Rev.Fac. Agronomia - UNLPam Vol. 9 N°}6300 Santa Rosa - ARGENTINA - }996 /SSN 0326-6/84

Obtención de biomasa de los géneros Rhizobium yBradyrhizobium: Influencia de la concentración denutrientes y de la aeración

Biomass production of Bradyrhizobium and Rhizobium strains:effect of media nutrient concentration and aeration

Recibido: 517195 Aceptado: 2417196

Ronchi, A.L.1; A. Grassano1 y A.P. Balatti.1

ResumenEn este trabajo se estudia el crecimiento de cepas de Bradyrllizobium y Rhizobium, en

sistema batch con el propóaito de obtener suspensiones de muy alta concentración celular.Para tal fin se considera la influencia de la aeración y de los constituyentes del medio decultivo. Las experiencias fueron realizadas en frascos er1enmeyersen un agitador rotatorio yen fermentador con agitación mec41nica.La evolución del crecimiento celular fue determinadaen base a medidas de densidad óptica, recuento de células viables, y peso seco. Usando elmedio seleccionado y las cepas de Rhizoblum meliloti B 36, B 399, Rhlzobium trifolii A 113,Rhizobium Ioti LL 22, Rhizobium leguminoserum O 70 Y Bradyrhizoblum japonicum E 109, E110 Y E 45 fue posible obtener concentraciones de microorganismos de 6 x 1010 a 1 x 1011células viables/mi en 48 y 96 horas de proceso, que corresponden a valores de peso seco delorden de 10 a 12 gil. Ademéa se determinaron valores de presión osmótica del orden de 300mlliosmoles. Por último, es de destacar que las cepas desarrolldas en los nuevos medioaseleccionados mantienen su capacidad fisiológica.

Palabra clav •• : Producción de biomasa. Rhizobium. Bradyrhizobium.

SummaryThis paper reporta a wofi( on growth straina of the Rhizobium and Bradyrllizobium, in a

batch system, in order to obtain microorganisms suspensiona of a very high cen concentration.In the process of designing the culture media the influence of the aeration and the nutrientconcentration is considered. The experiments were carried out in a er1enmeyers flask onrotatory shaker and in laboratory fermentors.The evolution of cen growth was determinedaccording to measures of optical denslty, viable cen count and dry weight. Using a selectedbalanced media and strains such as Rhizobium meliloti B 36, B 399, Rhizobium trifolll A 113,Rhizobium /oti LL 22, Rhizobium leguminosarum O 70 and Bradyrhizobium japonicum E 109, E110 and E 45, it was possible to obtain microorganisms concentrations of 6 x 1010 to 1 x 1011

I Programa de Microbiologla y Química Agrlcola. Departamento de Química.Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad Nacional de La Pampa.Uruguay 151. (6300) Santa Rosa. La Pampa. Argentina.

viable celllml in 48 and 96 hour processes, corresponding to dry weight concentrations higherthan 10 gIl. The osmotical presure in the selected medium was in the order of 300 miliosmoles.The modifications introduced in the culture media to achieve high microorganismsconcentration did not alter the nitrogen fixation pacíty of the strains.

Key words: Biomass productions. Rhizobium. Bradyrflizobium.

Introd ucciónLa obtención de biomasa con

alta concentración demicroorganismos es una premisafundamental en el desarrollo desuspensiones celulares de los génerosRhizobium y Bradyrhizobiumdestinados a la elaboración deinoculantes comerciales. Roughley(I985 Y 1988) puntualiza que el éxitode los programas de inocuJación deleguminosas depende entre otrosfactores de la concentración demicroorganismos que tiene elinoculante y de la densidad desiembra. Teniendo en cuenta lasconsideraciones anteriores, en elpresente trabajo se estudia laobtención de biomasa de altasconcentraciones celulares de cepas delos géneros antes indicados.

Los estudios fueron programadostomando inicialmente un medio baseque indica la bibliografla y teniendoen cuenta las recomendaciones dealgunos autores tales como Vincent(I977), Balatti et al (I 991) Y Balatti(1992) a fin de determinar lainfluencia de diferentes nutrientes enel crecimiento celular. Así se analizala influencia de la concentración defosfato, fuente de carbono, nitrógenoy factores de crecimiento bajocondiciones de operación queaseguren una correcta aeración de losmedios de cultivo (Balatti et al. 1987).Además en razón de que los mediosson incrementados en susconstituyentes, se evalúa el valor de la

presión osmótica de los mismos a finde establecer su compatibilidad con eldesarrollo celular.

Por otra parte es de destacarque la velocidad de crecimiento de losmicroorganismos en los nuevosmedios es muy similar, lo cual nosestá indicando que no existenlimitaciones en esta nueva condición,como así también lo demuestra latransferencia de oxigeno al medio decultivo ya que la concentración deoxigeno disuelto no baja del 30% delvalor de saturación en su valormínimo,

Materiales y métodosMicroorganismos: Las cepas

utilizadas fueron Bradyrhizobiumjaponicum E 109 , E 110 Y E 45,Rhizobium meli/oti B 36 Y B 399,Rhizobium leguminosarum D 70,Rhizobium trifo/ii A 113 Y Rhizobiumloti LL 22.

Estos microorganismos fueronsuministrados por el Ing. AlejandroPerticari, de INTA Castelar, VillaUdaondo, Pcia. de Buenos Aires.

Medio: Los medios usados enlos procesos son indicados en laTablas 1 y Tabla 2.

Inóculo: Fueron preparadoscon los medios base (medio 1 deTablas 1 y 2 ) pero empleando el 50%de fuente de carbono y extracto delevadura.

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Para la transferencia delinóculo, se utilizó un volumen delorden del 10% tratando de alcanzar entodos los procesos una concentracióninicial no inferior a 108 célulasviables! ml,

Crecimiento celular: Elcrecimiento celular fue evaluado enbase a medidas de: densidad óptica a600 nm, recuento de células viablesaplicando el método de Koch (1981) ypeso seco.

Medidas de la presiónosmótica: Fue determinada con unosmómetro de Fiske modelo G 66 enel rango 0-1000 miliosmol.

Demanda celular de oxfgeno:Fue determinada en un respirómetroWarburg, según la técnicarecomendada por Umbreit et al(1972).

Velocidad de absorción deoIÍgeno: La velocidad de absorción deoxigeno fue evaluada aplicando elmétodo del sulfito (Cooper el al1944).

Porcentaje de oxfgenodisuelto: Fue medido con un electrodogalvánico Ag-Pb,

Condiciones de operación:Los inóculos fueron desarrollados enfrascos erlenmeyers de 250 mi con 50mI de medio y los procesos enerlenmeyers de 1000 mi con 200 mide caldo. Los mismos fueronesterilizados en autoclave a 1210 Cdurante 20 minutos. Una vez fríos, sesembraron con las cepas mencionadasy se colocaron en agitador rotatorio a250 rpm y 2,5 cm de excentricidad encuarto estufa a 280 C, durante 48horas para las cepas de crecimiento

rápido y 96 horas para las decrecimiento lento. Además sedesarrollaron los cultivos enfermentador con agitación mecánica a350 rpm empleando 1 volumen deaire/volumen de medio/minuto. Seutilizó un equipo con dos turbinas decuatro paletas cada una y un diámetrode 8 cm. El diámetro del frasco es de14 cm y la altura de 34 cm. El reactorposee cuatro cortacorrientes de 1,5 cmde ancho. La conexión a monitorespermite obtener medidas y control detemperatura y velocidad de agitación,medida de la concentración deoxígeno disuelto por medio de unelectrodo Ag-Pb y control de espumamediante el agregado automático deantiespumante emulsionable AE al33%. La temperatura fue mantenida a280C. El fermentador fue esterilizadoa 1210Cdurante 30 minutos.

Evaluación de la capacidadsimbiótica: Las semillas de soja yalfalfa fueron inoculadas de acuerdo alos métodos recomendados porLopreto el al (1973) y Vincent (1970)respectivamente, según el siguienteesquema: tratamiento 1 sininoculación (control); tratamientos 2 y3 usando suspensiones demicroorganismos obtenidas en elmedio base (medio 1 de Tablas 1 y 2)Yen los medios modificados (medio 7de Tabla 1 y medio 4 de Tabla 2)respectivamente. Se determinó, tantoen las plantas de soja como en las dealfalfa, peso seco y contenido denitrógeno de la parte aérea y elnúmero de nódulos.

ResultadosExperiencias con cepas de

crecimiento lento. En una primera

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serie de experiencias se realizaronprocesos con diferentesconcentraciones de fosfatos a fin decompatibilizar su nivel y naturalezacon la regulación de pH. Estosensayos se hicieron sobre el mediobase (medio 1 de Tabla 1), donde sevarió la concentración de P04H2K yP04HK2 entre 0,5 y 1,8 gil y la deP04H(N14)2 entre el 0,3 y 0,6 gil.Aquí se vió que la integración delmedio de cultivo con 0,5 gil deP04H2K y P04HK2 y la adición de0,3 gil de P04H(Nl4)2 asegurabauna buena regulación del pH delmedio de cultivo.

Posteriormente ajustado ya elmedio en cuanto a la concentración defosfatos se realizaron experiencias condiferentes niveles de concentración deglicerol y nitrato de potasio (medios 3y 4 de Tabla 1). Aquí se observó quecuando se duplica la tasa de fuente decarbono y de nitrógeno se obtienenvalores de densidad óptica del ordende 14 (Figura 1).

Sobre el medio base, corregidoen sus concentraciones de fosfato,fuente de carbono y nitrógeno (medio3 de Tabla 1), se incrementó laconcentración de extracto de levaduraa 6g11,pero este incremento de 2g11sehizo con y sin agregado de CaCl2(medios 6 y 7 de Tabla 1). Losresultados obtenidos que se indican enla Figura 2, muestran que elincremento del extracto de levadurafavorece una mayor obtención debiomasa cuando su adición (2g11)serealiza a las 48 horas de proceso. Porotra parte la adición de CaCI2 no tuvoninguna influencia para el medioestudiado.

En la Figura 3, se muestran losresultados obtenidos en fermentadorcon agitación mecánica, utilizandouna cepa de Bradyrhizobiumjaponicum E 109 donde se presenta laevolución del crecimiento en funcióndel peso seco, densidad óptica,consumo de fuente de carbono yoxigeno disuelto. Se observa que losvalores de biomasa son similares a losobtenidos en agitador rotatorio y quela concentración de oxigeno disueltoen su valor mínimo está en el orden de26-27 %.

Paralelamente a los ensayos decrecimiento celular, en razón delincremento de la concentración denutrientes, los medios fueronevaluados en su presión osmótica. Losvalores para el medio 7 (Tabla 1), quecorresponde al medio finalseleccionado, están en el orden de 300miliosmoles.

Experiencias con cepas decrecimiento rápido. En lasexperiencias empleando las cepasindicadas, se determinó que laintegración del medio con 0,5 gil deP04 HK2 producfa una muy buenaregulación del pH, esto se puedeobservar en las Figuras 4 y 6 donde elpH varia entre 7 y 7,35.

En la Figura 4 se presentan losresultados obtenidos con una cepa deRhizobium meliloti B 36. Se observaque el máximo crecimiento se alcanzacuando se lleva la concentración denitrato de potasio y sacarosa a 2,4 y 30gil respectivamente (medio 4 de Tabla2) y que el aumento de concentraciónde extracto de levadura (medio 3 y 5de Tabla 2) no favorece la obtenciónde mayores niveles de células. Es de

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destacar que la adición de CaCl2 cony sin agregado de extracto de levadurano produjo ningún efecto positivo.

En la Figura 5 se presentan losresultados obtenidos del desarrollo deuna cepa de Rhizobium meliloti enfermentadores agitados. Se alcanzanvalores semejantes de densidad ópticaa los obtenidos en erlenmeyers loscuales se corresponden con un pesoseco de aproximadamente 12 a 13 gil,como se ve la concentración deoxigeno disuelto en su valor mínimoes del 30% del valor inicial.

En la Figura 6 se presenta laevolución del crecimiento celular deRhizobium leguminosarum, Rhizobiumtrifolii y Rhizobium lott utilizando elmedio 4 de Tabla 2, se ve que existeun comportamiento similar alalcanzado con Rhizobium meliloti.

La Tabla 3 muestra la máximaconcentración celular obtenidautilizando diferentes cepas decrecimiento rápido y lento. Se ve quelas suspensiones de Bradyrhizobium alas 96 horas de proceso alcanzan elorden de 6 a 7 x 1010 célulasviables/mI, mientras que con losmicroorganismos de crecimientorápido se llega a valores de 7,4 x10 lOa 10 11 células viables/mI a las48 horas.

Ensayos agronómicos. En lasTablas 4 y 5 se muestran los valoresde número de nódulos, materia seca yporcentaje de nitrógeno de ensayos decrecimientos de plantas de soja yalfalfa, obtenidos de 10 (diez)repeticiones para cada tratamiento enambas leguminosas.

DiscusiónLas modificaciones

introducidas en medios donde seutilizan cepas de crecimiento lentodemuestran que aumentasensiblemente la concentración demicroorganismos cuando seincrementa la fuente de carbono,nitrógeno y factores de crecimiento.El aumento de concentración deextracto de levadura a 6 gil deberealizarse adicionando 2 gil a las 48horas de proceso, de esta maneraademás de mejorar los rendimientoscelulares, se evita el efecto negativoque se produce en el medio paraconcentraciones mayores de 4 gil deextracto de levadura. La adición delCaCl2 no tuvo el efecto esperado.Vincent (1980) indica que la mayorconcentración de extracto de levaduraproduce un efecto quelante sobre elión calcio. Para las cepas por nosotrosensayadas, para las condicionesutilizadas no se observó ningún efectopositivo del agregado de CaCl2 .

Por otra parte si consideramosexperiencias con cepas de crecimientorápido, para los microorganismosutilizados surge que se incrementanotablemente la biomasa cuandosolamente se aumenta laconcentración de sacarosa y nitrato depotasio. El aumento de concentraciónde extracto de levadura no produce elefecto esperado, es probable que laconcentración de 4 gil sea suficientepara suministrar los requerimientos enfactores de las cepas empleadas.

Además es de destacar que, sibien se aumenta la concentración denutrientes ensayados, la presiónosmótica de los medios está en el

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orden de 300 miliosmoles, valorescompatibles con el desarrollo celular(Pirt, 1975).

En cuanto a la modificaciónintroducida en los medios aumentandola concentración de nutrientes, sunueva condición, como asl también eldesarrollo celular alcanzado no limitanla transferencia de oxigeno al mediode cultivo ya que la concentración deoxigeno disuelto no baja del 30% delvalor de saturación en su valormlnimo.

Los ensayos realizados conplantas de soja y alfalfa, utilizandocepas desarrolladas en los mediosseleccionados nos están indicando quelos microorganismos mantienen suspropiedades fisiológicas

ConclusionesComo corolario de estas

investigaciones surge la posibilidadindustrial de poder incrementarsensiblemente la concentración de lassuspensiones celulares quenormalmente se utilizan en laelaboración de inoculan tescomerciales, lo cual representa unavance tecnológico significativo, enrazón de la alta disponibilidad demicroorganismos en el entorno de lasemilla y consecuentemente de larizosfera.

BibliografíaBALAnl A.P., MAllA l.A, MOREnl E.

1987. Aeration requeriment ofRhizobium culture. MIRCEN.Joumal of Applied Mlcrobiology andBiotechnology.227-34.

BALAnl A.P., MAZZA l.A.,' PASTORM.O. 1991. Effect of media nutrientconcentration on growth ofBradyrtlizobium japonicum.Tropical Agriculture.68:215-218.

BALAnl A.P. 1992. Diseno de medios decultivo. En: Producción deInoculantes para Leguminosas.Tecnologla de las fermentacionesaplicadas a los géneros Rhizobiumy Bradyrtlizobium. EdicionesTrabuco. La Plata. Argentina. 63-127.

COOPER C.M., FERST G., MILLESA1944. Gas Iiquid contactor.Industrial and EngineeringChemistry. 36:504-509.

KOCH A 1981. Growth Measurement. InManual of methods generalbacteriology. Whashington D.C.American Society for Microbiology.179-207.

LOPRETO C.P., MAZZA l.A., BALAnlAP. 1973. Producción deinoculantes para soja. RevistaFacultad de Agronomla. La PlataXLIX: 201-212.

PIMENTEL,G.F. 1958. Curso deestadrstica experimental. Ed.Hemisferio Sur S.A. 173-176.

PIRT S.J. 1975. Oxygen demand supply. InPrincipies of microbes and cellcultivation. Oxford: BlackwelScientific Publication. 81-106.

ROUGHLEY R.J. 1985. Products andquality contents of Iegume seedinoculant in Australia. InProceeding of the Workshop onRhizobiumllegume inoculant PortoAlegre. R.S. Brasil. 37-42.

ROUGHLEY R.J. 1988. Legumeinoculanls; their technology andapplication.Nitrogen Fixation byLegumes. In MediterraneanAgriculture. Edited by Beck andMateron. 259-267.

54

UMBREIT W.w., BURRIS R.H., SAUFFERJ.F. 1972. The Warburg constantvolume respirometer. ManometricTechníques. Burguess PublishingCompany, 1-17.

VINCENT J.M. 1970. A manual for thepractical study of the rcot nodulebacteria.Blackwell ScientificPublication Oxford. 163 pago

VINCENT J.M. 1977. Rhizobium : Generalmicrobiology. In A Treatise onDinitrogen Fixation. Seco 111. Hardyand Silver (Eds). John Wiley andSonsoNew Yorl<.277-366.

VINCENT J.M. 1980. Australian studies ofIegurne/Rhizobium symbiosis.Rhízobium News Letler. 25:

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TABLA 1: Composición de medios (gil) de cepas de crecimiento lento. El medio 1 (mediobase) es modificado en la concentración de los fosfatos, nitrato de potasio, glicerol y extractode levadura con y sin agregado de cloruro de calcio.

MEDIOComponentes

2 3 4 5 6 7

K2HP04 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5KH2P04 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5MgS04·7H20 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

0,2(NH4)2HP04 0,3 0,6 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3KN03 0,8 0,8 1,6 2,4 1,6 1,6 1,6NaCI 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1Ext. Levadura 4 4 4 4 4 4+2 4+2Glicerol 10 10 20 30 20 20 20CaCI2 0,15 0,15

En todos los casos las concentraciones de FeCI3 y de MnS04 fueron de 3,68 y 4,47 x 10-5molll. El pH fue ajustado a 6,9 antes de la esterilización

TABLA 2: Composición de medios (gil) de cepas de crecimiento rápido. El medio 1 (mediobase) es modificado en la concentración de nitrato de potasio, sacarosa y extracto de levadura.

MEDIOComponentes

2 3 4 5

K2HP04 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5MgS04 . 7H20 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2NaC1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1Sacarosa 10 20 20 30 30Ext. Levadura 4 4 4+2 4 4+2KN03 0,8 1,6 1,6 2,4 2,4

En todos los casos la concentración del FeCI3 y el MnS04 fueron de 3,68 y 4,47 x 10-5mol/l. El pH fue ajustado a 6,9 antes de la esterilización.

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TABLA 3: Máxima concentración celular obtenida en el medio modificado usando diferentescepas de Bradyrhizobium japonicum E 109, E 110, E 45; Rhizobium meliloti B 36, B 399;Rhizobium loti LL 22; Rhizobium leguminosarum D 70; Rhizobium trifolit A 113.

MICROORGANISMOS

Bradyrhizobium japonicum E 109Bradyrhizobium japonicum E 110Bradyrhizobium japonicum E 45Rhizobium meliloti B 36Rhizobium meliloti B 399Rhizobium loti LL 22Rhizobium leguminosarum D 70Rhizobium trifolii A 1\3

CONCENTRACIÓN TIEMPO DECELULAR PROCESO

x 1010 h.

6,76,56,6lO9,78,57,48,0

9696964848484848

TABLA 4: Plantas de soja inoculadas con suspensiones de Bradyrhizobium japonicum E 109obtenidas en el medio seleccionado (medio 7, tabla 1).

MEDIO NITROGENO%

ControlMedio baseMedio seleccionado

1,29 (a)2,36 (b)2,43 (b)

PESO SECO Nro. NODULOSPARTEAEREA

(g)

4,80 (a)7,70 (b)7,90 (b)

3235

Las medias indicadas con las mismas letras no son significativamente diferentes de acuerdo altest de Tuckey (Pimentel, 1958).

TABLA 5: Plantas de alfalfa inoculadas con suspensiones de Rhizobium meliloti B 36obtenidas en el medio seleccionado (medio 4, tabla 2)

MEDIO NITROGENO(%)

ControlMedio baseMedio seleccionado

1,50 (a)3,15(b)3,10 (b)

PESO SECOPARTEAEREA

(mg)

7,80 (a)25,60 (b)26,70 (b)

Nro. NODULOS

1719

Las medias indicadas con las mismas letras no son significativamente diferentes de acuerdo altest de Tuckey (Pimentel, 1958).

57

15

Ec::

ªo 10ci:j

~~"1lo.9.í.~(,)

5

24 48 72 96 120

Tiempo (h)

Figura l. Crecimiento celular de una cepa de Bradyrhizabium japonicum E109, en medios con diferentes concentraciones de glicerol ynitrato de potasio .

• Medio 1; 0 Medio 3; O Medio 4; (Tabla 1)

58

=a. 7.0

15

Ec:

Ioci:j

~ 10

~i.~U

5

8.0

6.0

20

Tiempo (h)

Figura 2. Crecimiento celular de una cepa de Bradyrhizobium japonicum E109, en medios con diferentes concentraciones de extracto delevadura con y sin agregado de cloruro de calcio .• medio 1 ; 0medio 3 ; O medio 6 ; t) medio 7 ; (Tabla 1)

59

f~q 11O:j

100 Io

j~u

20

10 10

i¡r ~

fi t15 ilit ~ II50 20

15 9

5

5

Tiempo (h)

10

8

Figura 3. Curvas tlpicas de crecimiento celular de una cepa deBradyrhitobium japonicum E 109 en el medio 7. (Tabla 1).CD densidad óptica; 0 oxigeno disuelto (%); e glicerol;

e Log. Nro. células viables / mi ; • peso seco;

60

8.0

7.0 1-•••-Eiil!

6.0

15Ee~Oci:j.m

10iJ3.íE.~O

5

36 48

Figura 4. Crecimiento celular de una cepa de Rhizobium meli/oti B 36 condiferentes concentraciones de sacarosa y nitrato de potasio.

O medio 1; 0 medio 2; • medio 3. C) medio 4; e medio 5;

61

100

11

eo

1 i'1l :;¡R ~ tfi 10

50 ~ 20 I'/1.

t 10W 5:5~1 ges c:i 10::i

5

IoiE.~O

12 2. 3eTiImpo (h)

Figura 5. Curvas típicas de crecimiento celular de una cepa de Rhizobiummeliloti B 36 en el medio 4. (Tabla 2).(D densidad óptica; e oxígeno disuelto (%); ~ sacarosa;

e Log. Nro. células viables / ml ; • peso seco;

62

8.0

6.0

20

15Ee~Oci::)

I10u.9.íE.~U

5

12 24 36 48

Ti.mOl> 'n\

Figura 6. Crecimiento celular de diferentes cepas en el medio enriquecido.(medio 4 de Tabla 2).o Rhizobium trifolii A 113; O Rhizobium /eguminosarum D 70;• Rhizobium loti LL 22.

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