УДК 615 35 : 547.96 : 577.15

ФЕРМЕНТЫ И БЕЛКОВЫЕ ПРЕПАРАТЫВ МЕДИЦИНЕ

Н. Ф. Казанская, Н. И. Ларионова, В. П. ТорчилинМосковский государственный университет им. М. В. Ломоносова,

Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР

Применение ферментов и других физиологически активных ве-ществ (ФАВ) белковой природы1 в терапии имеет давние традиции.Современная медицина все нщре использует высокоочищенные (пре-параты ФАВ белковой природы в самых различных отраслях кли-нической медицины в качестве перспективных средств медикамен-тозного лечения вследствие их /исключительно высокой активностии специфичности [7]. В настоящее время наметились следующиеосновные направления энзимотерапии: 1) устранение дефицитаферментов с целью компенсации врожденной или приобретеннойфункциональной недостаточности; 2) удаление нежизнеспособных,денатурированных структур, клеточных и тканевых осколков;3) лизис тромбов; 4) комплексная терапия злокачественных ново-образований; 5) дето'ксикация организма. Все эти аспекты болееили менее широко рассматривались в течение последних десяти леткак в оригинальных статьях, так и в обзорных работах [15, 30, 31,45]. В настоящей работе мы остановимся на современном состоя-нии и перспективах использования ФАВ белковой природы в тера-певтических целях, исключая из рассмотрения их применение вклиническом анализе.

Применение ферментов для заместительной терапии практику-ется уже давно, причем необходимого увеличения количества фер-мента во внеклеточных жидкостях и пищеварительных соках дости-гают сравнительно легко. Для лечения расстройств пищеваренияпредложено множество препаратов, содержащих смесь ферментовживотного и растительного происхождения, расщепляющих белки,жиры, углеводы, и другие компоненты. Мы не имеем возможностиохватить обширную область расстройств пищеварения и обменавеществ, рассмотреть разнообразные показания для заместительнойтерапии и перечислить имеющиеся препараты. Эти вопросы подроб-но освещены [30], приведем лишь некоторые примеры. При эндо-кринной недостаточности поджелудочной железы особое значениепридается введению панкреатических ферментов, а для предупреж-дения появления неприятных симптомов после еды рекомендуютсяпрепараты, содержащие, кроме того, желчные соли, кислоты, цел-люлазы. Гидролитические ферменты (чаще всего папаин, бромела-ин, панкреатические ферменты в сочетании с целлюлазами) с ус-пехом применяются последние годы для растворения желчныхбезжировых камней. Главным фактором, влияющим на эффектив-ность оральной ферментной терапии, является инактивация пан-креатических ферментов иод действием желудочного^ сока. С цельюповышения локального рН в желудке до 4,0 рекомендуется сочетать

применение протеаз с бикарбонатом натрия или гидроокисью алю-миния. Другим подходом, позволяющим уменьшить вредное воздей-ствие содержимого желудка на протеазы, является получение пре-паратов ферментов в кишечно-растворимой оболочке.

Лечение врожденных энзимопатий, которых за последние двадесятилетия описано более 150, является важной проблемой за-местительной терапии. Такие наследственные заболевания, как гли-когенозы, липидозы, мукополисахаридозы и другие «лизосомаль-ные» болезни, пытались лечить внутривенным введением соответст-вующих нативных ферментов, выделенных из биологических жид-костей и тканей человека [31, 32]. Однако получить удовлетвори-тельные результаты не удалось, особенно для лизосомальныхболезней, характеризующихся патологическим накоплением суб-страта в нервных клетках. Причина неудач в быстром выведениинативных ферментов из кровотока и захвате печенью и в основномв непреодолимости гематоэнцефалического барьера и невозмож-ности проникновения ферментов в лизосомы нейронов. Клиническоеприменение ферментов (протеазы, коллагеназы и гиалуронидазы)для лечения различных гнойно-воспалительных процессов основанона их некролитическом, муколитическом и противоотечном действии,на способности снижать антибиотикорезистентность микробнойфлоры [5]. Протеазы животного и бактериального происхожденияиспользуются в хирургии [17] при лечении гнойных заболеваниймягких тканей, костей (при остеомиелитах и гнойных артритах),легких и плевры, при туберкулезе [3]. Одной из важнейших облас-

тей применения протеиназ являются термические ожоги. Местнаяэнзимотерапия при глубоких ожогах позволяет снизить летальностьъ токсемическом периоде, ускорить очищение и заживление раны,в большинстве случаев избегать пересадки кожи [17]. Ферментнаятерапия эффективна в травматологии и ортопедии, она способству-ет сокращению сроков лечения переломов, вывихов, растяжениясвязок, разрывов мышц [7, 17]. Довольно широко в ортопедическойклинике для лечения рубцов различного происхождения, контрак-тур и т. д. применяется гиалуронидаза. Весьма активно энзимотера-пия используется в отоларингологии для лечения дифтерии, тон-зиллита, ларингита, отита и т. д. [-5]. В стоматологической практи-ке протеазы являются многообещающими в гнойной хирургии-челюстно-лицевой области, в лечении тканей пародонта [9]. Такимобразом, приведенные данные свидетельствуют о том, что областиприменения протеиназ для лечения воспалительной реакции прак-тически безграничны.

В медицинской энзимологии вряд ли существует проблема, ко-торая исследовалась бы так же всесторонне и интенсивно, какпроблема лизиса тромбов. Острые тромбоэмболии сосудов по-преж-нему остаются основной причиной заболеваемости и смертностилюдей зрелого возраста. Мы не будем останавливаться на рассмот-рении современных представлений о механизмах свертывания кро-ви и фибринолиза, литература в этой области огромна [1, 7, 25].Укажем лишь, что образование и лизис тромба представляют собой

весьма сложный .каскад протеолитических процессов, в которомключевые позиции отводятся плазмину, тромбину и фибрину. Воз-можны два основных подхода к тромболитической терапии: 1) ис-пользование активаторов превращения плазминогена в плазмин,таких, как, стрептокиназа и урокиназа; 2) использование протеаз,оказывающих прямое фибринолитическое действие, таких, как самплазмин, трипсин, химотрипсин. Во многих случаях рекомендуетсясочетать ферментную и антикоагулянтную терапию [17]. В послед-ние годы как перспективные указываются ферменты тринсинопо-добного типа, выделенные из яда змей, в присутствии которых об-разуются сгустки фибрина, механически менее прочные, и поэтомуболее чувствительные к лизису — гемотромбиновый сгусток [30].Применение стрептокиназы и урокиназы при лечении инфарктамиокарда и легочной эмболии приводило к быстрому и стойкомуулучшению, однако после парентерального введения стрептокиназывозникали аллергические симптомы [7, 30]. Протеолитическиеферменты различного происхождения оказались эффективнымипри различных заболеваниях сосудов, таких, как артериальныетромбозы (периферические и мозговые), поверхностный и глубокийтромбофлебит [7, 17, 30]. Механизм действия трипсина и химотрии-сина в случаях патологического внутрисоеудистого тромбообразо-вания определяется их противовоспалительным и противоотечнымдействием и способностью активировать антисвертывающую систе-му крови, что выражается в повышении фибринолитической актив-ности плазмы в условиях практической неизменности показателейсвертывающей системы.

В связи с рассмотрением разнообразных примеров медицинскогоприменения протеолитических ферментов весьма уместно* упомянутьо широком использовании их белковых ингибиторов. Показаниямик их применению являются: 1) врожденный дефицит ингибиторовпротеиназ, в частности агантитрипсина; 2) патологическая актива-ция протеолитических процессов, связанных с индуцированным не-физиологическим «выбросом» протеаз или действием экзогенныхферментов при микробной патологии. Наибольшее распространениеполучили природные ингибиторы протеаз, выделенные из (поджелу-дочной и околоушной желез, легких крупного рогатого скота. Этиингибиторы эффективно ингибируют плазмин, активаторы плазми-на, факторы свертывания крови, калликреин, трипсин, химотрип-син, тканевые и лейкоцитарные протеиназы [44]. Поливалентныеингибиторы протеаз применяют в клинической практике при фибри-нолитических кровотечениях, возникающих после хирургическихвмешательств, поскольку наряду с плазминовой активностью онитормозят тромбопластинообразование [5, 18]. Названные белковыеингибиторы протеаз используют при лечении сепсиса, бактериально-го (эндотоксического) шока, аллергических реакций, острого ипослеоперационного панкреатита, механических и термическихтравм, артрозо-артритов [5, 18, 22, 33]. При инфаркте миокарда ин-гибиторы протеолиза оказывают антиишемическое действие, умень-шая некротическую зону и улучшая коллатеральное кровообраще-

ние [2]. В последние годы установлена эффективность противови-русного действия ингибиторов протеолиза в клинике и эксперимен-те [14]. Однако для расширения области применения ингибиторовферментов следует изыскать ингибиторы с более широким спект-ром действия, в частности способных тормозить нейтральные, ще-лочные и лизооомальные протеиназы.

Особое место занимает использование ферментов в онкологии.Предприняты попытки применить протеазы, нуклеазы, мукополиса-хариды с целью непосредственного лизирующего действия на рако-вые клетки [7, 30]. Введение их в опухоль дает выраженный эф-фект, парэнтеральное введение оказывает более слабое действиеиз-за наличия ингибиторов протеаз в сыворотке больных раком.Более перспективной в настоящее время считается область энзимо-терапии неоплазии, основанная на учете особенностей в метаболиз-ме раковых клеток и предполагающая применение ферментов,снижающих концентрацию метаболитов и питательных веществ вкровотоке и опухолевых клетках. Наиболее известным цитостати-ческим ферментным веществом такого типа является L-аспараги-наза. Этот фермент стал стандартным лекарственным средствомдля лечения лимфобластных лейкозо'в [30]. Однако токсичность,особенно аллергенность, и быстрое развитие резистентное™ к фер-менту ограничивают его применение. Открытие специфическоговлияния L-аспарагиназы на раковые клетки побудило к исследова-нию других ферментов, расщепляющих заменимые и незаменимыеаминокислоты. Была обнаружена противоопухолевая активностьглутаминазы, аргиназы, аргининдекарбоксилазы [28, 30], а такжеферментов, снижающих уровень отдельных незаменимых амино-кислот, таких, как а-гидроксилаза, лизиноксидаза, гисти-даза, фенилаланинаммиаклиаза [30]. Действие указанных фер-ментов усиливается в присутствии антиметаболитов аминокислотпутем ингибирования биосинтетических путей и изменения концент-рации аминокислот. В терапии рака описано использование фер-ментов, принимающих участие в катаболизме фолиевой кислоты, фо-латных коэнзимов или фолатных антагонистов. Фолатные кофер-менты необходимы для биосинтеза пуринов и тимина. Наиболеемногообещающим для деградации фолиевой кислоты является ис-пользование карбоксипептидазы G. Несмотря на заметную иммуно-генность, фермент в эксперименте обнаруживает противоопухоле-вую активность, кроме того, он эффективен для предотвращениятоксичности известного ингибитора дигидрофолатредуктазы-метот-рексата при лечении лейкемии и рака мозга [30].

Таким образом, мы видим, что лекарственные препараты, пред-ставляющие собой природные физиологически активные белковыесоединения (ферменты, их ингибиторы и активаторы, гормоны), об-рели достойное место среди средств практической медицины.

К сожалению, повседневное клиническое использование фермен-тов ограничено как экономическими факторами — их высокой стои-мостью и малой доступностью, так и их быстрой инактивацией вусловиях организма и вызываемыми ими как чужеродными белка-

ми различными побочными реакциями (антигенность, аллерген-ность, токсичность и т. п.) В значительной мере перечисленныепрепятствия могут быть устранены благодаря использованию фер-ментов в стабилизированном, .иммобилизованном виде, тем болеечто усилиями инженерной энзимологии на сегодняшний день разра-ботано значительное количество методов ковалентной и некова-лентной фиксации ферментов на нерастворимых и растворимыхносителях самой разной природы [4].

В настоящее время принято выделять два принципиальных под-хода к получению иммобилизованных терапевтических ферментов[13]. При различных системных поражениях, когда присутствиетерапевтического фермента необходимо в разных органах и тканях,целесообразно использовать тем или иным способом стабилизиро-ванные водорастворимые препараты иммобилизованных ферментов,обладающие повышенной стабильностью в физиологических усло-виях и замедленным выведением) уиз организма. Сюда же будут от-носиться и различные ферментсодержащие «искусственные клетки»типа ми'крокапсул, теней эритроцитов или липосом. С другой сто-роны, для терапии локальных поражений, когда присутствие фер-мента требуется лишь в месте поражения, целесообразно созданиебиосовместимых ферментсодержащих полимерных частиц (биодег-радируемых или просто временно имплантируемых), которые мо-гут быть локализованы в определенном месте и оставаться там за-данное время, непрерывно выделяя в окружающую среду терапев-тический фермент, предпочтительно дополнительно стабилизирован-ный. Самостоятельный случай представляет собой использованиеиммобилизованных ферментов в аппаратах для экстракорпораль-ной перфузии типа искусственной почки, в перевязочных (И дрени-рующих материалах для ускорения заживления ран и ожогов и длямодификации внутренней поверхности протезов кровеносных сосу-дов с целью понижения тромбообразования.

Стабилизация терапевтических ферментов в ряде случаев можетосуществляться без использования полимерных носителей, простоза счет целенаправленной химической модификации белковой гло-булы низкомолекулярными реагентами или за счет введения в гло-булу внутримолекулярных «скобок» из бифункциональных реаген-тов, затрудняющих денатурационное разворачивание молекулыбелка [43]. Этот подход особенно важен, если терапевтическийфермент для осуществления своей функции должен провзаимодей-ствовать с рецептором клеточной мембраны (например, пара тром-бин— тромбоцит) или проникнуть внутрь клетки (ферменты,применяемые для терапии многочисленных наследственных фер-ментных недостаточностей печени), а наличие полимерного носите-ля может резко снизить эффективность ферментного» препарата.

В ряде случаев применяют межмолекулярное сшивание фермен-тов бифункциональными реагентами типа глутарового альдегида,что можно также рассматривать как иммобилизацию одной моле-кулы фермента на другой. В ряде случаев такая модификация фер-мента приводит к повышению его стабильности и эффективности,

например, таким образам удалось стабилизировать а-галактозида-зу, применяемую для лечения болезни Фабри. Связывание фермен-тов с другими белками также дает выраженный эффект — »конъю-гаты уриказы или гемоглобина с альбумином! способны в несколькораз дольше циркулировать в активном состоянии IB кровотоке, чемсоответствующие нативные белки [13]. Следует, однако, иметь ввиду, что крупные белковые образования, имеющие большое коли-чество участков, взаимодействующих с рецепторами различныхклеток, могут в некоторых случаях захватываться, например, клет-ками печени с повышенной интенсивностью.

Наиболее распространенным способам получения растворимыхстабилизированных ферментных препаратов является их модифика-ция растворимыми полимерами [13, 41]. Наиболее удобны в ка-честве носителей полисахариды, в частности декстраны, из-за ихвысокой биосовместимости [20, 38]. Для иммобилизации терапев-тических ферментов могут использоваться и некоторые нетоксичныеи неиммуногенные синтетические полимеры, например реакцион-носпособные производные поливинилпирролидона, полиэтиленгли-коля, поливинилового спирта и др.

Определенные перспективы открывает использование в качественосителей природных соединений, которые сами по себе обладаютполезной физиологической активностью или способны усиливатьдействие связанного с ними фермента. Так, для иммобилизациитромболитических ферментов может использоваться антикоагулянтгепарин [42].

При использовании подобных препаратов следует учитывать,что их молекулярная масса не должна превышать 80—100 000, по-скольку в противном случае будет затруднено их выведение изорганизма после выполнения ими своей функции, а накопление -по-лимерных носителей в организме может вызвать непредсказуемыеосложнения. С этой целью в последние годы ведется разработкареакционноспособных синтетических полимеров, содержащих связи,способные к биодеградации, а значит, не накапливающихся в орга-низме даже при большой молекулярной массе [35].

Связывание терапевтических ферментов с растворимыми носи-телями осуществляют традиционными химическими методами им-мобилизации, которые подробно разработаны [4]. При этом самипо себе связи полимер—носитель могут бытыкак бионеразрушаемы-ми — амидные, эфирные, так и биоразрушаемыми — уретановые,азометиновые и др.

Принципиальные эффекты, достигаемые благодаря связываниютерапевтического фермента или другого белкового соединения, на-пример гормона — инсулина, сводятся к следующим: повышениеконформационной стабильности и устойчивости к действию эндоген-ных протеаз; увеличение времени циркуляции в кровотоке за счетувеличения молекулярной массы конъюгата и замедления его вы-ведения; возможность регуляции иммунного ответа организма набелковый препарат; наконец, возможность получать препаратыкомплексного терапевтического действия.

Возможность регуляции иммунного ответа организма «а введе-ние терапевтического фермента представляется чрезвычайно важ-ной, поскольку многие перспективные ферментные препараты немогут применяться из-за вызываемых ими как чужеродными белка-ми реакций организма. В то же время иммобилизация таких фер-ментов на природных или синтетических полимерах, например наполисахаридах или полиэтиленгликоле [23, 39], резко понижаетиммунологические и аллергические реакции организма, по-видимо-му, за счет создаваемых матрицей носителя стерических препятст-вий взаимодействию антиген—антитело. С другой стороны, пока-зано, что некоторые синтетические полиэлектролиты усиливаютиммунный ответ на связанное с ними белковое соединение [10],что открывает возможности создания синтетических вакцин новоготипа.

Как уже отмечалось, наиболее широко применяемыми в клини-ческой практике являются протеолитические ферменты. Поэтомунеудивительно, что большое количество исследований посвященополучению их иммобилизованных производных. Показано, чтоконъюгаты с растворимыми носителями протеаз — субтилизина,трипсина, ос-химотрипсина, террилитина и др. [12] могут сохранятьпрактически неизменной свою специфическую активность по низко-и высокомолекулярным субстратам, в то же время обладая болеевысокой по сравнению с нативными предшественниками стабиль-ностью по отношению к различным денатурирующим воздействиями увеличенным временем жизни в кровотоке. Препараты подобноготипа уже нашли клиническое применение: в СССР впервые в мирев практику внедрена иммобилизованная на полисахаридном носи-теле стрептокиназа, успешно применяемая при лечении различныхтромболитических заболеваний [19] и не вызывающая побочныхреакций. Из других гидролитических ферментов следует назватьлизосомальную p-D-N-ацетилгексозаминидазу, применяемую прилечении болезни Тея — Сакса, для которой было показано, что ееиммобилизация на поливинилпирролидоне [34] приводит к стаби-лизации по отношению к экзогенным протеиназам и к увеличениювремени ее действия в кровотоке экспериментальных животных.Потенциальные противоопухолевые препараты — нуклеазы, обла-дающие также и противовирусной активностью, резко; улучшаютсвои свойства — стабильность и. биологическую активность — присвязывании с растворимыми аминопроизводными декстрана мето-дом азосочетания [11].

Растворимые препараты иммобилизованных ферментов могутприменяться не только для внутривенного введения; так, модифи-цированные декстраном карбоксипептидаза G и аргиназа [40] привнутрибрюшинном введении мышам с привитой мастоцитомой об-ладают способностью создавать более высокую и длительно дей-ствующую концентрацию активного начала в кровотоке, чем на-тивные ферменты.

Можно было бы привести еще много примеров подобного рода,но все они сводились бы к одному — иммобилизация ферментов на

растворимых полимерных носителях позволяет получать более ста-бильные, активные и безопасные терапевтические препараты. Болеетого, методы, выработанные при иммобилизации ферментов, могутбыть успешно перенесены и на другие препараты белковой приро-ды— различные физиологически активные полипептиды типа пан-креатического ингибитора трипсина и, что особенно важно, гормонаинсулина.

Еще один перспективный метод применения модифицированныхформ ферментов для лечения — это создание различного типа ис-кусственных клеток. Исторически первым подходом к этой пробле-ме было микрокапсулирование ферментов, т. е. их включение в по-лимерные микрокапсулы, обеспечивающие надежное удержание изащиту фермента и свободное проникновение относительно низко-молекулярных субстратов и продуктов ферментативной реакции.Основные преимущества микрокапсулирования следующие: микро-капсула исключает контакт фермента с биологическими жидкостя-ми; в микрокапсулу могут быть включены относительно высокиеконцентрации фермента, достижение которых в кровотоке при ис-пользовании фермента в нативном виде невозможно; в микрокап-сулу могут включаться различные ферменты одновременно; ферментв микрокапсулах может быть дополнительно стабилизирован вну-три- или межмолекулярным сшиванием или модификацией раство-римыми полимерами. Учитывая к тому же, что сейчас имеютсяподходы к получению микрокапсул не только из синтетических по-лимеров (полиамидов, полиуретанов и т. п.), но и из природныхили их аналогов (полимолочной кислоты и т. п.), т. е. снимаетсяпроблема утилизации материала оболочек 'микрокапсул в организ-ме, подобного рода ферментные препараты представляются в выс-шей 'Степени перспективными. Следует подчеркнуть, однако, что ихприменение ограничено случаем, когда терапевтический ферментдолжен действовать на растворимый субстрат относительно невы-сокого молекулярного веса.

Первые успешные эксперименты по применению микрокапсули-рованных ферментов на животных были проведены с использова-нием уреазы (для понижения содержания мочевины в крови), ка-талазы (для лечения животных с каталазной недостаточностью) иаспарагиназы (для подавления роста аспарагинзависимых опухо-лей) [12]. Первым примером использования микрокапсулирован-ных ферментов в клинической практике является описанное в ра-боте [26] применение микрокапсулированной каталазы для лече-ния в ротовой полости человека ран, образующихся при акаталазе-мии в результате накопления выделяемой бактериями перекиси во-дорода.

Вторым по старшинству методом создания искусственных кле-ток является включение ферментов в липосомы— искусственныефосфолипидные микропузырьки. Ферменты, включенные в липосо-мы, также предохранены от инактивирующего воздействия внеш-ней среды, а сами липосомы, состоящие из природных соединений,

полностью утилизуются в организме. В отличие от микрокапсул,

однако, липосомы обладают уникальной способностью доставлятьвключений в них препарат внутрь клеток, с которыми они взаи-модействуют по механизму слияния или эндоцитоза. Если учестьупомянутый ранее ряд заболеваний, связанных с недостаточностьювнутриклеточных лизосомальных ферментов, то значение этого фак-та трудно переоценить. В липосомы с той или иной1 эффективностьювключали подавляющее большинство применяемых в клинике фер-ментов— данные такого рода исчерпывающе описаны в моногра-фии [37]. Там же приведены данные по первым успешным экспери-ментам с липосомально инкапсулированными ферментами в кли-нике: включенная в липосомы глюкоцереброзидаза в отличие отнативного фермента, который не способен проникнуть в клетки,оказалась весьма эффективна для лечения пациента с болезньюГоше, связанной с нарушением нормального метаболизма глюко-цереброзидов, накапливающихся в клетках ретикуло-эндотелиаль-ной системы. Включенная в липосомы амилоглюкозидаза былауспешно применена для лечения пациента с гликогенозисом II типа.Если учесть, что клетки ретикуло-эндотелиальной системы, в част-ности печени, представляют собой природную мишень для липосом,то ясно, что включенные в липосомы ферменты могут оказатьсявесьма эффективны в лечении различных ферментных недостаточ-ностей печени.

Липосомы, поверхность которых поддается различным модифи-кациям, могут использоваться в качестве контейнеров для направ-ленного транспорта лекарств, под которым сейчас принято пони-мать способность введенного лекарственного препарата накапли-ваться именно в зоне поражения. В ряде экспериментальных работпоказано [21 ], что липосомы, во внутреннюю полость которых вклю-чены различные препараты, а к наружной мембране химическиприсоединено «векторное» соединение, способное опознавать и спе-цифически связываться с зоной поражения (например, антителопротив специфического компонента зоны-мишени), действительноизбирательно концентрируются в заданном месте. Этот подход мо-жет еще более расширить арсенал методов ферментной терапии.

В качестве контейнеров для включения ферментов могут при-меняться и оболочки клеток ,'крови, например 'мембраны или «тени»эритроцитов [24]. Путем частичного гемолиза эритроцитов и ихпоследующего заполнения желаемым содержимым с полным вос-становлением целостности мембраны в них были включены самыеразнообразные ферменты, и при этом было показано, что -включен-ные ферменты значительно повышают время своего, нахождения вкровотоке в активном состоянии (эксперименты проводили «а мы-шах и обезьянах). Описана также попытка использования включен-ной в эритроциты глюкоцереброзидазы для лечения пациента с бо-лезнью Гоше [29].

Для лечения локальных, а не системных заболеваний, по-види-мому, нужно создавать препараты иммобилизованных ферментов,которые могут быть локализованы в требуемом месте и способнык выделению в окружающую среду активного фермента с заданной

скоростью, хаким ооразом может быть создано локальное депоферментного препарата в организме. В результате можно достичьвысокой местной концентрации препарата, тогда как его общаядоза будет ничтожна .по сравнению со случаем применения натив-ного фермента в виде раствора. Такие препараты могут быть полу-чены несколькими способами. Во-первых, они могут быть включеныв раствор синтетического биосовместимого полимера, из которогозатем будут отформованы таблетки или гранулы, предназначенныедля имплантации и способные медленно выделять включенный бел-ковый препарат (опыты проводились с трипсином, лизоцимом, ще-лочной фосфатазой, каталазой и др.) [36]. Скорость выхода фер-мента может регулироваться «плотностью» полимерной матрицы.Находясь в полимерной матрице, фермент защищен от воздействияагрессивной биологической среды, в результате чего подобные си-стемы могут быть длительно функционирующими. В этом случаенерешенной проблемой остается судьба полимерного имплантатапосле полного выхода активного начала. Во-вторых, ферменты мо-гут быть включены в процессе формования в структуру различныхволокон и пленок, применяемых в хирургии в качестве шовных,перевязочных или дренирующих материалов. Благодаря принципупостепенного выделения материалы с включенными протеолитиче-скими ферментами обладают высокой и длительной очищающей,дренирующей и неполитической активностью, способны служитьбез смены в течение длительного времени и в несколько раз уско-рять процессы заживления по сравнению с традиционными мето-дами терапии [8].

Препараты иммобилизованных ферментов для локального при-менения могут быть получены как на основе нерастворимых поли-меров, при этом фермент осуществляет свою функцию в связанномс носителем состоянии, а затем механически удаляется из очагапоражения [16], так и на основе биодеградируемых носителей,когда скорость выхода фермента в окружающую среду определя-ется скоростью разрушения носителя, с которым фермент связанковалентно. С использованием микрогранул сшитого декстрана —сефадекса — были получены препараты тромболитических фермен-тов с заданной скоростью биодеградации и было показано, что им-мобилизованные таким образом фибринолизин, стрептокиназа илиурокиназа могут быть использованы для локального депонирова-ния при терапии тромбозов [27]. Эффективная тромболитическаятерапия при этом в эксперименте на животных достигалась при ис-пользовании общих доз фермента, на два порядка меньших, чемпри традиционных методах терапии. Подобного рода препаратымогут быть депонированы практически в любом органе и несомнен-но перспективны для клинического применения.

Еще одна большая область применения ферментов в медицине,которая открылась только в результате разработки методов их им-мобилизации,— это использование иммобилизованных ферментов вразличных экстракорпоральных аппаратах для перфузионнойочистки различных биологических жидкостей. Частным случаем

этого общего подхода является создание ферментных реакторов, ко-торые могут использовать как тромбобезопасные протезы кровенос-ных сосудов.

Основными преимуществами реакторов на основе иммобилизо-ванных ферментов являются следующие: возможность избежатьнепосредственного контакта организма с чужеродным белком и та-ким образом уменьшить нежелательные реакции на этот белок;возможность многократного использования реактора; возможностьпроведения долговременного лечения. К недостаткам таких реак-торов следует отнести не до конца решенные проблемы тромбооб-разования или сорбции белков крови на чужеродных поверхностях.

Экстракорпоральная перфузия с использованием ферментныхреакторов уже применяется достаточно широко. Наиболее подроб-но описано применение аспарагиназы, включенной в самые разно-образные реакторы и используемой для терапии аспарагинзависи-мых твердых опухолей. В экспериментах на животных и на челове-ке показано, что включение иммобилизованной аспарагиназы в сис-тему циркуляции позволяет быстро и количественно удалить изкрови аспарагин. Подобные же системы с иммобилизованной ури-казой или L-фенилаланин-аммиак-лиазой могут применяться дляобщей детоксикации организма благодаря способности понижатьуровень мочевой кислоты ,в крови животных с гиперурикемией иуровень фенилаланина при фенилкетонурии [12, 13].

В заключение следует отметить, что возможности и перспекти-вы использования в медицине ферментов в иммобилизованном со-стоянии гораздо шире, чем достигнутые на сегодняшний день, иможно не сомневаться, что именно на этом пути медицину ждетсоздание новых и высокоэффективных методов лечения. Даже изкраткой сводки приведенных данных видно, что применительно кполучению лекарственных препаратов белковой природы биотехно-логия (в частности, такой ее раздел, как инженерная энзимология)уже играет важную роль, а ее потенциальные возможности простобезграничны.

ЛИТЕРАТУРА

1. Андреенко Г. В. Фибринолиз, химия и физиология процесса. М.: Медицина,1967. 248 с.

2. Андрека В., Шипош Е., Алекси М. О дополнении терапии острого инфарктамиокарда калликреин-трипсиновым ингибитором.— Венг. фармакотерапия,1976, № 3, с. 94—100.

3. Богуш Л. К-, Шварцман Л. Я. Применение протеолитических ферментов притуберкулезе легких. М.: Медицина, 1970. 128 с.

4. Введение в прикладную энзимологию/Под ред. И. В. Березина, К- Мартинека.М.: Изд-во МГУ, 1982. 384 с.

5. Веремеенко К. Н. Ферменты протеолиза и их ингибиторы в медицинской прак-тике. Киев: Здоровье, 1971. 216 с.

6. Веремеенко К. Н., Карпенко Г. Ф. Перспективы применения иммобилизован-ных ферментов в медицине.— Укр. биохим. журн., 1979, 51, с. 409—419.

7. Вольф М., Рансбергер К. Лечение ферментами. М.: Мир, 1976. 231 с.8. Григорян А. В., Толстых П. И., Василькова 3. Ф. и др. Синтетический шовный

материал и протеолитические ферменты в профилактике нарушения заживле-ния асептических и лечении инфицированных ран мягких тканей.— В кн.:Асептика и антисептика. М.: Медицина, 1979, с. 73—76.

9. Данилевский Н. Ф., Хоменко Л. А. Применение ферментов в стоматологии.Киев: Здоровье, 1972, 188 с.

10. Кабанов В. А., Петров Р. В., Хаитов Р. М. Новый принцип создания искус-ственных иммуногенов.— Журн. ВХО им. Д. И. Менделеева, 1982, т. 27,с. 417—428.

11. Куриненко Б. М., Калачева Н. В., Пензикова Г. А., Скокова И. Ф. Модифи-кация нуклеодеполимераз растворимыми производными полисахаридов.— Био-химия, 1978, 43, № 1, с. 1996—2001.

12. Ларионова Н И, Торчилин В. П. Применение иммобилизованных физиоло-гически активных веществ белковой природы в медицине.— В кн.: Введениев прикладную энзимологию/Под ред. И. В Березина, К. Мартинека. М.:Изд-во МГУ, 1982, с. 284—305.

13. Ларионова Н. И., Торчилин В. П. Современное состояние и перспективыиспользования в медицине иммобилизованных физиологически активных ве-ществ белковой природы.— Хим. фарм. журн., 1980, 4, с. 21—36.

14. Лозицкий В. П., Поляк Р. #. Роль протеолиза в репродукции вирусов живот-ных и человека и антивирусная активность ингибиторов протеаз.— Усп. соврем,биологии, 1982, 93, с. 352—362.

15. Мардашев С. Р. Некоторые проблемы медицинской энзимологии.— В кн.: Про-блемы медицинской энзимологии. М.: Медицина, 1970, с. 5—26.

16. Иммобилизованные протеолитические ферменты в лечении гнойно-некротиче-ских процессов/Под ред. Р. И. Салганик, А. С. Коган. Новосибирск: Наука,1981. 139 с.

17. Стручков В И, Григорян А В., Гостинцев В. К- и др. Протеолитические фер-менты в гнойной хирургии. М.: Медицина, 1970. 408 с.

18. Сыновей, А .С, Левицкий А. П. Ингибиторы протеолитических ферментов вмедицине. Киев: Здоровье, 1979. 78 с.

19. Торчилин В. П., Воронков Ю. И., Махаев А. В Использование иммобилизо-ванной стрептокиназы (стрептодеказы) для лечения тромбозов.— Терапевт,архив, 1982, 54, № И, с. 21—25.

20. Торчилин В. П., Рейзер И. Л., Смирнов В. И., Чазов Е. И. Иммобилизацияферментов на биосовместимых носителях. II. Иммобилизация а-химотрипси-на на растворимых декстранах.— Биоорган, химия, 1976, 2, с. 1252—1258.

21. Торчилин В. П., Смирнов В. И., Чазов Е. И. Проблемы и перспективы исполь-зования липосом для направленного транспорта лекарств.— Вопр. мед. химии,1982, 28, № 1, с. 3—14.

22. Яровая Г. А.-, Доценко В. Л., Агапова Э. И. и др. Эффективность действиякоммерческих поливалентных ингибиторов протеиназ. Применение гордоксапри хирургических вмешательствах по поводу патологии сосудов.— Вопр. мед.химии, 1980, 26, с. 837—843.

23. Abuchowski A., McCoy I R, Palczuk N. С. et al Effect of covalent attachmentof polyethylene glycol on immunogenicity and circulating life of bovine livercatalase.—J. Biol. Chem., 1977, 252, p. 3582—3586.

24. Ang E., Glew R. Ihler G. Enzyme loading of nucleated chicken erythrocytes.—Exp. Cell Res., 1977, 104, p. 430—434.

25. Barlow G. H. Enzymes of clot lysis.— In: Methods in enzymology. N. Y. etc.,1976, vol. 45, p. 239—280.

26. Chang Т. М. S. Effects of local applications of microencapsulated catalase onthe response of oral lesions to hydrogen peroxide in acatalasemia.— J Dent.Res., 1972, 51, p. 319—321.

27. Chazov E. L, Mazaev A. V., Lebedev B. S. et al. Experimental study of bioso-luble drugs.— Thrombus lysis with biosoluble immobilized fibrinolysin in expe-riment.—Thrombosis Res., 1978, 12, p. 809—816.

28. Cooney D. A., Rosenbluth R. J. Enzymes as therapeutic agents.— In: Advancesin pharmacology and chemotherapy. N. Y., 1975, vol. 12, p. 200—263.

29. Dale G. L., Beutler E. Enzyme replacement therapy in Gaucher's disease: A ra-pid, high-yield method for purification of glucocerebrosidase.— Proc. Nat Acad.Sci. US, 1976, 73, p. 4672—4674.

Я0. Enzymes as drugs/Ed. J. S. Holcenberg, J. Roberts. N. Y. etc.: Wiley and sons,1981. 455 p.

31. Enzyme therapy in genetic diseases/Ed. R. J. Desnick. N. Y.: Alan Liss, 1980.Vol. 2. 450 p.

32. Enzyme therapy of lysosomal storage diseases/Ed. J. M. Tager et al. Amster-dam: North-Holland, 1974.

33. Fritz H. Proteinase inhibitors in severe inflammatory processes (septic shockand experimental endotoxaemia): Biochemical, pathophysiological and thera-peutic aspects.— In- Protein degradation in health and disease. Amsterdam:Excerpta Medica, 1980, p. 351—379.

34. Geiger В., Specht B. U. von, Arnon R. Stabilization of human p-D-N-Acetyl-hexosaminidase A towards proteolytic inactivation by coupling it to poly(N-vi-nylpyrrolidone).— Europ. J. Biochem., 1977, 73, p. 141—147.

35. Kopecek J. Biodegradation of polymers for biomedical use.—In: IUPAC Mac-romolecules. Oxford; New York, 1982. 320 p.

36. hanger R., Folkman J. Polymers for the sustained release of proteins.— Nature,1976, 263, p. 797—799.

37. Liposomes in biological systems/Ed. G. Gregoriadis, A. C. Allison. N. Y.: Wileyand sons, 1980. 360 p.

38. Marshall J. J., Rabinowttz M. L. Enzyme stabilization by covalent attachmentof carbohydrate.—Arch. Biochem. and Biophys., 1975, 167, p. 777—779.

39. Newmark /., Abuchowski A.f Murano G. Preparation an properties of adductsof streptokinase and streptokinase-plasmin complex with polyethylene glycol andpluronic polyol F38.—J Appl Bochem., 1982, 4, p. 185—189.

40. Sherwood R. F., Baird J. K., Atkinson T. et al. Enhanced plasma persistence oftherapeutic enzymes by coupling to soluble dextran.— Biochem. J., 1977, 164,p. 461—464.

41. Torchilin V. P. Immobilized enzymes and the use of immobilization principlesfor drug targeting.— In: Targeted drugs. N. Y. etc., 1983, p. 127—152.

42. Torchilin V. P., Il'ina E. V., Streltsova Z. A. et al. Enzyme immobilization onheparin.—J. Biomed. Mater. Res., 1978, 12, p. 585—590.

43. Torchilin V. P., Martinek K. Enzyme stabilization without carriers.—EnzymeMicrobiol. Technol., 1979, 1, p. 74—82.

44. Vogel R., Trautschold L, Werle E. Natural proteinase inhibitors. N. Y.: Acad.press, 1958. 112 p.

45. Wiseman A. Enzymes in therapy — theory and practice.— In: Topics in enzymeand fermentation biotechnology. N. Y. etc., 1980, vol. 4, p. 9—24.