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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMAQ DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
OBTENÇÃO TECNOLÓGICA DE COMPRIMIDO REVESTIDO
DOSE-FIXA-COMBINADA À BASE DE ZIDOVUDINA,
LAMIVUDINA E EFAVIRENZ
Keyla Emanuelle Ramos da Silva
RECIFE
2009
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMAQ DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
OBTENÇÃO TECNOLÓGICA DE COMPRIMIDO REVESTIDO
DOSE-FIXA-COMBINADA À BASE DE ZIDOVUDINA,
LAMIVUDINA E EFAVIRENZ
Dissertação submetida ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas da
Universidade Federal de Pernambuco, como
requisito parcial para obtenção de Título de
Mestre em Ciências Farmacêuticas na Área de
Concentração: Produção e Controle de
Qualidade de Medicamentos.
Orientador: Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto
Co-Orientador: Prof. Dr. Antônio Rodolfo de
Faria
Keyla Emanuelle Ramos da Silva
RECIFE
2009
Silva, Keyla Emanuelle Ramos da.
Obtenção tecnológica de comprimido revestido dose-fixa-combinada à base de Zidovudina, Lamivudina e Efavirenz / Keyla Emanuelle Ramos da Silva. – Recife : O Autor, 2009.
Xvi + 102 folhas : il., fig. e tab.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2009.
Inclui bibliografia e anexos.
1. Comprimidos. 2. Dose-fixa-combinada. 3. Anti-retroviral. 4. Validação. 5. Método analítico I. Título.
615.2 CDU (2.ed.) UFPE
615.1 CDD (21.ed.) CCS2009-158
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
OBTENÇÃO TECNOLÓGICA DE COMPRIMIDO REVESTIDO
DOSE-FIXA-COMBINADA À BASE DE ZIDOVUDINA,
LAMIVUDINA E EFAVIRENZ
Banca Examinadora:
Membro Externo Titular Prof. Dr. Lívio César Cunha Nunes – Universidade Federal do Piauí
Membros Internos Titulares
Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto - Universidade Federal de Pernambuco - Presidente
Profª Drª Maria do Carmo Alves de Lima – Universidade Federal de Pernambuco
Membros Suplentes
Externo: Prof. Dr. Fábio Santos de Souza – Universidade Federal da Paraíba
Interno: Prof. Dr. Dalci José Brondani – Universidade Federal de Pernambuco
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
REITOR
Prof. Dr. Amaro Henrique Pessoa Lins
VICE-REITOR
Prof. Dr. Gilson Edmar Gonçalves e Silva
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Prof. Dr. José Thadeu Pinheiro
VICE-DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Prof. Dr. Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros
CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Prof. Dr. Dalci José Brondani
VICE-CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Prof. Dr. Antônio Rodolfo de Faria
COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto
VICE-COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMAÊUTICAS
Profª Drª Beate Seagesser Santos
iv
v
A minha Mãe, com todo o amor do mundo.
vi
AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal
de Pernambuco pela oportunidade de realização desta etapa da minha formação
acadêmica.
Á Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES pelo
financiamento.
A meu orientador, Prof. Pedro José Rolim Neto, pela oportunidade concedida de poder
desfrutar de seus ensinamentos e de sua amizade, por me ensinar mais do que fazer
pesquisa, por colaborar no meu crescimento como gente.
A meu co-orientador, Prof. Antônio Rodolfo de Faria, pela oportunidade e contribuição
para meu crescimento profissional, minha eterna gratidão.
A Profª Drª Maria do Carmo Alves de Lima, por toda a ajuda e por me permitir utilizar
as instalações do seu Laboratório.
Aos amigos de equipe Jeckson Luiz da Silva, Mônica Felts de La Roca Soares e Lariza
Darlene Alves Santos, pelo empenho no desenvolvimento desse trabalho.
Ao Laboratório de Tecnologia de Medicamentos - LTM pela oportunidade de realizar
este trabalho e a todos os seus integrantes pela aprendizagem diária regada a muitas
risadas.
Ao Laboratório de Síntese Orgânica Aplicada a Fármacos - LASOF, à Rafaella Passos
e a Leilane Santana, pela ajuda, companheirismo e amizade.
Aos amigos José Lamartine Soares Sobrinho, Mônica Felts de La Roca Soares e Lívio
César Cunha Nunes, pelos ensinamentos e apoio durante toda a jornada.
vii
A minha mãe Zélia Ramos de Sousa, que é o que tenho de mais precioso, pelos
ensinamentos, incentivo, confiança, amor e carinho dedicado a mim sempre.
A Tia Hortélia Vasconcelos, Vlademir Vasconcelos, Tia Elma Sousa e a meu irmão
Ramon Ramos pelas palavras de incentivo em todos os momentos A minha família, por
se fazerem presentes em todos os momentos.
A Romildo Johnson Pereira Diniz, Espedito Pereira do Nascimento Júnior, Maria
Gentil Pereira Diniz por estarem comigo sempre, meu muito obrigada.
A meus grandes amigos de infância, Adriane Borges Cabral, Myrtes Fabiana Pereira
Bezerra e Márcio Daniel Lima, por me acompanharem nessa longa jornada tão cheia de
encontros e desencontros, alegrias e tristezas, por me incentivarem sempre.
Aos amigos que colecionei durante toda a vida, obrigada por fazerem parte da minha
história.
A todos que de forma direta ou indireta contribuíram para a realização deste trabalho.
viii
A coisa mais bela que o homem pode experimentar é
o mistério. É esta a emoção fundamental que está na
raiz de toda ciência e arte. O homem que desconhece
esse encanto, incapaz de sentir admiração e
estupefação, esse já está, por assim dizer, morto e tem
os olhos extintos."
(Albert Einstein)
ix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIDS
HIV
FDA
LTM
LAFEPE
MS
DST
ITRN
ITRNN
CLAE
DFC
rpm
UV
ANVISA
IV
RMN 1H
RMN 13
C
OMS
LB
Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
Vírus da Imunodeficiência Adquirida
Food Drug Administration
Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos
Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco
Ministério da Saúde
Doença sexualmente transmissíveis
Inibidores da transcriptase reversa análogos de nucleosídeos
Inibidores da transcriptase reversa não-análogos de
nucleosídeos
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Dose-fixa-combinada
Rotação por minuto
Ultravioleta
Agência Nacional de Vigilância Sanitária
Infravermelho
Ressonância Magnética Nuclear de 1H
Ressonância Magnética Nuclear de 13
C
Organização Mundial de Saúde
Lote de Bancada
x
LISTA DE SÍMBOLOS
%
°C
mg
g
mL
nm
M
porcentagem
graus Celsius
miligrama
grama
mililitro
nanômetro
Molar
Comprimento de onda
xi
LISTA DE FIGURAS
Artigo I
Figura 1: Estrutura química da Zidovudina .......................................................................... 14
Figura 2: Estrutura química da Lamivudina ......................................................................... 14
Figura 3: Estrutura química do Efavirenz ............................................................................ 16
Artigo II
Figura 1: Fluxograma do estudo de estresse: Hidrólise sob condições ácidas e básicas
(Fonte: Adaptado de: SINGH &BAKSHI, 2000). ................................................................ 33
Figura 2: Fluxograma do estudo de estresse: Oxidação (Fonte: Adaptado de: Singh &
Bakshi, 2000) ........................................................................................................................ 35
Figura 3: Fluxograma do estudo de estresse: Fotólise (Fonte: Adaptado de: Singh & Bakshi,
2000) ..................................................................................................................................... 37
Artigo III
Figura 1: Placa cromatográfica com padrão da Efavirenz e produtos de degradação. 1 -
Padrão de Efavirenz; 2 – Produtos formados pós Reação de Hidrolise Básica; 3 - Produtos
formados pós Reação de Hidrolise Básica, reação repetida em maior escala para
confirmação de confirmação dos produtos de degradação ................................................... 52
Figura 2: Estruturas químicas do efavirenz e possíveis produtos da hidrólise básica (I –
EFAVIRENZ; II – AMINO ÁLCOOL ; III – QUINOLINA).............................................. 52
Figura 3: Esquema da formação do amino álcool e quinolina ............................................. 53
Figura 4: Características físicas observadas dos produtos após hidrólise básica e separação
.............................................................................................................................................. 53
Figura 5: RMN1H do produto de degradação amino álcool ................................................. 54
Figura 6: RMN1H do produto de degradação quinolina ....................................................... 54
Figura 7: Estrutura química da Zidovudina .......................................................................... 55
Figura 8: Estrutura química da Timina ................................................................................. 56
Figura 9: Placa cromatográfica do padrão da Zidovudina antes e após hidrólise básica. 1-
Padrão de Zidovudina; 2 – Produtos de degradação formados após reação de Hidrólise
Básica ................................................................................................................................... 56
xii
Figura 10: Placa cromatográfica com padrão da Lamivudina e produtos de degradação,
respectivamente. 1 – Padrão de Lamivudina; 2 – Produtos de Degradação formados após
Hidrólise Básica .................................................................................................................... 57
Artigo IV
Figura 1. Estrutras químicas da zidovudina, lamivudina e efavirenz. .................................. 62
Figura 2. Varredura cromatográfica do padrão misto dos três fármacos, sem coluna
cromatográfica – Faixa ampliada de 180 a 320 nm. ............................................................. 66
Figura 3. Cromatogramas dos fármacos AZT, EFZ e 3TC (padrão de trabalho) isolados sob
as condições cromatográficas definidas. .............................................................................. 70
Figura 4. Cromatograma referente ao método analítico escolhido para quantificação do
AZT (40mg), 3TC (20mg) e EFZ (40mg). ........................................................................... 70
Figura 5. Cromatograma do placebo realizada com o método desenvolvido. ...................... 74
Artigo V
Figura 1: Estrutura molecular da zidovudina (AZT) ............................................................ 81
Figura 2: Estrutura molecular da lamivudina (3TC) ............................................................ 82
Figura 3: Estrutura molecular do efavirenz (EFZ) ............................................................... 83
xiii
LISTA DE TABELAS
Artigo II
Tabela 1 - Condições de estresse para a realização do estudo de degradação forçada......... 30
Artigo IV
Tabela 1: Condições cromatográficas dos métodos analíticos publicados ........................... 67
Tabela 2: Composição e fluxo da fase móvel padronizadas no método desenvolvido. ....... 69
Tabela 3: Validação: Parâmetro Robustez utilizando Anova fator único. ........................... 72
Tabela 4: Validação: Parâmetro Precisão Intermediária utilizando Anova fator duplo. ...... 73
Tabela 5: Validação: Parâmetro Exatidão utilizando Teste-t. .............................................. 74
Artigo V
Tabela 1: Formulações dos lotes de bancada desenvolvidos ................................................ 84
Tabela 2: Resultados das análises de controle de qualidade físico-químico da matéria-prima
zidovudina, (Northeast® lote: DY 070041) ......................................................................... 86
Tabela 3: Resultados das análises de controle de qualidade físico-químico da matéria-prima
lamivudina (Hangzhou® lote: 071208) ................................................................................ 86
Tabela 4: Resultados das análises de controle de qualidade físico-químico da matéria-prima
efavirenz (Cristália®, lote: 1289/07) .................................................................................... 87
Tabela 5: Resultados do Controle físico-químico dos comprimidos obtidos ....................... 89
xiv
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 2
2 OBJETIVOS .................................................................................................................. 5
2.1 Objetivo Geral .......................................................................................................... 5
2.2 Objetivos Específicos ............................................................................................... 5
Capítulo I ............................................................................................................................... 6
3 REVISÃO BIBLIOGRAFICA ..................................................................................... 6
3.1 Artigo I. Situação Atual da Terapia Anti-Retroviral ................................................ 7
3.2 Artigo II. Modelos de Avaliação da Estabilidade de Fármacos e Medicamentos
para a Indústria Farmacêutica ....................................................................................... 22
Capítulo II ........................................................................................................................... 46
4 ESTUDO DE ESTABILIDADE DOS FÁRMACOS ................................................ 46
4.1 Artigo III. Estudo de degradação dos fármacos Zidovudina, Lamivudina e
Efavirenz em Condições Ácidas e Básicas ................................................................... 47
Capítulo III .......................................................................................................................... 60
5 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS .......... 60
5.1 Artigo IV. Determinação simultânea de zidovudina, lamivudina e efavirenz por
cromatografia líquida de alta eficiência – CLAE ......................................................... 61
Capítulo IV .......................................................................................................................... 77
6 TECNOLOGIA DE OBTENÇÃO DO COMPRIMIDO REVESTIDO DOSE-
FIXA-COMBINADA À BASE DE ZIDOVUDINA, LAMIVUDINA E EFAVIRENZ
.......................................................................................................................................... 77
6.1 Artigo V. Tecnologia de obtenção de comprimido revestido dose-fixa-combinada a
base de lamivudina, zidovudina e efavirenz ................................................................. 78
7 CONCLUSÕES ............................................................................................................ 95
8 PERSPECTIVAS ......................................................................................................... 96
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................90
Anexos ............................................................................................................................ 100
xv
RESUMO
O acesso de pacientes infectados à terapia anti-retroviral é uma prioridade da saúde pública
mundial em países em desenvolvimento. A grande quantidade de fármacos já
disponibilizados para o tratamento da AIDS, viabiliza novas associações terapêuticas, o que
proporciona uma maior adesão ao tratamento, diminuindo o índice de mortalidade dos
pacientes infectados. Para tal finalidade tem-se desenvolvido anti-retrovirais em dose-fixa-
combinada. Esse tipo de associação proporciona uma maior adesão ao tratamento quando
comparada à administração dos medicamentos em separado. Este trabalho teve como
objetivos o estudo de estabilidade dos fármacos zidovudina, lamivudina e efavirenz, em
meios ácido e básico, a caracterização físico-química destas drogas, assim como o
desenvolvimento da forma farmacêutica como comprimido revestido dose-fixa-combinada.
Desenvolveu-se e validou-se também um método analítico de doseamento, por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), capaz de quantificar os três fármacos
presentes na forma farmacêutica simultaneamente. As matérias-primas dos três fármacos
apresentaram qualidade adequada e o método analítico desenvolvido e validado apresentou
resultados satisfatórios para todos os quesitos avaliados. Diante dos resultados alcançados,
pode-se garantir a obtenção da forma farmacêutica comprimido revestido dose-fixa-
combinada à base de zidovudina, lamivudina e efavirenz com qualidade e confiabilidade
comprovadas, requisitos fundamentais no desenvolvimento de um medicamento segundo as
Boas Práticas de Fabricação e Controle (BPFC), preconizados pelo órgão regulatório
(ANVISA-MS).
Palavras-Chave: comprimidos, dose-fixa-combinada; anti-retroviral; validação; método
analítico; estabilidade
xvi
ABSTRACT
The access of infected patients to anti-retroviral therapy is a priority for global public health
in developing countries. A large amount of drugs already available for the treatment of
AIDS, makes possible new therapeutic associations, which provides a wide adherence to
treatment, reducing the mortality rate of infected patients. For this purpose, it has developed
anti-retrovirals in combined-fixed-dose. This type of association provides a wide adherence
to treatment when compared to administration of the drugs separately. This work aimed to
study the stability of drugs zidovudine, lamivudine and efavirenz on acid and basic
conditions, as well as physical-chemical characterization of these drugs and the
development of coated tablet form as combined-fixed-dose. Was also developed and
validated an analytical method of determination by high performance liquid
chromatography (HPLC) able to quantify the three drugs in the pharmaceutical form
simultaneously. The raw materials of the three drugs had an adequate quality and the
developed and validated analytical method showed satisfactory results for all items
evaluated. In view of the results achieved, we can ensure the preparation of the
pharmaceutical form coated tablet of zidovudine, lamivudine and efavirenz, on combined
fixed-dose with proven quality and reliability, the key requirements in developing a product
under Good Manufacturing Practices and Control (GMPC), recommended by the regulatory
body (ANVISA-MS).
Keywords: tablets, combined-fixed-dose, anti-retroviral, validation, analytical method,
stability
1
Introdução
2
1 INTRODUÇÃO
O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é o agente causador da Síndrome da
Imunodeficiência Adquirida (SIDA/AIDS). As conseqüências clínicas da infecção por esse
vírus devem-se à sua capacidade em desarmar o sistema imune do hospedeiro, devido à
depressão dos linfócitos que expressam, superficialmente, o antígeno CD4-positivo (CD4+)
que em conjunto com alterações qualitativas e quantitativas do sistema imune leva à
susceptibilidade do organismo às infecções oportunistas (GOLDMAN & BENNET, 2001).
Segundo Nash e Elul (2006) 39,4 milhões de pessoas estavam vivendo com AIDS
até o final do ano de 2004 e a grande parte dessa população infectada reside nos paises em
desenvolvimento, visto que o acesso à prevenção primária e o diagnóstico são restritos e
muitas vezes inexistentes. A África subsaariana concentra cerca de 64% das infecções no
mundo, reduzindo a espectativa de vida nesses países de 62 para 47 anos.
Atualmente, a terapia padrão é conhecida como terapia anti-retroviral de alta
atividade (HAART), a qual combina pelo menos três fármacos, sendo dois inibidores da
transcripitase reversa análogos de nucleosídeo (ITRN) associados a um inibidor da
transcripitase reversa não-análogo de nucleosídeo (ITRNN) ou um inibidor de protease (IP)
(LAURENT et al, 2004; WISSENT et al, 2005).
A grande quantidade de fármacos já disponibilizados para terapia anti-retroviral,
resulta em um variado número de possíveis combinações, o que pode oferecer mais opções
de tratamento, levando-se em consideração a rápida resistência apresentada pelo vírus HIV
(NOTARI et al, 2006).
A política Nacional de AIDS do Ministério da Saúde, preconiza a obtenção
tecnológica de formas farmacêuticas DFC seguindo a orientação do Consenso de AIDS
2007-2008. O Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos vem contribuindo de forma
ímpar com o Programa Brasileiro, pois tem desenvolvido vários medicamentos para
empresas públicas.
O estudo de estabilidade dos fármacos mostra-se como uma tendência dentro do
planejamento para o desenvolvimento de uma forma farmacêutica, já que investigação da
estabilidade intrínseca do fármaco fornece abordagens de formulação e indica tipos de
adjuvantes, aditivos de proteção específicos e de acondicionamento, que provavelmente
3
melhorarão a integridade do fármaco e do produto. Demonstrando que o conhecimento do
comportamento químico pode ser usado para garantir a estabilidade da forma farmacêutica
desejada (REYNOLDS et al, 2002; AULTON, 2005).
Diante das novas exigências da ANVISA, com relação ao desenvolvimento e
validação do método indicativo de estabilidade, estes estudos passaram a ser o novo desafio
aos profissionais da área de desenvolvimento de produtos farmacêuticos. Nosso grupo vem,
há alguns anos, desenvolvendo parcerias com laboratórios farmacêuticos para aplicação de
metodologias para estudo de estabilidade e ativos de origem natural e sintética, produtos
isolados, misturas de fármacos, bem como, produto acabado em diferentes formas
farmacêuticas em doenças negligenciadas e de alto custo, em monoterapia e em dose-fixa-
combinada.
Os medicamentos têm em sua composição, além dos princípios ativos, os excipientes
que não desenvolvem atividade farmacológica, porém possuem diversas funções técnicas. Sendo
assim, a determinação das propriedades físicas e químicas fundamentais das moléculas dos
fármacos e outras propriedades derivadas dos fármacos é vital ao processo de desenvolvimento
de uma forma farmacêutica. Estas informações ditam muitos dos eventos subseqüentes e das
abordagens no desenvolvimento da formulação, esta primeira etapa da pesquisa é conhecida
como pré-formulação (FLORENCE, ATTWOOD, 2003; WELLS, 2005).
Ao se desenvolver um método analítico deve-se realizar sua validação como método
prático de confiabilidade desejada e de baixo custo para a utilização na rotina industrial
farmacêutica. A validação de método analítico consiste na confirmação por exame e
fornecimento de evidência objetiva de que os requisitos específicos para um determinado
uso pretendido são atendidos (ANVISA, 2003; BEDOR et al., 2004; SOARES SOBRINHO
et al., 2005; USP, 2006).
A realização deste projeto além de sentido científico tem um cunho social,
possibilitando a aquisição de medicamentos de qualidade e de baixo custo, pois o estudo
será realizado em parceria com a Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) e o
Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco (LAFEPE).
4
Objetivos
5
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Desenvolvimento da forma farmacêutica comprimido revestido e validação de
métodos analíticos para controle de qualidade da dose-fixa-combinada – Zidovudina +
Lamivudina + Efavirenz comprimido.
2.2 Objetivos Específicos
Estudo de estabilidade dos fármacos Zidovudina, Lamivudina e Efavirenz, em
condições ácidas e básicas;
Caracterização Física e Química dos pós de Zidovudina, Lamivudina e Efavirenz;
Desenvolvimento e validação de método para doseamento do comprimido revestido à
base de Zidovudina, Lamivudina e Efavirenz por meio da técnica de CLAE;
Desenvolvimento da forma farmacêutica comprimidos revestidos dose-fixa-
combinada.
6
Capítulo I
3 REVISÃO BIBLIOGRAFICA
3.1 Artigo I. Situação Atual da Terapia Anti-Retroviral
Artigo a ser submetido
3.2 Artigo II. Modelos de Avaliação da Estabilidade de Fármacos e Medicamentos
para a Indústria Farmacêutica
Artigo submetido à Latin American Journal of Pharmacy
7
3.1 Artigo I. Situação Atual da Terapia Anti-Retroviral
Keyla Emanuelle Ramos da Silva1, Antônio Rodolfo de Faria
2, Pedro José Rolim Neto
1*
1- Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos – UFPE
2- Laboratório de Síntese Orgânica Aplicada a Fármacos - UFPE
RESUMO
O acesso da população infectada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) aos
medicamentos anti-retrovirais nos países em desenvolvimento é uma prioridade de saúde
pública. Com o apoio de programas, organizações não-governamentais, e autoridades
nacionais, a Organização Mundial de Saúde (OMS) tem o ambicioso objetivo de tratar 3
milhões de pessoas infectadas pelo HIV com a terapia anti-retroviral de alta atividade.
Atualmente, encontram-se à disposição na rede de saúde 16 fármacos. A incorporação de
novos anti-retrovirais no âmbito do Sistema Único de Saúde (SUS) é definida após análises
técnicas realizadas por três comitês assessores, também responsáveis pelas recomendações
para o uso e monitoramento desses medicamentos. A resistência aos medicamentos
atualmente disponíveis tem contribuído para o aumento da pandemia da AIDS, enfatizando
a necessidade de desenvolvimento de novas estratégias preventivas que possam ser mais
efetivas contra o HIV.Os esforços atuais focalizam na simplificação dos esquemas
terapêuticos de modo a aumentar a aderência ao tratamento e o manejo dos efeitos
colaterais.
Palavras-Chave: Dose-fixa-combinada, AIDS, Terapia
_______________________
*Endereço para Correspondência: Laboratório de Tecnologia de Medicamentos – LTM.
Departamento de Ciências Farmacêuticas – Universidade Federal de Pernambuco. Av. Prof.
Arthur de Sá, S/N, Cidade Universitária, Recife – PE. 50.740-521. Tel/Fax (81)3272-1373.
Email: [email protected]
8
Introdução
O acesso da população infectada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) aos
medicamentos anti-retrovirais nos países em desenvolvimento é uma prioridade de saúde
pública. Com o apoio de programas, organizações não-governamentais, e autoridades
nacionais, a Organização Mundial de Saúde (OMS) tem o ambicioso objetivo de tratar 3
milhões de pessoas infectadas pelo HIV com a terapia anti-retroviral de alta atividade
(LAURENTE et al., 2004).
A resistência aos medicamentos atualmente disponíveis tem contribuído para o
aumento da pandemia da AIDS, enfatizando a necessidade de desenvolvimento de novas
estratégias preventivas que possam ser mais efetivas contra o HIV e a necessidade de uma
vigilância quanto à resistência aos medicamentos (VERAS et al., 2007).
Os esforços atuais focalizam na simplificação dos esquemas terapêuticos de modo a
aumentar a aderência ao tratamento e o manejo dos efeitos colaterais (LANCELLOTTI;
GAGLIANI, 2005).
Materiais e Métodos
Utilizou-se para redação da revisão bibliográfica os bancos de dados eletrônicos
ScienceDirect, Scopus, Scirus, PubMed/Meddline e Bireme. Foram selecionados artigos
científicos publicados sobre a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida e os medicamentos
utilizados pra o tratamento da mesma. Os resultados da busca eletrônica foram expandidos
com busca entre as referências bibliográficas dos artigos selecionados.
Resultado e Discussão
AIDS
Aproximadamente 60% das doenças que atingem o homem são provocadas por
vírus, sendo em uma grande variedade de doenças crônicas e degenerativas. A luta contra
as infecções virais se faz de grande dificuldade, pois a replicação viral é um processo
9
intracelular, estando intimamente relacionada ao metabolismo das células infectadas.
(ANTUNES; TENURI, 2002; SOUZA; ALMEIDA, 2003).
A identificação do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) e da Síndrome da
Imunodeficiência Adquirida (SIDA/AIDS) ocorreu a pouco mais de duas décadas, porém o
número de pessoas infectadas e doentes têm aumento vertiginosamente nesse curto período
de tempo (CANINI, et al; 2004). As conseqüências clínicas da infecção pelo HIV devem-
se à sua capacidade em desarmar o sistema imune do hospedeiro, devido à depleção dos
linfócitos que expressam, superficialmente, o antígeno CD4-positivo (CD4+). A redução
progressiva dos linfócitos CD4+ em conjunto com alterações qualitativas e quantitativas do
sistema imune leva à susceptibilidade do organismo às infecções oportunistas (GOLDMAN
& BENNET, 2001).
O período entre a aquisição do HIV e a manifestação da AIDS pode durar alguns
anos, porém, apesar de o indivíduo portador do vírus estar muitas vezes assintomático, pode
apresentar importantes transtornos na esfera psicossocial, a partir do momento em que fica
sabendo de seu diagnóstico. Alguns estudiosos têm discutido que as diversas alterações que
ocorrem no sistema nervoso dos clientes com HIV/aids, associadas com depressão e/ou
estresse podem influenciar a evolução da doença, e as alterações nos estados psíquicos e
sociais podem contribuir para aumentar a vulnerabilidade biológica (THOMPSON, NANNI
& LEVINE, 1996).
A infecção pelo HIV-1 cursa com amplo espectro de apresentações clínicas, desde a
fase aguda, que pode se manifestar como síndrome retroviral aguda, até fase avançada da
doença com as manifestações definidoras da síndrome da imunodeficiência. Em indivíduos
não-tratados, estima-se em que o tempo médio entre o contágio e o aparecimento da doença
seja de 10 anos.
A infecção aguda ou Síndrome Retroviral Aguda é caracterizada por uma doença
transitória sintomática, que ocorre logo após exposição ao HIV. Está associada à intensa
replicação viral e a uma resposta imunológica vírus específica. Após a transmissão do HIV-
1, manifestações clínicas podem ocorrer em cerca de 50 a 90% dos indivíduos. O início dos
sintomas ocorre entre duas a quatro semanas após a exposição, porém, já foi descrito em até
10 meses após a infecção primária. A duração dessa fase sintomática pode ser de sete a dez
dias e, raramente, até duas semanas. Os sintomas, quando ocorrem, incluem febre alta por
10
um ou dois dias, suores, linfoadenomegalia transitória, que se caracteriza pela presença de
nódulos indolores, esplenomegalia, fadiga, falta de apetite, depressão que pode durar
semanas ou até meses, entre outros (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007).
O diagnóstico clínico da infecção aguda pelo HIV, geralmente, passa despercebido
por seu caráter inespecífico ou pela ausência de sintomas. O clínico deve estar atento para
avaliar não só os dados do exame físico e as queixas, mas também a situação
epidemiológica, incluindo história de possível exposição de risco para o HIV, tais como
relações sexuais desprotegidas, utilização de drogas endovenosas e acidente com material
biológico (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007).
Denomina-se fase assintomática o estágio em que a pessoa infectada não apresenta
qualquer sintoma. Esse período de latência do vírus é marcado pela forte interação entre o
sistema imune e as constantes e rápidas mutações do vírus. Durante essa fase, os vírus
amadurecem e morrem de forma equilibrada (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008).
A fase sintomática é a fase que se instalam doenças oportunistas, que são as
doenças que se desenvolvem em decorrência de uma alteração imunitária do hospedeiro,
devido à redução crítica de células T, tipo CD4, que chegam abaixo de 200 unidades por
mm³ de sangue. Adultos saudáveis possuem de 800 a 1200 unidades. Nessa fase, surgem os
sintomas típicos da AIDS, tais como: diarréia persistente, dores de cabeça, contrações
abdominais, febre, falta de coordenação, náuseas, vômitos, fadiga extrema, perda de peso e
câncer (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008).
Quanto a Terapia Anti-retroviral
O advento dos anti-retrovirais, para o tratamento dos indivíduos com HIV/aids, vem
proporcionando aumento no tempo de sobrevida, porém, seu alto custo e inúmeros efeitos
colaterais associados à inexistência de cura para a doença têm direcionado investigações
sobre o impacto qualitativo dessa terapêutica na qualidade de vida (MERCK & CO, 2001;
HARDMAN E LIMBIRD; 2001). Acreditava-se que o avanço tecnológico poderia ser uma
solução concreta para os principais problemas relacionados às doenças crônicas, tornando a
mensuração da qualidade de vida uma tarefa inútil (SILVA et al, 2006).
11
O principal objetivo da terapia anti-retroviral é retardar a progressão da
imunodeficiência, possibilitando aumento do tempo e da qualidade de vida da pessoa
infectada.
Desde a descoberta do primeiro anti-retroviral, observa-se a evolução ocorrida no
tratamento anti-retroviral, decorrente dos avanços alcançados no conhecimento da infecção
pelo HIV. Este tratamento, cuja história teve início no uso de monoterapia com Zidovudina,
de 1994 a 1996, consolidou-se com a terapia dupla como padrão terapêutico e, a partir de
1996, com a terapia tríplice, de introdução dos inibidores da protease (BONOLO; GOMES;
GUIMARÃES, 2007).
O primeiro medicamento específico, a zidovudina (AZT), foi desenvolvido em 1989
(MARINS et. al 2002), seguido do ddI e ddC em 1993 e 1995 (BASSO 2002). Estudos
demonstraram que o AZT isoladamente não alterava o tempo de sobrevida do paciente,
exceto quando utilizado em conjunto com as quimioprofilaxias (BASSO 2002, MARINS
et. al 2002). Em 1995 foi demonstrado que a terapia dupla, o AZT combinado com os
outros medicamentos, era capaz de aumentar discretamente a sobrevida dos pacientes
(MARINS et. al 2002). Dessa forma, em razão dessas múltiplas combinações de vários
medicamentos e terapias, o manejo da AIDS sempre exigiu uma atualização constante dos
profissionais.
Apesar dos medicamentos promissores, com excelentes resultados clínicos,
pesquisadores, profissionais de saúde, representantes de governo e de organizações não
governamentais reunidos na XI Conferência Internacional de AIDS, realizada em
Vancouver, Canadá, entre os dias 7 e 12 de julho de 1996, já tinham como consenso que
esses benefícios só seriam alcançados pela adesão ao tratamento (BONOLO; GOMES;
GUIMARÃES, 2007).
Um dos problemas que leva ao uso incorreto dos anti-retrovirais e está relacionado
diretamente à falência terapêutica, facilitando a emergência de cepas do HIV resistentes aos
medicamentos existentes, é a grande quantidade de medicamentos em diferentes horas do
dia, levando ao uso incorreto dos anti-retrovirais (LIGNANI JÚNIOR; GRECO;
CARNEIRO, 2001; SOUZA; STORPIRTIS, 2004).
Para manter a carga viral indetectável por tempo mais longo e obter aumentos
significativos na contagem de linfócitos CD4+, a aderência aos medicamentos deve ser
12
superior a 90%, no entanto os estudos disponíveis sobre o tema demonstram que a taxa de
aderência aos anti-retrovirais varia entre 40% e 80%(LIGNANI JÚNIOR; GRECO;
CARNEIRO, 2001).
Após a introdução da terapia anti-retroviral de alta eficiência (HAART), observou-
se um queda considerável no número de mortes relacionadas ao vírus HIV e representa um
padrão de terapia para o tratamento da AIDS. O regime recomendado na HAART é
constituído por dois ITRNs associado com um IP ou ITRNN para aumentar a potência,
minimizar a toxicidade, e diminuir o risco de resistência. Para terapia inicial se recomenda
para terapia Preferencial a utilização de 2 ITRN + ITRNN e como terapia alternativa a
utilização de 2 ITRN + IP/r (MARIER et al., 2007).
A fim de melhorar a conveniência do tratamento, formulações multifármacos, na
forma de dose-fixa estão sendo amplamente promovidas como regime de 1ª linha em
programas de acesso ao tratamento anti-retroviral. Esta forma farmacêutica é de grande
interesse do Ministério da Saúde, pois objetiva a produção por laboratórios como o
LAFEPE, com experiência na produção de medicamentos anti-retrovirais, que possam
produzir e disponibilizar estes medicamentos ao Programa DST-AIDS a um menor custo
(FARIAS et al., 2006).
O termo dose fixa-combinada (DFC) refere-se a associações de classes variadas de
fármacos em diversas combinações, sendo que os regimes terapêuticos mais potentes são
aqueles que combinam dois fármacos ITRNs e um ITRNN associados numa única forma
farmacêutica. Dentre as vantagens dessa associação: baixo custo; eficácia e tolerabilidade
semelhantes a outros esquemas terapêuticos; melhor adesão ao tratamento; menor número
de comprimidos/cápsulas ingeridos (FARIAS et al., 2006).
Durante os últimos anos, a lamivudina foi comumente administrada com a
zidovudina, e este se tornou o padrão nucleosídico da terapêutica combinada, em que
combinações complexas com um IP ou um ITRNN foram avaliados (MARIER et al.,
2007).
Demonstrou-se que esquemas que utilizam 2 ITRN + ITRNN são, em geral, de
posologia mais simples o que provavelmente facilita a adesão ao tratamento. Quanto à
escolha dos ITRNN, o efavirenz continua sendo preferencial à nevirapina, exceto em
gestantes. Essa opção está fundamentada na sua elevada potência de supressão viral,
13
comprovada eficácia em longo prazo e ao menor risco de efeitos adversos sérios.
Adicionalmente, a longa meia-vida deste permite maior flexibilidade no horário de tomada
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007).
De acordo com o Consenso 2007-2008, o efavirenz, a lamivudina e a zidovudina são
os fármacos de primeira escolha para o tratamento inicial de pacientes portadores do HIV.
Logo estudos estão sendo realizados para que se possa obter uma dose-fixa-combinada
contendo esses três fármacos.
Quanto aos fármacos de Primeira Escolha
Inibidores nucleosídicos da transcriptase reversa: Essa classe de fármacos é composta
por pró-drogas análogas de dideoxinucleosídeos que requerem fosforilação intracelular em
seu correspondente derivado trifosfato. O metabólito trifosfato então, compete com a
transcriptase reversa por agir como um substrato alternativo para a enzima, e uma vez que o
metabólito é incorporado à cadeia terminal do DNA em desenvolvimento, interrompe
analogamente desta (DE CLERCQ, 2004). Os fármacos desta classe impedem a infecção
aguda das células suscetíveis, mas exercem pouco efeito sobre as células infectadas
(GOODMAN E GILMAN, 2003).
Zidovudina
A Zidovudina, 3-azido-3-deoxitimidina (Figura 1), é semelhante à timidina
endógena, diferenciando apenas pela presença de um grupo azido (N3) no anel ribose ao
invés de hidroxila na posição 3. Ela apresenta-se neutra na faixa de pH, que varia de 3,5 a
5,5 e pKa igual a 9,8 (SOUZA; STORPIRTIS, 2004).
A rota sintética utilizada para sua produção foi a de Horwitz, sendo o primeiro
método de preparação industrial. Esta síntese tem como material de partida a Timina, tendo
sido realizada em seis etapas de síntese, tende este processo um rendimento global de 30%
(SOUZA; ALMEIDA, 2003).
14
Figura 1: Estrutura química da Zidovudina
Após penetrar nas células do hospedeiro, a zidovudina é fosforilada pela
timidinocinase em monofosfato; em seguida, pela timedilatocinase em difosfato; e, por fim,
pelo nucleosídio difosfatocinase em 5-trifosfato de zidovudina ativo (GOODMAN;
GILMAN, 2003). Este por sua vez, inibe a continuidade da cadeia do DNA viral, por
inibição da TR. Possui atividade contra o HIV 1 e o HIV 2 e apresenta-se na forma
farmacêutica sólida com dose diária de 600 mg (DE CLERCQ, 2004).
Lamivudina
A Lamivudina é uma citidina sintética, 2’-desoxi-3-tiacitidina (figura 2), com
configuração absoluta 2R, 5S não natural. Ela é uma didesoxipirimidina, em que o carbono
3’ do anel da ribose é substituído por enxofre. A 3TC é o enantiômero (-); o enantiômero
(+) possui maior toxicidade.
Figura 2: Estrutura química da Lamivudina
15
Apresenta-se como pó branco a branco-amarelado, com pKa igual a 4,3 (protonação
do grupo NH2). É facilmente solúvel em água, quando dissolvido neste, encontra-se
primariamente sob a forma não-ionizada. O pH da solução aquosa a 1% (p/V) é 6,9. Dados
da literatura afirmam que tanto em estado sólido quanto em solução aquosa ele possui
elevada estabilidade à luz e à temperatura. Possui faixa de fusão entre 176ºC e 178ºC.
(SOUZA; STORPIRTIS, 2004).
Penetra na célula por difusão passiva e sofre fosforilação em seu metabólito ativo, o
trifosfato de lamivudina, este compete com o trifosfato de desoxicitidina pela sua ligação
com a transcriptase reversa, e a incorporação ao DNA resulta em interrupção da cadeia. Ao
contrário a muitos análogos de nucleosídeos, a lamivudina desenvolve resistência
rapidamente (GOODMAN; GILMAN, 2003). Esse INTR também possui atividade contra o
HIV 1 e o HIV 2 e o HBV. Apresenta-se na forma farmacêutica sólida com dose diária de
300 mg (DE CLERCQ, 2004).
Inibidores não-nucleosídicos da transcriptase reversa: são compostos sintéticos
clinicamente distintos, inibidores alostéricos não competitivos que diminui a razão da
incorporação do nucleotídeo e bloqueia a transcriptase reversapor meio de sua ligação
adjacente ao sítio ativo da enzima, induzindo a alteração na configuração deste local
(GOODMAN & GILMAN, 2003). Essa classe de drogas possui maior eficácia contra HIV-
1 do que contra HIV-2. São ativas no seu estado nativo, não requerendo fosforilação (DE
CLERQ, 1998).
Efavirenz
Correspondente à 1,4-diidro-2H-3,1-benzoxazin-2-ona (figura 3) apresenta-se como
cristal não higroscópico e apresenta descrito na literatura cinco polimorfos . Seu coeficiente
de partição octanol - água é de 5,4. Com solubilidade aquosa de 9,2 µg/mL (pH 8,7) a 25 °
C. Essa solubilidade aquosa pode ser aumentada num pH acima de 9, consistente com a
perda do próton sobre a amina do carbamato (MAURIN et al., 2002). Possui faixa de fusão
de 136,0°C-141,0 °C, sendo praticamente insolúvel em água, mas solúvel em metanol e
diclorometano. Possui características hidrofóbicas, baixa densidade e oferece grande
16
resistência a escoamento. A densidade aparente e compactado da matéria-prima é de
respectivamente 0,389 e 0,397g/mL (VIANA et al., 2006).
Difunde-se na célula, onde se liga em um local adjacente ao local ativo da
transcriptase reversa. Essa ligação produz uma alteração de configuração na enzima, que
inibe a sua função (GOODMAN; GILMAN, 2003). Apresenta-se na forma farmacêutica
sólida e sua dosagem diária é de 600 mg (DE CLERCQ, 2004).
Figura 3: Estrutura química do Efavirenz
Outras Classes de anti-retrovirais
Inibidores de Protease: Quando as células infectadas são expostas a inibidores de protease
do HIV, ocorre a produção de vírus imaturos que necessitam de nucleocapsídeo típico não
sendo infecciosos. Isso ocorre porque a clivagem de poliproteínas no processo final da
proteína viral é impedida (FARIAS et al, 2006).Dentre os inibidores de protease
podemoscitar: saquinavir (SQV), inidavir (IDV), ritonavir (r) (adjuvante farmacológico),
nelfinavir (NFV), lopinavir(LPV) e atazanavir (ATV).
Inibidores de Fusão: Em um esforço para tratar pacientes infectados pelo HIV que se
tornaram resistentes ou intolerantes a ITRs ou IPs, novas estratégias foram exploradas,
inclusive a inibição da entrada de HIV nas células hospedeiras (POMMIE, JOHNSON,
MARCHAND, 2005) A primeira etapa da entrada é a ligação do vírus à célula hospedeira
via interação entre a proteína gp120 no invólucro viral e CD4 na membrana da célula
hospedeira. A proteína gp120, na camada do vírus HIV, se liga ao co-receptor da
quimoquina CCR5 ou CXCR4, que permite à proteína gp41, existente na superfície viral,
17
se fundir com a membrana da célula hospedeira (MEANWELL & KADOW, 2003;
CASTAGNA et al, 2005). A enfuvirtida, que ataca a proteína gp41, é o único inibidor de
fusão atualmente disponível (LALEZARI et al, 2003). A enfuvirtida oferece o benefício de
um novo mecanismo de ação, mas apresenta limitações. A principal desvantagem da
enfuvirtida é sua formulação, já que é administrada apenas por injeção. Além disso, reações
no local da injeção têm sido notificadas na maioria dos pacientes.
Inibidores de Integrase: Os inibidores da integrase bloqueiam uma etapa irreversível no
ciclo de vida do HIV e suas ações são independentes dos subtipos de co-receptor
(POMMIE, JOHNSON, MARCHAND, 2005; HAZUDA, 2006) Não há análogo humano à
integrase e, portanto, os inibidores da integrase são específicos para o HIV (LATAILLADE
& KOZAL, 2006). Devido a essa especificidade, os inibidores da integrase não parecem
interferir na função celular normal em células não infectadas (POMMIE, JOHNSON,
MARCHAND, 2005). A inibição da integração protege o DNA hospedeiro da infecção ao
desativar o genoma viral e impedir a produção do vírus. Ao impedir a integração do DNA
do HIV ao DNA celular, as células podem ser protegidas de contribuir para o
desenvolvimento de novos reservatórios latentes de infecção (HAZUDA, 2006).
O raltegravir é (Isentress®) é indicado em combinação com outros agentes anti-
retrovirais para o tratamento de infecção por HIV-1 em pacientes que não responderam aos
esquemas com pelo menos um fármaco de cada uma das seguintes classes: IP, ITRNs,
ITRNNs.
Conclusão
O HAART reduziu substancialmente a morbidade e a mortalidade no mundo
desenvolvido, e estão em andamento iniciativas promissoras para levar tratamentos anti-
retrovirais para os países em desenvolvimento. Uma combinação de tratamentos potentes
agora é um padrão de tratamento em âmbito mundial.
O LAFEPE em parceria com o Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos
(LTM), vem contribuindo na pesquisa e no desenvolvimento de medicamentos anti-
retrovirais. Atualmente encontra-se em fase de obtenção tecnológica a forma farmacêutica
comprimido revestido, associando os fármacos indicados como de primeira escolha pelo
18
Consenso de AIDS 2007-2008 na forma dose-fixa-combinada em um único comprimido
com a seguinte associação: Lamivudina 150 mg, Zidovudina 300 mg e Efavirenz 300 mg.
Desta forma estamos contribuindo com a política Nacional de AIDS do Ministério da
Saúde, que garante tratamento adequado, universal e gratuito.
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22
3.2 Artigo II. Modelos de Avaliação da Estabilidade de Fármacos e Medicamentos
para a Indústria Farmacêutica
Stability Models Assessing of Drugs and Drug Products for Pharmaceutical Industry
Silva, K.E.R.1, Alves, L.D.S.
1, Soares, M.F.R.
1, Passos, R.C.S.
2, Faria, A.R.
2, Rolim Neto,
P.J.1*.
1 Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos, Departamento de Ciências Farmacêuticas,
Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, Recife, PE, Brasil.
2 Laboratório de Síntese Orgânica Aplicada a Fármacos, Departamento de Ciências
Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, Recife, PE, Brasil.
*Autor correspondente: Pedro José Rolim Neto - Laboratório de Tecnologia Farmacêutica -
Departamento de Ciências Farmacêuticas – Universidade Federal de Pernambuco, UFPE -
Av. Prof. Arthur de Sá s/n, Cidade Universitária – CEP 50740-521 - Recife – PE, Brasil -
Telefone: +55 - (81) 3272-1383 – email: [email protected]
Título Resumido: Estabilidade de Fármacos e Medicamentos
23
Resumo
O estudo de estabilidade de fármacos e medicamentos, descrito pela resolução RE nº1/05
ANVISA determina a quantificação dos produtos de degradação, assim como o método
analítico utilizado correspondente. Como consequência, gerou-se a publicação do Informe
Técnico nº 1/2008, com o objetivo de esclarecer procedimentos a serem realizados, nos
casos em que a impureza ou padrões dos produtos de degradação não estão disponíveis.
Diante das novas exigências, o delineamento do estudo torna-se uma das grandes
dificuldades de sua realização, desafiando profissionais da área de desenvolvimento de
produtos farmacêuticos.
Palavras-Chave: Estabilidade, Fármacos, Medicamentos, Produtos de degradação, Teste
de Estresse
Abstract
The study of stability of drugs and medicines, described by resolution RE 1 / 05 ANVISA
determines the quantification of degradation products, as well as the analytical method
concerned. As a consequence, the Technical Report 1 / 2008 was published, aiming to
clarify procedures to be performed in cases where impurity or patterns of degradation
products are not available. In the face of new requirements, the design of the study consists
in one of the difficulties of their implementation, bringing new challenges for professionals
on area of developing pharmaceutical products.
Keywords: Degradation products, Drugs, Medicines, Stability, Stress Test
24
Introdução
A estabilidade é definida como o tempo durante o qual a especialidade farmacêutica
ou mesmo a matéria-prima considerada isoladamente, mantém dentro dos limites
especificados e durante todo o período de estocagem e uso, as mesmas condições e
características que possuía quando da época de sua fabricação. Pode também ser definida
como o período de tempo compreendido entre o momento no qual o produto está sendo
fabricado àquela que sua potência está reduzida a não mais do que 10 %, desde que os
produtos de alteração estejam todos seguramente identificados e previamente reconhecidos
seus efeitos (Taborianski, 2003; Vehabovic et al., 2003; Stulzer & Silva, 2006).
A estabilidade dos produtos farmacêuticos depende de fatores ambientais como
temperatura, umidade, luz e de outros fatores relacionados ao próprio produto como
propriedades físicas e químicas, de substâncias ativas e excipientes farmacêuticos, forma
farmacêutica e sua composição, processo de fabricação, tipo e propriedades dos materiais
de embalagens (Brasil, 2005).
Com a finalidade de garantir a integridade química, física, microbiológica,
terapêutica e toxicológica do fármaco e da forma farmacêutica dentro dos limites
especificados, sob influência dos fatores ambientais em função do tempo, são preconizados
estudos de estabilidade (Matthews, 1999; Lucas et al., 2004, Ansel et al. , 2007).
O estudo de estabilidade descrito pela RE nº1/2005 (ANVISA - Agência Nacional
de Vigilância Sanitária) possui como principal aplicabilidade a determinação do prazo de
validade do produto farmacêutico. Porém, também determina a quantificação dos produtos
de degradação e o método analítico correspondente, que resultou na publicação de um
25
Informe Técnico nº 1/2008, com o objetivo de esclarecer procedimentos nos casos em que a
impureza ou o padrão do produto de degradação não estão disponíveis. Estes
procedimentos envolvem a realização de testes de estresse sob condições variadas (Brasil,
2008).
A realização do teste de estresse, assim como o desenvolvimento do método
analítico para a identificação e quantificação dos produtos de degradação é de extrema
importância para as indústrias farmacêuticas, pois no momento do registro, pós-registro e
renovação, o estudo de estresse, acompanhado de sua análise crítica deverá ser
contemplada.
Diante do exposto, esse trabalho tem por objetivo trazer uma revisão atualizada
sobre estabilidade de medicamentos e fármacos, proporcionando atualização aos
profissionais da área, para as adequações que deverão ser estabelecidas a partir da
legislação vigente.
Estudo de Estabilidade e a Legislação Farmacêutica
A monitorização da estabilidade dos medicamentos é um dos métodos mais eficazes
para avaliação, previsão e prevenção de problemas relacionados à qualidade do produto
durante a validade. A segurança e a eficácia também podem ser avaliadas, através do
monitoramento da formação de produtos de degradação, que podem gerar perda de
atividade terapêutica ou toxicidade (Carvalho et al., 2005; Nóbrega et al., 2006).
Os estudos na fase de pré-formulação incluem a estabilidade no estado sólido do
fármaco isolado e a estabilidade na presença dos excipientes. Estas etapas são realizadas
26
para reduzir ou prevenir a ocorrência de deterioração devido à hidrólise, oxidação, entre
outros processos. Por sua vez, o estudo da estabilidade da formulação tem por finalidade
avaliar o comportamento dos medicamentos em função do tempo e a influência de uma
variedade de condições e fatores, sendo levado em consideração tanto o fármaco, quanto a
mistura de excipientes ou veículos utilizados, assim como a interação entre ambos, face às
condições as quais estão submetidos (Brasil, 2005; Mamede et al., 2006).
Para a realização desse estudo, as zonas climáticas constituem um dos importantes
fatores a serem considerados. Devido à grande variabilidade climática, o mundo foi
subdividido em zonas com diferentes especificações de temperatura e umidade, para
possibilitar a comercialização dos produtos em outras zonas climáticas (Carvalho et al.,
2005; Bott & Oliveira, 2007).
Para o procedimento dos ensaios de estabilidade realizados no Brasil, de zona
climática IV, as indústrias farmacêuticas seguem a RE nº 1/2005 da ANVISA que define
três estudos:
Estudo de Estabilidade Acelerada: estudo projetado para acelerar a degradação
química e/ou mudanças físicas de um produto farmacêutico em condições forçadas
de armazenamento. Os dados obtidos, juntamente com aqueles derivados dos
estudos de longa duração, são usados para avaliar efeitos químicos e físicos
prolongados em condições não aceleradas e para avaliar o impacto de curtas
exposições a condições fora daquelas estabelecidas no rótulo do produto, que
podem ocorrer durante o transporte.
Estudo de Estabilidade de Longa Duração: estudo projetado para verificação das
características físicas, químicas, biológicas e microbiológicas de um produto
27
farmacêutico durante e, opcionalmente, depois do prazo de validade esperado. Os
resultados são usados para estabelecer ou confirmar o prazo de validade e
recomendar as condições de armazenamento.
Estudo de Estabilidade de Acompanhamento: estudo realizado para verificar que o
produto farmacêutico mantém suas características físicas, químicas, biológicas, e
microbiológicas conforme os resultados obtidos nos estudos de estabilidade de
longa duração.
Esses estudos são realizados em câmaras climáticas qualificadas de acordo com
normas internacionais, que proporcionam o controle de temperatura e umidade em seu
interior, projetados para serem utilizados continuamente, sem preocupação com falhas nos
instrumentos de controle (Nunes et al., 2007).
Para a avaliação dos estudos, as amostras são retiradas nos tempos determinados
pelo guia. São determinadas as seguintes análises: doseamento, quantificação de produtos
de degradação, dissolução e pH (quando aplicáveis) (Brasil, 2005).
O uso de métodos indicadores de estabilidade, seletivos aos princípios ativos e seus
produtos de degradação, tem sido altamente recomendados pela ANVISA para
acompanhamento de resultados provenientes de estudos de estabilidade de medicamentos
(Brasil, 2003; Brasil, 2005). No entanto, poucas monografias existentes em farmacopeias
incluem metodologias para análise de produtos de degradação, e poucos fabricantes
conhecem e desenvolvem metodologias validadas para detecção e quantificação desses
produtos. Para o desenvolvimento e validação de metodologias indicativas de estabilidade,
28
preconiza-se a realização de testes de estresse, para obtenção de padrões, para fim de
análise (Bakshi & Singh, 2002; Boudreau et al., 2004; Carvalho et al., 2005).
Teste de Estresse
O teste de estresse é definido como um teste de estabilidade para fármacos e
medicamentos sob condições extremas. Esse teste mostra-se como uma tendência dentro do
planejamento para o desenvolvimento de uma forma farmacêutica, pois a investigação da
estabilidade intrínseca do fármaco fornece abordagens de formulação e indica tipos de
adjuvantes, aditivos de proteção específicos e de acondicionamento, que provavelmente
melhorarão a integridade do fármaco e do produto. Demonstrando-se assim, que o
conhecimento do comportamento químico pode ser usado para garantir a estabilidade da
forma farmacêutica desejada (Reynolds et al., 2002; Aulton, 2005).
Um dos principais objetivos a serem atingidos através desse teste é demonstrar a
especificidade ao desenvolver um método indicativo de estabilidade, sobretudo quando
poucas informações estão disponíveis sobre os possíveis produtos de degradação. Estes
também fornecem informações sobre as rotas de degradação e dos produtos formados, que
poderiam ser produzidos durante o período de armazenamento (Reynolds et al., 2002).
A natureza do teste de estresse utilizado para o fármaco depende de suas
características intrínsecas e da forma farmacêutica a ser desenvolvida. Para o medicamento,
o planejamento do estudo deve ser baseado nas propriedades do fármaco e dos excipientes
utilizados na formulação, assim como nas condições de armazenamento. Neste caso, são
utilizadas condições mais severas do que as condições do estudo de estabilidade acelerado,
29
como estratégia para a fase de desenvolvimento da forma farmacêutica (Klick et al., 2005).
No entanto, tais exames podem não ser necessários, se for demonstrado que os produtos de
degradação não são formados sob condições de estudo de estabilidade acelerado ou de
longa duração (ICH, 2003).
Embora o conceito do estudo de degradação forçada não seja novo para a indústria
farmacêutica, o procedimento para sua realização não foi claramente definido pelo guia de
estabilidade do International Conference on Harmonisation (ICH), assim como por outros
órgãos regulatórios. Devido à falta dessas informações detalhadas, a realização do teste
sofre variações extremas nos procedimentos utilizados pelas companhias farmacêuticas
para a obtenção dos resultados, sendo observada a condução dos estudos sem respaldo
científico, levando a resultados muitas vezes duvidosos, principalmente quando são
aplicadas condições estremas em um curto intervalo de tempo (ICH, 2003; Alsante et al.,
2003; Klick et al., 2005).
No Brasil, a ANVISA, através do Informe Técnico nº 1, esclarece procedimentos a
serem seguidos, uma vez que a identificação e quantificação dos produtos de degradação já
eram exigidas no item 2.2.6 da RE nº 560/2002 e no item 2.8 da RE nº 398/2004 –
regulamentações específicas sobre estudos de estabilidade, vigentes à época, além dos
estudos de fotoestabilidade exigidos no item 2.6 da Resolução RE nº 398/2004, assim como
as recomendações para a sua realização no Anexo II da mesma. Já no item 2.9 do anexo da
RE n° 1, de 29/07/2005 - Guia para Realização dos Estudos de Estabilidade, já era
preconizada a realização do ensaio de identificação e quantificação de produtos de
degradação e método analítico correspondente no estudo de estabilidade, para todos os
produtos a serem registrados.
30
O item 2.1.2 da RE N°899 de 29/05/2003 – Guia de Validação de Métodos
Analíticos preconiza que “quando a impureza ou o padrão do produto de degradação não
estiverem disponíveis, pode-se comparar os resultados do teste das amostras contendo
impurezas ou produtos de degradação com os resultados de um segundo procedimento bem
caracterizado” (por exemplo, metodologia farmacopéica ou outro procedimento validado)
(Brasil, 2003).
Este procedimento inclui a realização de testes sob condições de estresse
especificadas pela ANVISA (Tabela 1), que resultaram na apresentação da análise dos
produtos de degradação nos estudos de estabilidade acelerada e de longa duração com a
forma farmacêutica final.
Tabela 1 - Condições de estresse para a realização do estudo de degradação forçada
Aquecimento 60°C
Umidade 75% UR ou >
Solução Ácida 0,1 M HCl
Solução Básica 0,1 M NaOH
Solução Oxidativa 3% H2O2
Fotolítica UV-B fluorescente
Íons metálicos (opcional) 0,05M Fe 2+
ou Cu 2+
O objetivo dos testes realizados através deste procedimento, não é de degradar
totalmente o composto, mas promover uma degradação de pequena extensão (10-30%),
31
evitando-se a formação de compostos de degradação secundários. Sendo observada a
ausência total de degradação do composto após 10 dias, o fármaco deve ser considerado
estável. Se a degradação for inferior a 10%, devem-se aumentar as condições de estresse.
Contudo, a legislação vigente permite a utilização de publicações de literatura científica,
que possam vir a corroborar com os dados experimentais enviados, mas não com a
finalidade de substituir os dados referentes aos ensaios exigidos (Reynolds et al., 2002;
Brasil, 2008).
Um importante fator referente à identificação dos produtos de degradação está
relacionada à segurança dos medicamentos, pois pode ocorrer a formação de produtos
tóxicos e/ou a perda parcial ou total da atividade terapêutica do fármaco, sendo necessários
o isolamento e a caracterização das suas propriedades física e química, assegurando a
segurança biológica a partir da determinação dos níveis de segurança aceitáveis e de seus
limites de quantificação, com relação à posologia diária (Moriwaki et al., 2001).
Delineamento dos Testes de Estresse com Fármacos
O estudo de degradação forçada inclui os efeitos causados pela variação da
temperatura, umidade quando apropriado, oxidação, fotólise e suscetibilidade à hidrólise
por extensa variação dos valores de pH, que são condições típicas de degradação de
fármacos. Vários estudos vêm sendo realizados para a obtenção de produtos de degradação
de muitos fármacos utilizados na terapêutica, utilizando diferentes métodos de obtenção e
identificação (Kapoor et al., 2006; Kumar et al., 2008; Bedse et al., 2009).
32
Contudo, não existe um padrão na realização desses estudos. Na ausência de
procedimentos, dificuldades são enfrentadas pelos profissionais, ao decidir sobre as
condições de estresse a serem utilizadas para um novo fármaco. Alguns estudos, como o
realizado por Singh & Bakshi (2000), propõem um sistema de classificação para a
classificação de fármacos, tomando como base o comportamento da estabilidade de
fármaco diante de variações nas condições submetidas (Aulton, 2005).
Hidrólise
A água é considerada como um dos principais catalisadores em reações de
degradação. Muitos fármacos são considerados como instáveis nesse meio e necessitam de
intervenções durante a formulação e armazenamento, para que a eficácia e a estabilidade
dos fármacos e da forma farmacêutica final não sejam comprometidas. Para a avaliação da
instabilidade sob a condição de hidrólise, também deve ser levado em consideração o pH
do meio, pois íons hidrogênio e hidroxila podem acelerar ou retardar o processo de
degradação (Ansel et al., 2007).
Para realizar o estudo de estresse em condição de hidrólise ácida, utiliza-se
principalmente ácido clorídrico e para a hidrólise básica utiliza-se hidróxido de sódio,
sendo que, muitas variações são observadas no tempo e na temperatura de exposição de
fármacos para essa condição (Figura 1). Existem poucos relatos na literatura sobre a
hidrólise realizada em pH neutro, onde geralmente se utiliza água como agente de hidrólise.
Nessa condição, a taxa de decomposição é lenta, o que é compreensível, porque reações em
pH neutro são não-catalíticas e por isso podem ser necessários períodos muito longos sob
33
condições de temperatura extremas, para conseguir quantidades suficientes de produtos de
degradação (Singh & Bakshi, 2000).
As condições de estresse iniciais são realizadas, assumindo que o fármaco seja
instável, portanto, sujeito a receber condições mais amenas. Dependendo dos resultados
obtidos, aumenta-se ou diminui-se a concentração das condições de reação utilizada (Singh
& Bakshi, 2000).
Figura 1: Fluxograma do estudo de estresse: Hidrólise sob condições ácidas e
básicas (Fonte: Adaptado de: SINGH &BAKSHI, 2000).
34
Oxidação
A degradação oxidativa é uma das principais causas de instabilidade de fármacos,
dentre os mais conhecidos e estudados têm-se os esteróides, antibióticos, vitaminas, óleos e
gorduras. A oxidação envolve a remoção de um átomo eletropositivo, radical ou elétron, ou
a adição de um átomo eletronegativo ou radical. Muitas oxidações são reações em cadeia,
que procedem lentamente sob a influência do oxigênio molecular. Tal processo de reação é
referido como uma auto-oxidação (Florence & Attwood, 2003).
O peróxido de hidrogênio é utilizado para criar as condições de estresse empregadas
para o estudo de oxidação. Esse parece ser muito mais popular para o propósito que
qualquer outro agente oxidante. A concentração de peróxido utilizada varia entre 1% a 30%
(Figura 2).
A estabilização de fármacos frente a condições oxidativas envolve a observação de
um número de precauções durante a manufatura e estocagem. O oxigênio em recipientes
farmacêuticos deve ser substituído por nitrogênio ou dióxido de carbono; assim como o
contato com íons de metais pesados, que catalisam a oxidação, devem ser evitados e a
estocagem deve ser a temperaturas reduzidas (Florence & Attwood, 2003).
35
Figura 2: Fluxograma do estudo de estresse: Oxidação (Fonte: Adaptado de: Singh &
Bakshi, 2000)
Fotólise
A reação de fotólise é iniciada após absorção de radiação eletromagnética. A
maioria dos princípios ativos empregados na preparação de medicamentos apresenta
máximos de absorção na região do ultravioleta do espectro eletromagnético. A radiação
ultravioleta é muito energética e pode propiciar a clivagem de muitas ligações químicas,
ocorrendo a degradação da molécula. Desta forma, é importante conhecer a fotoestabilidade
36
das drogas utilizadas como medicamentos e os produtos formados devido à fotólise, além
de avaliar a toxicidade destes últimos (Moriwaki et al., 2001).
O estudo de fotoestabilidade é atualmente uma importante ferramenta para a
indicação de estabilidade de fármacos e formas farmacêuticas dentro da indústria.
Existe muita variação da maneira na qual o estresse de fotoestabilidade é realizado.
Os fármacos podem sofrer exposição a comprimentos de onda curtas ou longas dentro da
faixa de UV, ou luz fluorescente de iluminação que varia na faixa de (400-1580 foot
candles), sob temperatura ambiente (Figura 3). O período de exposição varia de algumas
horas a vários meses, dependendo da intensidade da fonte luminosa. Para saber se um
fármaco é sensível à fotólise ou não, depende da variação do comportamento de
decomposição observado. Os estudos de fotoestabilidade são feitos em fármacos na forma
sólida ou em solução (Singh & Bakshi, 2000).
Produtos farmacêuticos podem ser adequadamente protegidos da decomposição
induzida pela luz com o uso de recipientes de vidro colorido e estocagem no escuro. Vidros
de cor âmbar filtram luzes de comprimento de onda menores do que 470nm e oferecem
considerável proteção aos compostos sensíveis à luz ultravioleta. O revestimento de
comprimidos com um filme polimérico contendo absorventes de radiação ultravioleta tem
sido sugerido como um método adicional para proteção contra a luz (ICH, 1996; Florence
& Attwood, 2003).
37
Figura 3: Fluxograma do estudo de estresse: Fotólise (Fonte: Adaptado de: Singh & Bakshi,
2000)
Estabilidade Térmica
As técnicas termoanalíticas adquiriram importância crescente em todas as áreas de
conhecimento na química básica e aplicada. A utilização dessa metodologia foi favorecida
pela disponibilidade de instrumentos controlados por microprocessadores, capazes de
fornecer informações quanto ao comportamento térmico dos materiais de forma precisa e
num tempo relativamente curto (Wesolowski & Erecinska, 1998; Grangeioro Junior et al,
2006; Viana et al, 2008).
A análise térmica possibilita uma ampla faixa de aplicação para medidas de
propriedades físicas, como: estudo de reações químicas, avaliação da estabilidade térmica,
38
determinação da composição de materiais e desenvolvimento de metodologia analítica
(Faria et al., 2002).
Essas análises têm sido utilizadas na área farmacêutica como ferramenta útil para
avaliar rapidamente uma possível interação entre os componentes ativos e os excipientes
em estudos de compatibilidade na pré-formulação, além de avaliar a existência de
polimorfismo, compostos de inclusão e dispersões sólidas, determinação de pureza
química, estudos de reações no estado sólido, análise de formas farmacêuticas sólidas e
controle de qualidade (Tomassetti et al., 2005; Alencar et al, 2006; Mamede et al, 2006;
Silva et al, 2009).
A caracterização físico-química do princípio ativo do medicamento é importante,
pois dessa forma, se estabelece a carta de identidade do produto, possibilitando sua
padronização e avaliação de pureza, tornando-o adequado para a realização do estudo de
pré-formulação (Alves et al., 2008).
Um dos principais fatores que devem ser avaliados no desenvolvimento de
formulações é o estudo da estabilidade. Estes estudos são realizados rotineiramente pela
indústria farmacêutica, porém, requerem longos períodos de armazenamento das amostras,
sob condições controladas de temperatura e umidade (Rodante et al., 2002). Embora não
substituam os estudos convencionais, as técnicas termoanalíticas mostram-se extremamente
úteis em estudos de estabilidade, possibilitando a escolha das formulações mais estáveis
com extrema rapidez, fator desejável especialmente para a indústria farmacêutica (Bazzo &
Silva, 2005).
39
Considerações Finais
A Comunidade Europeia e também os Estados Unidos contemplam formalmente a
pesquisa dos produtos de degradação desde a década de 80. Avaliando a evolução do tema
no Brasil, pode-se observar um traçado paralelo entre as três resoluções referentes à
estabilidade da ANVISA. Diante das novas exigências com relação ao desenvolvimento e
validação do método indicativo de estabilidade, as indústrias farmacêuticas e Centros de
Pesquisa & Desenvolvimento necessitam realizar testes de estresse, com o objetivo de
isolar, identificar e caracterizar os produtos de degradação obtidos através de condições
adversas variáveis. Contudo, devido à peculiaridade de cada fármaco e medicamento, o
delineamento do estudo torna-se uma das grandes dificuldades de sua realização, ao mesmo
tempo em que se coloca como desafio necessário aos profissionais da área de
desenvolvimento de produtos farmacêuticos.
Nosso grupo vem, há alguns anos, desenvolvendo parcerias com laboratórios
farmacêuticos para aplicação de metodologias para estudo de estabilidade e ativos de
origem natural e sintética, produtos isolados, misturas de fármacos, bem como, produto
acabado em diferentes formas farmacêuticas em doenças negligenciadas e de alto custo, em
monoterapia e em dose-fixa-combinada.
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46
Capítulo II
4 ESTUDO DE ESTABILIDADE DOS FÁRMACOS
4.1 Artigo III. Estudo de degradação dos fármacos Zidovudina, Lamivudina e
Efavirenz em Condições Ácidas e Básicas
Artigo a ser elaborado após complementação dos resultados
47
4.1 Artigo III. Estudo de degradação dos fármacos Zidovudina, Lamivudina e
Efavirenz em Condições Ácidas e Básicas
Keyla Emanuelle Ramos da Silva1, Mônica Felts de La Roca Soares
1, Lariza Darlene
Santos Alves1, Rafaela C. S. Passos
2, Antônio Rodolfo de Faria
2, Pedro José Rolim Neto
1
1-Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos, Departamento de Farmácia – UFPE
2-Laboratório de Síntese Orgânica Aplicada a Fármacos – UFPE
Resumo
Estabilidade pode também ser definida como o período de tempo compreendido
entre o momento no qual o produto está sendo fabricado àquele que sua potência está
reduzida de não mais do que 10 %, desde que os produtos de alteração estejam todos
seguramente identificados e previamente reconhecidos seus efeitos. Fatores ambientais
como temperatura, umidade e luz, e de outros relacionados ao próprio produto como
propriedades físicas e químicas de substâncias ativas e excipientes farmacêuticos, forma
farmacêutica e sua composição, processo de fabricação entre outros, interferem com a
estabilidade da forma farmacêutica. Estudos de estabilidade são realizados com a finalidade
de garantir a integridade do fármaco e da forma farmacêutica dentro dos limites
especificados, sob influência dos fatores ambientais em função do tempo.
Palavras-Chave: Estabilidade, hidrólise ácida, hidrólise básica, Zidovudina, Lamivudina,
Efavirenz
______________________
*Endereço para Correspondência: Laboratório de Tecnologia de Medicamentos – LTM.
Departamento de Ciências Farmacêuticas – Universidade Federal de Pernambuco. Av. Prof.
Arthur de Sá, S/N, Cidade Universitária, Recife – PE. 50.740-521. Tel/Fax (81)3272-1373.
Email: [email protected]
48
1 Introdução
A realização de estudos de estresse de um dado fármaco pode auxiliar na
identificação de possíveis produtos de degradação, que podem por sua vez ajudar a
estabelecer as rotas degradativas, a estabilidade intrínseca da molécula do fármaco e no
desenvolvimento e validação dos procedimentos analíticos apropriados. A natureza do teste
de estresse dependerá das características individuais do fármaco e do tipo da forma
farmacêutica desenvolvida (SINGH, BAKSHI, 2000; ICH, 2006, 2003).
O objetivo principal de um estudo de estabilidade é a promoção de evidências
científicas de como a integridade do fármaco ou do produto farmacêutico varia em um certo
período de tempo sob diferentes fatores ambientais, como temperatura, umidade e luz, a fim
de se estabelecer um prazo de validade para o fármaco ou produto farmacêutico sob
recomendadas condições de armazenagem (ICH, 2003).
A Zidovudina (AZT), 3-ácido-3-dioxitimidina, foi a primeira droga utilizada na
terapêutica em 1987. Inicialmente foi utilizada na monoterapia, no entanto, atualmente
compõe o coquetel de tratamento da AIDS, como um das drogas inibidoras da trancripitase
reversa análogas de nucleosídeo (IRTN) de primeira escolha e o principal efeito adverso
associado ao AZT é a miolossupressão, particularmente anemia e neutropenia. (TURK,
2002; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).
A Lamivudina (3TC), também um IRTN, é o único fármaco aprovado pelo FDA
que tem atividade contra o HIV e a hepatite B. A dose da lamivudina utilizada na
terapêutica é de 150 mg duas vezes ao dia, apresentando-se na forma farmacêutica
comprimido. Seu tempo de meia vida plasmática é de 3-6h (MINISTÉRIO DA SAÚDE,
2006).
O efavirenz é um inibidor da transcriptase reversa não análogo de nucleosídeo
utilizado como fármaco de primeira escolha da sua classe no tratamento da AIDS. O
governo brasileiro distribui comprimidos de efavirenz 600 mg (Stocrin ), gratuitamente,
através do Programa DST-AIDS (RIBEIRO et al, 2007).
49
2 Materiais e Métodos
2.1 Materiais
As matérias primas utilizadas neste estudo foram: zidovudina, (Northeast®, lote:
15180); lamivudina (Aurobindo®, lote: CLMC055034); efavirenz (Xiamem Mchem®,
lote: 050501); hidróxido de sódio (Vetec); ácido clorídrico (Vetec); acetato de etila
(Cinética); hexano (Cinética); ácido fosfomolíbdico (Aldrich); diclorometano (Cinética),
Sulfato de Sódio Anidro (Cinética), Sílica gel 200-400 mesh com indicador 254 nm,
clorofórmio deuterado.
2.2 Estudo de Degradação
Efavirenz
Hidrolise básica: solubilizou-se o efavirenz em 5 mL de metanol, em seguida adicionou-se
20 mL de hidróxido de sódio (NaOH) 0,1M. Manteve-se a reação sob agitação constante a
uma temperatura controlada de 60°C por 24 horas. Após o termino da reação e resfriamento
da mesma, removeu-se o metanol, sob vácuo, em rotaevaporador. Em seguida, realizou-se
uma extração em funil de decantação, utilizando o solvente diclorometano (3 x 30 mL).
Reuniu-se as fases orgânicas e após secagem sob Na2SO4 anidro, removeu-se o solvente em
rotaevaporador.
Hidrolise ácida: solubilizou-se o efavirenz em 5 mL de metanol, em seguida adicionou-se
20 mL de ácido clorídrico (HCl) 0,1M.. Manteve-se a reação sob agitação constante a uma
temperatura controlada de 60°C por 24 horas. Após o termino da reação e resfriamento da
mesma, removeu-se o metanol, sob vácuo, em rotaevaporador. Em seguida, realizou-se uma
extração em funil de decantação, utilizando o solvente diclorometano (3 x 30 mL). Reuniu-
se as fases orgânicas e após secagem sob Na2SO4 anidro, removeu-se o solvente em
rotaevaporador.
50
Zidovudina
Hidrolise básica: solubilizou-se a zidovudina em 25 mL de NaOH 2,0 M. Manteve-se a
reação sob agitação constante a uma temperatura controlada de 80°C por 24 horas. Após o
termino da reação e resfriamento da mesma realizou-se uma neutralização utilizando-se
HCl 5 M. Ocorreu a precipitação dos produtos de degradação floculados, submeteu-se
então a solução a centrifugação de 2000 rpm por 4 minutos. Separou-se o sobrenadante
isolando-se o precipitado que apresentou-se gelatinoso.
Hidrolise ácida: solubilizou-se a zidovudina em 25 mL de HCl 1,0 M. Manteve-se a reação
sob agitação constante a uma temperatura controlada de 80°C por 24 horas. Após o termino
da reação e resfriamento da mesma realizou-se uma neutralização utilizando-se NaOH 5 M.
Ocorreu a precipitação dos produtos de degradação floculados, submeteu-se então a solução
a centrifugação de 2000 rpm por 4 minutos. Separou-se o sobrenadante isolando-se o
precipitado.
Lamivudina
Hidrolise básica: solubilizou-se a lamivudina em 25 mL de NaOH 1,0 M. Manteve-se a
reação sob refluxo sob agitação constante por 12 horas. Após o termino da reação, esperou-
se a solução esfriar e realizou-se uma extração em funil de decantação utilizando o solvente
acetato de etila (4 x 15 mL). As fases orgânicas foram reunidas, secas sob Na2SO4, anidro e
em seguida, removeu-se o solvente em rotaevaporador.
Hidrolise ácida: solubilizou-se a lamivudina em 25 mL de HCl 1,0 M. Manteve-se a reação
sob refluxo com agitação constante por 12 horas. Após o termino da reação, esperou-se a
solução esfriar e realizou-se uma extração em funil de decantação utilizando o solvente
acetato de etila (4 x 15 mL). As fases orgânicas foram reunidas, secas sob Na2SO4, anidro e
em seguida, removeu-se o solvente em rotaevaporador.
51
2.3 Obtenção de Produtos de Degradação
A deteção dos produtos formados nas reações de degradação foi realizada através de
cromatografia em camada delgada (CCD), utilizando-se como reveladores UV (254 nm),
Ácido fosfomolídico e Ácido sulfúrico 10% em metanol.
A purificação e isolamento dos produtos de degradação foram realizados através de
cromatografia “flash”, em coluna.
Através de CCD pode-se ajustar a fase móvel eluente para o isolamento dos
produtos por cromatografia em coluna “flash”.
Efavirenz
A fase móvel eluente utilizada foi hexano: isopropanol (97:3)
Zidovudina
A fase móvel eluente utilizada foi hexano: acetato de etila: isopropanol (45:45:10)
Lamivudina
A fase móvel eluente utilizada foi acetato de etila
3 Resultados e Discussão
A cromatografia de camada delgada é, atualmente, vista como uma técnica
qualitativa confiável e sensível para a separação de misturas complexas em amostras de
estabilidade (AULTON, 2005). Utilizou-se este como método inicial na condução do
estudo, por apresentar-se como simples e econômica para a identificação qualitativa dos
produtos de degradação obtidos e da sensibilidade dos fármacos às condições de estresse
submetidas. Esses resultados preliminares auxiliarão na análise dos produtos através da
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), que definirá quantitativamente a
proporção do produto obtido e a separação destes para utilização como padrões nos estudos
de estabilidade com a forma farmacêutica pretendida.
52
Efavirenz
Após exposição do fármaco a uma temperatura de 60°C por 24 horas em NaOH
0,1M e em HCl 0,1M e posteriormente resfriada a -2ºC, verificou-se posteriormente através
de CCD a formação de dois produtos de degradação, visualizados através de UV (254nm)
(Figura 1), que possivelmente tratam-se de um amino álcool e a quinolina, produtos
anteriormente descrito na literatura (Figura 2) (Ribeiro et al., 2007). Os espectros de RMN
de 1H (Figuras 5 e 6) confirmam as estruturas do amino álcool (II) e da quinolina (III)
respectivamente.
Figura 1: Placa cromatográfica com padrão da Efavirenz e produtos de degradação. 1 -
Padrão de Efavirenz; 2 – Produtos formados pós Reação de Hidrolise Básica; 3 - Produtos
formados pós Reação de Hidrolise Básica, reação repetida em maior escala para
confirmação de confirmação dos produtos de degradação
Figura 2: Estruturas químicas do efavirenz e possíveis produtos da hidrólise básica (I –
EFAVIRENZ; II – AMINO ÁLCOOL ; III – QUINOLINA).
1 2 3
53
A formação do amino álcool (sólido amarelo pálido) e da quinolina (cristal branco
com odor característico), segundo Ribeiro et al., 2007, segue o seguinte esquema de
formação (Figura 3):
Figura 3: Esquema da formação do amino álcool e quinolina
A separação dos produtos de degradação por cromatografia em coluna “Flash” foi
um ponto crítico, devido aos Rf dos produtos serem muito próximos, sendo necessário o
ajuste fino dos eluentes utilizados para essa finalidade.
As características físicas dos cristais puderam ser visualizadas após separação dos
produtos e remoção do eluente, através do rotaevaporador (Figura 4).
Figura 4: Características físicas observadas dos produtos após hidrólise básica e separação
54
Figura 5: RMN1H do produto de degradação amino álcool
Figura 6: RMN1H do produto de degradação quinolina
55
Zidovudina
Foram seguidos os parâmetros descritos na literatura, a fim de tentar reproduzir as
metodologias existentes. No entanto, esses não apresentaram reprodutibilidade satisfatória
para identificação dos produtos pela técnica pretendida, uma vez que a Zidovudina (Figura
7) apresenta-se consideravelmente estável em meio básico, sendo necessárias condições
mais drásticas de estresse para que o percentual de degradação seja satisfatório para
visualização por CCD e isolamento por cromatografia em coluna “Flash”. Devido a essa
característica, realizou-se vários experimentos modificando-se a concentração da solução
de NaOH (ou HCl), a temperatura e o tempo de exposição ao estresse. As condições
otimizadas, no qual observou-se degradação satisfatória nas reações de hidrólise foram:
NaOH (ou HCl) 2,0M, temperatura de 80°C, durante um período de 24h.
Após a degradação, neutralizou-se o meio reacional, com o objetivo de retirar a
interferência do NaOH (ou HCl) na eluição do produto.
Figura 7: Estrutura química da Zidovudina
Segundo Dunge et al. (2004), o principal produto de degradação da Zidovudina é a
Timina (Figura 8), sendo sua cinética de degradação de primeira ordem.
56
Figura 8: Estrutura química da Timina
Através do estudo realizado, pode-se observar a formação de apenas um produto
após a hidrólise básica e hidrólise ácida. Este foi visualizado através de radiação UV (254
nm), fornecendo fortes indícios que se trata da timina inicialmente citada, já que esta possui
ligações insaturadas em ressonância que absorvam radiação UV nesse comprimento de
onda. No entanto, essa afirmação ainda não pode ser feita, já que o produto observado ainda
não foi identificado através de análises com RMN e IV, para a confirmação das
informações descritas na literatura.
A placa cromatográfica, revelada em UV, como o produto de degradação (Figura 9),
demonstra que apenas uma pequena parte da Zidovudina foi degradada, mostrando que esta
pode ser considerada relativamente estável em tanto em meio básico quanto em meio ácido.
Figura 9: Placa cromatográfica do padrão da Zidovudina antes e após hidrólise básica. 1-
Padrão de Zidovudina; 2 – Produtos de degradação formados após reação de Hidrólise
Básica
Os produtos de degradação observados por CCD já foram devidamente isolados
utilizando-se cromatografia em coluna “flash”. Os mesmos serão submetidos à análise de
RMN 1H, RMN
13C e IV para que possam ser identificados.
1 2
57
Lamivudina
As informações existentes na literatura foram insuficientes e inconsistentes para a
reprodução do método de identificação dos produtos de degradação após exposição à
hidrólise. O método utilizado para o estudo foi desenvolvido e otimizado para que a
degradação fosse satisfatória, para a identificação e separação dos produtos obtidos.
O fármaco foi submetido a um refluxo durante 12 horas em NaOH 1M e em HCl
1M, para que a degradação observada fosse satisfatória. Após a extração, utilizando-se
acetado de etila, aplicou-se o padrão da Lamivudina juntamente com a amostra obtida em
CCD. Observou-se a formação de três produtos de degradação, sendo um em maior e os
outros dois em menor proporção, através do da CCD (UV 254nm) (Figura 10).
Figura 10: Placa cromatográfica com padrão da Lamivudina e produtos de degradação,
respectivamente. 1 – Padrão de Lamivudina; 2 – Produtos de Degradação formados após
Hidrólise Básica
Os produtos de degradação observados por CCD já foram devidamente isolados,
utilizando-se cromatografia em coluna “flash”. Os mesmos serão submetidos à análise de
RMN1H, RMN
13C e IV para que possa identificá-los. Como não há precedentes na
literatura, relativo à identificação dos produtos de degradação, os mesmos só serão
identificados após as análises espectrométricas.
1 2
58
4 Conclusões
O método de CCD mostrou-se simples e eficaz para a identificação inicial dos
produtos de degradação obtidos. A identificação dos produtos da hidrólise básica e da
hidrólise ácida através da CCD, auxiliará no isolamento e quantificação dos produtos e da
degradação, que serão realizados através de Cromatografia de Líquida de Alta Eficiência
(CLAE).
O Efavirenz apresentou-se instável quando submetido a condições drásticas de pH
ácido e básico, sendo observada através de CCD a formação de dois produtos de
degradação (amino álcool e quinolina), que foram isolados e identificados, confirmando-se
assim o que estava descrito na literatura, relativo á hidrólise básica. Apesar do precedente
de degradação do Efavirenz descrito na literatura, para condições básicas, otimizamos o
processo, visto que uma metodologia alternativa mais eficiente foi desenvolvida, além do
que desenvolvemos uma metodologia para a degradação em meio ácido, que não havia
precedente.
A zidovudina apresentou-se estável quando submetida a condições drásticas de pH
ácido e básico, observando-se a formação de um produto de degradação através de CCD.
As análises espectrométricas ainda serão realizadas, no entanto provavelmente se trate da
timina, como já descrito na literatura.
A lamivudina apresentou-se instável nas condições que foi submetida, apresentando
três produtos de degradação formados, que serão identificados a posteriore. A única
referência de degradação da lamivudina, descrita na literatura, não foi reprodutível, sendo
que as condições empregadas nesse trabalho foram satisfatórias e reprodutíveis.
5 Referências Bibliográficas
DUNGE, A.; CHAKRABORTI A. K.; SINGH, S. Mechanistic explanation to the variable
degradation behavior of stavudine and zidovudine under hydrolytic, oxidative and
photolytic conditions. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Amsterdã, v.
35, p. 965-970, 2004.
59
INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONISATION Guidance for Industry
Q1A(R2) Stability Testing of New Drug Substances and Products. nov, 2003
INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONISATION. Guidance for Industry
Q3B(R2) Impurities in New Drug Products. jul, 2006.
MINISTÉRIO DA SAÚDE. Recomendações para terapia Anti-retroviral em adultos e
adolescentes infectados pelo HIV 2006. Brasília, 2006.
RIBEIRO, J.A.A; CAMPOS, L.M.M; ALVES, R.J; LAGES, G.P; PIANETTI, G.A.
Efavirenz related compounds preparation by hydrolysis procedure: Setting reference
standards for chromatographic purity analysis. Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis. v. 43, p 298-303. 2007.
SINGH, S.; BAKSHI, M. Guidance of Conduct of Stress Tests to Determine Inherent
Stabolity of Drugs. Pharmaceutical Technology On-line, p. 1-14, abr. 2000
TURK, G.; MORONI, G.; PAMPURO, S.; BRIÑÓN, M. C.; SALOMÓN, H.
Antiretroviral activity and cytotoxicity of novel zidovudine (AZT) derivatives and the
relation to their chemical structure. International Journal of Antimicrobial Agents. n. 20,
p. 282-288. 2002.
60
Capítulo III
5 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS
5.1 Artigo IV. Determinação simultânea de zidovudina, lamivudina e efavirenz por
cromatografia líquida de alta eficiência – CLAE
Artigo submetido à Revista Química Nova
61
5.1 Artigo IV. Determinação simultânea de zidovudina, lamivudina e efavirenz por
cromatografia líquida de alta eficiência – CLAE
Simultaneous determination of zidovudine, lamivudine and efavirenz by high-
performance liquid chromatography – HPLC
Keyla Emanuelle Ramos da Silva e Pedro José Rolim Neto*
Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos - LTM. Departamento de Ciências
Farmacêuticas. Universidade Federal de Pernambuco - UFPE. Rua Arthur de Sá, s/n.
Cidade Universitária, 50740-521. Recife – PE, Brasil.
Monica Felts de La Roca Soares e José Lamartine Soares Sobrinho
Núcleo de Tecnologia Farmacêutica - NTF. Universidade Federal do Piauí - UFPI. Campus
Universitário Ministro Petrônio Portella, s/n, Ininga, 64.049-550. Teresina – PI, Brasil.
Antônio Rodolfo de Faria
Laboratório de Síntese Orgânica Aplicada a Fármacos – LASOF. Departamento de
Ciências Farmacêuticas. Universidade Federal de Pernambuco - UFPE. Rua Arthur de Sá,
s/n. Cidade Universitária, 50740-521. Recife – PE, Brasil.
Abstract
An accurate, sensitive and specific reversed-phase high-performance liquid
chromatography assay for the simultaneous quantitative determination of the nucleoside
reverse transcriptase inhibitors zidovudine and lamivudine with the non-nucleoside reverse
transcriptase inhibitor efavirenz in tablets is described. The HPLC method involve a C18-
250 mm column, λ 248 nm and gradient mobile phase composed by acetonitrile and water
in a 14 minutes run. The method was validated per ICH guidelines.
Keywords: Zidovudine, Lamivudine, Efavirenz, Method, DFC.
*Autor de correspondência: [email protected]
62
1 Introdução
A introdução da terapia combinada tem reduzido a morbidade e mortalidade de
pacientes infectados pelo vírus da imuno-deficiência humana (HIV). Fármaco de várias
classes farmacológicas e com mecanismos de ação em diferentes etapas da replicação viral
têm sido associados na forma de dose-fixa-combinada (DFC).1,2
O atual regime terapêutico
de primeira escolha associa dois inibidores da transcriptase reversa análogos de
nucleosídeos (ITRN), zidovudina (AZT) e lamivudina (3TC) a um não análogo, efavirenz
(EFZ) (Figura 1).3
Figura 1. Estrutras químicas da zidovudina, lamivudina e efavirenz.
A cromatografia líquida de alta eficiência é a técnica analítica mais empregada para
a pesquisa e quantificação de fármacos antiretrovirais. Na literatura encontram-se métodos
analíticos aplicados a quantificação da zidovudina4, lamivudina
5, efavirenz
6; associações
que não são mais as alternativas de primeira escolha, como lamivudina, estavudina e
nevirapina7,8
,
zidovudina, lamivudina e nevirapina1
e associações acadêmicas como
zalcitabina, lamivudina, didanosina, estavudina, zidovudina, abacavir e nevirapina9; assim
como métodos analíticos aplicados à amostras biológicas de efavirenz10
, lamivudina11
, e
associações de zidovudina e lamivudina12
, lamivudina, estavudina e nevirapina13
.
A produção de uma nova formulação DFC deve estar de acordo com as publicações
do Consenso do Ministério da Saúde3, e toda nova alternativa terapêutica, exige o
desenvolvimento e a validação de um novo método analítico que atenda às especificações
63
dos órgãos reguladores, haja vista a ausência de métodos publicados na literatura científica
e em compêndios oficiais pata a quantificação destes fármacos associados.1
Este estudo descreve o desenvolvimento e validação de um método analítico inédito
por cromatografia líquida de alta eficiência para a detecção e quantificação simultânea da
zidovudina, lamivudina e efavirenz em comprimidos DFC, atendendo às exigências do
Guia de validação de métodos analíticos do International Conference on Harmonisation of
Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH).14
2 Parte Experimental
2.1 Materiais
Comprimidos desenvolvidos pelo Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos –
LTM, da Universidade Federal de Pernambuco - UFPE, contendo 300 mg de zidovudina
(Northeast® lote: DY 070041, Teor 97,88%), 300 mg de efavirenz (Cristália®, lote:
1289/07, Teor 98,00%), e 150 mg de lamivudina (Hangzhou® lote: 071208, Teor
100,00%).
Padrões de trabalho
Para o desenvolvimento e validação do método analítico foram utilizados padrões
de trabalho de zidovudina (Ítaca®, lote HVZ0210304, teor 100,00%), efavirenz (Xiamem
Mchem®, lote 050501, teor 98,32%) e lamivudina (Northeast®, lote 00019, teor 100,47%).
Excipientes
Estearato de Magnésio (Blanver ); Dióxido de Silício Coloidal (Henkel );
Croscarmelose Sódica (Rellance Celulose ) e Polivinilpirrolidona (Xiamem ).
Reagentes
Acetonitrila grau HPLC (J.T. Baker®) e água ultra purificada obtida por Milli-Q
Millipore®, sal fosfato de sódio monohidratado (Vetec®), ácido ortofosfórico (J.T.
Baker®).
64
Equipamentos e condições cromatográficas.
Cromatógrafo líquido de alta eficiência HP/Agilent® 1100 equipado com bomba
quartenária série G1311A, autoinjetor série G1367A, detector DAD (arranjo de diodos)
série G1315A, forno para coluna e degaseificador série G1322A. As colunas utilizadas
neste estudo foram Shim-pack® VP-ODS, 150 x 4,6 mm, ø 10 µm e Phenomenex® 250 x
4,6 mm, ø 5 µm, mantidas a 30°C. A fase móvel foi definida ao longo do desenvolvimento
do método analítico, sendo utilizado acetonitrila, água, tampão fosfato em diferentes
proporções, assim como diferentes regimes de eluição (isocrático e gradiente) e variações
do fluxo da fase móvel.
2.2 Método
Desenvolvimento do método analítico
O desenvolvimento do método teve início com a realização de uma varredura
cromatográfica de 180 a 800 nm, com o auxílio do detector de arranjo de iodo, do padrão
misto contendo os três fármacos, objetivando-se identificar o comprimento de onda no qual
três fármacos apresentassem valores máximos de absorvâncias. Esta varredura foi realizada
com a injeção da amostra no sistema sem a fase estacionária.
Após realização de pesquisas referente a métodos de analises para quantificação de
antiretrovitais, já descritos em farmacopéias15,16
e em artigos científicos publicados,4-13
foram testados variações, avaliando-se os seguintes parâmetros: fase estacionária, coluna
C18 150 x 4,6 mm, ø 10 µm e C18 250 x 4,6 mm, ø 5 µm; fase móvel: variação da fase
aquosa por água grau HPLC, solução tampão fosfato de potássio 0.05 M, pH 3, ajustado
com ácido fosfórico 85%, e variação do sistema de isocrático em diferentes proporções para
o sistema gradiente.
A partir dos cromatogramas obtidos, avaliou-se a adequação do sistema
cromatográfico através dos parâmetros: número de pratos teóricos, fator de assimetria e
resolução entre os picos.
Preparação das amostras
Os comprimidos revestidos DFC foram pesados, triturados e pulverizados. O
equivalente a 12,50 mg de 3TC, 25 mg de AZT e 25 mg de EFZ foi pesado analiticamente,
65
transferido para balão volumétrico de 25 mL, diluído em fase móvel acetonitrila:água
(50:50) e sonicado por 10 minutos. As amostras foram aferidas e filtradas em papel de filtro
faixa-preta. Do filtrado, retirou-se alíquota volumétrica e diluiu-se com fase móvel até
obtenção da concentração final de 20, 40 e 40 μg/mL de 3TC, AZT e EFZ,
respectivamente. As soluções obtidas foram filtradas em unidades filtrantes de 0,45 μm e
analisadas por CLAE. Foram preparadas amostras em quintuplicata.
Validação do método analítico
Parâmetros Avaliados
O método proposto foi validado seguindo os parâmetros de linearidade, robustez,
precisão, exatidão e especificidade de cada princípio ativo, especificados no guia do ICH.14
A linearidade do método foi verificada a partir da análise de três curvas autênticas
do padrão misto nas concentrações de 10; 16; 20; 24 e 30 μg/mL para 3TC; 20; 32; 40; 48 e
60 μg/mL para AZT e 20; 32; 40; 48 e 60 μg/mL para EFZ. Os resultados obtidos foram
tratados estatisticamente, por cálculo de regressão linear pelo método dos mínimos
quadrados.
No parâmetro robustez foi analisada a possível influência de pequenas variações
ocasionadas pela alteração na vazão da fase móvel nos primeiros 4,5 minutos (0,99; 1,00 e
1,01 mL/min), na temperatura do forno (28, 30 e 32º C) e no tempo de sonicação da
preparação das amostras (08, 10 e 12 min).
A especificidade/seletividade do método foi determinada pela análise do placebo
dos comprimidos contendo polivinilpirrolidona, croscarmelose sódica, dióxido de silício
coloidal e estearato de magnésio.
A precisão foi avaliada em dois níveis: repetitividade (precisão intra-corrida) e
precisão intermediária (precisão inter-corridas). Para a repetitividade, replicatas de 6
determinações a 100% da concentração teste dos fármacos associados foram analisadas. Já
para precisão intermediária, as quintuplicatas foram analisadas em dias diferentes e por
analistas diferentes. Para avaliar a exatidão do método, amostras em concentrações
conhecidas equivalentes a 80, 100 e 120% da concentração teórica analisada para cada
fármaco foram testadas, as quais correspondem às concentrações mínima, média e máxima,
respectivamente.
66
3 Resultados e Discussão
3.1 Desenvolvimento do método analítico
Foi realizado um levantamento de métodos que utilizaram as moléculas envolvidas
no estudo com finalidade comparativa ao método desenvolvido (Tabela 1). A varredura
cromatográfica realizada apontou como melhor comprimento de onda 201 nm, seguido de
248 nm, sendo o primeiro comprimento muito próximo a região do visível e por
conseqüência apresentando diversas instabilidades de leitura, adotou-se então o
comprimento de onda de 248 nm (Figura 2).
Figura 2. Varredura cromatográfica do padrão misto dos três fármacos, sem coluna
cromatográfica – Faixa ampliada de 180 a 320 nm.
67
Tabela 1: Condições cromatográficas dos métodos analíticos publicados.
Métodos Fase móvel Sistema
Tempo de
retenção/
corrida
(minutos)
Fluxo
da FM
(mL/min)
Fase Estacionária °C
Forno
Vol.
injeção
(µL)
Detector λ N° Ref.
Artigo
Méto
do
s co
m M
atr
iz n
ão B
ioló
gic
a
EFZ + Impurezas
A: Água acidificada - 0.05% (ác. Trifluoroacético)/ Metanol – (90:10)
B: Água acidificada - 0.05% (ác. Trifluoroacético)/ Metanol – (10:90)
Gradiente
NI
Total: 40 1.5
Zorbax SB-CN, 150 x
4,6 mm 40 35 UV 250 6
AZT Tampão pH 4,5 (ác. acético)/Metanol
(77:23) Isocrático
AZT: 12
Total: 20 1
C18, 250 × 4.6 mm ø
5µm NI 10 DAD 265 4
3TC Acetato de amônio/Metanol (440:60) - pH
5,5 Isocrático NI 1 C18, 125 mm 35°C 20 UV 270 5
3TC + D4T+ NVP
A: Tampão acetato 10 mM pH 3,5 (ác. acético glacial)/Metanol (80:20)
B: Acetonitrila/Álcool isopropílico (50:50)
Gradiente
3TC: 5,9 D4T:
8,8
NVP: 14.2 Total: 25
0.6 C18, 250 mm NI 10 UV 270 7
3TC +AZT + NRP Tampão fosfato de potássio
0,05 M pH 3,0/Acetonitrila (60:40) Isocrático
3TC: 2,4 AZT: 3,4 NVP: 4,8
Total: 7,0
1.0 C18, 250 x 4,6 mm, ø
10 µm 30 10 UV 270 1
Méto
do
s co
m
Ma
triz
Bio
lóg
ica
3TC + D4T +NVP Água acidificada – 0,5% de ác. acético
glacial/Acetonitrila (20:80) Isocrática
NI
Total: 4,5 0.4
C18, 150 ×3.9mm, ø 5
µm 25 5 MS/MS NA 13
EFZ Tampão fosfato 10 mM pH 2,4 (1N
HCl)/Acetonitrila (55:45) Isocrátioco
EFZ: NI
Total: 10 2.4
C18, 150 ×4.6mm, ø 5
µm NI 20 UV 245 10
Méto
do
Dese
mvo
lvid
o
AZT + 3TC +EFZ
A: Acetonitrila/Água (50:50)
B: Acetonitrila/Água (70:30) C: Acetonitrila/Água (75:25)
Gradiente
AZT: 2,84
3TC: 2,28
EFZ: 8,30
Total: 14
A: 1.0
B e C: 1.5
C18, 250x 4,6 mm
ø 5 µm 30 10
DAD 248 NA
68
Devido a diferença das características físico-químicas das moléculas envolvidas
(Figura 1) dificilmente seria possível a separação cromatográfica e detecção das mesmas
por meio do detector de DAD, utilizando um sistema isocrático no método pretendido.
Trabalhos anteriormente publicados envolvendo determinações simultâneas de fármacos
pela técnica de cromatografia líquida, usando o detector DAD, utilizam em sua grande
maioria o sistema de eluição da fase móvel gradiente.6,7
Ao mesmo tempo também são
observados a utilização de sistemas de eluição isocráticos, quando o objetivo da análise são
moléculas de características semelhantes,1,13
onde outras variáveis como interação fase
estacionária-fármaco, fluxo da fase móvel e sua composição podem agir de forma efetiva
na separação dos compostos, além de ser empregado para determinação simples dos
fármacos em questão.4,10
A diferença da polaridade referente aos sistemas eluentes utilizados para a
determinação do EFZ,6,10
de natureza preponderante orgânica, em comparação ao
encontrado em sistemas eluentes para a determinação do 3TC e AZT, de natureza
preponderante aquosa,1,4
(Tabela 1) comprova que a associação de três moléculas de
composição heterogênea, para ter-se um método eficaz e com uma duração razoável de
análise, deve-se utilizar o sistema gradiente para tal finalidade.
As condições para o método cromatográfico foram primeiramente estabelecidas
com o padrão misto de 3TC, AZT e EFZ e, após otimização dos parâmetros, foram
aplicadas para o doseamento do comprimido DFC.
Por apresentar os três picos simétricos, com boa resolução entre eles e áreas bem
definidas, a fase estacionária escolhida para o doseamento foi a coluna C18
(Phenomenex®). Não houve diferenças estatisticamente significativas entre os resultados
obtidos com a fase aquosa água grau HPLC e tampão fosfato, optando-se por se trabalhar
com apenas água como a fase aquosa. Sob as condições experimentais verificadas (Tabela
2), o método foi o escolhido por apresentar melhor resolução entre os picos, condições
ideais para conservação da coluna e tempos de retenção de 2,28 min para 3TC; 2,84 min
para AZT e 8,30 min para EFZ, adequado a rotina de análise para aprovação ou liberação
do produto na indústria farmacêutica. A temperatura selecionada foi de 30ºC por ser
percebida durante as análises como a que apresenta maior facilidade de estabilização para o
forno do cromatógrafo. O volume de injeção foi de 10 μL. Os fármacos foram injetados
69
isoladamente em tal condição cromatográfica (Figura 3) e associados (Figura 4),
verificando a semelhança referente aos tempos de retenção dos princípios-ativos.
Tabela 2: Composição e fluxo da fase móvel padronizadas no método desenvolvido.
Tempo (min) de corrida
Solvente A
Acetonitrila%
Solvente B
Água %
Fluxo da FM
(mL/min)
0,01
3,00
4,5
50
50
70
50
50
30
1,0
1,0
1,5
5,00
10,00
11,00
75
75
50
25
25
50
1,5
1,5
1,0
14,00 50 50 1,0
70
Figura 3. Cromatogramas dos fármacos AZT, EFZ e 3TC (padrão de trabalho) isolados sob
as condições cromatográficas definidas.
Figura 4. Cromatograma referente ao método analítico escolhido para quantificação do
AZT (40mg), 3TC (20mg) e EFZ (40mg).
71
A performance do sistema cromatográfico escolhido foi avaliada de acordo com os
parâmetros: resolução entre os picos, fator de assimetria, além de número de pratos. A
resolução entre os picos mede a qualidade da separação entre eles: quanto mais distantes,
melhor a separação e mais segura é a quantificação. Os valores da resolução entre os picos
3TC e AZT foi de 3,39 e entre AZT e EFZ 33,4 sendo superiores a 2,00, indicando
separação eficaz entre os mesmos.1 Além do fator de resolução verificou-se por meio do
DAD a pureza dos picos individualmente, comprovando a não co-eluição dos picos
referentes aos 3 fármacos. O fator de assimetria obtido foi de 1,40 para 3TC; 1,38 para
AZT e 1,45 para EFZ, apresentando, portanto, valores inferiores a 1,5, descrito na literatura
como aceitável para amostras de interesse.17
O número de pratos teóricos diz respeito à
eficiência da coluna, devendo ser superior a 2000,4,18
os resultados obtidos foram 5776,42;
5748,28; 2792,71 para 3TC, AZT e EFZ, respectivamente.
3.2 Validação do método analítico
Os resultados obtidos da avaliação dos parâmetros foram tratados estatisticamente
por Análise de Variância (ANOVA) one-way e teste t de Student,13
com nível de
significância de 95%.
Robustez
Um método robusto tem a habilidade de fornecer resultados inalterados quando
sujeito a pequenas mudanças19
. Para todas as modificações analisadas na robustez, variação
da vazão da fase móvel, tempo de sonicação das amostras, variação da temperatura do
forno cromatográfico, os resultados obtidos apresentaram desvio padrão relativo inferior a
2,0%, a partir de amostras analisadas em quintuplicata. Pela análise estatística dos
resultados, foi verificado que os valores obtidos para os F calculados foram inferiores ao do
F tabelado, determinando com 95% de confiança que o método é robusto para estas
variáveis testadas (Tabela 3).
72
Tabela 3: Validação: Parâmetro Robustez utilizando ANOVA fator único.
Análise
Estatística
Lamivudina
(20µg/mL)
Zidovudina
(40µg/mL)
Efavirenz
(40µg/mL)
Variação do Fluxo da Fase Móvel (mL/min)
0,9 1,0 1,1 0,9 1,0 1,1 0,9 1,0 1,1
Média 19,70 20,80 19,96 40,83 41,1 40,73 40,73 40,30 40,07
DPR (%) 0,31 0,07 0,26 0,36 0,81 0,50 0,16 0,31 0,20
F cal 4,606 0,193 1,522
F tab 5,143
Tempo de Sonicação da Amostra (min)
8 10 12 8 10 12 8 10 12
Média 19,93 20,47 20,70 40,83 40,74 41,3 40,76 40,11 40,55
DPR (%) 0,10 0,16 0,19 0,16 0,18 0,07 0,54 0,86 0,09
F cal 3,044 1,930 0,656
F tab 5,143
Temperatura do Forno da Coluna (°C)
28 30 32 28 30 32 28 30 32
Média 21,02 21,33 20,43 40,43 40,47 40,72 40,33 40,10 40,97
DPR (%) 0,37 0,36 0,09 0,18 0,21 0,21 0,42 0,43 0,71
F cal 2,259 0,372 1,175
F tab 5,143
Linearidade
O método também se mostrou linear, para a faixa de variação entre 50 a 150%,
conforme as equações da reta do 3TC, onde y = 33,69925x – 5,27723, do AZT onde y =
19,88996x – 7,14878 e do EFZ onde y = 35,75349x – 3,31668; no entanto, seguindo a
análise de variância, tem-se que o R2 máximo explicável é de 0,9988, 0,9990 e 0,9991
respectivamente. Houve uma regressão estatisticamente significativa e sem falta de ajuste,
proporcionando uma curva linear.
A linearidade de um método demonstra que os resultados obtidos são diretamente
proporcionais à concentração do fármaco na amostra, dentro de um intervalo especificado.
As áreas obtidas no intervalo de variação analisado demonstraram que não há falta de ajuste
no modelo proposto, visto que os resíduos não apresentaram anormalidade na sua
distribuição, considerando os três parâmetros em estudo.
73
Precisão e exatidão
O método apresentou-se preciso nos dois níveis analisados. Na repetitividade, as
seis amostras autênticas com concentração de 100%, apresentaram desvio padrão relativo
(DPR) de 0,47 para o 3TC, 1,20 para o AZT e 0,69 para o EFZ, sendo estes inferiores a 2%.
Para a precisão intermediária (Tabela 4), os resultados entre dias e analistas diferentes não
evidenciaram diferença estatisticamente significativa entre analistas e dias, empregando-se
Anova fator duplo. Todos os resultados se mostraram inferiores ao f tabelado, confirmando
com 95% de confiança que o método é preciso, por não apresentar diferenças
estatisticamente significativas entre analistas e entre dias.
Na exatidão, os resultados para o t calculado referente à concentração mínima
considerada de 80% para a concentração média de 100%, e para a concentração máxima
referente a 120% estão descritos na Tabela 5. Estes resultados quando comparados com o t
tabelado de 4,303 com 95% de confiança se apresentaram inferiores, demonstrando que o
método desenvolvido é exato, já que não foram evidenciadas diferenças estatisticamente
significativas entre os valores obtidos e os esperados.
Tabela 4: Validação: Parâmetro Precisão Intermediária utilizando ANOVA fator duplo.
F c
alc
ula
do
3TC AZT EFZ F Tabelado
Entre Analistas 0,978 2,213 2,351 5,143
Entre Dias 2,88 1,321 2,125 5,987
Entre Dias e Analistas 0,921 1,609 0,961 5,143
74
Tabela 5: Validação: Parâmetro Exatidão utilizando Teste-t.
Concentração Fármaco T Calculado T Tabelado
3TC
0,337
80% AZT
EFZ
3TC
3,55 100% AZT 4,303
EFZ
3TC
0,640
120% AZT
EFZ
Especificidade
O método proposto demonstrou ser seletivo e específico, não sendo afetado pelos
excipientes utilizados no processo de fabricação do comprimido revestido, o que pôde ser
confirmado pela ausência de absorvâncias nos tempos de retenção dos picos referentes aos
três fármacos (Figura 5). Pode-se também notar que os fármacos possuem tempos de
retenção distintos como verificado nos cromatogramas da Figura 3, onde se observa a
detecção das moléculas isoladas.
Figura 5. Cromatograma do placebo realizada com o método desenvolvido.
75
4 Conclusão
O método descrito neste trabalho foi desenvolvido a fim de se disponibilizar um
procedimento analítico para quantificação desta associação de fármacos antiretrovirais em
comprimidos dose-fixa-combinada, haja vista a inexistência de métodos descritos seja em
compêndios oficiais seja em trabalhos científicos, destinados a este doseamento. É um
método simples e de baixo custo, levando-se em consideração a heterogeneidade dos
fármacos envolvidos, apresentando confiabilidade e segurança necessárias em
procedimentos analíticos. Os parâmetros verificados garantiram que ele é robusto, exato,
preciso e específico para a quantificação da forma farmacêutica contendo a associação de
lamivudina, zidovudina e efavirenz.
Agradecimentos: A CAPES, CNPq, FINEP, LAFEPE e Sinc do Brasil pela parceria no
projeto.
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Medeiros, F. P. M.; Lima, L. G. Quim. Nova. 2007, 30(5), 1163.
77
Capítulo IV
6 TECNOLOGIA DE OBTENÇÃO DO COMPRIMIDO REVESTIDO DOSE-FIXA-
COMBINADA À BASE DE ZIDOVUDINA, LAMIVUDINA E EFAVIRENZ
6.1 Artigo V. Tecnologia de obtenção de comprimido revestido dose-fixa-combinada a
base de lamivudina, zidovudina e efavirenz
Artigo a ser submetido
78
6.1 Artigo V. Tecnologia de obtenção de comprimido revestido dose-fixa-combinada a
base de lamivudina, zidovudina e efavirenz
Keyla Emanuelle Ramos da Silva1, Mônica Felts de La Roca Soares
1, Jeckson Luis da
Silva1, Antônio Rodolfo de Faria
2, Pedro José Rolim Neto
1*
1- Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos, Departamento de Farmácia – UFPE, Av.
Prof. Arthur de Sá, S/N, Cidade Universitária – CEP: 50.740-020, Recife-PE
2 - Laboratório de Síntese Orgânica Aplicada a Fármacos, Departamento de Farmácia –
UFPE, Av. Prof. Arthur de Sá, S/N, Cidade Universitária – CEP: 50.740-020, Recife-PE
Resumo
A terapia anti-retroviral altamente ativa pode suprimir a replicação viral e prolongar a
vida do paciente. Formulações multi-fármacos com dose fixa vêm sendo utilizadas para reduzir
o número de vezes que o medicamento é administrado e aumentam a conveniência do
tratamento. De acordo com o Consenso de AIDS 2007-2008, publicado pelo Ministério da
Saúde, os fármacos de primeira escolha para o tratamento da AIDS hoje são a Zidovudina, a
Lamivudina e o Efavirenz. A escolha de uma formulação adequada é essencial ao
desenvolvimento dos comprimidos e para garantir melhor disponibilização no trata
gastrointestinal, de forma a alcançar a biodisponibilidade e o efeito terapêutico desejado. Nesse
trabalho, apresentamos de forma lógica, o desenvolvimento tecnológico de comprimidos
revestidos dose-fixa-combinada a base de Zidovudina, Lamivudina e Efavirenz levando em
consideração as características físicas e físico-químicas desses fármacos. Os núcleos foram
obtidos utilizando-se a técnica de granulação por via úmida e os parâmetros adotados seguiram
as especificações farmacopéicas oficiais e a determinação quantitativa foi realizada mediante
métodos analíticos desenvolvidos e validados.
Palavras-Chave: Comprimido, dose-fixa-combinada, AIDS
*Email: [email protected]
79
1 Introdução
A terapia anti-retroviral altamente ativa pode suprimir a replicação viral e prolongar
a vida do paciente. No entanto pode falhar, por várias razões, incluindo a aderência não
satisfatória ao tratamento, potencial insuficiente do fármaco, desenvolvimento de
resistência, fatores celulares e farmacocinéticos e quantidades de fármacos a serem
administrados (BACK & KHOO, 2003).
A máxima supressão viral por maior tempo possível é a principal meta da terapia
anti-retroviral. Para isso, substituiu-se a monoterapia pela terapia combinada, ou seja,
administra-se mais de um fármaco ao mesmo tempo. Recomenda-se que esta terapia
combinada seja composta por dois inibidores da transcriptase reversa análogos de
nucleosídeo (ITRN) associados a um inibidor da transcriptase reversa não-análogo de
nucleosídeo (ITRNN) ou um inibidor de protease (IP) (LAVRA et al, 2008; FARIAS et al,
2006).
Formulações multi-fármacos com dose fixada reduzem o número de vezes que o
medicamento é administrado e aumentam a conveniência do tratamento. No entanto a terapia
anti-retroviral é uma área complexa, sujeita a constantes mudanças. As recomendações deverão
ser vistas periodicamente, com o objetivo de incorporar novos conhecimentos gerados pelos
ensaios clínicos (GULICK, 2003).
De acordo com o Consenso de AIDS 2007-2008, os fármacos de primeira escolha para o
tratamento da AIDS hoje são a Zidovudina, a Lamivudina e o Efavirenz.
Os inibidores da transcriptase reversa análogos de nucleosídeos foram a primeira
classe de drogas utilizada como anti-retrovirais. A Zidovudina (AZT), 3-ácido-3-
dioxitimidina, foi a primeira droga utilizada na clínica em 1987. Inicialmente foi utilizada
na monoterapia, no entanto atualmente, compõe o coquetel de AIDS como um das drogas
IRTN de primeira escolha. Seu tempo de meia-vida plasmática é de 1,1 h e sua dosagem é
de 300 mg duas vezes ao dia com restrições alimentares. O principal efeito adverso
associado ao AZT é a mielossupressão, particularmente anemia e neutropenia. Atualmente
a zidovudina encontra-se disponibilizada no mercado na forma farmacêutica cápsula de 100
mg e xarpoe 10 mg/mL (TURK, 2002; LAFEPE, 2006; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).
A Lamivudina (3TC), também um IRTN, é o único fármaco aprovado pelo FDA
que tem atividade contra o HIV e a hepatite B. A dose da lamivudina utilizada na
80
terapêutica é de 150 mg duas vezes ao dia, apresentando-se na forma farmacêutica
comprimido revestido. Seu tempo de meia vida plasmática 3-6h (MONTEIRO et al, 2006;
MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).
Encontra-se disponibilizado no mercado uma formulação que associa zidovudina
300 mg e lamivudina 150 mg (Combivir ), com posologia de duas vezes ao dia, sem
restrições alimentares (KENNEY et al, 2000).
O Efavirenz (EFV) foi o terceiro IRTNN a ser liberado (1998) e é a fármaco de
primeira escolha dessa classe de medicamentos. O governo brasileiro distribui comprimidos
de efavirenz 600 mg (Stocrin ) gratuitamente através do Programa DST-AIDS (RIBEIRO
et al, 2007). Seu tempo de meia vida é de 40-55 h. Recentemente o governo brasileiro
licenciou compulsoriamente a patente desse medicamento, permitindo assim que novas
DFC sejam desenvolvidas no país (VIANA et al, 2006; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008).
Com o desenvolvimento e a produção de um comprimido, pretende-se a administração
oral de uma quantidade correta de fármaco com sua integridade química protegida de modo
adequado durante o intervalo de tempo e no local desejado. Portanto, o objetivo do presente
estudo será a obtenção de núcleos dose-fixa-combinada, utilizando-se da técnica de granulação
por via úmida e os parâmetros adotados seguirão as especificações farmacopéicas oficiais e a
determinação quantitativa será realizada mediante métodos analíticos desenvolvidos e validados.
2 Metodologia
2.1 Controle de Qualidade Físico-Químico
Antes do desenvolvimento de qualquer forma farmacêutica, é essencial que as
propriedades físicas e químicas da molécula do fármaco e outras propriedades do fármaco
em pó sejam determinadas. As informações obtidas nesta etapa, conhecida como pré-
formulação, são imprescindíveis no desenvolvimento da nova formulação (AULTON,
2005).
O objetivo deste item foi caracterizar os antiretrovirais zidovudina, lamivudina e
efavirenz, realizando as análises de controle de qualidade físico-químicas de acordo com os
métodos descritos na Farmacopéia Brasileira 4ª edição.
81
2.1.1 Matérias-primas
As matérias – primas utilizadas neste estudo foram: zidovudina, (Northeast® lote:
DY 070041); lamivudina (Hangzhou® lote: 071208) e efavirenz (Cristália®, lote:
1289/07). A caracterização baseou-se nos métodos analíticos descritos na Farmacopéia
Brasileira, 4ª edição, 1988, 2001 e 2002.
2.1.2 Padrões de trabalho
Zidovudina (Ítaca® lote HVZ0210304 – teor 100,0%), lamivudina (Northeast® lote
00019 – teor 100,47%) e efavirenz (Xiamem Mchem® lote 050501 – teor 98,32%).
Zidovudina
Figura 1: Estrutura molecular da zidovudina (AZT)
A zidovudina apresentou-se na forma de pó branco ou acastanhado, possui massa e
fórmula molecular equivalente a 267,2 g/mol e C10H13N5O4, respectivamente. Funde-se a
aproximadamente 124 ºC, sendo levemente solúvel em água e solúvel em etanol.
Na verificação da descrição, foi realizada sua análise macroscópica e avaliada a
solubilidade. Foram avaliadas também as constantes físico-químicas referentes ao ponto de
fusão e poder rotatório. O ponto de fusão foi determinado por método capilar no
fusiômetro, já para o poder rotatório utilizou-se o polarímetro com uma solução a 1 %
(m/v) em etanol. O conteúdo de água foi determinado em 1 g da amostra utilizando um
82
analisador de umidade de alta precisão com fonte de radiação halógena, a uma temperatura
entre 100 ºC - 105 ºC.
Todos os ensaios foram realizados com auxílio da balança analítica e de vidrarias
graduadas e/ou volumétricas.
O doseamento foi realizado por dois métodos: espectrofotométrico, desenvolvido e
validado pelo LAFEPE (RV 024, LAFEPE, 2003), e por cromatografia líquida de alta
eficiência. Na quantificação pelo método espectrofotométrico foi analisada uma solução
aquosa a 0,01 mg/mL num comprimento de onda de 268 nm. Pelo método cromatográfico
uma solução a 0,2 mg/mL em fase móvel foi analisada nas seguintes condições
cromatográficas: coluna C18 (LiChrospher ®), 250 x 4,6 mm, partícula 5 μm; detector UV
(λ = 265 nm); fase móvel metanol grau HPLC e água ultrapurificada numa proporção de
20:80; fluxo de 1,2 mL/min e volume de injeção de 10 µL. Para os dois métodos foram
preparadas e analisadas soluções padrões nas mesmas condições.
Lamivudina
Figura 2: Estrutura molecular da lamivudina (3TC)
A lamivudina apresenta-se na forma de pó cristalino branco a branco-amarelado,
com massa e fórmula molecular equivalente a 229,26 g/mol e C8H11N3O3S,
respectivamente. Funde-se num intervalo entre 176 ºC – 178 ºC.
A verificação da sua solubilidade foi realizada em água purificada, metanol, etanol,
acetona, ácido clorídrico 0,1 M e hidróxido de sódio 0,1 M. O poder rotatório específico foi
determinado em polarímetro, com uma solução metanólica a 0,8 % (m/v) e o ponto de
83
fusão pelo método capilar em fusiômetro. O teor de água foi verificado pelo método Karl-
Fischer. O resíduo por incineração foi determinado em condições semelhantes à
zidovudina.
O doseamento da amostra foi realizado pelos métodos espectrofotométrico e
cromatográfico. Por espectrofotometria uma solução aquosa de lamivudina a 0,0015 %
(p/v) foi preparada e lida em detector UV (λ = 270 nm). Para análise por cromatografia, as
condições cromatográficas utilizadas foram as seguintes: coluna C 8 (Microbondapack®),
250 x 4,6 mm, 5 μm; detector UV (λ = 277 nm); fase móvel com tampão acetato pH 3,8 e
metanol (95:5); fluxo 1 mL/min e volume de injeção de 10 µL.
Efavirenz
Figura 3: Estrutura molecular do efavirenz (EFZ)
O efavirenz é representado pela fórmula molecular C14H9ClF3NO2 e possui massa
molecular 315,68 g/mol. Caracteriza-se como pó cristalino branco ou levemente amarelado.
Apresenta-se solúvel em metanol e diclorometano e praticamente insolúvel em água. A
faixa de fusão entre 136,0ºC – 141,0ºC foi verificada pelo método capilar em fusiômetro.
O teste de perda por dessecação foi determinado em 1 g da amostra, utilizando
analisador de umidade de alta precisão com fonte de radiação halógena a 105 °C. O
doseamento foi realizado por cromatografia líquida de alta eficiência, tendo como fase
estacionária a coluna cromatográfica C18 (LiChrospher ®), 250 x 4,6 mm, partícula 5 μm
detector UV (λ = 252 nm); fase móvel com tampão e acetonitrila e água acidificada com
ácido orto-fosfórico; fluxo 1,0 mL/min e volume de injeção de 20 µL.
84
2.2 Desenvolvimento de comprimidos revestidos dose-fixa-combinada
2.2.1 Materiais
Levando-se em consideração as características físicas e físico-químicas dos pós de
lamivudina, zidovudina e efavirenz, foi realizada uma planificação quali-quantitativa de
excipientes.
As matérias-primas com seus respectivos fornecedores foram: zidovudina,
(Northeast® lote: DY 070041); lamivudina (Hangzhou® lote: 071208) e efavirenz
(Cristália®, lote: 1289/07), Estearato de Magnésio (Blanver ); Dióxido de Silício Coloidal
(Henkel ); Croscarmelose (Rellance celulose ); Polivinilpirrolidona (Xiamem ). Os
equipamentos utilizados no processo de obtenção dos comprimidos foram: misturador em
“V” (Lawes ); Granulador oscilante (Fabbe-Primar ); Estufa industrial (Imarvil );
Compressora rotativa de 16 punções (Newberger ); Drageadeira convencional.
Baseando-se em uma planificação qualitativa e quantitativa de excipientes, foram
manipulados 4 (quatro) lotes de bancada (LB) contendo 300 g de massa de pós, os quais
estão descritos na tabela 1. Os lotes de bancada foram calculados para obtenção de
comprimidos com 800 mg de peso médio.
Tabela 1: Formulações dos lotes de bancada desenvolvidos
Componente LBI % LBII
%
LBIII
%
LBIV
%
Função
ETAPA I
Lamivudina 19,23 19,23 19,2 19,2 Principio ativo
Zidovudina 38,46 38,46 38,4 38,4 Principio ativo
Efavirenz 38,46 38,46 38,4 38,4 Principio ativo
Croscarmelose Sódica 2,85 2,85 1,5 1,0 Desintegrante
Polivinilpirrolidona ----- ----- ----- 0,5 Agregante
Solução hidro-
alcoolica (1:1)
100
(gotejado)
100
(total)
100 100
ETAPA II
Estearato de Magnésio 1,0 1,0 1,0 1,0 Lubrificante
Dióxido de Silício
Coloidal
---- ---- 0,5 0,5 Desumidificante
Croscarmelose Sódica ---- ---- 1,0 1,0 Desintegrante
TOTAL 100 100 100 100
85
2.2.2 Técnica de Obtenção de Comprimidos
Com a finalidade de melhorar as características reológicas dos fármacos, requisito
necessário para alcançar o escoamento adequado durante a alimentação da máquina
compressora e no enchimento das matrizes de compressão (PRESCOTT & BARNM,
2000), todos os lotes de bancada foram obtidos utilizando-se a técnica de granulação por
via úmida. (MONTEIRO, 2000).
Foi produzido um granulado dos princípios ativos (Lamivudina, Zidovudina e
Efavirenz) – ETAPA I. A etapa de molhagem mostrou-se um ponto crítico do processo.
Mudou-se a forma de molhagem (vertendo a solução molhante aos poucos e toda de uma
vez) durante o processo a fim de obter-se uma massa coesiva. Após a passagem pelo
granulador oscilante, a massa foi submetida à secagem em estufa industrial (50°C por 1
hora e 30 min).
Na ETAPA II, o granulado seco foi calibrado, em seguida misturado com os demais
excipientes e submetido à compressão. Foram utilizados punções oblongos de 17 mm, na
obtenção dos lotes de bancada, de forma a se obter uma melhor homogeneidade da massa
de adjuvantes no comprimido, já que o aporte de fármacos no mesmo é muito alto.
A mudança realizada nos lotes de bancada I e II foi no processo, a forma com que a
massa foi molhada nos dois lotes foi diferente.
Os núcleos obtidos foram submetidos aos testes físico-químicos (Peso médio,
uniformidade de peso, dureza, friabilidade, desintegração, dissolução e doseamento).
O revestimento por película realizado utilizou-se o Opadry Y-1-7000 como
polímero disperso em sistema aquoso. O lote de bancada submetido aos testes de
revestimento foi o LB IV. Todos os parâmetros definidos para o processo de revestimento
foram controlados: temperatura de secagem (35 2°C), rotação da drageadeira (20 rpm),
distância da pistola de aspersão para o leito dos comprimidos (20 cm), pressão da bomba de
pulverização (3 Bar). A eficiência do revestimento foi avaliada pelas características
macroscópicas e pelo ganho de peso alcançado após o processo.
86
3 RESULTADO E DISCUSSÃO
3.1 Controle de qualidade físico-químico
Os resultados das matérias-primas dos fornecedores testados estão descritos nas
tabelas 2, 3 e 4.
Tabela 2: Resultados das análises de controle de qualidade físico-químico da
matéria-prima zidovudina, (Northeast® lote: DY 070041)
Parâmetros Especificações (Farmacopéia Brasileira) Resultado
Caracteres físicos Pó branco ou acastanhado De acordo
Doseamento (CLAE) 98,0 a 102,0% 101,01%
Doseamento (espectrofotometria) 98,0 a 102,0% 100,79%
Perda por dessecação Máximo 1,0% 0,55%
Poder rotatório
Ponto de fusão
+ 60,5° a + 63,0° a 25°C
Aproximadamente 124°C
+ 61,5°
123°C
Solubilidade Levemente solúvel em água
Solúvel em etanol
De acordo
De acordo
Tabela 3: Resultados das análises de controle de qualidade físico-químico da matéria-prima
lamivudina (Hangzhou® lote: 071208)
Parâmetros Especificações Resultado
Caracteres físicos Pó cristalino branco a branco-amarelado De acordo
Solubilidade Facilmente solúvel em água
Ligeiramente solúvel em metanol e
etanol
Insolúvel em acetona
Facilmente solúvel em HCl 0,1 M e
NaOH 0,1 M
De acordo
De acordo
De acordo
De acordo
Perda por dessecação Máximo 2,0 % (por Karl Fischer) 0,4%
Doseamento (espectrofotometria) 98,0 a 102,0% 100%
Doseamento (CLAE) 98,0 a 102,0% 101,08%
Faixa de fusão 176°C a 178°C 177,5 °C
Poder rotatório (25°C) -135° a –146° a 25 °C - 143,5 0º
87
Tabela 4: Resultados das análises de controle de qualidade físico-químico da matéria-prima
efavirenz (Cristália®, lote: 1289/07)
Parâmetros Especificações (Farmacopéia Brasileira) Resultado
Caracteres físicos Pó cristalino,branco ou levemente
amarelado, inodoro
De acordo
Solubilidade Bastante solúvel em metanol e
diclorometano, insolúvel em água
De acordo
De acordo
Perda por dessecação Não mais que 1,5% 1,36%
Doseamento (CLAE) 98,0 a 102,0% 101,01%
Ponto de fusão 136-141°C 136°C
Poder rotatório -86,0° a –98,0° 25°C -86,0°
A verificação das características físicas (aparência, odor, pH da solução saturada e
ponto de fusão) é a primeira etapa na análise da qualidade das matérias-primas (AULTON,
2005). De acordo com as especificações para os três fármacos em estudos, descritos nas
tabelas acima, todos estavam em conformidade com os aspectos físicos específicos para
cada ativo. No entanto, sabe-se que a determinação do aspecto macroscópico sozinho não é
capaz de garantir a qualidade de qualquer substância farmacêutica, sendo necessário a
realização de testes analíticos adicionais que confirmem suas características e integridade.
A análise do teor de água, para zidovudina, seguiu o princípio termogravimétrico no
qual após o aquecimento, ocorre uma redução no peso inicial da substância em análise,
devido à volatilização da água (GENNARO, 2004). O equipamento utilizado foi o
analisador de umidade de alta precisão com fonte de radiação halógena, sendo esta
responsável pelo aquecimento. Já para a lamivudina e para o efavirenz utilizou-se o método
titulométrico de Karl Fischer. Os três princípios ativos apresentaram teor de água dentro do
especificado.
A determinação do ponto de fusão corresponde a temperatura na qual a substância
em análise encontra-se totalmente fundida (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1988) e
muitas vezes uma redução nesta constante pode caracterizar alteração na pureza ou
polimorfismo. Os três ativos apresentaram resultados em conformidade com as
especificações.
A determinação do poder rotatório é utilizada para estabelecer a identidade e a
pureza da substância, representando a sua capacidade de desviar o plano de luz polarizada
(FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1988). De acordo com o resultado obtido, AZT
88
apresenta-se como uma substância dextrógira, EFZ e 3TC levógiras, estando em
conformidade com as respectivas especificações.
Para quantificação do AZT e 3TC, foram utilizados dois métodos. O
cromatográfico, que por ser mais seletivo e específico detectaria a presença de possíveis
impurezas e substâncias de degradação. No entanto este tipo de análise requer maior tempo
e custo mais elevado, desde a preparação das amostras até a obtenção dos resultados. Como
alternativa, para redução do custo e tempo de análise, utilizou-se método
espectrofotométrico, que para 3TC já é farmacopéico e para AZT foi desenvolvido e
validado pelo LAFEPE®, agilizando o processo analítico de rotina. O teor dos fármacos,
por ambos os métodos, apresentavam-se dentro do limite especificado. O teor da efavirenz
determinado por CLAE também se apresentou dentro do limite especificado.
Através das análises físico-químicas realizadas foi possível verificar e garantir que a
matéria-prima utilizada no processo de desenvolvimento farmacotécnico industrial dos
comprimidos revestidos dose-fixa-combinada de zidovudina, lamivudina e efavirenz
apresentavam a qualidade requerida para produtos farmacêuticos. Além disso, a
caracterização dos ativos foi o passo inicial para o processo de qualificação de fornecedores
exigidos pela RDC n° 210, de 04 de Agosto de 2003 (ANVISA).
3.2 Desenvolvimento de comprimidos revestidos dose-fixa-combinada
Com base nas características físicas dos fármacos, já descritas na literatura e a
experiência do grupo no desenvolvimento de medicamentos anti-AIDS, a obtenção desse
comprimido pelo processo de Compressão Direta não foi possível ser realizada, sendo
necessário recorrer ao processo de Granulação por Via Úmida (LAVRA, 2006; FARIAS,
2006; VIANA, 2005).
Durante o processo de granulação por via úmida, a etapa de malaxagem mostrou-se
a mais crítica do processo de obtenção do comprimido de dose-fixa-combinada. Diferente
da maioria das granulações por via úmida, nesta a etapa de molhagem realizou-se vertendo
toda solução molhante de uma só vez na mistura de pós, pois observou-se que quando esta
molhagem é realizada aos poucos a massa apresenta-se muito seca. E em decorrência das
características apresentadas pelo fármaco efavirenz o volume da solução molhante é
89
limitado, pois se esse limite for excedido a massa toma rapidamente o aspecto de resina e
torna-se muito pegajosa, dificultando a etapa de granulação. O controle do volume de
molhagem e a modificação na forma de molhar a massa de pós possibilitaram a obtenção de
um granulado mais adequado para obtenção dos comprimidos.
Foram adotados parâmetros farmacopéicos para avaliação dos núcleos
comprimidos, os resultados estão descritos na tabela 5.
Tabela 5: Resultados do Controle físico-químico dos comprimidos obtidos
PARÂMETROS ESPECIFICAÇÃO LBI LBII LBIII LBIV
Peso Médio (mg) 800 mg 5% 780 794 799 801
Dureza (Kgf/cm2) > 8,0 6,8 9,5 14,1 13,2
Friabilidade (%) < 1,00 0,740 0,221 0,113 0,124
Desintegração (min) < 30 2,0 5,0 3,4 2,24
Teor (%) Entre 90 – 110
Efavirenz
Lamivudina
Zidovudina
90,4
98,3
96,7
90,5
98,6
96,5
93,1
98,7
97,96
95,5
99,29
97,88
Com base nos dados apresentados na tabela 5, observa-se que o lote de banca LB I
foi reprovado no parâmetro dureza, atribui-se esse fato ao processo de malaxagem, onde se
verteu a solução molhante aos poucos e pode-se observar que a massa apresentou aspecto
seco, o que dificultou a granulação e a compressão.
Otimizou-se o processo realizando a molhagem dos pós de maneira diferente,
verteu-se toda a solução molhante de uma só vez e foi observada uma melhora
significativa, obtendo-se um granulado com qualidade superior ao lote anterior e um
processo de compressão mais fácil, obtendo assim núcleos com dureza satisfatória.
Afim de facilitar o escoamento do granulado no momento da compressão adicionou-
se ao LBIII dióxido de silício coloidal. No entanto mesmo com a modificação no processo,
ainda observava-se a massa com aspecto seco. Então no LB IV, adicionou-se a formulação
PVP –K30, onde observou-se uma massa úmida mais uniforme.
Por apresentar melhores resultados e superfície mais homogênea e bem definida, o
lote de bancada LBIV foi submetida ao processo de revestimento. O revestimento utilizado
sistema aquoso – Opadry Y-1-7000 disperso em água, demonstrou-se simples e prático. A
90
disposição do polímero na superfície dos comprimidos foi homogênea e uniforme, sem
presença de falhas. O ganho de peso dos comprimidos revestidos, em relação aos núcleos
foi de 2,12%, dentro do recomendado para revestimento utilizando película, que é entre 2-
3%.
4 CONCLUSÕES
Todos os comprimidos obtidos das 4 (quatro) formulações testadas, apresentaram
resultados dentro das especificações farmacopéicas, exceto o LB I que apresentou dureza
abaixo do especificado. O lote de bancada LBIV obteve os melhores resultados, com
homogeneidade de conteúdo, peso e superfície bem definida, lisa e uniforme, o que
facilitou o processo de revestimento. O revestimento aquoso vem se demonstrando como
uma alternativa em relação ao revestimento orgânico, uma vez que se torna simples, rápido
e não há risco de impurezas residuais de solventes orgânicos. No entanto, serão necessários
mais estudos para avaliação da influência do tipo de sistema de dispersão utilizado
(orgânico ou aquoso) no processo de dissolução do comprimido dose-fixa-combinada, uma
vez que um dos fármacos presente na formulação (efavirenz) possui baixa solubilidade em
água, levando a problemas de disponibilidade do fármaco no meio.
É de grande interesse para o Programa DST-AIDS, do Ministério da Saúde-Brasil a
forma farmacêutica desenvolvida, comprimidos revestidos de dose-fixa-combinada, visto
que este projeto recebeu financiamento da FINEP para obtenção do medicamento que será
distribuído no referido Programa.
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2006.
94
Conclusões e Perspectivas
95
7 CONCLUSÕES
I - As matérias-primas analisadas apresentaram qualidade satisfatória e foram consideradas
adequadas para serem submetidas ao processo produtivo, uma vez que se apresentam
dentro das especificações estabelecidas de controle de qualidade.
II - As metodologias de degradação foram desenvolvidas e otimizadas. Evidenciou-se por
CCD os produtos de degradação formados quando os fármacos são submetidos às
hidrólises básica e ácida, os mesmos foram isolados por Cromatografia em Coluna “Flash”
e preparados para serem submetidos às Técnicas de RMN 1H, RMN
13C e IV.
III - O método analítico de quantificação desenvolvido por Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência apresentou resultados satisfatórios para todos os quesitos avaliados por meio de
processo da validação.
IV - Diante dos resultados alcançados, pode-se garantir a obtenção da forma farmacêutica
comprimido revestido dose-fixa-combinada à base de zidovudina 300 mg, lamivudina 150
mg e efavirenz 300 mg com qualidade e confiabilidade, requisitos fundamentais no
desenvolvimento de um medicamento segundo as Boas Práticas de Fabricação e Controle
(BPFC), preconizados pelo órgão regulatório (ANVISA-MS).
96
8 PERSPECTIVAS
Realização do estudo de estabilidade utilizando as outras formas de estresse:
oxidação, fotólise e hidrólise neutra;
Realização do estudo de estabilidade dos fármacos associados;
Determinação da cinética de degradação dos fármacos;
Transposição de escala para produção industrial do comprimido desenvolvido;
Estudo de estabilidade da forma farmacêutica comprimido revestido, segundo a RE
01/2005 - ANVISA;
Estudos de Bioequivalência para os comprimidos revestidos;
Validação do método de dissolução para os comprimidos revestidos dose-fixa-
combinada.
97
Referências Bibliográficas
98
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100
Anexos