Embed Size (px)
Citation preview
OPTIMASI VOLUME ETANOL DAN AKUADES DALAM PROSES
PERKOLASI DAUN STEVIA (Stevia rebaudiana Bertonii M.) DENGAN
APLIKASI DESAIN FAKTORIAL
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Far.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh :
Totok Lasmono Hadi Purwanto
NIM : 058114167
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA 2009
i
OPTIMASI VOLUME ETANOL DAN AKUADES DALAM PROSES
PERKOLASI DAUN STEVIA (Stevia rebaudiana Bertonii M.) DENGAN
APLIKASI DESAIN FAKTORIAL
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Far.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh :
Totok Lasmono Hadi Purwanto
NIM : 058114167
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA 2009
ii
iii
iv
Untuk Tuhan Yesus yang selalu menjagaku
Untuk Mama & Papa yang selalu memberi dukungan
Untuk Kakak dan Adikku yang selalu memberi semangat
Dan untuk Alamamaterku
Kebersamaan adalah....
Berbagi rasa, memberi kedamaian, saling memperhatikan,
saling mengasihi, mengerti artinya dicintai dan mencintai,
menerima apa adanya.
Sukses adalah suatu hal yang tidak dapat kita bayar
dengan tunai. Kita harus membayarnya dengan cara
mencicil dan melakukan pembayaran setiap hari
-Zig ziglar-
v
vi
PRAKATA
Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat dan karunia-Nya
penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Optimasi Volume Etanol dan
Akuades dalam Proses Perkolasi Daun Stevia (Stevia rebaudiana Bertonii M.)
dengan Aplikasi Desain Faktorial ” sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar
sarjana pada Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Skripsi ini merupakan bagian dari penelitian payung ”Optimasi Proses
Isolasi Steviosida Sebagai Pemanis Pengganti Gula” yang dibiayai Hibah PHK A3
Dikti tahun 2008. Dalam penulisan skripsi ini, penulis mendapatkan bantuan dari
banyak pihak. Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan penghargaan dan
ucapan terima kasih kepada:
1. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku dosen pembimbing I atas bimbingan dan
pengarahannya baik selama penelitian maupun penyusunan skripsi ini.
2. Sri Hartati Yuliani, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing II atas bimbingan
dan pengarahannya baik selama penelitian maupun penyusunan skripsi ini.
3. Romo Drs. Petrus Sunu Hardiyanta, S.J., S.Si. selaku penguji atas segala
masukan, kritik, dan sarannya.
4. Yustina Sri Hartini M.Si., Apt selaku penguji atas segala masukan, kritik,
dan sarannya.
5. Mas Wagiran, Mas Sigit, Mas Andri, dan Mas Sarwanto atas bantuannya
selama peneliti bekerja di laboratorium Farmakognosi Fitokimia.
vii
viii
ix
INTISARI
Pada penelitian ini dilakukan optimasi volume etanol dan akuades sebagai cairan penyari dalam proses perkolasi daun S. rebaudiana. Desain faktorial diaplikasikan dalam penelitian ini. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui faktor dominan dan pengaruh interaksi antara etanol dan akuades, serta volume cairan penyari yang optimum untuk mendapatkan ekstrak dengan kadar steviosida tertinggi.
Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni menggunakan desain faktorial dengan dua faktor yaitu volume etanol dan akuades. Penelitian diawali dengan determinasi tanaman, pembuatan serbuk, defatisasi dan penyarian secara perkolasi. Analisis kualitatif perkolat dengan KLT silika gel F254 dan fase gerak kloroform:metanol:akuabides (10:15:2) serta deteksi bercak dengan pereaksi KI dan vanilin-asam sulfat. Penetapan kadar steviosida dengan mengukur luas area di bawah kurva (AUC) menggunakan software Image-J. Data hasil penelitian dianalisis secara statistik menggunakan Yate’s Treatment dengan tingkat kepercayaan 95 % untuk mengetahui tingkat signifikansi tiap faktor dan interaksi keduanya dalam menentukan respon kadar steviosida.
Hasil analisis data menunjukkan bahwa etanol merupakan faktor dominan yang signifikan berpengaruh dengan nilai F hitung 47,2498 lebih besar dari F tabel 10,128 sedangkan interaksi tidak berpengaruh terhadap respon kadar steviosida. Berdasarkan hasil penelitian dapat ditemukan area optimum volume cairan penyari untuk mendapatkan ekstrak dengan kadar steviosida tertinggi (> 7% b/b).
Kata kunci : steviosida, perkolasi, desain faktorial, Image-J, Yate’s Treatment
x
ABSTRACT
The optimation of ethanol and aquadest volumes as solvent were performed in percolation process of S. rebaudiana leaves. Factorial design was applied in this research. This research has the objectives to know the dominant factor and interaction effect between ethanol and aquadest, also the optimum volumes of solvent to get the highest concentration of stevioside within the extract.
This research was included to be a pure experimental research using application factorial design of two factors, ethanol and aquadest. This research was preceded by determination of plant, powderisation, defatitation, and extraction by percolation. Qualitative analysis of percolate by TLC silica gel F254 and mobile phase chloroform:methanol:aquabidest (10:15:2) also detection of spot with KI and vanilin-sulphuric acid reagents. Assay the concentration of stevioside by measure area under curve using software image-J. Data of this research are analysed statistically using Yate’s Treatment with confidence level 95% to know the significance level of each factor and interaction between them to determine the respon stevioside concentration.
The results of data analyse show that ethanol is the significance dominant factor with F value 47,2498 higher than F tabel 10,128 and interaction have no effect to the respon stevioside concentration. Based on the results of research , it was found optimum area volume of solvent to get the highest concentration of stevioside within the extract (> 7% w/w).
Keywords : stevioside, percolation, factorial design , Image-J, Yate’s Treatment
xi
DAFTAR ISI
HALAMAN SAMPUL ......................................................................................... i
HALAMAN JUDUL............................................................................................. ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................... iii
HALAMAN PEENGESAHAN ............................................................................ iv
HALAMAN PERSEMBAHAN ...........................................................................v
HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ...........................vi
PRAKATA............................................................................................................vii
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................. ix
INTISARI..............................................................................................................x
ABSTRAK ............................................................................................................xi
DAFTAR ISI ........................................................................................................xii
DAFTAR TABEL.................................................................................................xvi
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................xvii
DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................... xviii
BAB I PENDAHULUAN.....................................................................................1
A. Latar Belakang...............................................................................................1
1. Perumusan Masalah ..................................................................................4
2. Keaslian Penelitian....................................................................................5
3. Manfaat Penelitian ....................................................................................5
B. Tujuan Penelitian...........................................................................................5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA...........................................................................6
A. Stevia rebaudiana Bertonii M. ......................................................................6
xii
1. Uraian Tanaman .........................................................................................6
2. Kegunaan ....................................................................................................7
3. Kandungan Kimia ......................................................................................8
B. Glikosida........................................................................................................10
1. Umum........................................................................................................10
2. Diterpen.....................................................................................................10
C. Steviosida.......................................................................................................11
D. Penyarian .......................................................................................................12
E. Perkolasi ........................................................................................................14
F. Sokhletasi.......................................................................................................17
G. Pengeringan ...................................................................................................17
H. Desain Faktorial.............................................................................................18
I. KLT .. ...........................................................................................................20
J. Image J ..........................................................................................................24
K. Landasan Teori ..............................................................................................24
L. Hipotesis .......................................................................................................25
BAB III METODE PENELITIAN .......................................................................26
A. Jenis dan Rancangan Penelitian.....................................................................26
B. Variabel dan Definisi Operasional ................................................................26
1. Klasifikasi Variabel ....................................................................................26
2. Definisi Operasional ...................................................................................26
C. Bahan Penelitian ............................................................................................27
D. Alat Penelitian ...............................................................................................28
E. Tata Cara Penelitian.......................................................................................28
1. Determinasi Tanaman S.rebaudiana
2. Pembuatan serbuk simplisia S.rebaudiana
a. Pengumpulan Bahan .............................................................................28
b. Sortasi Kering .......................................................................................28
c. Pembuatan serbuk.................................................................................29
3. Pembuatan Ekstrak Tanaman S.rebaudiana .............................................29
xiii
a. Defatisasi serbuk simplisia ...................................................................29
b. Ekstraksi serbuk simplisia secara erkolasi dengan adanya variasi
volume etanol dan akuades.............................................................. 29
4. Analisis Kualitatif Steviosida....................................................................30
5. Analisis Kuantitatif Steviosida..................................................................30
a. Pembuatan larutan standar steviosida 2 mg/ml. ...................................30
b. Pembuatan kurva baku..........................................................................31
c. Penetapan kadar steviosida dalam ekstrak S. rebaudiana dengan
program ImageJ. ...................................................................................31
6. Analisis Hasil.. ..........................................................................................32
a. Analisis hasil kadar steviosida dengan desain faktorial .......................32
b. Yate’s Treatment...................................................................................32
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi Tanaman....................................................................................34
B. Pembuatan Serbuk Simplisia Stevia rebaudiana...........................................34
1. Pengumpulan Bahan ...................................................................................34
2. Sortasi Kering .............................................................................................35
3. Pembuatan serbuk.......................................................................................35
C. Pembuatan Ekstrak Cair Dari Daun Stevia rebaudiana ................................36
1. Defatisasi serbuk simplisia .........................................................................36
2. Perkolasi dengan aplikasi Desai Faktorial..................................................37
D. Analisis Kualitatif Ekstrak Tanaman S. rebaudiana (Bert.)..........................39
E. Analisis Kuantitatif Ekstrak Tanaman S. rebaudiana (Bert.)........................42
1. Pembuatan Kurva baku .............................................................................42
2. Penentuan kadar sampel dengan software Image J...................................44
F. Analisis Hasil Kadar Steviosida ....................................................................44
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN...............................................................49 A. Kesimpulan....................................................................................................49
B. Saran .............................................................................................................49
xiv
DAFTAR PUSTAKA ...........................................................................................50
Lampiran ..............................................................................................................53
Biografi Penulis.....................................................................................................67
xv
DAFTAR TABEL
Tabel I. Gugus gula glikosida steviol...................................................................... 9
Tabel II. Rancangan percobaan desain faktorial dengan dua faktor dan dua level19
Tabel III. Perbandingan volume etanol dan akuades yang digunakan pada
perkolasi ................................................................................................. 30
Tabel IV. Harga Rf baku dan sampel ekstrak steviosida ...................................... 42
Tabel V. Data jumlah steviosida (µg) dengan AUC ............................................. 43
Tabel VI. Data Kadar steviosida (% b/b) untuk masing-masing percobaan ........ 44
Tabel VII. Hasil Analisis Satistik Yate’s Treatment............................................. 46
xvi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Stevia rebaudiana Bert.......................................................................... 7
Gambar 2. Struktur glikosida steviol ...................................................................... 9
Gambar 3. Struktur kimia steviosida..................................................................... 11
Gambar 4. Kromatogram baku steviosida dan ekstrak steviosida deteksi vanilin
asam sulfat.............................................................................................. 41
Gambar 5. Kurva baku hubungan jumlah steviosida (µg) dengan AUC .............. 43
Gambar 6. Pengaruh akuades terhadap kadar steviosida yang terekstrak pada
etanol level rendah dan tinggi ................................................................ 45
Gambar 7. Pengaruh etanol terhadap kadar steviosida yang terekstrak pada
akuades level rendah dan tinggi ............................................................. 45
Gambar 8. Contour Plot Kadar Steviosida ........................................................... 48
xvii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat Keterangan Determinasi......................................................... 54
Lampiran 2. Data Penimbangan Baku Steviosida................................................ 56
Lampiran 3. Data Kurva Baku Steviosida............................................................ 56
Lampiran 4. Data kadar steviosida pada sampel.................................................. 57
Lampiran 5. Data Desain Faktorial dan Efek masing-masing Faktor..................57
Lampiran 6. Perhitungan Persamaan Desain Faktorial ..................................... ...58
Lampiran 7. Perhitungan Yate’s Treatment ......................................................... 60
Lampiran 8. Foto simplisia kering dan serbuk daun Stevia rebaudiana .............. 63
Lampiran 9. Foto Alat .......................................................................................... 64
Lampiran 10. Foto Larutan Pereaksi Semprot ..................................................... 64
Lampiran 11. Foto Perkolat...................................................................................65
xviii
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar belakang
Sekarang ini, perhatian masyarakat di Indonesia akan pentingnya
pencegahan penyakit dan perbaikan kesehatan semakin besar. Salah satu penyakit
yang banyak diderita dan bersifat kronis adalah diabetes. Upaya peningkatan
kesehatan berkaitan dengan penyakit ini adalah mengurangi konsumsi gula atau
menggunakan pemanis dengan nilai kalori yang rendah seperti pada pemanis
buatan (Widodo, 2008).
Pemanis buatan adalah adalah bahan tambahan pangan yang dapat
menyebabkan rasa manis pada produk pangan yang tidak atau sedikit mempunyai
nilai gizi atau kalori, hanya boleh ditambahkan ke dalam produk pangan dalam
jumlah tertentu (Anonim,2004). Pada mulanya pemanis buatan ini ditujukan untuk
penderita penyakit diabetes dan pencegahan terjadinya caries pada gigi. Namun
dikarenakan kemudahan untuk mendapatkan dan harganya yang relatif murah,
penggunaan pemanis buatan ini meluas pada masyarakat umum termasuk yang
tidak mengidap diabetes ( Wati, 2004).
Zat pemanis sintetis yang sering digunakan adalah Ca atau Na sakarin
dan siklamat. Penggunaan sakarin pada konsentrasi tinggi menimbulkan rasa pahit
getir dan pada jangka panjang dikhawatirkan memicu terjadinya kanker (Achyar,
2005). Penggunaan siklamat berbahaya bagi kesehatan karena senyawa hasil
metabolismenya yaitu sikloheksamina bersifat karsinogenik yang dapat
merangsang pertumbuhan tumor pada kandung kemih tikus (Mudjajanto, 2005).
1
2
Oleh karena itu, banyak dilakukan penelitian mengenai pemanis
pengganti gula yang sedikit atau hampir tidak mengandung kalori tetapi lebih baik
untuk kesehatan. Salah satu yang potensial untuk dikembangkan adalah pemanis
alami dari tanaman Stevia rebaudiana Bertonii atau yang lebih dikenal dengan
nama stevia (Midmore and Rank, 2002).
Stevia rebaudiana Bertonii, spesies yang paling manis, mengandung
seluruh glikosida di daunnya, dan steviosida merupakan komponen yang paling
banyak terkandung di dalamnya (3% - 8% dari berat kering daunnya) (Melis,
1992). Steviosida memiliki tingkat kemanisan 110-270 kali dibandingkan gula
(Midmore and Rank, 2002). Keuntungan menggunakan steviosida adalah karena
stabil, rendah kalori, menjaga kesehatan gigi dengan menurunkan intake gula, dan
baik untuk penderita diabetes, stabil dipanaskan sampai 2000C, stabil dalam asam,
dan tidak terfermentasi (Geuns, 2003).
Hasil penelitian toksisitas steviosida, menunjukkan tidak adanya efek
toksik yang muncul pada tikus dengan pemberian steviosida sampai 7% dari
makanan selama tiga bulan. Hasil penelitian jangka pendek juga menunjukkan
tidak adanya efek mutagenik ataupun genotoksik dari steviosida (Bakal and
Nabors, 1986).
Proses ekstraksi konvensional untuk mendapatkan ekstrak yang
mengandung glikosida steviol pada umumnya mengunakan metode yang sama
yaitu daun stevia diekstrak dengan air atau alkohol panas. Glikosida steviol
berupa serbuk putih kekuningan yang larut dalam air dan etanol (Kuznesof, 2007).
Pada penelitian sebelumnya diketahui bahwa kristal steviosida dapat diperoleh
3
melalui ekstraksi dengan etanol panas (Martono, Kristopo, Sihasale, 2007)
ataupun dengan ekstraksi dengan air panas (Matsushita, 1979). Perolehan kristal
yang dihasilkan pada penelitian Matsushita sebesar 7,5% sedangkan penelitian
Martono dkk hanya sebesar 0,97%. Perbedaan perolehan kristal yang jauh ini
belum menunjukkan bahwa air berperan lebih besar dalam penyarian steviosida.
Hal ini dapat dikarenakan perbedaan daun S. rebaudiana yang digunakan dalam
masing-masing penelitian. Menurut Lutony (1993) kandungan steviosida pada
daun S. rebaudiana di Jepang dapat mencapai 20% sedangkan di Indonesia
kurang dari 20 %. Selain itu juga dimungkinkan adanya perbedaan dalam proses
deklorofilasi dan kristalisasi yang dapat mempengaruhi perolehan kristal
steviosida sesudah proses ekstraksi.
Berdasarkan hasil recovery kristal kedua penelitian di atas dibandingkan
dengan kandungan steviosida yang terdapat dalam daun, dirasa perlu ditingkatkan
recovery kristal yang diperoleh. Proses awal dalam peningkatan recovery kristal
ini dengan cara meningkatkan jumlah steviosida yang tersari.
Langkah yang dapat dilakukan guna meningkatkan penyarian biasanya
digunakan campuran penyari antara etanol dan air. Perbandingan jumlah etanol
dan air tergantung pada bahan yang akan disari. Dari pustaka dapat ditelusuri
kandungannya baik zat aktif maupun zat lainnya sehingga dapat dilakukan
beberapa percobaan untuk mencari perbandingan pelarut yang tepat
(Anonim,1986).
Pada penelitian ini dilakukan optimasi volume etanol dan akuades
sebagai cairan penyari pada daun S. rebaudiana. Aplikasi desain faktorial
4
digunakan dalam penelitian ini sehingga dapat diketahui pengaruh dari masing-
masing penyari dan interaksinya serta volume cairan penyari yang optimum untuk
mendapatkan ekstrak dengan kadar steviosida tertinggi. Melalui metode ini dapat
dikurangi trial and error dalam percobaan jika dibandingkan dengan meneliti efek
faktor secara terpisah (Bolton,1997). Proses ekstraksi yang dilakukan pada
penelitian ini menggunakan perkolasi pada suhu 300C sehingga akan
meningkatkan efisiensi dari proses ekstraksi dengan mengurangi biaya
operasional bahan bakar yang dibutuhkan dibandingkan dengan kedua penelitian
sebelumnya yang menggunakan etanol ataupun air panas.
Diharapkan dengan ditemukannya area optimum cairan penyari akan
diperoleh batasan level dari faktor yang diteliti untuk mendapatkan ekstrak
dengan kandungan steviosida terbesar. Pemanfaatan teknologi pengolahan,
khususnya proses ekstraksi ini nantinya diharapkan dapat meningkatkan perolehan
kristal yang diperoleh sehingga juga dapat meningkatkan nilai ekonomis daun S.
rebaudiana serta pengembangannya sebagai bahan alternatif pemanis pengganti
gula yang alami.
1. Perumusan Masalah
Dari latar belakang di atas, masalah yang muncul dapat dirumuskan
sebagai berikut :
a. Manakah yang paling dominan antara etanol 96%, akuades, atau interaksi
keduanya dalam menentukan kadar steviosida yang tersari?
b. Apakah ditemukan area optimum cairan penyari untuk mendapatkan ekstrak
dengan kandungan steviosida terbesar (> 7%b/b) ?
5
2. Keaslian Penelitian
Sejauh penelusuran pustaka penulis, penelitian tentang optimasi volume
cairan penyari etanol dan akuades pada proses perkolasi daun S.rebaudiana
terhadap perbedaan kadar steviosida yang tersari dengan aplikasi desain faktorial
belum pernah dilakukan oleh peneliti lain.
3. Manfaat Penelitian
a. Manfaat Teoritis
Penelitian ini diharapkan dapat menambah khasanah ilmu
pengetahuan, khususnya dalam bidang kefarmasian sains teknologi mengenai
aplikasi desain faktorial pada proses perkolasi steviosida dari daun S.
rebaudiana.
b. Manfaat Praktis
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan data mengenai
pengaruh volume etanol dan akuades ataupun interaksinya dalam proses
perkolasi daun S. rebaudiana serta volume cairan penyari paling optimal
untuk mendapatkan ekstrak dengan kadar steviosida terbesar.
B. Tujuan Penelitian
1. Mengetahui pengaruh yang dominan antara etanol, akuades, ataupun interaksi
keduanya dalam menentukan kadar steviosida yang tersari.
2. Menemukan area optimum cairan penyari untuk mendapatkan ekstrak dengan
kandungan steviosida terbesar.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Stevia rebaudiana Bertonii M.
1. Uraian Tanaman
Stevia rebaudiana Bertonii M. merupakan salah satu anggota dari 154
jumlah spesies stevia dan salah satu dari hanya dua yang menghasilkan glikosida
steviol (Soejarto, Douglas, Farnsworth 1982). S. rebaudiana merupakan anggota
dari famili Compositae. Tanaman ini merupakan tanaman perenial bersemak kecil,
yang dapat tumbuh hingga ketinggian 65 cm. Percepatan pembungaan dari
tanaman ini setelah tumbuh minimal empat daun sejati telah dapat dilakukan.
Reproduksi dari gamet jantan dan betinanya mirip dengan angiospermae
angiosperms. Stevia adalah diploid dan mempunyai 11 pasang kromosom, yang
sebagian besar karakteristiknya dari anggota genus yang berasal dari Amerika
Selatan (Brandle and Rosa, 1992).
Tanaman ini merupakan tanaman asli dari daerah Rio Monday, dataran
tinggi di Paraguay. Tanaman ini dapat mencapai tinggi 80 cm saat semua bagian
matang. Stevia pertama kali dibawa ke daerah eropa pada tahun 1887 ketika M.S
Bertonii mempelajari karakteristik unik dari Indian dan Mestizos Paraguay
(Lewis, 1992). Daun dari S. rebaudiana ini digunakan sebagai agen pemanis yang
biasa digunakan. Sebuah usaha besar untuk membuat stevia sebagai hasil
pertanian di Jepang dimulai oleh Sumida (1968). Sejak saat itu, stevia mulai
dikenal sebagai hasil pertanian di beberapa negara diantaranya: Brazil, Korea,
6
7
Meksiko, Amerika Serikat, Indonesia, Tanzania, dan sejak tahun 1990 di Kanada
(Brandle and Rosa, 1992).
Gambar 1. Stevia rebaudiana Bertonii M.
2. Kegunaan
S. rebaudiana telah digunakan selama ratusan tahun sebagai pemanis
alami, dan sangat membantu dalam terapi diabetes. Tanaman ini juga mempunyai
efek pada tekanan darah, beraksi sebagai vasodilator pada binatang yang
mempunyai tekanan darah normal maupun hipertensi. Tanaman ini menurunkan
tekanan darah degan meningkatkan efek diuretik dan natriuretik pada tikus. S.
rebaudiana mempunyai aksi cardiotonik dengan cara menormalkan tekanan darah
dan mengatur detak jantung. Ekstrak S. rebaudiana merupakan bakterisidal
dengan spektrum luas termasuk diantaranya strain E. Coli. Steviol –aglikon
stevia- merupakan senyawa mutagenik bagi Salmonella sp dan bakteri lain dengan
berbagai kondisi, juga sangat efektif untuk membunuh Candida albicans. S.
rebaudiana juga berperan dalam membersihkan plak gigi. Dari paparan di atas
dapat dikatakan S. rebaudiana dapat digunakan sebagai bahan pemanis, penurun
tekanan darah, mempunyai efek hipoglikemik dan sebagai anti bakteri (Sapna,
Avinash, Mukul, Pathak, 2008).
8
3. Kandungan Kimia
S. rebaudiana spesies yang paling manis, mengandung seluruh glikosida di
daunnya, dan steviosida merupakan komponen yang paling banyak terkandung di
dalamnya (3% - 8% dari berat kering daunnya) (Melis, 1992). Kandungan
steviosida pada batang bervariasi antara 1,54-3,85 % (Megeji, Kumar, Singh,
Kaul, Ahuja, 2005). Rebaudiosida A merupakan kandungan pemanis terbesar
kedua setelah steviosida yaitu 30-40% dari total pemanis, dan merupakan senyawa
yang manis dengan tingkat kemanisan 180-400 kali kemanisan gula dan tidak
menimbulkan after taste (Midmore and Rank, 2002). Selain itu masih ada masih
ada rebaudiosida C (1-2%), dulcosida A & C, kumarin, asam sinamat,
fenilpropanoid, dan beberapa minyak atsiri (Midmore and Rank, 2002). Impurities
yang terdapat pada ekstrak daun stevia merupakan ciri khas dari material tanaman,
seperti pigmen dan sakarida. Senyawa - senyawa non fraksi glikosida dari ekstrak
daun stevia terdiri dari : spathulenol; asam dekanoat; 8,11,14- asam ecosatrienoic;
2-metiloktadekan; pentacosane; octacosane; stigmasterol; b-sitosterol; a- dan b-
amyrin; lupeol; b-amyrin asetat; dan pentasiklik triterpen. Senyawa-senyawa
tersebut merupakan substansi non polar mewakili 56% dari total ekstrak non
glikosida, 44% lainnya masih belum teridentifikasi (Kuznesof, 2007). Pada
tanaman stevia, minimal terdapat 95% dari total tujuh golongan glikosida steviol
(Kuznesof, 2007).
9
Gambar 2. Struktur glikosida steviol
Tabel I. Gugus gula glikosida steviol
Glikosida Diterpen R1 R2 Tingkat
Kemanisan
(Sukrosa = 1)
Steviosida Glu Glu - Glu 150 - 300
Rebausida Glu Glu 100 - 120
Steviolbiosida H Glu – Glu 100 - 125
Rebaudiosida A Glu Glu – Glu
Glu
250 - 450
Rebaudiosida B H Glu – Glu
Glu
300 - 350
Rebaudiosida C
(Dulkosida B)
Ram Glu – Ram
Glu
50 - 120
Rebaudiosida D Glu – Glu Glu – Glu
Glu
250 - 450
Rebaudiosida E Glu – Glu Glu – Glu 150 – 300
Dulkosida A Glu Glu – Ram 50 - 120
Glu = β-D-Glukopironasil Ram = α-L-Ramnopironasil (Mantovanelli dkk, 2004).
10
B. Glikosida
1. Umum
Glikosida adalah senyawa yang bila terhidrolisis menghasilkan molekul
gula (glikon) dan senyawa bukan gula (a-glikon). Ikatan antara gikon dan aglikon
dapat berupa atom O, S, N, dan C, sehingga terdapat empat macam ikatan antara
glikon dan aglikon dalam glikosida, yaitu ikatan O-heterosid, ikatan S-heterosid,
ikatan N-heterosid, ikatan C-heterosid (Mursyidi, 1990). Pembagian glikosida
berdasarkan aglikonnya : golongan antrakinon, golongan saponin, golongan
sianofor, golongan tiosianat, golongan flavonol, golongan alkohol, golongan
aldehid, golongan lakton, golongan fenol, golongan lain dan senyawa nitrat,
golongan kardioaktif (Mursyidi, 1990).
Glikosida pada umumnya adalah larut baik dalam air dan etanol, dalam
bahan pelarut seperti eter, kloroform, benzen, tidak larut. Asam encer dan basa
encer, dan seringkali pemanasan suatu larutan dalam air menyebabkan pemisahan
glikosida (Voigt, 1994).
2. Diterpen
Terpen merupakan senyawa hasil kondensasi linier asam asetat dengan
dua atom karbon. Asam asetat melalui berbagai cara akan menjadi asam malonat
yang akhirnya menjadi beberapa senyawa terpen. Terpen merupakan senyawa
hidrokarbon jenuh atau tak jenuh dengan jumlah atom C merupakan kelipatan
lima. Selanjutnya senyawa terpen digolongkan atas dasar jumlah atom C
penyusunnya. Istilah terpen diganti dengan terpenoid mengingat senyawa
hidrokarbon tersebut mempunyai gugus fungsional yang mengandung atom O,
11
dan diketahui bahwa biosintetik terpenoid merupakan polimerisasi senyawa
isopren. Terpenoid bisa digolongkan menjadi :
a. Monoterpenoid dengan jumlah atom C = 10
b. Seskuiterpenoid dengan jumlah atom C =15
c. Diterpenoid dengan jumlah atom C = 20
d. Sesterpenoid dengan jumlah atom C = 25
e. Triterpenoid dengan jumlah atom C = 30
f. Tetraterpenoid dengan jumlah atom C = 40 (Mursyidi, 1990).
C. Steviosida
Steviosida merupakan pemanis utama (60-70%) dari pemanis total dalam
Stevia sp, dan diketahui mempunyai tingkat kemanisan 110-270 kali kemanisan
gula. Steviosida inilah yang bertanggung jawab terhadap after taste yang
seringkali dilaporkan (licorice after taste) (Midmore and Rank, 2002). Ekstrak
stevia mengandung persentase besar glikosida diterpen steviol, steviosida dan
rebaudiosida A (Kuznesof, 2007).
Gambar 3. Struktur kimia steviosida (Nanayakkara et al., 1987).
12
Larutan steviosida pada rentang pH 3-9 dengan suhu 1000C selama 1
jam tidak menunjukkan penurunan kadar yang signifikan. Steviosida
dipertimbangkan mengalami dekomposisi pada pH 10. Penelitian lain
menunjukkan steviosida sangat stabil dalam larutan asam dan dengan adanya
garam. Steviosida tidak berinteraksi dengan bahan makanan dan tidak
menyebabkan browning. Selain itu steviosida juga tidak terfermentasi sehingga
tidak kariogenik (Bakal and Nabors, 1986).
D. Penyarian
Penyarian adalah kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang
tidak dapat larut dengan pelarut cair. Simplisia yang disari mengandung zat aktif
yang dapat larut dan zat yang tidak dapat larut seperti serat, karbohidrat, protein,
dan lain-lain (Anonim,1986). Proses penyarian dapat dipisahkan menjadi :
pembuatan serbuk, pembasahan, penyarian dan pemekatan (Anonim,1986).
Pada umumnya penyarian akan bertambah baik bila permukaan serbuk
simplisia yang bersentuhan dengan cairan penyari makin luas. Tetapi dalam
pelaksanaannya tidak selalu demikian, karena penyarian masih tergantung juga
pada sifat fisik dan kimia simplisia yang bersangkutan (Anonim,1986).
Pembasahan serbuk sebelum dilakukan penyarian dimaksudkan untuk
memberikan kesempatan sebesar-besarnya kepada cairan penyari memasuki
seluruh pori-pori dalam simplisia sehingga mempermudah penyarian selanjutnya
(Anonim,1986).
13
Pada dasarnya proses ekstraksi dibedakan menjadi dua fase:
Fase pencucian. Pada penyatuan cairan ekstraksi dengan material
simplisia maka sel-sel yang dirusak atau terusakkan dengan operasi penghalusan
langsung kontak dengan bahan pelarut. Komponen sel yang terdapat di sini
dengan lebih mudah dapat diambil atau dicuci. Dalam fase pertama ekstraksi ini,
sebagian bahan aktif akan tiba-tiba berpindah ke dalam bahan pelarut. Semakin
halus serbuk simplisia, maka semakin optimal jalannya proses pencucian simplisia
(Voigt, 1994).
Fase ekstraksi. Yang lebih kompleks adalah peristiwa selanjutnya, yaitu
fase ekstraksi karena untuk melarutkan komponen dalam sel yang tidak terluka
bahan pelarut harus mendesak masuk ke dalamnya. Membran sel yang mengering
dan menciut yang terdapat dalam simplisia mula-mula harus dirubah dalam suatu
keadaan, yang memungkinkan suatu pelintasan bahan pelarut ke dalam bagian sel.
Hal itu terjadi melalui pembengkakan, dengan demikian membran mengalami
suatu pembengkakan volume melalui pengambilan molekul bahan pelarut.
Kemampuan mengikat dari zat perancah terhadap molekul cairan, menyebabkan
struktur perancak tersebut menjadi longgar, sehingga terbentuk ruang
antarmiselar, yang memungkinkan bahan ekstraksi mencapai ke dalam ruang
dalam sel. Peristiwa pembengkakan ini dalam skala tinggi disebabkan oleh air
(Voigt, 1994).
Mengalirnya bahan pelarut ke dalam ruang sel juga mengakibatkan
protoplasma membengkak, dan bahan kandungan dalam sel akan terlarut sesuai
dengan kelarutannya. Mereka berpindah sejauh mereka terlarut molekuler,
14
mengikuti difusi melalui ruang antarmiselar. Gaya yang bekerja adalah gaya difusi
melalui adanya perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan cairan
ekstraksi yang mula-mula masih tanpa bahan aktif. Bahan kandungan sel akan
mencapai ke dalam cairan di sebelah luar selama difusi melintasi melintasi
membran sampai terbentuknya suatu keseimbangan konsentrasi antara larutan di
sebelah dalam dan di sebelah luar sel (Voigt, 1994).
Penyarian dipengaruhi oleh :
a. Derajat kehalusan serbuk
b. Perbedaan konsentrasi yang terdapat mulai dari pusat serbuk simplisia sampai
ke permukaannya, maupun pada perbedaan konsentrasi yang terdapat pada lapisan
batas, sehingga suatu titik akan dicapai, oleh zat-zat yang tersari jika ada daya
dorong yang cukup untuk melanjutkan perpindahan massa (Anonim,1986).
Jenis ekstraksi mana dan bahan ekstraksi mana (cairan ekstraksi,
menstruum) yang digunakan, terutama tergantung dari kelarutan bahan kandungan
serta stabilitasnya. Oleh karena banyak bahan tumbuhan larut alkohol, maka air
atau etanol lebih disukai penggunaannya sebagai cairan pengekstraksi (Voigt,
1994).
Ekstrak adalah sediaaan kering, kental, atau cair dibuat dengan menyari
simplisia atau nabati menurut cara yang cocok, diluar pengaruh cahaya matahari
secara langsung (Anonim, 1979).
E. Perkolasi
Perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan
cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Serbuk simplisia
15
ditempatkan dalam suatu bejana silinder yang bagian bawahnya diberi sekat
berpori. Cairan penyari dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk tersebut,
cairan penyari akan melarutkan zat aktif sel-sel yang dilalui sampai keadaaan
jenuh (Anonim, 1986).
Prinsip perkolasi adalah sebagai berikut : serbuk simplisia ditempatkan
dalam suatu bejana silinder yang bagian bawahnya diberi sekat berpori. Cairan
penyari dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk tersebut, cairan penyari akan
melarutkan zat aktif sel-sel yang dilalui sampai mencapai keadaan jenuh. Gerak
ke bawah disebabkan oleh kekuatan gaya beratnya sendiri dan cairan di atasnya
dikurangi dengan daya kapiler yang cenderung untuk menahan. Kekuatan yang
berperan pada perkolasi antara lain : gaya berat, kekentalan, daya larut, tegangan
permukaan, difusi osmosa, adhesi, daya kapiler, dan daya geseran (friksi)
(Anonim, 1986).
Alat yang digunakan untuk perkolasi disebut perkolator, cairan yang
digunakan untuk perkolasi disebut cairan menstrum, larutan yang keluar dari
perkolator disebut sari atau perkolat sedangkan sisa setelah dilakukannya
penyarian disebut ampas atau sisa perkolasi (Anonim, 1986).
Serbuk simplisia yang akan diperkolasi tidak langsung dimasukkan ke
dalam bejana perkolator, tetapi dibasahi atau dimaserasi terlebih dahulu dengan
cairan penyari. Maserasi dilakukan dalam bejana tertutup (Anonim, 1986).
Setelah maserasi, massa dimasukkan ke dalam perkolator. Pemindahan
dilakukan sedikit-demi sedikit untuk mengatur kecepatan pengaliran cairan
penyari. Bila ada kekhawatiran bahwa aliran cairan penyari terlalu cepat, hingga
16
zat aktif tidak tersari sempurna maka penekanan dapat dilakukan dengan agak
kuat. Sebaiknya bila perkolat tidak menetes, berarti massa terlalu padat atau
serbuk simplisia terlalu halus. Bila hal ini terjadi, isi perkolator harus dibongkar,
dan kemudian dimasukkan kembali dengan penekanan yang agak longgar
(Anonim, 1986).
Cairan penyari dituangkan perlahan-lahan hingga di atas permukaan
massa masih tergenang dengan cairan penyari. Cairan penyari harus selalu
ditambahkan sehingga terjaga adanya lapisan cairan penyari di atas permukaan
massa (Anonim, 1986).
Keran diatur sehingga kecepatan menetes 1ml tiap menit. Jika penetesan
terlalu cepat, penyarian tidak sempurna, sebaliknya penetesan terlalu lambat akan
membuang waktu dan kemungkinan menguap lebih besar (Anonim, 1986).
Untuk menentukan akhir perkolasi dapat dilakukan pemeriksaan zat aktif
secara kualitatif pada perkolat terakhir (Anonim, 1986).
Cara perkolasi lebih baik daripada dengan cara maserasi, karena aliran
penyari menyebabkan adanya pergantian larutan yang terjadi dengan larutan yang
konsentrasinya lebih rendah, sehingga meningkatkan derajat perbedaaan
konsentrasi, ruangan diantara butir-butir serbuk simplisia membentuk saluran
tempat mengalir cairan penyari. Karena kecilnya saluran pipa kapiler tersebut,
maka kecepatan pelarut cukup untuk mengurangi lapisan batas, sehingga dapat
meningkatkan perbedaan konsentrasi (Anonim, 1986).
17
F. Sokhletasi
Bahan yang akan diekstraksi berada dalam sebuah kantung ekstraksi
(kertas, karton dan sebagainya) di dalam sebuah alat ekstraksi dari gelas yang
bekerja kontinu (perkolator). Wadah gelas yang mengandung kantung diletakkan
di antara labu suling dan suatu pendingin aliran balik dan dihubungkan dengan
melalui pipa pipet (Voigt, 1994).
Uap cairan penyari naik ke atas melalui pipa samping, kemudian
diembunkan kembali oleh pendingin tegak. Cairan turun ke labu melalui tabung
yang berisi serbuk simplisia. Cairan penyari sambil turun melarutkan zat aktif
serbuk simplisia. Karena adanya sifon maka setelah cairan mencapai permukaan
sifon, seluruh cairan akan kembali ke labu. Cara ini lebih menguntungkan karena
uap panas tidak melalui serbuk simplisia, tetapi melalui pipa samping (Anonim,
1986).
G. Pengeringan
Tujuan pengeringan adalah mendapatkan simplisia yang tidak mudah
rusak, sehingga dapat disimpan dalam waktu yang lama. Caranya dengan
mengurangi kadar air. Air yang masih tersisa dalam simplisia pada kadar tertentu
dapat merupakan media pertumbuhan kapang dan jasad renik lainnya. Enzim
tertentu dalam sel masih dapat bekerja, menguraikan senyawa aktif sesaat setelah
sel mati dan selama bahan simplisia tersebut masih mengandung air tertentu
(Anonim, 1985).
Dari hasil penelitian diketahui bahwa reaksi enzimatis tidak berlangsung
bila kadar air dalam simplisia kurang dari 10%, dengan demikian proses
18
pengeringan sudah dapat menghentikan proses enzimatik dalam sel bila kadar
airnya mencapai kurang dari 10%. Penghentian reaksi peruraian enzimatik akan
mencegah penurunan mutu atau perusakan simplisia (Anonim, 1985).
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam proses pengeringan adalah suhu
pengeringan, kelembaban udara, waktu pengeringan, dan luas permukaan bahan.
Suhu pengeringan tergantung dari bahan simplisia dan cara pengeringannya.
Bahan simplisia yang dikeringkan pada suhu 30-900C, tetapi suhu yang terbaik
adalah tidak melebihi 600C (Anonim, 1985).
Berbagai cara pengeringan telah dikenal dan digunakan orang. Pada
dasarnya dikenal dua macam pengeringan, yaitu pengeringan alamiah dengan
menggunakan sinar matahari secara langsung, dan yang satu dengan diangin-
anginkan. Selain pengeringan alamiah ada juga pengeringan buatan yaitu dengan
merancang suatu alat pengering sederhana, praktis, dan murah dengan hasil yang
cukup baik. Proses pengeringan diharapkan terkontrol untuk mencegah dan
menghindari perubahan kimia karena panas sinar matahari yang mengandung
sinar ultraviolet ( Anonim, 1985).
H. Desain Faktorial
Metode factorial design adalah sistem desain eksperimental dimana
faktor-faktor yang terlibat dalam suatu reaksi atau proses dapat dievaluasi secara
simultan dan mengukur efek dari faktor-faktor tersebut. Teknik ini bisa diterapkan
dalam masalah farmasi, dan menjadi dasar bagi berbagai macam percobaan atau
penelitian untuk mencari pemecahan yang optimum (Armstrong dan James,
1996).
19
Factorial design sederhana salah satunya adalah dengan dua faktor pada
dua level (rendah dan tinggi). Hal ini berarti ada dua faktor yang masing-masing
faktor diuji pada dua level yang berbeda, yaitu pada level rendah dan tinggi
(Bolton, 1990).
Optimasi campuran dua bahan (berarti ada dua faktor) dengan desain
faktorial (two level factorial design) dilakukan berdasarkan:
Y = bo + b1X1 + b2X2 + b12X1X2Dengan: Y = respon hasil atau sifat yang diamati
X1, X2 = level bagian A, level bagian B bo, b1, b2, b12 = koefisien dapat dihitung dari hasil percobaaan bo = rata-rata hasil semua percobaan b1, b2, b12 = koefisien yang dihitung dari hasil percobaan
Pada desain faktorial dua level dan dua faktor diperlukan empat
percobaan (2n=4, dengan 2 menunjukkan level dan n menunjukkan jumlah faktor).
Penamaan formula untuk 4 percobaan adalah formula (1) untuk percobaan I,
formula a untuk percobaan II, formula b untuk percobaan III, dan formula ab
untuk percobaan IV (Bolton, 1990)
Rancangan percobaan desain faktorial sebagai berikut: Tabel II. Rancangan percobaan desain faktorial dengan dua
faktor dan dua level
Percobaan Faktor A Faktor B Interaksi
1 - - +
a + - -
b - + -
ab + + +
Keterangan: (-) = level rendah (+) = level tinggi Percobaan(1) = faktor A level rendah, faktor B rendah
Percobaan a = faktor A level tinggi, faktor B rendah
20
Percobaan b = faktor A level rendah, faktor B tinggi
Percobaan ab = faktor A level tinggi, faktor B tinggi (Bolton, 1997).
Efek masing-masing faktor dan interaksinya dapat dihitung sebagai rata-
rata selisih antara respon pada level rendah dengan respon pada level tinggi. Efek
dan interaksi faktor yang diteliti dapat dirumuskan menjadi persamaan berikut:
Efek faktor A= ((a-(1)) + (ab-b)) / 2
Efek faktor B = ((b-(1)) + (ab-a)) / 2
Interaksi = ((ab-b)) + ((1)-a) / 2 (Bolton, 1997).
Desain faktorial memiliki beberapa keuntungan. Metode ini memiliki
efisiensi yang maksimum untuk memperkirakan efek yang dominan dalam
menentukan respon. Keuntungan utama desain faktorial adalah bahwa metode ini
memungkinkan untuk mengidentifikasi efek masing-masing faktor, maupun efek
interaksi antar faktor. Metode ini ekonomis, dapat mengurangi jumlah penelitian
jika dibandingkan dengan meneliti dua efek faktor secara terpisah (Bolton, 1997).
I. KLT
Kromatografi lapis tipis ialah metode pemisahan fisikokimia. Lapisan
yang memisahkan, yang terdiri atas bahan berbutir-butir (fase diam), ditempatkan
pada penyangga yang berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok.
Campuran yang akan dipisahkan berupa larutan, ditotolkan berupa bercak atau
pita (awal). Setelah pelat atau lapisan ditaruh di dalam bejana tertutup rapat yang
berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak), pemisahan terjadi selama
perambatan kapiler (pengembangan). Selanjutnya senyawa yang tidak berwarna
harus ditampakkan (dideteksi) (Stahl, 1985).
21
Fase diam dibuat dari salah satu penjerap yang khusus digunakan untuk
KLT yang dihasilkan oleh berbagai perusahaan. Panjang lapisan tersebut 200 mm
dengan lebar 200 atau 100 mm. Untuk analisis, tebalnya 0,1-0,3 mm, biasanya 0,2
mm. Sebelum digunakan, lapisan disimpan dalam lingkungan yang tidak lembab
atau bebas dari uap laboratorium (Stahl, 1985).
Fase gerak ialah medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa
pelarut. Pelarut bergerak di dalam fase diam, yaitu suatu lapisan berpori, karena
ada gaya kapiler. Pelarut yang digunakan hanyalah bertingkat mutu analitik dan
bila diperlukan, sistem pelarut multikomponen ini harus berupa suatu campuran
sesederhana mungkin yang terdiri atas maksimum tiga komponen. Pada
kromatografi jerap, pelarut pengembang dapat dikelompokkan ke dalam deret
eluotropik berdasarkan sifat elusinya. Misalnya, heksana nonpolar mempunyai
efek elusi lemah, kloroform cukup kuat, dan metanol yang polar efek elusinya
kuat. Tetapan dielektrik memberi informasi mengenai kepolaran suatu senyawa.
Laju rambat tergantung kepada viskositas pelarut dan tentu juga kepada struktur
lapisan (misalnya butiran penjerap) (Stahl, 1985).
Fase gerak dapat berupa hampir segala macam pelarut atau campuran
pelarut. Silika gel merupakan fase diam yang paling banyak digunakan dalam
KLT. Material ini dapat langsung digunakan atau dicampur dengan pengikat
misalnya kalsium sulfat untuk membuat lapisan yang lebih kohesif. Bila
digunakan pengikat CaSO4 maka pada namanya diberi tanda G, misalnya silika
gel G, dan bila dicampur dengan indikator fluoresensi diberi tanda F, misalnya
silika gel GF (Stahl,1985).
22
Sistem pelarut untuk KLT dapat dipilih dari pustaka, tapi lebih sering
kita mencoba-coba saja karena waktu yang diperlukan sebentar. Sistem yang
paling sederhana adalah campuran pelarut organik yang dipakai untuk
memisahkan molekul yang mempunyai satu dan atau dua gugus fungsi. Pelarut
diotak – atik terutama dengan mengubah – ubahnya dan mencampurnya agar
diperoleh kepolaran yang tepat untuk pemisahan tertentu, biasanya dengan
menggunakan deret eluotropi sebagai pedoman. Tiga faktor yang harus kita ingat
ketika mencampur pelarut untuk membuat pengembang campuran. Faktor pertama
ialah bahwa hanya pelarut yang mempunyai kepolaran yang serupa yang dapat
dicampur. Faktor kedua ialah bahwa kepolaran campuran tidak merupakan fungsi
linier dari susunan campuran tetapi merupakan fungsi logaritma. Akhirnya, harus
diingat bahwa kita dapat memakai landaian antara dua pelarut pada beberapa
metode (Gritter, 1991).
Penotolan dimulai 1,5 cm dari tepi pelat bagian bawah, jarak antara 2
totolan 1cm dan diameter totolan 2-5mm. Sampel ditotolkan pada pelat yang
sudah dilapisi dengan menggunakan mikropipet atau syringe dengan volume
penotolan 1-5µl (Gritter, 1991).
Pengembangan merupakan proses pemisahan campuran cuplikan akibat
pelarut pengembang merambat naik dalam lapisan. Jarak pengembangan normal
yaitu jarak antara mulai penotolan dan hingga batas perambatan adalah 10 cm. Di
samping larutan cuplikan selalu ada larutan pembanding yang dikromatografi
pada saat bersamaan. Campuran ini terdiri dari 1-5 senyawa yang diketahui
dengan konsentrasi yang diketahui pula (Gritter, 1991).
23
KLT merupakan metode fisikokimia, artinya pada saat pendeteksian
lokasi bercak dari komponen yang terpisah yang tidak berwarna umumnya
dilakukan dengan cara fisika dan kimia. Cara fisika yaitu dengan melihat senyawa
berfluoresensi di bawah lampu UV atau melihat senyawa tidak berfluoresensi
dengan latar belakang berfluoresensi. Adapun cara kimia yaitu dilakukan
penyemprotan dengan substansi kimia yang akan memberikan noda atau bercak
baik yang terlihat pada cahaya tampak ataupun sebagai noda yang tampak pada
lampu ultraviolet (Hardjono, 1983).
Deteksi paling sederhana adalah jika senyawa menunjukkan penyerapan
di daerah UV gelombang pendek ( radiasi utama kira-kira 254 nm) atau jika
senyawa ini dapat dieksitasi ke fluoresensi radiasi UV gelombang pendek dan atau
gelombang panjang (365 nm). Jika dengan kedua cara ini senyawa tidak dapat
dideteksi maka harus dicoba dengan reaksi kimia. Pertama tanpa pemanasan lalu
bila perlu dengan pemanasan (Stahl, 1985).
Jarak pengembangan pada senyawa pada kromatogram biasanya
dinyatakan dengan angka Rf atau hRf
Rf = Jarak titik pusat bercak dari penotolan Jarak rambat fase gerak
Angka Rf berjarak antara 0,00 dan 1,00 dan hanya dapat ditentukan dua
desimal. hRf ialah angka Rf dikalikan faktor 100 (Stahl, 1985).
24
J. Image-J
Image J adalah suatu software Java yang digunakan untuk memproses
suatu gambar yang dirancang untuk memproses dan menganalisis suatu gambar,
seperti gambar sel secara 3 dimensi, gambar radiological, atau sistem multi
gambar perbandingan sistem hemologi. Image J dirancang dan dibuat menjadi
program yang lebih mudah dipahami dan digunakan untuk proses mempelajari
suatu gambar. Image J dapat digunakan untuk menghitung area, statistik, nilai
pixel dan intensitas dari suatu objek gambar, seperti penggunaan KLT
densitometer (Anonim, 2008). Lempeng KLT yang telah dielusi kemudian
dihitung intensitas bercaknya menggunakan program Image J (Zeligs and
Bradlow, 2006).
K. Landasan Teori
Sebagian besar literatur mengekstrak tanaman S. rebaudiana dengan air
atau alkohol (etanol atau metanol) panas. Penyarian dengan campuran air dan
etanol ini biasanya digunakan untuk meningkatkan penyarian. Perbandingan
antara jumlah etanol dan air yang digunakan untuk penyarian tergantung pada
bahan yang akan disari.
Cara penyarian simplisia dapat dibedakan menjadi infudasi, maserasi,
perkolasi dan penyarian berkesinambungan. Penyarian dengan campuran air dan
etanol dilakukan dengan cara maserasi atau perkolasi. Penyarian dengan perkolasi
umumnya dapat memberikan hasil penyarian yang lebih baik dibandingkan
maserasi. Hal ini dikarenakan adanya aliran cairan penyari menyebabkan
konsentrasi yang lebih rendah sehingga dapat meningkatkan derajat perbedaan
25
konsentrasi. Pada maserasi, penyarian yang terjadi tidak maksimal dikarenakan
adanya keseimbangan konsentrasi antara cairan penyari dengan sel simplisia.
Steviosida merupakan senyawa glikosida diterpen steviol yang
merupakan kandungan utama dalam daun S. rebaudiana. Glikosida steviol
merupakan golongan senyawa yang larut dalam air maupun etanol.
Proses penyarian steviosida secara perkolasi menggunakan campuran
etanol dan air ini diharapkan dapat meningkatkan kadar steviosida yang tersari.
Digunakan variasi volume etanol dan air dalam proses penyarian sehingga melalui
desain faktorial dapat diketahui faktor mana yang paling berpengaruh dalam
menentukan kadar steviosida, serta volume cairan penyari optimum untuk
mendapatkan ekstrak dengan kadar steviosida terbesar.
L. Hipotesis
Hi(1) : kadar steviosida yang didapatkan melalui perkolasi daun S.rebaudiana
menggunakan volume etanol level rendah berbeda dengan volume etanol
level tinggi.
Hi(2) : kadar steviosida yang didapatkan melalui perkolasi daun S.rebaudiana
menggunakan volume akuades level rendah berbeda dengan volume
akuades level tinggi.
Hi(3) : ada interaksi antara volume etanol dan volume akuades dalam menentukan
respon kadar steviosida pada perkolasi daun S.rebaudiana.
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk dalam penelitian eksperimental murni karena
adanya intervensi atau perlakuan terhadap subyek uji, dengan desain penelitian
secara desain faktorial.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Klasifikasi Variabel
a. Variabel Bebas
Volume etanol dan akuades masing-masing 150 ml dan 375 ml.
b. Variabel Tergantung
Kadar steviosida yang tersari dari daun S. rebaudiana.
c. Variabel Pengacau Terkendali
1) Suhu sokhlet diatur pada rentang 640C – 650C.
2) Suhu ekstraksi menggunakan 300C
d. Variabel Pengacau Tak Terkendali
Lama dan proses pengeringan simplisia setelah dipanen.
2. Definisi Operasional
a. Perkolasi merupakan suatu metode ekstraksi menggunakan variasi jumlah
pelarut etanol dan akuades dengan perkolator yang telah dimodifikasi
menggunakan pemanas dengan suhu 300C, kecepatan tetesan 1ml/menit.
26
27
b. Ekstrak Steviosida merupakan ekstrak cair yang didapatkan secara
perkolasi 300C dengan variasi volume etanol dan akuades yang berasal
dari serbuk daun S. rebaudiana.
c. Etanol yang dimaksud dalam penelitian ini adalah etanol 96 %
d. Air yang dimaksud dalam penelitian ini adalah akuades
e. Respon adalah besaran yang akan diamati perubahan efeknya, besarnya
dapat dikuantitatifkan. Dalam penelitian ini, respon yang dimaksud adalah
banyaknya steviosida.
f. Efek adalah perubahan respon yang disebabkan variasi level dan faktor.
g. Area optimum adalah area dimana variasi volume etanol dan akuades
menghasilkan ekstrak dengan kadar steviosida >7% b/b dari bobot serbuk
kering daun S. rebaudiana.
h. Steviosida yang dimaksud dalam penelitian ini adalah steviosida yang
setara dengan baku steviosida (99,2% assay dengan HPLC BM 804,87
Wako Jepang).
i. Penetapan kadar steviosida dengan menghitung luas area di bawah kurva
(AUC) bercak pada lempeng KLT dengan program Image J.
C. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: simplisia daun S.
rebaudiana yang diperoleh dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan
Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TO2T) Tawangmangu, baku steviosida
dari Wako Jepang serial number 196-8131 kandungan 99,2%, heksan teknis,
etanol 96% teknis, akuades, lempeng Silika Gel GF 254 precoated (E. Merck),
28
kloroform p.a., metanol p.a., akuabides, pereaksi semprot KI, pereaksi semprot
vanilin-asam sulfat.
D. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas,
grinder, ayakan mesh 50, oven, lemari es, sokhlet, seperangkat alat perkolasi,
perangkat KLT, neraca analitik (Precision Balance, model GB-3002, Melter
Todelo), hot plate magnetic stirer merk Cenco Instrument, pipet kapiler 1 µl merk
Einmal-Mikropipetten, lampu UV 254 nm, chamber, scanner, program Image J.
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi Tanaman S. rebaudiana
Determinasi Tanaman S. rebaudiana dilakukan oleh Balai Besar Penelitian
dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TO2T)
menurut Backer (1968).
2. Pembuatan serbuk simplisia S. rebaudiana
a. Pengumpulan bahan
Penelitian ini menggunakan simplisia daun S. rebaudiana yang diperoleh
dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tananaman Obat dan Obat
Tradisional (B2P2TO2T).
b. Sortasi Kering
Sortasi kering dilakukan dengan cara memisahkan daun S. rebaudiana dari
batang, bunga, ranting dan juga pengotor lain yang masih tertinggal
sehingga hanya didapatkan daun saja.
29
c. Pembuatan serbuk
Daun tanaman S. rebaudiana hasil sortasi yang telah dioven selama satu
hari, diserbuk menggunakan grinder (mesin penyerbuk). Kemudian serbuk
diayak dengan ayakan nomor mesh 50. Proses pengayakan untuk setiap
500 gram serbuk berlangsung selama 5 menit hingga diperoleh derajat
kehalusan serbuk yang dikehendaki.
3. Pembuatan Ekstrak Tanaman S. rebaudiana
a. Defatisasi serbuk simplisia
Lima puluh gram daun S. rebaudiana yang telah halus, dipisahkan dari
senyawa – senyawa non polar menggunakan pelarut heksan sejumlah
volume 2 kali sirkulasi dengan alat soklet. Sokletasi ini dilakukan selama
2 x 8 jam, dengan jumlah sirkulasi 3 – 4 kali per 10 menit pada suhu
640C – 650C. Simpan residu sampel dalam oven suhu 400C. Setelah
kering residu sampel kemudian siap untuk diekstraksi.
b. Ekstraksi serbuk simplisia secara perkolasi dengan adanya variasi
volume etanol dan akuades
Tiga puluh gram serbuk daun S. rebaudiana dibasahi dengan larutan
penyari terlebih dahulu kemudian dimasukkan ke dalam bejana tertutup
selama 3 jam. Massa tersebut kemudian dipindahkan sedikit demi sedikit
ke dalam perkolator sambil tiap kali ditekan hati–hati. Selanjutnya
dituangi dengan cairan penyari secukupnya sampai cairan mulai menetes
dan diatas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari. Kemudian
perkolator ditutup dan dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 ml/menit
30
serta ditambahkan berulang–ulang cairan penyari secukupnya sehingga
selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia dan diatur suhu
perkolator sesuai yang diinginkan yaitu 300C. Digunakan variasi volume
pelarut etanol dan akuades seperti pada tabel III:
Tabel III. Perbandingan volume etanol dan akuades yang digunakan pada perkolasi
Percobaan Etanol 96 % (ml) Akuades (ml) (1) 150 150 a 150 375 b 375 150 ab 375 375
Proses perkolasi dihentikan setelah didapatkan ekstrak dengan volume total sesuai
desain percobaan. Replikasi dilakukan sebanyak 2 kali.
4. Analisis Kualitatif Steviosida
Analisis kualitatif kandungan steviosida dilakukan dengan KLT
menggunakan fase diam Silika Gel F254 dan fase geraknya kloroform:
metanol: akuabides (10:15:2). Pengelusian dilakukan sepanjang 15 cm.
Pendeteksian bercak yang diamati menggunakan lampu UV 254 nm. Pelat
KLT tersebut kemudian disemprot dengan pereaksi KI dan vanilin-asam
sulfat kemudian dipanaskan di atas hotplate hingga terbentuk spot
kehitaman.
31
5. Analisis Kuantitatif Steviosida
a. Pembuatan larutan standar steviosida 2 mg/ml
Larutan standar steviosida 2 mg/ml dibuat dengan menimbang kurang
lebih seksama 10 mg baku steviosida dan dilarutkan dengan akuabides
sampai 5 ml.
c. Pembuatan kurva baku
Larutan standar steviosida (2 mg/ml) ditotolkan pada lempeng Silika Gel
F254 dengan pipa mikro kapiler, dengan jumlah totolan masing-masing
1µl, 2µl, 3µl, 4µl, 5µl, 6µl, dan 7µl dimana masing-masing totolan
tersebut mengandung seri jumlah standar steviosida sebanyak 2µg, 4µg,
6µg, 8µg, 10µg, 12µg, dan 14µg. Kemudian dielusi dengan fase gerak
kloroform : metanol : akuabides (10:15:2). Selanjutnya dilakukan
pengukuran luas area di bawah kurva (AUC) bercak menggunakan
program Image J. Kemudian ditentukan persamaan kurva baku y = Bx +
A antara seri baku dengan luas area.
d. Penetapan kadar steviosida dalam ekstrak S. rebaudiana dengan
program Image J
Pemisahan dilakukan dengan KLT dengan fase diam Silika Gel F254 dan
fase geraknya kloroform:methanol: akuabides (10:15:2). Larutan sampel
ditotolkan pada pelat dengan pipa mikro kapiler sebanyak 3µl, kemudian
dielusi dengan jarak elusi 15 cm dengan batas bawah 2 cm.
32
Kadar steviosida diketahui dengan memasukkan luas area di bawah
kurva (AUC) bercak yang ditetapkan pada Image J sebagai nilai Y
dalam persamaan kurva baku.
6. Analisis Hasil
a. Analisis hasil kadar steviosida dengan desain faktorial
Berdasarkan respon tiap kombinasi dapat diperoleh persamaan desain
faktorial :
Y = b0 + b1XA + b2XB + b12XAXB
Keterangan :
Y = respon hasil percobaaan/sifat yang diamati, dalam hal ini
kadar steviosida
XA = faktor pertama, dalam hal ini etanol 96%
XB = faktor kedua, dalam hal ini akuades
b0, b1, b2, b12 = koefisien yang dapat dihitung berdasarkan hasil
percobaan
Dari persaamaan desain faktorial dapat dibuat suatu profil kadar
steviosida dengan adanya variasi volume etanol dan akuades yang digunakan.
Kemudian dapat dihitung besarnya efek etanol, efek akuades maupun interaksi
yang dihasilkan.
b. Yate’s Treatment
Data kuantitatif kadar steviosida perkolat tanaman S. rebaudiana yang
diperoleh dianalisis menggunakan Yate’s Treatment dengan taraf kepercayaan
33
95% untuk melihat signifikansi dari tiap faktor dan interaksinya dalam
mempengaruhi respon kadar steviosida.
Sebelumya ditentukan terlebih dahulu, hipotesis alternatif (Hi) yang
menyatakan respon kadar steviosida faktor level rendah berbeda dengan respon
kadar steviosida faktor level tinggi dan ada interaksi antara faktor dalam
mempengaruhi respon, sedangkan H0 merupakan negasi dari Hi yang menyatakan
respon kadar steviosida faktor level rendah tidak berbeda dengan respon kadar
steviosida faktor level tinggi dan tidak ada interaksi antara faktor dalam
mempengaruhi respon. Hi diterima dan H0 ditolak bila harga F hitung lebih besar
dari F tabel. F tabel diperoleh dari Fα (numerator, denominator) dengan taraf
kepercayaan 95 %. Derajat bebas dan interaksi sebagai numerator yaitu 1, dan
derajat bebas experimental error sebagai denomimator yaitu 3, sehingga diperoleh
harga F tabel untuk interaksi pada semua respon adalah F0,05(1,3) = 10,128
Area kadar steviosida yang terbesar (>7% b/b) dapat diperoleh dari
contour plot antara volume etanol dengan volume akuades.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman dilakukan untuk mendapatkan kepastian akan
kebenaran tanaman yang diselidiki sesuai dengan yang dimaksud dalam
penelitian. Determinasi dilakukan dengan mencocokkan tanda serta ciri-ciri yang
ada pada tanaman dengan kunci determinasi yang ada dalam buku acuan.
Determinasi tanaman stevia ini dilakukan oleh Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Tananaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TO2T) menurut
Backer (1968).
Berdasarkan hasil determinasi yang dilakukan di Balai Besar Penelitian
dan Pengembangan Tananaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TO2T)
Tawangmangu, tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah Stevia
rebaudiana Bertonii M. (lampiran 1).
B. Pembuatan Serbuk simplisia S rebaudiana
1. Pengumpulan bahan
Penelitian ini menggunakan simplisia daun S. rebaudiana yang diperoleh
dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tananaman Obat dan Obat
Tradisional (B2P2TO2T). Pihak B2P2TO2T mengumpulkan simplisia S.
rebaudiana yang dipanen oleh petani di sekitar daerah Tawangmangu setiap dua
bulan sekali. Berdasarkan keterangan B2P2TO2T, simplisia ini merupakan
varietas jumbo yang dipanen pada umur daun yang sama oleh para petani.
34
35
2. Sortasi Kering
Sortasi kering dilakukan dengan tujuan memisahkan daun S. rebaudiana
dari bagian-bagaian yang tidak diinginkan seperti batang, bunga, ranting dan juga
pengotor lain yang masih tertinggal seperti adanya tanah atau kerikil. Dalam
penelitian ini digunakan daun dari tanaman S. rebaudiana dikarenakan kandungan
steviosidanya paling tinggi (3% - 8% dari berat kering daunnya).
3. Pembuatan serbuk
Daun S. rebaudiana hasil sortasi kemudian dikeringkan. Pengeringan ini
dilakukan dengan oven pada suhu 400C – 500C selama satu hari. Peletakan daun
dalam oven ini haruslah rata dan tidak terlalu tebal untuk menjamin keseragaman
dan keefektivan pengeringan. Faktor-faktor yang mempengaruhi pengeringan
adalah suhu pengeringan, kelembaban udara, aliran udara, waktu pengeringan dan
luas permukaan bahan. Daun yang sudah kering ini nantinya akan mempermudah
penyerbukan dengan grinder (mesin penyerbuk).
Proses pengayakan serbuk dilakukan dengan menggunakan ayakan no
mesh 50. Menurut Matsushita (1979), range ukuran mesh penyerbukan daun S.
rebaudiana antara 50-400. Melalui pengayakan ini akan diperoleh ukuran partikel
serbuk yang kecil ( ≤ ukuran mesh 50) sehingga proses ekstraksi bertambah baik.
Hal ini dikarenakan luas kontak area antara cairan penyari dengan serbuk makin
besar.
Proses pengayakan untuk setiap 500 gram serbuk berlangsung selama 5
menit hingga diperoleh derajat kehalusan partikel yang dikehendaki. Berdasarkan
36
orientasi jika terlalu cepat, banyak serbuk yang belum terpisah secara maksimal.
Sedang jika terlalu lama, maka proses pengayakan tidak akan efisien.
C. Pembuatan Ekstrak Cair Dari Daun Stevia rebaudiana
1. Defatisasi serbuk simplisia
Defatisasi ini bertujuan untuk menghilangkan senyawa-senyawa non
polar yang terkandung dalam daun seperti lemak, minyak esensial, dan pigmen
tumbuhan. Senyawa non polar ini perlu dihilangkan untuk meminimalkan
pengaruhnya terhadap proses ekstraksi steviosida. Senyawa-senyawa yang relatif
non polar ini dapat ikut tersari oleh adanya etanol, selain itu air juga dapat
melarutkan lemak sehingga akan ikut meningkatkan kejenuhan. Senyawa-
senyawa non polar pada S. rebaudiana menurut Kuznesof (2007) meliputi
dekanoic acid, pentacosane, octacosane, stigmasterol, lupeol, dan pentacyclic
triterpene. Melalui defatisasi ini, diharapkan proses ekstraksi steviosida yang
dilakukan pada tahap selanjutnya akan lebih optimal. Pelarut heksan digunakan
dalam defatisasi ini, dikarenakan kepolarannya yang sangat rendah sehingga akan
lebih efektif dalam menyari senyawa non polar dan tidak mengurangi kadar
steviosida yang nantinya tersari yang bersifat relatif polar.
Defatisasi ini dilakukan dengan cara sokletasi atau penyarian
berkesinambungan. Cairan penyari (heksan) dipanaskan pada suhu 640C - 650C.
Uap penyari akan naik ke atas dan akan mengembun karena didinginkan oleh
pendingin balik. Embun ini akan turun melalui serbuk dan akan melarutkan
senyawa non polarnya. Proses penyarian ini berkelanjutan (kontinu), sehingga
keuntungannya diperlukan cairan penyari yang lebih sedikit. Volume yang
37
digunakan sejumlah 2 x sirkulasi untuk menjamin agar proses penyarian terus
berlangsung (tidak kehabisan atau hangus). Lama defatisasi ini 2 x 8 jam, yang
menunjukkan bahwa tiap 8 jam dilakukan penggantian cairan penyari (heksan)
agar proses penyarian lebih efektif (cairan penyari yang baik haruslah murni atau
azeotrop). Waktu dan jumlah sirkulasi sudah dioptimasi untuk menghasilkan titik
akhir defatisasi yang menunjukkan cairan terlihat jernih (indikator visual sudah
habisnya senyawa yang terlarut oleh heksan).
2. Perkolasi dengan aplikasi Desain Faktorial
Ekstraksi secara perkolasi ini dilakukan dengan mengalirkan cairan
penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Cairan penyari akan
dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk dan akan melarutkan zat aktif dalam
sel-sel sampai jenuh. Pembasahan atau maserasi ini penting untuk simplisia yang
mengandung bahan yang mudah mengembang jika kontak dengan air. Jika bahan
tersebut langsung dialiri cairan penyari tanpa pembasahan, maka cairan penyari
tidak dapat menembus ke seluruh bagian sel dengan sempurna (penyarian tidak
efektif karena tidak seluruh sel mengembang). Apabila bahan tersebut dibasahi
terlebih dahulu, seluruh sel serbuk akan mengembang dan aliran cairan penyari
akan merata.
Penekanan serbuk pada perkolator bertujuan untuk mengatur kecepatan
aliran penyari. Kecepatan aliran penyari harus disesuaikan antara aliran penyari
dari keran menstrum dengan aliran dari keran perkolat. Kecepatan aliran penyari
yang digunakan adalah 1ml/menit. Penggunaan kecepatan tetesan 1 ml/menit ini
didasarkan atas kandungan zat aktif steviosida pada daun yang relatif kecil(<
38
10%). Penetesan yang terlalu cepat menyebabkan penyarian tidak sempurna,
sedangkan penetesan yang terlalu lambat akan menyebabkan kemungkinan
menguapnya cairan penyari lebih besar dan tidak efisien dalam hal waktu
penyarian.
Kondisi penyarian harus dijaga agar selalu ada selapis cairan penyari di
atas serbuk (tergenangi). Jika serbuk kering terutama pada bagian permukaan
dapat menyebabkan adanya gelembung-gelembung udara yang mengganggu
penyarian. Cairan penyari tidak dapat menembus sel-sel zat aktif karena terhalang
oleh gelembung udara. Selain itu aliran perkolat akan melambat karena gaya
aliran ke bawah berkurang jika tidak ada selapis cairan penyari di atas serbuk.
Pada proses perkolasi ini digunakan suhu 300C untuk meningkatkan
efisiensi proses ekstraksi dengan mengurangi beban bahan bakar sekaligus
mengontrol suhu proses ekstraksi. Suhu dapat meningkatkan kelarutan bahan aktif
dalam cairan penyari. Oleh karenanya dengan suhu yang terkontrol ini diharapkan
dapat mengurangi variabilitas penelitian sehingga perolehan kadar steviosida yang
didapatkan hanya berasal dari pengaruh variasi volume etanol dan akuades.
Titik akhir perkolasi pada umumnya sampai didapatkan perkolat yang
tidak berwarna/jernih. Namun, dikarenakan pada penelitian ini menggunakan
desain faktorial yang level rendah dan level tinggi masing-masing faktornya
berhubungan dengan volume total, maka titik akhir perkolasi didasarkan pada
volume total perkolat yang sesuai untuk masing-masing percobaan dengan
kecepatan alir yang sama yaitu 1ml/menit.
39
Pada penelitian ini, pertimbangan yang digunakan untuk menentukan
level rendah tiap faktor 150 ml dengan total volume 300 ml adalah perbandingan
minimal serbuk dengan cairan penyari untuk mendapatkan hasil ekstrak yang
cukup memberikan respon adalah 1 : 10. Serbuk yang digunakan 30 g, sehingga
total volume cairan penyari minimal adalah 300 ml. Level tinggi tiap faktor yang
digunakan adalah 375 ml. Hal ini didasari pertimbangan total volume cairan
penyari yang digunakan yakni 750 ml. Pada saat orientasi, penyarian dengan
volume 750 ml didapatkan tetesan perkolat yang mulai terlihat bening, yang dapat
diindikasikan penyarian telah mendekati titik maksimalnya. Selain itu, diharapkan
dengan penggunaan volume penyari pada rentang level tersebut dapat
memberikan hasil yang berbeda secara signifikan terhadap kadar steviosida.
D. Analisis Kualitatif Ekstrak Tanaman S. rebaudiana (Bert.)
Analisis kualitatif dilakukan dengan menggunakan prinsip Kromatografi
lapis Tipis (KLT). Tahap ini dilakukan untuk memastikan bahwa ekstrak yang
dihasilkan benar mengandung senyawa yang dikehendaki, dalam hal ini adalah
steviosida.
Penggunaan fase diam Silika Gel F254 adalah karena bersifat polar
sehingga dapat mengikat senyawa yang akan kita pisahkan yaitu steviosida yang
bersifat relatif polar. Selain itu, fase diam yang cocok digunakan untuk pemisahan
senyawa terpenoid adalah Silika Gel F254. Fase gerak yang digunakan adalah
kloroform: metanol: akuabides ( 10:15:2) dengan sifat kepolaran campuran yang
lebih kuat daripada fase diam, sehingga dapat mengelusi steviosida. Digunakan
40
campuran dari tiga komponen ini dikarenakan satu pelarut saja (akuabides) dapat
menggerakkan bercak terlalu jauh sedangkan jika kloroform saja tidak dapat
menggerakkan bercak cukup jauh. Pencampuran akuabides dan kloroform saja
dikhawatirkan dapat menyebabkan terjadinya pemisahan pelarut pada saat
dikembangkan, karena perbedaan kepolaran yang cukup jauh (sesuai deret
eleutropik). Oleh karena itu, fungsi penambahan metanol disini untuk mengatasi
perbedaan kepolaran yang cukup jauh sehingga nantinya fase gerak dapat lebih
tercampur, selain juga untuk mengubah kepolaran campuran fase gerak.
Analisis kualitatif steviosida dilakukan dengan menotolkan sampel
ekstrak dan baku steviosida pada lempeng Silika Gel F254, kemudian dielusi
dengan fase gerak kloroform: metanol: akuabides (10:15:2) yang telah dijenuhkan
dalam bejana dengan jarak perambatan 15 cm. Pendeteksian bercak dilakukan
dengan pereaksi semprot KI dan vanilin asam sulfat. Melalui pereaksi semprot KI
dapat dideteksi adanya senyawa yang memiliki atom oksigen yang ditunjukkan
dengan timbulnya bercak berwarna kecoklatan. Hasil penelitian menunjukkan
adanya bercak berwarna kecoklatan setelah disemprot dengan pereaksi KI.
Diketahui bahwa steviosida memiliki atom O sebagai jembatan antara aglikon
dengan glikon, sehingga bercak tersebut dapat digunakan sebagai indikasi awal
adanya steviosida. Penyemprotan dengan vanilin asam sulfat dan dilakukan
pemanasan pada suhu 100-110 0C selama beberapa menit sampai terbentuk spot
kehitaman. Adanya spot kehitaman (arang) ini menunjukkan adanya senyawa
organik. Diketahui bahwa steviosida merupakan senyawa organik dengan rumus
molekul C38H60O18.
41
Gambar 4. Kromatogram baku steviosida dan ekstrak steviosida deteksi vanilin asam sulfat
Keterangan Fase Diam : Silika Gel F254 Fase gerak : kloroform: metanol: akuabides (10:15:2) Deteksi : vanilin asam sulfat a : sampel rep 1 etanol : akuades = 375 : 375 b : sampel rep 2 etanol : akuades = 375 : 375 c : sampel rep 1 etanol : akuades = 375 : 150 d : sampel rep 2 etanol : akuades = 375 : 150 e : sampel rep 1 etanol : akuades = 150 : 375 f : sampel rep 2 etanol : akuades = 150 : 375 g : sampel rep 1 etanol : akuades = 150 : 150 h : sampel rep 2 etanol : akuades = 150 : 150 i : baku steviosida
42
Tabel IV. Harga Rf baku dan sampel ekstrak steviosida dideteksi dengan
vanilin asam sulfat Baku Sampel
Bercak i a b c d e f g h Rf 0,78 0,76 0,76 0,76 0,77 0,78 0,78 0,77 0,77
Warna Bercak
gelap gelap gelap gelap gelap gelap gelap gelap gelap
Melalui hasil yang diperoleh dari KLT pada gambar 4 dan tabel IV,
diketahui bahwa sampel ekstrak mengandung steviosida. Hal ini ditunjukkan dari
kedelapan bercak sampel ekstrak, yang semuanya memiliki harga Rf mirip dengan
Rf standar steviosida yaitu 0,78 dan intensitas warna bercak yang menyerupai
baku.
E. Analisis Kuantitatif Ekstrak Tanaman Stevia rebaudiana (Bert.).
1. Pembuatan Kurva baku
Kurva baku yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan seri
jumlah baku steviosida(µg), bukan menggunakan seri kadar baku seperti pada
umumnya pembuatan kurva baku. Hal ini dikarenakan minimnya jumlah baku
steviosida yang tersedia untuk dibuat seri kadar baku yang sesuai. Pembuatan seri
baku berdasarkan massa atau jumlahnya ini dilakukan dengan jumlah penotolan
yang berbeda-beda. Semakin banyak totolan menunjukkan semakin besar massa
steviosida yang terelusi.
Persamaan kurva baku dibuat dengan memplotkan seri massa steviosida
(berdasarkan jumlah totolan) dengan luas area di bawah kurva (AUC) melalui
software Image-J . Sebelumnya, lempeng KLT di scan terlebih dahulu sehingga
didapatkan image untuk dianalisis dengan software Image-J.
43
Persamaan kurva baku ini dibuat dengan menggunakan data pada totolan
kedua sampai totolan keenam. Hal ini dikarenakan totolan pertama sulit teramati
(terlalu tipis), sedangkan pada totolan ketujuh, visualisasi bercaknya menyulitkan
Image-J untuk mendapatkan data luas bercak di bawah kurva (AUC) yang sesuai
sehingga data bercak ketujuh tidak dimasukkan dalam perhitungan persamaan
kurva baku. Data nilai AUC dari totolan baku kedua sampai keenam masih
meliputi nilai AUC sampel, sehingga persamaan kurva baku yang diperoleh dapat
digunakan untuk mengetahui jumlah steviosida pada sampel.
Tabel V. Data jumlah steviosida (µg) dengan AUC Jumlah Totolan AUC Jumlah
steviosida (µg) 2 26,876 4,0560 3 35,408 6,0840 4 42,789 8,1120 5 51,176 10,1400 6 62,056 12,1680
Kurva Baku
0
20
40
60
80
0 2 4 6 8 10 12 14
jumlah Steviosida (mikrogram)
AUC
Gambar 5. Kurva baku hubungan jumlah steviosida (µg) dengan AUC
Persamaan kurva baku yang didapatkan melalui perhitungan adalah Y =
4,2469X + 9,2098 dengan nilai r = 0,9975.
44
2. Penentuan kadar sampel dengan Software Image J
Penentuan kadar sampel dilakukan sama seperti pada pembuatan kurva
baku, hanya saja jumlah totolan yang digunakan tetap yaitu 3 µl. Data yang
diperoleh adalah :
Tabel VI. Data Kadar steviosida (% b/b) untuk masing-masing percobaan
Pengulangan Uji
1 a b ab
1 3,6227 5,5953 3,6598 8,3992 2 2,7630 5,3066 4,4363 7,1767
Rata-rata 3,1929 5,4509 4,0481 7,7879 SD 0,6079 0,2041 0,5491 0,8644
Berdasarkan tabel VI diketahui bahwa rata-rata kadar steviosida terbesar
didapatkan pada percobaaan ab yaitu dengan menggunakan volume etanol 375 ml
dan volume akuades 375 ml.
F. Analisis Hasil Kadar Steviosida
Data kadar steviosida yang didapatkan berdasarkan tiap-tiap percobaan
diolah lebih lanjut menggunakan aplikasi desain faktorial, sehingga didapatkan
efek etanol 96 % = 2,9989; efek akuades = 1,5961; efek interaksi = 0,7409.
Berdasarkan data tersebut diketahui bahwa efek etanol 96% paling dominan.
Hubungan pengaruh peningkatan level etanol 96 % dan akuades terhadap
kadar steviosida yang terekstrak, dapat dilihat dari gambar berikut :
45
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
100 150 200 250 300 350 400
volume akuades (ml)
Kad
ar s
tevi
osid
a (%
b/b
)
etanol level tinggietanol level rendah
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
100 150 200 250 300 350 400
Volume Etanol (ml)
Kada
r ste
vios
ida
(% b
/b)
akuades level tinggiakuades level rendah
Gambar 6. Pengaruh akuades terhadap kadar steviosida yang
tersari
Gambar 7. Pengaruh etanol terhadap kadar steviosida yang
tersari
Pada etanol 96% level rendah, peningkatan akuades akan meningkatkan
kadar steviosida yang tersari. Pada etanol 96% level tinggi, peningkatan akuades
juga meningkatkan kadar steviosida yang tersari (gambar 6).
Pada akuades level rendah, peningkatan etanol 96% akan meningkatkan
kadar steviosida yang tersari. Pada akuades level tinggi, peningkatan etanol 96%
juga meningkatkan kadar steviosida yang tersari (gambar 7).
Melalui hubungan kedua gambar di atas, diketahui bahwa etanol 96%
maupun akuades memiliki efek meningkatkan kadar steviosida yang tersari. Akan
tetapi, efek dari etanol dalam meningkatan kadar steviosida yang didapatkan lebih
besar. Hal ini dapat terlihat dari jarak antar garis etanol level rendah dan tinggi
yang lebih lebar dengan jarak antar garis akuades level rendah dan tinggi. Hal ini
juga terlihat dari perhitungan desain faktorial pada lampiran 5 dimana nilai efek
etanol 96% paling besar yaitu 2,9989. Adanya interaksi antara etanol 96 % dan
akuades ditunjukkan dengan garis yang tidak sejajar pada masing-masing kurva.
46
Namun untuk menentukan faktor mana yang paling berpengaruh dalam
meningkatkan kadar steviosida yang tersari haruslah diuji terlebih dahulu secara
statistik apakah pengaruh tersebut signifikan atau tidak. Pengujian secara statistik
ini menggunakan Yate’s Treatment. Melalui pengolahan data secara statistik
didapatkan hasil ‘:
Tabel VII. Hasil Analisis Satistik Yate’s Treatment Source of variation
Degrees of freedom Sum of Squares Mean Squares
F
Replicates 1 28602,3431 28602,3431 Treatment 3 2176268,182 725422,7273
a 1 1618920,183 1618920,183 47,2515b 1 458546,7641 458546,7641 13,3836ab 1 98801,2349 98801,2349 2,8837
Experimental error 3 102785,2749
0,3807
Total 7 2307655,8
Ket : a= etanol b= akuades ab= interaksi
Nilai Ftabel (1,3) dengan tingkat kepercayaan 95% adalah 10,128.
Berdasarkan analisis statistik Yate’s Treatment (Tabel VII) diketahui nilai Fhitung
etanol 96% 47,2515 > 10,128 , sedangkan Fhitung akuades 13,3836 > 10,128,
sehingga Hi1 diterima yang menunjukkan kadar steviosida yang didapatkan pada
perkolasi daun S. rebaudiana menggunakan volume etanol 96% level tinggi
berbeda dengan perkolasi daun S. rebaudiana menggunakan volume etanol 96%
level rendah (lampiran 7). Hi2 juga diterima yang menunjukkan kadar steviosida
yang didapatkan pada perkolasi daun S. rebaudiana menggunakan volume
akuades level tinggi berbeda dengan perkolasi daun S. rebaudiana menggunakan
volume akuades level rendah (lampiran 7).
47
Nilai Fhitung interaksi lebih kecil dari F tabel sehingga Hi3 ditolak, Ho3
diterima yang menunjukkan tidak ada interaksi antara volume etanol 96% dengan
volume akuades dalam menentukan respon kadar steviosida rendah (lampiran 7).
Hal ini menunjukkan interaksi tidak berpengaruh secara signifikan, sehingga
respon kadar steviosida lebih dipengaruhi oleh faktor yang digunakan, dalam hal
ini etanol 96% dan akuades. Namun etanol 96% memberikan efek yang paling
dominan, dikarenakan nilai F-nya paling besar.
Efek etanol yang paling dominan ini, dapat dikarenakan kelarutan
steviosida yang lebih larut dalam etanol dibandingkan dengan akuades. Hal ini
menyebabkan pada saat penyarian dengan komponen etanol lebih besar, lebih
banyak pula steviosida yang tersari. Hal ini sesuai dengan penelitian Moussa,
Zeitoun dan Hassan (2003) tentang sifat fisikokimia stevia, yang menyatakan
bahwa stevia sweetener highly soluble in ethanol and methanol, soluble in water.
Dari hasil penetapan kadar steviosida pada tiap-tiap percobaan,
didapatkan persamaan desain faktorial Y = 1,7761+ 5,6449 x 10-3 XA - 5,8978 x
10-4 XB + 2,9270 x 10-5 XAXB. Melalui persamaan tersebut dibuat contour plot
untuk menentukan area optimum volume etanol 96% dan akuades dalam
mendapatkan ekstrak dengan kadar steviosida yang terbesar yaitu >7% b/b dari
bobot kering daun terbatas pada level yang telah ditentukan. Penentuan
penggunaan kadar steviosida yang terbesar yaitu >7% b/b didasarkan pada
penelitian Melis (1992) yang menunjukkan bahwa kadar steviosida pada daun S.
rebaudiana berada pada rentang 3-8 % b/b dari bobot kering daun. Oleh
karenanya dalam penelitian ini dipilih kadar steviosida yang diharapkan tersari
48
yakni >7% b/b, sehingga steviosida yang nantinya didapatkan dapat lebih
maksimal.
Gambar 8. Contour Plot kadar steviosida yang didapatkan dari ekstraksi
Berdasarkan contour plot (gambar 8) diketahui adanya area optimum
volume etanol dan akuades untuk mendapatkan kadar steviosida >7% b/b dari
bobot kering daun. Bobot serbuk kering yang digunakan adalah 30 g, maka
jumlah steviosida terbesar yang diharapkan tersari adalah > 2,1 g
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
1. Etanol 96% berpengaruh paling dominan dalam menentukan kadar steviosida
yang terekstrak.
2. Ditemukan area optimum volume penyari etanol dan akuades untuk
menghasilkan ekstrak dengan kadar steviosida terbesar ( >7% b/b).
B. Saran
1. Perlu dilakukan optimasi terhadap penggunaan etanol 96%, akuades, dan suhu
sehingga dapat diketahui pengaruh ketiga faktor tersebut dan interaksinya
terhadap kadar steviosida yang terekstrak.
2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk pembentukan kristal steviosida dari
ekstrak yang dihasilkan.
49
50
DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 1985, Cara Pembuatan Simplisia, 105-123, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta
Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 16-17, Departemen Kesehatan Republik
Indonesia, Jakarta Anonim, 1979, Farmakope Indonesia edisi III, 9, Departemen Kesehatan
Republik Indonesia, Jakarta Anonim, 2004, Keputusan Kepala Badan Pengawasan Obat dan Makanan
Republik Indonesia No. hk.00.05.5.1.4547 tentang Persyaratan Penggunaan bahan Tambahan Pangan pemanis Buatan dalam Produk Pangan. Tahun 2004, BPOM, Jakarta
Anonim, 2008, http://www.scientistsolution.com/t11475-image+j.html, diakses
tanggal 20 okober 2008
Achyar, 2005, Zat Aditif Pada Makanan, http://www.pppgtertulis.or.id/index.php?id=16, diakses tanggal 5
November 2008
Amstrong, N.A., James, K.C., 1996, 131 – 165, Pharmaceutical Experimental Design and Interpretation, Taylor and Francis, USA
Backer, C.A., Bakhuizen van den Brink R.C., 1968, flora of Java, Volume I & II,
2, Warta Tumbuhan Obat, Volume I
Bakal, A.I., Nabors, L.O., 1986, Alternative Sweeteners, 295-304, Marcel Dekker, Inc., Ner York
Bolton, S., 1990, Pharmaceutical StatisticPractical and Clinical Application, 2ndI
Ed., 308-553, Marcell Dekker Inc., New York Bolton,S.,1997, Pharmaceutical StatisticPractical and Clinical Application , 3rd
Ed., 326, Marcell Dekker Inc., New York
Brandle, J.E., dan Rosa, N., 1992, Heritability for yield, leaf: stem ratio and stevioside content estimated from a landrace cultivar of Stevia rebaudiana. Can. J. Plant Sci. 72: 1263-1266
Geuns, J.M.C.,2003, 64, 913-921, Molecules of Interest : Stevioside,
Phytochemistry,
51
Gritter, R.J., Bobit, J.M., Schwarting, A.E., 1991, 107-155, Introduction to
Chromatography, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Cetakan II, Penerbit ITB, Bandung
Hardjono, S., 1983, Kromatografi, 32-34, Laboratorium Analisa Kimia Pusat,
Universitas Gajah Mada, Yogyakarta Kuznesof, P.M., 2007, 1-8, Steviol Glycosides : Chemical and Technical
Assessment Lewis W.H., 1992, Economic Botanical, 336, Great Britain Lutony, 1993, Tanaman Sumber Pemanis, Jakarta : Penebar Swadaya.
Mantovanelli, I.C.C., Ferretti, E.C., M. R. Simões, M.R., dan C. Ferreira da Silva. 2004. The effect of temperature and flow rate on the clarification of the aqueous stevia-extract in a fixed-bed column with zeolites. Braz. J. Chem. Eng. São Paulo . vol.21 no.3: 449-458.
Martono, Y., Kristopo, H., Sihasale, L.R.,2007, Recovery produk ekstrak steviosida sebagai bahan alternatif pengganti gula dari Stevia rebaudiana (Bert.), laporan penelitian, Fakultas Sains dan Matematika, Universitas Satya Wacana : Salatiga
Matshushita, 1979, 1-5, Separation of Sweet Component from Natural Sweet
Extracts Megeji, N.W., Kumar, J.K., Singh, V., Ahuja, P.S., Introducing Stevia
rebaudiana, a natural zero-calorie sweetener, Institute of Himalayan Bioresource Technology, Palampar 176 061, India, Current Science, Vol.88, No.5, 10 Maret 2005.
Melis, M.S., 1992, 213-217, Stevioside effect on renal function of normal and
hypertensive rats, Journal of Ethnopharmacology 36(3), USA
Midmor, D.J., and Rank, A.H., 2002, A New Rural Industry – Stevia- to Replace Imported Chemical Sweeteners, RIRDC Rural Industries Research & Development Corporation
Moussa, M.M; Zeitoun. A.M.; ZeitounA.A. and Hassan I. Mona, 2003, Physicochemical properties of stevia sweeteners as natural low caloric sweetener, Egypt. J. Dairy Sci..31,pp 61-70, 31(??), 61 - 7 http://www.freewebs.com/stevia, diakses tanggal 20 desember 2008
52
Mudjajanto, E.S. 2005. Keamanan Jajanan Tradisional. http://www.kompas.com/kompas-cetak/0502/17/ilpeng/1563189.htm, diakses tanggal 5 November 2008
Mursyidi, A.,1990, Analisis Metabolit Sekunder, 192-193, 245, Penerbit: Proyek
Pengembangan Pusat Fasilitas Bersama Antar Universitas (Bank Dunia XVII)-PAU Bioteknologi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
Nanayakkara, N.P., Klocke, J.A., Compadre, C.M., Hussain, R.A., Pezzuto, J.M.
& Kinghorn, A.D. (1987) Characterization and feeding deterrent effects on the aphid, Schizaphis graminum, of some derivatives of the sweet compounds, stevioside and rebaudioside A. J. Nat. Prod., 50, 434-441.
Sapna, S., Avinash, K., Mukul, T., Pathak, A.K., 2008, Pharmacognosy and
Phytochemical Investigation of Stevia rebaudiana, Pharmacognosy magazine,vol 4, issue 13 (suppl), Jan-Mar 2008
Soejarto DD, Douglas K, dan Farnsworth NR. 1982. Potential sweetening agents of plant origin. III. Organoleptic evaluation of Stevia leaf herbarium samples for sweetness. J Nat;45(5):590-599.
Stahl, E., 1985, Drug Analysis by Chromatography and Microscopy : a practical supplement to to pharmacopias, diterjemahkan oleh Kosasih P. dan Soediro, 205-207, ITB, Bandung
Sumida T (1968). Reports on stevia introduced from Brazil as a new sweetness resource in Japan (English summary). J. Cent. Agric. Exp. Stn. 31: 1-71.
Voigt, R., 1994, Buku Pelajaran teknologi Farmasi, edisi ke-5, diterjemahkan
oleh Soendani Noerono, 565-572, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Wati, H.H., 2004, Kadar Pemanis Buatan Pada Minuman Yang Dijual Di Sekolah
Dasar Di Kecamatan Wonoayu Kabupaten, Sidoarjo, http://etd.library.ums.ac.id/go.php? id= jiptummpp-gdl-s1-2004 hennyhikma-132, diakses tanggal 8 januari 2009.
Widodo, R., 2008, Mengenal Pemanis Buatan Mutakhir, http://www.untag-
sby.ac.id/index.php?mod=berita&id=128, diakses tanggal 8 januari 2009 Zeligs, Michael A., and H. Leon Bradlow, 2006, Diindolylmethane (DIM), formed
spontaneously from Indole-3-carbinol (I3C), is the dominant anti-proliferative indol in cell culture media after adding I3C, http://www.aidic.it/IBIC2008/webpapers/86Alupuli.pdf, diakses tanggal 22 Desember 2008
53
Lampiran
54
Lampiran 1. Surat Keterangan Determinasi
55
56
Lampiran 2. Data Penimbangan Baku Steviosida
Berat Cawan = 13,36065 g
Berat Cawan + Zat = 13,37079 g
Berat Zat = 0,01014 g
= 10,14 mg add 5 ml
Konsentrasi Baku Steviosida = 2,028 mg/ml
Kadar Steviosida dalam 1µl (1 totolan ) = 2,028 µg
Lampiran 3. Data Kurva Baku Steviosida
Jumlah Totolan AUC Massa (µg) 2 26,876 4,0560 3 35,408 6,0840 4 42,789 8,1120 5 51,176 10,1400 6 62,056 12,1680
A = 9,2098
B = 4,2469
R = 0,9975
Persamaan kurva baku:
Y = 4,2469X + 9,2098
57
Lampiran 4. Data kadar steviosida pada sampel
Rep Volume Etanol (ml)
Volume Akuades
(ml)
Suhu (0C)
AUC Sampel
Kadar Sampel (µg/3µl)
Kadar Sampel
(mg/total volume)
Kadar sampel (% b/b)
Kadar sampel
Rata-rata (% b/b)
1 150 150 30 44,411 10,868 1086,8 3,6227 2 150 150 30 55,367 8,289 828,9 2,7630
3,1929
1 375 150 30 47,842 9,592 1678,6 5,5953 2 375 150 30 49,947 9,097 1591,975 5,3066
5,4509
1 150 375 30 41,507 6,274 1097,95 3,6598 2 150 375 30 35,854 7,605 1330,875 4,4363 4,0481
1 375 375 30 45,785 10,079 2519,75 8,3992 2 375 375 30 52,013 8,612 2153 7,1767
7,7879
Lampiran 5. Data Desain Faktorial dan Efek masing-masing Faktor
Kondisi Volume etanol
Volume akuades
Interaksi Rata-rata kadar
sampel (1) - - + 3,1929 a + - - 5,4509 b - + - 4,0481 ab + + + 7,7879
Efek etanol 96 % = - 3,1929 + 5,4509 - 4,0481 + 7,7879 2
= 2,9989 Efek akuades = - 3,1929 - 5,4509 +4,0481 + 7,7879
2 = 1,5961
Efek interaksi = 3,1929 - 5,4509 - 4,0481 + 7,7879 2
= 0,7409
58
Lampiran 6. Perhitungan Persamaan Desain Faktorial
Persamaan
Y = b0 + b1XA + b2XB + b12XA
Formula 1
3,1929 = b0 + b1(150) + b2(150) + b12 (150) (150)
3,1929 = b0 + 150 b1 +150 b2 + 22500 b12 (1)
Formula a
5,4509 = b0 + b1(375) + b2(150) + b12 (375) (150)
5,4509 = b0 + 375 b1 +150 b2 + 56250 b12 (a)
Formula b
4,0481 = b0 + b1(150) + b2(375) + b12(150) (375)
4,0481 = b0 + 150 b1 +375 b2 + 56250 b12 (b)
Formula ab
7,7879 = b0 + b1(375) + b2(375) + b12(375) (375)
7,7879 = b0 + 375 b1 +375 b2 + 140625 b12 (ab)
59
Eliminasi persamaan (1) dan (a)
3,1929 = b0 + 150 b1 +150 b2 + 22500 b12
5,4509 = b0 + 375 b1 +150 b2 + 56250 b12 -
-2,2580 = -225 b1 – 33750 b12 (I)
Eliminasi persamaan (b) dan (ab)
4,0481 = b0 + 150 b1 +375 b2 + 56250 b12
7,7879 = b0 + 375 b1 +375 b2 + 140625 b12 -
-3,7398 = -225 b1 – 84375 b12 (II)
Eliminasi persamaan (I) dan (II)
-2,2580 = -225 b1 – 33750 b12
-3,7398 = -225 b1 – 84375 b12 -
1,4818 = 50625 b12
b12 = 2,9270 x 10-5
Eliminasi persamaan (1) dan (b)
3,1929 = b0 + 150 b1 +150 b2 + 22500 b12
4,0481 = b0 + 150 b1 +375 b2 + 56250 b12 -
-0,8552 = -225 b2 –33750 b12 (III)
Substitusi b12 ke persamaan (I)
-2,2580 = -225 b1 – 33750 b12
-2,2580 = -225 b1 – 33750 x 2,9270 x 10-5
-2,2580 = -225 b1 – 0,9879
60
-1,2701 = -225 b1
b1 = 5,6449 x 10-3
Substitusi b12 ke persamaan (III)
-0,8552 = -225 b2 –33750 b12
-0,8552 = -225 b2 – 33750 x 2,9270 x 10-5
-0,8552 = -225 b2 – 0,9879
0,1327 = -225 b2
b2 = - 5,8978 x 10-4
Substitusi b1,b2,b12 ke persamaan (1)
3,1929 = b0 + 150 b1 +150 b2 + 22500 b12
3,1929 = b0 +150 x 5,6449 x 10-3 +150 x - 5,8978 x 10-4 +22500 x 2,9270 x
10-5
3,1929 = b0 + 0,8467 – 0,0885 + 0,6586
b0 = 1,7761
Persamaan Desain Faktorial
Y = 1,7761+ 5,6449 x 10-3 XA - 5,8978 x 10-4 XB + 2,9270 x 10-5 XAXB
Faktor A = Volume Etanol Faktor B = Volume Akuades
Lampiran 7. Perhitungan Yate’s Treatment
Faktor etanol A1 A2
Replikasi b1 b2 b1 b2
1 3,6227 3,6598 5,5953 8,3992 2 2,7630 4,4363 5,3066 7,1767
61
2yΣ = total sum of squares2yΣ = (3,6227)2 + (2,7630)2 +(3,6598)2 + (4,4363)2 +( 5,5953)2 + (5,3066)2 +
(8,3992)2 +(7,1767)2 – 8
)40,9596( 2
= 235,3520 – 209,7111 = 25,6409
Ryy = replicate sum of squares
Ryy = ( ) ( ) ( )8
40,95964
19,682621,2770 222
−⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛ +
= 210,0289 – 209,7111 = 0,3178 Tyy = treatment sum of squares
Tyy = ( ) ( ) ( )8
40,95962
15,5759)()9019,10(8,09616,3857 22222
−⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛ +++
= 233,8920 – 209,7111 = 24,1809 Eyy = experiment al error sum of squares = 25,6409 – 0,3178 – 24,1809 = 1,1422 Ayy = sum of squares associated with the different level of a
= ( ) ( ) ( )8
40,95964
26,477814,4818 222
−⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛ +
= 227,6991 – 209,7111 = 17,9880 Byy = sum of squares associated with the different level of b
= ( ) ( ) ( )8
40,95964
23,67217,2876 222
−⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛ +
= 214,8062 - 209,7111 = 5,0951
Abyy = sum of squares associated with the interaction of the two factor A & B Abyy = 24,1809 - 17,9880 - 5,0951 = 1,0978
62
Source of variation
Degrees of freedom
Sum of Squares
Mean Squares F
Replicates 1 0,3178 0,3178 Treatment 3 24,1809 8,0603
a 1 17,9880 17,9880 47,2498 b 1 5,0951 5,0951 13,3836 ab 1 1,0978 1,0978 2,8837
Experimental error 3 1,1422 0,3807
Total 7 25,6409
Nilai F tabel (1,3) dengan tingkat kepercayaan 95% adalah 10,128
HIPOTESIS
1. Hi = kadar steviosida yang didapatkan melalui perkolasi daun S.rebaudiana
menggunakan volume etanol level rendah berbeda dengan volume etanol
level tinggi.
Ho = kadar steviosida yang didapatkan melalui perkolasi daun S.rebaudiana
menggunakan volume etanol level rendah tidak berbeda dengan volume
etanol level tinggi.
2. Hi = kadar steviosida yang didapatkan melalui perkolasi daun S.rebaudiana
menggunakan volume akuades level rendah berbeda dengan volume
akuades level tinggi.
Ho = kadar steviosida yang didapatkan melalui perkolasi daun S.rebaudiana
menggunakan volume akuades level rendah tidak berbeda dengan
volume akuades level tinggi
3. Hi = ada interaksi antara volume etanol dan volume akuades dalam
menentukan respon kadar steviosida pada perkolasi daun S.rebaudiana.
Ho = tidak ada interaksi antara volume etanol dan volume akuades dalam
menentukan respon kadar steviosida pada perkolasi daun S.rebaudiana
63
Lampiran 8. Foto simplisia kering dan serbuk daun Stevia rebaudiana
Simplisia kering
Serbuk sebelum defatisasi Serbuk setelah defatisasi
64
Lampiran 9. Foto Alat
Perkolator Sokhlet
Lampiran 10. Foto Larutan Pereaksi Semprot
KI Vanilin-asam sulfat
65
Lampiran 11. Foto Perkolat
Etanol : Akuades = 150 : 150 rep 1 Etanol : Akuades = 150 : 150 rep 2
Etanol : Akuades = 375 : 150 rep 1 Etanol : Akuades = 375 : 150 rep2
Etanol : Akuades = 150 : 375 rep 1 Etanol : Akuades = 150 : 375 rep2
66
Etanol : Akuades = 375 : 375 rep 1 Etanol : Akuades = 375 : 375 rep 2
67
Biografi Penulis
Penulis yang bernama lengkap Totok Lasmono Hadi
Purwanto, lahir di Madiun pada tanggal 10 Mei 1987
adalah anak keenam dari delapan bersaudara pasangan
Bapak Simo dan Ibu Sulasmi. Penulis menyelesaikan
pendidikan taman kanak-kanak di TK Petra Madiun pada
tahun 1992-1993, SD Petra Madiun tahun 1993-1999,
SLTP Santo Yusuf Madiun pada tahun 1999-2002, dan
dilanjutkan di SMA Kolese Santo Yusuf Malang pada
tahun 2002-2005. Selepas SMA penulis masuk ke Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta dan menyelesaikan studinya sampai tahun 2009.
Selama kuliah, penulis pernah menjadi Asisten Praktikum Biokimia, dan
Praktikum Kromatografi. Selain itu, penulis juga aktif di berbagai kepanitiaan
seperti Inisiasi Fakultas Farmasi TITRASI 2006 (Perlengkapan), Inisiasi Fakultas
Farmasi TITRASI 2007 (Ketua Bidang Umum), Pharmacy Performance Maserasi
2006 (Pubdekdok), Pharmacy Event Cup 2006 (Acara), Pengobatan Gratis JMKI
2007 (Keamanan).
