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Optimisation du potentiel thérapeutique des cellules souches de sang de cordon ombilical
Mémoire
Marie-Eve Rhéaume
Maîtrise en microbiologie
Maître ès sciences (M. Sc.)
Québec, Canada
© Marie-Eve Rhéaume, 2017
Optimisation du potentiel thérapeutique des cellules souches de sang de cordon ombilical
Mémoire
Marie-Eve Rhéaume
Sous la direction de :
André Darveau, directeur de recherche
Renée Bazin, codirectrice de recherche
iii
RÉSUMÉ
Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont greffées à des patients dont le système immunitaire est affaibli ou déficient, afin de reconstituer leur système hématopoïétique. En raison de leurs nombreux avantages, les CSH provenant du sang de cordon ombilical sont de plus en plus utilisées. Cette hausse de la demande a mené à l’implantation de plusieurs banques publiques, dont celle d’Héma-Québec, opérant selon les lignes directrices d’organismes réglementaires. Malgré la standardisation des protocoles de mise en banque, certains paramètres ne sont pas règlementés, telle la température d’entreposage des sangs de cordon avant leur cryopréservation. À Héma-Québec, le transport et la conservation des prélèvements avant la mise en banque sont faits à température pièce (TP) en respectant un délai maximal de 48 heures entre le moment du prélèvement et celui de la mise en banque. De récents travaux rapportés dans la littérature ont montré que les CSH provenant de sang de cordon conservé à TP pendant une période de 72 heures avant la mise en banque perdaient complètement leur capacité de reconstitution hématopoïétique alors que celle-ci était préservée si la conservation était faite à 4°C. Nous avons donc entrepris la présente étude afin de déterminer l’impact de l’entreposage à 4oC ou TP allant jusqu’à 48 heures sur plusieurs paramètres fonctionnels des CSH de sang de cordon ombilical, soit la viabilité, la capacité à se différencier et le potentiel de reconstitution hématopoïétique à l’aide d’un modèle animal de greffe. Les essais de différenciation ont permis de prédire les résultats des greffes, et ces derniers ont mis en évidence une grande variabilité entre les différents sangs de cordon. À ce stade, l’impact de la température d’entreposage avant la mise en banque sur le potentiel de reconstitution hématopoïétique des CSH n’est pas encore déterminé et des travaux supplémentaires devront être effectués.
iv
ABSTRACT
Umbilical cord blood (UCB) has been proven to be an important alternative source of hematopoietic stem cells (HSCs) mostly for pediatric patients suffering from hematologic disorders. Because of its many advantages over other sources of HSCs, such as ease of collection, less stringent HLA restrictions and lower risks of developing GVHD, the use of UCB has expanded in recent years and led to a growing number of public cord blood banks (CBB) that operate under guidelines established by the regulatory organisms such as Netcord FACT, AABB or FDA. Despite the standardization of CBB procedures, some parameters remain unregulated, such as the pre-processing storage temperature. At Héma-Québec Public CBB, the units are kept at room temperature (RT) before being processed and cryopreserved within 48 hours after collection. Recently, a study using a mouse model of engraftment revealed that a pre-processing storage of 72 hours at room temperature might have deleterious effects on the HSC reconstitution capacity. The aim of our study was to evaluate the impact of pre-processing storage temperature on HSCs, by evaluating their viability, differentiation capacity and in vivo hematopoietic reconstitution in a mouse engraftment model. Results show that hematopoietic reconstitution potential measured in NSG mice differed for each of CBUs tested and that, in contrast to the previously published study, the in vivo reconstitution could be predicted by CFU assays. At this stage, the impact of preprocessing temperature on HSCs has not been confirmed, and to do so will require additional experiments.
v
TABLE DES MATIÈRES
RÉSUMÉ ................................................................................................................ III ABSTRACT ............................................................................................................ IV LISTE DES FIGURES ........................................................................................... VII LISTE DES ABRÉBIATIONS ............................................................................... VIII REMERCIEMENTS ................................................................................................. X 1. INTRODUCTION ................................................................................................. 1 1.1 HÉMATOPOÏÈSE .............................................................................................. 1 1.2 LES GREFFES DE CELLULES SOUCHES HÉMATOPOÏÉTIQUES ............... 3
1.2.1 Les types de greffe ...................................................................................... 4 1.2.2 La compatibilité HLA ................................................................................... 5
1.3 LES SOURCES DE CELLULES SOUCHES HÉMATOPOÏÉTIQUES ............... 6 1.3.1 La moelle osseuse ...................................................................................... 6 1.3.2 Le sang périphérique (cellules souches périphériques stimulées (CSP)) ... 7 1.3.3 Le sang de cordon ombilical ................................................................... 8
1.4 MISE EN BANQUE DU SANG DE CORDON OMBILICAL ............................. 12 1.5 STRATÉGIES POUR L’OPTIMISATION DES GREFFES DE CSH DE SANG DE CORDON OMBILICAL .................................................................................... 14
1.5.1 Les doubles transplantations de sang de cordon ombilical ...................... 14 1.5.2 Expansion des CSH ................................................................................. 15
1.5.2.1 Récepteurs Notch ............................................................................... 16 1.5.2.2 Molécule Copper ................................................................................. 17 1.5.2.3 Molécule UM171 ................................................................................. 18
1.5.3 Optimisation du homing des CSH ............................................................ 19 1.6 UTILISATION CROISSANTE .......................................................................... 21 1.7 CONDITIONS DE CONSERVATION DES SANGS DE CORDON .................. 23 1.8 HYPOTHÈSE ET OBJECTIFS ........................................................................ 28 2. MATÉRIEL ET MÉTHODE ................................................................................ 29 2.1 EXPÉRIENCES IN VITRO .............................................................................. 29
2.1.1 Traitement du sang de cordon ombilical ................................................... 29 2.1.2 Protocole ISHAGE ................................................................................ 31 2.1.3 Essais de progéniteurs.......................................................................... 33 2.1.4 Marquage des molécules de migration à la moelle osseuse ................. 34
2.2 EXPÉRIENCES IN VIVO ............................................................................. 35 2.2.1 Modèle murin ........................................................................................... 35 2.2.2 Analyses post-greffe................................................................................. 36
2.2.2.1 Analyse sanguine ................................................................................ 36 2.2.2.2 Évaluation de la prise de greffe .......................................................... 36 2.2.2.3 Analyses statistiques .......................................................................... 37
3. RÉSULTATS ..................................................................................................... 39 3.1 RÉSULTATS IN VITRO ............................................................................... 39
3.1.1 Contenu des unités de sang de cordon .................................................... 39 3.1.2 Effet de la température d’entreposage sur la viabilité des cellules ........... 40 3.1.3 Effet de la température d’entreposage sur le potentiel de différenciation des CSH ................................................................................................................... 42
vi
3.1.4 Effet de la température d’entreposage sur l’expression de molécules de surface ............................................................................................................... 44
3.2 RÉSULTATS IN VIVO ..................................................................................... 45 3.2.1 Mise au point de la transplantation de cellules souches hématopoïétiques 45 3.2.2 Reproductibilité des expériences 72 heures ......................................... 47 3.2.3 Effet de la température d’entreposage pendant le traitement du sang de cordon sur la prise de greffe .............................................................................. 49
3.2.3.1 Cellules humaines en circulation......................................................... 52 3.2.3.2 Prise de greffe à long terme ................................................................ 52
3.2.4 Prédictibilité de la prise de greffe ............................................................. 57 4. DISCUSSION ................................................................................................. 59 5. CONCLUSION ................................................................................................ 65 6. BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................... 66
vii
LISTE DES FIGURES
Figure 1. L’hématopoïèse. .................................................................................... 3 Figure 2. Recours aux différentes sources de CSH. ........................................... 22 Figure 3. Schéma de la méthodologie utilisée pour les essais in vivo ................ 30 Figure 4. Stratégie d’analyse de cellules du protocole ISHAGE pour l’identification et le compte des CD34+ dans le sang de cordon. .......................... 33 Figure 5. La morphologie des colonies des essais de progéniteurs. ................... 34 Figure 6. Contenu cellulaire des unités de sang de cordon à leur réception. ..... 40 Figure 7. Impact de la température d’entreposage sur les populations cellulaires des USC…………… .............................................................................................. 42 Figure 8. Impact de la température d’entreposage sur le nombre de progéniteurs hématopoïétiques des USC................................................................................... 43 Figure 9. Impact de la température d’entreposage du sang de cordon sur l’expression de molécules à la surface des CD34. ................................................ 45 Figure 10. Prise de greffe chez les souris selon la dose de cellules transplantées………... ........................................................................................... 47 Figure 11. Impact de l’entreposage du sang de cordon ombilical pendant 72 heures avant la congélation sur la prise de greffe. ................................................ 49 Figure 12. Analyse du contenu en CD34+ des USC en vue de la greffe. ............. 51 Figure 13. Profils de cytométrie de la moelle osseuse de souris NSG. ................ 53 Figure 14. Reconstitution hématopoïétique chez les souris NSG. ........................ 54 Figure 15. Reconstitution hématopoïétique chez les souris NSG (suite). ............. 56 Figure 16. Corrélation entre le contenu en progéniteurs CFU et la prise de greffe………. . …………………………………………………………………………….58
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LISTE DES ABRÉBIATIONS
AABB : American Association of Blood Banks ALDH : aldéhyde déshydrogénase BEST :Biomedical Excellence for Safer Transfusion BSA : bovine serum albumin CFC : colony-forming cell CFU : colony-forming unit CFU-E : colony-forming unit - erythrocytes CFU-GEMM : colony forming unit – granulocytes, erythrocytes, monocytes, megakaryocytes CFU-GM : colony-forming unit – granulocytes, monocytes cGy : centigray CHU : Centre Hospitalier Universitaire CMH : complexe majeur d’histocompatibilité CPA : Comité de protection des animaux CPH : cellules progénitrices hématopoïétiques CSH : cellules souches hématopoïétiques CSP : cellules souches périphériques stimulées CTL : contrôle CXCR4 : C-X-C chemokine receptor type 4 DMSO : diméthyl sulfoxyde DPP4 : Dipeptidyl peptidase-4 EDTA : acide éthylène diamine tétraacétique FACT : Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy G-CSF : granulocyte colony-stimulating factor GvHD : graft-versus-host disease HLA : antigènes leucocytaires humains huCD45 : cellules CD45+ humaines IL-3 : interleukine-3 IL-6 : interleukine-6 ISHAGE : International Society of Hematotherapy and Graft Engineering IV : intraveineux LT-HSC : long-term hematopoietic stem cells muCD45 : cellules CD45+ murines NAD : nicotinamide adénine dinucléotide NAM : nicotinamide NK : natural killers NOD-SCID : non-obese diabetic severe combined immunodeficiency NSG : NOD/SCID IL2Rgnull PSGL-1 : P-selectin glycoprotein ligand-1 SC : sang de cordon SCF : stem cell factor SDF-1 : stromal cell-derived factor 1 SRC : SCID-repopulating cell ST-HSC : short-term hematopoietic stem cells
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SVF : sérum de veau fœtal TNC : cellules totales nucléées TP : température pièce TPO : thrombopoiétine USC : unité de sang de cordon
x
REMERCIEMENTS
Ce mémoire a été rendu possible (et surtout agréable) grâce à mes collègues et à
mes proches.
J’aimerais remercier tous mes amis et collègues d’Héma-Québec, qui m’ont si bien
soutenue et qui m’ont tant appris pendant ma maîtrise. Un gros merci en particulier
à ma directrice Renée Bazin, dont la rigueur, l’attitude positive et l’enthousiasme
pour son travail ont été contagieux et m’ont donné envie de faire carrière en
science.
Et un gros merci à ma famille, qui a été très patiente et qui m’a endurée pendant
ce long processus! Merci à mes parents et à Christina, pour vos encouragements,
votre support inconditionnel et votre amour.
1
1. INTRODUCTION
1.1 HÉMATOPOÏÈSE
L’hématopoïèse est le processus permettant la production des cellules sanguines.
Puisque ces cellules ont une durée de vie limitée, le corps humain a besoin en
moyenne de 100 milliards de nouvelles cellules hématopoïétiques chaque jour.
C’est dans les années 1960 que Till et McCulloch ont découvert que
l’hématopoïèse est assurée par les cellules souches hématopoïétiques (CSH)
(Figure 1) [1]. Ces cellules primitives et non différenciées possèdent deux
caractéristiques qui les distinguent des autres cellules ; elles ont la capacité d’auto-
renouvellement, et aussi de différenciation, c’est-à-dire qu’elles peuvent se
différencier en tout l’éventail des cellules spécialisées qui composent le sang
(érythrocytes, granulocytes, plaquettes, etc.) [2]. Des CSH qui reçoivent un signal
de différenciation deviennent des cellules progénitrices hématopoïétiques (CPH), à
partir desquelles deux voies de différenciation peuvent être empruntées, selon les
cytokines et les signaux auxquels sont exposées les cellules : la voie lymphoïde,
qui mène à la production des cellules de l’immunité acquise, soit les lymphocytes T
et B et les natural killer (NK), ou la voie myéloïde, qui assure le renouvellement
des globules rouges, des plaquettes et des cellules de l’immunité innée, c’est-à-
dire les neutrophiles, basophiles, éosinophiles, et monocytes [2].
Chez l’adulte, la plupart des CSH se trouvent dans les niches ostoéblastiques de
la moelle osseuse, où elles représentent environ 0,005% des cellules totales
[3]. C’est dans la moelle osseuse qu’a lieu l’hématopoïèse, et d’où les cellules
hématopoïétiques créées vont migrer vers la circulation sanguine.
Bien qu’elles aient été découvertes il y a plusieurs décennies, l’identification et la
caractérisation des CSH demeurent problématiques, principalement à cause de
l’hétérogénéité de cette population cellulaire et du fait que ces cellules sont très
rares. Le modèle par excellence pour l’identification des CSH est l’essai in vivo, qui
consiste à injecter des cellules à un animal et à observer s’il y a reconstitution
2
hématopoïétique [3]. C’est grâce à ce type d’essai que nous savons qu’il existe
deux types de cellules souches hématopoïétiques; les short-term hematopoietic
stem cells (ST-HSC), qui ont une capacité d’auto-renouvellement limitée et sont
responsables de la prise de greffe initiale en procurant des cellules
hématopoïétiques pendant trois à quatre mois, et les long-term hematopoietic stem
cells (LT-HSC), qui vont assurer la production de cellules hématopoïétiques à long
terme[4]. La transplantation chez des animaux est la seule façon de distinguer ces
deux types de population cellulaire de façon certaine; on examine, après la
transplantation, s’il y a présence soutenue de cellules hématopoïétiques à long
terme. Par la suite, on utilise les cellules prélevées chez l’animal reconstitué pour
transplanter un second animal. La transplantation secondaire est la seule manière
d’identifier avec certitude les LT-HSC.
Mais puisque ces essais sont coûteux et requièrent beaucoup de temps, d’autres
méthodes plus simples ont dû être développées pour l’identification des CSH.
L’approche phénotypique est la plus utilisée; bien que nous ne sommes pas
encore capables de caractériser et d’identifier toutes les CSH, nous savons que la
majorité des CSH et CPH expriment à leur surface la molécule CD34, une
glycoprotéine de 90-120 kilodaltons [3], ce qui en fait le marqueur le plus
couramment utilisé pour identifier les CSH et CPH. Malgré les limites de cette
approche, notamment la découverte d’une population de CSH/CPH CD34- [5],
l’expression de CD34 est devenue le standard pour l’identification des CSH. Avec
les années, d’autres marqueurs ont été découverts, de sorte que les CSH et CPH
sont maintenant reconnues comme étant majoritairement une population
CD34+CD38-CD45RA- (lineage-) [3].
3
Figure 1. L’hématopoïèse.
La production des cellules sanguines débute avec les CSH, capables de s’auto-renouveler et de se différencier en un large éventail de cellules. En se différenciant, la cellule en vient à perdre sa capacité d’auto-renouvellement; au stade des progéniteurs, deux voies de différenciation sont possibles, soit la voie lymphoïde ou la voie myéloïde.
1.2 LES GREFFES DE CELLULES SOUCHES HÉMATOPOÏÉTIQUES
Les cellules souches hématopoïétiques sont utilisées depuis plusieurs décennies
pour traiter différents désordres du système immunitaire. C’est pendant la Seconde
Guerre mondiale, à la suite des bombardements atomiques de Nagasaki et
Hirochima, que les effets myélosuppresseurs des radiations ont pu être observés
pour la première fois à grande échelle. En effet, tous les survivants avaient subi
une baisse importante, voire même une suppression, de la production des cellules
sanguines, laissant ainsi leur système immunitaire sans défense. C’est en
cherchant un moyen de renverser cet effet que l’injection de moelle osseuse a été
essayée, à la fin des années 1950 [6].
4
Depuis, la transplantation de cellules souches est utilisée comme traitement non
seulement pour les victimes de radiations, mais également pour plusieurs
désordres qui affectent le système hématopoïétique, causant un défaut ou un
dérèglement dans la production des cellules du sang. Certaines maladies
génétiques, comme l’anémie aplasique (absence de reconstitution des globules
rouges, accompagnée de thrombocytopénie et de neutropénie) et l’anémie de
Fanconi (qui cause aussi des insuffisances médullaires et des cancers du sang)
nécessitent comme traitement la reconstitution d’un système hématopoïétique
fonctionnel [7]. C’est aussi le cas de certains cancers, comme la leucémie et le
lymphome ; la chimiothérapie nécessaire pour le traitement de ces cancers affecte
les cellules en division, dont font partie les CSH. La chimiothérapie a donc comme
effet secondaire la destruction du système hématopoïétique; pour la survie du
patient, il est primordial de reconstituer sa capacité d’hématopoïèse, à l’aide de la
transplantation de CSH [8].
Bien des facteurs influencent la réussite ou l’échec d’une greffe, ce qui fait qu’il est
difficile de prévoir le résultat. Le type de cellules, leur provenance, le traitement de
conditionnement que le patient reçoit ainsi que la dose cellulaire jouent tous des
rôles importants lors de la transplantation de CSH.
1.2.1 Les types de greffe
Les greffes de CSH peuvent être catégorisées selon le type de cellules utilisées :
on parle de greffe autologue lorsque les cellules sont préalablement prélevées
chez le patient et entreposées/congelées pendant que le patient reçoit un
traitement myéloablatif, le plus souvent de la chimiothérapie jumelée à des doses
d’irradiation. Une fois son traitement terminé, le patient se fait ré-injecter ses
propres cellules. La greffe autologue a l’avantage de permettre une reconstitution
hématopoïétique rapide, de même que l’absence ou le faible risque de rejet, qui
est une des complications possibles suite à une transplantation de CSH. Lorsqu’un
5
patient reçoit des cellules d’un donneur, plusieurs facteurs (comme par exemple un
manque de compatibilité) peuvent faire en sorte que le système immunitaire du
patient ne reconnaît pas les cellules du donneur, il engendre une réaction contre
ces cellules, menant ainsi au rejet de la greffe [9]. Ce risque est absent lors des
greffes autologues. Toutefois, l’utilisation de cellules autologues n’est pas toujours
possible, par exemple si le patient a un système immunitaire non fonctionnel, ou
encore si ses CSH sont malignes, ce qui entraînerait un risque de rechute
important. Dans les cas où on ne peut procéder à une greffe autologue, on utilise
les cellules d’un donneur compatible au patient, ce que l’on nomme une greffe
allogénique [10]. Dans ce cas, le patient est assuré de recevoir un greffon qui ne
contient pas de cellules malignes. Toutefois, la greffe allogénique est plus
complexe que l’autologue, puisqu’elle repose sur la compatibilité entre le donneur
et le receveur.
1.2.2 La compatibilité HLA
Sans la découverte des antigènes leucocytaires humains (HLA) par Jean Dausset
en 1958 [11], il serait impossible de procéder à des transplantations allogéniques,
qui requièrent de procéder au typage HLA du donneur et du receveur. Les
molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) sont des protéines
membranaires exprimées à la surface des cellules; les CMH de classe I sont
exprimés par l’ensemble des cellules nucléées de l’organisme, alors que les CMH
de classe II sont exprimés à la surface des cellules présentatrices d’antigènes,
dont le rôle est de présenter aux lymphocytes T des peptides d’antigènes [12]. On
appelle les protéines humaines du CMH les HLA. Le locus CMH est un des
principaux déterminants du rejet ou de la prise de greffe d’organes et de cellules,
incluant les cellules souches hématopoïétiques [12]. Trois gènes de CMH de
classe I existent (HLA-A, HLA-B, HLA-C) de même que plusieurs de classe II
(HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DO). Lors d’une greffe de tissu, la
sélection d’un donneur dépend de la compatibilité HLA. Celle-ci est déterminée à
partir des loci HLA-A, -B, -C et –DR [13]. Les différences de profils de HLA entre
6
donneur et receveur augmentant grandement le risque de rejet de greffe ou de la
maladie du greffon contre l’hôte (graft-versus-host disease, GvHD), il est important
de trouver le donneur le plus compatible possible afin d’optimiser la réussite de la
greffe.
1.3 LES SOURCES DE CELLULES SOUCHES HÉMATOPOÏÉTIQUES
Les transplantations de CSH peuvent également être catégorisées selon la source
des cellules utilisées. Alors qu’au début, on parlait de greffe de moelle osseuse, le
terme a été remplacé par « greffe de cellules souches hématopoïétiques », en
raison de l’utilisation croissante de sources alternatives à la moelle osseuse; le
sang périphérique et le sang de cordon ombilical [14] [15]. Chacune de ces
sources de CSH possède différentes caractéristiques, de même que des
avantages et inconvénients à prendre en considération [16].
1.3.1 La moelle osseuse
La première transplantation de moelle osseuse réussie a été effectuée à la fin des
années 1950 par le Dr ED Thomas et son équipe, chez un patient atteint de
leucémie [17]. Les cellules provenaient de son jumeau identique, assurant donc la
comptabilité entre le donneur et le receveur. Par la suite, la découverte des HLA a
permis le début des allo-greffes. En raison de l’absence d’un registre de donneurs,
toutes les transplantations allogéniques étaient effectuées avec le don d’un
parent/frère/sœur des patients. Ce n’est qu’en 1973 qu’a eu lieu la première
transplantation à partir de cellules d’un donneur non apparenté au patient [11]. Par
la suite, la création d’un registre national, puis international, de donneurs de moelle
osseuse a permis à plusieurs patients sans parent compatible d’être transplantés.
7
Le don de moelle osseuse requiert une chirurgie mineure; le donneur est placé
sous anesthésie générale, et la moelle est prélevée dans les os du bassin à l’aide
d’aiguilles stériles. Une période de convalescence pouvant aller jusqu’à deux
semaines suit l’opération [18]. Étant donné le volume important (un litre) qu’il est
possible d’aller chercher lors du don, l’extraction de moelle osseuse est la méthode
qui permet d’aller chercher le plus de CSH possible. Toutefois, la recherche d’un
donneur compatible (pouvant prendre plusieurs semaines), la procédure
chirurgicale et la logistique nécessaire au déroulement du don et de la greffe sont
des désagréments importants à l’utilisation de la moelle osseuse.
1.3.2 Le sang périphérique (cellules souches périphériques stimulées (CSP))
La présence de CSH dans la circulation sanguine est connue depuis les années
1950 [19]. L’idée d’utiliser des CSH prélevées de cette façon au lieu de dons de
moelle osseuse est arrivée dans les années 1970, lorsqu’il a été possible pour la
première fois de prélever des celulles formant des colonies (colony-forming
cells ou CFC, c’est-à-dire des cellules encore capables de se différencier dans les
différents lignages hématopoïétiques) dans le sang périphérique [19]. Les
premières greffes de CSH de sang périphérique ont eu lieu dans les années 1980,
avec le développement de techniques de cryopréservation et d’aphérèse; en effet,
à l’état normal, les CSH se retrouvent en faible nombre dans la circulation
sanguine. Il était nécessaire de faire plusieurs prélèvements jusqu’à l’obtention de
la dose de cellules nécessaire. Chaque don de cellules était donc prélevé et
cryopréservé jusqu’à la greffe.
Après les premiers cas rapportés de reconstitution totale du système
hématopoïétique avec des CSH de sang périphérique, des efforts ont été faits pour
augmenter les doses de cellules prélevées, menant à l’utilisation de certaines
cytokines comme la granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), un facteur de
croissance hématopoïétique permettant d’augmenter la quantité de CSH dans la
circulation sanguine, en mobilisant les cellules de la moelle osseuse vers la
8
circulation sanguine [20]. Ainsi, quelques jours avant le prélèvement, le donneur
reçoit de façon intraveineuse des doses de cytokines, et celles-ci mobilisent les
CSH vers le sang périphérique. Une fois les cellules mobilisées, on procède à la
leucophérèse; le sang du donneur est prélevé et centrifugé pour isoler les globules
blancs des plaquettes et globules rouges. Ces derniers sont alors retournés au
donneur, alors que les globules blancs, contenant les CSH, sont greffés au patient.
Malgré des inquiétudes initiales face à l’utilisation des CSH de sang périphérique,
entre autres un plus grand risque de GvHD dû à la présence d’un plus grand
nombre de lymphocytes T dans le sang périphérique que dans la moelle osseuse,
de nombreuses études cliniques ont démontré qu’il n’y a pas de différence
significative entre les taux de GvHD et de survie des patients après des greffes de
moelle osseuse et de sang périphérique [21]. De plus, on observe chez les
patients greffés avec des CSH de sang périphérique une reprise des neutrophiles
et des plaquettes plus rapide que chez les patients greffés avec des CSH de
moelle osseuse [22].
En raison de cet avantage, et du fait que cette technique de prélèvement soit
moins invasive que le prélèvement de moelle osseuse, le sang périphérique
comme source de CSH est de plus en plus favorisé par les cliniciens; entre 2002 et
2006, 74% des transplantations allogéniques de CSH chez les adultes étaient
effectuées avec des cellules de sang périphérique [23].
1.3.3 Le sang de cordon ombilical
Toutefois, une autre source de CSH est de plus en plus sollicitée : le sang de
cordon ombilical. La première greffe de cellules souches issues de sang de cordon
ombilical a eu lieu en 1988. C’est le Dr Hal E. Broxmeyer qui a été le premier à
s’interroger sur le potentiel du cordon ombilical [24], jusque-là considéré comme un
déchet biologique et jeté après la naissance. Il était connu que le sang de cordon
ombilical contenait des progéniteurs hématopoïétiques, qui pouvaient être
9
« cultivés » grâce aux essais de différenciation en progéniteurs précurseurs des
granulocytes et macrophages (colony-forming unit-granulocyte/macrophage, CFU-
GM) [25]. Toutefois, il était impossible de savoir si des LT-HSC s’y trouvaient,
puisque le test in vivo consistant à transplanter des cellules à des animaux dont le
système immunitaire est défectueux n’existait pas encore à ce moment, laissant
les chercheurs incapables d’identifier les LT-HSC. Toutefois, en raison de la
présence d’un nombre important de progéniteurs (CFC) et de la grande capacité
de prolifération des progéniteurs dans le sang de cordon, Broxmeyer était
convaincu de la possibilité d’utiliser des cellules de sang de cordon à des fins de
transplantation. Cela fut démontré en 1988, lorsqu’un enfant atteint d’anémie de
Fanconi fut transplanté avec le sang de cordon de sa sœur, qui avait été prélevé et
congelé à sa naissance [26]. La greffe, effectuée par le Dr Eliane Gluckman, fut un
succès, démontrant ainsi qu’une seule unité de sang de cordon était suffisante
pour reconstituer, à long terme, le système hématopoïétique d’un enfant, et que la
congélation du sang de cordon n’affectait pas la capacité de reconstitution des
cellules.
Alors que les premiers essais cliniques fructueux s’enchaînaient, des tests en
laboratoire ont été développés grâce à des modèles animaux comme les souris
génétiquement modifiées SCID, NOD/SCID et NSG (voir section 2.2.1), permettant
d’identifier les LT-HSC et d’analyser le potentiel de repopulation des CSH [25]. Ces
tests mesurant les CSH possédant la capacité de reconstitution hématopoïétique
(SCID-repopulating cells, SRC) ont permis d’observer que le potentiel et la
capacité de prise de greffe des CSH de sang de cordon ombilical étaient
comparables à ceux des cellules de moelle osseuse [27]. Après ces observations,
et les succès cliniques, l’utilisation des cellules issues de sang de cordon ombilical
s’est répandue. En plus de leur grand potentiel de prolifération, les cellules de
sang de cordon ombilical ont plusieurs autres avantages, comme le fait que la
méthode de prélèvement du sang de cordon ombilical ne comporte aucun risque
pour le donneur. De plus, on observe, lors des greffes de CSH de sang de cordon
ombilical, une plus faible incidence de GvHD [28]. Cette complication se développe
10
lorsque les cellules du greffon reconnaissent les tissus de l’hôte comme étant
étrangers, ce qui enclenche l’activation et l’expansion des lymphocytes T du
greffon, qui vont ensuite attaquer les tissus du receveur. Cet effet moindre serait
dû à l’immaturité des lymphocytes T présents dans le sang de cordon ombilical
[29].
Un autre avantage majeur du sang de cordon ombilical concerne la compatibilité
HLA. Plusieurs études et résultats cliniques ont démontré que la greffe de sang de
cordon ombilical permet une plus grande permissivité au niveau de la compatibilité
entre le donneur et le receveur; le taux de survie sans rechute un an après une
greffe de CSH de sang de cordon compatible entre 4/6 et 6/6 (donc avec aucune,
une ou deux discordances au niveau des allèles HLA entre le patient et le
donneur), est comparable à celui de patients greffés avec des cellules d’un
donneur adulte compatible à 7/8 ou 8/8. En général, le typage HLA pour le sang de
cordon se concentre sur 3 loci (HLA-A, -B et –DRB1) [30] alors que le typage HLA
pour les cellules provenant de la moelle osseuse ou du sang périphérique va se
faire sur 4 loci (HLA-A, -B, -C, DRB1) [31]. Ainsi, deux discordances HLA pour les
CSH de sang de cordon ont le même effet qu’une seule discordance, ou même
qu’un don totalement compatible provenant d’un adulte [32]. Cette compatibilité
plus permissive du sang de cordon est un avantage considérable pour les patients
possédant un typage HLA rare, surtout dans le cas des minorités ethniques.
Considérant le fait que seulement 30% des patients cherchant un donneur à
l’international trouvent un donneur adulte compatible, le sang de cordon ombilical
est devenu une alternative très attrayante [33].
Finalement, la possibilité de prélever un sang de cordon, de faire le typage HLA à
partir d’un échantillon et de le congeler par la suite est un avantage important,
puisque cela permet la mise en banque des unités de sang de cordon. La
présence d’un inventaire d’unités déjà typées assure la disponibilité immédiate des
cellules, contrairement à l’utilisation de la moelle osseuse et du sang périphérique,
11
où la recherche d’un donneur compatible et l’organisation des procédures
nécessaire pour le don peuvent prendre plusieurs mois.
Malgré tous les avantages des cellules de sang de cordon ombilical, il existe un
inconvénient majeur à leur utilisation: le faible nombre de cellules présentes dans
le sang de cordon. On y retrouve beaucoup moins de CSH que dans la moelle
osseuse et le sang périphérique. Or, plusieurs études ont démontré que le facteur
déterminant pour une prise de greffe rapide est la dose de cellules injectée [34-40].
Il a aussi été démontré que la dose de cellules greffées est directement reliée à la
reprise des neutrophiles et des plaquettes; la dose minimale de cellules est de
3x107 cellules totales nucléées par kg [41, 42]. Les faibles doses de cellules du
sang de cordon ombilical limitent donc l’utilisation des dons de sang de cordon,
puisqu’il est rare de pouvoir greffer des patients de plus de 50kg. Cette limite
empêche la plupart des patients adultes d’avoir recours au sang de cordon,
particulièrement en Amérique du Nord, où le poids moyen d’un adulte est de plus
de 80kg [43].
Même lorsqu’un sang de cordon contient assez de cellules pour greffer un patient,
la dose est toujours plus faible que celle provenant d’une moelle osseuse; la
médiane de la dose cellulaire pour un don de moelle osseuse est de 3x106
CD34/kg, alors que celle pour un sang de cordon est de 2,7x106 CD34/kg [35]. En
plus d’augmenter le risque d’échec de la greffe, une faible dose de cellules mène à
un délai de la prise de greffe et de la reconstitution hématopoïétique, augmentant
ainsi les risques d’infection des patients lors de l’aplasie, et ce même si le patient
reçoit une dose cellulaire suffisante à la prise de greffe [44]. De ce fait, un des
problèmes les plus importants lors de la greffe de sang de cordon est le temps
nécessaire à la reprise des neutrophiles et des plaquettes, qui est beaucoup plus
long après une greffe de sang de cordon qu’après une greffe de sang périphérique
ou de moelle osseuse; le temps médian pour la reprise des neutrophiles est de
plus de 3 semaines pour le sang de cordon, alors qu’il est de 16 à 18 jours et de
12
13 à 15 jours respectivement pour le sang périphérique et la moelle osseuse [45-
49].
En raison de cette contrainte, le sang de cordon ombilical est surtout utilisé pour
transplanter les enfants, qui requièrent une dose de cellules plus faible que les
adultes.
1.4 MISE EN BANQUE DU SANG DE CORDON OMBILICAL
Après le succès des premières transplantations de sang de cordon ombilical, des
banques de sang de cordon ont été établies afin de prélever et d’entreposer des
unités de sang de cordon. Il existe deux types de banques, les banques privées et
les banques publiques [50]. Dans les banques privées, le sang de cordon est
congelé et réservé uniquement à l’usage de la famille de l’enfant, ce qui assure la
disponibilité de cellules compatibles dans l’éventualité où l’enfant développerait
une maladie nécessitant une greffe de CSH. Pour ce qui est des banques
publiques, les unités de sang de cordon sont prélevées et entreposées dans un
inventaire mis à la disponibilité de la communauté internationale. Une différence
importante entre les deux types de banques est le standard de qualité; alors
qu’une grande partie des unités envoyées aux banques publiques sont
disqualifiées et jetées en raison de critères de qualification très stricts, les banques
privées ne peuvent disqualifier les dons qui leur sont acheminés, puisqu’ils
appartiennent à la famille. Il est alors possible qu’une famille débourse des frais
pendant plusieurs années pour la conservation d’une unité de sang de cordon
ombilical qui ne pourrait finalement pas être utilisée pour une greffe. Au Canada, la
plupart des banques de sang de cordon ombilical sont privées. Jusqu’à tout
récemment, une seule banque publique était en opération au pays, administrée par
Héma-Québec.
13
La collecte du sang de cordon ombilical ne comporte aucun risque pour la mère et
le nouveau-né. Le sang de cordon est recueilli après l’accouchement, avant
l’expulsion placentaire. L’infirmière désinfecte le cordon ombilical avec une solution
antiseptique, et recueille le sang à l’aide d’une aiguille reliée à une poche de
250mL contenant une solution anticoagulante d’acide citrique et de dextrose.
Par la suite, la poche de sang de cordon est envoyée à la banque publique de
sang de cordon d’Héma-Québec, située à Montréal. Comme de nombreuses
banques publiques, celle d’Héma-Québec respecte les standards internationaux
décrits par les organismes réglementaires tels que l’AABB (American Association
of Blood Banks) et Netcord-FACT (Netcord-Foundation for the Accreditation of
Cellular Therapy), fondé en 1998 dans le but d’établir un registre international
regroupant les unités de toutes les banques publiques, de même que mettre en
place des procédures assurant la qualité des unités mises en banque [51].
Subséquemment, plusieurs critères doivent être respectés lors de la mise en
banque d’unités de sang de cordon. Tout d’abord, pour qu’une unité soit acceptée
par la banque, la poche doit contenir un minimum de 85 mL de sang de cordon,
ainsi qu’un minimum de 1.3 x 109 cellules totales nucléées (TNC). De plus, tous les
dons doivent être congelés dans les 48 heures suivant le prélèvement. Ces
critères de qualifications robustes font en sorte que plus de 60% des dons de sang
de cordon prélevés et acheminés vers la banque sont disqualifiés.
Une fois le don qualifié, celui-ci est centrifugé et subit une réduction de volume,
effectué avec un appareil semi-automatisé de type extracteur. Après centrifugation,
le contenu de la poche de sang est séparé en 3 couches, soit une couche de
globules rouges au fond de la poche, une couche de plasma au-dessus de la
poche, et une couche leuco-plaquettaire à l’interface des deux couches, contenant
les cellules mononuclées dont font partie les CSH. La réduction de volume à l’aide
de l’appareil extracteur permet de se débarrasser d’une partie du plasma et des
globules rouges présents, ce qui augmente la concentration en CSH. Une fois
14
réduite, la poche de sang de cordon est transférée dans une plus petite poche, à
laquelle est ajoutée une solution de cryopréservation contenant du
diméthylsulfoxyde (DMSO) et du Dextran 40. La poche est ensuite entreposée
dans la phase gazeuse de l’azote liquide. Des échantillons sont prélevés pendant
le processus de mise en banque, permettant ainsi de faire plusieurs tests de
dépistage de maladies et de typage HLA.
1.5 STRATÉGIES POUR L’OPTIMISATION DES GREFFES DE CSH DE SANG
DE CORDON OMBILICAL
Ces dernières années, plusieurs approches ont été tentées pour remédier au
problème de la faible dose de cellules des dons de sang de cordon. Les deux
approches principales sont l’expansion des CSH de sang de cordon avant la
greffe, et la modulation des cellules pour augmenter leur capacité à se loger dans
la niche hématopoïétique.
1.5.1 Les doubles transplantations de sang de cordon ombilical
Une des premières approches exploitées pour surmonter le problème est la greffe
de deux unités de sang de cordon. Puisqu’il est souvent impossible de trouver une
unité de sang de cordon respectant le minimum de 2.5x107 TNC/kg, l’utilisation de
deux unités a été proposée. La faisabilité et la sécurité de l’approche ont été
démontrées au début des années 2000, lorsqu’un groupe de l’Université du
Minnesota a utilisé une stratégie mêlant des régimes de conditionnement à
intensité réduite à la double transplantation, pour traiter des patients adultes qui
n’avaient pas accès à des dons de sang de cordon avec suffisamment de cellules
[52, 53].
15
Depuis, la double transplantation est devenue un moyen de greffer des patients
adultes n’ayant pas accès à des donneurs de moelle osseuse ou de sang
périphérique; chez les patients adultes, les patients recevant une double
transplantation sont maintenant plus nombreux que ceux recevant une seule unité
de sang de cordon [54]. Bien qu’initialement, chez les adultes, une meilleure prise
de greffe a été observée chez les patients recevant deux unités de sang de
cordon, comparativement à une seule [55, 56], les données cliniques dont nous
disposons actuellement ne permettent pas de conclure qu’il y ait un avantage
définitif, à long terme, à la double transplantation. Effectivement, des résultats plus
récents semblent indiquer qu’il n’y a pas d’avantage à recevoir deux unités de
sang de cordon, comparativement à une unité ayant une dose cellulaire adéquate
[57]. De plus, une des limitations de cette approche est les coûts liés à celle-ci;
alors qu’un sang de cordon est déjà dispendieux, les coûts pour une double
transplantation, incluant la recherche et le typage afin de trouver deux unités,
peuvent s’élever jusqu’à 90 000$ [58].
Malgré le fait qu’il est maintenant théoriquement possible de greffer n’importe quel
adulte, peu importe son poids, avec des cellules de sang de cordon, l’utilisation de
deux unités ne semble pas accélérer la reprise hématopoïétique [59, 60]. Ainsi,
d’autres pistes ont été explorées afin de contrer la problématique du faible nombre
de cellules dans le sang de cordon.
1.5.2 Expansion des CSH
Beaucoup d’efforts ont été investis pour tenter d’accroître la quantité de CSH dans
le sang de cordon, en faisant des expansions en culture avant de greffer les
cellules (expansion ex vivo). Les premières tentatives à cet effet se sont
concentrées sur l’utilisation de cytokines, puisque plusieurs cytokines ont été
identifiées dans la régulation des CSH, au niveau de leur survie, prolifération ou
différenciation.
16
Une des premières études visant à tester l’expansion des CSH en culture a utilisé
une approche qui consistait à greffer à des patients une unité de sang de cordon
séparée en deux fractions; une fraction non manipulée et une fraction
expansionnée, afin d’éviter d’utiliser deux unités de sang de cordon [61]. La partie
non manipulée du sang de cordon était donc infusée aux patients, et l’autre
fraction mise en culture pendant 10 jours avec un cocktail de cytokines
comprenant du stem cell factor (SCF), granulocyte colony-stimulating factor (G-
CSF) et de la thrombopoiétine (TPO). Cette fraction était par la suite infusée aux
patients. Bien que la culture des cellules avec les cytokines ait permis des
expansions de 56 fois des cellules mononuclées et de 4 fois des cellules CD34+,
aucune amélioration dans le délai avant la prise de greffe n’a pu être observée
chez les patients recevant des cellules cultivées de cette façon. Toutefois, cette
étude a démontré que la greffe de cellules cultivées in vitro était sécuritaire,
encourageant ainsi plusieurs autres équipes de recherche à poursuivre sur la voie
de l’expansion des CSH, malgré le manque de succès.
La difficulté de cette approche vient du fait que les mécanismes entourant la
capacité d’auto-renouvellement des CSH ne sont pas encore bien compris. Ainsi,
différentes combinaisons de cytokines permettent d’augmenter le nombre de
progéniteurs hématopoïétiques, mais poussent les CSH vers la différenciation,
affectant la capacité de reconstitution à long terme des cellules. Le manque de
succès de cette approche a mené la communauté scientifique à chercher d’autres
façons de procéder à l’expansion des CSH en culture, notamment en travaillant sur
des voies de signalisations moléculaires, et en utilisant des facteurs de
transcription ou encore des composés chimiques à la pace de cytokines.
1.5.2.1 Récepteurs Notch
Les récepteurs Notch et leurs ligands (Jagged-1 et 2, et Delta-like 1, 3 et 4) jouent
un rôle important dans une grande variété de processus biologiques. Des études
portant sur les CSH ont démontré la présence du gène Notch1 chez les cellules
CD34+ [62]. Depuis, cette voie de signalisation a été utilisée dans le but d’accroître
17
la quantité de CSH de sang de cordon. Les travaux de Varnum-Finney et Delaney,
entre autres, ont permis d’obtenir des expansions des cellules CD34+ de plus de
10 fois, en exposant les cellules à une forme immobilisée du ligand Delta-1 et à un
cocktail de cytokines contenant SCF, Flt3 ligand, IL-6, thrombopoïétine et IL-3 [63].
Après plusieurs études pré-cliniques démontrant l’augmentation du nombre de
cellules SRC et la rapide reconstitution myéloïde chez les souris avec cette
approche, l’équipe de Delaney a décidé de tester sa technique d’expansion avec
une étude clinique de phase I. Chacun des 10 patients a reçu une unité de sang de
cordon non manipulée, et une unité mise en culture de la façon détaillée ci-dessus.
Après 16 jours de culture, l’expansion moyenne des cellules CD34+ était de 164
fois, permettant ainsi au patient de recevoir une dose de 6x106 CD34/kg [64].
Aucun effet négatif n’a été observé chez les patients, démontrant ainsi la sécurité
du protocole. Le temps médian pour la prise de greffe était de 16 jours, soit 10
jours de moins que ce qu’on peut observer chez les patients recevant une thérapie
conventionnelle avec deux unités de sang de cordon non manipulées. Toutefois,
l’analyse de la prise de greffe à long terme a montré que la reconstitution
hématopoïétique a été atteinte avec les cellules de l’unité manipulée chez
seulement 2 patients, laissant croire que l’expansion des cellules n’était pas une
expansion des « vraies » cellules souches à long terme, c’est-à-dire les LT-HSC.
1.5.2.2 Molécule Copper
Des molécules chimiques ont aussi été utilisées pour l’expansion des CSH. L’une
d’entre elle, le nicotinamide (NAM), semble prometteuse. La nicotinamide fait
partie du groupe de vitamine B, et est un inhibiteur des enzymes dépendantes du
nicotinamide adénine dinucléotide (NAD). Il a été démontré que le NAM retarde la
différenciation des cellules CD34+ en inhibant SIRT1; en cultivant des CD34+ en
présence de NAM et de plusieurs cytokines comme TPO et IL-6, Peled et al. ont
obtenu une augmentation du nombre de SRC (9 fois plus de SRC avec les cellules
cultivées en présence de NAM comparativement à des cellules CD34+ non
expansionnées) [65]. Après ces résultats pré-cliniques encourageants, un produit
18
commercial, Nicord, fut développé afin de procéder à une étude clinique de phase
I. Lors de cette étude, 11 patients ont reçu des cellules CD34+ expansionnées 72
fois avec NiCord, de même qu’un sang de cordon non manipulé [66]. La prise de
greffe fut rapide, avec un temps médian de 13 jours pour la reprise des
neutrophiles, et 33 jours pour celle des plaquettes. De plus, chez 6 patients, la
reprise hématopoïétique à long terme fut assurée par le sang de cordon
expansionné avec NiCord, une première dans des essais cliniques de cellules
expansionnées. Ces résultats laissent donc croire que NiCord permet l’expansion
des cellules CD34+ sans qu’il y ait perte de leur caractère multipotent. Des essais
cliniques de phase II sont présentement en cours.
1.5.2.3 Molécule UM171
Plus récemment, les travaux d’un groupe de recherche canadien ont permis
d’identifier un composé qui semble prometteur pour l’expansion des cellules
souches [67]. Plusieurs tests in vitro ont démontré que le composé UM171
atténuerait la différenciation des cellules et stimulerait l’expansion des cellules
hématopoïétiques primitives (LT-HSC), celles qui sont responsables de la
reconstitution hématopoïétique à long terme. Plusieurs essais avec des modèles
animaux de reconstitution hématopoïétique ont mis en évidence l’effet d’UM171
sur les cellules souches primitives, puisqu’on pouvait observer une prise de greffe
chez les souris injectées avec très peu de cellules cultivées avec le composé. De
plus, la présence soutenue de LT-HSC a été démontrée à l’aide de greffes
secondaires, dans lesquelles on prélève les cellules souches de la moelle osseuse
du premier groupe de souris greffées, pour les injecter à un deuxième groupe de
souris immunodéprimés. La prise de greffe dans le deuxième groupe confirme la
présence et la compétence de LT-HSC. Présentement, les auteurs de cette étude
tentent d’élucider le mécanisme d’action du composé UM171. Des essais cliniques
sont à prévoir pour évaluer le potentiel du composé, qui pourrait s’avérer la
solution au problème du faible nombre de cellules souches hématopoïétiques
présent dans le sang de cordon ombilical.
19
Plusieurs autres stratégies d’expansion des cellules de sang de cordon sont
présentement étudiées. Bien que plusieurs semblent prometteuses, la plupart
d’entre elles requièrent deux unités de sang de cordon, engendrant des coûts
importants pour les centres hospitaliers. De plus, la plupart des techniques
d’expansion actuellement testées semblent assurer une prise de greffe à court
terme seulement. Toutefois, puisque l’infection lors de la période d’aplasie
demeure l’une des causes principales de décès après transplantation, la prise de
greffe à court terme assurée par les cellules expansionnées reste très utile.
Comme il a été mentionné ci-dessus, une autre stratégie vise à améliorer la prise
de greffe des cellules de sang de cordon ombilical, en misant sur l’acheminement
des cellules transplantées vers les niches de la moelle osseuse.
1.5.3 Optimisation du homing des CSH
La réussite d’une greffe de CSH repose, en premier lieu, sur la capacité des
cellules injectées à migrer vers la moelle osseuse, pour aller se loger dans des
niches. Ce processus est appelé homing, et bien qu’il ne soit pas encore
complètement élucidé, nous savons qu’il implique la migration et la diapédèse des
cellules, grâce à l’action de chimiokines sécrétées par la niche de la moelle
osseuse et de molécules d’adhésion présentes à la surface des CSH [68].
Bien que la prise de greffe tardive observée après la greffe de sang de cordon
ombilical puisse être expliquée par la faible dose cellulaire, un autre facteur
pouvant être en cause serait la capacité de homing des CSH de sang de cordon.
Plusieurs molécules d’adhésion jouent un rôle dans la migration des CSH vers la
moelle osseuse, et les CSH de sang de cordon ombilical se sont avérées exprimer
des niveaux inférieurs de CD49e, CD49f et de CXCR4 que les CSH de sang
périphérique et de moelle osseuse [69]. Des efforts ont donc été faits, ces
dernières années, pour améliorer le homing des CSH, par exemple en injectant les
20
cellules directement dans la moelle osseuse. Des études cliniques ont démontré
que bien que les taux de prise de greffe étaient satisfaisants avec cette technique,
les délais pour la prise de greffe dépassaient toujours la barre des 20 jours [70-72].
Une autre façon d’améliorer le homing des CSH est de bloquer certaines
molécules ou peptides à la surface des CSH. Par exemple, plusieurs travaux se
sont concentrés sur la dipeptidyl peptidase-4 (DPP4), une protéine à la surface des
CSH qui clive et inactive la chimiokine stromal cell-derived factor 1 (SDF-1). SDF-
1, ainsi que son récepteur CXCR4 (aussi appelé CD184), est l’un des médiateurs
du homing des CSH vers la moelle osseuse après une transplantation. En clivant
le SDF-1, DPP4 régule négativement l’activité de la chimiokine et de ce fait, la
migration des CSH. Des études chez la souris ont démontré que l’inhibition de
DPP4 menait à une augmentation du homing des cellules de sang de cordon [73].
Une étude clinique récente a testé un inhibiteur oral de DPP4, la sitagliptine, chez
des patients recevant une greffe de sang de cordon [74]. 16 patients ont pris une
dose quotidienne de sitagliptine entre la journée avant et deux jours après la
greffe. Une amélioration très modeste du délai pour la reprise des neutrophiles fut
observée. Toutefois, une différence marquée de l’inactivation de DPP4 fut
observée entre les patients chez qui la reprise des neutrophiles fut rapide (<21
jours) et les patients avec une reprise plus lente (>21 jours). L’optimisation du
dosage et de l’administration de la sitagliptine est nécessaire, mais, bien que
modestes, ces résultats semblent indiquer que l’inhibition de DPP4 pourrait être
une technique intéressante dans le futur.
D’autres équipes se sont penchées sur la diapédèse des CSH lors du homing, une
des premières étapes clés. Les cellules commencent d’abord par rouler sur
l’endothélium, et vont s’y lier grâce aux sélectines E et P. Ensuite, les intégrines
activées par SDF-1 vont induire l’adhésion des cellules à l’endothélium,
notamment grâce à CD44 et PSGL-1. Les cellules peuvent ensuite migrer à travers
l’endothélium pour passer dans la moelle osseuse [75]. La liaison aux sélectines
requiert la fucosylation des ligands présents à la surface des CSH [76]. Or, les
21
ligands présents sur les CSH de sang de cordon ombilical démontrent des niveaux
de fucosylation bien moins élevés que les CSH de sang périphérique mobilisé ou
de moelle osseuse [76, 77]. Cette observation a mené à l’hypothèse selon laquelle
cette « déficience » en fucosylation expliquerait la plus faible capacité de homing
des cellules de sang de cordon, en raison d’un plus faible pouvoir de liaison aux
sélectines de l’endothélium. De ce fait, plusieurs équipes ont tenté de fucosyler les
CSH de sang de cordon pour améliorer leur homing. En utilisant la
fucosyltransférase et son substrat GDP-fructose, il est possible d’augmenter les
niveaux de fucosylation des cellules CD34+ jusqu’à 99% [78]. Cette approche est
présentement en cours d’essai clinique [78]. Jusqu’à maintenant, 10 patients ont
reçu deux unités de sang de cordon; une unité non manipulée, l’autre traitée
pendant 30 minutes avec la fucosyltransférase et son substrat. Le temps médian
pour la reprise des neutrophiles et des plaquettes est de 14 et 33 jours
respectivement, une amélioration comparativement aux contrôles historiques. Le
recrutement de patients se poursuit dans cette étude, dont les résultats finaux
seront disponibles en 2016.
1.6 UTILISATION CROISSANTE
Non seulement l’utilisation de cellules de sang de cordon pour les maladies
hématopoïétiques connaît une hausse, mais depuis quelques années, le sang de
cordon a commencé à être utilisé dans le traitement de plusieurs autres maladies,
dont des maladies neurologiques.
22
Figure 2. Recours aux différentes sources de CSH.
Nombre de transplantation de CSH selon les différentes sources de cellules, entre 1990 et 2013. Tiré de National Marrow Donor Program/Be The Match FY 2013.
Dans ces études, on mise sur le concept selon lequel les cellules de sang de
cordon peuvent jouer un rôle dans la réparation de tissus non hématopoïétique
[79]. Par exemple, une étude avec une petite cohorte d’enfants atteints de la
maladie de Krabbe a démontré qu’une greffe de sang de cordon avant l’apparition
des symptômes avait des effets favorables et entraînait une amélioration des
signes neurologiques en permettant la progression de la myélination [80]. Des
travaux sont en cours afin de développer un traitement à base de progéniteurs
d’oligoendrocytes cultivés à partir de sang de cordon [79].
Un autre exemple est le travail du Dr Wise Young, qui traite des patients ayant des
lésions de la moelle épinière. En injectant des cellules de sang de cordon
directement dans la moelle épinière de 20 patients, il a été capable de restaurer un
23
niveau de motricité impressionnant chez ses patients; après plusieurs mois de
thérapie, 15 des patients arrivaient à se déplacer à l’aide d’une marchette [81].
D’après leurs résultats, les cellules de sang de cordon stimuleraient la
régénération en sécrétant des facteurs qui mèneraient à la croissance de fibres à
l’endroit de la lésion de la moelle épinière, laissant croire que la réparation
d’axones sectionnés pourrait être possible. Une étude clinique de phase III est en
préparation.
Ainsi, tout porte à croire que plusieurs nouvelles applications pour le sang de
cordon seront découvertes dans les prochaines années, ajoutant à la demande
actuelle.
1.7 CONDITIONS DE CONSERVATION DES SANGS DE CORDON
Malgré tous les efforts déployés pour augmenter l’efficacité des greffes de sang de
cordon ombilical, quelques aspects concernant l’utilisation et le traitement du sang
de cordon restent à être optimisés, particulièrement au niveau de la congélation
des dons. Bien qu’une réglementation soit en place actuellement, plusieurs
paramètres des protocoles de récolte et de congélation des cellules de sang de
cordon ombilical ne sont pas très encadrés. Le plus important d’entre eux est sans
doute la température d’entreposage du sang de cordon entre le moment où il est
récolté et sa congélation. Ce délai est important, puisqu’il est impossible de
procéder à la congélation du sang de cordon immédiatement après son
prélèvement. En effet, les banques de sang de cordon doivent traiter un volume
trop important de dons, sans compter toute la logistique d’approvisionnement qui
rend la mise en banque immédiate impossible. La réglementation de la Netcord-
FACT en place suivie par la plupart des banques publiques accorde un délai de 48
heures avant la congélation du sang de cordon alors que ce délai est de 72 heures
pour les banques privées. Par contre, aucune indication quant à la température à
laquelle les unités doivent être conservées pendant ce délai n’est fournie [13].
24
Ce manque de précision sur la température d’entreposage fait en sorte que dans
les banques publiques, le sang de cordon ombilical est gardé entre 4°C et 25°C
avant sa congélation [82], ce qui représente une très grande variabilité. Ainsi,
certaines banques conservent les poches à 4°C, et d’autres à température pièce
(TP), pendant des périodes pouvant aller jusqu’à 48 heures avant de procéder à la
réduction du volume et la mise en banque des unités. Chez Héma-Québec, les
unités de sang de cordon (USC) sont entreposées à TP jusqu’à leur congélation,
qui a lieu entre 24 et 48 heures après le prélèvement du don. Cette décision a été
prise lorsque la banque a observé une meilleure récupération des cellules
nucléées totales dans le produit mis en banque, lorsque la réduction de volume a
lieu 24 heures après le prélèvement du sang de cordon.
Plusieurs équipes de recherche se sont penchées sur la question de la
température d’entreposage des unités de sang de cordon avant leur congélation,
afin de vérifier si ce paramètre pouvait affecter les CSH. Dès 1995, Campos et al.
s’interrogaient sur les conditions optimales pour la collecte et la congélation du
sang de cordon [83]. Après avoir fait des essais de progéniteurs sur des unités de
sang de cordon conservées à la température de la pièce (TP) et 4°C pendant 48
heures, ils ont observé, après décongélation, une perte importante des
progéniteurs lorsque les cellules étaient conservées à 4°C avant la congélation.
Lorsque les cellules étaient conservées à TP, une perte substantielle avait
également lieu, sauf lorsque les cellules étaient congelées dans un délai de 24
heures suivant la collecte du don. Leur étude suggérait donc l’entreposage du
sang de cordon ombilical à TP, pour un délai maximal de 24 heures avant sa
cryopréservation.
Une autre étude publiée en 2007 concluait aussi que l’entreposage à TP était
optimale pour la qualité du sang de cordon [84], après avoir observé l’effet de la
température d’entreposage sur la quantité de cellules CD34+, de progéniteurs,
l’apoptose des cellules ainsi que leur capacité de transmigration (capacité de
25
migrer vers un gradient de SDF-1). D’après leurs observations, les cellules
conservées à TP avaient une meilleure viabilité, un taux d’apoptose plus faible,
une meilleure capacité de transmigration et exprimaient plus de CXCR4 que les
cellules conservées à 4°C.
Cependant, plusieurs études avec des conclusions contraires ont été publiées. En
2011, le collectif Biomedical Excellence for Safer Transfusion (BEST) a publié les
résultats de leur étude sur l’impact de la température d’entreposage sur le sang de
cordon [85] : ils n’ont pas observé de différence au niveau des comptes de cellules
CD34+ viables et des progéniteurs CFU-GM entre les deux températures
d’entreposage. Toutefois, en raison de la baisse de viabilité des TNC à TP, ils
recommandent la conservation des poches de sang de cordon à 4°C jusqu’à leur
congélation. Un autre groupe, en 2012, est arrivé à une conclusion semblable,
après avoir constaté que la récupération des cellules CD34+ viables était plus
faible, après décongélation, lorsque le sang de cordon était conservé à TP
comparativement à 4°C [86].
En plus du manque de consensus présent dans la littérature au sujet de la
température d’entreposage, plusieurs des études mentionnées ci-dessus
comportent certaines lacunes. Ainsi, certaines équipes ont étudié la viabilité des
cellules par exclusion du bleu de trypan, une méthode qui permet seulement
d’établir la viabilité des cellules totales, qui peut différer grandement de celle des
cellules CD34+. D’autres études ont observé la viabilité des cellules CD34+, mais
soit après avoir isolé les cellules du sang de cordon (méthode qui peut avoir
comme effet de perdre les cellules mortes, affectant ainsi la viabilité mesurée) ou
en n’utilisant qu’un simple marquage de cytométrie, sans utiliser la méthode
standardisée d’énumération des cellules CD34+, le protocole ISHAGE
(International Society for Hematotherapy and Graft Engineering [87]). Certaines
des études ont aussi des protocoles expérimentaux qui ne sont pas optimaux pour
pouvoir mesurer l’impact de l’entreposage du sang de cordon sur les cellules.
Plusieurs équipes se sont contentées d’incuber différents groupes d’unités de sang
26
de cordon à différentes températures, ce qui a mené à de grands écart-types dans
leurs résultats, en raison de la variabilité qu’on retrouve entre les différents dons
de sang de cordon. D’autres ont testé les différentes températures et temps
d’entreposage sur les mêmes unités, mais en les séparant en petits flacons de
quelques millilitres, ce qui ne permet pas de reproduire l’impact de ces paramètres
dans le contexte clinique.
En plus de ces différentes lacunes expérimentales, on remarque aussi dans la
littérature un manque de données in vivo concernant la température d’entreposage
optimale pour le sang de cordon. La première étude qui a testé cette variable avec
un modèle animal a été publiée en 2012 par des chercheurs de l’hôpital Sainte-
Justine à Montréal [88]. Dans le cadre de cette étude, des unités de sang de
cordon ont été prélevées et laissées soit à TP ou 4°C pendant 72 heures. Comme
contrôle, certaines poches ont été traitées et congelées dès leur réception. À la
décongélation des poches, des tests in vitro et in vivo ont été faits; un compte de
cellules totales, de cellules CD34+ et CD45+ a été effectué, de même qu’un essai
de progéniteurs. De plus, des cellules de chaque condition d’entreposage (congelé
immédiatement, après 72 heures à TP et 72 heures à 4°C) ont été injectées à des
souris immunosupprimées NOD/scid gamma null (NSG). Les résultats des
expériences in vitro de cette étude sont semblables à certains résultats
mentionnés ci-dessus, c’est-à-dire que l’entreposage à TP pendant une longue
période a un effet négatif sur la viabilité des cellules CD45+, de même que sur la
récupération des cellules CD34+ après décongélation. Or, alors que la plupart des
chercheurs préconisent une courte période d’entreposage du sang de cordon
avant la congélation (en général, on observe un déclin de la viabilité des cellules et
des progéniteurs après 48 heures d'entreposage), l’équipe de Sainte-Justine a
observé que les cellules CD34+ ne sont pas sensibles à un long délai de
traitement, mais plutôt à la température d’entreposage pendant ce délai. Ainsi,
l’entreposage à 4°C pendant 72 heures n’aurait pas d’effet sur la récupération des
cellules CD34+, alors que l’entreposage de 72 heures à TP se traduirait par une
importante réduction de la viabilité de ces cellules. Toutefois, l’équipe n’a pas
27
observé cet effet sur la récupération des CFU après congélation; l’entreposage à
TP ou 4°C n’avait pas d’effet sur ce paramètre. Ce dernier résultat est surprenant,
puisqu’une baisse de la viabilité des cellules CD34+ devrait normalement se
traduire par une réduction du nombre de progéniteurs, mesuré à l’aide du test de
progéniteurs CFC.
Du côté in vivo, 20 semaines après la greffe, l’équipe a observé une prise de greffe
chez les souris greffées avec les cellules conservées à 4°C pendant 72 heures
avant la mise en banque et celles congelées immédiatement après le
prélèvement, mais une absence totale de prise de greffe dans les groupes greffés
avec des cellules conservées à TP pendant 72 heures. Ainsi, malgré une capacité
de différenciation in vitro semblable à celles des cellules à 4°C, les cellules
laissées à TP semblaient avoir une capacité de reconstitution in vivo déficiente.
Les auteurs concluaient donc que la température d’entreposage du sang de
cordon, et non le temps d’attente avant la congélation, a un effet sur la
fonctionnalité des CSH, et recommandaient un entreposage à 4°C avant
congélation. Contrairement à d’autres études [89], celle-ci conclut que les tests in
vitro utilisés pour évaluer le potentiel des CSH, principalement l’essai CFC, ne
corrèlent pas avec la capacité de reconstitution hématopoïétique telle que mesurée
dans des tests in vivo.
Bien qu’il ne s’agisse que d’un seul article, les résultats de cette équipe sont
néanmoins déconcertants, puisqu’ils sont les premiers à recommander
l’entreposage des unités de sang de cordon à 4°C suite à des expériences in vivo.
Toutefois, le délai de 72 heures appliqué dans leur étude dépasse la limite de 48
heures imposée aux banques de sang de cordon publiques accréditées par
Netcord-FACT. Vérifier l’impact de l’entreposage à TP pendant 48 heures dans un
modèle animal in vivo constitue un des principaux objectifs de mon projet de
maîtrise, puisque cette température est utilisée dans plusieurs banques publiques
de sang de cordon, y compris celle d’Héma-Québec.
28
1.8 HYPOTHÈSE ET OBJECTIFS
L’hypothèse posée ici, en se basant entre autres sur les résultats in vivo de l’étude
décrite ci-haut [88], est que la capacité de reconstitution des CSH contenues dans
le sang de cordon ombilical est affectée négativement durant l’entreposage
prolongé à TP et qu’une optimisation du délai et de la température d’entreposage
durant la période d’attente pré-congélation permettra d’augmenter le potentiel
thérapeutique de ces cellules. Les résultats découlant de cette étude pourront
permettre une optimisation des pratiques de la banque publique de sang de cordon
d’Héma-Québec. Pour ce faire, plusieurs objectifs ont été définis :
Premier objectif : déterminer l’effet de la température d’entreposage avant la
réduction du volume de l’unité de sang de cordon et sa mise en banque sur
la reconstitution hématopoïétique par les CSH in vivo, à l’aide d’un modèle
animal.
Deuxième objectif : déterminer quelles populations cellulaires peuvent être
affectées par les conditions d’entreposage durant le délai respecté avant la
mise en banque des unités de sang de cordon.
Troisième objectif : déterminer quel test ou paramètre in vitro serait le plus
indicatif de la capacité des CSH de sang de cordon à reconstituer le
système hématopoïétique.
29
2. MATÉRIEL ET MÉTHODE
2.1 EXPÉRIENCES IN VITRO
2.1.1 Traitement du sang de cordon ombilical
Les unités de sang de cordon ombilical ont été recueillies immédiatement après
l’accouchement par le personnel de l’unité d’obstétrique de l’hôpital Saint-François
d’Assise, avec le consentement de la mère et l’accord des comités d’éthique
d’Héma-Québec et du CHU de Québec, dans des poches (Fenwal, Lake Zurich,
IL) contenant une solution anticoagulante d’acide citrique et de dextrose. Chaque
don a été pesé afin de s’assurer que tous les dons acheminés à notre laboratoire
avaient un poids minimal de 80g, évitant ainsi la réception d’unités de sang de
cordon trop petites pour effectuer tous nos tests.
La manipulation des dons de sang de cordon a été faite de façon aseptique, dans
une hotte biologique. Afin de comparer l’effet de différentes températures, chaque
don a été séparé dans deux poches stériles (Fenwal), chacune entreposée
pendant un certain temps (48h et, dans le cadre de certaines expériences, jusqu’à
72h) soit à TP, ou dans un réfrigérateur maintenant une température entre 2 et 6°C
(pour la condition 4°C). Les dons utilisés à des fins de greffe chez la souris ont été
séparés en 2 conditions seulement (TP et 4°C), alors que ceux utilisés pour des
tests in vitro ont été séparés en 3 fractions; 2 étant destinées à l’entreposage, et la
3e pour effectuer des tests sur un échantillon au temps zéro, c’est-à-dire le plus
rapidement possible après le prélèvement. La figure 3 résume la démarche
expérimentale.
30
Figure 3. Schéma de la méthodologie utilisée pour les essais in vivo
Pour tester les deux températures d’entreposage, chaque poche de sang de cordon a été séparée en deux parties égales. Par la suite, différents tests pour l’énumération et la caractérisation des cellules ont été faits avant la congélation des poches. Après la décongélation, les cellules ont été déplétées en lymphocytes T, analysées par cytométrie en flux et injectées à des souris NOD/SCID à raison de 1,5x104 CD34 par souris.
Pour la partie in vivo, la réduction du volume a été effectuée une fois le délai fixé
écoulé et les cellules ont été congelées avec une méthode semblable à celle
utilisée à la banque publique de sang de cordon d’Héma-Québec. La principale
différence entre les deux méthodes était que nous devions transférer le sang de
cordon dans des tubes pour procéder à la congélation, alors que la banque
publique possède l’équipement nécessaire pour procéder à la congélation sans
extraire le sang de cordon de la poche. Le sang de cordon était donc transféré
dans des tubes Falcon (Corning, Tewksbury, MA, É.-U.) de 50mL, et une
sédimentation des cellules était d’abord effectuée en centrifugeant les tubes à
31
1000 g pendant 10 minutes. Ensuite, le maximum de plasma était retiré du tube, et
la couche leuco-plaquettaire (se trouvant entre le plasma et les globules rouges)
était aspirée à l’aide d’une pipette, pour obtenir une réduction de volume d’environ
5 fois. À cette étape, un échantillon était prélevé afin d’énumérer les cellules
CD34+ isolées à l’aide du protocole ISHAGE. Une solution de congélation
commerciale contenant 50% de diméthyl sulfoxyde (DMSO) v/v et 5% de Dextran
40 w/v (Alanza, Ont, Canada) était par la suite ajoutée à la fraction contenant les
cellules mononuclées du sang à un ratio 1/5, pour obtenir une concentration finale
de 10% DMSO v/v et 1% Dextran w/v. Après un passage de 120 minutes +/- 30
minutes dans un système CoolCell (Biocision, San Rafael, CS, É.-U.) entreposé à -
80°, permettant un refroidissement de 1°C/minute, les cellules étaient ensuite
entreposées à -135°C, dans la phase gazeuse de l’azote liquide d’un contenant
(Cryoplus, Thermo Scientific, Waltham, MA, É.-U.).
Le jour de la greffe, les cellules étaient décongelées dans une solution contenant
5% de Dextran 40 (Cedarlane, Burlington, Ont., Canada) et 2.5% d’albumine
humaine (Alburex 25, CSL Behring, Ottawa, Ont., Canada). Après deux lavages
suivis à chaque fois d’une centrifugation de 10 minutes à 330 g chacun, les
cellules étaient prêtes à être déplétées en lymphocytes T à l’aide du système
EasySep™ Human CD3 Positive Selection Kit (Stem Cell Technologies,
Vancouver, BC, Canada). Brièvement, des anticorps anti-CD3 couplés à des
particules magnétiques se lient aux lymphocytes CD3+, et les particules sont
éliminées de la suspension cellulaire à l’aide d’un aimant. Cette étape d’élimination
des lymphocytes T permet d’éviter le développement d’une GvHD chez la souris.
2.1.2 Protocole ISHAGE
Pour déterminer le contenu en cellules CD34+ dans le sang de cordon, un
échantillon de 100 µl a été prélevé à plusieurs étapes pendant le traitement de
chaque don (à l’arrivée, après entreposage, après réduction de volume, après
décongélation). La concentration de cellules CD34+ dans le sang a été déterminée
32
à l’aide du protocole ISHAGE (International Society for Hematotherapy and Graft
Engineering), un protocole établissant des normes pour la quantification des
cellules CD34+ par cytométrie en flux (Figure 4), et du StemKit Reagent (Beckman
Coulter, Pasadena, CA, É.-U.), une trousse comprenant des anticorps
monoclonaux dirigés contre les antigènes de surface humains CD34 et CD45, de
même qu’un marqueur de viabilité, le 7-AAD. Suite à l’incubation de 50 µl de
cellules avec les anticorps, un tampon de lyse est ajouté afin de lyser les globules
rouges, et une quantité prédéterminée de billes (fluorosphères) est aussi ajoutée
afin de permettre la quantification des cellules. Par la suite, l’acquisition au
cytomètre BD Accuri C6 (BD Biosciences) est effectuée dans l’heure qui suit. La
concentration exacte de cellules CD34+ dans l’échantillon de sang de cordon est
calculée avec la formule suivante :
CD34/µl sang = Nombre cellules CD34+ * Nombre de billes dans l’échantillon
Nombre de billes comptées * volume de l’échantillon * facteur de dilution
33
Figure 4. Stratégie d’analyse de cellules du protocole ISHAGE pour
l’identification et le compte des CD34+ dans le sang de cordon.
A Identification des cellules CD45+. B Le marqueur de viabilité 7AAD est utilisé afin d’exclure les cellules mortes à partir des cellules CD45+ (la région de gauche (R2) encadre les cellules vivantes). C En R3, nous retrouvons ainsi les cellules CD45+ vivantes. D À partir des cellules CD45+ vivantes, les cellules sont affichées en fonction du marqueur CD34; la région P1 entoure les cellules CD34+. E Les cellules CD34+ (région P1) sont affichées en fonction du marqueur CD45, afin d’exclure les cellules CD45high, puisque les CSH sont CD45low. F Finalement, les cellules vivantes CD34+CD45low sont affichées selon leur taille et granularité (FSC/SSC) afin d’exclure les débris (à l’extrême gauche du graphique) du compte de CD34. G Afin d’obtenir un compte précis, une quantité connue de billes fluorescentes est ajoutée à l’échantillon (en haut, à droite).
2.1.3 Essais de progéniteurs
L’essai de progéniteurs clonogéniques myéloïdes (CFC) est le test standard in
vitro permettant de déterminer le potentiel de différenciation des cellules CD34+,
puisqu’il permet la culture des progéniteurs myéloïdes, granulocytaires,
érythrocytaires et mégacaryocytaires. Ces essais ont été effectués après la
déplétion des lymphocytes T du produit décongelé, tout juste avant la greffe des
souris NSG. Les cellules décongelées et déplétées en lymphocytes T étaient
énumérées en cytométrie en flux avec le protocole ISHAGE, et un prélèvement de
cellules contenant soit 250 ou 500 cellules CD34+ était ajouté au milieu
34
MethoCultTM H4034 (StemCell Technologies), selon les instructions du fabricant.
Tous les essais ont été faits en duplicata. Après 14 à 18 jours d’incubation à 37°C,
les différentes colonies étaient énumérées au microscope optique et divisées en
trois catégories; les progéniteurs érythroïdes (CFU-E), de granulocytes et
macrophages (CFU-GM) et les progéniteurs « mixtes » (CFU-GEMM). Ces
derniers sont les plus immatures (Figure 5).
Figure 5. La morphologie des colonies des essais de progéniteurs.
A Colonie issue d’un progéniteur érythroïde (CFU-E). B Deux colonies issues de progéniteur de granulocytes et macrophages (CFU-GM). C Colonie issue d’un progéniteur myéloïde (CFU-GEMM). Tiré de Using MethocultTM : Technical manual.
2.1.4 Marquage des molécules de migration à la moelle osseuse
Les cellules mononucléées du sang de cordon ont d’abord été isolées par gradient
de densité Ficoll-Paque, selon les instructions du fabricant (GE Healthcare,
Piscataway, NJ, É.-U.), à l’aide d’un tube LeucosepTM (Greiner Bio-One, Monroe,
NC, É.-U.) contenant un filtre perméable aux globules rouges et aux neutrophiles;
brièvement, le sang de cordon a été dilué avec du tampon phosphate salin, et a
ensuite été transféré à raison de 30 mL dans un tube LeucosepTM contenant 15mL
de Ficoll-Paque. Après centrifugation à 800 g pendant 15 minutes, la couche de
cellules mononucléées a été recueillie. Celles-ci ont été énumérées à
l’hématimètre et resuspendues à une concentration de 5 x 107 cellules/ml. Les
cellules CD34+ ont ensuite été isolées à l’aide de la trousse d’enrichissement pour
progéniteurs humains EasySep™ Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit
35
(Stem Cell Technologies). Après l’enrichissement et numération cellulaire, 1 x 105
cellules étaient prélevées pour procéder à un marquage avec les anticorps
fluorescents anti-CD184 (CXCR4), anti-CD44, anti-CD162 (eBiosciences, San
Diego, CA, É.-U.), anti-CD34 (Immunotech Beckman-Coulter), anti-CD49d
(Southern Biotech, Birmingham, AL, É.-U.), et HECA-452 (BioLegend, San Diego,
CA, É.-U.). Un minimum de 50 000 événements était analysé par cytométrie en
flux au Partec CyFlow ML (Sysmex-Partec, Görlitz, Allemagne).
2.2 EXPÉRIENCES IN VIVO
Le protocole mis au point et utilisé afin de déterminer la capacité de reconstitution
des CSH in vivo a été approuvé par le Comité de protection des animaux (CPA) de
l’Université Laval.
2.2.1 Modèle murin
Pour les essais in vivo, des souris NOD.Cg-Prkd Scid Il2rgtml Wjl/Szj (NSG)
femelles de sept à neuf semaines (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, É-U) ont
été utilisées. Les souris NSG présentent une immunodéficience sévère,
puisqu’elles ont des lymphocytes B et T non-fonctionnels, de même qu’une faible
activité des macrophages et des cellules NK. Puisqu’elles sont
immmunosupprimées, elles devaient être gardées dans un environnement stérile
pendant toute la durée du protocole; les souris étaient gardées dans des cages
stériles avec filtres à air, et manipulées dans une hotte à flux laminaire. La veille de
la greffe, elles ont été irradiées à une dose de 325 centigray (cGy) à l’aide d’un
appareil Gammacell Exactor 40 (Best Thetratonics, Ottawa, ON, Canada, source
de cs-137). Une dose de cellules totales déplétées en CD3, contenant 1,5 x 104
cellules CD34+ (tel que déterminé par cytométrie en flux; section 2.1.2) a été
transplantée par voie intraveineuse (IV) chez les souris par la veine caudale.
Comme contrôle, à chaque expérience un groupe de souris a reçu 300 µl de
tampon PBS (IV).
36
2.2.2 Analyses post-greffe
2.2.2.1 Analyse sanguine
Après la greffe, des analyses sanguines ont été effectuées à plusieurs moments
pendant le protocole de 20-22 semaines. Des prélèvements d’environ 30 µl ont été
effectués par la veine saphène des souris à l’aide d’un capillaire contenant de
l’acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) (Drummond Scientific, Broomall,
PA) afin d’éviter la coagulation du sang, par les techniciens de l’animalerie. Pour
évaluer la quantité de cellules humaines en circulation, un marquage suivi d’une
analyse en cytométrie en flux des cellules murines et humaines exprimant le
CD45+ (anti-CD45 humain APC, anti-CD45 murin PE, BD Biosciences) était
effectué, après une lyse des globules rouges avec la solution commerciale BD
FACS lysing solution (BD Biosciences). Un volume de 10 µl de sang était dilué
dans du PBS 1% BSA, et la concentration de cellules humaines et murines CD45+
pouvait être obtenue par analyse au cytomètre PARTEC CyFlow ML (Sysmex-
Partec).
2.2.2.2 Évaluation de la prise de greffe
20 à 22 semaines après la greffe, les souris ont été sacrifiées par inhalation au
CO2, et les fémurs et tibias, de même que la rate de chaque souris ont été
prélevés. Les extrémités des os ont été coupés pour accéder à la moelle osseuse,
et celle-ci a été extraite à l’aide d’une seringue et aiguille 27 ½ G par injection d’un
milieu composé d’Iscove's Modified Dulbecco's Media (IMDM; Life technologies,
Carlsbad, CA, United States), de sérum de veau fœtal (SVF; Fisher, Garland, TX,
É.-U.) à 10% et 1mM d’acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) (Fisher
Scientific, Fair Lamn, NJ, É-U). Le contenu de la moelle osseuse a été récupéré
dans un total de 8 mL de milieu. La rate, quant à elle, a été broyée sur un tamis et
à l’aide d’un mortier, et les cellules ont été resuspendues dans la même solution
d’IMDM-SVF-EDTA.
Pour évaluer la présence de cellules humaines chez les souris, 500 000 cellules de
moelle osseuse ont été utilisées pour des marquages suivis d’analyse en
37
cytométrie. D’abord, afin de bloquer la liaison des anticorps de marquage aux
récepteurs Fc exprimés par les cellules analysées, les cellules étaient incubées
avec l’anticorps 2.4G2, purifié dans nos laboratoires à partir de surnageant de
culture d’hybridomes 2.4G2. Cet anticorps permet de bloquer les liaisons non
spécifiques aux domaines Fcγ et ainsi d’éliminer un possible bruit de fond [90].
Pour les marquages, les anticorps utilisés étaient anti-CD45 (leucocytes), anti-CD3
(lymphocytes T), anti-CD19 (lymphocytes B), anti-CD33 (cellules myéloïde), anti-
CD34 et anti-CD45 murin (tous provenant de BD Biosciences), et anti-
CD34 (Immunotech Beckman-Coulter). Après le marquage, les cellules étaient
lysées et fixées avec le FACS Lysing Solution (BD Biosciences), lavées et filtrées
(CellTricks, Sysmex-Partec, Norderstedt, Allemagne) avant l’acquisition des
données au cytomètre Partec CyFlow ML (Sysmex-Partec).
Les gains du cytomètre ont été ajustés à l’aide de cellules non marquées et de
billes de compensation (Compbeads; BD Biosciences). Ces dernières ont aussi été
utilisées pour calculer et éliminer le chevauchement entre les différents
fluorochromes. Les débris ont été exclus à l’aide d’une région basée sur la taille
(FSC) et la granularité (SSC) des cellules. Le cytomètre a été ajusté afin de faire
l’acquisition d’un minimum de 50 000 événements dans cette région. Des contrôles
négatifs (cellules non marquées, cellules marquées avec un seul anticorps couplé
à un fluorochrome) ont été utilisés pour placer les quadrants séparant les cellules
positives des cellules négatives. Le logiciel FCS Express 4 (De Novo Software,
Los Angeles, CA, É.-U.) a été utilisé pour faire l’analyse des données.
2.2.2.3 Analyses statistiques
Les analyses statistiques concernant les expériences in vitro (viabilité des cellules
CD45+ et récupération des cellules CD34+) ont été faites avec le test T de Student
à comparaison pairée. Le logiciel InStat version 3.0 (GraphPad, La Jolla, É.-U.) a
été utilisé pour les analyses statistiques. Le test de Mann-Whitney a été utilisé
pour déterminer les différences significatives entre les différents groupes de souris.
Les valeurs de P inférieures à 0.05 étaient considérées significatives.
38
Dans le cas du coefficient de corrélation, c’est le coefficient Pearson product-
moment correlation coefficient qui a été utilisé, avec l’équation suivante :
où et ӯ sont les moyennes des deux séries de données.
39
3. RÉSULTATS
3.1 RÉSULTATS IN VITRO
3.1.1 Contenu des unités de sang de cordon
Pour la partie in vitro de ce projet de maîtrise, la première étape a été d’évaluer le
contenu cellulaire des unités de sang de cordon prélevées. Pour ce faire, un
marquage en cytométrie en flux a été effectué à la réception de chaque poche de
sang de cordon, en utilisant le Stem-kit Reagents et les lignes directrices de
l’ISHAGE pour l’analyse des marquages. Ainsi, nous avons pu amasser des
données sur la quantité de CSH présente dans chaque unité, illustrées dans la
figure 6.
Il faut d’abord mentionner que la plupart des USC que nous avons pu obtenir pour
ce projet n’auraient pas répondu aux critères de qualification de la banque
publique de sang de cordon d’Héma-Québec, en raison de leur contenu en cellules
CD45+ (inférieur à 1,3x109). Bien que la plupart des dons qui sont acheminés vers
la banque publique soient disqualifiés (entre 60 et 70%), le taux de
« disqualification » que nous avons observé pour ce projet frôlait le 90%. Cette
différence s’explique probablement par le fait que le personnel hospitalier
responsable de la collecte des USC pour ce projet de recherche n’est pas le même
que celui qui prélève les unités pour la banque publique. Néanmoins, les tests et
marquages ont été effectués sur toutes les USC acheminées à notre laboratoire.
Les analyses ont montré de très grandes différences entre chacune des USC; la
quantité de cellules CD34+ variait entre 2,5x105 et 1,5x107, avec une médiane de
1,3x106. De plus, il semble que le contenu en leucocytes (CD45+) ne soit pas un
bon indicatif du contenu en CSH (CD34+). Alors que la majorité des banques de
sang de cordon ombilical sélectionnent leurs USC en fonction du nombre de
leucocytes, cette donnée n’est pas représentative de la quantité de cellules
CD34+; on peut observer, dans la figure 6, plusieurs USC ayant la même quantité
40
de cellules CD45+ mais des contenus en cellules CD34+ qui diffèrent
significativement.
Figure 6. Contenu cellulaire des unités de sang de cordon à leur
réception.
Nombre de cellules CD45+ et CD34+ par USC, énumérées moins de 10 heures après le prélèvement. Expérience effectuée à chaque réception d’une unité de sang de cordon, totalisant 21 unités.
3.1.2 Effet de la température d’entreposage sur la viabilité des cellules
Toujours à l’aide du marquage ISHAGE, l’impact de la température d’entreposage
des poches de sang de cordon sur les leucocytes et les CSH a été mesuré après
48 heures. Chaque poche de sang de cordon a été divisée en deux parties afin de
tester les deux conditions sur les mêmes échantillons, une caractéristique qui
s’avère importante après avoir constaté la variabilité importante du contenu
cellulaire entre chaque USC (voir la figure ci-dessous). En premier lieu, comme
l’indique la figure 7A, l’entreposage des poches de sang de cordon à TP pendant
48 heures mène à une baisse significative de la viabilité des cellules CD45+; alors
que la viabilité moyenne des cellules est de 98% ± 0.02% à la réception des
41
poches, elle chute à 74% ± 2% après un entreposage à TP, alors qu’un
entreposage à 4°C permet le maintien de la viabilité autour de 87%. Ces résultats
montrent une différence significative entre les deux températures de conservation
(P < 0,001).
Pour analyser l’effet de la température d’entreposage des poches de sang de
cordon sur les cellules CD34+, nous avons regardé l’impact de la température sur
la récupération des CD34+ après l’entreposage, à l’aide de la stratégie d’analyse
de cellules ISHAGE. Ainsi, nous avons analysé la récupération des cellules CD34+
après un entreposage de 48 heures, en comparant les données obtenues à TP et
4°C à celles obtenues au T=0 (figure 7B). La moyenne de récupération des
cellules CD34+ de 15 USC après l’entreposage à TP était de 99%, et celle après
l’entreposage à 4°C était de 107%. La différence entre les deux conditions n’est
pas significative.
Ces résultats révèlent que les CSH sont plus robustes que les leucocytes puisque,
malgré la baisse de viabilité importante des leucocytes, on n’enregistre pas de
perte significative des cellules CD34+ après 48 heures à TP. La température
d’entreposage des poches aurait donc un effet seulement sur une sous-population
des cellules CD45+ autre que les cellules CD34+.
42
Figure 7. Impact de la température d’entreposage sur les populations
cellulaires des USC.
A : Moyenne de la viabilité des cellules CD45+ à leur réception (<10 heures post-prélèvement), après 48 heures à TP et à 4°C (n=21). L’entreposage à TP amène une baisse importante de viabilité, comparativement à l’entreposage à 4°C. B : Moyenne de la récupération des cellules CD34+ après l’entreposage des poches de sang de cordon à TP ou 4°C pendant 48 heures. (Paired t test; *** P < 0,001)
3.1.3 Effet de la température d’entreposage sur le potentiel de différenciation des
CSH
L’effet de la température d’entreposage sur les CSH a aussi été analysé à l’aide de
l’essai CFC, qui permet de d’énumérer le nombre de progéniteurs CFU (colony-
forming units) présents dans chaque sang de cordon ou suspension cellulaire.
Cette mesure nous permet donc de comparer le potentiel de différenciation des
CSH entre différentes conditions et ainsi établir le niveau de maturité des différents
progéniteurs présents.
Les cellules déplétées en CD3 pour injection aux souris ont donc été utilisées pour
des essais de progéniteurs. Pour toutes les conditions testées, 50 000 cellules
viables (contenant entre 250 et 500 cellules CD34+) ont été ensemencées dans le
milieu Méthocult, et les colonies ont été énumérées après 14 jours d’incubation.
***
B A
***
43
Sur 4 USC testés, la moitié démontrait le même pourcentage de progéniteurs
totaux, peu importe la température de conservation du SC avant la congélation
(voir figure 8). Pour ce qui est du SC1, aucune colonie n’a été observée pour les
cellules provenant de la partie conservée à TP, en raison de contaminations dans
le pétri. Pour le SC4, la partie conservée à TP contenait plus de progéniteurs que
celle conservée à 4°C. Aucune tendance n’a donc été observée quant à un effet
potentiel de la température d’entreposage des USC sur le contenu en progéniteurs
hématopoïétiques. Cependant, nous avons remarqué que le contenu en
progéniteurs variait beaucoup entre les différents USC, indépendamment de la
température d’entreposage (entre 10% et 30%, selon l’USC) et ce pour un même
nombre de cellules CD34+ ensemencées.
Figure 8. Impact de la température d’entreposage sur le nombre de
progéniteurs hématopoïétiques des USC.
Pourcentage des cellules CD34+ s’étant différenciées en colonies (nombre total de colonies incluant les CFU-E, CFU-GM et CFU-GEMM). Chaque pourcentage est calculé selon la moyenne du nombre de colonies énumérées sur deux pétris méthocult ensemencés à partir de la même suspension cellulaire. Donnée SC1-TP non disponible suite à une contamination. Le pourcentage de CFU est calculé selon la formule suivante: (nombre de colonies/nombre de cellules CD34+ ensemencées) x 100.
44
3.1.4 Effet de la température d’entreposage sur l’expression de molécules de
surface
Puisque notre hypothèse de départ suggérait que l’entreposage des USC à TP
affecte négativement les CSH, nous avons pensé que cet effet pourrait être
détecté in vitro. Bien que nous ne savions pas pourquoi l’entreposage à TP menait
à l’absence de reconstitution in vivo observée par l’équipe de Sainte-Justine [88]
malgré la présence d’un nombre de CFU similaire à TP et 4°C, une de nos
hypothèses était que l’entreposage à cette température régulait à la baisse
l’expression de certaines molécules essentielles à la migration des CSH vers la
moelle osseuse (appelé homing), les empêchant donc, au moment de la greffe, de
se rendre à la moelle osseuse et de reconstituer le système hématopoïétique. Cinq
molécules ont été analysées; CXCR4, le récepteur de SDF-1, qui est une des
principales chimiokines qui attirent les CSH à la moelle osseuse; le niveau de
fucosylation a été analysé à l’aide de l’anticorps HECA-452, qui reconnaît les
glycoprotéines fucosylées à la surface des leucocytes [91]; le récepteur
d’adhésion CD44, qui joue un rôle important dans la migration des CSH à la moelle
osseuse [92]; le CD49d (aussi appelé very late antigen-5) qui jouerait un rôle dans
la migration des CSH à travers la matrice extracellulaire [93]; et finalement CD162
(aussi appelé P-selectin glycoprotein ligand-1), qui joue aussi un rôle dans le
homing [94]. L’analyse de l’expression de ces molécules de surface a été effectuée
sur 4 USC différentes, après entreposage de 48 heures, isolement des cellules
mononuclées par Ficoll-Paque et sélection positive des cellules CD34+. Comme le
démontre la figure 9, aucune différence n’a été observée entre les deux conditions
quant à l’expression des 5 marqueurs analysés. En effet, les niveaux de
fucosylation des cellules se situaient autour de 60%, peu importe la température
d’entreposage. L’expression de CXCR4 était à +/- 20% dans les deux conditions.
La majorité des cellules CD34+ exprimaient CD44 et CD162 (autour de 90% et
80%, respectivement), peu importe la température d’entreposage du sang de
cordon. L’expression de CD49d variait beaucoup entre les différentes USC testées
(de 5% à 60%, résultats non montrés). Toutefois, il n’y avait pas de différence
entre les deux températures, comme le démontrent les moyennes des deux
45
conditions, qui sont presque identiques. Ainsi, aucune de nos expériences in vitro
nous a permis d’observer un impact quelconque de l’entreposage à TP du sang de
cordon sur les CSH.
Figure 9. Impact de la température d’entreposage du sang de cordon sur
l’expression de molécules à la surface des cellules CD34+.
Expression moyenne de plusieurs marqueurs cellulaires ayant un rôle dans la migration des CSH vers les niches de la moelle osseuse, après entreposage de 48 heures à TP ou 4°C, cryopréservation, décongélation et sélection positive. Les barres d’erreurs représentent l’erreur standard à la moyenne. Moyenne de 4 unités de sang de cordon. Aucune différence significative entre les deux conditions.
3.2 RÉSULTATS IN VIVO
3.2.1 Mise au point de la transplantation de cellules souches hématopoïétiques
Les premières expériences du volet in vivo de ce projet de maîtrise concernaient la
mise au point de la transplantation des CSH. Dès le début, nous avions plusieurs
46
interrogations sur le protocole à adopter; dans la littérature, la plupart des
expériences sur les cellules souches de sang de cordon portent soit sur
l’optimisation de la reprise des neutrophiles, ou soit sur l’expansion des cellules
souches. Ainsi, dans la plupart des expériences chez les souris, celles-ci sont
transplantées avec un nombre important de cellules CD34+, avec un mélange de
cellules provenant de plusieurs cordons, ou encore avec des cellules CD34+
isolées. Or, notre problématique étant si étroitement reliée aux activités de la
banque de sang de cordon, il était important de mettre au point un protocole
mimant le contexte clinique dans lequel des patients reçoivent les greffes de
cellules, c’est-à-dire utiliser un sang de cordon total, donc des cellules souches
non isolées, ainsi qu’une seule unité de sang de cordon, et non un mélange. Ces
contraintes nous empêchaient donc de greffer aux souris plusieurs millions de
cellules CD34+, étant donné le faible nombre de cellules présentes dans une unité
de sang de cordon.
La première expérience in vivo porta donc sur la détermination de la dose cellulaire
à transplanter chez les souris. Les souris furent transplantées avec une
suspension cellulaire déplétée en CD3, afin d’éviter une réaction GvHD. Chaque
souris a reçu une suspension cellulaire contenant soit 1,5x104 ou 4x104 CD34+, tel
que déterminé par le marquage ISHAGE. Deux unités de sang de cordon furent
testées. Après 12 semaines, tel qu’attendu, nous avons retrouvé une quantité
appréciable de cellules CD45 humaines (huCD45) dans la moelle osseuse des
souris (figure 10). Pour le premier sang de cordon (CB1010), il n’y avait pas de
différence significative entre les deux doses au niveau de la prise de greffe (p =
0.2). Par contre, pour CB1023, nous avons observé une différence significative
entre les deux doses (p = 0.0476). Mais puisque la dose de 1,5x104 CD34+
permettait la détection de la prise de greffe chez les souris, et qu’elle nous
permettait de transplanter un plus grand nombre de souris avec la même USC (ou
d’utiliser des USC plus petites), c’est avec cette dose que nous avons choisi de
continuer nos expériences in vivo.
47
Figure 10. Prise de greffe chez les souris selon la dose de cellules
transplantées.
Pourcentage de cellules CD45+ humaines retrouvées dans la moelle osseuse des souris (n=5 par groupe), 12 semaines après la greffe, calculé suite au marquage des cellules de la moelle osseuse des souris (quantité de huCD45/cellules totales). Les souris contrôles ont reçu une injection de PBS. 5 souris par groupe. Aucune différence statistique dans la prise de greffe entre les deux USC, peu importe la dose de cellules greffée (p = 0.25).
3.2.2 Reproductibilité des expériences 72 heures
Après avoir mis au point le protocole de transplantation des cellules de sang de
cordon, l’étape suivante a été de tenter de reproduire les résultats rapportés dans
le papier de Louis et al [88]. Pour ce faire, des groupes de souris ont été injectés
avec 1,5x104 cellules CD34+ provenant de deux USC congelées après un
48
entreposage de 72 heures à TP et à 4°C. La prise de greffe fut analysée 13
semaines après la transplantation. Bien que les souris de cette expérience aient
reçu une dose de cellules plus faible que celle de l’expérience publiée par Louis et
al (5x104 cellules CD34+), nous avons pu observer une prise de greffe chez un
groupe de souris ayant reçu un sang de cordon conservé à TP, comme le
démontre la figure 11. Pour le CB1034, il y a eu prise de greffe chez le groupe TP
mais pas chez le groupe 4°C car les souris de ce groupe ont dû être euthanasiées
avant la fin du protocole. Pour le CB1036, la prise de greffe a été significativement
meilleure chez le groupe 4°C que chez le groupe TP (p = 0.0286). En effet, une
très faible proportion de cellules humaines a été retrouvée chez les souris du
groupe CB1036 TP; légèrement plus élevée que chez le groupe contrôle, mais trop
faible pour signifier une reconstitution solide (différence non significative entre
CB1036 TP et le groupe contrôle, car la taille de l’échantillon était trop petite).
Ainsi, contrairement à ce qui a été rapporté dans l’étude de Sainte-Justine [88], un
entreposage à TP, même jusqu’à 72 heures, ne semble pas faire perdre aux CSH
toute leur capacité de reconstitution hématopoïétique, puisque l’une des deux USC
conservées à TP a pu, dans l’expérience décrite ci-dessus, reconstituer le système
hématopoïétique de quelques souris.
49
Figure 11. Impact de l’entreposage du sang de cordon ombilical pendant 72
heures avant la congélation sur la prise de greffe.
Prise de greffe chez des souris NSG ayant reçu des cellules de sang de cordon conservé pendant 72 heures, soit à TP ou 4°C. 3 souris par groupe, sauf pour le groupe CB1036-4°C qui contenait 4 souris.
3.2.3 Effet de la température d’entreposage pendant le traitement du sang de
cordon sur la prise de greffe
Bien que le protocole in vivo décrit précédemment nous ait permis d’observer que
les CSH de sang de cordon étaient toujours fonctionnelles après un entreposage
de 72 heures avant leur congélation, la prise de greffe observée a eu lieu chez un
faible nombre de souris. La taille de l’échantillon était aussi petite, puisque le but
du protocole était simplement de vérifier la reproductibilité de l’étude de l’équipe de
Sainte-Justine. Malgré les résultats obtenus avec des unités de sang de cordon
congelées après 72 heures, il était important de travailler selon les paramètres en
50
place à la banque publique de sang de cordon, où l’entreposage maximal des USC
est de 48 heures.
Deux protocoles d’essais de souris ont donc été élaborés, afin d’analyser la prise
de greffe chez des souris recevant des USC conservées à TP et à 4°C pendant 48
heures avant congélation. Chaque souris a été transplantée avec une suspension
cellulaire déplétée en lymphocytes T et contenant 1,5x104 cellules CD34+, tel que
déterminé par le protocole ISHAGE (voir figure 12). Six USC ont été utilisées,
chacune séparée en deux pour tester les deux températures d’entreposage. Les
expériences ont été effectuées lors de deux protocoles différents. Lors du premier
protocole, les USC SC1 à SC3 ont été transplantées dans 6 groupes de souris (3
USC à deux conditions chacune, TP et 4°C) à raison de 6 ou 7 souris par groupe.
Des souris contrôles (n=2 par USC) ont reçu des injections de saline. Le deuxième
protocole s’est déroulé de la même façon, quelques semaines plus tard, avec les
USC SC4 à SC6. La prise de greffe a été évaluée de plusieurs façons. D’une part,
des prélèvements sanguins dans la veine saphène ont été effectués à plusieurs
intervalles durant le protocole, afin d’évaluer la quantité de cellules humaines en
circulation chez les souris par cytométrie en flux. D’autre part, la prise de greffe a
été mesurée dans la moelle osseuse des souris après leur sacrifice 20-22
semaines post-greffe, en évaluant la quantité de cellules humaines par cytométrie
en flux à l’aide d’un anticorps dirigé contre les CD45 humaines. Les analyses de la
moelle osseuse et des rates ont été effectuées 20 à 22 semaines après la
transplantation des cellules, nous permettant ainsi de détecter la présence de LT-
CSH.
51
Figure 12. Analyse du contenu en cellules CD34+ des USC en vue de la
greffe.
A-E : analyse des cellules du SC1-TP en cytométrie en flux ISHAGE, où la zone R4 contient les cellules CD34+ viables et R6 contient les fluorosphères énumérées pendant l’acquisition au cytomètre. F: données brutes utilisées pour calculer la concentration de cellules CD34+ viables dans l’échantillon, à l’aide de la formule :
CD34/µl sang = Nombre cellules CD34+ * Nombre de billes dans l’échantillon Nombre de billes comptées * volume de l’échantillon * facteur de dilution Procédure représentative de l’analyse effectuée sur chaque USC.
52
3.2.3.1 Cellules humaines en circulation
Des cellules humaines en circulation ont seulement été détectées chez 3 souris du
groupe SC4-4°C, au sacrifice (résultats non montrés). Ces 3 souris ont été les
seules reconstituées, c’est-à-dire les seules avec une prise de greffe, dans ce
groupe. Toutefois, le nombre de cellules humaines en circulation était trop faible
pour en estimer la concentration.
Dans les autres groupes de souris, même chez des souris ayant connu une
meilleure prise de greffe (c’est-à-dire une plus grande quantité de cellules
humaines dans la moelle osseuse), aucune cellule humaine n’a été détectée en
circulation.
3.2.3.2 Prise de greffe à long terme
Des 6 USC testées, deux se sont avérées incapables de reconstituer le système
hématopoïétique des souris, et ce peu importe la température d’entreposage des
poches. Aucune cellule humaine n’a été retrouvée dans la moelle des souris ayant
reçu des cellules des SC5 et SC6; ces USC sont donc exclues des figures de
résultats présentés.
Des cellules humaines ont été retrouvées dans la moelle osseuse de la majorité
des souris (Figure 13) transplantées avec les USC SC1 à SC4. La figure 13
montre des profils de cytométrie représentatifs des marquages de la moelle
osseuse de chacun des groupes. Les souris contrôles ont reçu du PBS, et le signal
de cellules humaines était inférieur à 1%. De ce fait, la détection de cellules
humaines dans la moelle des souris à une quantité égale ou inférieure à 1% a été
considérée comme du bruit de fond.
53
Figure 13. Profils de cytométrie de la moelle osseuse de souris NSG.
Profils de cytométrie représentatifs des marquages de la moelle osseuse de chaque groupe de souris transplantées, soit les groupes ayant reçu de la saline (CTL) ou des cellules issues de la même USC conservée à TP et à 4°C. Les leucocytes humains (huCD45+) et murins (muCD45+) ont été marqués à l’aide d’anticorps spécifiques. La souris contrôle sert à identifier quelle population cellulaire est négative pour le marqueur huCD45. Les quadrants ont été placés à l’aide des souris contrôles (<1% d’événements dans les quadrants huCD45+), de façon à séparer les populations cellulaires positives et négatives.
Les figures 14A et 14B représentent la proportion de cellules humaines retrouvées
dans la moelle osseuse des souris 20 à 22 semaines après la greffe. Des cellules
humaines ont été retrouvées dans tous les groupes (SC1 à 4), à l’exception du
groupe SC1-TP, où aucune des 6 souris n’a connu une prise de greffe. Toutefois, il
est possible que cela ait été causé par une contamination bactérienne des cellules;
lors de l’essai de progéniteurs effectué avec les cellules du SC1-TP, aucune
colonie n’a pu pousser en raison d’une contamination. Bien qu’il soit possible que
la contamination ait eu lieu pendant l’essai de progéniteurs, qui dure 14 jours, on
ne peut écarter la possibilité que les cellules elles-mêmes fussent contaminées au
moment de la greffe, portant ainsi atteinte au bon déroulement de la greffe. À
première vue, l’entreposage des poches à 4°C a représenté un très faible
avantage pour le SC2, mais cet avantage n’est pas statistiquement significatif
(p>0.5). La prise de greffe des souris du groupe SC4-4°C, quant à elle, est
statistiquement supérieure à celle des souris du groupe SC4-TP (p<0,05). Il en est
de même pour le SC1 (p<0,01), étant donné l’absence de reconstitution chez le
groupe TP. Quant au SC3, la température d’entreposage n’a pas fait de différence
54
sur la proportion de cellules humaines retrouvées dans la moelle des souris
(p>0.5).
A
B
Figure 14. Reconstitution hématopoïétique chez les souris NSG.
A Proportion de cellules CD45+ humaines dans la moelle osseuse des souris NSG, 20-22 semaines post-greffe. Le nombre de cellules CD45+ humaines a été évalué dans la moelle de chaque souris greffée (groupes de 6 ou 7 souris par condition expérimentale). Une proportion >1% de cellules CD45+ humaines dans les cellules de la moelle osseuse indique une prise de greffe. B Résultats présentés sous forme de moyenne ± erreur standard à la moyenne. Deux protocoles de greffe indépendants (SC1 à SC3 et SC4). *p<0.05, **p<0.01
**
*
55
Les résultats peuvent également être exprimés en nombre absolu de cellules
humaines dans la moelle osseuse (Figure 15A). On observe sensiblement les
mêmes différences entre les groupes, à savoir que la conservation des USC à 4°C
a été bénéfique pour les SC1 et SC4, et que la température d’entreposage n’a pas
eu d’effet significatif sur les SC2 et SC3.
La seule disparité entre les façons d’interpréter les résultats est au niveau de la
prise de greffe du SC2 lorsqu’on regarde la proportion des souris avec une
reconstitution hématopoïétique (Figure 15B). En effet, en utilisant ce paramètre, on
observe encore les mêmes tendances pour les SC1 et SC4 (à savoir que
l’entreposage à 4°C leur a été bénéfique) et SC3 (c’est-à-dire que la température
d’entreposage n’a eu aucun effet sur la capacité des CSH à greffer). Toutefois,
pour le SC2, la tendance change; deux fois plus de souris ont connu une prise de
greffe chez le groupe 4°C que chez le groupe TP. Ainsi, du point de vue de la
réussite ou de l’échec de la greffe, c’est-à-dire du point de vue qualitatif, la
conservation à 4°C est meilleure que la conservation à TP pour le SC2.
56
A
B
Figure 15. Reconstitution hématopoïétique chez les souris NSG (suite).
A Prise de greffe des souris 20-22 semaines post-greffe, sous forme du nombre total de cellules CD45+ humaines retrouvées dans la moelle osseuse des souris. B Proportion, pour chaque groupe (n=6 ou 7 souris par groupe), des souris qui ont été reconstituées par les cellules de sang de cordon greffées, 20-22 semaines post-greffe. Deux protocoles de greffe indépendants.
Comme il a été mentionné précédemment, des marquages ont été faits pour
évaluer la composition de la moelle osseuse des souris (résultats non montrés).
Nous n’avons pas observé la présence de lymphocytes B humains (huCD19+) ni
57
de cellules myéloïdes humaines (huCD33+) chez les groupes SC1 et SC4. Nous
avons décelé des huCD19+ et huCD33+ chez toutes les souris des groupes SC3,
et chez seulement 4 souris des groupes SC2. Il n’y avait aucune différence dans la
composition de la moelle osseuse entre les groupes TP et 4°C. Bien qu’il n’est pas
surprenant de trouver des populations cellulaires huCD19+ et huCD33+ chez les
souris des groupes SC4 en raison du haut taux de reconstitution hématopoïétique
dans ce groupe, c’est étrange de ne pas constater la présence de ces populations
dans d’autres groupes, particulièrement chez des souris ayant atteint des niveaux
semblables de prise de greffe.
3.2.4 Prédictibilité de la prise de greffe
Nous avons comparé les résultats de nos expériences in vitro et in vivo, afin de
regarder si l’effet de la température sur les CSH, observé in vivo, aurait pu être
prédit sur la base des essais in vitro. Bien que la température d’entreposage sur la
prise de greffe ne s’est pas avéré être un facteur déterminant, nous avons pu
trouver un lien entre la prise de greffe et nos tests in vitro. En effet, en regardant
les contenus en progéniteurs CFU, tels qu’établis par les essais CFC, nous avons
observé les mêmes tendances dans la « performance » des CSH. Par exemple,
pour les deux USC (SC5 et SC6) qui n’ont pas reconstitué de souris, ni à TP ou à
4°C, aucun progéniteur CFU n’a été décelé lors des essais de progéniteurs.
L’essai de progéniteur nous aurait ainsi permis de prédire l’absence de prise de
greffe chez 5 des 12 groupes de souris : SC1-TP, SC5-TP, SC5-4°C, SC6-TP et
SC6-4°C. L’essai corrèle aussi avec les tendances de la prise de greffe; les
groupes SC3-TP et SC4-4°C contenaient sensiblement la même quantité de
progéniteurs (voir Figure 8), et leurs capacités de reconstitution hématopoïétique
chez les souris étaient aussi très semblables. Lorsqu’on regarde les données de
tous les groupes testés, incluant ceux qui n’ont pas reconstitué les souris, on
observe une corrélation positive de 0.83 entre la proportion de progéniteurs CFU
présents dans le sang de cordon et la prise de greffe chez les souris, telle
58
qu’évaluée par la quantité de huCD45+ présents dans la moelle osseuse des
souris (Figure 16).
Figure 16. Corrélation entre le contenu en progéniteurs CFU et la prise de
greffe.
Lien entre la quantité de progéniteurs CFU présents dans le sang de cordon avant la transplantation (tel qu’établi par l’essai CFU) et la prise de greffe chez les souris, plus précisément la quantité de cellules CD45+ humaines retrouvée dans la moelle osseuse des souris, 23 semaines après la greffe. Pour la prise de greffe, on utilise la moyenne de huCD45+ dans la moelle osseuse des souris de chaque groupe.
59
4. DISCUSSION
Le sang de cordon ombilical permet à des patients qui ne trouvent pas de
donneurs adultes compatibles d’avoir accès à la greffe de cellules souches
hématopoïétiques. Les nombreux avantages du sang de cordon encouragent la
communauté scientifique à chercher des façons d’optimiser les capacités et le
nombre des CSH du sang de cordon, afin d’accroître le nombre de patients
pouvant en bénéficier. Cependant, l’absence d’encadrement de certains
paramètres critiques lors du traitement du sang de cordon, comme la température
d’entreposage, pourrait compromettre ces efforts. En effet, il est primordial de
s’assurer que la façon dont les USC sont prélevées et conservées est optimale.
Malgré cela, aucune étude à grande échelle n’a été effectuée afin de vérifier quel
impact la température d’entreposage des USC avant leur congélation a sur les
CSH.
La première étude in vivo sur ce paramètre par un groupe du Centre de Recherche
de l’hôpital Ste-Justine à Montréal a rapporté un impact très négatif de
l’entreposage à TP du sang de cordon avant les étapes de cryopréservation et
mise en banque. Ce projet de maîtrise a été mis sur pied suite à la parution cette
étude, qui a déclenché des questionnements sur les pratiques utilisées à la
Banque publique de sang de cordon. Par contre, nous n’avons pu reproduire leurs
résultats; les deux USC conservées à TP pendant 72 heures avant la congélation
ont réussi à reconstituer le système hématopoïétique de plusieurs souris,
contrairement à ce qu’a observé l’équipe de Sainte-Justine, et ce même avec une
dose de cellules CD34+ plus faible que dans l’étude originale. Cela pourrait
s’expliquer par la méthodologie de l’étude; si les USC qu’ils ont utilisées pour les
essais in vivo n’ont pas été séparées en deux parties afin de tester les deux
températures d’entreposage sur le même USC (ce que nous ne sommes pas en
mesure de savoir, car la méthodologie décrite dans le papier n’était pas claire), il
est possible que, par le hasard des choses, les USC conservées à TP étaient tout
simplement de moins bonne qualité que les unités conservées à 4°C, ce qu’il est
seulement possible de démontrer en testant les deux conditions sur chaque
60
échantillon. En effet, nos résultats démontrent une grande variabilité du potentiel
de reconstitution hématopoïétique entre les différentes USC. Puisque nous ne
savons pas combien de USC ont été testées in vivo dans cette étude, et que leur
conclusion quant à l’absence de lien entre l’essai de progéniteurs et la prise de
greffe in vivo va à l’encontre de la majorité des études publiées à ce jour [89, 95-
97], il est difficile d’expliquer leurs résultats.
Toutefois, puisque nous n’avons pas pu reproduire ces résultats, nous pouvons
donc écarter la théorie selon laquelle l’entreposage à TP de sang de cordon
ombilical avant sa mise en banque entraîne une perte totale de la fonctionnalité
des CSH. Effectivement, un sang de cordon ombilical entreposé à TP est encore
capable de reconstituer le système hématopoïétique dans notre modèle animal.
Bien que rassurants, ces résultats ne précisent pas quelle température
d’entreposage est optimale pour les CSH de sang de cordon. Nos expériences in
vivo ont pu infirmer la théorie mise de l’avant par l’équipe de Sainte-Justine, mais
elles n’ont pas pu confirmer la théorie selon laquelle la conservation à 4°C est
favorable. Un échantillon de 6 USC aurait peut-être été suffisant pour remarquer
une tendance dans la prise de greffe chez les souris, mais malheureusement chez
2 des 6 USC, aucune cellule humaine n’a été retrouvée chez les souris. La taille
résultante de notre échantillon est donc trop petite pour parvenir à une conclusion
définitive. Sur 4 USC, en évaluant la prise de greffe de façon quantitative, nous
avons observé des effets de la température différents selon les groupes.
L’entreposage à TP a été significativement néfaste pour les SC1 et SC4, semble
avoir été néfaste pour le SC2 malgré l’absence de différence significative entre les
deux températures testées, et n’a eu aucun impact sur le SC3, où la prise de greffe
était identique pour les deux températures. Et si l’on considère les contaminations
présentes dans l’essai de progéniteurs du SC1-TP, qui ont pu affecter la greffe
chez les souris, alors il ne nous reste que les résultats de 3 USC pour tirer une
conclusion, ce qui est un échantillon trop petit lorsque les résultats ne sont pas
identiques pour tous les groupes.
61
Par contre, en regardant la proportion de prise de greffe chez chaque groupe,
c’est-à-dire le nombre de souris reconstituées dans chaque groupe, nos résultats
in vivo pointent vers un avantage pour l’entreposage du sang de cordon à 4°C,
puisque deux fois plus de souris ont été reconstituées dans les groupes 4°C que
les groupes TP pour les SC2 et SC4. En observant le succès de la greffe, nous
pouvons donc dire que l’entreposage à 4°C semble procurer un avantage dans la
majorité des cas.
D’autres travaux in vivo seront nécessaires pour confirmer l’impact de la
température d’entreposage sur la qualité des CSH. En raison de la grande
variabilité dans la prise de greffe d’un sang de cordon à un autre, il sera
nécessaire de tester un plus grand nombre d’échantillons pour tirer une
conclusion. Évidemment, les expériences dans un modèle murin ne peuvent pas
amener de conclusion définitive, mais elles constituent les meilleures preuves que
l’on peut détenir sans faire d’expérience chez des patients. Éventuellement, il
serait intéressant de rassembler des données cliniques sur les différentes banques
de sang de cordon ombilical et leurs USC distribuées dans les centres hospitaliers,
afin de vérifier si la température d’entreposage pré-congélation a un effet sur la
réussite de la transplantation de sang de cordon ombilical. Bien qu’il soit difficile
d’isoler un seul paramètre dans de telles données cliniques, le résultat chez le
patient demeure la meilleure façon de déterminer la « qualité » des CSH.
Pour ce qui est de la raison pour laquelle l’entreposage à 4°C pré-congélation
serait bénéfique, nous n’avons pas encore trouvé. La principale hypothèse, au
début de mes travaux, était un défaut, lors de l’entreposage à TP, de la capacité
des CSH à migrer vers la moelle osseuse lors de la greffe, soit en raison d’une
diminution de l’expression de certaines molécules de surface, ou en raison d’une
baisse de la fucosylation des CSH. Toutefois, nous n’avons pas observé de
différence d’expression de molécules de surface ou encore de taux de fucosylation
entre les cellules entreposées à TP et celles à 4°C. Une des pistes intéressantes à
62
poursuivre serait de regarder l’impact de la température sur le niveau d’activité de
l’enzyme aldéhyde déshydrogénase (ALDH). Cette enzyme est de plus en plus
considérée comme étant un marqueur très sélectif des CSH et CPH [98]. Certaines
études ont même démontré la possibilité d’isoler les LT-HSC en isolant les cellules
ayant une grande activité ALDH et en les transplantant chez des souris; les
cellules avec une grande activité ALDH (ALDHbr) démontraient la capacité de
reconstituer le système hématopoïétique des souris à long terme, alors que les
cellules ALDHlow en étaient incapables [99, 100]. Cette enzyme est d’ailleurs si
prometteuse que certains groupes ont commencé à mettre au point un marquage
de l’ALDH qui pourrait être utilisé par les banques de sang de cordon comme essai
fonctionnel, afin d’évaluer la qualité du sang de cordon [101]. En ce moment, les
banques utilisent l’essai de progéniteurs CFC afin d’évaluer les USC mises en
banque. Mais cet essai est difficile à standardiser, et requiert une incubation de 14
jours, alors qu’un marquage de l’ALDH est beaucoup plus rapide et facile à mettre
en place, et serait tout aussi apte à prédire la fonctionnalité des CSH que l’essai de
progéniteurs. Il serait donc intéressant de regarder si les cellules de sang de
cordon expriment des différents niveaux d’ALDH selon la température
d’entreposage pré-congélation. Des travaux en ce sens sont d’ailleurs en cours
dans notre laboratoire.
Au-delà de nos tests sur la température d’entreposage du sang de cordon
ombilical, nous avons pu constater plusieurs faits à propos des CSH de sang de
cordon, notamment en ce qui a trait à la sélection des USC pour la mise en
banque. Le marquage ISHAGE nous a permis de constater que le nombre de
leucocytes (TNC ou cellules CD45+) n’est pas représentatif du nombre de cellules
CD34+, et donc de CSH présents dans le sang de cordon ombilical. Pourtant, c’est
encore ce critère, c’est-à-dire le nombre de cellules CD45+, qui est utilisé pour la
qualification des USC, de même que pour l’optimisation des procédures de mises
en banque. Comme il a été mentionné ci-dessus, la banque de sang de cordon a
adopté un délai de traitement entre 24 et 48 heures après le prélèvement en raison
de la meilleure récupération de cellules totales pendant ce délai, suite à la
63
réduction de volume. Or, une étude de notre laboratoire a démontré que ce délai
de 24 à 48 heures n’est pas meilleur au niveau de la récupération des cellules
CD34+, mais seulement pour les cellules totales [102]. Nous avons également
observé un effet semblable lors de nos expériences in vitro, où des effets observés
sur les cellules CD45+ sont différents de ceux observés sur les cellules CD34+ ;
alors que l’entreposage à TP pendant 48 heures engendrait une baisse de la
viabilité des leucocytes (qui s’explique par la mort des granulocytes, qui ont une
courte durée de vie en circulation et périssent plus rapidement à TP qu’à 4°C
[103]), aucun impact n’était observé quant à la récupération des cellules CD34+,
qui est pratiquement parfaite dans les deux conditions (figure 7). À première vue,
une récupération supérieure à 100%, dans le cas de la condition 4°C, semble
suspecte. Toutefois, cela peut s’expliquer par la marge d’erreur des méthodes à
notre disposition pour compter les cellules CD34+ : en cytométrie en flux, au
moment de l’analyse des USC, notre protocole requiert l’acquisition de 50 000 à
75 000 cellules CD45+ viables, ce qui représente entre 100 et 300 CD34+. La loi
de Poisson indique que la marge d’erreur dans ce contexte se situe entre 10 et
5.8% [104]. Le compte de cellules CD34+ plus élevé après l’entreposage à 4°C se
situe donc dans la marge d’erreur de l’essai. Ainsi, les cellules CD34+ n’étaient
pas affectées par la température d’entreposage, alors que les cellules CD45+
l’étaient. Nous avons donc constaté que la mesure du contenu en CD45 du sang
de cordon n’est pas un bon indicateur de son contenu en CD34. Ainsi, il est
possible de croire que les critères de qualification en place actuellement dans les
banques de sang de cordon ombilical ne mènent pas à la sélection des USC
contenant le plus de CSH. Puisque le nombre de CSH est le principal facteur
limitant dans l’utilisation du sang de cordon, il serait important de revoir les
pratiques pour la qualification des dons en priorisant le paramètre CD34+.
Un autre objectif de ma maîtrise était de déterminer quel test in vitro est le plus
indicatif de la prise de greffe in vivo. Bien qu’il ait déjà été démontré que l’essai de
progéniteurs était un bon prédicteur de la prise de greffe et du taux de survie chez
les patients [89], nous avions quelques doutes suite à la parution de l’étude sur
64
l’entreposage des USC pendant 72 heures dans laquelle l’équipe de Sainte-Justine
observait, pour les USC conservées à TP, une capacité de différentiation normale
in vitro avec l’essai de progéniteurs, et une absence de reconstitution
hématopoïétique in vivo, dans leur modèle de souris NSG. Toutefois, les résultats
obtenus lors de nos essais de progéniteurs ont reflété la variabilité de la prise de
greffe entre les différentes USC chez les souris. Notamment, l’essai de
progéniteurs CFC a permis de prédire quelles USC n’arriveraient pas à
reconstituer les souris, en raison d’une absence de progéniteurs. La suite des
expériences in vivo permettrait de confirmer et de renforcer le lien entre les
progéniteurs CFC et les résultats des greffes in vivo.
Bien qu’à ce stade, l’impact précis de la température d’entreposage avant la mise
en banque sur le potentiel de reconstitution hématopoïétique des CSH ne soit pas
encore déterminé, ce mémoire démontre l’importance de poursuivre les travaux
sur cette piste, permettant ainsi aux banques publiques de sang de cordon comme
celle d’Héma-Québec d’optimiser leurs procédés de traitement du sang de cordon
tout en respectant le cadre réglementaire en place.
65
5. CONCLUSION
Nos travaux avec un modèle animal de transplantation de cellules souches
hématopoïétiques ont permis d’infirmer la théorie selon laquelle l’entreposage du
sang de cordon ombilical à température pièce pré-congélation détruisait toute
fonctionnalité des CSH. Cependant, les résultats obtenus n’ont pas permis
d’évaluer l’impact précis de la température d’entreposage, mais ils ont confirmé
que le potentiel de reconstitution hématopoïétique des CSH peut être prédit par les
essais de progéniteurs CFC. Des travaux supplémentaires seront nécessaires afin
de confirmer la température d’entreposage optimale du sang de cordon, et
permettront à la banque publique de sang de cordon d’Héma-Québec d’assurer la
qualité de ses unités mises en banque.
66
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