Obtencin de extractos diferenciales de semilla de Neem

1.- Como primer paso es la obtencin de semillas de Neem, seguido de su trituracin, (puede ser

con una licuadora) y colocarlas en un recipiente de vidrio.

2.- Aadir hexano suficiente para cubrir las semillas, esto para que el solvente vaya diluyendo la

parte grasa de las semillas. Despus dejar en reposo por 15 das en un lugar fresco y cubrir de la

luz.

3.- Pasados los 15 das se procede a separar la solucin de hexano, decantando el recipiente

teniendo cuidado de no arrastrar muchos slidos. Tratando de separar lo ms posible de hexano.

Esta solucin de hexano se filtra en un embudo y un poco de algodn en el fondo, dejando pasar el

liquido slo por gravedad (Si la solucin tiene muchos slidos, moverlos constantemente con una

esptula para evitar que se depositen sobre el algodn, o cambiar el algodn con regularidad para

acelerar el proceso).

4.- Se procede a separar el solvente de la solucin sin sedimentos mediante un rotavapor,

cuidando en no sobrepasar los 45C. El producto obtenido es una masa semi-slida temperatura

ambiente. La mezcla obtenida se debe almacenar y guardar hasta el momento que sea procesada.

5.- Despus de obtener el primer extracto, se adiciona hexano nuevamente y se deja reposar 15

das, repitiendo el proceso de extraccin ya descrito.

6.- Seguido de la obtencin de los dos primeros extractos se procede a aadir acetato de etilo

suficiente y se deja reposando 15 das ms, en un lugar fresco y cubriendo de la luz. Repitiendo el

proceso de extraccin antes descrito (Teniendo cuidado de no bajar demasiado la presin al

momento de la separacin en el rotavapor).

7.- Despus de obtener un extracto de acetato de etilo se vuelve a aadir solvente suficiente y

dejar reposar nuevamente por 15 das, pasado este tiempo, obtener el segundo extracto con

acetato de etilo.

8.- Ahora se le agregar metanol suficiente, pero ste se deja reposar por 30 das y solo se

obtendr un extracto

Determinacin colorimtrica de Azadiractina (AZA) total

A una solucin de extracto de Neem resuspendida en dicloromentano (0.7mL) se le agrega 0.2mL

de vainillina metanlica (0.02mg/mL). Despus mezclar manualmente, dejando a temperatura

ambiente por 2 min. Se agrega cido sulfrico concentrado (0.3 mL, 98%) adicionando en tres

porciones de 0.1mL c/u mezclando y dejando reposar por 10 segundos (esto en un bao de hielo,

debido a que el calor generado puede desnaturalizar la AZA) entre cada porcin. Seguido del cido

se agrega 0.7mL de metanol, y se observa la formacin de dos fases de color azul-verdoso, sta se

mezcla para formar una solucin homognea. Se deja a temperatura ambiente por 5 min. Y se lee

a 577 nm. en celdas de cuarzo. La solucin "blanco" fue obtenida sustituyendo la solucin de

extracto, por 0.7mL de diclorometano.

Las lecturas de los extractos son cuantificadas mediante una curva de calibracin con estndar de

AZA.