Upload
others
View
3
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
ผลของเคอรเซตนตอความมชวตและการตายแบบอะพอพโทสสของเซลลออสทโอซารโคมาของมนษยชนด U2-OS
ในหองปฏบตการThe Effect of Quercetin on Cell Viability and Apoptotic Cell Death of Human Osteosarcoma Cell Line (U2-OS)
in Vitroกตตนนท จนตระกลวฒน1, ยาว เมฆข�า1, ฤทธไกร ณ ล�าพน1,
นรชชา ไชยสมบรณ2, ฐานต ประสทธศกด3, รงอรณ เกรยงไกร3
1นสตทนตแพทย คณะทนตแพทยศาสาตร มหาวทยาลยนเรศวร2หนวยวจยวทยาศาสตรทางทนตแพทยศาสตร คณะทนตแพทยศาสตร มหาวทยาลยนเรศวร
3ภาควชาชววทยาชองปาก คณะทนตแพทยศาสตร มหาวทยาลย นเรศวรKittinun Juntrakulwat1, Yawee Mekhom1, Ritthikrai Na Lampoon1, Niratcha Chaisomboon2,
Thanit Prasitsak3, Rungarun Kriangkrai31Dental Student, Faculty of Dentistry, Naresuan University
2Dental Science Research Center, Faculty of Dentistry, Naresuan University3Department of Oral Biology, Faculty of Dentistry, Naresuan University
ชม. ทนตสาร 2558; 36(1) : 63-74CM Dent J 2015; 36(1) : 63-74
บทคดยอ ออสตโอซารโคมาเปนมะเรงกระดกทพบมากในกลม
เดกและวยรน แตการรกษาโดยเคมบ�าบดยงมขอจ�ากดหลาย
ประการ โดยเฉพาะการดอตอยาทใหการรกษา ดงนน ทาง
เลอกใหมโดยใชเคอรเซตนเพอเพมประสทธภาพการรกษา
ผปวยจงเปนสงทนาสนใจ งานวจยนมวตถประสงคเพอ
ศกษาผลของเคอรเซตนตอความมชวตและการตายแบบ
อะพอพโทสสของเซลลออสทโอซารโคมาของมนษยชนด
U2-OS ผลศกษาพบวาเคอรเซตนระดบความเขมขน 5 10
Abstract Osteosarcoma is the most common bone can-
cer found in childhood and adolescents. However,
major problems associated with chemotherapy still
remain, particularly the frequent development of
drug resistance. Hence, new therapeutic approach-
es that can further improve the efficiency by using
quercetin are interesting. The purpose of this study
was to investigate the effect of quercetin on cell
Corresponding Author:
รงอรณ เกรยงไกรผศ.ทพญ.ดร. ภาควชาชววทยาชองปาก คณะทนตแพทยศาสตร มหาวทยาลยนเรศวร จ.พษณโลก 65000
Rungarun KriangkraiAssistant Professor Dr., Department of Oral Biology, Faculty of Dentistry, Naresuan University, Phisanulok, 65000 ThailandE-mail: [email protected]
บทวทยาการOriginal Article
ชม. ทนตสาร ปท 36 ฉบบท 1 ม.ค.-ม.ย. 2558 CM Dent J Vol. 36 No. 1 January-June 201564
25 50 และ 100 ไมโครโมลาร ลดรอยละความมชวตของ
เซลลอยางมนยส�าคญทางสถต เปนไปตามระดบความเขม
ขนของเคอรเซตนทเพมขน เคอรเซตนสามารถเหนยวน�า
ใหเซลลเกดการตายแบบอะพอพโทสสโดยพบการแตกหก
ของดเอนเอไดเปนชนสวนขนาดใหญ ผลการศกษาแสดง
ใหเหนวาเคอรเซตนมฤทธตานการเจรญและเหนยวน�าให
เกดการตายแบบอะพอพโทสสของเซลล U2-OS ซงเปน
ขอมลพนฐานในการศกษาตอถงกลไกการออกฤทธของ
เคอรเซตนตอเซลล U2-OS เพอน�าประโยชนมาประยกต
ใช ในการรกษาผปวยตอไป
ค�ำส�ำคญ: เคอรเซตน ออสทโอซารโคมา ความมชวตของ
เซลล การตายแบบอะพอพโทสส
viability and apoptotic cell death of human osteo-
sarcoma cell line (U2-OS). The results showed that
quercetin at 5 10 25 50 and 100 μM significantly
decreased the percentage of viability of U2-OS
cells in a dose-dependent manner. Quercetin could
induce apoptosis in U2-OS cells resulting in a large
DNA fragmentation. Our results suggested that
quercetin can inhibit cell proliferation and induce
apoptosis of U2-OS cells, and provided for further
investigation of underlying mechanisms of quer-
cetin on U2-OS cells applied for osteosarcoma
therapy.
Keywords: quercetin, osteosarcoma, cell viability,
apoptosis
บทน�า ออสตโอซารโคมา (osteosarcoma) เปนเนองอก
ชนดรายแรงและเปนมะเรงกระดกทพบมากในกล มเดก
และวยรน(1,2) สวนใหญพบมะเรงชนดนไดทกระดกยาว (long bone) ไดแก กระดกตนขา (femur) รอยละ 42 กระดกเเขง
(tibia) รอยละ 19 และกระดกตนแขน (humerus) รอยละ
10 กระดกบรเวณอนทพบไดบอยไดแก กระดกขากรรไกร
(jaw) รอยละ 8 และกระดกเชงกราน (pelvis) รอยละ 8(2)
ถงแมการรกษาโดยเคมบ�าบด การผาตดและฉายรงสรกษา
จะเพมอตราการรอดชวตของผปวยในชวงเวลา 5 ป ไดถง
รอยละ 60 ถง 80(3) อยางไรกตามการรกษาโดยเคมบ�าบด
ยงพบขอจ�ากดอยหลายประการ เชน การดอตอยา (drug resistance) ของเซลลมะเรง(4) ความเปนพษ (toxicity) ของยาทผปวยไดรบ เชน เมโทรทรเซต (methotrexate) ซสพลาทน (cisplatin) โดโซรบซน (doxorubicin) ทง
ในระยะแรกของการใชยาหรอการใชยาตดตอกนเปนเวลา
นาน(5) ดงนนการรกษาแนวใหมโดยอาศยสารสกดจาก
สมนไพรเพอเพมประสทธภาพในการรกษาผปวยมะเรงกระดก
ออสตโอซารโคมาจงเปนสงทนาสนใจ
เคอรเซตน (quercetin) เปนสารในกลมฟลาโวนอยด
ทพบมากในชาและผกผลไม จากการศกษาพบวา โพลฟ
นอลมคณสมบตทหลากหลาย ไดแก คณสมบตในการตาน
ปฏกรยาออกซเดชน (antioxidative effect)(6) ตานการ
อกเสบ (anti-inflammatory effect)(7) ตานตอการเจรญ
ของแบคทเรย (antimicrobial effect)(8) และตานตอการ
เจรญของเซลลมะเรงได (anticancer effect) จากการศกษา
ทผานมาไดแสดงฤทธของเคอรเซตนตอการตานการเจรญของ
เซลลมะเรงชนดตางๆ ดงนเคอรเซตนสามารถตานการเจรญ
เซลลมะเรงเมดเลอดขาวของมนษยชนด HL-60 (promy-elocytic leukemic cell line, HL 60) เคอรเซตนยบยง
การเจรญของเซลล HL-60 แปรผนกบความเขมขนและเวลา
ททดสอบ เคอรเซตนทระดบความเขมขน 10 ไมโครโมลาร
มผลในการยบยงการเจรญของเซลล HL-60 รอยละ 17.1
27.3 40.1 และ 52.7 เมอทดสอบเปนเวลา 24 48 72 และ
96 ชวโมงตามล�าดบ ในขณะทเคอรเซตนระดบความเขมขน
20 40 และ 60 ไมโครโมลาร ทดสอบเปนเวลา 24 ชวโมง ม
ผลท�าใหวฏจกรของเซลลหยดลง(9) สอดคลองไปกบผลการ
ศกษาฤทธตานการเจรญของเคอรเซตนตอเซลลมะเรงเมด
เลอดขาวของมนษยชนด CEM (human leukemic T-cells, CEM) พบวาเคอรเซตนทระดบความเขมขน 70 ไมโครโม-
ลาร ทดสอบเปนเวลา 15 ชวโมง ท�าใหวฏจกรการแบงตวของ
เซลลหยดลงไดถงรอยละ 64(10) จากการศกษาผลของเคอร-
ชม. ทนตสาร ปท 36 ฉบบท 1 ม.ค.-ม.ย. 2558 CM Dent J Vol. 36 No. 1 January-June 201565
เซตนตอเซลลมะเรงกระเพาะอาหารของมนษยชนด HGC-27 (human gastric cancer cell line, HGC-27) พบวาเคอร-
เซตนทระดบความเขมขน 70 ไมโครโมลารทดสอบเปนเวลา
48 ชวโมง ท�าใหการจ�าลองตวเองของดเอนเอเพอการแบงตว
ของเซลลลดลงเหลอเพยงรอยละ 14 เมอเปรยบเทยบกบกลม
ควบคมและสงผลใหวฏจกรการแบงตวของเซลลหยดลง(11)
นอกจากนเคอรเซตนยงสงเสรมการตายแบบอะพอพโท-
สสของเซลลมะเรงชนดตางๆ ได เคอรเซตนท�าใหเซลลมะเรง
เมดเลอดขาวของมนษยชนด U937 (human leukemic cell line, U937) เกดการตายแบบอะพอพโทสสเมอทดสอบเคอร-
เซตนทระดบความเขมขน 20 ไมโครโมลาร เปนเวลา 24
ชวโมง วเคราะหโดยอาศยเทคนค DNA fragmentation assay(12) ขณะทเมอทดสอบเคอรเซตนทระดบความเขมขน
50 ไมโครโมลารเปนเวลา 48 ชวโมง มผลกระตนการตาย
ของเซลลแบบอะพอพโทสสในเซลลมะเรงตบของมนษยชนด
HepG2 (human hepatoma cell line, HepG2) โดยผาน
การกระตนแคสเปสสาม (caspase) ซงเปนเอนไซมกระตน
กลไกเกดการตายของเซลลแบบอะพอพโทสส(13) จากการ
ศกษาในเซลลมะเรงปอดของมนษยชนด A549 (human lung carcinoma cell line, A549) พบวาเมอทดสอบเคอร-
เซตนทระดบความเขมขน 20 ถง 80 ไมโครโมลาร เปนเวลา 24
ชวโมง ท�าใหเซลลเกดการตายแบบอะพอพโทสสโดยมความ
สมพนธกบความเขมขนของเคอรเซตนทเพมขน นอกจากน
เคอรเซตนทระดบความเขมขน 60 ไมโครโมลาร เมอทดสอบ
เปนเวลา 24 ชวโมง สามารถยบยงการท�างานของเซอร-
ววน (survivin) ซงเปนโปรตนทเซลลมะเรงสรางขนเพอตอ
ตานกระบวนการตายของเซลลแบบอะพอพโทสสและเคอร-
เซตนยงสงเสรมการแสดงออกของยน P53 ท�าใหเซลลเกด
การตายแบบอะพอพโทสสได(14)
นอกจากเคอรเซตนจะมประโยชนในการน�ามาใชในการ
รกษาผปวยมะเรงโดยอาศยฤทธตานการเจรญและสงเสรม
การตายของเซลลมะเรงผานกลไกตางๆ ทกลาวมาแลว เคอร-
เซตนยงเสรมฤทธยาเคมบ�าบดในการเหนยวน�าใหเกดการ
ตายแบบอะพอพโทสสในเซลลมะเรงเตานมของมนษยชนด
MCF-7 และชนด MAD-MB 231 (human breast cancer cell line, MCF-7 and MAD-MB 231)(15) จากการศกษาขางตนแสดงใหเหนไดวาเคอรเซตนมผล
ในการยบยงการเจรญและท�าใหเกดการตายของเซลลแบบ
อะพอพโทสสผานกลไกตางๆ ในเซลลมะเรงชนดตางๆ ใน
ระดบความเขมขนของเคอรเซตนและเวลาทใชทดสอบแตก
ตางกนไป อยางไรกตามการศกษาผลของเคอรเซตนตอการ
ตานการเจรญของเซลลมะเรงกระดกนนยงไมทราบแนชด
และก�าลงเปนทสนใจ การศกษานจงท�าการศกษาฤทธของ
เคอรเซตนตอเซลลออสตโอซารโคมาของมนษยชนด U2-OS (human osteosarcoma cell line, U2-OS) ในหอง
ปฏบตการ โดยทดสอบผลของเคอรเซตนตอความมชวตของ
เซลล (cell viability) โดยเทคนค MTT assay และผลการ
ตายแบบอะพอพโทสสของเซลลออสตโอซารโคมาของมนษย
โดยศกษาลกษณะเซลลภายใตกลองจลทรรรศนชนดหวกลบ
และเทคนค DNA fragmentation assay ผลการศกษาจะ
เปนขอมลพนฐานในการศกษาฤทธเคอรเซตนตอการตานการ
เจรญและการตายของเซลลออสตโอซารโคมาของมนษยเพอ
ประยกตใชการรกษาผปวยตอไป
วสดและวธการ 1. สำรเคม
เคอรเซตน (2 - (3, 4 - Dihydroxyphenyl) -3, 5, 7 - trihydroxy - 4H-1 -benzopyran -4 -one dehydrate 3, 3′, 4′, 5, 7 - Pentahydroxyflavone dehydrate) จากบรษทซกมาร (Q0125; Sigma®, St. Louis, MO, USA) จะถกละลายในไดเมทลซลฟอกไซด (dimethyl sulfoxide, DMSO) ทระดบความเขมขน 100 มลลโมลาร เพอเปน
สารละลายตงตนกอนท�าการทดสอบ น�าสารละลายเคอรเซตน
ตงตนความเขมขน 100 มลลโมลารมาเจอจางดวยอาหารเลยง
เซลลทไมมซรม เพอท�าการทดสอบผลการมชวตของเซลล
ออสตโอซารโคมามนษยชนด U2-OS ทระดบความเขมขน 1
5 10 25 50 และ 100 ไมโครโมลาร และผลการตายของเซลล
ออสตโอซารโคมาของมนษยชนด U2-OS ทระดบความเขม
ขน 5 25 และ 100 ไมโครโมลาร ในแตละความเขมขนของ
สารละลายเคอรเซตนทใช ในการทดสอบจะมความเขมขน
ของ DMSO นอยกวาหรอเทากบรอยละ 0.1 กลมควบคม
จะไมใสสารละลายเคอรเซตนแตจะใสอาหารเลยงเซลลทไมม
ซรมในปรมาตรทเทากบกลมทดลอง และมความเขมขนของ
DMSO รอยละ 0.1 (vehicle control)
ชม. ทนตสาร ปท 36 ฉบบท 1 ม.ค.-ม.ย. 2558 CM Dent J Vol. 36 No. 1 January-June 201566
2. กำรเพำะเลยงเซลลออสตโอซำรโคมำของมนษยชนด
U2-OS
เซลลออสตโอซารโคมาของมนษยชนด U2-OS ได
รบความอนเคราะหจากคณะทนตแพทยศาสตร จฬาลงกรณ
มหาวทยาลย เลยงในอาหารเลยงเซลลชนด Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM , Gibco® BRL, New York, USA) ทประกอบดวยซรมรอยละ 10 (10% Fe-tal calf serum, Gibco® BRL) เพนนซลลน/สเตรปโตมย
ซนซลเฟต และแอมโฟเทอรซนบ รอยละ 1 (1% Penicillin / Streptomycin sulfate and Amphotericin B; Gibco® BRL) และถกเลยงในตอบทอณหภม 37 องศาเซลเซยส และ
มระดบคารบอนไดออกไซดรอยละ 5 ระดบความชนสมพทธ
รอยละ 95
3.กำรสรำงกรำฟมำตรฐำน
หวานเซลลททราบจ�านวนลงในจานเพาะเลยงจ�านวน
20,000 40,000 60,000 80,000 และ 100,000 เซลลตอจาน
เพาะเลยง แลวน�าเขาตอบเพาะเลยงเซลลเปนเวลา 18 ชวโมง
หลงจากนนท�าการวดจ�านวนเซลลดวยเทคนค MTT as-say แลวน�าผลมาหาความสมพนธของคาการดดกลนแสงกบ
จ�านวนเซลลซงทราบจ�านวนแนนอนทไดท�าการหวานขางตน
จะท�าใหไดความสมพนธเปนกราฟเสนตรงแสดงความสมพนธ
ของจ�านวนเซลลกบคาการดดกลนแสงทมคาสมประสทธ
สหสมพนธ (R2) เขาใกล 1
4. ศกษำผลของเคอรเซตนตอควำมมชวตของเซลล
ออสทโอซำรโคมำของมนษยชนด U2-OS โดยเทคนคMTT assay
การวดผลโดยเทคนค MTT assay(16) เซลลเพาะเลยง
จะถกถายลงในจานเลยงเซลลแบบ 24 หลม ทความหนาแนน
50,000 เซลลตอ 0.5 มลลลตรของอาหารเลยงเซลลปกต เปน
เวลา 18 ชวโมง จากนนเปลยนอาหารเลยงเซลลปกตทไมม
ซรมและน�าเขาตอบเพาะเลยงเซลลตอเปนเวลา 6 ชวโมง ตอ
มาเซลลจะถกทดสอบดวยเคอรเซตนความเขมขน 1 5 10 25
50 และ 100 ไมโครโมลาร เปนเวลา 24 48 และ 72 ชวโมง
โดยกลมควบคมของแตละการศกษาจะไมมเคอรเซตนอยแตม
DMSO ซงเปนตวท�าละลายอยรอยละ 0.1 หลงจากนนเซลล
จะถกลางดวย phosphate buffer saline (PBS) 2 ครงและ
อาหารเลยงเซลลจะถกเปลยนเปนชนดทไมม Phenol red
และม MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphen-
yltetrazolium bromide, a tetrazole; USB®, Claveland, OH, USA) ทความเขมขนสดทายเทากบ 0.5 มลลกรมตอ
มลลลตร บมในตบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา
30 นาทสดทายของการทดสอบ จากนนอาหารเลยงเซลลจะ
ถกดดออกและใส DMSO จ�านวน 800 ไมโครลตรลงในแตละ
หลมของจานเลยงเซลลเพอละลายผลก formazan ทเซลล
สรางขนจากสารละลาย MTT จากนนจงน�าไปอานคาการ
ดดกลนแสงดวย spectrophotometer (Genesys G10-S, Themo Fisher Scientific, Inc., Mandison-Wisonsin, USA) ทความยาวคลนแสง 570 นาโนเมตร น�าคาการดด
กลนแสงทวดไดมาเทยบคาจ�านวนเซลลทยงมชวตอยกบเสน
กราฟมาตรฐาน โดยในแตละกลมการทดลองจะท�าซ�ากน 3
ครง โดยรอยละความมชวตของเซลล (% cell viability) ในแตละการทดลองมคาเทากบ (จ�านวนเซลลทยงมชวตอย
ในแตละกลมทดลองตอจ�านวนเซลลทงหมดในกลมควบคม)
คณดวย 100
5.ศกษำลกษณะกำรตำยแบบอะพอพโทสสของเซลล
ออสตโอซำรโคมำของมนษยชนดU2-OS โดยเคอรเซตน
ภำยใตกลองจลทรรศนชนดหวกลบ
เซลลเพาะเลยงจะถกถายลงในจานเลยงเซลลขนาดเสน
ผานศนยกลาง 60 มลลเมตร ทความหนาแนน 50,000 เซลล
ตอ 0.5 มลลลตรของอาหารเลยงเซลลปกตเปนเวลา 18
ชวโมง จากนนเปลยนอาหารเลยงเซลลปกตทไมมซรมและ
น�าเขาตอบเพาะเลยงเซลลตอเปนเวลา 6 ชวโมง ตอมาเซลล
จะถกทดสอบดวยเคอรเซตน ความเขมขนท 100 ไมโคร-
โมลาร เปนเวลา 48 54 และ 72 ชวโมง จากนนน�าไปสอง
ภายใตกลองจลทรรศนชนดหวกลบ (Inverted System Microscope, IX70, Olympus) 6.ศกษำผลของเคอรเซตนตอกำรตำยแบบอะพอพ-
โทสสของเซลลออสตโอซำรโคมำของมนษยชนดU2-OS
โดยเทคนคDNA fragmentation assay เซลลเพาะเลยงจะถกถายลงในจานเลยงเซลลขนาดเสน
ผานศนยกลาง 60 มลลเมตร ทความหนาแนน 50,000 เซลล
ตอ 0.5 มลลลตรของอาหารเลยงเซลลปกตเปนเวลา 18
ชวโมง จากนนเปลยนอาหารเลยงเซลลปกตทไมมซรมและน�า
เขาตอบเพาะเลยงเซลลตอเปนเวลา 6 ชวโมง ตอมาเซลลจะ
ถกทดสอบดวยเคอรเซตนระดบความเขมขน 5 และ 25 เปน
เวลา 48 และ 72 ชวโมง และระดบความเขมขน 100 ไมโคร-
ชม. ทนตสาร ปท 36 ฉบบท 1 ม.ค.-ม.ย. 2558 CM Dent J Vol. 36 No. 1 January-June 201567
โมลาร เปนเวลา 48 54 และ 72 ชวโมง โดยกลมควบคมของ
แตละการศกษาจะไมมเคอรเซตนอยแตม DMSO ซงเปน
ตวท�าละลายอยรอยละ 0.1 จากนนท�าการตรวจสอบการตาย
ของเซลลแบบอะพอพโทสสโดยเทคนค DNA fragmenta-tion assay โดยใช Apoptotic DNA Ladder Detection (Milipore®) ดงน ท�าการเกบเซลลทดสอบจ�านวน 5×105
เซลล ใสในหลอด microcentrifuge ท�าการปนเหวยงเซลล
ความเรวประมาณ 8,000 รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท ท
อณหภม 25 องศาเซลเซยส และลางเซลล PBS จากนน
ท�าใหเซลลแตกโดยใส TE Lysis buffer และก�าจดอารเอน
เอ (RNA) ดวย enzyme A (RNAase A) ปรมาตร 5
ไมโครลตร แลวน�าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปน
เวลา 10 นาท ท�าการยอยโปรตนทไมตองการออกโดยการเตม
enzyme B (Proteinase K) ผสมกนอยางนมนวล และบมท
อณหภม 50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 12 ชวโมง ท�าการตก
ตะกอนดเอนเอดวยแอมโมเนยมอะซเตท (ammonium ace-tate) ปรมาตร 5 มลลลตร และไอโซโพรพานอล (isopropa-nol) ปรมาตร 50 ไมโครลตร ผสมใหเขากนและเกบไวท -20
องศาเซลเซยส เปนเวลาอยางนอย 3 ชวโมง น�าดเอนเอทสกด
มาไดไปปนเหวยงทความเรว 15,500 รอบตอนาท เปนเวลา
20 นาท และปลอยใหดเอนเอแหงทอณหภมหองเปนเวลา
10 นาท หลงจากนนละลายดเอนเอดวย DNA suspension buffer ปรมาตร 30 ไมโครลตร น�าดเอนเอทสกดไดมาแยก
ในสนามไฟฟาท 90 V โดยเทคนค DNA electrophoresis ผานตวกลางคอ 1% Tris-acetate agarose gel เปนเวลา 55
นาท จากนนยอมดวยเอททเดยม-โบรไมด (TE/ethidium bromide) เปนเวลา 10 ถง 15 นาท และตรวจสอบดเอนเอ
ทสกดไดโดยการ ทรานสอลลมเนชน (Transillumination) ดวยแสงอลตราไวโอเลต (Ultraviolet) ความยาวคลนแสง
302 นาโนเมตร
7.กำรวเครำะหขอมล
แสดงผลเปนคาเฉลย ± ความคลาดเคลอนมาตรฐาน
(means±standard errors) ของรอยละของความมชวต
ของเซลล วเคราะหความแตกตางของคาเฉลยรอยละของ
ความมชวตของเซลลในแตละกลมทดลองเปรยบเทยบกบ
กลมควบคมโดยอาศยสถตความแปรปรวนแบบปจจยเดยว
(One-way ANOVA) และ Post Hoc Tests (Tukey HSD) การวเคราะหใชโปรแกรม SPSS 16.0 (SPSS Inc.,
Chicago, IL, USA) นยส�าคญทางสถตของการวเคราะห
แสดงผลท P<0.05
ผลการศกษา กรำฟมำตรฐำนแสดงควำมสมพนธระหวำงจ�ำนวนเซลล
และคำกำรดดกลนแสงของเซลลออสทโอซำรโคมำของมนษย
ชนดU2-OSโดยเทคนคMTT assay
กราฟมาตรฐานแสดงแนวแกน Y คอจ�านวนเซลลและ
แนวแกน X คอคาการดดกลนแสงทความยาวคลน (absor-bance) 570 นาโนเมตร พบความสมพนธระหวางจ�านวนเซลล
และคาการดดกลนแสงของเซลล U2-OS คอ Y = 97643X
และมคาสมประสทธสหสมพนธ (R2) เทากบ 0.9977 (รปท 1)
กราฟมาตรฐานจะถกน�ามาใชเทยบคาการดดกลนแสงทวดได
ในแตละการศกษาโดยเทคนค MTT assay เปนจ�านวนเซลล
ทยงมชวตอย
รปท 1 กราฟมาตรฐานแสดงความสมพนธระหวางคาการ
ดดกลนแสงและจ�านวนเซลลออสทโอซารโคมา
ชนด U2-OSFigure 1 Standard curve showed the relation between
an absorbance and number of osteosarcoma cell line, U2-OS.
ผลของเคอรเซตนตอควำมมชวตของเซลลออสทโอซำร
โคมำของมนษยชนดU2-OSโดยเทคนคMTT assay
ผลการศกษาพบวาเคอรเซตนความเขมขน 1 ไมโคร-
โมลาร ในทกชวงเวลาทท�าการทดสอบ ไมมผลตอความม
ชวตของเซลลเมอเปรยบเทยบกบกลมควบคม ในขณะท
เคอรเซตนความเขมขน 5 10 25 50 และ 100 ไมโครโมลาร
ในทกชวงเวลาทท�าการทดสอบมผลลดรอยละความมชวต
ของเซลลอยางมนยส�าคญทางสถตเมอเปรยบเทยบกบกลม
ชม. ทนตสาร ปท 36 ฉบบท 1 ม.ค.-ม.ย. 2558 CM Dent J Vol. 36 No. 1 January-June 201568
ควบคม และรอยละความมชวตเซลลมคาลดลงไปตามระดบ
ความเขมขนของเคอรเซตนทเพมขน (เครองหมาย * ในรป
ท 2) รอยละความมชวตเซลลลดลงมากกวา 50 เมอเซลล
ถกทดสอบดวยเคอรเซตนระดบความเขมขน 100 ไมโคร-
โมลารเปนเวลา 24 ชวโมง (รอยละความมชวตเซลลลดลง
เทากบ 55.089) ทระดบความเขมขน 25 50 100 ไมโครโม-
ลารเปนเวลา 48 ชวโมง (รอยละความมชวตเซลลลดลงเทากบ
54.898, 66.723, 74.898 ตามล�าดบ) และทระดบความเขม
ขน 25 50 100 ไมโครโมลารเปนเวลา 72 ชวโมง (รอยละ
ความมชวตเซลลลดลงเทากบ 57.419, 72.130, 81.424 ตาม
ล�าดบ) เคอรเซตนมผลลดรอยละความมชวตของเซลลแปรผน
ไปตามเวลาทท�าการทดสอบทเพมขนอยางมนยส�าคญทาง
สถต ในระหวางการทดสอบทเวลา 24 ชวโมง กบ 48 และ
72 ชวโมง ในระดบความเขมขน 25 50 และ 100 ไมโคร-
โมลาร (เครองหมาย # ในรปท 2)
ผลลกษณะกำรตำยแบบอะพอพโทสสของเซลลออสต
โอซำรโคมำของมนษยชนดU2-OS โดยเคอรเซตนภำยใตกลองจลทรรศนชนดหวกลบ
ผลการศกษาพบวากลมควบคมทไมไดถกทดสอบดวย
เคอรเซตน เซลลแสดงลกษณะปกตในจานเพาะเลยงเซลล
ในหองปฏบตการเปนเวลา 48 54 และ 72 ชวโมง แสดงดง
รปท 3A, D, และ G ตามล�าดบ เมอเซลลถกทดสอบดวย
เคอรเซตนจะมการหดตวและฝอลบ มความหนาแนนของเซลล
ในจานเพาะเลยงลดลง เซลลมการหลดออกจากผวจานเพาะ
เลยงเซลล ลกษณะดงกลาวจะเพมขนเปนไปตามความเขม
ขนและเวลาทเซลลถกทดสอบเพมขน เซลลแสดงลกษณะการ
ตายแบบอะพอพโทสสเมอถกทดสอบดวยเคอรเซตนท 100
ไมโครโมลารเปนเวลา 48 ชวโมงเปนตนไป โดยพบเยอหม
เซลลเกดการบวมเปนตมหรอหนอขน (plasma membrane blebbing) เมอเซลลถกทดสอบดวยเคอรเซตนท 100 ไมโคร-
โมลารเปนเวลา 48 ชวโมง (รปท 3B, C ลกศรช) ตอมาพบ
การรวมตวกนแนนของนวเคลยส (nuclear condensation) และมการแตกหกของดเอนเอ (DNA fragmentation) เมอ
เซลลถกทดสอบดวยเคอรเซตนท 100 ไมโครโมลารเปนเวลา
54 ชวโมง (รปท 3E, F ลกศรช) และเมอเซลลถกทดสอบ
ดวยเคอรเซตนท 100 ไมโครโมลาร เปนเวลา 72 ชวโมง
เซลลจะมการแยกสลายเปนเมดเลกๆ ซงมชอเรยกเฉพาะ
วา อะพอพโทตก บอด ซงบรรจดเอนเอทแตกหกอยภายใน
(รปท 3H, I ลกศรช)
ผลของเคอรเซตนตอกำรตำยแบบอะพอพโทสสของ
เซลลออสตโอซำรโคมำของมนษยชนดU2-OSโดยเทคนค
DNA fragmentation assay
เพอสนบสนนผลการศกษาลกษณะการตายแบบอะพอพ-
โทสสของเซลลโดยเคอรเซตนภายใตกลองจลทรรศนชนด
หวกลบ กลมวจยจงท�าการศกษาเพมเตมถงผลของเคอร-
เซตนตอการตายแบบอะพอพโทสสของเซลลโดยอาศยเทคนค
DNA fragmentation assay ผลการศกษาพบวาเมอเซลล
ถกทดสอบดวยเคอรเซตนระดบความเขมขน 5 25 และ 100
ไมโครโมลาร เปนเวลา 48 ชวโมง (รปท 4A) และความเขม
ขน 5 และ 25 ไมโครโมลาร เปนเวลา 72 ชวโมง (รปท 4B)
รปท 2 รอยละความมชวตของเซลลออสทโอซารโคมา
ของมนษยชนด U2-OS เมอทดสอบดวยเคอรเซ
ตนทระดบความเขมขน 1 5 10 25 50 และ 100
ไมโครโมลารเปนเวลา 24 48 และ 72 ชวโมง *
P<0.05 แสดงความแตกตางอยางมนยส�าคญ
ของการทดสอบดวยเคอรเซตนในระดบความเขม
ขนตางๆ เปรยบเทยบกบกลมควบคมทเวลา 24
48 และ 72 ชวโมง #P< 0.05 แสดงความแตก
ตางอยางมนยส�าคญระหวางการทดสอบทเวลา 24
ชวโมง กบ 48 และ 72 ชวโมง ในระดบความเขม
ขน 25 50 และ 100 ไมโครโมลาร
Figure 2 % cell viability of osteosarcoma cell line, U2-OS after treated with the varied con-centrations of quercetin at 24, 48 and 72 h. *P<0.05 quercetin treatments compared with control at 24, 48 and 72 h. #P< 0.05 compared between 24 h and, 48 and 72h of quercetin treatments in concentration of 25, 50 and 100 µM.
ชม. ทนตสาร ปท 36 ฉบบท 1 ม.ค.-ม.ย. 2558 CM Dent J Vol. 36 No. 1 January-June 201569
รปท 3 ลกษณะการตายแบบอะพอพโทสสของเซลล U2-OS เมอทดสอบดวยเคอรเซตนทระดบความเขมขน 100 ไมโครโม
ลารเปนเวลา 48 54 และ 72 ชวโมงภายใตกลองจลทรรศนชนดหวกลบ รป A, B, D, E, G, H ก�าลงขยาย 200
เทา (C, F, I เปนภาพขยายจาก B, E, H, ตามล�าดบ) A, D, G แสดงลกษณะของเซลลกลมควบคม B, C แสดง
ลกษณะของเซลลเมอถกทดสอบทระดบความเขมขน 100 ไมโครโมลารเปนเวลา 48 ชวโมง ลกศรแสดงลกษณะของ
plasma membrane blebbing E, F แสดงลกษณะของเซลลเมอถกทดสอบทระดบความเขมขน 100 ไมโครโม
ลารเปนเวลา 54 ชวโมง ลกศรแสดงลกษณะการแตกหกของดเอนเอ H, I แสดงลกษณะของเซลลเมอถกทดสอบ
ทระดบความเขมขน 100 ไมโครโมลารเปนเวลา 72 ชวโมง ลกศรแสดงลกษณะของ apoptotic body ซงบรรจด
เอนเอทแตกหกอยภายใน
Figure 3 Morphological changes of U2-OS cells after treated with 100 µM of quercetin for 48, 54 and 72 h observed by using Inverted System Microscope. A, B, D, E, G, H (x200) and C, F, I are higher magnification from B, E, H, respectively. A, D, G are control cells. Arrows in B, C indicated mem-brane blebbing after treated with 100 µM of quercetin for 48 h. Arrows in E, F, indicated DNA fragmentation after treated with 100 µM of quercetin for 54 h. Arrows in H, I indicated apoptotic body containing fragmented DNA after treated with 100 µM of quercetin for 72 h.
ชม. ทนตสาร ปท 36 ฉบบท 1 ม.ค.-ม.ย. 2558 CM Dent J Vol. 36 No. 1 January-June 201570
รปท 4 ผลการสกดดเอนเอของเซลล U2-OS โดยเทคนค DNA fragmentation assay เมอถกทดสอบดวยเคอรเซตน
ความเขมขน 5 25 100 ไมโครโมลารเปนเวลา 48 ชวโมง (A) และ 72 ชวโมง (B) และทความเขมขน 100 ไมโคร
โมลารเปนเวลา 54 และ 72 ชวโมง (C) พบการแตกหกของดเอนเอเมอเซลลถกทดสอบดวยเคอรเซตนความเขม
ขน 100 ไมโครโมลารเปนเวลา 54 และ 72 ชวโมง (หวลกศรรป B และ C) (M= marker Hind III แสดงคาน�า
หนกโมเลกลดเอนเอ; C= กลมควบคม; 5 25 100= เคอรเซตนความเขมขน 5 25 100 ไมโครโมลาร; bp= base pairs หนวยของน�าหนกโมเลกลของดเอนเอ)
Figure 4 Extracted DNA of U2-OS cells observed by DNA fragmentation assay, after U2-OS cells were treated with 5, 25 and 100 µM of quercetin for 48 h (A) and 72 h (B), and 100 µM of quercetin for 54 h and 72h (C). Large DNA fragments were found after U2-OS cells were treated with 100 µM of quercetin for 54 h and 72h (arrow heads in B and C) (M = marker Hind III; C= control group; 5 25 100= 5, 25 and 100 µM of quercetin; bp= base pairs)
ไมพบการแตกหกของดเอนเอของเซลล น�าหนกดเอนเอทสกด
ไดไมแตกตางจากกลมควบคม ในขณะทเซลลถกทดสอบดวย
เคอรเซตนระดบความเขมขน 100 ไมโครโมลาร เปนเวลา
54 และ 72 ชวโมง พบการแตกหกของดเอนเอเปนผลใหน�า
หนกโมเลกลของดเอนเอทสกดไดมคานอยกวากลมควบคม
และมน�าหนกโมเลกลของดเอนเอทแตกหกมากกวา 23,130
bp ขนไป (รป 4B, C, หวลกศรช) ผลการศกษาสอดคลอง
ไปกบการศกษาลกษณะการตายแบบอะพอพโทสสของเซลล
โดยเคอรเซตนภายใตกลองจลทรรศนชนดหวกลบ โดยพบ
วาเคอรเซตนเหนยวน�าใหเกดการตายของเซลลแบบอะพอพ-
โทสสและมการแตกหกของดเอนเอ (DNA fragmentation) เมอเซลลถกทดสอบดวยเคอรเซตนท 100 ไมโครโมลารเปน
เวลา 54 ชวโมง และ 72 ชวโมง (รปท 3E, F ลกศรชและ
รปท 3H, I ลกศรช)
บทวจารณ การศกษานแสดงใหเหนวาเคอรเซตนมฤทธตานการ
เจรญของเซลลออสตโอซารโคมาของมนษยชนด U2-OS
อยางมนยส�าคญทางสถตทระดบความเขมขน 5 10 25 50 และ
100 ไมโครโมลาร เปนเวลา 24 48 และ 72 ชวโมง โดยรอย
ละความมชวตของเซลลลดลงเปนไปตามระดบความเขมขน
ของเคอรเซตนทเพมมากขน เคอรเซตนทระดบความเขมขน
100 ไมโครโมลารเปนเวลา 24 ชวโมงและระดบความเขมขน
25 50 100 ไมโครโมลาร เปนเวลา 48 และ 72 ชวโมงมผล
ลดรอยละความมชวตเซลลไดมากกวา 50 เมอเปรยบเทยบ
ผลการศกษานกบการศกษาผลของเคอรเซตนตอเซลลออส-
ตโอซารโคมาของมนษยชนดอนๆ พบวาเคอรเซตนระดบ
ความเขมขน 100 ไมโครโมลารทดสอบเปนเวลา 48 ชวโมง
มผลลดรอยละความมชวตของเซลลออสตโอซารโคมาของ
มนษยชนด HOS-143B นอยกวา 40(17) และเคอรเซตน
ระดบความเขมขน 160 ไมโครโมลารทดสอบเปนเวลา 48
ชวโมงมผลลดรอยละความมชวตของเซลลออสตโอซารโคมา
ของมนษยชนด MG-63 ไดเทากบ 50(18) ขณะทการศกษา
นเมอเปรยบเทยบเวลาในการทดสอบท 48 ชวโมง พบวา
เคอรเซตนระดบความเขมขนท 25 ไมโครโมลารมผลลดรอย
ละความมชวตของเซลล U2-OS ไดมากกวา 50 จะเหนไดวา
ชม. ทนตสาร ปท 36 ฉบบท 1 ม.ค.-ม.ย. 2558 CM Dent J Vol. 36 No. 1 January-June 201571
เซลล U2-OS มความไว (sensitivity) ตอเคอรเซตน สง
กวาเมอเปรยบกบเซลล HOS-143B และ MG-63 เคอรเซ
ตนมผลตอเซลลออสตโอซารโคมาของมนษยแตกตางกนไป
อาจเปนผลมาจากคณลกษณะของเซลลทแตกตางกน เซลล
HOS-143B มลกษณะทลกลามสง (invasion) และสามารถ
แพรกระจาย (metastasis) ไปยงเนอเยออนๆ ไดในขณะท
เซลล U2-OS มลกษณะทลกลามสงเชนกน แตไมมการแพร
กระจายของเซลล สวนเซลล MG-63 ไมมลกษณะการลกลาม
และการแพรกระจาย(19) จากความไวของเซลล U2-OS ตอ
เคอรเซตนแสดงใหเหนวาเคอรเซตนนาจะใหผลดในการรกษา
ผปวยในระยะทเซลลออสตโอซารโคมามคณลกษณะทลกลาม
สง แตไมมการแพรกระจายของเซลล ทงนเพอประสทธภาพ
สงสดในการออกฤทธของเคอรเซตนในปรมาณทต�าสดทใช
ในการรกษา เนองจากมรายงานการศกษาพบวาเคอรเซตนม
ผลดานความเปนพษตอเซลลกระดกปกตของหนทดลองชนด
M3T3E1 ไดเชนเดยวกนโดยระดบความเขมขน 50 ไมโคร-
โมลารมผลลดรอยละความมชวตของเซลลกระดกไดเทากบ
55(20) ดงนนการใชเคอรเซตนในปรมาณทสงอาจมผลเสยตอ
เซลลกระดกปกตของผปวยได
การตายของเซลล เปนกลไกทก�าจดเซลลเสอมสภาพ
ตามอายขยหรอเสอมสภาพจากการถกท�าลายจนไมสามารถ
ซอมแซมได การตายของเซลลแบบอะพอพโทสสเกดขนได 2
วถ คอ (1) วถภายนอกหรอ death-receptor-induced ex-trinsic pathway เกดเมอตวรบสญญาณการตายหรอ death receptors (DRs) เชน tumor necrosis factor receptor (TNFR), Fas receptor (FasR), TNF-related apopto-sis-inducing ligand receptor (TRAILR) เปนตน ตวรบ
สญญาณการตายเหลานจะถกกระตนดวยการจบของลแกนด
(ligand) ทจ�าเพาะท�าใหเกดเปนโครงสรางทประกอบดวย
โปรตนตวปรบ (adaptor proteins) กระตนการท�างานของ
กลมเอนไซมแคสเปส (caspases) ทท�าหนาทสลายโปรตน
โครงสรางของเซลล สลายออรแกเนลล (organelles) และ
เกดการแตกหกของดเอนเอ (DNA fragmentation) (2) สวนวถภายในหรอ mitochondrial-apoptosome-mediat-ed apoptotic intrinsic pathway ซงจะถกควบคมโดยความ
สามารถในการซมผานของเยอหมชนนอกของไมโทคอนเดรย
(mitochondria outer membrane permeabilization) เมอ
มสงกระตน เชน สารเคมทเปนพษ อนมลอสระ การเสยสมดล
ของแคลเซยมไอออนจะรบกวน electrochemical gradient ท�าใหเยอหมชนนอกของไมโทคอนเดรยสญเสยการควบคม
และปลอยไซโทโครม ซ (cytochrome c) ออกมาจากไมโท-
คอนเดรย ไซโทโครม ซ จะกระตนการท�างานของกลมเอน-
ไซมแคสเปส (caspases) น�าไปสการตายแบบอะพอพโทสส
อยางไรกตามการน�าสญญาณการตายของทงสองวถนอาจเปน
อสระตอกนหรออาจเหนยวน�าสญญาณการตายรวมกนได การ
ตายของเซลลแบบอะพอพโทสสจะมลกษณะรปรางทจ�าเพาะ
สามารถมองเหนไดภายใตกลองจลทรรศนชนดหวกลบ โดย
เซลลจะเกดการหดตวเนองจากมการท�าลายโปรตนโครงสราง
ของเซลล เชน เสนใยแอคตน (actin filaments) ในไซโท-
พลาสซม ท�าใหไซโทพลาสซม ออรแกเนลลและนวเคลยส
เกดการรวมตวกนแนน (nuclear condensation) โครมาตน
เกาะกลมกน (chromatin aggregation) เยอหมเซลลเกด
บวมเปนตมหรอหนอขน (plasma membrane blebbing) ในระยะทายของกระบวนการดเอนเอจะถกยอยเปนชนสวน
ตางๆ (endonucleocytic degradation of DNA into nucleosomal fragments) จากนนเซลลจะแยกสลายออก
เปนเมดเลกๆ หรอเวสซเคล (vesicle) ซงมชอเรยกเฉพาะ
วา อะพอพโทตก บอด (apoptotic body) ซงตอมาจะถก
จบกนโดยเซลลอนๆ โดยวธฟาโกไซโตสส (phagocyto-sis) การแตกหกของดเอนเอจากการถกยอยสลายมรปแบบ
ทชดเจน ดงน 1. ไดเปนชนสวนดเอนเอขนาดใหญ (large DNA fragments) ทมขนาดโมเลกล 50-300 kbp 2. ได
เปนชนสวนดเอนเอสายสนๆ (small DNA fragments) ทมขนาด 180-200 bp หรอ 3. ไดชนสวนดเอนเอขนาด
ใหญและชนสวนสายสนๆ รวมกน ชนสวนดเอนเอทแตกหก
สามารถแยกไดตามน�าหนกโมเลกลโดยวธอเลกโตรโฟรซส
(gel electrophoresis)(21,22)
นอกจากเคอรเซตนจะออกฤทธตานการเจรญโดยมผล
ลดรอยละความมชวตของเซลลอยางมนยส�าคญทระดบความ
เขมขน 5 25 50 ไมโครโมลารแลว ในระดบความเขมขนทสง
ขนของเคอรเซตนท 100 ไมโครโมลาร ยงสามารถเหนยวน�า
ใหเกดการตายของเซลลแบบอะพอพโทสสได โดยส�ารวจพบ
เยอหมเซลลเกดการบวมเปนตม เมอถกทดสอบเปนเวลา 48
ชวโมง ตอมาเกดการแตกหกของดเอนเอและพบอะพอพ-
โทตก บอดเมอเซลลถกทดสอบเปนเวลา 54 และ 72 ชวโมง
รปแบบการแตกหกของดเอนเอไดเปนชนสวนขนาดใหญม
ชม. ทนตสาร ปท 36 ฉบบท 1 ม.ค.-ม.ย. 2558 CM Dent J Vol. 36 No. 1 January-June 201572
น�าหนกโมเลกลมากกวา 23,130 bp หรอ 23.13 kbp โดย
กระบวนการตายของเซลลแบบอะพอพโทสสเปนไปตามระยะ
เวลาทเซลลถกทดสอบเพมมากขน อยางไรกตามเคอรเซตน
สามารถเหนยวน�าใหเกดการตายแบบอะพอพโทสสในเซลล
มะเรงชนดตางๆ ผานวถใดนนยงไมเปนททราบแนชด(12,14,23)
จากการศกษาทใกลเคยงแสดงถงกลไกสงเสรมวถการเหนยว
น�าการตายแบบอะพอพโทสสของเคอรเซตนตอเซลลมะเรง
ชนดตางๆ พบวา เคอรเซตนสงเสรมฤทธ ลแกนดทเรยกวา
TRAIL ผานตวรบสณญาณการตายทเรยกวา TRAILR ซง
เปนการเหนยวน�าการตายของเซลลจากวถภายนอก ในการ
กระตนการตายแบบอะพอพโทสสของเซลลมะเรงล�าไส ใหญ
ของมนษยชนด HT-29 SW-620 และ Caco-2(24) และ
เซลลมะเรงตอมลกหมากของมนษยชนด DU-145 และ PC-3(25) และการศกษาทแสดงผลของเคอรเซตนทสมพนธกบการ
กระตนการตายแบบอะพอพโทสสของเซลลมะเรงผานวถ
ภายใน ในเซลลมะเรงตบชนด HepG2(13) และเซลลมะเรง
เยอบผวชนด KB และ KBv200(26) จากการศกษาฤทธ
การเหนยวน�าใหเกดการตายแบบอะพอพโทสสของเคอร-
เซตนตอเซลลออสตโอซารโคมาของมนษย พบวาเคอรเซตน
สามารถเหนยวน�าใหเกดการตายแบบอะพอพโทสสในเซลล
HOS-143B และเซลล MG-63 วถการเหนยวน�าการตาย
ของเซลล HOS-143B โดยเคอรเซตยงไมทราบแนชด ขณะ
ทการตายของเซลล MG-63 โดยเคอรเซตนสมพนธกบการ
เหนยวน�าวถภายใน ในขณะทวถการเหนยวน�าการตายของ
เซลล U2-OS โดยเคอรเซตนยงไมเปนททราบแนชดและยง
คงตองมการศกษาเพมเตมตอไป
จากการศกษาแสดงถงฤทธของเคอรเซตนตอการตาน
การเจรญและเหนยวน�าใหเกดการตายของเซลลแบบอะพอพ-
โทสสในเซลลมะเรงออสตโอซารโคมาของมนษย การศกษา
เพมเตมถงกลไกการออกฤทธดงกลาวจะเปนประโยชนใน
การน�าไปใชในการรกษาผปวยตอไป การน�าเคอรเซตนไปใช
ในการรกษาผปวยอาจจะอาศยฤทธโดยตรงของเคอรเซตนใน
การตานการเจรญของเซลลมะเรงเพอลดการใชยาเคมบ�าบด
ซงมขอจ�ากดอยหลายประการ ปจจบนมการพฒนาการขน
สงเคอรเซตนเขาสรางกายใหอยในรปแบบของนาโนพาทเคล
(nanoparticle) ซงจะท�าใหรางกายดดซมเคอรเซตนไดด
ขน ลดปรมาณการใชเคอรเซตน และเพมประสทธภาพการ
ออกฤทธของเคอรเซตน โดยเคอรเซตนจะถกน�าสงโดยตรง
ไปยงเซลลมะเรงซงเปนเปาหมายในการออกฤทธ(27) การใช
เคอรเซตนเพอการรกษาผปวยมะเรงอาจใชรวมกบยาเคม
บ�าบด เนองจากมรายงานการศกษาพบวาเคอรเซตนเพม
ประสทธภาพของยาเคมบ�าบดไดแก โทโปทแคน ไฮโปคลอ-
ไรด (topotecan hydrochloride) ในการเหนยวน�าใหเกด
การตายของเซลลได 1.4 เทาในเซลลมะเรงเตานมของมนษย
ชนด MCF-7 และ 1.3 เทาในเซลลมะเรงเตานมของมนษย
ชนด MAD-MB 231 เมอเปรยบเทยบกบการใชยาเคม
บ�าบดเพยงอยางเดยว(15) จากการศกษาแสดงใหเหนวาเคอร-
เซตนนาจะเปนอกทางเลอกหนงทนาสนใจ ในการน�ามาใชใน
การรกษาผปวยเซลลมะเรงออสตโอซารโคมาของมนษย เพอ
เพมประสทธภาพในการรกษา ลดปรมาณการใชยาเคมบ�าบด
ซงมขอจ�ากดเรองความเปนพษและการดอตอยาเคมบ�าบด
ของผปวย อยางไรกตามการเลอกใชเคอรเซตนในการรกษา
ผปวยยงคงตองมการศกษาคนควาเพมเตมตอไป
บทสรป ผลการศกษาพบวาเคอรเซตนมฤทธตานการเจรญและ
เหนยวน�าใหเกดการตายแบบอะพอพโทซสของเซลลออสต-
โอซารโคมาของมนษยชนด U2-OS ทงนขนอยกบระดบความ
เขมขนของเคอรเซตนและเวลาทเซลลไดรบ เซลลออสต-
โอซารโคมาของมนษยชนด U2-OS ซงมคณสมบตการลกลาม
สงแตไมแพรกระจายไปอวยวะขางเคยง ดงนนเคอรเซตนนา
จะเปนทางเลอกหนงทจะชวยเพมประสทธภาพในการรกษา
ผปวยในระยะทเซลลมพฤตกรรมเทยบเคยงไดกบเซลล U2-OS อยางไรกตามควรมการศกษาเพมเตมถงกลไกการออก
ฤทธของเคอรเซตนตอการตานการเจรญและการเหนยวน�าให
เกดการตายแบบอะพอพโทสสของเซลล U2-OS เพอน�าผล
มาประยกตใช ในการเพมประสทธภาพการรกษาผปวยตอไป
กตตกรรมประกาศ ผ วจยขอขอบพระคณ คณะทนตแพทยศาสตร
มหาวทยาลยนเรศวร ทใหการสนบทนวจยและเครองมอใน
การศกษาวจย และขอขอบพระคณ ภาควชากายวภาคศาสตร
จฬาลงกรณมหาวทยาลย ส�าหรบความอนเคราะห ใหเซลล
ออสทโอซารโคมาของมนษยชนด U2-OS เพอการศกษาวจย
ชม. ทนตสาร ปท 36 ฉบบท 1 ม.ค.-ม.ย. 2558 CM Dent J Vol. 36 No. 1 January-June 201573
เอกสารอางอง1. Mirabello L, Troisi RJ, Savage SA. International
osteosarcoma incidence patterns in children and adolescents, middle ages and elderly persons. Int J Cancer 2009; 125: 229-234.
2. Ottaviani G., Jaffe N. The epidemiology of os-teosarcoma. In: Pediatric and Adolescent Os-teosarcoma. Edited by Norman Jaffe, Oyvind S. Bruland, Stefan Bielack. New York: Springer; 2009. pp. 3-13.
3. Oertel S, Blattmann C, Rieken S, et al. Radiother-apy in the treatment of primary osteosarcoma--a single center experience. Tumori 2010; 96: 582-588.
4. Won KY, Lee CH, Kim YW, Park YK. Primary giant-cell-rich osteosarcoma of the urinary blad-der: usefulness of osteocalcin and osteonectin immunohistochemical staining and literature review. Pathology 2011; 43: 161-164.
5. Bielack SS, Carrle D, Hardes J, Schuck A, Pau-lussen M. Bone tumors in adolescents and young adults. Curr Treat Options Oncol 2008; 9: 67-80.
6. Mei Y, Wei D, Liu J. Reversal of multidrug resis-tance in KB cells with tea polyphenol antioxidant capacity. Cancer Biol Ther 2005; 4: 468-473.
7. Muldoon MF, Kritchevsky SB. Flavonoids and heart disease. BMJ 1996; 312: 458-459.
8. Taguri T, Tanaka T, Kouno I. Antimicrobial activity of 10 different plant polyphenols against bacteria causing food-borne disease. Biol Pharm Bull 2004; 27: 1965-1969.
9. Kang TB, Liang NC. Studies on the inhibitory effects of quercetin on the growth of HL-60 leukemia cells. Biochem Pharmacol 1997; 54: 1013-1018.
10. Yoshida M, Yamamoto M, Nikaido T. Quercetin arrests human leukemic T-cells in late G1 phase of the cell cycle. Cancer Res 1992; 52: 6676-6681.
11. Yoshida M, Sakai T, Hosokawa N, et al. The effect of quercetin on cell cycle progression and growth of human gastric cancer cells. FEBS Lett 1990; 260: 10-13.
12. Lee TJ, Kim OH, Kim YH, et al. Quercetin arrests G2/M phase and induces caspase-dependent cell death in U937 cells. Cancer Lett 2006; 240: 234-242.
13. Granado-Serrano AB, Martin MA, Bravo L, Goya L, Ramos S. Quercetin induces apoptosis via caspase activation, regulation of Bcl-2, and inhibition of PI-3-kinase/Akt and ERK pathways in a human hepatoma cell line (HepG2). J Nutr 2006; 136: 2715-2721.
14. Kuo PC, Liu HF, Chao JI. Survivin and p53 mod-ulate quercetin-induced cell growth inhibition and apoptosis in human lung carcinoma cells. J Biol Chem 2004; 279: 55875-55885.
15. Akbas SH, Timur M, Ozben T. The effect of quercetin on topotecan cytotoxicity in MCF-7 and MDA-MB 231 human breast cancer cells. J Surg Res 2005; 125: 49-55.
16. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 1983; 65: 55-63.
17. Berndt K, Campanile C, Muff R, Strehler E, Born W, Fuchs B. Evaluation of quercetin as a potential drug in osteosarcoma treatment. Anticancer Res 2013; 33: 1297-1306.
ชม. ทนตสาร ปท 36 ฉบบท 1 ม.ค.-ม.ย. 2558 CM Dent J Vol. 36 No. 1 January-June 201574
18. Liang W, Li X, Li C, et al. Quercetin-mediated apoptosis via activation of the mitochondrial-de-pendent pathway in MG-63 osteosarcoma cells. Mol Med Rep 2011; 4: 1017-1023.
19. Mohseny AB, Machado I, Cai Y, et al. Functional characterization of osteosarcoma cell lines pro-vides representative models to study the human disease. Lab Invest 2011; 91: 1195-1205.
20. Nam TW, Yoo CI, Kim HT, Kwon CH, Park JY, Kim YK. The flavonoid quercetin induces apop-tosis and inhibits migration through a MAPK-de-pendent mechanism in osteoblasts. J Bone Miner Metab 2008; 26: 551-560.
21. Bortner CD, Oldenburg NB, Cidlowski JA. The role of DNA fragmentation in apoptosis. Trends Cell Biol 1995; 5: 21-26.
22. Stadelmann C, Lassmann H. Detection of apopto-sis in tissue sections. Cell Tissue Res 2000; 301: 19-31.
23. Haghiac M, Walle T. Quercetin induces necrosis and apoptosis in SCC-9 oral cancer cells. Nutr Cancer 2005; 53: 220-231.
24. Psahoulia FH, Drosopoulos KG, Doubravska L, Andera L, Pintzas A. Quercetin enhances TRAIL-mediated apoptosis in colon cancer cells by inducing the accumulation of death receptors in lipid rafts. Mol Cancer Ther 2007; 6: 2591-2599.
25. Kim YH, Lee DH, Jeong JH, Guo ZS, Lee YJ. Quercetin augments TRAIL-induced apoptotic death: involvement of the ERK signal transduc-tion pathway. Biochem Pharmacol 2008; 75: 1946-1958.
26. Zhang JY, Yi T, Liu J, Zhao ZZ, Chen HB. Quer-cetin induces apoptosis via the mitochondrial pathway in KB and KBv200 cells. J Agric Food Chem 2013; 61: 2188-2195.
27. Men K, Duan X, Wei XW, et al. Nanoparticle-de-livered quercetin for cancer therapy. Anticancer Agents Med Chem 2014; 14: 826-832.