfor velegnet for RT-PCR og
real-time PCR analyser
KJB220
3. step: cDNA synthesis Omdanning av mRNA til cDNA
Ulike kommersielle RT-enzymer Omniscript RT-kit (Qiagen) Kit from Roche: Master RNA
Cybergreen Superscript (Life Technol.)
1
2
3
4
5
6
7
8
mRNAoligo dT
RT: Reverse transcriptase
cDNA
mRNA
5´3´5´ 3´
Templat forReal-time PCR
capAAAAAAAAAAAAA
mRNA
KJB220
Reaction mix for the LightCycler
Template DNA cDNA from 50 ng total RNA, diluted 1:10 or 1:50
Primers 0.3-1.0 uM of each primer
MgCl2 1-5 mM
Nucleotides, Taq PCR buffer, Taq DNA Polymerase Included in the LightCycler DNA Master SYBR Green I
1
2
3
4
5
6
7
8
KJB220
Samples to run
A series of dilutions are made to construct a standard curve for target gene Using a subclone of the target
Sample (cDNA) with primers for target gene In the form of cDNA made from the isolated RNA
Sample (cDNA) with primers for housekeeping genes for normalization purposes
1
2
3
4
5
6
7
8
KJB220
Standard curve
Use at least 3 concentrations for a standard curve
Use serial dilutions that are one order of magnitude apart _ 1:10, 1:100, 1:1000,...
For medium and high concentrations, a single point per concentration is sufficient
1
2
3
4
5
6
7
8
KJB220
Programming the Lightcycler
1
2
3
4
5
6
7
8
KJB220
Programming the Lightcycler
Preincubation Denaturation Amplification
Denaturation, annealing (primer dependent), elongation (bp/25 sec), cycle number (may be increased during run)
Melting curve Primer dependent, 5-10 higher than the primer annealing temp
Cooling Edit samples
1
2
3
4
5
6
7
8
KJB220
Optimization - an important step
Finding optimal MgCl2
Find conc (1-5 mM) that gives best crossing point, signal intensity and slope
Annealing temperature? Try to design primers with similar Tm, allows standard conditions of
annealing temp
Controls - positive and negative Always include a NTC (non template control, here water) to see
primer-dimers Also include a positive control to see that the reaction works
1
2
3
4
5
6
7
8
KJB220
1
2
3
4
5
6
7
8
Optimizing PCR conditions
Template dilution Use dilution that gives crossing points in the 20-30 range
Programming Annealing temp, elongation time
Improve your primer design? If difficult to optimize, order new primers (much cheaper than long
optimalization experiments)
KJB220
Interpretation of the results
Quantification by one or several standard curves
Ratio: target gene/housekeeping gene in each sample Assumption: housekeeping gene expression = constant in the
samples Normalisation of the total cDNA using constitutively expressed
housekeeping genes
1
2
3
4
5
6
7
8Jurkat/Myb = 2.351
Jurkat/PP1
HeLa/Myb = 0.107
HeLa/PP1
KJB220
Interpretations of the results
Evaluation Parameters Error < 1 r = -1.00 Slope
Melting curve analysis Primer dimers Expected melting point
Calculations
E = 10 -1/slope
E = 10 -1/-3.407
= 1.97
Jurkat/Myb = 2.351
Jurkat/PP1
HeLa/Myb = 0.107
HeLa/PP1
22 fold
1
2
3
4
5
6
7
8
KJB220
Troubleshooting:Problem 1: primer dimers
Primer-dimers interferes with quantitation LC with SYBR-green measures all DNA produced Primer-dimer is a template-independent product that also
produces fluorescence
Identifying primer-dimers: melting curve analysis Pure, homogenous PCR products produce a single, sharply
defined melting curve with a narrow peak. Primer dimers melt at relatively low temperatures and have broader peak
1
2
3
4
5
6
7
8
KJB220
How to avoid primer/dimers?
General approaches Reduce delays in workflow Optimize primers - may be more important with LC than in conventional
PCR Increase the annealing temperature Reduce annealing time to 1-5 sec. Use hot start
inactive modified enzyme/Ab-bound enzyme that becomes activated after heat exposure
LC-specific approaches Increase the temperature for fluorescence registration Use of hybridization probes rather than SYBR-green Reduce number of cycles, e.g. to 40.
1
2
3
4
5
6
7
8
KJB220
Problem 2: RNA contaminated with genomic DNA
Identify by running ± reverse transcriptase, compare Cps
Traces of genomic DNA will work as templates interfering with quantitation, may reduce reproducibility
1
2
3
4
5
6
7
8
KJB220
How to avoid problems with genomic DNA?
Always include a DNase I purification step in the RNA isolation procedure Included in the kit used here
Always run a ±reverse transcriptase reaction to check the quality of the RNA Used as the first experiment here
1
2
3
4
5
6
7
8
KJB220
Jurkat celler(T-lymfocytter)
HL60 celler(Myeloide celler)
HeLa celler(Cervix celler)
RNA isolering
RT: cDNA-syntese med revers transkriptase
Kvantitering av spesifikke mRNAs
Forsøk 1
Forsøk 2
Forsøk 3
•±RT for å sjekke kvaliteten av RNA
•Test av referanse-mRNA (husholdningsgen)
• PP1
•Test av celletype- spesifikk mRNA
•c-myb
Real-timePCR
Lightcycler
Mandag
KJB220
Jurkat celler(T-lymfocytter)
HL60 celler(Myeloide celler)
HeLa celler(Cervix celler)
RNA isolering
RT: cDNA-syntese med revers transkriptase
Kvantitering av spesifikke mRNAs
Forsøk 1
Forsøk 2
Forsøk 3
•±RT for å sjekke kvaliteten av RNA
•Test av referanse-mRNA (husholdningsgen)
• PP1
•Test av celletype- spesifikk mRNA
•c-myb
Real-timePCR
Lightcycler
Tirsdag
KJB220
Ulike mønstre av mRNA uttrykk
Ulike celler uttrykker et spektrum av mRNA Noen er de samme i alle celler og
blir uttrykt i rimelig like mengder overalt (husholdningsgener)
Andre er spesifikke for noen få celletyper og bidrar til disse cellenes særlige egenskaper (celletypespesifikke gener).
I real-time kvantitering av mRNA brukes de første som referanse
mRNA mRNA
cDNAcDNA
Referanse UkjentKvantitering
KJB220
Criteria for single standard curve
Equal Efficiency Required for Accurate Analysis
Prerequisite: EfficiencyStandard = EfficiencyTarget
Efficiency depends on:
- fragment length - advantage with short PCR-products (100-200 bp)
- intervening sequence
- spacing RT primer to PCR primer - advantage to design primers in the 3´-part of the gene
KJB220
Prerequisites of a suitable housekeeping gene RNA-specific detection
pseudogene free amplification / detection specific for active target
No regulation of expression level in the system analysed normal vs. tumor tissue unstimulated vs. stimulated cells
Similar expression level compared to the target analysed
KJB220
Housekeeping Genes
ß-actin multigene family; > 20 genes; 1 active locus : hormones of tyroid gland20 pseudogenes : stomach tumor
-actin multigene family; pseudogenesGAPDH multigene family; 10-30 genes; > 200 in mouse : lung, pancreatic, colon cancer
mostly pseudogenes : insulin, EGF5.8S,18S, 28S RNA pseudogenesß2-microglobulin no pseudogenes : Non-Hodgkin lymhoma
abnormal expression in tumorsG6PDH no pseudogenes : kidney, stomach tumor
: hormones, oxidant stress, growth factors
PBGD no pseudogenesaldolase pseudogenesHPRT pseudogenesU3, U8, ... Pseudogenesornithin : tumorsdecarboxylase...
Gene Genomic structure / pseudogenes Regulation e.g.