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El alumno... Conoci-
miento
Compren-
sión
Aplica-
ción
V.
METABOLISMO
DEL DNA
Revisará los diferentes procesos metabólicos en los
que el DNA es la molécula central, i.e., la replicación, la
reparación y la recombinación. Describirá la
enzimología de los diferentes procesos y destacará la
importancia de la fidelidad de la replicación y de la
necesidad de conservar la estructura y función del
DNA.3. Reparación del
DNA
3.1. Describirá los daños que causan agentes químicos y físicos
al DNA.
X
3.2. Comprenderá los mecanismos que conducen a una
mutación cuando el DNA dañado no es reparado.
X
3.3. Describirá los principales mecanismos de reparación del
DNA (fotoreactivación, reparación por escisión de bases,
reparación por escisión de nucleótidos).
X
3.4. Reconocerá la importancia de la síntesis de DNA y de las
enzimas replicativas en los procesos de reparación del DNA.
X
3.5. Conocerá la respuesta SOS en bacterias y la función de la
reparación sujeta a errores.
X
3.6. Distinguirá los mecanismos generales de reparación
(reparación global del genoma y reparación acoplada a
transcripción) en eucariontes.
X
3.7. Conocerá algunas enfermedades asociadas a defectos en
los sistemas de reparación del DNA.
X
Objetivos del tema
El DNA puede ser dañado de muchas maneras, pero este daño
solamente conduce a una mutación cuando NO es reparado.
• Daño: cambios químicos en el DNA
• Mutación: cambios en la secuencia de bases del DNA
Reparación del DNA
MUTACIONES EN EL DNA
Mutaciones espontáneas (105 – 108)
Mutaciones inducidas (por mutágenos)
Mutaciones puntuales
Mutaciones: Adiciones o deleciones de bases
Substitución de base:
transición (AG; GA)transversión (CG; CA; TG; TA)
Tipos de mutaciones de pares de bases
CATTCACCTGTACCA
GTAAGTGGACATGGT
CATGCACCTGTACCA
GTACGTGGACATGGT
CATCCACCTGTACCA
GTAGGTGGACATGGT
Transición (T-A por C-G) Transversión (T-A por G-C)
CATGTCACCTGTACCA
GTACAGTGGACATGGT
Inserción
Sustituciones de pares de bases transición: pirimidina por pirimidina o purina por purina transversión: pirimidina por purina o purina por pirimidina
Secuencia silvestre
Deleción o eliminaciónCATCACCTGTACCA
GTAGTGGACATGGT
Repercusión a nivel de proteína
Mutación sinónima
Mutación de error
Mutación sin sentido
Mutación de marco
Conservativa
No conservativa
Tipos de Daño al DNA. Rayos X y rayos gamma.
Ionizan moléculas que rodean al DNA generando radicales libres, algunos de estos contienen oxígeno que tienen un electrón desapareado. Son especies altamente reactivas y pueden atacar la molécula del DNA causando rupturas en una o en las dos cadenas.
También pueden modificar quimicamente una base, como la guanina.
Generación de 8-oxo-guanina. Causa transversiones: GC -> TA
Tipos de Daño al DNA. Radiación UV. Formación de dímeros de timina.
Entrecruzamiento covalente de pirimidinas adyacentes en la misma cadena de DNA. Generalmente son timinas.
Dímeros de timina
Exposición a radiacionesultravioleta
Tipos de daño: Alteraciones espontáneas en el DNA
Depurinación y desaminación de bases
100 al día
5000 al día
Desaminaciones
Tipos de Daño al DNA. Desaminación por ácido nitroso.
Desaminación de citosina genera uracilo
Desaminación de 5-metil citosina genera
timina
Depurinaciones
Introduction to Genetic AnalysisAnthony Griffiths, VIII Ed.
Etil Metano Sulfonato:
MutágenoAgente alquilanteTransición de base
Mutágenos
Tipos de Daño al DNA. Alquilación.
Metilación o acetilación de las bases en los átomos (O/N) que participan en la formación de puentes de H, desestabiliza la doble hélice de DNA y hace esa zona susceptible a mutación.
La presencia de estas regiones dañadas puede causar detención de la replicación, o si ésta continúa, está sujeta a errores.
Metabolismo
celular
Exposición
Luz UV
Radiación
ionizante
Exposición
Química
Errores en
replicación
Activación
Punto de control
Ciclo celular
Activación
Programa
transcripcional
Reparación de DNA:
Reversión directa
Excisión de base
Excisión de nucleótido
Reparación de error
Reparación por
Recombinación homóloga
Apoptosis
Cuando los daños no son reparados, se pueden generar cambios en las secuencia de las bases durante la replicación, produciendo una mutación.
REPARACIÓN
• Corrección directa del DNA dañado.
• Eliminación de la región dañada del DNA y relleno con DNA recién sintetizado.
MECANISMOS DE REPARACIÓN
1. Fotoreactivación: ruptura de dímeros de pirimidinas por acción de
una fotoliasa (phr) activada mediante luz visible.
2. Reparación por Escisiónde bases (BER): DNA glicosilasa (fpg) reconoce el nt dañado,intervienen exo III (xth), endo IV (nfo),
de nucleótidos (NER): necesita la otra hebra como molde (hasta 30bp), intervienen las endonucleasas uvrA,B,C y la helicasa uvrD
3. Reparación post- replicativa
Reparación de apareamiento erróneo de bases (“mismatch”): unametilasa reconoce DNA recientemente replicado (dam) e intervienenlas proteínas “mut” (helicasas, etc)
Reparación por recombinación
Reparación Directa de Daños al DNA
Fotoreactivación
Sistema de reparación que se activa en presencia de luz.
Fotoliasa. Detecta al DNA dañado y se une a éste. La enzima absorbe luz azul y se activa. Rompe los enlaces covalentes entre los dímeros de timina.
La enzima se disocia y se separa del DNA.
Reacción dependiente de FADH
Acción de la fotoliasa (fotoreactivación)
Reversión directa dímeros de pirimidinas
Solo se activa por luz visible
Reparación de DNA por Escición
Implica la remoción del DNA dañado incluyendo algunas secuencias adyacentes.
BER: “Base excision repair”
NER: “Nucleotide excision repair”
Reparación de DNA por Escición de Bases (BER)
Cuando una base dañada en el DNA es reconocida, una glicosilasa actúa y rompe el enlace N-glicosídico entre la base y el azúcar. Esto deja un sitio AP (apurínico/ apirimidínico). Una endonucleasa AP reconoce este “hueco” e hidroliza los enlaces fosfodiéster adyacentes.
La DNA pol I repara degradando el DNA (5’->3’) y sintetiza DNA nuevo.
DNA ligasa sella el último enlace.
Las DNA glicosilasas reconocen bases dañadas
Reparación por escisiónde base BER
Reparación de DNA por Escición de Nucleótidos (NER)
Escinucleasa uvrABC realiza este tipo de reparación en dímeros de timina, otros fotoproductos y bases dañadas.
Escinucleasa (246 kDa) está compuesta por tres subunidades (A, B y C)
UvrA se une al DNA en la región dañada.
UvrB/UvrC tienen actividad de endonucleasa y corta en los lados adyacentes de la cadena liberando un oligonucleótido de unos 12-13 nts de largo.
La región “vacía” es rellenada por una DNA polimerasa I y sellada por una DNA ligasa.
Reparación por escisiónde nucleótido
uvrABC: exinucleasa
NER
uvrD: helicasa
Reparación por escisión de nucleótidos en bacterias y en humanos
BER NER
¿Cómo se
identifica a la
cadena molde
cuando se
repara un error?
MutSMutL
MutH
MutH corta la cadena NO metilada
Mismatch repair
Mismatch repair
(NER) “Mismatch Repair”
A pesar de la alta fidelidad que exhiben las DNA polimerasas y de su actividad correctora, pueden cometer errores, dejando las dos cadenas desapareadas.
¿Cómo distingue el sistema de reparación cuál de las dos cadenas debe reparar? Las cadenas parentales
están metiladas (-GATC-). Sistema de
reparación MUTATOR:
Identificación del sitio de desapareamiento y unión al DNA.
Corte de la cadena de DNA no metilada.
Eliminación del DNA de cadena sencilla.
DNA pol III rellena el “hueco”
DNA ligasa sella el último enlace.
Mecanismos de reparación postreplicativos
La respuesta SOS en E. coli
En células sin daño en el DNA, LexA reprime la síntesis de LexA, recA, uvrABC y de otras proteínas involucradas en la respuesta SOS.
LexA es una proteína de 22 kDa que se une a las regiones operadoras.
La respuesta SOS en E. coli
Cuando hay daño en el DNA, se activa RecA al unirse al DNA de cadena sencilla y estimular la auto-proteólisis de LexA en un enlace Ala-Gly.
Ocurre transcripción de los genes de las proteínas encargadas de la reparación del DNA.
Algunos de los mecanismos de reparación regulados por SOS son susceptibles a errores (“error prone”).
Genes y proteínas que participan en la Respuesta SOS
Nombre del gen Proteína o función en la reparación de DNA
Genes de función conocida
polB (dinA)
uvrA
uvrB
umuC
umuD
sulA
recA
dinB
Subunidad polimerasa de la DNApol II requerida para comenzar la replicación durante la reparación del DNA en recombinaciónSubunidades UvrA y UvrB en ABC de la excinucleasaDNA pol VProteína que inhibe la división celular para dar tiempo a reparación del DNAProteína RecA requerida para la reparación en recombinaciónDNA pol IV
Genes involucrados en metabolismo de DNA pero de función desconocida en reparación
ssbuvrDhimA
recN
Proteína SSBDNA helicasa IIRecombinación sitio específica, replicación, transposición, regulación de la expresiónReparación en recombinación
• Cuando se expone E. coli a altos niveles de radiación o a un mutágeno, ocurre un daño extensivo en el DNA. La célula responde induciendo la vía SOS de reparación.
• Se activan los genes umuC yumuD cuyos productos componen las subunidades de la DNA polimerasa V.
• DNA PolV replica el DNA, aún en regiones donde hay daño y es muy propensa a cometer errores.
• Se observa una alta tasa de mutación
• Cepas de E. coli nulas en umuC son inmutables.
Reparación sujeta a errores
Reparación de DNA por Recombinación
+
+
I. Durante la replicación, se brinca la región frente al dímero.
II. Ocurre intercambio entre las cadenas y recombinación
III. Se completa la síntesis de la cadena que sufrió intercambio. El dímero se quedó sin reparar.
Reparación por escición de nucleótidos en eucariontes
1. Reparación global de genoma. El heterodímero XPC-hHR23B localiza lesiones que distorsionan a la doble hélice de DNA.
2. Reparación acoplada a la transcripción. La RNA polimerasa identifica el daño en el DNA. Se detiene la transcripción.
Reparación por escición de nucleótidos en eucariontes
Una vez que se ha reconocido el daño, participan las mismas proteínas en la reparación.
• TFIIH (XPB + XPD) que tiene actividad de helicasa es reclutado.
• XPA y RPA contribuyen a mantener abierta la doble hélice de DNA.
• XPA guía a las endonucleasas para realizar el corte del DNA.
• Endonucleasa XPG corta el DNA en el lado 3’.
• El complejo ERCC1-XPF corta del lado 5’ de la cadena dañada.
• El oligonucleótido (24-32nts) con la región dañada es liberado.
• El hueco es rellenado por la DNA
polimerasa o .
Enfermedades humanas asociadas con defectos en la replicación o reparación del DNA
Asociadas con una alta frecuencia de mutaciones en cromosomas y genes. Algunas se asocian a una alta predisposición a tumores. • Xeroderma pigmentosum
•Mutaciones en genes involucrados en reparación por escición de nucleótidos. Melanoma
• Ataxia telangiectasia• Mutaciones en genes que detectan daño al DNA.• Riesgo incrementado a rayos X.
•Anemia de Fanconi• Mutación en gene involucrado en reparación al DNA.
•Síndrome de Bloom • Mutación en una helicasa de DNA. • Hipersusceptibilidad a rayos X y a la luz solar.
•Síndrome de Cockayne (CSA/CSB)• Defecto en reparación acoplada a transcripción. • Susceptibilidad a luz solar.
• Síndrome de Werner• Mutación en un gen de DNA helicasa. • Envejecimiento prematuro.