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UNIVERSIDAD DE JAÉN Facultad de Ciencias Experimentales
Trabajo Fin de Grado
Alumno: Manuel Arroyo Galán
Julio, 2016
Los exosomas urinarios como fuente de
biomarcadores de enfermedad renal
INDICE
1. RESUMEN……………………………………………………………………………1
2. INTRODUCCION………………………...…………………………………………..2
2.1Biosíntesis…………………………………………..…………………….3
2.2 Composición de los exosomas…………………………...……………6
2.3 Funciones biológicas de los exosomas...........……………………….7
3. OBJETIVOS………………………………………………………………………...10
4. AISLAMIENTO DE EXOSOMAS…………………........................................…11
4.1 Aspectos generales……………………………………………………………11
4.2 Métodos de aislamiento de exosomas………………………………………11
4.2.1 Pre-aislamiento………………………………………………………………12
4.2.2 Ultra centrifugación……………...…………………………………………..12
4.2.3 Filtración………………………………………………………………………14
4.2.4 Aislamiento basado en la inmunoafinidad…………………………….....15
4.2.5 Agentes de agregación…………………………..…………………………16
4.2.6 Cromatografía por exclusión de tamaño………………….………………16
4.2.7 Métodos basados en microfluidos…………………………………...…….17
4.2.8 Diálisis hidrostática……………………………..……………………………17
5. EXOSOMAS URINARIOS COMO BIOMARCADORES DE DISFUNCION
RENAL………………………………………………………………………………19
5.1 Enfermedades renales………………………………………………………..19
5.2 Daño renal agudo……………………………………………………………..21
5.3 Trastornos glomerulares………………………………….…………………..21
5.3.1 Nefropatía diabética…………………………………………..…….22
5.3.2 Glomerulonefritis………………………….……………….………..22
5.3.3 Nefropatía en la membrana basal (TBMN)……………….……….23
5.4 Fibrosis renal………………………………………….…………….……….…23
5.5 Trastorno poliquístico renal…………………………………………………..24
5.6 Trasplante renal………………………………….....………………………….24
5.7 Implicaciones en el cáncer………………………………………………..….25
5.7.1 Carcinoma renal celular…………………………………………….25
5.7.2 Cáncer de vejiga……………………………………………………..26
5.7.3 Cáncer de próstata……………………….…………………………26
6. CONCLUSION…………………………………………………………………….27
7. BIBLIOGRAFIA……………………………………………………………………27
1
1. RESUMEN
Gracias a los avances en ciencia, se siguen descubriendo más secretos acerca del
funcionamiento del cuerpo humano. Hace pocos años se descubrieron los
exosomas, un tipo de microvesícula, que se libera por las células al medio
extracelular. En un principio se creía que solo tenían función de eliminación de
sustancias, pero con el tiempo se ha descubierto que participan en muchos más
procesos fisiológicos (Comunicación intercelular, fuente de biomarcadores en
patologías, etc.). Este trabajo proporciona una visión particular y especifica de la
metodología y aplicaciones que poseen los exosomas urinarios como fuente de
biomarcadores en disfunciones renales y demuestra que el uso y análisis en clínica
de estos compuestos se está convirtiendo en una metodología muy recomendada
para el diagnostico de diferentes patologías renales.
Palabras Clave: fracción exosomal, aislamiento, biomarcador, exosomas urinarios,
aplicación.
ABSTRACT
Thanks to advances in science are still being discovered more secrets about the
human body. Few years ago, exosomes were found, a kind of microvesicle, wich is
released by cells to extracellular medium. At first, it was believed that only had
substance removal function, but over time it has been discovered that they involved
in many physiological processes (intercellular communication, source of biomarkers
in diseases,etc).This work provide a particular and specifies view the methodology
and applications that urinary exosomes have as a source of biomarkers in renal
dysfunction and shows that use and analysis in clinical of these vesicles is becoming
a highly recommended methodology for the kidney diseases diagnostic.
Key words: Exosomal fraction, isolation, biomarker, urinary exosomes, application.
2
2. INTRODUCCION
Durante los últimos años, los exosomas han sido objeto de gran interés científico. Se
trata de pequeñas microvesiculas liberadas por diferentes tipos de células (Keller S.
et al., 2006), las cuales pueden ser localizadas en varios fluidos corporales como
plasma, orina y saliva (Lasser C. et al., 2011; Witwer KW. Et al., 2013).
Los exosomas son un tipo de vesículas extracelulares (EVs), este término incluye
diferentes tipos de vesículas, fundamentalmente los exosomas (EXs), ectosomas
(también conocidos como micro-vesículas) y cuerpos apoptoticos. Esta
diferenciación se efectúa en relación a varios aspectos, por ejemplo con respecto a
su tamaño, los exosomas poseen un diámetro de entre 30-150 nm, las micro-
vesículas (Ectosomas) son más grandes, su diámetro comprende entre 100-1000
nm y los cuerpos apoptoticos tienen un tamaño y forma heterogéneo. De la misma
manera, también se encuentran diferencias en su origen, los exosomas son
derivados de la invaginación de la membrana plasmática de los grandes cuerpos
multivesiculares, los ectosomas se producen por una brotación directa de la
membrana y los cuerpos apoptoticos proceden de células que mueren y que arrojan
vesículas membranosas (Gámez-Valero A. et al., 2015).
3
Figura 1: Dibujo que distingue las diferentes vesiculas extracelulares. Burger D.,
Schock S. Thompson CS., Montezano A., Hakim A., (2013).
Microparticles:biomarkers and beyond. Clinical Science. 124: 423-441.
Los exosomas como se ha comentado, tienen un diámetro de 30-150 nm y proceden
de la brotación hacia el interior por parte de las membranas endosomales, lo que
causa la acumulación progresiva de vesículas intraluminales que posteriormente
forman los grandes cuerpos multivesiculares (MVBs) (Mathivanan S. et al., 2010;
Kowal J. et al., 2014).
Originalmente se describieron como un mecanismo de eliminación, (Keller S. et al.,
2006) pero a partir de estudios recientes se ha descubierto que tienen gran
importancia en procesos de comunicación intercelular, patogénesis y como posible
fuente de biomarcadores para enfermedades renales [Mittelbrunn M. et al., 2011;
Borges FT. Et al 2013).
La orina es el fluido corporal ideal para diagnosticar y clasificar varias enfermedades
renales ya que estas vesículas secretadas en todos y cada uno de los segmentos de
la nefrona contienen liquido intracelular y proteínas que se pueden encontrar
alteradas si existe alguna enfermedad renal (Hua Zhou et al., 2006). Este trabajo
describe en particular este tipo de vesículas extracelulares (Urinarias) con un
enfoque especial sobre la importancia que pueden adquirir como fuente de
biomarcadores de distintas enfermedades renales.
2.1 Biosíntesis
Los exosomas son vesículas de membrana que se liberan al espacio extracelular
tras la fusión de la membrana plasmática con los cuerpos multivesiculares (MVBs)
(Schorey J. et al., 2008). Existen diferentes mecanismos por los que las células
liberan proteínas en el espacio extracelular. El proceso más común es la liberación
de grandes biomoleculas a través de la membrana plasmática por un proceso
denominado exocitosis (Keller S. et al., 2006). La exocitosis se define como el
proceso mediante el cual se dirigen las vesículas del interior ceular hacia el espacio
extracelular a través de la membrana plasmática. En el proceso de formación y
4
liberación de exosomas, además de la exocitosis clásica, existe una vía endocitica
que tiene un papel fundamental, esta función es la biosíntesis de los cuerpos
multivesiculares (MVBs) (Dimov I. et al 2009).
Así pues, el origen de los exosomas se ha asociado con la vía endocitica (Keller S.
et al., 2006) que es un sistema dinámico cuya función es ayudar a internalizar,
transportar, clasificar y degradar macromoléculas (Fader C. et al., 2009). De esta
forma, en el proceso de degradación de macromoléculas, los componentes de esta
via endocitica son endosomas tempranos, endosomas tardíos (Los llamados
cuerpos multivesiculares o MVBs) y lisosomas (Keller S. et al., 2006). En lo que
respecta a la ruta endocitica, los endosomas tempranos, que se encuentran cerca de
la membrana celular, actúan como el primer sitio de encuentro para las vesículas
primarias endocitadas. Estas vesículas se pueden reciclar devolviéndose a la
membrana plasmática o pueden evolucionar a cuerpos multivesiculares (MVBs) (Hill
A. et al., 2009). Los endosomas tempranos sufren una acidificación y se generan los
endosomas tardíos, que son clave en la formación de cuerpos multivesiculares
(MVBs), esto se produce porque la membrana endosomica se invagina dentro del
propio endosoma tardío formando mini-vesículas internas. Estas pueden seguir dos
vías: una directamente al lisosoma, donde se degradan, y otra donde se da la
liberación al espacio extracelular (Secreción de exosomas). Los factores de
regulación que determinan cual de las dos vías se producirá no está aún muy clara.
(Keller S. et al., 2006; Schorey J. et al., 2008; Buschow S. et al., 2005).
5
Figura 2: Grafica que escenifica la vía secreción proteica por exosomas. Keller S.,
Sanderson M., Stoeck A., and Altevogt P., (2006). Exosomes: from biogenesis and
secretion to biological function. Immunology letters. 107: 102-108.
Con respecto a la localización de los exosomas, los primeros estudios muestran la
liberación de exosomas derivados de células inmaduras del linaje linfoide, mieloide y
eritroide (reticulocitos), estos últimos liberan el receptor para la transferrina a través
de estas vesículas de membrana (Clayton A. et al., 2000; Clayton A. et al., 2005;
Mignot G. et al., 2006; Lamparski H. et al., 2002; Rapaso G. et al., 1996). Por tanto,
inicialmente se propuso que la secreción de exosomas era un mecanismo a través
del cual la célula se deshacía de proteínas. Posteriormente, se han identificado
estas vesículas en otros tipos celulares como células epiteliales (Lin X. et al., 2005),
neuronas (Cheruvanky A. et al., 2006), nefronas (Cheruvanky A. et al., 2006),
mastocitos (Shokos D. et al., 2003), plaquetas y células tumorales (Andre F. et al.,
2002), células epiteliales intestinales (Buning J. et al., 2008), células microgliales
primarias (Hill A. et al., 2009) y células dendríticas (Stoorvegel W. et al., 2002).
6
2.2 Composición de los exosomas
El análisis proteomico de exosomas se realizo a partir de líquidos corporales como
sangre y orina. Los análisis de estos fluidos muestran que los exosomas de
mamíferos comparten una serie de características comunes, tales como la estructura
(Bicapa lipidica), la densidad, la composición general de proteínas y el tamaño
(Keller S. et al., 2006).
Los exosomas básicamente son estructuras formadas por una bicapa lipidica y el
medio intracelular caracterizado por una composición proteica, la cual se puede
analizar tanto en la superficie (Membrana plasmática) como en el lumen. Existe una
gran cantidad de proteínas asociadas a estas estructuras. Asi pues, se han
identificado proteínas membranales tales como sintaxina 7, dinamina 2, Rab
1,2,4,5,6,7,10,11b,13,14,15, Snap 23, anexina y clatrina (Mignot G. et al., 2006).
También se encuentran chaperonas como Hsp 70, Hsp 90 y Hsp 72 (Keller S. et al.,
2006; Mignot G. et al., 2006). Asimismo hay moléculas transmembranales como
CD13, CD93, Lamp-1 y Lamp-2, además de proteínas como el receptor de
transferrina, moléculas de señalización como fosfolipasa C, proteínas G y Rho
(Segura E. et al., 2005), proteínas que componen el citoesqueleto entre las que se
encuentran actina, tubulina B5 y miosina (Keller S. et al., 2006). De igual forma se
identificaron moléculas proteicas relacionadas con la formación de los cuerpos
multivesiculares (MVB) como TSG 101(Mignot G. et al., 2006), Beclin-1(Fader C. et
al., 2009), Alix (Morita E. et al., 2007) y GAG (Segura E. et al., 2005). Otro tipo de
proteínas son las que poseen función de adhesión como ICAM-1 (Segura E. et al.,
2008). Cabe destacar, la familia de proteínas más comúnmente asociadas a los
exosomas, las tetraspaninas, incluyendo CD9, CD63, CD81 y CD82 (Escola JM. Et
al., 1996; Chaput N. et al., 2005).
Es de importancia resaltar que la composición proteica de estas vesículas de
membrana simboliza el origen celular, por ejemplo, el análisis de exosomas en orina,
muestra un enlace o conexión entre las mismas vesículas, las cuales contienen
acuoporina-2, que tiene su origen en el tracto urogenital (Pisitkun T. et al., 2004).
Esto también ocurre con el CMH (Complejo Mayor de Histocompatibilidad), es así
como tenemos proteínas especificas de células inmunológicas de la Clase I, II y
CD86 (Mignot G. et al., 2006) cuyas funciones se ven relacionadas con la activación
7
del sistema inmunologico. Cabe destacar que la función inmune de estos vesiculas
depende en gran parte del estado funcional de la célula que derivan. Por esta razón,
los exosomas de células dendríticas maduras presentan una mayor eficacia en la
inducción de la activación de linfocitos T, debido a la presencia superficial del
exosoma de una molécula de adhesión concreta “ICAM-1”, mientras que exosomas
que derivan de células dendríticas inmaduras se caracterizan inactivación de los
Linfocitos T (Segura E. et al., 2008). Todas estas proteínas pueden ser utilizadas
como marcadores específicos de los exosomas, y su presencia, ausencia, aumento
o disminución nos ayudan a conocer que tipo de patología posee el paciente.
Como conclusión al análisis proteico, es relevante añadir que todas las proteínas de
los exosomas son de origen endosomal, es decir, no existen proteínas propias del
núcleo, de las mitocondrias o del retículo endoplasmatico. Todas las proteínas de los
exosomas son típicas del citosol o de la membrana plasmática (Mears R. et al.,
2004).
2.3 Funciones biológicas de los exosomas
Los exosomas se describieron por primera vez en los años 80, y hasta hace
relativamente poco (Año 2000), la comunidad científica no había prestado mucha
atención a estos compuestos, ya que solamente se creía que su papel era el de
desechar componentes celulares no deseados (Mecanismo de eliminación) (Pan
BT. Et al., 1983; Trams EG. Et al., 1981). Debido a este hecho, a día de hoy se
están descubriendo nuevos papeles y funciones fisiológicas de los exosomas en el
organismo. Algunos de los roles importantes son la progresión del cáncer, la
comunicación intercelular, la secreción proteica (Vía no-clásica), la biología del
patógeno y su función como fuentes de biomarcadores de patologías (Doreen YPF.
Et al., 2013).
En un principio, se creía que los procesos de comunicación intercelular se basaban
en la secreción de señales como neurotransmisores, hormonas que son liberadas
por las células y que actúan mediante mecanismos autocrinos y paracrinos además
del mecanismo que corresponde al contacto célula a célula (Adhesión). Actualmente
8
se ha descubierto que los exosomas pueden participar en unos nuevos mecanismos
de comunicación intercelular. Estas vesículas pueden ser transportadas entre
células con una gran especificidad, así se adhieren a las células diana a través de
receptores específicos (En este proceso no es necesaria la fusión de membranas
plasmáticas de las células implicadas, es un proceso que tiene una alta
especificidad). Otro mecanismo a describir es en el cual se produce una fusión entre
la membrana plasmática de la célula diana y los exosomas, esta fusión se produce
mediante endocitosis (Skog J. et al., 2008; Fitzner D. et al., 2011). Otro factor
importante en la comunicación es que los exosomas pueden transferir proteínas,
ARNm y miARNs. Este hecho es importante ya que puede alterar la información
genética de la célula diana, con la consecuente modificación del proteoma y de las
funciones de esa célula concreta (Valadi H. et al., 2007; Mittelbrunn M. et al., 2009;
Sheldon H. et al., 2009). Otro sentido que se le ha proporcionado al transporte de
secuencias genéticas es el de la protección, los exosomas así protegen a esta
secuencias de la degradación que se produciría si estuvieran libres en el medio
extracelular, de esta forma, esta vía de comunicación intercelular es más fiable y
permite que se entregue una mayor concentración de las moléculas transportadas
(Proteínas, ARN, miARNs) (Doreen YPF. Et al., 2013).
Uno de los tipos celulares que produce exosomas son las células del sistema
inmunitario y particularmente estos exosomas poseen una amplia gama de
funciones en el sistema inmune (Chaput N. et al., 2010). Por ejemplo, la función mas
destacada es la de ser moléculas presentadoras de antígenos (Raposo G. et al.,
1996). Los exosomas son capaces de presentar antígenos derivados de varias
enfermedades (Walker JD. Et al., 2009), mostrar inmunosupresores o incluso
presentar sustancias de efecto citotoxico (Alonso R. et al., 2011). Otro efecto
funcional producido por los exosomas en las células inmunes es el ejercido por la
transferencia de miARNs, este se identifico en el mecanismo de respuesta a la
estimulación de antígenos en Linfocitos T (Mittelbrunn M. et al 2011).
El proceso de liberación de exosomas, implica una maduración de reticulocitos, así
pues en el momento de la secrecion de exosomas se pueden arrojar proteínas de
membrana sin utilidad al interior celular, proceso que conlleva la remodelación de la
membrana plasmática (Johnstone RM. Et al., 1991), de esta forma se consigue una
alternativa a la degradación de proteínas no deseadas realizada por el lisosoma.
9
Este mecanismo de secreción se explica porque las proteínas transmembrana
poseen también una forma soluble, de esta manera pueden separarse de la
membrana plasmática e introducirse en el interior de la célula.
Una vez dentro, comienza a formar parte de los endosomas (Como ya se ha visto en
la formación de los exosomas) hasta pertenecer a los cuerpos multivesiculares
(MVBs). Este hecho ha sido demostrado con un gran conjunto de moléculas que
incluyen moléculas de adhesión, factores de crecimiento, receptores (Dello Sbarba
P. et al., 2002).
Los organismos patógenos utilizan a los exosomas como medio de propagación
intercelular y como medio de comunicación. Esto se debe a una capacidad que
poseen los exosomas y es la de transportar proteínas virales entre células y asi
promover la enfermedad, se considera un mecanismo de escape frente al sistema
inmune del organismo (Lenassi M. et al., 2010). Algunas proteínas virales que se
transportan mediante exosomas son los priones, el miARNs (Pegtel DM. Et al.,
2010) y varias proteínas implicadas en la difusión del VIH-1 (Izquierdo-Useros N. et
al ., 2009; Fevrier B. et al., 2004).
Una vez las células tumorales han desarrollado el tumor, comienzan a interactuar
con el medio para estimular procesos de crecimiento, invasión y supervivencia
(Doreen YPF. Et al., 2013). Dentro de estos procesos entra el papel de los
exosomas tumorales que pueden actuar como mediadores importantes de estas
situaciones entre las que se incluyen metástasis (Jung t. et al., 2009; Hood JL. Et al.,
2011), inmunomodulacion (Iero M. et al., 2007), proliferación de células tumorales
(Keller S. et al., 2009 y la angiogenesis (Skog J. et al., 2008). Por ejemplo, estudios
realizados en cáncer renal, han descubierto que exosomas derivados de células
madre del cáncer son capaces de activar angiogenesis y promover la metástasis.
Otra función de estos exosomas tumorales es la de interrumpir las respuestas
inmunes especificas además de diferenciar células a células inmunosupresoras
(Grange C. et al., 2011).
Una de las funciones más importantes que se ha descubierto que tienen los
exosomas es la de ser fuente de biomarcadores de enfermedades renales, es decir,
su presencia en muestras biológicas puede ser indicadora de lesión en alguna parte
10
del sistema renal. Para ello la mejor muestra a analizar es la orina, debido
principalmente a su facilidad en la recogida, ya que es un proceso no invasivo.
Las células epiteliales renales liberan los exosomas urinarios que contienen factores
de transcripción, ARNm, miARNs y podocitos (Celulas propias de los tubulos renales
y células que recubren el sistema de drenaje urinario) (Dimov I. et al., 2009).
El análisis de la fracción exosomica de la orina proporciona información valiosa con
respecto a las enfermedades renales. Por ejemplo, enfermedades genéticas como la
“Enfermedad renal poliquistica autosomica dominante” (PQRAD), los tipos 1 y 2 son
las enfermedades renales más comunes que provocan insufuciencia renal. Las
proteínas Policisteina 1 y Policisteina 2 son el producto de dos mutaciones y se
encuentran en baja concentración en el tejido renal pero son fácilmente detectables
en los exosomas urinarios. Su análisis podría identificar si el paciente padece o no
enfermedad renal (Gonzalez PA. Et al., 2009; Hogan MC. Et al., 2009).
Gracias a análisis de inmunotransferencia también se han detectado mutaciones en
moléculas como el co-transportador Na-Cl sensible a la Tiazida en el tubulo
contorneado distal, que podría diagnosticar el sindroma de Gitelman (Dimov I. et al.,
2009). De la misma manera, por inmunotrasferencia se puede diagnosticar el
sindroma de Bartter Tipo 1 por la ausencia del co-transportador de Potasio-Sodio-
Calcio.
3. OBJETIVO
El objetivo general de esta revisión bibliográfica es hacer una actualización de lo
publicado hasta la fecha relativo a los exosomas y a sus aplicaciones en medicina y
clínica. Primero, hay que poner de manifiesto que los estudios sobre la función de
los exosomas como biomarcadores de enfermedad renal son muy recientes, por
tanto hay aun mucho que investigar ya que pueden servir eficazmente como ayuda
en el diagnostico clínico de diversas patologías renales. Se ha planteado esta
revisión con estructura de trabajo de investigación en el que además de plantear las
aplicaciones de los exosomas, también se han explicado los aspectos metodológicos
relativos a su aislamiento.
11
Así, este objetivo general puede dividirse en los siguientes objetivos específicos:
1) Describir las características, composición y funciones biológicas de los
exosomas presentes en diferentes fluidos corporales.
2) Analizar y comparar los distintos protocolos que se han utilizado para el
aislamiento y caracterización de los exosomas.
3) Investigar las aplicaciones de los exosomas como marcadores diagnósticos
de enfermedad y, más concretamente, de los exosomas presentes en la orina
y de las alteraciones en su composición como marcadores de enfermedad
renal.
4. AISLAMIENTO DE EXOSOMAS
4.1 Aspectos generales
Los métodos y protocolos de aislamiento de exosomas varían dependiendo del fluido
corporal de origen (Doreen YPF. Et al., 2013). Como se ha resaltado anteriormente
el mejor liquido corporal para el estudio de los exosomas es la orina. Esto se debe
principalmente a la consideración de dos factores importantes antes de proceder al
aislamiento y análisis de los exosomas, que son, la obtención y el tratamiento de la
muestra. Con respecto a este hecho, la obtención de la muestra, es más fácil de
realizar y es un método menos invasivo en orina que en comparación con sangre
(Hua Zhou et al., 2006).
En relación al tratamiento de la muestra antes de proceder con los métodos de
aislamiento, se recomienda el uso de inhibidores de proteasa dentro de los
contenedores de recogida para conservar la muestra y así preservar perfectamente
la composición proteica de la muestra de orina. Las muestras pueden ser
procesadas inmediatamente después de su recogida o se pueden almacenar a -
80ºC (Gámez-Valero A. et al., 2015). En resumen, si se ha realizado el
procedimiento normal de gestión de muestras de orina, la contaminación no debería
existir (Witwer KW. Et al., 2013; Jacquillet G. et al., 2013).
12
4.2 Métodos de aislamiento de exosomas
Para poder estudiar las funciones y aplicaciones particulares que poseen estas
vesículas extracelulares primero hay que recluirlas para su posterior análisis.
Básicamente lo que hay que hacer es separar la fracción celular, de la fracción
exosomal en la muestra de orina aunque este proceso es complejo debido a su
desconocimiento en la actualidad. En este apartado del estudio, se resumen los
diferentes métodos que se utilizan para aislar los exosomas en muestras de orina.
4.2.1 Pre-aislamiento
Una vez se va a iniciar el proceso de aislamiento de exosomas urinarios hay que
tener en cuenta la presencia de la proteína Tamm-Horsfall (THP) (Uromodulina) la
cual es un componente común de las muestras de orina en condiciones fisiológicas y
patológicas. La explicación de por qué hay que tener en consideración la presencia
de esta proteína es, que posee la capacidad de interferir en el estudio y aislamiento
de exosomas (Gámez-Valero A. et al., 2015).
En solución a esto, se recomienda realizar algunas de las técnicas de pre-
aislamiento para así poder eliminar o al menos poder reducir considerablemente la
presencia de la THP antes de comenzar con métodos propios de aislamiento y
determinación de exosomas (Witwer KW., et al. 2013; Rood IM., et al., 2010).
El tratamiento con mayor éxito escogido para evitar la acción de la proteína THP ha
sido el TDT (Fernández-Llama P., et al., 2010), aunque también existe una
alternativa, y es el uso de “3-[(3-colamidopropil(dimetilamonio]-1 sulfonico propano”
(CHAPS), el cual se trata de un leve detergente que es capaz de disolver el THP. Un
hecho a favor del método CHAPS es que preserva la conformación de la proteína y
sus actividades enzimáticas (Musante L. et al., 2012), sin embargo, una desventaja
de este método es que la duración de la técnica es mayor que en el tratamiento
TDT. (Salih M., et al., 2014).
Una vez utilizados alguno de estos métodos, la muestra de orina ya está preparada
para el aislamiento de los exosomas.
13
4.2.2 Ultracentrifugación
La primera vez que la ultracentrifugacion fue utilizada para realizar el aislamiento de
exosomas fue durante la década de los 80 (Harding C. et al., 1983; Jonhstone. Et al.,
1984) y desde entonces ha sido ampliamente utilizada, aun independientemente del
origen de la muestra.
Este método se basa en una ultracentrifugación diferencial de dos etapas (UC) para
así aislar correctamente los exosomas. La primera centrifugación es a baja velocidad
(10.000-17.000 g) para eliminar los cuerpos apoptoticos, los deshechos celulares y
en definitiva aquellas vesículas de gran tamaño que no nos interesan. La segunda
centrifugación, ahora si a gran velocidad (100.000-200.000 g) es capaz de retener la
fracción exosomal (Gámez-Valero A. 2006).
Figura 4: Esquema ilustrativo de los diferentes pasos a realizar en la
ultracentrifugacion. Zhou et al. Kidney Int. 2006 ; 69(8): 1471–1476.
Cabe destacar que en ciertas situaciones, la ultracentrifugacion se puede
complementar con una etapa de filtración para eliminar con más seguridad las
vesículas y proteínas de gran tamaño. Sin embargo, la inclusión de esta etapa de
filtración no está bien valorada por algunos autores, los cuales defienden que esta
filtración puede llegar a fracturar estas proteínas de gran tamaño y transformarlas en
compuestos más pequeños que pueden incluirse en la fracción exosomal e interferir
en el resultado del método de aislamiento (Witwer KW. Et al., 2013).
14
En condiciones patológicas, como por ejemplo puede ser la alteración de la filtración
glomerular (En el glomérulo se produce una “depuración” de la sangre que llega al
riñón para así eliminar las sustancias de desecho, si esta función está alterada,
cualquier compuesto puede llegar a la orina) existe una fuga masiva de proteínas
hacia la orina, estos compuestos, junto con THP puede aislarse con los exosomas y
aparecer en la fracción exosomal centrifugada. Las principales soluciones para evitar
este problema y obtener así una muestra más purificada es procesar los sedimentos
por gradientes de densidad de sacarosa (Raj DA. Et al., 2012) o gradientes de
densidad de potasio “Bromideoriodix-anol” (Optiprep) que son capaces de eliminar
los contaminantes (Yuana Y. et al., 2014; Van Deun J. et a., 2014).
Los principales problemas de este método se basan en la compleja aplicabilidad a la
práctica clínica que poseen, ya que los equipos necesarios son costosos y no existe
un protocolo universal (Cvjetkovic A. et a., 2014). A pesar de esto, es la técnica más
usada y la más importante actualmente para el aislamiento estas vesículas
extracelulares.
4.2.3 Filtración
El fundamento de esta técnica es hacer pasar la muestra de orina a través de una
nanomembrana, estas nanomembranas en general suelen ser de éter o PVDF. La
muestra sufre una pequeña centrifugación a velocidad muy lenta y así se consigue
evitar la ultracentrifugacion. Este método se analizo como una nueva opción para el
aislamiento de vesículas extracelulares urinarias ya que una de sus principales
ventajas es que se pueden usar volúmenes muy pequeños de muestras. Se detecto
que proteínas típicas de la composición de los exosomas eran retenidas en la
nanomembrana, aunque cabe mencionar que la obtención final requiere una etapa
de lavado adicional (Cheruvanky A. et al., 2007).
15
Figura 3: Esquema del proceso de aislamiento de exosomas mediante Filtracion.
Cheruvanky A., Zhou H., Pisitkun T., Kopp J., Knepper M., Yuen Peter., and Star R.,
(2006). Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane
ultrafiltration concentrator. Journal Physiology Renal. 292: 1657-1661
Se ha descubierto además, que existe una lenta recuperación de los marcadores de
exosomas, ya que se encuentran unidos a estas proteínas por el co-aislamiento que
se produce, por ejemplo, se suele encontrar a la albumina dentro del sedimento
urinario exosomal (Rood IM. et al., 2010). La retención y la adherencia de proteínas
a la nanomembrana son importantes desventajas que actualmente encuentra este
método para poder aislar eficientemente los exosomas de la orina de los pacientes
(Gámez-Valero A. et al., 2015).
Las soluciones para este método es el uso de la ultrafiltración, que se caracteriza
por el uso de una membrana de baja unión a proteínas o una filtración aplicando
vacio. Aplicando estas opciones se pueden purificar los exosomas urinarios a partir
muestras con poco volumen (Merchant ML. Et al., 2010).
4.2.4 Aislamiento basado en la Inmunoafinidad.
Como se ha comentado anteriormente, los exosomas poseen proteínas típicas de su
superficie (Tetraspanina). Empleando esta expresión proteica en la superficie de la
vesícula, se han desarrollado métodos para el aislamiento de exosomas basados en
la afinidad hacia estas proteínas.
Estos métodos se basan en utilizar anticuerpos (Soportes o péptidos magnéticos),
capaces de reconocer y unirse específicamente a estas proteínas superficiales de
16
los exosomas, por esta razón se les conoce como métodos de inmuno-afinidad
(Wang D. et al., 2014; Kalra H. et al., 2013). Es relevante mencionar que este
inmuno-aislamiento requiere también una etapa de centrifugación a baja velocidad
para concentrar las vesículas extracelulares y obtener la fracción exosomal (Salih M.
et al., 2014; Witwer KW. Et al., 2013).
Otra variable de este método es utilizar péptidos sintéticos que posean afinidad
especifica por proteínas de choque térmico (Chaperonas), que se tratan de
marcadores de exosomas (Kim DK. Et al., 2014). El péptido denominado Vn-96
puede ser el elegido, ya que es capaz de retener y capturar los exosomas a partir de
muestras de orina o sangre e incluso en el sobrenadante de cultivos celulares
(Ghosh. A., et al., 2014).
En definitiva, debido a la falta de marcadores específicos de vesículas
extracelulares, los exosomas obtenidos con estas técnicas podrían no estar
estructuralmente completos, es decir, estarían segados, dependiendo del órgano
utilizado o el péptido usado, por esta razón no es el método más fiable para el
aislamiento (Kowal J. et al., 2014).
4.2.5 Agentes de agregación
En los últimos años, se han introducido también como técnicas de aislamiento de
exosomas el uso de reactivos de precipitación comerciales como por ejemplo
“ExoQuick TC”, “Invitrogen”, “Exospin” y “miRCURY”. Estos kits de aislamiento de
exosomas se usan en muestras de orina además de otros líquidos corporales y
realizan también una centrifugación a baja velocidad para que se produzca la
agregación de la fracción exosomal (Gámez-Valero A. et al., 2015).
La ventaja de este método es su rápido rendimiento y su fácil aplicación. Además
posee una gran aplicabilidad en laboratorios de diagnostico (Schageman J. et al.,
2013; Musante L. et al., 2014).
Sin embargo, este método también posee desventajas. El principal inconveniente es
que el agregado de partículas que se obtiene se trata de una mezcla compleja de
exosomas mas proteínas que van a interferir en la determinación especifica de los
exosomas (Álvarez ML. Et al., 2012). Además de este factor, cabe resaltar que estos
métodos también requieren pre-tratamientos específicos de la muestra para eliminar
17
las vesículas y proteínas de gran tamaño (Wang D., et al., 2014; Witwer KW. Et al.,
2013; Salih M. et al., 2014; Van Deun J. et al., 2014).
4.2.6 Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)
La aplicación principal de esta técnica es la de fraccionar muestras biológicas
complejas como pueden ser orina y plasma, para así poder tener un mejor acceso
al aislamiento eficaz de exosomas. Esto es así porque en el proceso de exclusión
por tamaño se eliminan los principales contaminantes, tales como agregados de
proteínas, lipoproteínas y en general compuestos “co-aislados” por
ultracentrifugación (UC) que poseen gran tamaño.
En experimentos anteriores, en los cuales se utilizo la ultracentrifugacion y a
continuación la cromatografía por exclusión de tamaño se demostró que existen
contaminantes que pueden enmascarar la presencia de marcadores de exosomas
importantes, aumentando así la importancia que tiene eliminar la mayor cantidad de
contaminantes para obtener una fracción exosomal fiable ( Rood IM. Et a., 2010).
Cabe destacar que recientemente se han realizado estudios en los cuales se ha
podido aislar exosomas morfológicamente intactos mediante esta técnica tanto en
sangre (Muller L. et al., 2014; Boing AN. Et al., 2014) como en orina (Gamez-Valero
A. et al., 2015).
Por tanto, se puede emplear esta técnica para obtener resultados eficientes y asi
también poder valorar la opción de ser implantada en el entorno clínico.
4.2.7 Métodos basados en microfluidos
Recientemente se han desarrollado métodos basados en microfluidos. Por ejemplo,
ExoChip es una plataforma basada en esta técnica que consiste en una matriz de
“polidimetilsiloxano” cubierta de “Abs” específico contra un marcador exosomal típico
como es la proteína CD63. Básicamente estos kits se han desarrollado para aislar
exosomas mediante inmuno-afinidad. Un factor a favor de este método es que no
requiere una etapa de separación o fracción de la muestra para cuantificar los
exosomas, sino que estos son marcados con un tinte fluoresencente y después se
pueden leer en un lector de placas.
18
En la actualidad existe también una plataforma de microfluidos para el aislamiento
de exosomas basada en el diámetro y en el desplazamiento lateral. Los primeros
estudios han mostrado una separación eficiente entre los exosomas sin alterar la
morfología y la biología de la vesícula extracelular, pero al ser estudios tan recientes,
se debería analizar profundamente con experimentos adicionales. De hecho, no esta
tan claro que se pueda separar exosomas en muestras biológicas complejas en las
que las densidades son altamente variables (Santana SM. Et al., 2014).
4.2.8 Diálisis hidrostática
Esta novedosa técnica se basa en una diálisis hidrostática para aislar los exosomas
sin necesidad de realizar una ultracentrifugación y tiene su principal ventaja en que
es una posible solución para muestras muy diluidas. Una diálisis se define como un
proceso de separación de sustancias que están juntas o mezcladas en una misma
disolución, a través de una membrana que las filtra. Técnicamente este método
consiste en la separación de la fracción exosomal, de la fracción celular de la
muestra que pueda contener los contaminantes. Esta diálisis de membrana tiene
capacidad para separar sustancias de peso molecular 1.000 kDa, para así poder
eliminar todos los contaminantes posibles en muestras a analizar (Musante L. et al.,
2014).
En conclusión, aunque se ha comprobado que recientemente se han desarrollado
varios métodos de aislamiento de exosomas, todavía se está buscando el más
adecuado. Esto es debido a la gran variabilidad de resultados que se han obtenido al
comparar diferentes métodos (Álvarez ML. Et al., 2012), aun así, el método más
recomendado actualmente para obtener una fracción exosomal fiable es la ultra
centrifugación.
19
Tabla 1: Diferentes métodos de aislamiento y purificación, separación, identificación
y cuantificación de los métodos utilizados con exosomas urinarios relacionados con
los estudios de biomarcadores.
5. EXOSOMAS URINARIOS COMO BIOMARCADORES DE DISFUNCION
RENAL
5.1 Enfermedades renales
El riñón es el principal órgano implicado en el mantenimiento de la homeostasis del
medio interno, es decir, de la regulación del volumen y la composición química de
este. Mediante la formación de orina se eliminan del organismo gran cantidad de
20
residuos metabólicos procedentes del metabolismo endógeno (urea, acido úrico,
creatinina) y de productos administrados (Fármacos). La principal alteración en la
función del riñón es la enfermedad renal crónica (ERC). Este defecto es un problema
de salud pública que causa una importante mortalidad, de hecho, muchos estudios
concluyen sugiriendo que las enfermedades renales crónicas (ERC) predicen el
riesgo de mortalidad en la población general (Matsushita K. et al., 2010).
Existen diferentes terapias para los pacientes con enfermedad crónica renal y las
principales incluyen la hemodiálisis o diálisis peritoneal y el trasplante renal, siendo
este la mayor elección por parte de los pacientes (Wolfe RA. Et al., 1999) debido a
los notables avances que se han realizado en los últimos años, aunque hay que
poner de manifiesto que aun así, el rechazo inmunológico al injerto y los efectos de
los fármacos tienen importantes consecuencias negativas a largo plazo para el
paciente.
Nuestro trabajo trata de encontrar alguna relación entre los exosomas y la
enfermedad renal, para ello, es fundamental el estudio de la función renal, que
puede investigarse a través de biopsia renal (El cual es un método invasivo no muy
recomendable) o estudiarse mediante la medición de la tasa de filtración glomerular,
el aclaramiento de creatinina o la proteinuria.
En cualquier caso, como se ha comentado anteriormente el estudio de la orina se ha
convertido en la fuente perfecta de biomarcadores renales para el desarrollo de
nuevas herramientas de diagnostico. En primer lugar, se comenzó a estudiar la orina
total pero actualmente se le ha dado más interés a estudiar la fracción exosomal de
la orina. Esto es debido a que los exosomas pueden ser secretados por cualquier
parte del sistema renal como las estructuras glomerulares, células de los túbulos
renales y en general, las células que recubren todo el sistema renal (Figura 4), lo
que se traduce en que no solo se puede conocer la composición proteica
característica de la enfermedad renal (Hoorn EJ. Et al., 2005; Dear JW. Et al., 2013)
si no que también se puede llegar a saber la localización exacta, es decir, el tejido
concreto donde existe la alteración (Pisitkun T. et al., 2006; Miranda KC. Et al.,
2010).
21
Figura 6: Imagen que ilustra las diferentes zonas del sistema renal por las cuales
pueden liberarse exosomas y la composición proteica característica de cada zona.
5.2 Daño renal agudo
Por definición, el daño renal agudo, es un trastorno que se caracteriza por una
disminución veloz de la tasa de filtración glomerular y la consecuente retención de
productos de desecho (Lamiere N. et al., 2005).
Clásicamente el biomarcador usado para esta patología era el valor de
concentración de creatinina sérica (SCR) ya que se ha demostrado que la
concentración de creatinina serica (SCR) se eleva cuando existe una disminución de
la filtración renal de al menos el 30%. Sin embargo, en nuevos estudios se descubrió
que los altos niveles de SCR no están asociados al origen de la lesión renal
(Barrera-Chimal J. et al., 2011) además de que sus concentraciones varían
22
ampliamente, por tanto, estas razones reflejan la necesidad de encontrar nuevos
biomarcadores mas eficaces.
Inmediatamente después, como respuesta a estos descubrimientos, los
biomarcadores propuestos para el diagnostico precoz del daño agudo renal fueron
NGAL (Lipocalina gelatinasa asociada a los neutrofilos), la interleucina 18 (Wang D.
et al., 2014; Mishra J. et al., 2005), y algunas proteínas como las chaperonas (En
concreto la Hsp72) (Barrera-Chimal J. et al., 2011; Morales-Buenrrostro LE. Et al.,
2014). En estudios posteriores, se sabía que la Fenituina A formaba parte de la
composición de los exosomas urinarios, se detecto que este compuesto aparecía
después de la lesión renal pero, no solo aparecía aumentada después, sino también
aparecía aumentada antes de cualquier cambio estructural que se detectase en una
biopsia renal (Zhou H. et al., 2006). Además el mismo equipo de investigación
identifico el factor de transcripción 3 (ATF3) en la fracción exosomal de la orina.
Como se puede observar se han encontrado varios compuestos que pueden ser
biomarcadores pero cabe mencionar que todos estos biomarcadores se detectaron
en pacientes, es decir, no se encuentran en individuos sanos en las proporciones
que estamos analizando.
5.3 Trastornos glomerulares
La barrera de filtración glomerular está compuesta por la membrana glomerular
basal, las células endoteliales y las células epiteliales, en cuyo caso se denominan
“podocitos”. La lesión de esta estructura se traduce en una pérdida de proteínas y
células de la sangre ya que no existe filtración (Lennon R. et al., 2014). En general,
en los trastornos glomerulares, los podocitos son las principales células afectadas
por lo tanto el estudio de podocitos en la composición de exosomas puede ser una
fuente fiable de biomarcadores para trastornos glomerulares.
5.3.1 Nefropatía diabética
Esta patología se origina debido al daño que ejerce el exceso de glucosa en sangre
sobre las nefronas. Para detectar esta enfermedad se realizo un estudio para
describir la expresión de miARNs de exosomas procedentes de pacientes control y
otros con micro-albumina (Diabéticos). Los resultados fueron diferentes dependiendo
23
del miARN usado, por ejemplo los niveles de miARN-145 y miARN-130 aumentaron
en pacientes diabéticos en comparación con los control, mientras que con el estudio
de miARN-155 y miARN-424 los pacientes control mostraron niveles similares y en
los diabéticos disminuyeron (Barutta F., et al., 2013), por lo que los estudios de
miARNs pueden resultar eficaces aunque se necesitan más experimentos para
asegurarse.
Otro biomarcador relevante para este trastorno es la enzima dipeptidil-peptidasa. Se
sabe que la concentración de esta enzima se sobre expresa en situación de
diabetes, así pues, se realizo un experimento con pacientes diabéticos y control para
comprobar su relación. Los resultados fueron los esperados, se detecto una mayor
sobreexpresión para esta enzima en los exosomas de los pacientes diabéticos en
comparación con los pacientes control (Sun AL. Et al., 2012). Por tanto estos
biomarcadores son prometedores en investigación pero se recomienda seguir
haciendo más estudios para corroborar los datos.
5.3.2 Glomerulonefritis
La glomerulonefritis es una inflamación de los glomérulos renales debida a la
acumulación de un gran número de anticuerpos en el glomérulo. Dentro de esta
patología, la nefropatía causada por la Ig A es el trastorno más común.
Concretamente, la nefropatía por Ig A puede aparecer por varios factores como la
síntesis de anticuerpos dirigidos a la “galactosa deficiente de Ig A” o la unión de la
“galactosa deficiente de anticuerpos (Ig A)” con glicopeptidos para así formar
complejos que a su vez se acumulan en el glomérulo (Suzuki H. et al., 2011). Se
llevo a cabo el aislamiento de los exosomas de pacientes con este trastorno y se
identifico un biomarcador, la CeruloPlasmina (CP) ya que se encontró en mayor
concentración en pacientes afectados que en los individuos sanos (Moon PG. Et al.,
2011) aunque se necesitan estudios más profundos para confirmar los resultados.
Otra patología relacionada con la glomerulonefritis es la glomeruloesclerosis
producida por podocitos que puede ser autoinmune o secundaria a la obesidad. Los
experimentos identificaron como biomarcador la proteína 1 del tumor de Wilm, que
se trata de un factor de transcripción fundamental para el desarrollo normal de los
24
riñones. Este se encontraba aumentado en los exosomas de pacientes enfermos
(Zhou H. et al., 2008). Años más tarde se realizo el mismo experimento con una
cohorte más grande de pacientes y los resultados fueron idénticos (Zhou H. et al.,
2013). Este sería un buen biomarcador de enfermedad renal.
5.3.3 Nefropatía en la membrana basal (TBMN)
La nefropatía de la membrana basal delgada del glomérulo renal se caracteriza por
una proteinuria mínima, una hematuria no progresiva y una función normal debido a
que la membrana basal aun está presente, solamente que ha adelgazado. Se cree
que está causada por la mutación en genes del colágeno como COL4 y COL5
(Tryggvason K. et al., 2006).
Los biomarcadores detectados en la composición de los exosomas de pacientes de
TBMN son la amino peptidasa N y los precursores de vasorine. Estos se
incrementaron en pacientes con TBMN así pues se podrían utilizar como
biomarcadores para el diagnostico de este trastorno (Moon PG. Et al., 2011).
5.4 Fibrosis renal
La fibrosis renal causa la degeneración progresiva del riñón y está relacionada con
la enfermedad renal crónica (ERC) en que este trastorno conduce a la insuficiencia
de varios órganos en las etapas finales de la ERC. Por tanto el estudio de
biomarcadores para la fibrosis renal es de gran relevancia ya que como se ha
comentado anteriormente la ERC es una de las causas de mortalidad más
importantes en el mundo. Estudios realizados con los miARNs contenidos en
exosomas urinarios han demostrado que comparando individuos sanos con
pacientes de ERC, se han detectado niveles reducidos de miARN-29 y miARN-200
en los pacientes de ERC (Lv LL. et al., 2013). Además, se encontró que tanto
miARN-9a y miARN29c pueden discriminar entre la fibrosis leve y la fibrosis severa.
Otro descubrimiento con respecto al estudio de los ARNs fue evaluando ARNs
mensajeros, en concreto la sinaptodina y la CD2AP. Los estudios reflejaron un
aumento de sinaptodina en detrimento de CD2AP que disminuía su concentración
en pacientes de ERC. En definitiva estos resultados apoyan la idea de utilizar el
25
contenido de ARN de los exosomas urinarios como herramientas de diagnostico en
el estudio y evaluación de enfermedades renales (Lv LL. et al., 2014).
5.5 Trastorno poliquistico renal
Se define la enfermedad renal poliquistica (PKD) como un trastorno genético que se
caracteriza por una serie de dilataciones quísticas del riñon que pueden causar una
afectación multiorganica. El origen principal de esta patología es una alteración en la
regulación genética de los genes PKD1, PKD2 o PKHD1 (Gonzales PA. Et al., 2009;
Hartung EA. Et al., 2014). Los productos de estos genes se detectan fácilmente en
los estudios proteomicos de los exosomas urinarios de pacientes, por lo que, podría
ser considerado para el análisis de la enfermedad (Pisitkun T. et al., 2006; Hogan
MC. Et al., 2009).
5.6 Trasplante renal
El trasplante renal es la opción más recomendada para pacientes con enfermedad
renal en la etapa terminal, aunque como se ha identificado, aun existen problemas
con los injerto ya que se suele producir el rechazo inmunológico. Debido a esto, una
vez hecho el trasplante, se han realizado varios estudios para investigar sobre las
enfermedades renales después del trasplante de riñón.
Los primeros estudios que usaron exosomas urinarios identificaron que la presencia
de NGAL en pacientes con trasplante de riñón era considerablemente diferente a la
concentración de NGAL de individuos control, además de que no hubo diferencias
significativas de concentración de NGAL en las muestras proporcionadas por
pacientes vivos y pacientes fallecidos por lo que el análisis de la concentración de
NGAL podría ser un biomarcador de daño en el injerto (Álvarez. Et al., 2013).
Otro marcador estudiado en los últimos años es la proteína CD133 exosomal. Se
sabía que en donantes sanos la concentración de esta proteína era elevada
mientras que en pacientes con enfermedad renal crónica (ERC) era muy baja en su
etapa terminal. La cuestión está en que en pacientes trasplantados se detecto una
concentración menor que en los individuos sanos, pero más elevada que en los
26
pacientes con la enfermedad crónica. Por tanto, esta proteína CD133 de la fracción
exosomal podría servir como biomarcador para valorar la función tubular renal y la
regeneración tisular después del trasplante, de esta forma poder realizar un
seguimiento del paciente para detectar un rechazo al injerto o la regeneración tisular
completa (Dimuccio V. et al., 2014).
5.7 Implicaciones en el cáncer
Los exosomas también se han estudiado para conocer si están implicados en los
procesos tumorales, actuando a nivel de mensajeros llevando información de un
lugar a otro del organismo. Los principales trastornos en los que se han estudiado
los exosomas son el carcinoma renal celular (RCC), el cáncer de vejiga y el cáncer
de próstata.
5.7.1 Carcinoma renal celular
Con respecto al carcinoma renal, los primeros estudios realizaron comparaciónes
entre los perfiles proteicos de los exosomas de pacientes de RCC y de individuos
control esperando diferentes resultados en ambas muestras. Al finalizar el estudio,
las hipótesis se corrobororan y específicamente los compuestos MMP-9 y EMMPRIN
se encontraban sobre expresados en los pacientes de carcinoma renal. Es
interesante resaltar que no solo se detecto la presencia, si no que se identifico su
relación con la progresión de la enfermedad, es decir, como potenciadores de la
metástasis (Raimondo F. et al., 2013).
5.7.2 Cáncer de vejiga
Al estudiar el cáncer de vejiga, recientemente se ha descrito que los exosomas
urinarios de pacientes con cáncer de vejiga poseen compuestos que promueven la
migración celular para así facilitar la progresión del cáncer. Este diagnostico se
realizo estudiando la proteína TACSTD2 en una pequeña población de individuos
(Chen CL. et al., 2012). Cabe destacar los estudios realizados por Pérez et al, que
describen un perfil de expresión diferente para cuatro ARNs mensajeros
encontrados en exosomas. Estos ARNm codifican información para las proteínas
27
LASS2, GALNT1, ARHGEF39 y FOXO3 (Pérez A. et al., 2014). En resumen tanto
GALNT1 como LASS2 se identificaron solo y exclusivamente en los exosomas
urinarios de los pacientes con cáncer de vejiga mientras que ARHGEF39 y FOXO3
se detectaron en los pacientes control. En conclusión estos marcadores podrían
utilizarse para evaluar la presencia del cáncer aunque se necesitan aun mas
estudios para los biomarcadores en cáncer de vejiga.
5.7.3 Cáncer de Próstata
El cáncer de próstata o hiperplasia benigna de próstata es una de las patologías
más comunes en los varones aunque solo una pequeña proporción progresa a
enfermedad de tipo agresiva. Actualmente para su diagnostico se incluye la
determinación sérica del antígeno prostático especifico (PSA) mediante biopsias. El
problema de este método es que puede fallar al identificar correctamente si se trata
de cáncer agresivo o no agresivo, lo que implica un exceso de pacientes a tratar
(Nogueira L. et al., 2010).
A raíz de este problema, en principio la orina sería el mejor fluido biológico para
encontrar nuevos biomarcadores pero un estudio mostro que en este caso, se
identifican mas en plasma sanguíneo (Hessvik NP. Et al., 2013). En relación a los
estudios de orina, realizando una comparación entre pacientes afectados por este
cáncer e individuos sanos, se identificaron las proteínas PSA y PSMA en exosomas
de los pacientes enfermos con lo cual pueden servir de biomarcadores (Mitchell PJ.
Et al., 2009). Un factor importante es si los exosomas urinarios también realizan una
función de comunicación para promover la metástasis y recientemente se han
encontrado unas proteínas (ITGA3 e ITGB1) específicamente en pacientes con
cáncer de próstata y metástasis mientras que estas proteínas no aparecen en
pacientes con el cáncer y sin metástasis (Bijnsdorpl V. et al., 2013).
6. CONCLUSION
Nuestro objetivo era el de realizar una revisión bibliográfica de la implicación de los
exosomas en las enfermedades renales. Como se ha podido observar, poseen
ventajas e inconvenientes ya que dado su reciente descubrimiento existen muchos
28
métodos a seguir y muchos resultados dispares que abren un gran abanico de
posibilidades en la investigación para mejorar la capacidad de diagnostico.
Este hecho, provoca que no se puedan dar unas conclusiones concretas sobre este
tema pero se puede resumir en que debido a la naturaleza no invasiva del
procedimiento de toma de muestras y la gran cantidad de información disponible a
partir de todos estos estudios, será probable que el análisis de exosomas tenga un
rol importante en la investigación de enfermedades renales en el futuro.
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