GenomicaRama de la gentica que estudia el genoma de los organismos.Involucra proyectos de secuenciacin a gran escalaTecnologa de la secuencacin de ADNEl costo de la secuenciacin fue disminuyendo a medida q pasaron los aos gracias a las nuevas tecnologas con un gran decremento a partir del 2007. 2001 100millones a 2007 10millones 2014 1000 pe.Asi tambin aumenta la cantidad de genomas secuenciados 2014 229mil genoma s y se calcula para el 2017 1.620.000. La mayor cantidad de genomas secuenciados es de bacterias seguido por eucariotas y por ultimo arqueobacterias, a medida que avanzaron las tecnologas esta cantidad de secuencias aumento proporcionalmente, se mantienen las dif.

Tecnologa de la secuencacinde ADN.Mtodo de los ddNTPs (Sanger)Se inicia la sntesis con altas concentrciones de dntps y baja concentracin de ddNTP, le falta el OH en el 3, tiene un H, por lo que la sntesis no continua. Se electroforean cada uno de los cuatro tubos con el ddNTP (A T C y G) y se det la sec en base a los fragm sintetisados, de abajo para arriba el gel se lee 5-3. Se revela por autorradiografia.Secuencian automtica re piola vago con fluorocromos de diferente color se puede poner en el mismo pocillo de gel de electroforesis los cuatro tubos. El color de cada banda corresponde al del dideoxinucleotido 3 terminal de ese fragmento. Se detecta los cuatro colores tras acabar la separacin electrofortica, tambin puede segn va transcurriendo la separacin el detector puede medir la presencia de bandas que van pasando por el haz laser y su color. Generando un registro informatizadfo de los cuatro perfiles de color, que combninados se interpretan como una secuencia.Para la secuenciacin se necesita gran cantidad de DNA por lo que primero se realiza un clonado en bacteria para tener mayor cantidad y luego se procede a la extensin de primerso con ddntp marcados y por ultimo se realiza la separacin por electroforesis y se leen las marcas.En forma automtica son graficos feos

Lapirosecuenciacinosecuenciacin 454, de454 Life Sciences, es una tecnologa de determinacin de secuencia deADNa gran escala, aplicable agenomascompletos, medianteluminiscencia. A diferencia del sistema deSanger, capaz de resolver 67.000 bases cada hora,1el mtodo 454 puede determinar la secuencia de 20 millones en 4,5 horas, lo cual abarata enormemente el coste del proceso.2Procedimiento[editar] Mediante unaemulsinse generan microrreactores (microesferas); se intenta que en cada microesfera haya un nico fragmento de ADN. En cada microrreactor se encuentran los elementos necesarios para la reaccin dePCR: iniciadores, dNTPs,polimerasa, cuentas de secuenciacin y, por lo comn, un nico fragmento deADNmolde. Mediante la amplificacin porPCR, se generan muchas copias del mismo fragmento de ADN original. Despus se liberan las cuentas de la emulsin y se colocan en placas donde se procede con la secuenciacin en paralelo. Para realizar la secuenciacin se vierte la emulsin sobre una fase slida con celdillas. Tras aadir las microesferas se incorporan esferas que inmovilizan a estas y se realiza en cada celdilla una pirosecuenciacin. La secuenciacin se realiza en paralelo aadiendo uno de los cuatro nuceltidos y observando qu celdilla se ilumina, se lava y se aade el siguiente nucletido (se repite el mismo proceso hasta completar la secuencia).Su bajo coste y velocidad,

Esta tcnica comienza con el procesado y adaptacin del ADN para obtener una librera de pequeos fragmentos monocatenarios. Lo primero es fragmentar el ADN a secuenciar mediante un proceso fsico conocido como nebulizacin donde el ADN se rompe en fragmentos de 200 a 800 pares de bases aproximadamente.

Posteriormente, mediante protocolos estandarizados de biologa molecular, se aaden dos pequeas secuencias adaptadoras a cada fragmento de ADN obtenido en la nebulizacin. El adaptador A y el B. Las secuencias adaptadores estn diseadas para cumplir funciones en los pasos de seleccin, amplificacin y secuenciacin.

El siguiente paso es seleccionar los fragmentos de ADN a los que se han unido correctamente los adaptadores. Para esto, los fragmentos de ADN se unen a unas esferas especiales por la parte 3 del adaptador B. Esta unin no es por complementariedad de bases. Los fragmentos que solo contengan adaptador A no se unirn a las esferas y son eliminados y los que contengan dos adaptadores B se unirn por dos puntos. Los fragmentos de doble cadena unidos a estas esferas son sometidos a alta concentracin de NaOH que provoca la separacin de las cadenas simples. Si el fragmento tiene dos adaptadores B se separarn las cadenas pero ambas permanecern unidas a las esferas. Como resultado de este sencillo proceso se liberan de las esferas los fragmentos de cadena simple que tienen un adaptador de cada clase con el B situado en el extremo 5 del fragmento, ya que los fragmentos complementarios a estos permanecern unidos por el extremo 3 del adaptador B. Se busca en tonces adaptadores correctamente posicionads A 3 y B 5ara el proceso de amplificacin, los fragmentos libres de cadena simple se unen a otras esferas que tienen un gran nmero de secuencias complementarias del adaptador A. Esta unin est optimizada para que solo se una un fragmento a una esfera. Una vez unidos los fragmentos a las esferas se introducen en una emulsin de agua y aceite de forma que cada esfera quede dentro de una gota con todos los reactivos y encimas necesarios para la PCR. Tras una serie de termociclos de PCR se habrn generado en cada esfera un gran nmero de secuencias de doble cadena idnticas y unidas por el adaptador A. De nuevo, las esferas son sometidas a alta concentracin de NaOH para separar las cadenas complementarias. El resultado es que cada esfera tiene adherido a su superficie un gran nmero de cadenas simples idnticas unidas por el extremo 3.

Antes de empezar la secuenciacin en s misma se aaden cebadores complementarios al adaptador B en posicin 5, ADN polimerasas y los cofactores necesarios para la sntesis de la cadena complementaria a los fragmentos unidos a las esferas.

El siguiente paso es cargar las esferas en un dispositivo conocido como PicoTiterPlate que es el que se introduce en el secuenciador. Este dispositivo consta de ms de un milln de pocillos de 44 micras de dimetro de forma que solo quepa una esfera con fragmentos de ADN por pocillo. Adems de las esferas con ADN, se introducen otro tipo de esferas que contienen las enzimas necesarias para detectar la incorporacin de nucletidos durante la sntesis de la cadena complementaria.

Estas enzimas son la sulfurilasa y la luciferasa. La sulfurilasa genera ATP a partir de pirofosfato y la luciferasa se transforma en oxiluciferina en presencia de ATP con emisin de luz. De esta forma se construye una cascada enzimtica que empieza cuando la ADN polimerasa incorpora un nucletido a la cadena creciente complementaria del ADN a secuenciar liberando un pirofosfato y termina cuando la luciferasa emite luz.

Una vez cargadas las esferas con ADN y las esferas con enzimas, el PicoTiterPlate se introduce en el secuenciador. El secuenciador automatiza el proceso de secuenciacin, la captura de imgenes y su interpretacin. El secuenciador vierte automticamente sobre los pocillos los reactivos necesarios y un tipo de nucletido cada vez. As de forma cclica se irn vertiendo As, Cs, Gs y Ts. En cada pocillo, la ADN polimerasa aadir uno o ms nucletidos dependiendo de la secuencia que acta como molde y se emitir luz con una intensidad proporcional al nmerro de nucletidos incorporados a la nueva cadena que se va sintetizando durante el proceso de secuenciacin. El secuenciador consta de un sistema ptico especial que recoge el patrn de destellos luminosos que se emiten en el PicoTiterPlate. Mediante programas informticos se interpretan estos patrones de luz y se generan unas grficas que indican si ha habido incorporacin o no de nucletidos y su nmero.

Despus de esto se lava el exceso de nucletidos y reactivos y se repite el proceso con otro tipo de nucletido de forma cclica hasta que finalice la sntesis de una cadena complementaria a la cadena que acta como molde. El resultado es la secuenciacin de los fragmentos que hay en cada pocillo.

En los adaptadores hay unas secuencias conocidas que sirven para calibrar los aparatos de recepcin e interpretacin de imgenes. Uno de los defectos de este sistema es la prdida de precisin en las regiones homopolimricas.

La posibilidad de automatizar y de paralelizar el proceso de secuenciacin que ofrece esta tcnica es una de las principales ventajas frente a otros mtodos de secuenciacin. La pirosecuenciacin permite la secuenciacin de grandes cantidades de ADN en menos tiempo que otras tcnicas y con un coste menor. El DNA es Nebulizado Se fragmenta en tamaos aleatorios Se agregan adaptadores universales (Adaptador A y B) a los Extremos Se denatura Cada Perla bead contiene miles de adaptadores, pero solo se le adhiereun fragmento de DNA que queda atrapado en una emulsin que contiene en su interior los elementos para una PCR. El DNA se amplifica en esta emulsin Generando cientos de copias en cada perla Estas son puestas en la PicoTiter Plate (PTP). El diseo de esta permite una bead por orificio.

Illumina Se fragmenta el DNA Se reparan los extremos Se agregan los adaptadores Se agrega el DNA a la placa Se hibrida aleatoriamente con los adaptadores que estan en la placa Se agregan NTPs sin marcar y DNA polimerasa. Comienza la amplificacin se forman puentes con otros adaptadores en la placa Se denatura el DNA y se vuelve a realizar la amplificacin puente. Se han generado millones de Clsters en la placa. Se agregan los dNTPs, cada uno posee un fluoroforo de color particular: G - Amarillo. C Azul A Rojo T - Verde Se excita con un laser y se captura una imagen. La imagen capturada en una posicin especfica corresponde al primer nucletido. Los ciclos de secuenciacin se repiten hasta determinar la secuencia del templado. Una base a la vez.

RendimientoLargoCalidadCostoAplicacionesPpl Fuente de errores

Sanger6mb x Dia800nt500$/MbPequeas muestras,genomas, Indels/SNPS, haplotipos largos, regiones de baja complej etc.Polimerasa/amplificacion, bajas intensidades/variaciones de terminacin perdidas, secuencias contamintantes

454/Roche750mb400nt$20Genomas complejos, SNPS, variacin estrucura, small RNA, mRNAs, etcAmplificacion, perlas mezcladas, umbral de intensidad, homopolimeros, ajuste de fase, interferencia vecina

Illumina5000mb100nt$0.5Genomas complejos, (Sage ChiP, Smal RNA) mRNAS,Indels/homopolimeros, variacin estructura, datos bisulfito, snps, etcAmplificacion, mezcla de clusters/interferencia vecina, ajuste de fase, marcado de base

SOLiD5000mb50nt$0.5

Helicons5000mb32nt