REGULACIN GENTICA EN EL OPERN lac

IntroduccinEn 1961, Francois Jacob y Jacques Monod formularon el modelo del opern para explicar la regulacin de la sntesis de protenas. El modelo se basaba en estudios de la induccin de las enzimas del catabolismo de la lactosa en Escherichia coli. Adems de la -galactosidasa, estas enzimas incluyen la lac permeasa, que participa en el transporte de la lactosa a la clula, y la transacetilasa, que metaboliza ciertos disacridos distintos de la lactosa.Los genes para las tres enzimas que participan en la captacin y utilizacin de la lactosa estn prximos entre s en el cromosoma bacteriano y se regulan juntos. Estos genes, que determinan las estructuras de las protenas, se denominan genes estructurales para distinguirlos de la regin de control contigua en el DNA. Cuando se introduce lactosa en un medio de cultivo, todos los genes estructurales lac se transcriben y traducen de forma rpida y simultnea. En la regin control del opern lac hay dos segmentos de DNA relativamente cortos. Uno, el promotor, es la regin del DNA donde la RNA polimerasa inicia la transcripcin. El otro es el operador, que es como un semforo que emite una seal de avance o de detencin para la transcripcin de los genes estructurales. Un conjunto de sitios operadores y promotores, y los genes estructurales que ellos controlan, es lo que define a un opern; por lo tanto, la combinacin de los tres genes estructurales lac y las regiones de control contiguas se denomina opern lac.En el DNA bacteriano cerca del opern lac se ubica un gen regulador denominado gen I, que codifica protena represora.Cuando la lactosa est ausente la protena represora se une firmemente al sitio operador. Esta unin impide que la enzima RNA polimerasa transcriba los genes estructurales adyacentes; en consecuencia, no se forma mRNA y no se sintetizan enzimas.En cambio, cuando la lactosa est presente, parte de ella es transportada al interior de las clulas y convertida en el inductor alolactosa. El inductor se une a la protena represora y la altera de modo que no puede unirse al sitio operador. En ausencia de una protena represora unida al operador, la RNA polimerasa puede transcribir los genes estructurales en mRNA, que luego se traduce en enzimas. Esta es la razn por la que en presencia de lactosa se producen enzimas. Se dice que la lactosa induce la sntesis de la enzima y el opern lac se denomina opern inducible. La regulacin del opern lactosa tambin depende de la concentracin de glucosa en el medio, la que a su vez controla el nivel intracelular de la pequea molcula de AMP cclico (cAMP), una sustancia derivada del ATP que acta como una seal de alarma celular. Las enzimas que metabolizan la glucosa son constitutivas y las clulas crecen a su mxima velocidad con la glucosa como fuente de carbono porque pueden utilizarla de modo ms eficaz. Cuando la glucosa ya no est ms disponible se acumula cAMP en la clula. Este se une al sitio alostrico de una protena activadora catablica o CAP. Entonces la CAP se une con el promotor lac, que inicia la transcripcin porque facilita la unin de la RNA polimerasa con el promotor. Por lo tanto, la transcripcin del opern lac requiere tanto la presencia de lactosa como la ausencia de glucosa.El mismo mecanismo que involucra al cAMP permite que la clula crezca en presencia de otros azcares. La inhibicin del metabolismo de fuentes de carbono alternativas por la glucosa se denomina represin por catabolito. Cuando la glucosa est disponible, la concentracin de cAMP en la clula es baja y por consiguiente la CAP no est unida.En esta prctica utilizamos un anlogo de la lactosa que es el ONPG, el cual al reaccionar con la -galactosidasa nos dar una coloracin amarilla y que al agregar carbonato hace que se intensifique el color amarillo, adems que se detiene la reaccin de la -galactosidasa con el ONPG.

Fig 1. Reaccin que lleva a cabo la -galactosidasa, el ONP es el que da el color amarillo.Objetivos Comprender la importancia de la regulacin gentica como mecanismo para controlar los niveles de enzimas en la clula. Conocer los elementos que integran el opern de lactosa. Entender el funcionamiento del opern de lactosa en presencia y ausencia de este carbohidrato. Conocer el concepto de represin catablica y cmo se lleva a cabo.Hiptesis Si las bacterias son capaces de activar el opern lac en presencia de lactosa entonces producirn la -galactosidasa, comprobando su presencia agregando un anlogo de la lactosa (ONPG) obteniendo una coloracin amarilla. Materiales y mtodosSe desarroll en la prctica segn el manual de prcticas de Bioqumica Experimental (pg. 60-61). Colocamos en 4 microtubos estriles (A, B, C Y D) 1 ml de cultivo de E. coli w3110. Al tubo A le aadimos 250 l de glucosa 2%, al tubo B 150l de lactosa 2%, al tubo C 250 l de una mezcla de glucosa2% y lactosa. Incubamos los tubos a 37 C durante 15 minutos. A los 7.5 minutos de incubacin aadimos 250 l de lactosa 2% al tubo D. Luego centrifugamos los tubos a 10,000 rpm durante 1 minuto y decantamos el sobrenadante. Resuspendimos el paquete celular en 250 l de amortiguador Z. Aadimos 25 l de cloroformo y 12.5 l de SDS 0.1% y agitamos suavemente 10 segundos. Aadimos 50 l de reactivo ONPG, agitamos e incubamos a temperatura ambiente durante 2 minutos. Paramos la reaccin aadiendo 125 l de NaCO 1M. Al final se observaron las intensidades del color amarillo. Resultados y discusin Tabla 1. Intensidad de color en tubos despus de agregar el carbonato de sodio.TUBOINTENSIDAD DE COLOR

A

B+++

C++

D+

E

Fig 2. Tubos antes de agregar el carbonato de sodio, ntese que no se logra ver la coloracin amarilla.

Fig 3. Tubos despus de agregar el carbonato, ntese la diferencia de intensidad de color en los tubos B, C y D, donde existe la presencia de -galactosidasa.En el tubo A como solo hay presencia de glucosa el opern Lac esta inactivado y como consecuencia no se sintetiza la -galactosidasa y al agregar en anlogo de la lactosa (ONPG) no sufre ninguna modificacin y no presenta coloracin alguna. Adems la presencia de glucosa disminuye la concentracin de cAMP. En el tubo B solo hay lactosa y este puede transformarse a alolactosa la cual se une al represor liberando al operador, teniendo como resultado la unin de la RNA poli y pla produccin de la -galactosidasa que al reaccionar con el ONPG da como resultado el color amarillo (ONP). En el tubo C las bacterias tiene mayor preferencia hacia la glucosa como sustrato, es por eso que al usar glucosa las concentraciones de cAMP disminuyen y no es capaz de unirse a CAP, hasta que se acabe la glucosa no se utiliza la lactosa pero si se quita el represor, cuando se acaba por completo la glucosa, las concentraciones de cAMP aumentan y se unen a CAP por lo que comienza la sntesis de -galactosidasa a menos concentraciones al tiempo que agregamos el ONPG. En el tubo D como se agrega despus de 15 minutos la lactosa esta empieza a actuar en el represor y al tiempo que se agrega el ONPG la concentracin de -galactosidasa es menor que en el caso del tubo C. El tubo E al no existir bacterias no se puede observar ninguna coloracin, por lo tanto el tubo nos sirve como testigo de nuestro experimento.

Conclusiones En el tubo que contiene glucosa solamente (tubo A), no se desarrollar color amarillo debido a que el opern lac no ser activado.En el tubo que contiene lactosa solamente (tubo B), se desarrollar el color amarillo debido a que el opern lac es activado.En el tubo que contiene glucosa y lactosa (tubo C), se desarrollar poco color amarillo, esto en cuanto se haya terminado de metabolizar la glucosa y el opern ya no est reprimido para ser activado.En el tubo que contiene glucosa y que pasado un tiempo se le agreg lactosa (tubo D), se desarrollar color amarillo solo si la glucosa se termin de metabolizar.El tubo que contiene glucosa y lactosa, pero no tiene microorganismos (tubo E), servir de blanco, ya que al no contener a la Escherichia coli, no habr microorganismos que metabolicen los carbohidratos aadidos.BibliografaCurtis Helena, Biologa, sptima ed., Ed. Panamericana, Madrid, 2008, pp. 227-230.