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Obtención de Nuevas Enzimas para la Producción de Biodiesel y Bioetanol mediante Técnicas
Metagenómicas Inés Loaces, Cecilia Rodríguez, Vanesa Amarelle, Francisco Noya
Departamento de Bioquímica y Genómica Microbianas
Instituto de Investigaciones Biológicas “Clemente Estable”
¿Cuánto bioetanol necesita Uruguay?
0
100
200
300
400
500
600
700
4,5% 5% 15% 85% 100%
3 69
531
630
Etan
ol (
mill
on
es d
e lit
ros)
Vehículos Flex Fuel Vehículos a nafta comunes
Lignocelulosa a Etanol
La biomasa vegetal es renovable y abundante
Mediante hidrólisis enzimática se liberan azúcares sencillos
que pueden ser fermentados en etanol
20-40% del costo 2 empresas productoras
Objetivo Desarrollar enzimas nacionales que permitan hacer económicamente viable la conversión de biomasa en etanol.
Estrategia
• Aprovechar toda la diversidad genética de una comunidad bacteriana especializada mediante la metagenómica funcional.
• Analizar todos los organismos, sean cultivables in vitro o no.
• Seleccionar las mejores enzimas y expresarlas en cepas industriales especializadas en convertir azúcares sencillos en etanol.
Construcción de bibliotecas metagenómicas
Extraer el ADN
Seleccionar por tamaño
Clonarlo en fósmidos pCC1FOS
Empaquetarlos in vitro e infectar E.coli EPI300
Seleccionar aquellas colonias que adquirieron funciones de interés
Comunidades Microbianas
Departamento de Ingeniería de Reactores Facultad de Ingeniería Universidad de la República
Selección
Función Medio
Celulasas Avicel o CMC, revelado con Rojo Congo Avicel como única fuente de carbono
Hemicelulasas Xilano de Avena, revelado con Rojo Congo
Esterasas/Lipasas Tributirina Trioleína/rodamina
Tamaño de las bibliotecas: 30.000 clones cada una, 42 kbp por clon
Lipasas
Celulasas
Actividad celulolítica
Papel de filtro Bagazo de caña de azúcar
Cantidad de clones identificados
Función Rumen Lodos de bioreactores
Celulasas 21 6
Hemicelulasas 5 4
Esterasas/Lipasas 11 6
Genes identificados por secuenciación masiva ORF Predicted function CAZy
Xil3_c1_87 Xylanase, arabinofuranosidase GH43,62,32,68
Xil3_c1_45 Xylanase, arabinofuranosidase GH43,62,32,68
Xil3_c1_71 BACON-glucanase GH5
Csd6_c1_40 BACON-glucanase GH5
Csd9_c1_5 Endoglucanase GH5
Csd8_c5_17 β-xylosidase GH43
Csd18Uruguay_c1_59 Endoglucanase GH5,16
Csd4_endoG Endoglucanase GH5
Csd4_xyl β-xylosidase GH43
Csd4_lac Laccase / Cu-oxydase AA1
Conversión de celulosa en etanol
Etanol a partir de celulosa (1% CMC)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 20 40 60 80 100 120
Etan
ol (
g/L
)
Tiempo (h)
C- Csd4 Csd23 Csd18
Producción de etanol por Csd4
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
Glucose CMC Avicel FP Bagasse Xylan Salts
Eth
ano
l (g
/l)
Sustratos al 1%, 48 horas, 37ºC
Caracterización Enzimática
Csd4
Putative promoter
Csd4
34406 bp
Endoglucanase
LaccaseCgtA GTPase
Adenylate kinase
Beta-xylosidase
Putative hemin binding
Phosphoenolpyruvate synthase
EndoG
pH y temperatura óptimos de EndoG
0
20
40
60
80
100
120
10 30 50 70 90
Re
lati
ve a
ctiv
ity
(%)
T (⁰C)
0
20
40
60
80
100
120
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Re
lati
ve
Ac
tivit
y (
%)
pH
Actividad de EndoG en distintos solventes
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Re
lati
ve A
ctiv
ity
%
Especificidad de EndoG
Sustrato Actividad
CMC +
Avicel -
4-MUC +
Celotetraosa +
Xilano +
Lichenan -
Perspectivas
Perspectivas
glucanasa xilanasa β-glicosidasa
MS04
CBP Consolidated Bioprocessing
β-xilosidasa
Perspectivas
Switchgrass Pasto elefante Caña común
Panicum virgatum Pennisetum purpureum Arundo donax
Pretratamientos físicos y/o químicos
“CBP”
Etanol
Agradecimientos
• BIOGEM • Inés Loaces • Cecilia Rodríguez • Vanessa Amarelle • Daniela Senatore • Uriel Koziol • Elena Fabiano • Andrés Iriarte • Federico Battistoni • Raúl Platero • Federico Rosconi
• Unidad de secuenciación • José Sotelo
• ANCAP • Nikolai Guchin
• FING • Liliana Borzacconi
• Frig. Pando • Betiana Bouzas
• ANII • Laura Barreiro
• UNAM • Alfredo Martínez
• University of Florida • Lonnie Ingram
• Ismael Nieves