Oscar Caldera Díaz · A mi Madre y hermanos, que son el mejor logro de mi vida. A betita a quien simplemente le debo todo. A Fabio (Mono) y Carlos Julio (Negrito) gracias por sus

Identificación de polimorfismos en el gen gyrA de Pseudomonas

aeruginosa de pacientes con fibrosis quística y otras patologí as

en la ciudad de Cartagena (Colombia)

Oscar Caldera Díaz

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias

Bogotá, Colombia

2011

Identificación de polimorfismos en el gen gyrA de Pseudomonas

aeruginosa de pacientes con fibrosis quística y otras patologí as

en la ciudad de Cartagena (Colombia)

Oscar Caldera Díaz

Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título

de:

Magister en Ciencias - Microbiología

Director: Ph. D. Claudio Gómez Alegría

Codirector: Ph. D. Doris Gómez Camargo

Línea de Investigación:

Biología Molecular en Enfermedades Genéticas e infecciosas

Grupo de Investigación:

Unimol

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias

Bogotá, Colombia

2011

A mi Madre y hermanos, que son el mejor logro de mi vida.

A betita a quien simplemente le debo todo. A Fabio (Mono) y Carlos Julio (Negrito) gracias por sus consejos acertados, al apoyo incondicional y sobre todo por ese amor

verdadero hacia mí. Por todo esto estaré inmensamente agradecido por el resto de mis días.

Agradecimientos

A Dios, por estar siempre conmigo.

A mi familia que han estado pendientes de mis avances y dándome ánimos continuamente. Su amor ha significado un apoyo muy importante.

A mi amiga y Profesora María Teresa Reguero. De las innumerables cosas que aprendí de ella, las mas importante es que lo cortés no quita lo valiente. Dr. Claudio Gómez Alegría, por la confianza que depositó en mí, así como por sus consejos y orientaciones.

A la Dra. Doris Gómez a su amable y valiosa contribución a este trabajo, no sólo por las cepas de P. aeruginosa proporcionadas, sino también por su gran experiencia y conocimiento sobre en el tema. A Socorro Prieto sinónimo de eficiencia y dedicación a su trabajo.

A lo largo de la maestría he corrido con suerte de estar rodeado de gente de una calidad humana excepcional. Javier Baena, María Vallejo a mis compañeros de maestría: Mery, Carolina, Alexis, Julieth, Sol, Alexandra, Vivian, Sebastián, Myriam, Vanessa, a todos ellos.

Quiero agradecer al posgrado Ciencias Microbiología y al grupo Unimol por el apoyo financiero que permitió la culminación de este proyecto.

Quisiera mostrar mi agradecimiento más sincero a todas aquellas personas que han contribuido de una manera u otra a la realización de esta tesis.

Finalmente, debo agradecer al posgrado en Ciencias Microbiología y al fondo del grupo

Unimol por el financiamiento de este proyecto.

Resumen y Abstract VII

Resumen La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad genética debida a mutaciones en el gen

CFTR que codifica un canal de cloruro. Los pacientes con FQ expresan un canal no

funcional en la membrana de las células epiteliales, y son susceptibles a infecciones

pulmonares crónicas por P. aeruginosa. En este trabajo, se analizó la resistencia a

ciprofloxacina de 60 aislados clínicos de P. aeruginosa: 30 de pacientes FQ y 30 de

pacientes con otras patologías (no-FQ), y se secuenció la región QRDR del gen gyrA

para identificar polimorfismos relacionados con resistencia a quinolonas. Se encontraron

más aislados resistentes a ciprofloxacina en el grupo FQ (19/30) comparado con el grupo

no-FQ (4/30) (p<0.001). Se identificaron polimorfismos en ambos grupos: Thr-83Ile,

Asp87Asn, y Asp87Gly, entre otras. El número de aislados con resistencia a

ciprofloxacina con mutaciones en gyrA fue significativamente mayor en el grupo FQ

(11/24) comparado con el grupo no-FQ (3/21) (p<0,05), sugiriendo que la resistencia a

ciprofloxacina en este grupo podría deberse a las mutaciones encontradas.

Palabras clave: Pseudomonas aeruginosa, gen gyrA, Ciprofloxacina, Fluoroquinolonas, Fibrosis quística, Resistencia a antibióticos.

Resumen y Abstract IX

Abstract

Cystic fibrosis (CF) is a genetic disease due to mutations in CFTR gene encoding for a

chloride channel. CF patients express a non-functional channel in epithelial cell

membranes and they are susceptible to chronic lung infections by P. aeruginosa. In this

work, resistance to ciprofloxacin of 60 P. aeruginosa clinical isolates was analyzed: 30

isolates from CF patients and 30 from other pathologies (non-CF), and the QRDR region

of GyrA gene was sequenced to identify polymorphisms related to quinolone resistance.

More ciprofloxacin-resistant isolates were found in the CF group (19/30) compared to

non-CF group (4/30) (p<0.001). Polymorphisms in both groups of isolates were identified:

Thr-83Ile, Asp87Asn, and Asp87Gly, among others. The number of ciprofloxacin-resistant

isolates with mutations in gyrA was significantly higher in the CF-group (11/24) compared

to non-CF group (3/21) (p<0.05), suggesting that the ciprofloxacin-resistance in this group

might be due to the mutations identified.

Keywords: Pseudomonas aeruginosa, gyrA gene, Polymorphism, Ciprofloxacin, Fluoroquinolones, Cystic Fibrosis, Antibiotic resistance.

Contenido XI

Contenido

Pág.

Resumen ........................................... ............................................................................. VII

Lista de figuras .................................. ........................................................................... XIII

Lista de tablas ................................... .......................................................................... XIV

Introducción ...................................... .............................................................................. 1

1. Capítulo 1: Estado del arte ....................... ............................................................... 5

1.1 Pseudomonas aeruginosa ............................................................................... 5

1.1.1 Características Generales ..................................................................... 5

1.1.2 Patogenicidad. ...................................................................................... 6

1.1.3 Epidemiología ....................................................................................... 9

1.2 Antibióticos del tipo quinolonas ...................................................................... 10

1.2.1 Estructura química .............................................................................. 10

1.2.2 Mecanismo de acción de las quinolonas ............................................. 11

1.2.3 Mecanismo de resistencia a quinolonas en P. aeruginosa .................. 13

2. Capítulo 2: Metodología ........................... .............................................................. 17

2.1 Tipo de investigación ..................................................................................... 17

2.2 Material biológico ........................................................................................... 17

2.3 Determinación de la susceptibilidad a la ciprofloxacina .................................. 19

2.4 Identificación de mutaciones en la región QDRD del gen GyrA. .................... 20

2.4.1 Extracción del ADN Genómico. ........................................................... 20

2.4.2 Cuantificación de ADN ........................................................................ 20

2.4.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). .................................... 21

2.4.4 Secuenciación de los productos obtenidos por PCR ........................... 22

2.5 Alineación de secuencias .............................................................................. 22

2.6 Análisis estadístico ........................................................................................ 22

3. Capítulo 3: Resultados ............................ ............................................................... 23

3.1 Susceptibilidad a ciprofloxacina ..................................................................... 23

3.2 Identificación de Mutaciones en la Región QDRD Del Gen GyrA ................... 25

3.2.1 Extracción de ADN genómico .............................................................. 25

3.2.2 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). .................................... 25

3.2.3 Secuenciación de los productos de PCR. ............................................ 27

3.3 Alineamiento múltiple de las secuencias ........................................................ 27

3.4 Polimorfismos en GyrA y resistencia a ciprofloxacina. ................................... 33

XII

Identificación de polimorfismos en el gen gyrA de Pseudomonas aeruginosa de pacientes con fibrosis quística y otras patologí as en la ciudad de

Cartagena (Colombia)

4. Capítulo 4: Discusión ............................. ................................................................39

5. Capitulo 5. Conclusiones y recomendaciones ........ .............................................45

5.1 Conclusiones ..................................................................................................45

5.2 Recomendaciones ..........................................................................................46

A. Anexo: Alineamiento de las secuencias de nucleótido s obtenidas para el gen GyrA………………. ....................................... ...................................................................47

B. Anexo: Alineamiento de las secuencias aminoacídicas (Los aminoácidos destacados corresponden a las mutaciones identifica das) .......................................51

Bibliografía ...................................... ...............................................................................55

Contenido XIII

Lista de figuras Pág.

Figura 1 -1 Pseudomonas aeruginosa. a) Microfotografía por microscopia de fuerza atómica de una célula típica de P.aeruginosa con flagelos polares (Stanley et al, 2007. b) Estructura química de piocianina expresado por P. aeruginosa (Liu & Nizet, 2009)

5

Figura 1-2 Fenotipo mucoide y no mucoide de P. aeruginosa aislada de paciente con FQ (Høiby, et al, 2008)

8

Figura 1 -3: Estructura de las Fluoroquinolonas. (a). Estructura básica o núcleo de las fluoroquinolonas. (B). Estructura de la ciprofloxacina (Zhanel et al. 2002)

10

Figura 1 -4: Composición de la ADN-girasa y mecanismo de acción (Nollmann et al, 2007).

12

Figura 3 -1: Electroforesis en gel de agarosa de muestras ADN genómico purificado de aislados clínicos de P. aeruginosa.

25

Figura 3 -2: Electroforesis en gel de agarosa al 1 % de los productos de la PCR obtenidos a partir de los aislados clínicos de P. aeruginosa provenientes de pacientes con FQ y de otras entidades clínicas.

26

Figura 3 -3: Cromatograma de una secuencia obtenida con el sistema de electroforesis capilar ABI 3730 utilizando el cebador delantero PaGa1 a partir del aislado PA036.

27

Contenido XIV

Lista de tablas Pág.

Tabla 1-1:Factores de virulencia en P. aeruginosa y su papel en la infección 7

Tabla 2-1: Listado completo de aislados clínicos de P. aeruginosa estudiados en este trabajo.

18

Tabla 3-1: Datos de resistencia a ciprofloxacina en los aislados clínicos de P. aeruginosa estudiados

23

Tabla 3-2: Cambios nucleotídicos hallados en los aislados clínicos procedentes de pacientes con FQ.

28

Tabla 3-3: Cambios nucleotídicos hallados en los aislados clínicos procedentes de pacientes con patologías diferentes a FQ.

29

Tabla 3-4: Cambios de aminoácidos identificados en los aislados clinicos procedentes de pacientes con FQ.

30

Tabla 3-5: Cambios de aminoácidos en los aislados clínicos procedentes de pacientes con patologías no-FQ.

31

Tabla 3-6: Resumen de las mutaciones genéticas encontradas en la región QRDR del gen gyrA de aislados clínicos de P. aeruginosa.

32

Tabla 3-7: Susceptibilidad a ciprofloxacina y polimorfismos en gyrA. 35

Tabla 3-8: Análisis comparativo de mutaciones del gen gyrA y patrón de susceptibilidad a ciprofloxacina por origen de la cepa de Pseudomonas aeruginosa.

37

Introducción

Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista que causa amplio rango de enfermedades en el ser humano, afectando a pacientes inmunocomprometidos, quemados y con fibrosis quística (FQ). En esta última enfermedad, se ha encontrado que P. aeruginosa es el microorganismo más predominante y causante de infección crónica a nivel pulmonar, lo cual genera reducción rápida de los parámetros respiratorios, convirtiéndose en la principal causa de muerte en éstos (Heijerman, 2005 & Ramsey, 1996). Además el progresivo aumento de la resistencia de este microorganismo a diversos antibióticos ha generado gastos económicos significativos, representados en hospitalizaciones ocasionalmente prolongadas con el fin de administrar antibioticoterapia parenteral, con agentes antimicrobianos de más alto costo y el empleo de un abordaje intervencionista que puede favorecer el desarrollo de sobreinfecciones por otros patógenos de difícil erradicación.

Las fluoroquinolonas son una de las alternativas recomendadas para el abordaje terapéutico vía oral de las infecciones por Pseudomonas aeruginosa, sin embargo, la rápida disminución de respuesta al tratamiento por mecanismos como mutaciones en genes codificantes de la subunidades de la girasa de ADN (gyrA y gyrB) y en genes reguladores para bombas de expulsión de fármacos, ha limitado su utilidad, especialmente en pacientes con fibrosis quística y pacientes cuya inmunidad se encuentra comprometida (oliver et al, 2000). Las mutaciones en los genes gyrA y gyrB, se encuentran en una región denominada QRDR (región determinante de resistencia a quinolonas) específica para cada subunidad. En gyrA, estas mutaciones afectan con mayor frecuencia al codón 83 y en segundo lugar al codón 87. Una mutación provoca susceptibilidad disminuida a las fluoroquinolonas y una doble mutación estaría asociada a elevados niveles de resistencia. En gyrB, las mutaciones más frecuentes ocurren en los codones 426 y 447, siendo de menor importancia clínica en comparación con las que ocurren en gyrA (Akasaka et al 2001 ).

El grupo de investigación UNIMOL, por medio del Programa de Atención Integral a Pacientes con Fibrosis Quística y sus Familias, realiza cultivos y antibiogramas de esputo periódicos a estos pacientes con FQ, en los cuales Pseudomonas aeruginosa, constituye el patógeno más aislado y exhibe una respuesta diferencial a aislados de P. aeruginosa procedentes de otras enfermedades, como es un mayor grado de resistencia a diferentes antibióticos, como la ciprofloxacina, generando un inferior pronóstico para estos pacientes. A pesar que los aspectos moleculares de Pseudomonas aeruginosa implicados en la falla al tratamiento con fluoroquinolonas es un tópico ampliamente reportado en la literatura a nivel mundial (Drlica et al, 1997; Cambau et al, 1995). En

2 Introducción

nuestro medio ha sido poco explorado y se desconocen cuales mecanismos moleculares puede estar involucrados en dicha diferencia. En este sentido este trabajo se pretendió responder las siguientes preguntas de investigación:

¿ Existen polimorfismos en el gen gyrA de Pseudomonas aeruginosa aislada de pacientes con fibrosis quística y otras patologías en la ciudad de Cartagena?

¿ Existe relación entre resistencia a ciprofloxacina y polimorfismos en GyrA?

Se analizaron 60 aislados clínicos de P.aeruginosa obtenidos de pacientes con Fibrosis Quística (aislados FQ), y de pacientes con otras patologías (aislados No-FQ). A todos los aislados se les determinó la respuesta a ciprofloxacina (sensible o resistente) y se obtuvieron las secuencias de la región QRDR mediante secuenciación directa. Una vez obtenidas las secuencias, se realizo un alineamiento múltiples en el programa MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis, versión 4.0) teniendo como secuencia de referencia la subunidad A del gen gyrA de P. aeruginosa (clon pGL2B5; GenBank Número de acceso L29417). Los resultados indican que el número de los aislados FQ presentaron una mayor resistencia a ciprofloxacina comparados con los aislados no-FQ (16 aislados FQ versus 4 aislados no-FQ) (p< 0,001). Nuestros resultados también muestran que no hubo diferencias significativas en el número de aislados con mutaciones entre los dos grupos de aislados analizados (14 (FQ) y 12 (no-FQ)), indicando que al menos en la muestra poblacional, así como en la región génica estudiada, no hubo una tendencia a presentar mutaciones en gyrA en uno u otro grupo estudiado.

El análisis de los alineamientos múltiples revelaron mutaciones en gyrA en ambos grupos de aislados: FQ (Thr-83Ile, Asp87Asn, Asp87Gly), no-FQ (las mismas anteriores, y las dobles mutaciones Val85Asn/Asp87Asn, Val85Gly/Asp87Asn y Asp87Asn/Ala119Pro). Los cambios identificados en este trabajo en los residuos 83 y 87 de gyrA han sido ampliamente reportados en la literatura como la sustituciones más frecuentemente identificada en aislados de P. aeruginosa con resistencia a este antimicrobiano. En la relación entre la presencia de mutaciones con la condición de resistencia a ciprofloxacina se observo que el grupo FQ presentó un número significativamente mayor de aislados resistentes y con mutaciones en gyrA, comparado con el grupo No-FQ (11/24 FQ versus 3/21 no-FQ) (p<0.05), mostrando que la resistencia a ciprofloxacina en el grupo FQ podría deberse a las mutaciones encontradas. También se observaron hechos interesantes como que algunos aislados resistentes a ciprofloxacina no presentaron ningún tipo de mutación en gyrA o que varios aislados que mostraron diferentes niveles de resistencia, a pesar de tener la misma mutación. Estos resultados podrían sugerir la participación de otros mecanismos (o genes) implicados en la resistencia a este antibiótico, como mutaciones en los genes que codifican para la subunidad B de la ADN-girasa (gyrB), y para la topoisomerasa IV (parC y parE), o la participación de bombas de eflujo como mecanismo de resistencia a este tipo de antimicrobianos.

Introducción 3

El análisis de los polimorfismos en gyrA adquieren enorme relevancia clínica porque demuestran que el uso de la ciprofloxacina contra las infecciones por P. aeruginosa en pacientes FQ no resultaría apropiado, debido a que las mutaciones identificadas en gyrA confieren resistencia a este antibiótico, lo que daría como resultado el fracaso terapéutico. Adicionalmente el conocimiento de aspectos moleculares que afectan la respuesta al tratamiento y el posterior desarrollo de medidas especificas para el manejo de este tipo de infecciones, disminuiría notablemente los gastos tanto de las familias de pacientes como del sistema de salud, al tratarse por lo general de padecimientos crónicos y de alto costo, reduciendo el tiempo de hospitalización, mayores técnicas diagnósticas y mal uso de antibióticos.

1. Capítulo 1: Estado del arte

1.1 Pseudomonas aeruginosa

1.1.1 Características Generales

Pseudomonas aeruginosa es un bacilo Gram negativo, aerobio estricto, oportunista, miembro de la γ-subdivisión de las Proteobacteria. Estos bacilos miden de 0.5 a 0.8 x 1.5-8 µm, y son móviles en virtud a la presencia de un simple flagelo polar (Figura 1-1a) (Bennik M, 2004). Muchas cepas de P. aeruginosa elaboran pigmentos que pueden participan en la toxicidad de las células eucariotas como la piocianina (azul) (Figura 1-1b), que puede inhibir la respiración celular mediante la alteración del ciclo Redox y el incremento del estrés oxidativo (Liu & Nizet, 2009). Otros de los pigmentos que pueden producir son la pioverdina (verde fluorescente), piorrubina (rojo oscuro), piomelanina (negro) (Govan & Deretic, 1996).

Figura1-1: Pseudomonas aeruginosa. a) Microfotografía por microscopia de fuerza atómica de una célula típica de P.aeruginosa con flagelos polares. Tomado de: Stanley et al, 2007. b) Estructura química de piocianina expresado por P. aeruginosa. Tomado de: Liu & Nizet, 2009.

a) b)

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Identificación de polimorfismos en el gen gyrA de Pseudomonas aeruginosa de pacientes con fibrosis quística y otras patologí as en la ciudad de Cartagena

(Colombia)

La temperatura optima de crecimiento de esta bacteria es 37 °C pero puede crecer a temperaturas superiores como los 42 °C, y aunque so n considerados como aerobios estrictos tiene la habilidad de crecer en condiciones anaeróbicas en presencia de arginina o nitratos como aceptores terminales de electrones. P. aeruginosa también presenta una notable versatilidad nutricional lo que les permite utilizar alrededor de 80 compuestos orgánicos como fuente de energía y carbono, por lo que puede habitar en una gran variedad de nichos ecológicos (Yahr & Parsek, 2006; Bennik M, 2004). Esta bacteria ha sido aislada de agua (dulce o salada), aire, suelo, animales, y plantas (Mahajan et al, 1999: Kominos et al, 1972). Se ha sugerido que esta versatilidad es consecuencia del tamaño del genoma (6,264 kb, 5,570 genes codificantes), así como a la complicada red de regulación celular, como se observa en los más de 90 sistemas reguladores de dos componentes en el genoma bacteriano (Stover et al, 2000: Manson et al, 1998).

1.1.2 Patogenicidad.

Aunque los seres humanos están en frecuente contacto con P. aeruginosa, las infecciones ocasionadas por ésta rara vez son adquiridas por pacientes inmunocompetentes; no obstante, cuando se alteran las barreras normales de la piel y mucosas, frente a estados de inmunodepresión o cuando el paciente es expuesto a reservorios del ambiente hospitalario, puede actuar como patógeno primario. Con base a esto, P. aeruginosa puede provocar infecciones graves como: neumonía (por el uso del tubo endotraqueal y ventilación), bacteriemia, infecciones del tracto urinario, ulceración de la córnea (de usar lentes de contacto), infecciones del sistema nervioso central y septicemia aguda en pacientes con quemadura o infección de la herida quirúrgica. Estas infecciones, generalmente nosocomiales, tienen un curso fulminante y una letalidad extremadamente alta a pesar de un tratamiento adecuado con antibióticos (Kang et al, 2005; Richards et al, 1999; Van Delden and Iglewski, 1998; Bodey et al, 1983).

P. aeruginosa es, además, el principal causante de infección pulmonar crónica en pacientes con enfermedades respiratorias crónicas como fibrosis quística (FQ), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y bronquiectasias (Martinez et al, 2008; Gilligan, 2001). Estas infecciones a pesar de presentar una elevada colonización bacteriana, son muy poco invasivas, no citotóxicas y raramente progresan a infección sistémica. Hecho que contrasta con infecciones como en el caso de neumonías asociadas a ventilación, las cuales se caracterizan por ser invasivas, citotóxicas y frecuentemente resultan en infección sistémica, shock séptico y elevada mortalidad (Hirakata, 2003; Lyczak et al 2000).

Capítulo 1: Estado del arte 7

Una vez que se establece la infección, P. aeruginosa produce una serie de compuestos tóxicos (Tabla 1-1), que causan no solo daño tisular extenso, si no también interfieren con el funcionamiento del sistema inmune (Lyczak et al 2000).

Tabla 1-1: Factores de virulencia en P. aeruginosa y su papel en la infección

Factor de virulencia Papel en la Infección

Pili Tipo IV � Movilidad, receptor para asilo Gm1

Flagelo � Motilidad y quimiotaxis durante la invasión tisular

Alginato � Producción de biofilm

Tipo de secreción tipo III � Secreción e inyección de factores de virulencia hacia el citoplasma de las células hospedero.

PcrV � Traslocación del sistema de secreción tipo III

Sistema de secreción Xcp � Secreción de toxinas y enzimas al fluido extracelular.

Exo S � Afecta los niveles de GTP y actividades de proteínas de unión a GTP de las células del hospedero.

Exo U � Toxico para los macrófagos.

Exotoxina A � Detiene la síntesis proteica de las células huésped.

LasA y LasB � Actúa sinérgicamente para degradar elastina, anticuerpos y otras proteínas.

Proteasa Alcalina

Fosfolipasa S

� Probablemente juegan un papel en la destrucción de los surfactantes pulmonares.

En primer lugar, los factores de virulencia de P. aeruginosa incluyen una variedad de toxinas extracelular (Exotoxina A, Fosfolipasa C, Elastasa) que pueden causar grandes daños a los tejidos del huésped a través de sus actividades enzimática. (Veesenmeyer et al, 2009; Bitter, 2003).

Otro grupo de factores de virulencia son los flagelos y Pili, donde los primeros permiten la adhesión a las células huésped facilitando la colonización y la evasión del sistema inmune (Arora et al, 1998; Manson, et al 1998; Govan & Deretic, 1996). De hecho, estudios de infección e invasión empleando cepas mutantes no flageladas se observo que están fueron defectivas (Fleiszig et al, 2001; Montie et al, 1982). Además, la proteína flagelar FliD ha sido implicada en la adherencia de P. aeruginosa a la mucina humana respiratorias, lo cual es importante para la colonización inicial de las vías respiratorias del paciente con FQ (Arora et al, 1998). Los Pili (tipo IV) por su lado median la adhesión específica a las células huésped eucarióticas, así como la unión no específica a otras

8


(Colombia)

superficies, por lo que éstos también intervienen en el contacto íntimo y la colonización bacteriana (Mattick, 2002; Arora et al, 1998).

Una característica distintiva de la patogenicidad de P. aeruginosa es la existencia del fenotipo mucoide, una condición donde las células bacterianas sobre producen el polisacárido extracelular alginato durante la colonización de los pulmones del paciente de FQ (Figura 1-2) (Govan & Deretic, 1996). El alginato aumenta la virulencia y supervivencia de P. aeruginosa ya que se comporta como una barrera para las células bacterianas en contra de los fagocitos y anticuerpos, interfiriendo con la fagocitosis (Krieg, et al, 1988; Simpson et al, 1988; Meshulam et al, 1984).

Figura 1-2: Fenotipo mucoide y no mucoide de P. aeruginosa aislada de paciente con FQ. Tomado de: Høiby, et al, 2008.

También puede modular el sistema inmune del hospedero debido a su capacidad de neutralizar radicales libres de oxigeno liberados por las células fagocíticas, suprimir las funciones de los linfocitos, y actuar como un mitógeno junto con los lipopolisacaridos (Mai et al, 1993; Daley et al, 1985). Además como un componente habitual de la biopelícula de P. aeruginosa, éste puede jugar un papel en las funciones asociadas a biofilms, tales como la adherencia y la resistencia a los antibióticos (Wozniak et al, 2003).

Aunque la patogénesis de P. aeruginosa es multifactorial, el sistema de secreción de tipo III (TTSS), es el mayor determinante de virulencia, ya que permite el transporte toxinas directamente desde la bacteria adherida a la célula eucariota. Este sistema de secreción transporta cuatro toxinas (Exo S, Exo T, Exo U y Exo Y) implicadas en la inhibición de la fagocitosis, la promoción de destrucción tisular y el retardo de la curación de heridas (Engel & Balachandran, 2009). La formación de biopelículas (biofilm) también juega un papel muy importante en la patogénesis de P. aeruginosa, ya que permite a este


microorganismo colonizar superficies, por ejemplo, instrumentos médicos como catéteres y tubos endotraqueales, y lentes de contacto, por lo que se piensa que también contribuye a la infección crónica de las vías respiratorias de pacientes con fibrosis quística. Comparando con los planctónicos, los microorganismos que crecen formando parte de biofilms presentan elevada resistencia a los antibióticos, a sistemas de eliminación mediados por el complemento, la fagocitosis y los biocidas. Estos hacen que las infecciones donde se han formado biofilms sean difíciles de tratar (Parsek & Nielsen, 2008; Fah et al, 2003; LeClerc et al, 2000).

1.1.3 Epidemiología

La neumonía causada por P. aeruginosa se encuentra entre las neumonías más frecuentes y generalmente también más graves dentro del conjunto de neumonías nosocomiales, donde este microorganismo es el primer causante de neumonía asociada a la ventilación mecánica (NAV) en las unidades de cuidados intensivos (UCI), causando elevadas tasas de mortalidad dada su facilidad para colonizar el aparataje hospitalario, incluyendo los respiradores artificiales (McGowan, 2006; Vincent 2003; Lynch, 2001). Entre los pacientes con neumonía nosocomial grave que precisan ingreso en la UCI, el 42% de las diagnosticadas etiológicamente se debe a bacilos Gram negativos, y P. aeruginosa es la causa en el 60% de los casos (Valles et al, 2003). La incidencia de neumonía asociada a la ventilación mecánica y los agentes involucrados más comúnmente varían según cada centro de referencia, donde esta variabilidad es aplicable a las diferentes poblaciones de pacientes estudiadas y a los parámetros diagnósticos empleados (Gaynes et al, 2005; Valles & Mariscal, 2005). En Colombia un estudio realizado por Ortiz et al, [2009] donde se tuvieron en cuenta 409 (48,4%) pacientes con episodios neumonía asociada a la ventilación mecánica de 35 UCI en siete ciudades de Colombia, se evidencio que P. aeruginosa fue la primera causa para esta patogénesis. Además, un estudio similar realizado por moreno et al, [2006] se encontró que de los 86 episodios de NAV diagnosticados, el 24,4% de estos eran ocasionados por P. aeruginosa. A nivel de la costa atlántica, un estudio realizado por Rebolledo et al, 2009 donde incluyo a 3.294 pacientes que ingresaron a las 9 UCI de la ciudad de barranquilla, evidenciaron que del 48.3 % de casos de NAV diagnosticados, P. aeruginosa fue la causa en el 46.3 % de los casos (Rebolledo et al, 2009).

Por otro lado, P. aeruginosa también puede ocasionar en las unidades de cuidado intensivo, alrededor del 16,3% de las infecciones del tracto urinario, 9,5% de las infecciones en herida quirúrgica, y el 3,4% de infecciones sistémicas (Gaynes et al, 2005). Este organismo es considerado como el tercero patógeno más común asociado con infecciones del tracto urinario asociados a catéter, donde su habilidad de formar biofilm contribuye significativamente con esta patogénesis, ya que le permite a la población bacteriana se pueda adherir a la superficie del catéter a través de los pilis y exopolisacaridos (Mittal et al, 2009). En los últimos 20 años la incidencia de las infecciones nocosomiales por P. aeruginosa ha sufrido un incremento, como es el aumento del 9,6% al 18,1% de neumonías adquiridas en hospitales, así como de las infecciones en herida quirúrgica y del tracto urinario (del 4,7% al 9,3% y del 9,3% al 16,3%, respectivamente) (Talbot et al, 2006, Gaynes et al, 2005).

10


(Colombia)

P. aeruginosa es, además, el principal causante de infección pulmonar crónica en pacientes con enfermedades respiratorias crónicas como fibrosis quística (FQ), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y bronquiectasias (Martinez et al, 2008; Gilligan, 2001). Se ha informado que el 60% de los pacientes adultos con FQ están infectados por P. aeruginosa, que puede llegar al 80% en pacientes mayores de 18 años. Los pacientes colonizados por P. aeruginosa durante los primeros 5 años de vida tienen un riesgo mayor de mortalidad (2,6veces) que el de los pacientes con FQ no colonizados por este microorganismo (Oliver et al, 2009). De hecho estudios inmunológicos han documentado que la colonización puede darse más temprano de lo que se sospechaba anteriormente, ya que se han evidenciado anticuerpos positivos a los 15 meses de edad (Burns et al, 2001). A nivel nacional un estudio realizado por Vásquez et al, [ ] en 128 pacientes con FQ, mostro que P. aeruginosa estuvo presente en 51 (3 9.8%) pacientes. Además cuando analizaron la edad de la colonización por parte de P. aeruginosa, se evidencio que el 35.2% de los pacientes estaban colonizados a una edad promedio de 6.38 años.

1.2 Antibióticos del tipo quinolonas

1.2.1 Estructura química

Las quinolonas son un grupo numeroso y químicamente muy heterogéneo de agentes antimicrobianos sintéticos, que surgieron a partir de modificaciones en el núcleo básico del ácido nalidíxico, introducido a la práctica clínica en 1962 (Zhanel et al, 2002). Las quinolonas, al igual que sus antecesores, tienen como unidad estructural básica un anillo hetero-aromático (figura 1-3a). Este tipo de antibióticos está compuesto por dos anillos, uno de tipo piridona y el otro aromático, bencénico o de otro tipo. Para que la molécula presente actividad bactericida, la piridona debe presentar un nitrógeno en posición 1, un carboxilo en posición 3 y un grupo carbonilo en posición 4. Estos dos últimos radicales son necesarios para la interacción con el ADN bacteriano (Bhanot et al, 2001).

Figura 1-3: Estructura de las Fluoroquinolonas. (A) Estructura básica o núcleo de las fluoroquinolonas. (B) Estructura de la ciprofloxacina. Tomado y modificado de Zhanel et al. 2002. A Critical Review of the Fluoroquinolones. Drugs. 62 (1): 13-59.


El principal avance en el desarrollo de este grupo de antibióticos fue en la década de los ochenta con la introducción de un átomo de flúor en la posición 6 y un anillo piperazina en el carbono 7 (figura 1-3b), dando origen a norfloxacina, ofloxacina, ciprofloxacina, etc, los cuales presentaron mejoras tanto en actividad biológica como en propiedades farmacocinéticas (buena absorción oral y amplia distribución tisular). El sustituyente flúor en el C-6 incrementó tanto la penetración celular (1 a 70 veces) así como la inhibición de la ADN girasa (2 a 17 veces) comparado con anteriores moléculas que no poseían esta sustitución. De igual forma, la integración de un grupo básico en la posición C-7 aumentó la actividad inhibitoria de la ADN-girasa, así como la potencia, la solubilidad y otras propiedades fisicoquímicas. Hay datos que reportan que un anillo de piperazina desempeña un papel en la inhibición de mecanismos de eflujo, mejorando la potencia del fármaco. Frente a P. aeruginosa, la ciprofloxacina es la más activa de las fluoroquinolonas. Las diferencias en las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) típicas de la ciprofloxacina son de dos a ocho veces menores que las de levofloxacina o de quinolonas más nuevas como moxifloxacina y gatifloxacina (Zhanel et al, 2002; Bauernfeind, 1997).

1.2.2 Mecanismo de acción de las quinolonas

Las fluoroquinolonas son potentes agentes antibacterianos, y su diana molecular son dos enzimas relacionadas: la ADN girasa (Topoisomerasa II) y la Topoisomerasa IV (Ruiz, 2003). Estas enzimas son responsables del mantenimiento del estado adecuado de superenrrollamiento del ADN en las regiones del cromosoma en que ocurre la replicación (Hawkey, 2003; Drlica & Zhao, 1997). Estas enzimas son ATP-dependientes y catalizan la reacción de relajación del ADN superenrrollado, catenación y decatenación de los anillos de ADN (Levine & DiBona, 2002). En Escherichia coli existen dos tipos de topoisomerasas bacterianas clasificadas con base a su funcionamiento: las tipo I y las tipo II; mientras las de tipo I cortan transitoriamente una de las cadenas de la hélice de ADN para pasar otra cadena simple por la ruptura, las del tipo II lo hacen sobre las dos cadenas de ADN pasando una cadena doble o un segmento de doble cadena a través de la ruptura. Posteriormente se religan los extremos que fueran separados. A este último grupo pertenecen la ADN-girasa (topoisomerasa II) y la topoisomerasa IV (Levine & DiBona, 2002; Hooper, 2001).

La ADN-girasa es un heterotetrámero compuesto por dos subunidades A y dos subunidades B (GyrA2-GyrB2), las cuales están codificadas por los genes gyrA y gyrB, respectivamente, y cuya actividad enzimática es esencial para la regulación del superenrrollamiento del ADN, transcripción, iniciación y elongación durante la replicación del ADN (figura 1-4a) (Nollmann et al, 2007; Levine &DiBona, 2002). Esta enzima cataliza de un modo eficiente reacciones de enrollamiento o desenrrollamiento del ADN, pero su acción como decatenasa es pobre. Además, es la única topoisomerasa conocida con la capacidad de generar enrollamientos negativos en ácidos nucleícos. Debido a esta propiedad única, es esencial para el mantenimiento de la densidad cromosomal y responsable de aliviar el estrés torsional que se acumula por delante de la horquilla de replicación y transcripción (figura 1-4. b) (Hawkey, 2003; Drlica y Zhao, 1997).

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Figura 1-4: Composición de la ADN-girasa y mecanismo de acción (a). La ADN-girasa es un heterotetramero compuesto por dos monómeros de GyrA (azul) y dos de GyrB (amarillo). (b) (1) En primer lugar, la ADN-girasa se une a un dúplex de ADN por la región denominada fragmento G (del inglés ¨gate¨). (2-3) La unión del ATP a los dos dominios N-terminales los aproxima. El cambio conformacional provoca la incisión del fragmento G en ambas hebras y la unión de otro dúplex de ADN, el fragmento T. (4-5) A continuación, el fragmento T atraviesa el hueco en el fragmento G dirigiéndose a la parte inferior de la enzima. La hidrólisis del ATP devuelve a la enzima a su estado inicial con el fragmento G aun unido. Tomado y modificado: Nollmann et al, 2007.


La topoisomerasa IV es un tetrámero C2D

2 y es codificada por los genes parC y parE. Las

subunidades C y E son homólogas a las subunidades A y B de la topoisomerasa II respectivamente. Es la principal decatenasa bacteriana. Como resultado de esta propiedad, sus funciones fisiológicas son la separación de las cadenas de ADN hijas posteriores a la replicación, además de separar catenenos y nudos resultantes de procesos de recombinación (Drlica y Zhao, 1997).

Para alcanzar sus dianas, las fluoroquinolonas necesitan cruzar la membrana citoplasmática y, en bacterias gramnegativas, la membrana externa. Una vez en el interior de la célula las quinolonas interactúan con los complejos que se forman entre el ADN y las topoisomerasas II y IV, creando alteraciones conformacionales que resultan en la inhibición de la actividad enzimática normal. La enzima se queda atrapada en el complejo fármaco-enzima-ADN, inhibiendo la replicación del ADN puesto que se desarrolla una barrera física que impide el movimiento de la horquilla de replicación, ARN polimerasa y ADN helicasa (Hooper, 2001).

La formación de estos complejos inhibe la religación del ADN y el crecimiento celular, además, de inducir la respuesta S.O.S y se supone que es el mecanismo responsable de la acción bacteriostática de las quinolonas. La acción letal necesita por lo menos dos pasos, siendo el primero de ellos la formación de los complejos bacteriostáticos anteriormente mencionados. Para ejercer su actividad bactericida son necesarias concentraciones superiores a las bacteriostáticas y algunas quinolonas inhiben mejor el crecimiento que otras pero son menos eficaces en el efecto bactericida (Drlica et al, 2008; Hawkey, 2003).

1.2.3 Mecanismo de resistencia a quinolonas en P. aeruginosa

Existen varios mecanismos de resistencia bacteriana a las quinolonas, pudiendo coexistir varios en una misma cepa e interactuar de forma sinérgica, incrementando significativamente los niveles de resistencia. Los principales mecanismos de resistencia descritos son: (1) Mutaciones en los genes que codifican las topoisomerasas bacterianas II y IV; (2) Disminución de la permeabilidad de la pared bacteriana por alteraciones en la expresión de proteínas de la membrana externa (porinas), (3) excreción activa del antimicrobiano por sobre-expresión de sistemas de expulsión y (4) resistencia mediada por plásmidos (Hooper, 2001).

En Pseudomonas aeruginosa, al igual que otras bacterias, el mecanismo más importante que confiere resistencia a las quinolonas son las mutaciones en los genes que codifican para las subunidades A y B de la ADN-girasa. Los cambios de aminoácidos en las subunidad gyrA de la ADN-girasa se encuentran generalmente en una región entre los codones 67 y 106, que se ha denominado región QDRD (Quinolone resistance-determining región), la cual está próxima al sitio activo, donde la tirosina 122 (Tyr122) se une covalentemente a las hebras de ADN rotas durante la acción enzimática. Aunque las mutaciones en los codones 67, 81, 82, 83, 84, 87 y 106 de gyrA han demostrado ser

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responsables del desarrollo de resistencia a quinolonas en E. coli (Ruiz, 2003), el principal efecto de resistencia se asocia con mutaciones en los aminoácidos 83 y 87 (Drlica et al, 2008; Drlica y Zhao, 1997), observándose que estos cambios alteran la estructura del sitio de unión de las quinolonas en el complejo girasa-ADN llevando a una disminución de la afinidad de la quinolona por dicho sitio (Hooper, 2001).

La resistencia a fluoroquinolonas también es resultado de la disminución de la acumulación del fármaco al interior de la célula bacteriana. Se han establecido dos principales mecanismos: la disminución de porinas en la membrana externa, y sistemas de expulsión activa (Ruiz, 2003). Las porinas son proteínas presentes en la membrana externa de las bacterias gramnegativas y funcionan como cribas moleculares, con base en el tamaño, carga iónica e hidrofobicidad de la molécula. La ausencia o disminución de la expresión de OmpF en cepas mutantes de Escherichia coli está relacionada con una disminución de la sensibilidad a algunas quinolonas pero otras como tosufloxacina y esparfloxacina no son afectadas y puede implicar resistencia cruzada a otros agentes antimicrobianos. La porina OmpC en Escherichia coli y las Ompk35 y Ompk36 en Klebsiella pneumoniae, homólogas de OmpF y OmpC, han sido también descritas como implicadas en la resistencia a quinolonas. Estos mecanismos de resistencia son generalmente de bajo nivel puesto que la entrada del antimicrobiano no es evitada completamente; por esto, la resistencia suele ser el resultado de la combinación de defectos en la permeabilidad sumado a otros mecanismos de resistencia. En Pseudomonas aeruginosa este tipo de resistencia es inducible y permite una supervivencia inmediata. Todas las quinolonas pueden cruzar la membrana externa a través de las porinas, pero solamente las más hidrofóbicas pueden atravesar la capa lipídica. Las alteraciones en la expresión de porinas, sobretodo de OmpF, o mutaciones, suponen una disminución en la entrada de la quinolona dentro de la célula, aunque otros antimicrobianos y sustancias puedan ser afectadas (Van Bambeke et al, 2005).

El segundo mecanismo de resistencia, común en especies de grampositivas y gramnegativas, son los sistemas de expulsión activa, aunque más complejos en las segundas por las características estructurales de la pared celular. Los determinantes del eflujo de la resistencia a fluoroquinolonas son transportadores multifármaco codificados por genes cromosómicos endógenos. Estos sistemas de expulsión activa pueden transportar una amplia variedad de sustratos, incluyendo antimicrobianos no relacionados estructuralmente como quinolonas, betalactámicos, aminoglicósidos, macrólidos, anfenicoles, tetraciclinas, colorantes, detergentes y/o solventes orgánicos. Esta excreción se hace de un modo dependiente de energía, pero no implica alteración/degradación del sustrato (Poole, 2005). Estos sistemas se pueden agrupar en estas familias según el modo de obtención de energía. Las familias MFS, SMR, MATE y RND (del inglés Major facilitator superfamily; small multidrug resistance, the multidrug and toxic-compound extrusion, and resistance nodulation división, respectivamente), obtienen su energía por medio de un gradiente protónico (∆pH), mientras las ATPasas del tipo ABC (ATP Binding Cassette) lo obtienen por hidrólisis del ATP. Ejemplos de sistemas de expulsión activa responsables de resistencia intrínseca y adquirida a las quinolonas son MexAB-OprM,


MexCD-OprJ y MexEF-OprN, entre otros en Pseudomonas aeruginosa y AcrAB, AcrEF, AcrD, MacAB, EmrAB y MdfA en Escherichia.coli (Drlica & Zhao, 1997). La expulsión activa es responsable de bajos niveles de resistencia, pudiendo actuar como un primer paso en la selección de resistencias; su ausencia puede hacer más difícil la selección de cepas resistentes. En algunos casos los sistemas de expulsión activa pueden por si mismos ser responsables de niveles de resistencia clínicamente relevantes (Van Bambeke et al, 2005). Un factor importante a tener en cuenta es que estos sistemas de expulsión activa permiten la supervivencia bacteriana en la presencia de concentraciones sub-óptimas de antimicrobianos.

2. Capítulo 2: Metodología

2.1 Tipo de investigación

El presente estudio es de carácter descriptivo y analítico.

2.2 Material biológico

En el presente trabajo se estudiaron 60 aislados clínicos de Pseudomonas aeruginosa obtenidos de pacientes con diferentes cuadros clínicos. La mitad de las muestras (30 aislados) fueron obtenidas del esputo de pacientes con fibrosis quística (aislados FQ), y la otra mitad (30 aislados) se obtuvieron de pacientes con entidades clínicas diferentes a fibrosis quística (aislados No-FQ); la mayor proporción de éstas últimas provenían de secreciones de heridas y de orina (Tabla 2-1).

Todos los aislados fueron recolectados el año 2009 en la ciudad de Cartagena por integrantes del grupo UNIMOL; los pacientes con fibrosis quística (FQ) pertenecen al Programa de “Atención Integral del Paciente con Fibrosis Quística” desarrollado por el grupo UNIMOL en la ciudad de Cartagena (Colombia). Las muestras de esputo se tomaron previo enjuague oral con agua y aceptación del consentimiento informado. El resto de los aislados procedieron de cultivos realizados a pacientes hospitalizados con entidades clínicas varias diferentes a fibrosis quística en distintos centros de salud de la ciudad de Cartagena. Todas las muestras fueron tomadas bajo consentimiento escrito e informado del paciente o de un familiar responsable.

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Tabla 2-1: Listado completo de aislados clínicos de P. aeruginosa estudiados en este trabajo.

AISLADO TIPO ORIGEN AISLADO TIPO ORIGEN

PA001 FQ Esputo PA031 NO-FQ Urocultivo

PA002 FQ Esputo PA032 NO-FQ Herida


PA004 FQ Esputo PA034 NO-FQ Sec. Quemaduraa

PA005 FQ Esputo PA035 NO-FQ Secreción Ulcera




PA009 FQ Esputo PA039 NO-FQ Tejido de rodilla




PA013 FQ Esputo PA043 NO-FQ Sec. Respiratoriasb




PA017 FQ Esputo PA047 NO-FQ Coprocultivo

PA018 FQ Esputo PA048 NO-FQ Secreción perianal



Capítulo 2: Metodología 19

Continuación de la tabla 2.1

AISLADO TIPO ORIGEN AISLADO TIPO ORIGEN

PA021 FQ Esputo PA051 NO-FQ Coprocultivo








PA029 FQ Esputo PA059 NO-FQ Secreción ótica

PA030 FQ Esputo PA060 NO-FQ Aspirado Cadera

aSec. Quemadura: Secreción de quemaduras. bSec .respiratorias: Secreción vías respiratorias bajas

2.3 Determinación de la susceptibilidad a la ciprofloxacina

Se determinó la concentración inhibitoria mínima (CIM) a ciprofloxacina utilizando el método de microdilución en caldo bajo los criterios establecidos por Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI 2009). Cada uno de los aislados clínicos se sembró en agar Müeller Hinton (AMH) y se incubó de 18-24 h a 37°C. Posterior a la incubación , se tomaron dos a tres colonias y se resuspendieron en solución salina isotónica (NaCl 0.85%) hasta alcanzar una turbidez equivalente a la del tubo 0.5 del nefelómetro de McFarland (aproximadamente 108 UFC/mL). En paralelo se preparó una microplaca con 96 pozos de fondo redondo, en la que se realizaron diluciones seriales del antibiótico en un volumen final de 50 µL; por último, se colocaron 50 µL del inóculo en cada uno de los pozos, y las microplacas fueron incubadas durante 18-24 h a 37°C. Se utilizó como c ontrol la Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 como lo recomienda la CLSI.

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2.4 Identificación de mutaciones en la región QDRD del gen GyrA.

2.4.1 Extracción del ADN Genómico.

Se siguió el protocolo de extracción de ADN genómico por CTAB descrito por Sambroock et al. (1989), con alguna modificación:

• Se hizo crecer el microorganismo en un vial con 1000 µl de caldo LB (Luria-Bertani) a 37 o C toda la noche (O/N).

• Se centrifugó a 5000 rpm durante 3 min y se resuspendió el pellet en 567 µL de buffer TE (Tris HCl – EDTA), añadiendo 30 µL SDS al 10% y 3 µL de Proteínasa K 20 mg/ml (Promega, Madison WI, EU) y se incubó a 37 ºC por 60 min.

• Se agregaron 100 µl de NaCl 5 M, y luego 80 µl de solución de CTAB/NaCl, y se incubó por 10 min a 65 ºC.

• Se añadió igual volumen de cloroformo / isoamílico, 24:1, se mezcló y centrifugó por 5 min a 13.000 rpm. Se removieron los sobrenadantes viscosos y se pasaron a tubos nuevos.

• Se añadió a cada nuevo tubo 400 µl de Isopropanol para precipitar los ácidos nucleícos, centrifugando por 5 min a 13.000 rpm.

• Se lavó el ADN con 250 µl de etanol al 70% para remover el CTAB residual y se centrifugó una vez más por 5 min, posteriormente se descartó el sobrenadante, y se secaron los tubos por 10 min.

• Se disolvió el pellet en 30 µl de Buffer TE y se adicionó 1 µl de RNAasa (Promega, Madison WI, EU. 10 mg/ml en agua ultrapura) incubando por 15 minutos a 37 ºC.

Las muestras de ADN purificado fueron analizadas mediante electroforesis en geles de agarosa (1% p/v en buffer TAE 1X). Estos fueron digitalizados a través del sistema de fotodocumentación Kodak EDA 290 1D versión 3,5,4 con transiluminador Spectroline Bi – O Vision (Spectroline, Westbury NY, EU).

2.4.2 Cuantificación de ADN

Para determinar la concentración de ADN se realizaron lecturas de Absorbancia a 260 nm en un espectrofotómetro Hewlett Packard 8453 UV-VIS DAD; para ello se mezclaron 5 µl de la solución de ADN con 995 µl de agua destilada. Un valor de DO260 nm igual a 1 equivale a 50 µg/ml de DNA. La calidad del ADN fue inferida a partir de la razón DO260/280.

Capítulo 2: Metodología 21

2.4.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

La amplificación de la región QRDR del gen gyrA se realizó mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando los cebadores PaGa1 y PaGa 4, los cuales fueron previamente reportados por Kureishi et al, (1994). Estos cebadores amplifican un fragmento de 252 bp, que abarca la región de los codones 38 al 122, dentro de la cual se encuentra la región QRDR (codones 67-106) del gen gyrA de P. aeruginosa. A continuación se detalla la secuencia y sentido de los cebadores empleados.

Los reactivos utilizados y sus concentraciones finales en la mezcla de PCR fueron:

Reactivo Concentración

Final

Volumen

µl

Buffer (Tris.HCl, KCl, pH8, 4).

50 mM 6 µl

MgCl2 3mM 3,6 µl

dNTPS (c/u de los trifosfatos A,C,G,T)

480 uM 6 µl

Iniciador - F 18 pM 2,4 µl

Iniciador - R 18 pM 2,4 µl

aq ADN polimerasa 1,2 U 6 µl

ADN molde 240ng

Volumen Final 60 µl

La amplificación se llevó a cabo en un termociclador Genius (Techne Incorporated, Burlington NJ, EU). Se utilizó el siguiente perfil térmico: un ciclo inicial de desnaturalización a 95 °C durante 5 minutos; 30 cic los de 1 minuto a 95°C, un 1 minuto a 61 °C y 1 minuto a 72° C; un ciclo final a 72°C dur ante 10 minutos.

Los productos amplificados se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1% bajo las condiciones antes descritas, con el fin observar el resultado de la amplificación y confirmar el tamaño del producto (252 pb).

Cebador Sentido Secuencia (5’------ 3’) PaGa1 Delantero TGACGGCCTGAAGCCGGTGCAC PaGa4 Reverso TATCGCATGGCTGCGGCGTTG

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El ADN amplificado se purificó posteriormente usando Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) bajo las condiciones descritas por el fabricante y se resuspendió en 35 µl de agua ultra pura estéril. De esta solución se tomaron 5 µl para el análisis por electroforesis en gel de agarosa.

2.4.4 Secuenciación de los productos obtenidos por PCR

Se contrató el servicio de secuenciación de ADN con Macrogen Inc (Korea), lugar en el cual se realiza la secuenciación de ADN mediante el método de Sanger y utilizan secuenciadores capilares automáticos del tipo ABI3700 y ABI3730XL. Para la reacción de secuenciación se enviaron los productos de amplificación (20 µl por muestra) y los iniciadores “Delantero” y “Reverso” utilizados en la reacción de amplificación con el fin de obtener las secuencias correspondientes a las dos hebras de ADN (sentido y antisentido).

2.5 Alineación de secuencias

Las secuencias obtenidas fueron revisadas y depuradas utilizando el programa MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis, versión 4.0) (Tamura et al, 2007). La depuración de las secuencias consistió en contrastar los cromatogramas de las secuencias sentido y antisentido, corregir las bases mal asignadas o no reconocidas, y eliminar las bases asignadas a bandas de baja intensidad correspondientes a amplificaciones no específicas. Una vez depuradas se obtuvieron las secuencias consenso.

2.6 Análisis estadístico

Para el análisis de los datos se utilizó el software estadístico Med Calc 5.4. Para determinar la asociación entre la presencia de mutaciones genéticas y los patrones de resistencia observados en los grupos de estudio se utilizó el Test de Fischer. Se consideró significancia estadística cualquier valor de p ≤0.05.

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3. Capítulo 3: Resultados

3.1 Susceptibilidad a ciprofloxacina A todos los aislados clínicos de P. aeruginosa seleccionados se les determinó su perfil de susceptibilidad a ciprofloxacina mediante de la técnica de microdilución en caldo, de acuerdo a las recomendaciones de CLSI (CLSI, 2009). Los resultados se muestran en la tabla 3-1. Teniendo en cuenta las concentraciones mínimas inhibitorias (MIC) obtenidas, se encontró que el 63.3% (19/30) de los aislados FQ fueron resistentes a ciprofloxacina. En contraste, un 13.3% (4/30) de los aislados no-FQ exhibieron resistencia a este antibiótico. EL análisis estadístico indica que tal diferencia es significativa (p<0.001) (Tabla 3).

Tabla 3-1: Datos de resistencia a ciprofloxacina en los aislados clínicos de P. aeruginosa estudiados.

AISLADO CMIa (µg/ml)

SUSCEPTIBILIDAD b AISLADO CMIa (µg/ml)

SUSCEPTIBILIDAD b

PA001 32 Resistente PA031 1 Susceptible


PA003 32 Resistente PA033 0.5 Susceptible


PA005 1 Susceptible PA035 2 Intermedio

PA006 1 Susceptible PA036 1 Susceptible

PA007 1 Susceptible PA037 0.5 Susceptible


PA009 0.5 Susceptible PA039 1 Susceptible

PA010 2 Intermedio PA040 1 Susceptible

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(Colombia)

Continuación de la Tabla 3-1.

AISLADO CMIa (µg/ml)

SUSCEPTIBILIDADb AISLADO CMIa (µg/ml)

SUSCEPTIBILIDADb


PA012 2 Intermedio PA042 0.5 Susceptible

PA013 1 Susceptible PA043 2 Intermedio








PA021 2 Intermedio PA051 2 Intermedio






PA027 1 Susceptible PA057 8 Resistente




aCMI: Concentración mínima inhibitoria.

bCriterios de CLSI para ciprofloxacina: susceptible, ≤ 1mg/litro; intermedio, 2 mg/litro, resistente ≥ 4 mg/litro. Aislados resistentes a ciprofloxacina: grupo FQ (19/30, no-FQ (4/30) (p<0.001).

Capítulo 3: Resultados 25

3.2 Identificación de Mutaciones en la Región QDRD Del Gen GyrA

3.2.1 Extracción de ADN genómico

De cada uno de los aislados clínicos se purificó ADN genómico, según lo descrito en la metodología. En general se observó que el protocolo para la extracción de ADN permitió obtener suficiente ADN, y de buena calidad. En la figura 3-1se observa un gel representativo de algunas muestras de ADN extraídos de los aislados clínicos de P. aeruginosa.

Figura 3-1: Electroforesis en gel de agarosa de muestras ADN genómico purificado de aislados clínicos de P. aeruginosa. Carril 1-15 muestras de ADN total extraído a partir de aislados clínicos provenientes de pacientes con fibrosis quística. El número sobre la figura corresponde al número de carril (no de aislado).

3.2.2 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

A continuación, para cada uno de los ADN genómicos purificados, se amplificó una región de 252 pb, que abarca la zona QDRD del gen gyrA de P. aeruginosa. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 1% y se visualizaron en un transiluminador de luz ultravioleta, realizando el respectivo registro fotográfico (Figura 3-2).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

ADN genómico

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Figura 3-2: Electroforesis en gel de agarosa al 1 % de los productos de la PCR obtenidos a partir de los aislados clínicos de P. aeruginosa provenientes de pacientes con FQ y de otras entidades clínicas. Los números sobre el gel corresponden al número de identificación del aislado. M. Marcador de peso molecular (100-1500 pb). S: P. aeruginosa ATCC® 27853. FQ: Aislados provenientes de pacientes con fibrosis quística; No-FQ: aislados provenientes de pacientes con otras patología

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3.2.3 Secuenciación de los productos de PCR.

De los 61 productos de PCR que se enviaron a secuenciar (60 aislados clínicos, y un control correspondiente a la cepa de referencia PAO1), se obtuvieron sólo 45 secuencias de 192 nucleótidos cada una, correspondientes a los codones 38-122 de gyrA (24 secuencias del grupo FQ, y 21 secuencias del grupo No-FQ). Las bases adyacentes a los cebadores no fueron bien resueltas, por lo que no se consideraron para el análisis. La figura 3-3 muestra un cromatograma representativo de las secuencias obtenidas.

Figura 3-3: . Cromatograma de una secuencia obtenida con el sistema de electroforesis capilar ABI 3730 utilizando el cebador delantero PaGa1 a partir del aislado PA036.Cada nucleótido aparece en un color diferente (verde para adenina, rojo para timina, azul para citosina y negro para guanina).

3.3 Alineamiento múltiple de las secuencias

Las secuencias obtenidas fueron luego alineadas según se describe en la metodología. El anexo A muestra el alineamiento múltiple de las secuencias de nucleótidos de los aislados clínicos estudiados. El análisis de los alineamientos revela la existencia de mutaciones en el fragmento analizado del gen gyrA en ambos grupos de aislados clínicos de P. aeruginosa. Para los aislados procedentes de pacientes con FQ se detectaron mutaciones dentro de la región QDRD, específicamente en las posiciones nucleotídicas 248, 259 y 260 con respecto al sitio de inicio de la transcripción del gen gyrA. En estas posiciones se observaron los cambios de C por T, G por A y A por G, respectivamente (Tabla 3-2).

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Tabla 3-2 : Cambios nucleotídicos hallados en los aislados clínicos procedentes de pacientes con FQ.

Aislados

Posición en GyrA

(nt)*

Cambio de nucleótido

PA003 248 C T

PA004 248 C T

PA008 260 A G

PA009 259 G A

PA010 259 G A

PA011 248 C T

PA012 259 G A

PA014 260 A G

PA016 260 A G

PA017 248 C T

PA021 260 A G

PA022 260 A G

PA027 248 C T

PA030 259 G A

(*) Posición relativa respecto al sitio de inicio de la transcripción del gen gyrA.

En el grupo de los aislados procedentes de patologías diferentes a FQ también se detectó la sustitución de G por A en el nucleótido 259 (Tabla 3-3). De igual forma, se pudo evidenciar dobles o triples sustituciones en la misma región y aislado, como fueron las modificaciones de T por G y G por A en las posiciones 254 y 259, ó G por A, A por G, G por C en las posiciones 259, 354 y 355, respectivamente. Así mismo, se pudo constatar la presencia sustituciones nucleotídicas simples (PA048) o dobles (PA050) fuera de la región QDRD, la cual está comprendida entre los nucleótidos 199 y 318 (codones 67-106).


Tabla 3-3: Cambios nucleotídicos hallados en los aislados clínicos procedentes de pacientes con patologías diferentes a FQ.

(*) Posición relativa respecto al sitio de inicio de la transcripción del gen gyrA.

Aislados

Posición en GyrA

(nt)*

Cambio de nucleótido

PA031 259 G A

PA033 259 G A

PA034 259 G A

PA035 254 T G

259 G A

PA037 259 G A

PA039 259 G A

PA040

259 G A

354 A G

355 G C

PA043 259 G A

PA044 259 G A

PA048 152 C G

PA050 151 G T

152 C G

PA051

163 C A

213 C G

228 G A

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(Colombia)

En el ANEXO B se muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de los aislados de P. aeruginosa, obtenido a partir de la traducción de las secuencias nucleotídicas alineadas. De todas las mutaciones genéticas identificadas para el gen gyrA, aquellas que significan un cambio de aminoácido se resumen en las tablas 3-4 y 3-5. En los aislados procedentes de FQ se evidenció cambios de aminoácido en los codones 83 y 87: Thr83Ile, Asp87Gly, Asp87Asn.

Tabla 3-4: Cambios de aminoácidos identificados en los aislados clinicos procedentes de pacientes con FQ.

Aislados

Cambio de aminoácido

PA003 Thr83Ile

PA004 Thr83Ile

PA008 Asp87Gly

PA009 Asp87Asn

PA010 Asp87Asn

PA011 Thr83Ile

PA012 Asp87Asn

PA014 Asp87Gly

PA016 Asp87Gly

PA017 Thr83Ile

PA021 Asp87Gly

PA022 Asp87Gly

PA027 Thr83Ile

PA030 Asp87Asn

Los aislados procedentes de pacientes no-FQ, al igual que los aislados pertenecientes a pacientes con FQ, presentaron también el cambio de ácido aspártico a asparagina en el codón 87 (Asp87Asn) del gen gyrA (Tabla 7). También se identificaron reemplazos dobles de aminoácidos, como los presentes en los codones 85 y 87 ó 87 y 119 donde se


presentaron cambios de valina por glicina (Val85Gly) y de ácido aspártico a asparagina (Asp87Asn) o alanina por prolina (Ala119Pro), respetivamente.

Tabla 3-5: Cambios de aminoácidos en los aislados clínicos procedentes de pacientes con patologías no-FQ.

Las sustituciones que se hallaron fuera de la región QDRD ocasionaron cambios de aminoácidos en el codón 51 (Ala51Gly y Ala51Cys) y el codón 55 (Leu55Met). A diferencia del grupo anterior, este grupo presentó cambios de tipo silencioso en los codones 71, 76 y 118 (cepa PA051 y PA040, respectivamente). En la tabla 3-6 se resumen todos los cambios de nucleótidos y de aminoácidos hallados en el fragmento analizado del gen gyrA.

Aislados

Cambio de aminoácido

PA031 Asp87Asn

PA033 Asp87Asn

PA034 Asp87Asn

PA035

Val85Gly

Asp87Asn

PA037 Asp87Asn

PA039 Asp87Asn

PA040

Asp87Asn

Ala119Pro

PA043 Asp87Asn

PA044 Asp87Asn

PA048 Ala51Gly

PA050 Ala51Cys

PA051 Leu55Met

32


(Colombia)

Tabla 3-6: Resumen de las mutaciones genéticas encontradas en la region QRDR del gen gyrA de aislados clinicos de P. aeruginosa.

Procedencia

Tipo de Mutación

Remplazo de Aminoácido

Remplazo de Nucleótidos

Número (%) de Mutaciones

Encontradas

Número (%) de Cepas sin Mutaciones

FQ Simple Thr 83-Ile ACC-ATC 5 (11.1) 10 (22.2)

Simple Asp87-Gly GAC-GGC 5 (11.1)

Simple Asp 87- Asn GAC-AAC 4 (8.9)

Simple

Simple

Simple

Simple

Simple

Ala 51-Gly

Ala 51-Cys

Leu 55-Met

Asp 87-Asn

Ala118-Ala

GCC-GGC

GCC-TGC

GTC-ATG

GAC-ACC

GCA-GCG

1 (2.2)

1 (2.2)

1 (2.2)

7 (15.6)

1 (2.2)

7 (15.6)

NO-FQ Doble

Doble

Doble

Gly71-Gly

Lys76-Lys

Val 85 - Gly

Asp 87- Asn

Asp 87- Asn

Ala119 - Pro

GGC-GGG

AAG-AAA

GTC-GGC

GAC-AAC

GAC-AAC

GCC-CCC

1 (2.2)

1 (2.2)

1 (2.2)

Total de cepas con o sin mutaciones en el gen gyrA n= (62.2) 17 (37.8)

Total de cepas analizadas 45 (100)

*Este número corresponde al total de aislados cuyas secuencias fueron obtenidas.


3.4 Polimorfismos en GyrA y resistencia a ciprofloxacina.

La tabla 3-7 muestra un resumen de todos los aislados clínicos para los cuales se logró obtener secuencias de la región analizada, y los datos de CMI para ciprofloxacina y la presencia o ausencia de mutaciones en el gen gyrA.

Con el fin de realizar asociaciones entre la presencia/ausencia de mutaciones y los patrones de resistencia/susceptibilidad a ciprofloxacina, los resultados fueron analizados estadísticamente mediante el Test de Fisher, según se describe en Metodología. Los resultados del análisis estadístico se resumen en la Tabla 3-8, donde se aprecia lo siguiente:

1. El número de aislados clínicos que presentan mutaciones en el grupo FQ no es significativamente diferente del número de aislados con mutaciones en el grupo No-FQ (14 aislados FQ versus 12 no-FQ) (p>0.05). Esto indica que, al menos en la muestra poblacional y región del gen estudiadas en el presente trabajo, no existe una mayor prevalencia de mutaciones en gyrA en ninguno de los dos grupos clínicos estudiados (FQ vs No-FQ).

2. El número de aislados que presentan resistencia a ciprofloxacina es significativamente mayor en el grupo FQ respecto al grupo No-FQ (16 aislados FQ versus 4 aislados no-FQ) (p< 0,001).

3. El número de aislados con resistencia a ciprofloxacina y presencia de mutaciones en gyrA es significativamente mayor en el grupo FQ respecto al grupo no-FQ (11 aislados FQ versus 3 aislados No-FQ) (p<0,05).

4. EL número de aislados sensibles a ciprofloxacina y con mutaciones en gyrA es significativamente menor en el grupo FQ respecto al grupo no-FQ (3 aislados FQ versus 9 aislados no-FQ) (p<0,05).

34


(Colombia)

Tabla 3-7: Susceptibilidad a ciprofloxacina y polimorfismos en gyrA

Aislado

Origen

CMI (µg/ml)

Mutación

Aislado

Origen

CMI (µg/ml)

Mutación

PA002 Esputo 64 N.i. PA031 Urocultivo 1 Asp87Asn

PA003 Esputo 32 Thr83Ile PA033 Urocultivo 0.5 Asp87Asn

PA004 Esputo 32 Thr83Ile PA034 Quemaduraa 0.5 Asp87Asn

PA006 Esputo 1 N.i.

PA035 Ulcerab

2

Asp87Asn

Val85Gly

PA007 Esputo 1 N.i. PA037 Urocultivo 0.5 Asp87Asn

PA008 Esputo 16 Asp87Gly PA038 Heridac 1 N.i.

PA009 Esputo 0.5 Asp87Asn PA039 Rodillad 1 Asp87Asn

PA010

Esputo

2

Asp87Asn

PA040 Urocultivo

1

Asp87Asn

Ala119Pro

PA011 Esputo 32 Thr83Ile PA043 Respiratoriase 2 Asp87Asn

PA012 Esputo 2 Asp87Asn PA044 Urocultivo 1 Asp87Asn

PA013 Esputo 1 N.i. PA045 Quemaduraa 1 N.i.

PA014 Esputo 2 Asp87Gly PA046 Quemaduraa 0.5 N.i.

PA016 Esputo 32 Asp87Gly PA048 Perianalf 1 Ala51Gly

PA017 Esputo 1 Thr83Ile PA049 Heridac 0.5 N.i.

35


(Colombia)

Continuación de la tabla 3-7

N.i. = No identificado ningún polimorfismo en la región analizada. aSecreción de quemadura. bSecreción de ulcera. cSecreción de heridas. dTejido de rodilla. eSecreción respiratoria. fSecreción perianal. gSecreción ótica. hAspirado de cadera

Aislado

Origen

CMI (µg/ml)

Mutación

Aislado

Origen

CMI (µg/ml)

Mutación

PA018 Esputo 16 N.i. PA050 Heridac 1 Ala51Cys

PA020 Esputo 1 N.i. PA051 Coprocultivo 2 Leu55Met

PA021 Esputo 2 Asp87Asn PA055 Heridac 0.5 N.i.

PA022 Esputo 32 Asp87Asn PA056 Quemaduraa 1 N.i.

PA024 Esputo 64 N.i. PA057 Ulcerab 8 N.i.

PA026 Esputo 1 N.i. PA059 Óticag 0.5 N.i.

PA027 Esputo 1 Thr83Ile PA060 Aspirado Caderah 1 N.i.

PA028 Esputo 2 N.i.

PA029 Esputo 1 N.i.

PA030 Esputo 2 Asp87Asn

36


(Colombia)


FQ

(n= 24)

No-FQ

(n= 21)

Valor de p*

N° (%) N° (%)

Aislados con mutaciones en gyrA 14 (58,3) 12 (57,1) 1,0000

Aislados resistentes a ciprofloxacina 19 (66,7) 4 (19,0) 0.00043

Resistencia a ciprofloxacina y presencia de mutaciones 11 (45,8) 3 (14,3) 0,0284

Sensibilidad a ciprofloxacina y presencia de mutaciones 3 (12,5) 9 (42,9) 0,0406

* Valores obtenidos por análisis estadístico utilizando el Test de Fisher

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(Colombia)


FQ

(n= 24)

No-FQ

(n= 21)

Valor de p*

N° (%) N° (%)

Aislados con mutaciones en gyrA 14 (58,3) 12 (57,1) 1,0000

Aislados resistentes a ciprofloxacina 19 (66,7) 4 (19,0) 0.00043

Resistencia a ciprofloxacina y presencia de mutaciones 11 (45,8) 3 (14,3) 0,0284

Sensibilidad a ciprofloxacina y presencia de mutaciones 3 (12,5) 9 (42,9) 0,0406

* Valores obtenidos por análisis estadístico utilizando el Test de Fisher

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(Colombia)

4. Capítulo 4: Discusión

Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista capaz de causar un amplio rango de infecciones agudas y crónicas. En pacientes con Fibrosis Quística (FQ) es el patógeno predominante, originando un proceso crónico de difícil erradicación, pero usualmente sin invasión sistémica. Este organismo puede llegar a ser invasivo en otros grupos de pacientes y causar bacteremias asociadas con altas tasas de mortalidad, lo que ocurre en infecciones de tipo agudo. El curso de la infección (aguda o crónica) dependerá de los determinantes de virulencia predominantes (Jain et al, 2008; Chugani & Greenberg 2007), y se ha sugerido que el direccionamiento en uno u otro tipo va depender de señales producidas por el hospedero (Wu et al, 2005) o incluso provenientes del ambiente (Goodman et al, 2004).

El incremento de cepas de P. aeruginosa resistentes a antibióticos es un grave problema en la práctica clínica, particularmente en el tratamiento de procesos crónicos, donde se ha evidenciado que aislados procedentes de este tipo de infecciones presentan mayores niveles de resistencia a diversos antimicrobianos que los aislados de infecciones agudas (Henrichfreise et al, 2007; Gómez y Malambo 2002; Henwood et al, 2001).

En el presente estudio se analizaron 60 aislados clínicos de P.aeruginosa. La mitad de ellos fueron obtenidos de pacientes con Fibrosis Quística (aislados FQ), y la otra mitad de pacientes con otras patologías (aislados No-FQ). A todos los aislados se les determinó la respuesta a ciprofloxacina (sensible o resistente), que es uno de los antibióticos más utilizados en el tratamiento de infecciones por esta bacteria.

Se encontró que los aislados FQ presentaron una mayor resistencia a ciprofloxacina comparados con los aislados no-FQ (19/30 ó 63,3% versus 4/30 ó 13.3%, respectivamente (Tablas 3 y 10), diferencia que fue estadísticamente significativa (p<0,001). Estos resultados concuerdan con lo reportado en un estudio previo realizado en esta misma ciudad, donde el nivel de resistencia a ciprofloxacina en cepas de P. aeruginosa provenientes de pacientes con fibrosis quística fue mayor que el encontrado en aislados de pacientes con otras patologías (73% versus 42%, respectivamente) (Gómez y Malambo, 2002). Los resultados también concuerdan con estudios reportados por diferentes autores, como uno realizado en 48 centros médicos canadienses, donde la resistencia a ciprofloxacina en los aislados de P. aeruginosa provenientes de pacientes FQ fue del 22% comparado con un 12% de las cepas provenientes de pacientes con infecciones urinarias, de piel y/o tejidos blandos (Blondeau et al, 1998). Asímismo, estudios realizados en Alemania e Inglaterra, reportan una mayor resistencia a ciprofloxacina en aislados obtenidos de pacientes FQ respecto a aislados No-FQ (Henrichfreise et al, 2007; Henwood et al, 2001).

¿A qué se debería la mayor resistencia a ciprofloxacina en aislados FQ respecto a aislados no-FQ?

40


(Colombia)

Fallas en el tratamiento terapéutico de infecciones por P. aeruginosa con quinolonas se deben a diversos factores, entre ellos las mutaciones en genes que codifican ADN-girasa y topoisomerasa-IV, que son consideradas como la principal causa de resistencia a esta familia de antibióticos (Livermore, 2002).

En este trabajo, adicionalmente, se encontró relación entre la resistencia a ciprofloxacina y la presencia de mutaciones en gyrA de los aislados estudiados, observándose que el grupo FQ presentó un número significativamente mayor de aislados resistentes a ciprofloxacina, y con mutaciones en gyrA, comparado con el grupo No-FQ (p<0.05) (Tabla 10). Más específicamente, mediante el método de secuenciación de ácidos nucleicos, se identificaron diferentes mutaciones en una región de 252 pb del gen gyrA en ambos grupos de aislados (Tablas 4 y 5). Las mutaciones identificadas en el grupo FQ afectan la estructura primaria de la subunidad A de la girasa, a través de cambios aminoacídicos Thr83Ile, Aps87Asn, Aps87Gly (Tabla 8). Estos resultados sugieren que las mutaciones identificadas podrían ser las responsables de la resistencia observada a ciprofloxacina en los aislados FQ estudiados.

Como puede apreciarse, los cambios identificados en este trabajo afectan mayoritariamente a los residuos 83 y 87 de gyrA. Estos cambios concuerdan con los descritos previamente por otros autores (Lee et al, 2005; Wydmuch et al 2005; Higgins et al, 2003), quienes sugieren que la sustitución Thr83Ile es la más frecuentemente identificada en aislados de P. aeruginosa con resistencia a ciprofloxacina, y que ha sido descrita como la principal responsable de la resistencia a este antibiótico en P. aeruginosa (Wydmuch et al, 2005; Lee et al, 2005; Higgins et al, 2003). Esta propuesta, sin embargo contrasta con lo propuesto por Vashist et al (2009), quienes hicieron un estudio químico-computacional de la ADN-girasa de E. coli, la cual tiene serina en la posición 83 en lugar de la treonina 83 de P. aeruginosa. Vashist et al (2009) reportan que la ciprofloxacina se uniría a la subunidad A de la ADN girasa tipo silvestre de E.coli a través de tres puentes de hidrógeno con los aminoácidos Asp-87, Arg-121 y Met-120. Según su análisis, la sustitución de un aminoácido polar por un aminoácido aromático, por ejemplo Ser83Tyr o Ser83Phe en gyrA de E.coli, permitiría la interacción con ciprofloxacina a través de dos puentes de hidrógeno con los aminoácidos Asp87 y Arg121. El aminoácido Asp87 de la subunidad A de la girasa de E.coli interactúa por puentes de hidrógeno con la posición 3 de la ciprofloxacina y, por lo tanto, mutaciones en esta posición se esperaría que afecten la interacción con el antibiótico. Mutaciones como Asp87Tyr ó Asp87Gly en la ADN-girasa de E. coli originarían dos nuevos conjuntos de puentes de hidrógenos entre la ADN girasa y la ciprofloxacina, que involucraría a residuos diferentes (Ser-172, His-45, Lys-42 / Arg-91, Gln-94, Ala-117). Estos cambios harían que la ciprofloxacina se una a un nuevo sitio en gyrA, distinto al sitio de unión de la quinolona. Así, para Vashist et al (2009), el aminoácido Asp-87 es más importante que la Ser-83 para la unión de la ciprofloxacina a la ADN-girasa de E. coli, porque estaría directamente involucrado en la interacción con el antibiótico.

En consecuencia, nuestros datos discreparían de lo propuesto por Vashist et al (2009), y ratificarían lo propuesto por otros autores (Lee et al, 2005; Wydmuch et al 2005; Higgins et al, 2003). Probablemente, las discrepancias puedan deberse a que Vashist et al (2009) basaron su conclusión en un análisis químico-computacional y no experimental.

Capítulo 4 Discusión 41

Otro resultado obtenido en este trabajo fue que el grupo no-FQ presentó un número significativamente mayor de aislados susceptibles a ciprofloxacina y con presencia de mutaciones en gyrA que el grupo FQ (p<0.05) (Tabla 10). En este trabajo se identificaron 6 mutaciones diferentes en el grupo de aislados no-FQ sensibles a ciprofloxacina: Ala51Gly, Ala51Cys, Leu55Met, Val85Gly, Asp87Asn y Ala119Pro (Tabla 9). Este resultado fue inesperado, porque era de suponer que los aislados sensibles a ciprofloxacina no presentaran mutaciones en gyrA. La discrepancia podría explicarse porque algunas mutaciones en el grupo no-FQ corresponden a cambios que se encuentran fuera de la región QDRD (Ala51Gly, Ala51Cys, Leu55Met, Ala119Pro) (Tabla 7). Es interesante observar que este grupo no-FQ sensible a ciprofloxacina también presentó mutaciones en el residuo 87, que es parte de la región QRDR (Asp87Asn y Asp87Gly) (Tabla 7). No tenemos aún una explicación a esta observación.

La sustitución Thr83Ile se identificó únicamente en el grupo FQ, mientras que la mutación Asp87Asn se encontró en ambos grupos (Tabla 8). Debido a que el grupo FQ presentó resistencia a ciprofloxacina significamente mayor que el grupo no-FQ (discutido anteriormente), este resultado podría indicar que el cambio Thr83Ile quizás sea más determinante del fenotipo de resistencia a ciprofloxacina.

¿Qué otros factores estarían implicados en la resistencia observada a ciprofloxacina?

En nuestros resultados es interesante observar que algunos aislados resistentes a ciprofloxacina no presentan ningún tipo de mutación en gyrA, al menos en la región de 252 pb estudiada en este trabajo. Por otro lado, también es interesante observar que algunos aislados estudiados mostraron diferentes niveles de resistencia, a pesar de tener la misma mutación. Por ejemplo, cuando se comparan los aislados PA003 y PA004 con los aislados PA017 y PA027 se observa que presentan diferentes grados de resistencia a ciprofloxacina (CMI: 32 vs 1 µg/ml; tabla 9), y todos tienen la mutación Thr83Ile. Estos resultados, en conjunto, podrían estar sugiriendo la participación de otros mecanismos ( o genes) implicados en la resistencia a este antibiótico. A pesar de que no disponemos de datos experimentales que expliquen estos resultados, la literatura reporta la participación de otros mecanismos y genes implicados. Por ejemplo, se han reportado mutaciones en los genes que codifican para la subunidad B de la ADN-girasa (gyrB), y para la topoisomerasa IV (parC y parE), que no fueron estudiados en el presente trabajo, que se relacionan con resistencia a quinolonas. Por ejemplo, Lee et al (2005) reportan que la sustituciones Glu468Asp o Glu468Trp (reportada como Glu-470) y Ser475Ala (reportada como Ala-477) en gyrB son responsables de la resistencia a fluoroquinolonas en aislados resistentes a ciprofloxacina (CMIs, 8-256 mg/l). También se ha reportado la participación de bombas de eflujo como mecanismo de resistencia a este tipo de antimicrobianos. Un estudio realizado de Jalal et al (2000) reportó que el mecanismo predominante en la resistencia a quinolonas aislados de P. aeruginosa de pulmones de pacientes con FQ es la alteración en la expresión de los sistemas de eflujo MexCD-OprJ y MexEF-OprN, mientras que en los aislados de orina y heridas fueron mutaciones en los genes gyrA y parC.

También se ha reportado que las bombas de eflujo de aislados clínicos de P. aeruginosa procedentes de infecciones crónicas presentan niveles de expresión mayor (14-75%) que aislados de infecciones agudas, hecho que se debería a los largos períodos de exposición a antibióticos de los pacientes, donde éstos servirían como inductores, regulando la expresión de genes codificantes de algunas bombas de eflujo a nivel de transcripción o traducción (Roberts, 1996). Por otro lado, también se ha encontrado

42


(Colombia)

asociación entre los factores de virulencia y sistemas de expulsión, donde se ha demostrado que existe una relación entre la sobreexpresión de MexCD-OprJ y MexEF-OprN y una fuerte reducción de la citotoxicidad de P. aeruginosa en una línea celular de macrófagos, sugiriendo que las cepas de P. aeruginosa que manifiestan la sobreproducción de esas bombas son probablemente menos capaces de desencadenar una infección aguda, y están más probablemente adaptadas para producir infecciones crónicas (Linares et al, 2005).

Nuestros resultados también muestran que no hubo diferencias significativas en el número de aislados con mutaciones entre los dos grupos de aislados analizados (FQ y no-FQ). En efecto, el numero de aislados con mutaciones fueron 14 en el grupo FQ versus 12 en el grupo no-FQ (p>0.05) (Tabla 10). Esto indica que, en nuestra muestra poblacional, y región génica estudiada, no existe una tendencia a presentar mutaciones en gyrA en uno u otro grupo estudiado.

Oliver et al (2000) han encontrado que en el 37% de los pacientes con fibrosis quística con infecciones crónicas por P. aeruginosa, un 20% de estos aislados muestran altas tasas de mutación (fenómeno de hipermutación), lo que les confiere un mayor nivel de resistencia a diversos antibióticos en comparación a aislados de infecciones agudas (quemaduras, heridas y otras), y que no poseen esta condición de hipermutación. Macia et al (2005) también encontraron la presencia de aislados hipermutables de P. aeruginosa en el 57% de pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). En contraste, Gutiérrez et al (2004), estudiando un conjunto de aislados de P. aeruginosa provenientes de infecciones agudas, observaron relación entre resistencia a varios antibióticos y presencia de mutaciones, pero con baja frecuencia de aislados hipermutables. En conjunto, los estudios anteriores sustentan la hipótesis de que los aislados de P. aeruginosa presentes en infecciones crónicas, como es el caso de los pacientes con fibrosis quística (FQ), poseen una mayor tasa de mutación comparados con aislados procedentes de infecciones agudas (Oliver et al, 2004). Diferentes investigadores han estudiado los potenciales mecanismos implicados en el fenómeno de hipermutación descrito. Oliver et al (2000), propusieron que la capacidad de hipermutación se debería a defectos en los genes del sistema de reparación MMR (del inglés Mismatch Repair). Se ha observado que la inactivación de cualquiera de los genes de este sistema de reparación (mutS, mutL, mutH, y mutU) incrementa la tasa de mutación de 100 a 1000 veces, generando mutaciones de tipo transiciones (G:C a A:T, y A:T a G:C), y mutaciones de 1 a 4 pb, que afectan el marco de lectura (Modrich & Lahue, 1996). También, se ha observado que la inactivación del sistema MMR aumenta la tasa de mutación por incremento en la tasa de recombinación homóloga (Matic et al, 1995). En E. coli, Miller et al (2000) también demostraron que la aparición de aislados multirresistentes puede llegar a ser de 100 a 1.000 veces superior cuando se emplean cepas con alta tasa de mutación.

Otro mecanismo de resistencia es la formación de biopelículas (biofilm). Según Drenkard & Ausubel (2002), los aislados clínicos multirresistentes procedentes de pacientes FQ presentan mayor diversidad fenotípica, como es el caso de la variante de colonia pequeña-rugosa (RCSV), que es más pequeña y que puede llegar a ser hasta 40 veces más resistente a diversos antibióticos que las cepas silvestre. Sin embargo, su verdadero

Capítulo 4 Discusión 43

potencial radica en la capacidad de formar biopelículas (biofilms) en alta frecuencia, tanto in vitro como en los pulmones de pacientes FQ.

Teniendo en cuenta que la mayoría de los aislados del grupo no-FQ provienen de infecciones de tipo agudo, mientras que los aislados del grupo FQ, por lo general, corresponden a infecciones de tipo crónico, sería interesante ampliar el presente estudio para intentar establecer asociación entre multirresistencia, hipermutación, y tipo de infección (aguda o crónica) en aislados locales de P.aeruginosa.

Por último, la ciprofloxacina es un antibiótico de uso clínico importante en el tratamiento de pacientes FQ infectados con P. aeruginosa a nivel pulmonar. En este sentido, los resultados obtenidos en el presente estudio adquieren enorme relevancia clínica porque demuestran que el uso de este antibiótico para tratar pacientes FQ con infecciones crónicas por P. aeruginosa no resultaría apropiado teniendo en cuenta que las mutaciones en gyrA aquí identificadas confieren resistencia a quinolonas, lo que daría como resultado el fracaso terapéutico. Si la muestra poblacional estudiada en el trabajo fuera un reflejo fiel de lo existente a nivel nacional, nuestros datos permitirían proyectar un 63% de casos resistentes a ciprofloxacina en pacientes con FQ.

Capitulo 5. Conclusiones 45

5. Capitulo 5. Conclusiones y recomendaciones

5.1 Conclusiones

� Se identificaron polimorfismos genéticos en la región QDRD del gen gyrA en ambos grupos de aislados. Gran parte de estos cambios están en los codones 83 y 87.

� En el grupo de aislados no-FQ se encontraron mutaciones que están fuera de la

región QDRD del gen gyrA.

� Se encontró mayor resistencia a ciprofloxacina en los aislados de fibrosis quística en comparación con aislados de otras patologías.

� En aislados del grupo FQ se encontró asociación entre resistencia a

ciprofloxacina y presencia de polimorfismos.

46


(Colombia)

5.2 Recomendaciones

� Se sugiere proseguir los estudios moleculares, analizando potenciales mutaciones

en los genes gyrB, parC, parE y de las bombas de eflujo, esto para comprender

de manera más integral este importante fenómeno multifactorial que involucra la

resistencia a fluoroquinolonas en aislados clínicos de P. aeruginosa.

Anexo A: Alineamiento de las secuencias de nucleótidos obtenidas para el

gen GyrA

47

A. Anexo: Alineamiento de las secuencias de nucleótidos obtenidas para el gen GyrA

48


(Colombia)

Continuación del anexo A.

Anexo A: Alineamiento de las secuencias de nucleótidos obtenidas para el

gen GyrA

49

Continuación del anexo A.

Anexo B: Alineamiento de secuencias aminoacídicas. Los aminoácidos

destacados corresponden a las mutaciones identificadas.

51

B.Anexo: Alineamiento de las secuencias aminoacídicas (Los aminoácidos destacados corresponden a las mutaciones identificadas)

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54 Identificación de polimorfismos en el gen gyrA de Pseudomonas aeruginosa de pacientes con fibrosis quística y otras patologías en la ciudad de Cartagena

(Colombia)

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Oscar Caldera Díaz · A mi Madre y hermanos, que son el mejor logro de mi vida. A betita a quien simplemente le debo todo. A Fabio (Mono) y Carlos Julio (Negrito) gracias por sus