INSTITUTIONEN FÖR BIOLOGI OCH

MILJÖVETENSKAP

Uppsats för avläggande av naturvetenskaplig kandidatexamen med huvudområdet biologi BIO602 Biologi: Examensarbete 15 hp Grundnivå Termin/år: Ht 2016

Handledare: Kristina Sundell, Inst. för biologi och miljövetenskaper samt Anna Godhe Inst. för marina vetenskaper

Examinator: Susanne Eriksson, Inst. för biologi och miljövetenskap

NY PARASITÄR ENCELLIG ORGANISM I SVENSKA OSTRON Mikroskopi av vävnadsprov och cellulära isolat

Anders Alfjorden

Ange källa till ev bild på framsida här

1

Innehållsförteckning

Abstract/Sammanfattning ................................................................................................................. 3

Introduktion ...................................................................................................................................... 4

Bakgrund ...................................................................................................................................... 4

Problemområde ............................................................................................................................ 4

Syfte och hypotes ............................................................................................................................. 4

Några frågeställningar och hypoteser. ...................................................................................... 5

Material och metod .......................................................................................................................... 5

Genomförandeplan ....................................................................................................................... 5

Material och odlingsmedier .......................................................................................................... 5

Provinsamling ............................................................................................................................... 6

Aseptisk provuttag från kylförvarade ostron ................................................................................ 6

Vuxna ostron 1-7: 15 november ............................................................................................... 6

Juvenila ostron, 11-15 (årgång 2016) samt 16-20 (årgång 2015): 26 november ...................... 6

Juvenila ostron 21-30 (årgång 2016 och 2015): 27 november ................................................. 7

Blåmusslor 31-35 och Stillahavsostron 36-40: 28 november ................................................... 7

Cellodling i termokonstantrum ..................................................................................................... 7

Urval och isolering av klonala kulturer ........................................................................................ 8

Fotodokumentation och mikroskopiska studier ........................................................................... 8

DNA extraktion och Molekylärgenetisk undersökning PCR ....................................................... 9

DNA extraktion......................................................................................................................... 9

Molekylärgenetisk undersökning genom kvantitativ PCR analys .......................................... 10

Resultat ........................................................................................................................................... 10

Biologiska data ........................................................................................................................... 10

Längd och viktuppgifter: djur som ingick i undersökning (ostron och musslor) ................... 10

Mikroskopiska fynd och påvisade celltyper ............................................................................... 11

Kroppsegna rörliga celler........................................................................................................ 11

Apicomplexa-liknande celler, rörliga bananformade celler av zoit-typ ................................. 11

Centriska kiselalger (diatomeer, växtplankton av släktet Thalassiosira spp.) ........................ 12

Kiselflagellater, Dictyochales, växtplankton (Dictyocha specelum och D. fibula) ................ 14

Olikstora multicellulära sfärer, okänd organismtyp ............................................................... 15

Ovala elongerade-rektangulära celler, okänd organismtyp .................................................... 16

DNA extraktion och molekylärgentisk undersökning genom q-PCR ........................................ 17

Sekvensiering pågår, resultat återstår att analysera ................................................................ 17

Diskussion ...................................................................................................................................... 17

Påvisade celler av zoit-typ indikerar infektion med Apicomplexa, en grupp med enbart parasitära organismer ................................................................................................................. 17

2

Hypotes 1) Parasitära encelliga organismer förekommer vilande och latent i vuxna och juvenila ostron......................................................................................................................... 17

Hypotes 2) Kan mollusker/filtrerande tvåskaliga djur fungera som en reservoar för växtplankton och temporärt fungera som både näringskälla medverka till spridning och cellulär förökning av dessa ..................................................................................................... 18

Diagnostik genom mikroskopi av parasiter ................................................................................ 18

Möjligt väg mot bättre förståelse av encelliga organismer ........................................................ 19

Fråga 1: förekommer parasitära encelliga organismer i svenska ostron? ............................... 19

Tack till .......................................................................................................................................... 21

Referenslista ................................................................................................................................... 21

Bilaga 1 .......................................................................................................................................... 22

Medier ..................................................................................................................................... 22

Kemikalier .............................................................................................................................. 23

Förbrukningsmaterial .............................................................................................................. 23

Utrustning ............................................................................................................................... 24

3

Abstract/Sammanfattning Odling av svenska ostron är en vattenbruksnäring med stor potential men den brottas idag med både abiotiska och biotiskt hämmande miljöfaktorer. För att närmare undersöka förekomst av parasitära organismer som skulle kunna ha negativ inverkan på ostronets tillväxt och överlevnad, togs initiativet till denna studie. Målet var att identifiera potentiellt skadliga encelliga organismer i vuxna eller juvenila ostron. Genom att etablera primära ostroncellkulturer från olika organprover möjliggjordes studier av levande ostronceller och deras interaktion med andra kroppsfrämmande och eventuellt parasitära organismer. Genom undersökningarna har parasitära infektioner som misstänkt tillhörande gruppen Apicomplexa (koccidier) påvisats både i ostron men också i blåmussla. Genom odling av enskilda celler har denna organism kunnat isoleras och studeras ytterligare genom cellodling. Kompletterande undersökningar pågår för att fylogentiskt placera detta isolat med molekylärgenetisk metodik. Om dessa fynd kan verifieras och kopplas till Apicomplexa gruppen är det i så fall det första och enda kända fyndet av muskulär koccidios i platta ostron (Ostrea edulis). Infektion med parasitär koccidios hos tvåskaliga djur är dåligt studerat och endast ett fåtal exempel finns idag väl beskrivna. Denna mikroskopiska undersökning har också påvisats förekomst och cellutveckling av växtplankton tillhörande kiselalgs- (centriska diatomeer, Thalassiosira spp.) och kiselflagellats-gruppen (Dictyocha spp.). Att algcellerna är levande med aktiva kloroplaster har verifierats genom fluoroscensmikroskopi med blått ljus. Kloroplaster från utvalda prover har vid dessa tester emitterat rött ljus och därmed verifiera att de innehåller aktiva kloroplaster. Detta indikerar att växtplankton kan ha ett liv efter döden, dvs. aktiveras efter passage genom ostronets matsmältningssystem. Rubrik muntlig presentation zoologen 20170113: Parasitära zoiter invaderar ostronmuskel och en kiselalgs liv efter döden.

Introduktion Bakgrund Intresset för att odla svenska ostron är stort både från vattenbrukets sida men också ur miljösynpunkt då dessa arter livnär sig genom filtrering av havsvatten. Dessa djur kan därmed minska kväve och fosfor halterna i havet genom sitt näringsupptag. Filtrerande tvåskaliga djur (musslor), inklusive våra ostronarter, har stort kommersiellt värde. Livskraftiga bestånd av dessa arter är därför en viktig tillgång vid utnyttjandet av de näringsrika havsområden som vi har längs med vår nordvästra kust i Skagerrak. Detta områden har en stor potential för att expandera i ett framtida svenskt vattenbruk.

Problemområde Försök att utnyttja det platta ostronet (Ostrea edulis) som kommersiell art har visat på stora svårigheter bland annat när det gäller att få de olika larvstadierna att överleva fram till full storlek och skörd. Olika abiotiska och biotiska faktorer i odlingsmiljön påverkar ostronets överlevnad liksom potentiella sjukdomsproblem, men de sistnämnda faktorerna är dåligt undersökta. Internationella studier visar att sjukdomar och olika smittämnen kan bidra till försämrad överlevnad för ostron och orsaka produktions störningar (Bower, 2011). De fåtal svenska studier som genomförts har fokuserat på förekomst av virus eller bakteriella smittämnen. De dominerande och allvarligaste sjukdomsproblemen ur ett internationellt perspektiv är dock framförallt encelliga parasiter tillhörande Rhizaria gruppen. Dessa har dock enbart studerats beträffande sjukdomarna Bonamios och Marteilios bland annat genom ett svenskt hälsokontrollprogram under 2009-2015. Ingen av dessa allvarliga smittämnen har dock påträffats i ostron i Sverige. Marina encelliga parasiter hos tvåskaliga djur (bivalver) är dock en mycket divers och mångfacetterad organismgrupp. Kanadensiska studier visar att en av dessa arter inom Rhizaria/Haplosporidium i Nordamerika: Microcytos mackini har en oerhört snabb evolutionär utveckling (Burki et al. 2013). Andra endemiska eller invaderande encelliga organismer som skulle kunna utgöra ett potentiellt hot och sjukdomsproblem är alltså fortfarande mycket dåligt studerade. Klart är därför att stora kartläggningsbehov fortfarande finns och en pilotstudie av denna typ som skissas nedan kan vara en inkörsport för ökad kunskap inom området.

Syfte och hypotes Genom att utföra undersökningar av vävnadsprov från unga djur och vuxna föräldradjur av det inhemska europeiska platta ostronet, Ostrea edulis, var målet att identifiera och påvisa förekommande parasitära encelliga organismer. Detta gjordes i första delen av detta pilotprojekt genom mikroskopi för att identifiera organismer som misstänks ha potential att åstadkomma sjukdom i det europeiska platta ostronet O. edulis. Studien var i första hand kvalitativ dvs. syftade till att studera förekomst av encelliga organismer (påvisad / ej påvisad) som kan misstänkas bidra till ohälsa. Studietiden var alltså ej inriktad på att kvantifiera/analysera prevalenser då vi idag inte känner till vilka agens som skulle kunna bidra till sjukdom och produktionsbortfall hos det svenska ostronet. Om studien påvisar potentiellt patogena (sjukdomsframkallande) encelliga djur så skall dessa identifieras så långt det är möjligt inom den tidsram som examensarbetet medger. Dessa analyser gjordes i första delen med mikroskopi och cellodlingsteknik. Detta kompletteras med mikropipettering (se metoder: urval och isolering nedan) och isolering från befintliga vävnadskulturer för att få fram klonala cellkulturer till det uppföljande molekylärgenetiska arbetet. Genom att isolera kulturer från en – max. tiotalet celler ökar möjligheterna för bra och djuplodande fylogenetiska analyser samtidigt som dessa isolat kan öppna för nya framtida studier av den eller de smittämnen som påvisas. Om pilotstudien förmår att identifiera deras systematiska placering ökar också vår förståelse om dessa djur/organismer som skulle kunna utgöra ett hot och medverka till de produktionsstörningar som förekommer vid ostronuppfödning. Studierna utförs

med de befintliga tidsbegränsningar som ett 15 poängs exemensarbete medger och har därför lagts upp som en pilotstudie. Som stöd för urvalet av celler vid mikropipettering och fördjupade studier används de egna kunskaperna inom området, inhämtade från genomgångna kurser och medverkan vid nationella och internationella möten inom ämnesområdet. Detta kompletteras av tillgängliga övergripande referenslitteratur inom området för ostronparasitologi och ostronhälsa (Bower 2011).

Några frågeställningar och hypoteser. 1) Förekommer encelliga organismer i svenska ostron som också är kända för att vara parasitära och sjukdomsframkallande i andra tvåskaliga djur och i så fall vilka? 2) Finns mixotrofa/planktoniska (potentiellt parasitära) encelliga organismer, som också kan vara frilevande i havsmiljön, i ostron?

3) Kan mollusker/filtrerande tvåskaliga djur fungera som en reservoar för växtplankton när dessa inte förekommer som fritt svävande celler?

Utifrån dessa frågor skulle vi kunna ställa upp nedanstående hypoteser. A) Tvåskaliga djur är en reservoar för växtplankton och en potentiell näringskälla för spridning och förökning av dessa.

B) Parasitära encelliga organismer förekommer vilande latenta i friska vuxna och juvenila ostron.

För att testa dessa påståenden genomfördes försök att odla fram encelliga organismer från ostron och synliggöra dem för mikroskopisk detektion.

.

Material och metod Genomförandeplan Provuttag från ostron har genomförts med aseptisk metodik för att minimera kontaminering mellan de vävnaderna som skulle studeras. Odling av ostronvävnad med eventuella mikroparasiter har genomförts vid kontrollerad temperatur (termokonstantrum) och i slutna odlingsplattor efter provuttag (se nedan).

Primärkulturer syftade till att upptäcka latenta former av parasitära celler. Studierna har genomförts vid Loven centrum, Tjärnö marinbiologiska station över en 4 veckors period 15 november – 8 december. Avsikten var att kunna upptäcka celltyper med avvikande utseende och som skulle kunna vara av parasitärt ursprung. Från dessa har nya kulturer valts ut för att isolera potentiellt parasiterande protister. Genom odling har cellantalet uppförökas så att molekylärbiologiska undersökningar också kunnat genomföras. Denna gjordes med q-PCR efter att DNA extraherats. Detta arbete pågick ännu vid detta examensarbetes avslut. Genomförande och delresultat redovisas men sekvenser q-PCR reaktionen fanns ej klart har därför ej kunnat redovisas vid denna rapports avslut.

Material och odlingsmedier För att isolera och hålla celler vid liv krävs medier som uppfyller deras näringskrav. Vid odling av växtceller och djurceller så skiljer sig dessa nutritionellt. Valet av odlingsmedie är därför avgörande för ett lyckat resultat. Vid denna studie har jag valt att testa flera odlingsmedier för celler med olika näringsbehov. minska risken för att prokaryota celler (bakterier)skall ta över, Detaljerad lista över samtliga medier, kemikalier, förbrukningsmaterial och utrustning finns i bilaga 1.

Provinsamling Den ursprungliga planen var att genomföra undersökning på Sydkoster, Ekenäs i samarbete med Ostrea Koster AB. Eftersom odlingsverksamheten inte hade startat när denna undersökning skulle genomföras fick dessa planer ställas in. All provtagningsverksamhet placerades därför på Göteborgs Universitet, Loven Center, Tjärnö. Denna marinbiologiska station, ligger söder om Strömstad. i nära anslutning till samma vattenområde som ostronodlingen, ovan. Detta bidrog dock till att undersökningen kunde påbörjas genom att inhämta ett mindre antal levande vuxna platta ostron och juvenila ostron från Sydkoster, Ekenäs till den aktuella undersökningen. Vuxna ostron, n=7 togs upp den 14 november, och juvenila ostron, n=20 hämtades upp den 23 november. Dessa djur hölls kylförvarade på is i kylrum fram till respektive provtagning påbörjades. Därutöver genomfördes en egen provinsamling av 5 blåmusslor och 5 stillahavsostron från kanalen mellan Tjärnö och Saltö, söder om bron mellan öarna. Denna insamling genomfördes personligen med vadarstövlar och genom handplockning samt håvning den 26 november 2016.

Aseptisk provuttag från kylförvarade ostron Samtliga djur som ingick i undersökningen vägdes och mättes för att fastställa längd och vikt. Längdmätning genomfördes med skjutmått från skallås till skalkant och vikt mättes på en OHEIM våg med mätnoggranhet 0,1gram. Provuttag genomfördes med klopincett och engångsskalpell efter öppning med ostronkniv. Både ostronkniv och pincetter rengjordes mellan varje provtaget ostron och varje provtaget organ genom individuell avtorkning med engångsservett och nedsänkning av instrument i 15% klorinlösning.

Vuxna ostron 1-7: 15 november Prov till cellodling Vid provuttag togs små vävnadsprover ca 0,2–0,5 gram/brunn, djur och organ, från flertalet av de organ som finns i ett tvåskaligt djur. Dessa organprov fördelade på två 24-hålsplattor och inkuberades med olika cellodlingsmedier. Från det platta ostronet togs prov från hjärta, hjärtsäck, mantel, muskel, gälar, tarm, magsäck och digestionskörtel. Prov från mage togs med engångsplatinös (en plastögla med provvolym 1 µl) som insamlar sekret från magsäck efter tvärsnittning av digestionskörtel med engångsskalpell. Dessa prover inkuberades i sterila 24-håls cellodlingsplattor med plats för två ostron/platta. Vävnadsproverna fördelades på två plattor med olika cellodlingsmedierna: f/2 Sötvatten och f/2 Havsvatten (se bilaga, 1 medier). Volym 1,25ml odlingsmedia/odlingsbrunn. Därutöver inkuberades också ett vävnadsprov (1gram) från muskel i 6-hålsplatta med Marin Emem (se bilaga 1: medier nedan), 4ml media/cellodlingsbrunn. Övriga prover Vid provuttag togs också organprov för kompletterande diagnostiska undersökningar (cytologi, histologi, molekylärgenetik och elektronmikroskopi). Cytologiska prover togs från muskel, hjärta och digestionskörtel, genom organavtryck på objektglas. Övriga prover togs från samma organprov som inkuberades i cellodlingsmedier ovan. Dessa prover fixerades i 30ml Nuncrör med tättslutande lock i Davidsons Marine fixative (se medier, bilaga 1 nedan) och små organbitar respektive i 2ml centrifugför i 96% etanol samt i glutaraldehyd.

Juvenila ostron, 11-15 (årgång 2016) samt 16-20 (årgång 2015): 26 november Prov till cellodling Dessa djur var mycket små och majoriteten av organproverna förbrukades till cellodlingen. Prov om ca 0,2-0,5 gram/brunn, från hjärta, mantel, gälar, tarm, magsäck och digestionskörtel fördelades i 24-brunnar med Marin EMEM. Prover från 2 ostron fick plats i varje 24-brunnars

platta: total 5 plattor för 10 ostron. Därutöver inkuberades ca 0,2 gram muskel fördelade på två 6-brunnsplattor med Marin Emem.

Övriga prover Prov togs därutöver tillcytologi (imprint): från muskulatur, hjärta, dig kört samt PCR(medbomullssvabb): från digetions körtel, muskulatur och hjärthålsvätska. Tvärsnitt av ostronen fixerades i Davidsons marine fixative.

Juvenila ostron 21-30 (årgång 2016 och 2015): 27 november För att komplettera provtagningen av juvenila ostron ovan och få en bättre helkroppsbild av djurets alla organ inklusiva matsmältningsystemet (labiala palper till ändtarm/kloak) så fixerades de övriga juvenila ostronen platt liggande i hela sin längd. Vid eventuell kompletterande histologisk undersökning möjliggör denna fixering studier av parasitär lokalisation i hela djuret och distribution i alla organ. Hela djuret fixerades liggande i histologiska kassetter i Davidsons marine fixative. Mindre organprover fixerades i glutaraldehyd och 96% etanol.

Blåmusslor 31-35 och Stillahavsostron 36-40: 28 november Från stillahavsostron (synonym Japanska jätteostron) togs prov för cellodling till marin EMEM från hjärta, mantel, gälar, tarm, magsäck och digestionskörtel (24hålsplatta) och muskel (6hålsplatta). Från blåmussla togs prov till odling i marin EMEM från fot, mantel, gäle, mage, tarm och digestionskörtel (24hålsplatta) och muskel (6 hålsplatta). Prov togs även ut för eventuellt kompletterande undersökning (cytologi, histologi, molekylärgenetik och TEM), se ovan.

Cellodling i termokonstantrum Samtliga organprover för cellodling inkuberades i termokonstantrum som höll en jämn temperatur på 10 oC +/- ca.1 oC och med belysning i form av 6 vertikala lysrörsarmaturer med dubbla lysrör (1,5 m längd) och med en förinställd ljusperiod från klockan 6:30 -21:30, se figur 1 nedan. Mikroskopiska cellkontroller genomfördes första gången i ett inverterat mikroskop efter 1 veckas inkubering i termokonstantrummet och därefter vid upprepade tillfällen fram till undersökningen

avslutades den 8 december på Tjärnö.

Figur 1. Termokonstantrum 115 på Tjärnö marinbiologiska station. Vägghängda ljuspaneler (bild 1a) och bänk för uppställning av algodlingar (bild 1b). Närbild 1c på arbetsbänk med cellodlingskulturer från ostronprover inkuberade vid 10 oC.

Urval och isolering av klonala kulturer För att kunna isolera och klonalt odla enskilda celler valdas dessa ut genom mikropipettering med hjälp av 5-8 cm glascylindrar utdragna till en smal spets. Dessa tillverkades för hand på Loven centret, Tjärnö genom upphettning se figur 2 nedan. Genom att värma de smala 100 µl micropipett-rören i glas över låga från spritbrännare och försiktig snurra cylindern så kunde glasröret dras isär. Då bildades en mycket tunn förbindelse mellan de isärdragna cylindrarna. Dessa kunde sen skiljas i två delar och bildade då två mikropipetter med en smal spets. För det klonala arbetet tillverkades ca 100-talet mikropipetter som förbrukades och kastades allteftersom vid varje cellprovtagning. För att få cellproverna rena bereddes utvalda cellprover genom mikro-pipettering stegvis i flera vätskedroppar på objektglas (foto 2 och 3). När cellerna låg enskilt isolerade flyttades de till ny cellplatta med medium för fortsatt odling. Detta skedde primärt i 96

hålsplatta senare 24 hålsplattor samt i 10ml cellodlingsflaskor.

Figur 2. Tillverkning av micripipetter i glas (1a), samt beredning av klonala algkulturer på objektglas med odlingsmedie (1b). Genom mikropipettering kan kulturer startas från enskilda celler. Celler isoleras på objektglas i flerstegstvättning (1c) genom att förflytta dem genom flera droppar på objektglaset.

Fotodokumentation och mikroskopiska studier Mikroskopisk cellkontroll och undersökning skedde ö i ett inverterat mikroskop Olympus IX71 med okular 4-40x och infällbar lins för ökad förstoring med 1,6x. Fotografering av celler skedde kontinuerligt när nya celltyper påvisades och prover valdes ut för fortsatta studier. Dokumentation skedde genom mikroskopfotografering och notering om bildnummer,

förstoringsgrad, motiv (cellutseende, djurart, och individnr) på mikrofotoblankett kontinuerligt under detta arbete. Fotografier togs med systemkamera monterad med mikroskopadapter dels via mikroskopets ögonokular, alternativt genom mikroskopets egen C-adapter för ordinarie fotografering. För att kunna koppla bilderna till cellstorlek så togs också referensbilder på objektglas med referensskala av märket WILD avsedd som referens för storleksjämförelse.

Under arbetet med att studera celler uppstod också behov av att undersöka och dokumentera celler av växtplankton typ och om de var levande och innehöll aktiva kloroplaster. Därför undersöktes också cellprover från kulturer på objektglas med täckglas i fluorescens mikroskop Olympus BX51. Aktiva och levande kloroplaster innehåller olika pigment som emitterar ljus med annan våglängd än de själva absorberar. Genom bestrålning av celler med blått ljus i fluorescens mikroskop kan man avgöra dels om cellen innehåller levande kloroplaster men också få indikation om vilken typ av pigment som cellen innehåller: klorofyll a,fykocyanin och fykoerytrin. Dessa undersökningar genomfördes i mörkrum i ett Olympus BX51 mikroskop med 4,10 och 20x okular.

Figur 3. Eget arbete på Tjärnö vid Inverterad mikroskop, (foto 3a och 3b) samt dokumentation med referenskala vid fluoroscensmikroskop bild 3c-3e.

DNA extraktion och Molekylärgenetisk undersökning PCR DNA extraktion Isolat undersöktes först i mikroskop för att kontrollera så inga kontaminerande celler fanns i provet. Utvalda isolat som bedömdes rena (enskilda brunnar i 24 hålsplatta) tömdes på celler och överfördes till 1,5ml eppendorfrör med snäpplock för cellkoncentrering och borttagning av cellodlingsmedie. Detta skedde genom centrifugering vid 10’000 g i 10 minuter. När all vätska tagits bort genom försiktig pipettering frystes pelleten in i -20 oC och förvarades fryst i 1 dygn fram till extraktion av DNA påföljande dag. DNA extraktionen följde extraktionsprotokoll för Skeletonema marinoi enligt anvisning i Godhe et al. 2001 och 2006. Cellerna lyserades i CTAB extraktionsbuffert i 65°C under 1 timme med avbrott var 15:e minut för omskakning genom vortexning. DNA extraherades med 500 µl kloroform/isoamyl alkohol. Lysatet blandades först med vortex och skiktades därefter genom centrifugering i 15 000 g i 10 minuter vid 4 oC.

Supernatanten sparades och överfördes till nytt ependorfrör. Detta upprepades två gånger, genom tillsättning av kloroform/isoamylalkohol, blandning och centrifugering. DNA fälldes därefter ut från supernatanten genom tillsättning av frysförvarad iso-propanol. Utfällning av extraherat DNA gjordes över natt i frys. Nästa dag tvättades DNAt genom att centrifugera ner DNA-fraktionen till en pellet. Denna tvättades 3 gånger i frysförvarad 75% etanol. Efter sista tvättningen torkades pelleten 1 timme i inkubator vid 30 oC. DNA löstes därefter upp i destillerat vatten (Milli-Q) och förvarades på is fram till q-PCR nästkommande dag.

Molekylärgenetisk undersökning genom kvantitativ PCR analys DNA kvantitet och kvalitet kontrollerades med hjälp av en NanoDrop Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, USA) vid absorbanserna 260 och 280 nm.

Amplifiering av DNA sekvenser gjordes genom qPCR med hjälp av ett fluorescerande färgämne i SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green supermix och apperatur CFX Connect™ real-time cycler (Bio-Rad Laboratories, Sundbyberg, Sweden). Primrar köptes från Eurofins MWG Synthesis GmbH, Ebersberg, Tyskland (tabell 1).

Alla prover analyserades i duplikat med 5 µl SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green supermix, 0.5 µl av varje primer (slutlig koncentration 500 nM) och 4 µl DNA i en total volym på 10 µl. qPCR-reaktionen involverade 40 cykler med en dissociationstemperatur på 95 °C i 10 s och annealing och elongering i samma steg vid 50 °C i 30 s. Tabell 1. Primersekvenser för qPCR amplifiering av delar av rDNA sekvens (ITS och LSU) isolat från ostron

Gen Primer Sekvens (5’ – 3’)

ITS ITS-1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG

ITS-3 GCATCGATGAAGAACGCAGC

DIR-R TATGCTTAAATTCAGCGGGT

LSU DIR ACCCGCTGAATTTAAGCATA

D2C

D2C-F

D3CA

CCTTGGTCCGTGTTTCAAGA

TCTTGAAACACGGACCAAGG

ACGAACGATTTGCACGTCAG

Gelelektrofores

qPCR-produkterna analyserades också med hjälp av gelelektrofores (1,2 % agaros), 90 V ca 60 minuter, där endast ett enda band av rätt storlek sågs i varje reaktion. Gelelektrofores-utrustningen kom från Bio-Rad Laboratories, Sundbyberg, Sverige.

Resultat Biologiska data Längd och viktuppgifter: djur som ingick i undersökning (ostron och musslor) Tabell 2. Biologiska data för de ostron och musslor som ingick undersökningen.

Art Lokal Provtagn. dag

längd vikt Antal (n): id

Ostron (O. edulis) vuxen

Sydkoster (Ekenäs)

20161115 8,2-10,6cm (medel:9,5cm)

90-182 gram (medel:135gram)

7 : 1-7

Ostron (O. edulis) 6 mån (årg 2016)

Sydkoster (Ekenäs)

20161126 3,2-4,2 cm (medel:3,8cm)

2,7-4,6 gram (medel:3,7gram)

5 : 11-15

Ostron (O. edulis) 1 år (årg 2015)

Sydkoster (Ekenäs)

20161126 4,0-5,1 cm (medel:4,6cm)

6,1-10,3 gram (medel:8,3gram)

5 : 16-20

för fixering/histolog Ostron (O. edulis) 6 mån (årg 2016)

1 år (årg 2015)

Sydkoster (Ekenäs)

20161127

-“-

2,8-3,3 cm (3,1)

3,7-5,3 cm (4,7)

1,2-3,2 g (2,4)

6,4-12,7g (9,5)

5: 21-25

5: 26-30

Blåmussla (Mytilus edulis)

Tjärnö (söder om Saltöbron)

20161128 3,5-7,2 cm (medel:6,6cm)

4,3-34,0 gram (medel:23,8gram)

5 : 31-35

Stillahavsostron (Crassostrea. gigas)

Tjärnö (som ovan)

20161128 5,2-10,0 cm (medel:8,4cm)

19,7-101,3gram (medel:48,1g)

5 : 36-40

Mikroskopiska fynd och påvisade celltyper Kroppsegna rörliga celler Undersökta djur, både vuxna och juvenila ostron, hade när cellprover tagits ut en stor andel både sammansatta grupper av celler men också enskilt liggande celler som var flagellerade och/eller cilierade. Dessa celltyper rörde sig i oregelbundna cirklar, vickade fram och tillbaka eller snurrade och rörde sig i cirklar. Dessa celler höll sig också vid liv under flera veckor. I prov från mantel, gälar, digestionskörtel påvisades måttlig till riklig förekomst av dessa polymorfa cilierade och/eller flagellerade celler. Många av dessa uppvisade ingen tydlig celldelning genom att en cell splittrades i två nya eller genom avknoppning och avsnörning bildade nya kopior utan istället växte de till oregelbundet åt olika håll som en flercellig organism i långsam tillväxt. Dessa celler bedömdes därmed som kroppsegna. Några upprepade försök att klonalt selektera celler av denna typ resulterade inte i ökad tillväxt eller snabb celldelning vilket också talar för att dessa celler var kroppsegna värddjursceller.

Apicomplexa-liknande celler, rörliga bananformade celler av zoit-typ OSTRON: I muskelprov som inkuberats i 6 hålsplatta marin-EMEM från ostron 1 och 2 påvisade sparsam till riklig förekomst av rörliga zoitliknande celler. Dessa celler påvisade efter en veckas inkubering i termokonstantrum (se figur 4, bild 4a-d). Cellerna låg tillsammans med en mängd andra celler både kroppsegna muskelceller och blodceller (haemocyter) samt granulerad sfäriska celler av mer svårbestämd typ. Multipla prov togs för klonal odling till 96 hålsplatta samt ytterligare celler (ett 10-tal/ny kultur) valdes ut som backup prov till två ytterligare plattor med 24 hålsbrunnar. Ingen av de prover som inkuberades 96 hålsplatta lyckades för att etablera klonala kulturer.

Figur 4. Foto 4a primärkultur från ostron 2, muskulatur avläst den 24 november. I brunn med muskelprov ses både kroppsegna och zoit-liknande celler. Cellerna var rörliga och plastiska, dvs. kunde ändra sin form från rak till ihopdragen, blå pil (foto 4b-c) och röd triangel: bananform (4d). Foto 4a visar klonalt isolerade celler i faskontrast på botten på 24 hålsplattan. Här kan det karakteristiska böjda zoit-lika formen iakttas. Cellerna rörde sig glidande längs med cellbrunnens botten. Motsvarande celler i högre förstoring ses vid vanlig ljusmikroskopi, 4e. Skalstreck 10µm

I flertalet av de båda 24 brunn plattorna etablerades cellkulturer med hög tillväxt och god celltäthet (se figur 4 bild 4 a-b ovan). Observationer som gjordes under cellodlingen visade på celldelning i form av endodyogeny. En typ av celldelning som endast är beskrivet för gruppen Apicomplexa. Cellmorfologi och celldelning indikerar att dessa isolat tillhör denna parasitgruppen. Endodyogenal celldelning innebär att i modercellen bildas nya embryon som snabbt tillväxer och konsumerar modercellen inifrån innan de både cellerna separerar och bryter sig ur moder cellen för att gå åt var sitt håll (Melhorn 2001).

Blåmussla: i muskelprov inkuberad 28 november (marin EMEM), från blåmussla 31 påvisades den 6 december liknande rörliga något större och längre zoitliknande celler. Försök till att lösgöra dessa celler för klonal isolering misslyckades och andra jästcellsliknande/mykotiska organismer tog över i dessa renodlingsförsök. Inga klonala zoit-isolat har därmed kunnat etableras från primärkultur från blåmussla.

Centriska kiselalger (diatomeer, växtplankton av släktet Thalassiosira spp.) I muskelprov från ett juvenilt ostron id:12 (årgång 2016), inkuberad Marin-EMEM påvisades efter 1 vecka enstaka Thalassiosira sp. kiselalger, 2 och senare 3 celler kedjekopplade. Detta tolkades först som ett bifynd. Men efter ytterligare 7 dagar påvisade betydligt fler av dessa celler i samma muskelprov och genom att tidsmässigt följa en specifik rund sfärisk cell kunde cellutvecklingen dokumenteras fotografiskt och följas tidsmässigt. Cellutveckling gick från en vilande sfärisk liggande på botten av brunnen till svävande korta kedjor om 3 celler på 60 minuter se figur 5 nedan.

Figur 5. Bildserie från primärkultur ostron 12, muskel inkuberad i marin EMEM. Grå rutor indikerar klockslag när respektiv bild togs den 6 december. Första bilden föreställer sfärisk granulerad cell liggande på botten av cellbrunnen. Fortsatta bildserie visar cellutveckling till fritt svävande och karakteristisk kiselalg av släktet Thalassiosira sp. Skalstreck 10µm.

Figur 6. Full utvecklade Thalassiosira celler i typisk kedjeform. Notera också de långa utskotten som utgår radiellt åt flera håll.

I en annan primärkultur från ostron 3 tarm (odlingsmedium f/2 havsvatten) kunde planktoniska centriska diatomeer med olika cellstorlek påvisas efter 14 dagars ljusinkubering. Dessa stadier var inte fullt utvecklade utan sågs främst som dubbla membraninneslutna kiselalgsceller. Det går inte att säga om det dessa tillhörde Thalassiosira släktet eller om det var andra kiselalgsarter. Eftersom dessa låg tillsammans med dött material, nedbrutna cellrester och tomma cellskal från döda växtplankton behövdes någon sorts verifiering för att visa att cellerna var levande med aktiv fotosyntetisk förmåga. Därför togs prover ut från denna cellkultur för jämförande studier i ett flouroscensmikroskop (Olympus BX 51). För att påvisa aktiva kloroplaster och även skilja

mellan olika typer av fotosyntes har metodik utvecklats för med ljusstråle med högt energiinnehåll (blåljus) bestråla algceller och på så vis även skilja mellan klorofyll, fykocyanin och fykoerythrin Om celler med klorofyll bestrålas med blåljus exciteras elektroner till ett högre energilager och när dessa återgår till sitt normala elektronskal emitteras ljus med lägre energiinnehåll i detta fall röd fluoroscens från klorofyllet. Denna fluoroscens används idag för att mäta alginnehåll i vatten (Sanders 20170114). Nedan visas resultat för några undersökta algceller i ostron 3, dels vid vanlig ljusmikroskopi och under bestrålning med blått ljus (figur 6).

Figur 7. Foto tagna med Olympus BX51 på Tjärnö. Mikroskopiska bilder illustrerar algceller undersökta med okulär 20x vid vanliga ljusmikroskopi (foto 7a,c,f,g) och vid fluoroscens med blåljus (foto7b,d,e,h,i). Röd fluoroscens indikerar aktiva kloroplaster med klorofyllpigment.

Kiselflagellater, Dictyochales, växtplankton (Dictyocha specelum och D. fibula) I flera av de undersökta tarmproverna och magsäcksproverna både f/2 havsvatten och f/2 sötvatten (ostron 3,4 och 6) påvisades karakteristiska skelettbärande kiselflagellater båda Dictyocha fibula och D. speculum (fig. 8). Flera försök att isolera dessa celler gav inte förväntat resultat dvs. inga klonala prover med god förökning och aktiv celldelning av planktonceller med samma utseende. Istället noterades i flera av dessa prover förekomst av sammanhängande molnbildningar med bakteriestora granula/koccoida celler. Detta kan vara en amöboid mellanform som finns beskriven för denna Dictyocha speculum. Eftersom klonala prover endast kunde inkuberats på Tjärnö i 2-3 veckor efter start från primärkulturer så går det inte att utesluta att dessa fingranulerade cellkomplex senare skulle ha utvecklats till nya kiselflagellatceller..

Figur 8. Foto 8a, b: multipla Dictyocha speculum celler på rad i tarmprov från ostron 3. Foto 8d föreställer D. fibula och 8c samma cell sedd vid fluoroscens mikroskopi. 8e skelett av D. speculum i prov från ostron 6 mage.

Olikstora multicellulära sfärer, okänd organismtyp I flera prov från juvenila ostron (årgång 2015, 2016) påvisades olikstora sfäriska multicellulära stadier i prov från muskel inkuberad i marin EMEM. I figur 9 nedan ses foto från ostron 13 (foto 21), ostron 18 (foto 22), ostron 19muskel (foto 23 och 24). Notera särskilt foto 21 där man ser celler av mikrocelltyp som sprids från en sådan mindre sfär. I prov från ostron 29 mantel inkuberad i marin EMEM påvisades ovala/rektangulära celler med karakteristiskt utseende (foto 25). Försök att klonalt selektera och vidareodla dessa celler har dock inte resulterat i prover med snabbt delande celler av samma utseende. Det kan antingen tyda på att dessa celler är polymorfa och ständigt föränderliga och därmed ger intryck av att vara flera organismer utan att detta nödvändigtvis är fallet eller att de av någon anledning inte trivs i nytt media utan primärceller/muskelvävnad och därmed inte fortsätter att dela sig normalt.

Figur 9. Olika former av sfäriska multicellulära/multigranulära celler påvisade vid inkubering av muskelprov i marin EMEM. Foto 9a- ostron 13, foto 9b-ostron 18, foto 9c och 9d ostron 19. Foto 9e är primärkultur från mantel ostron 29.

Ovala elongerade-rektangulära celler, okänd organismtyp I mantelprov från juvenilt ostron 29 se ovan, påvisades fokalt rikliga med karakteristiska rektangulära celler av kiselalgsliknande utseende. Vid försökt till renodling av dessa celler iaktogs istället bönskideformade Fusarium liknande celler (luftburen mögelsvamp). Se figur 10

Figur 10. Försök till isolering av ovala celler. Misstänkt isolat av mögelsvampar, Fusarium liknande celler, dock utan tydlig septering.

DNA extraktion och molekylärgentisk undersökning genom q-PCR Prover från 5 olika zoit-isolat samt prov från brunnar med klonala cellprover från kiselalger (Thalassiosira sp.) och kiselflagellat (Dictyocha spp.) extraherades enligt protokoll för Kiselplankton se DNA extraktion ovan. Uppmätta DNA nivåer var låga i proverna och låg mellan 0,7-10 nanogram/µl. Totalt 20 prover undersöktes genom q-PCR, se figur 11 nedan.

Figur 11. Foto till vänster illustrerar kylcentrifug vid DNA extraktion på Botan. Högra fotot illustrera överst q-PCR reaktionen vid analys av de 20 proverna och nedre bilden visar resultat från analys PCR produkt genom gelanalys av utvalda prover. Framkallning av PCR synliggörs genom belysning med UV-ljus.

Sekvensiering pågår, resultat återstår att analysera Produkter från gelkörningen se figur 11 ovan extraherades efter utskärning av produkt med gelextraktionskit (Qiagen Gel extraktion Kit). Resultat från sekvensiering av dessa produkter har ej hunnit bli klara innan denna slutdatum för när denna rapport skulle vara inlämnad.

Diskussion Påvisade celler av zoit-typ indikerar infektion med Apicomplexa, en grupp med enbart parasitära organismer Hypotes 1) Parasitära encelliga organismer förekommer vilande och latent i vuxna och juvenila ostron.

Målet med denna studie var att undersöka förekomst och identifiera potentiellt skadliga encelliga organismer i vuxna eller juvenila ostron. Genom att etablera primära ostroncellkulturer från olika organprover möjliggjordes studier av levande ostronceller och deras interaktion med andra kroppsfrämmande och eventuellt parasitära organismer. Vid dessa undersökningarna har en parasitär infektion som misstänks tillhöra gruppen Apicomplexa (koccidier) påvisats både i ostron men också blåmussla. Genom odling av enskilda celler har denna organism kunnat isoleras

från platta ostron och studeras ytterligare genom cellodlingsteknik. Kompletterande undersökningar pågår för att fylogentiskt placera detta isolat med molekylärgenetisk metodik. Om dessa fynd kan verifieras och kopplas till Apicomplexa gruppen är det i så fall det första och enda kända fyndet av denna typ av parasit infektion i muskulatur hos platta ostron (Ostrea edulis). Infektion med parasitär koccidios hos tvåskaliga djur är dåligt studerat och endast ett fåtal exempel finns idag väl beskrivna.

En av få kända fall med zoit-infektion i muskelvävnad hos tvåskaliga djur härrör från Island. Under början mitten av 2000-talet kraschade av okänd anledning beståndet av isländsk kammussla (Chlamys islandica). Detta blev starten på en 10 årigt projekt för att klarlägga orsakssambanden och hitta en förklaring till denna populationsnedgång som också ledde till fiskeförbud och försök till restaurering av beståndet. Trots fiskeförbud sågs endast en mycket svag återhämtning i slutet av 2000-talet och början av 2010-talet av denna kammusselpopulation. Redan tidigt fanns indikationer att detta rörde sig om en infektion tillhörande gruppen Apicomplexa eftersom ansamlingar av zoiter kunde påvisas direktmikroskopiskt och histologiskt (Kristmundsson et al. 2011a). Men stora problem att fylogenetiskt och molekylärgenetisk beskriva dessa fynd uppstod dock under projektets gång och inte förrän 2015 publicerades data som indikerar att närmaste kända art placeras i släktet Aggregata spp. med infektion främst påvisade hos olika bläckfiskarter.

Morfologi och cellutseende vid jämförelse mellan det egna ostronisolatet och bilder från zoiter i isländska kammusslor indikerar dock att detta inte är samma organism. Initiala studier visar stora skillnader på zoiterna från kammussla och ostron. Kammussel-zoiter är jämnbreda, njurformade och med en större cellkärna som dominerar halva cellen (Kristmundsson et al. 2011a). Preliminära studier av ostronisolatet visar en betydligt smalare cellform med multipla granula spridd i hela cellen och utan tydlig och stor cellkärna. Fortsatta morfologiska, cytologiska, histologiska, ultrastrukturella och molekylärgenetiska undersökningar får visa om det finns en koppling till det isländska fyndet, om detta tillhör en annan del av Apicomplexa trädet eller om det inte alls tillhör denna organismgrupp.

Hypotes 2) Kan mollusker/filtrerande tvåskaliga djur fungera som en reservoar för växtplankton och temporärt fungera som både näringskälla medverka till spridning och cellulär förökning av dessa Utifrån denna undersökning kan vi inte förkasta detta påstående. Denna mikroskopiska undersökning har påvisats förekomst och cellutveckling av växtplankton tillhörande kiselalgs- (centriska diatomeer, Thalassiosira spp.) och indikerat cellutveckling av kiselflagellats-gruppen (Dictyocha spp.). Att algcellerna är levande med aktiva kloroplaster har verifierats genom fluoroscensmikroskopi främst för centriska kiselalger. Kloroplaster från utvalda prover har vid dessa tester emitterat rött ljus och därmed verifiera att de innehåller aktiva kloroplaster. Detta indikerar att växtplankton kan reaktiveras efter passage genom ostronets matsmältningssystem. Detta är en ekologiskt intressent iakttagelse och visar på alternativa spridningsvägar för växtplankton och väcker frågor om hur deras livscykel kan växla över året. Kompletterande studier för att verifiera dessa iakttagelser bör därför vara av intresse för andra framtida ekologiska undersökningar.

Diagnostik genom mikroskopi av parasiter Ljusmikroskopisk parasitologiska undersökningar grundar sig ofta på vävnadsprov eller hudskrap från fiskars yttre organ. Genom att mikroskopiskt skilja parasitära organismer från fiskens egna celler i hud, fenor eller gälar kan man snabbt påvisa eller utesluta förekomst av yttre parasitära djur. Diagnostiken grundar sig på igenkänning av celler i rörelse eftersom fiskens egna celler i

normalfallet är orörliga. Därigenom igenkännes flertalet typer av encelliga parasitära organismer såsom flagellater, ciliater, amöbor och vissa utvecklingsstadier inom gruppen Apicomplexa (rörliga zoiter). Coccider och andra grupper inom Apicomplexa har dock främst intracellulära utvecklingsstadier som oftast är svåra att identifiera (egen erfarenhet från mer än 20 års ektoparasitkontroll vid undersökning av fisk insända för hälsokontroll på SVA).

Att undersökta tvåskaliga filtrerande organismer för encelliga yttre parasitära är mer komplicerat eftersom djuret helt skyddas av sina båda yttre skalhalvor. Vid de flesta ostron parasitologiska undersökningar bygger istället diagnostik på mikroskopi av döda fixerade djur där organprover fixerats direkt från de avlivade djuren. Mikroskopi utförs på histologiskt infärgade tvärsnittade organ som blottläggs och undersöks parasitologiskt utifrån redan kända parasitära celltyper och hur dessa skiljer sig från kroppsegna celler.

n försvårande faktor vid direktmikroskopi av färska organprover från tvåskaliga djur är att många kroppsegna celler är flimmerhårsförsedda och liknar parasitära ciliater eller flagellater om de friprepareras. Inre ytor såsom magsäck tarm och digestionskörtel samt stora utbredda organ såsom mantel och gälar är helt eller delvis är täckta av flimmerhår/cilier som sköter mattransporten. Det inkommande flödet av partikler samt såsom djur och växtplankton, organiska partiklar och bakterier förflyttas aktivt av sammanlänkade cilierade celler. Kroppsegna celler bidrar också till djurets egna blodcellers rörelse och transport. Ostron har ett öppet blodsystem och en mycket svagare hjärtfunktion vilket innebär att många kroppsegna celler själva bidrar och hjälper till med cellulära förflyttning. Blodceller sk. haemocyter har också en dubbel funktion som syrebärare och makrofager (städarceller). Så stora delar av ostronet och musslans ytor består av sorteringsverk för att skilja ut nyttig mat från osmältbara eller giftiga födoämnen eller partiklar. Matpartiklar går till labiala palperna för att där malas sönder i magsäcken och övriga för kassation och urskiljning som pseudofesces för direkttransport ut ur djuret.

Möjligt väg mot bättre förståelse av encelliga organismer Fråga 1: förekommer parasitära encelliga organismer i svenska ostron? Detta kan man svara på i form av påvisad / inte påvisad men kräver kunskap om cellmorfologi och möjlighet att påvisa och isolera cellerna, alternativt ha metoder för att styrka identiteten på den celltyp som observerats i djuret. Normalt sker detta genom cytologiska, histologiska eller molekylärgenetiska metoder och i flera fall som en kombination av dessa metoder. När det gäller bakteriella smittämnen så har man för oss människor och men också våra däggdjur ofta kunnat isolera patogener (sjukdomsframkallande bakterier) genom odling på agarplattor. Relativt enkelt har dessa bakteriella celler kunna isolerats och växt till klonalt. Vidareodling genom att plocka en bakteriekoloni som har sitt ursprung i en bakteriecell för fortsatta studier och odling på agarplatator har varit mycket värdefullt för vår förståelse om dessa smittämnen. Senare när kunskapen fördjupats genom biokemiska tester och kunskaper om bakteriers egenskaper samt genom infektionsförsök och påvisande av ”Koch’s Postulat” har dessa kunskaper fördjupats. På så vis har smittvägar blottlagts och bakteriens egenskaper kunnat studeras. Med nya tekniker har denna kunskap byggts på ytterligare och utökas idag också snabbt genom nya verktyg såsom molekylärgenetiska metoder. Diagnostiskt kan man idag mycket snabbt och enkelt få fram en bakteries arttillhörighet genom realtids undersökningar där analyser av proteinmönster (MALDI TOF) och RNA/ DNAmönster q-PCR ger direkta och korrekta svar. Denna teknik kan idag kan också skilja på underarter och möjliggöra mer profilerade studier och direkt smittspårning av bakterier. Detta har ofta inte varit möjligt för encelliga organismer och ännu svårare har det varit när det gäller encelliga organismer i mollusker/tvåskaliga djur då den miljö som det lever i, normalt har

en mycket hög förekomst av kontaminerande mikroorganismer som förekommer i havsvatten och lever i direkt kontakt till många av dessa inre organ. Diagnostiskt lever man därför kvar på gamla morfologiska tekniker med cytologi och histopatologi som Golden Standard. EU’s referens laboratorium använder än idag histologiska ringtester som skickas till medlemsländerna och som fokuserar på dessa gamla men i många fall fortfarande hyfsat tillförlitliga tekniker. Flera av dessa encelliga parasitär organismer år så stora och så speciella att man relativt enkelt kan synliggöra dem genom normal mikroskopisk teknik. Idag kompletteras också dessa analyser med nya molekylärdiagnostisk metodik såsom PCR, immunohistologi och In situ hybridisering. Molekylärgenetiskt har man alltså utvecklat allt starkare metoder och fått fram verktyg för att filtrera fram DNA sekvenser som finns i den akvatiska miljön kring oss. Därför finns en allt bättre kunskap också om våra encelliga organismerna och idag har vi metoder att direkt leta direkt i ett vattenprov för att påvisa förekomst både flercelliga organismer (Miljö DNA) och encelliga organismer vilket exemplifieras av de första fynden av protister tillhörande Perkinsus-gruppen. i nordisk sötvattensområden (Bråte et. al. 2010). För bakteriella smittämnen har detta varit en god grund att stå på då mycket av den tidiga kunskapen bygger på klonala prover och isolat av enskilda bakteriestammar varifrån stora databibliotek har byggts upp. Vi har också en allt större kunskap om oss själva och de flercelliga djur och växter som vi omger oss av. Problemet kvarstår dock för stora delar av gruppen encelliga organismer som har den störst kända genetisk variation som finns. Och trots att stora forskningsinsatser genomförs kontinuerligt, så bygger fortfarande dessa studier sina nya kunskapsdata på ett relativt fåtal antal isolerade arter inom den eukaryota protistgruppen samt på molekylärgenetisk information från den prokaryota organismgruppen. En mycket stor majoritet av de existerande encelliga organismerna är dock fortfarande okända och ännu inte beskrivna arter och som dessutom har mycket större variation avseende morfologi och egenskaper än de djur och växtgrupper som vi närmast kan observera i vår omgivning. Apicomplexa är den enda större taxonomiska grupp som helt består av parasitära organismer. Samtidigt känner vi endast till en bråkdel av dess hela biodiversitet: 0,1% of beskrivna arter (Morrison 2009). Phylogenetisk undersökningar avseende Apicomplexa infektioner i invertebrates har nästan helt ignorerats och även om försök till att stabilt placera dessa ibland Apicomplexa gruppen så kvarstår stor osäkerhet (Kopecna et al. 2006). Mycket kan bero på just det smala urvalet av sekvensierade organismer för just dessa djurgrupper, vilket innebär att man försöker jämföra en sekvens med ett stort tomrum där enstaka bitar av genomisk information kan identifieras. För att lösa det problem krävs bättre molekylärgenetiska data.

Så fördjupade kunskap inom området encelliga organismer behövs och bör byggas ut genom mer grunddata på artnivå. En väg att uppnå sådan ökad kunskap skulle vara att parallellt med ny fylogenetisk miljödata samtidigt ta fram bättre och mer diversifierad basal helgenomdata från nya isolat genom vävnadsanrikning och cellsortering få fram renkulurer med hög cellrenhet som man lyckats med de prokaryota organismerna: bakterierna. Det finns idag några exempel inom området för evertebrata encelliga organismer där kända intracellulära mycket små patogener har kunnat studeras fullt ut från bl.a. stillahavs ostron. Genom att odla och infektera värddjuret och därefter i flera steg filtrera fram mikroceller har man fått fram över en över 95 % renhet av parasiten Microcytos mackini (Joly et al. 2001) och utifrån dessa nästan rena prover med ny molekylärgenetik fått fram hela genomet på denna organism (Burki et al 2013). Detta har visat sig mycket värdfullt för förståelsen av artdiversiteten inom gruppen Rhizaria och inneburet en fördjupad kunskap om denna grupp av smittsamma organismer. Dock krävde detta mer än 10 års forskning och omfattande arbetsinsatser, så fanns andra metoder att enklare få fram rena isolat för flera sådana studier vore det ett stort framsteg.

Tack till Mina båda handledare Anna Godhe och Kristina ”Snuttan” Sundell som gett mig goda råd, stöd och hjälpt mig både i praktiskt frågor och genom synpunkter på text och utförande fört projektet. Jag vill också framföra min djupa uppskattning till Linda Hasselberg som varit en klippa i det praktiska genomförande och molekylärgenetiska arbete med q-PCR och Susanna Gross på Botan som guidade mig genom DNA extraktionen.

Sen vill jag framföra min uppskattning till alla personal och studenter på Tjärnö som på olika sätt bidragit till att jag kunna genomföra mitt arbete på denna fantastiskt belägna fältstationen strax söder om Stömstad. Utan denna station hade detta arbetet inta varit möjligt.

Tack också till Ostrea Koster AB och Kent Berntsson som bidragit med både ostron och sin gedigna erfarenhet om ostronets biologi.

Jag vill också framföra min stora uppskattning till SVA och för att jag fått tillgång och kunnat utnyttja extra material som blivit över från annan cellodlingsverksamhet. Detta har varit en förutsättning för att jag skulle kunna genomföra mitt examensarbete. Ett speciellt tack i detta sammanhang till mina medarbetare på DOA och fisksektionen som gör mitt arbete lättare att bära.

Referenslista Bower, S.M. (20161230). Synopsis of infectious diseases and parasites of commercially exploited shellfish. http://www.dfo-mpo.gc.ca/science/aah-saa/diseases-maladies/toc-eng.html#mol. Fisheries and Oceans, Government of Canada.

Barta J.R., Thompson R.C.A., (2006). What is Cryptosporidium? Reappraising its biology and phylogenetic affiniteis. Trends in Parasitology, vol 22, issue 10, p463-468.

Bråte J., Logares R., Berney C., Ree D.K., Klaveness D., Jakobsen K.S., Shalchian-Tabrizi K., (2010). Freshwater Perkinsea and marine-freshwater colonizations revealed by pyrosequencing and phylogeny of environmental rDNA. The ISME Journal (2010), 1–10.

Burki F., Corradi N., Sierra R., Pawlowski J., Meyer G.R., Abbott C.L., Keeling P.J (2013). Phylogenomics of the intracellular parasite Mikrocytos mackini reveals evidence for a mitosome in Rhizaria. Curr Biol. 23:1541–1547.

Godhe, A., Otta, S. K., Rehnstam-Holm, A.-S., Karunasagar, I. & Karunasagar, I. (2001). Polymerase chain reaction in detection of Gymnodinium mikimotoi and Alexandrium minutum in field samples from southwest India. Mar. Biotechnol. 3:152–62.

Godhe A., Melissa R. McQuoid M. R., (2006). Comparison of three common molecular tools for distinguishing among geographically seperated clones of the diatom Skeletonema marinoi Sarno et Zingone (Bacillariophyceae). J. Phycol. 42, 280–291.

Imai I., Yamaguchi M., (2012). Life cycle, physiology, ecology and red tide occurrences of the fish-killing raphidophyte Chattonella. Harmful algae 14, 46-70.

Joly, J.-P., Bower S.M., and Meyer G.R., (2001). A Simple Technique to Concentrate the Protozoan Mikrocytos mackini, Causative Agent. of Denman Island Disease in Oysters. J. Parasitol., 87(2), 2001, p. 432–434.

Kristmundsson Á., Helgason S., Bambir S. H., Eydal M. Freeman M. A.,(2011a) Previously unknown apicomplexan species infecting Iceland scallop, Chlamys islandica (Müller, 1776), queen scallop, Aequipecten opercularis L., and king scallop, Pecten maximus L. Journal of

Invertebrate Pathology 108, 147–155 Kristmundsson, Á., Helgason, S., Bambir, S.H., Eydal, M. and Mark A. Freeman, M.A.,(2011b). Margolisiella islandica sp. nov. (Apicomplexa: Eimeridae) infecting Iceland scallop Chlamys islandica (Müller, 1776) in Icelandic waters. J. Invertebr. Pathol. 108, 139–146.

Kristmundsson Á., Erlingsdóttir Á., Freeman A., (2015). Is an Apicomplexan Parasite Responsible for the Collapse of the Iceland Scallop (Chlamys islandica) Stock? PLOS ONE, DOI:10.1371/journal.pone.0144685.

Kopecna J., Jirku M., Oborn M., Tokarev Y.S., Lukes J., Modry D., (2006). Phylogenetic Analysis of Coccidian Parasites from Invertebrates: Search for Missing Links. Protist, Vol. 157, 173—183, April 2006. http://www.elsevier.de/protist, Published online date 11 April 2006

Mehlhorn H., (2001). Encyclopedic Reference of Parasitology, Biology, Structure, Function. Second edition, Springer.

Morrison D.A., (2009). Evolution of the Apicomplexa: where are we now? Trends in Parasitology, vol. 25 no. 8, Cell Press.

Pascual E.S., Gestal C., Soto M., Rodriguez H., Arias C., (1996) Aggregata octopiana (Apicomplexa: Aggregatidae) from Octopus vulgaris off N W Spain DAO, vol. 27, 227-231.

Sanders P.A., (20170114). In vivo monitoring of Blue-Green ”Algae” Using Hydrolab Multi-parameter sondes. www.env.gov.ni.ca/env/waterres/rti/rtwq/15.pdf

Sanders P.A., (20170114). An introduction to Algae measurements using in vivo fluoroscens. www.Hydrolab.com/articles/an-introduction-to-algae-measurements-using-in-vivo-fluoscens/

Sierra R., Canas-Duarte S.J., Burki F., Schwelm A., Fogelqvist J., Dixelius C., Gonzalez-Garc L.N., Gile G.H., Slamovits C.H., Klopp C., Restrepo S. Arzul,I., Pawlowski J., (2015) Evolutionary Origins of Rhizarian Parasites. Mol. Biol. Evol. 33(4):980–983.

Bilaga 1 Medier EMEM med antibiotika och serum: 500 ml flaska, EMEM med tricin (SVA cellodling medie: art nr 991470) beredes genom tillsättning av Penicillin-Streptomycin 5ml/500ml medium + L-Glutamin (200mM) 5ml/500ml medium och FBS (Fetalt Bovint Serum) 8-10%. Efter beredning i sterilbänk kylförvaras odlingsmediet fram till använing och bruk/tillverkning av stamlösningarna i på Loven center/Tjärnö enligt nedan. Autoklaverat Havsvatten, 3,5% salthalt: (upptaget och filtrerat från 90m djup, norra västkusten vid Sydkoster) och autoklaverat i 500ml glasflaskor före användning. f/2 medium:1 ml : Trace elements EDTA chelated lösning + 1 ml: NaH2PO4 lösning + 1 ml :NaNO3 lösning + 0.5ml :Vitamin lösning Kiselsilikat- NaSiO3: Lös upp 3 g i NaSiO3100 ml dest.vatten (milliQ) Vitamin: Diamond Vitamin Tween 80 solution 40X, prod nr. 58980C, leverentör Sigma-Aldrich. MilliQ-vatten: Destillerat vatten

Nedanstående brukslösningar beredes för cellkultur i 50ml centrifugrör från WWR från ovanstående stam lösning:

Marin EMEM: Autoklaverat Havsvatten och EMEM med antibiotika och serum blandas till lika delar (ca 25ml) i 50ml provrör. Tillsätt också 100µl kiselsilikat. f/2 Sötvatten-1ml f/2 medium blandas med 48ml dest.vatten (milliQ) och 1 ml Diamond vitamin + 100 µl Kiselsilikat f/2 Bräckvatten- dest. vatten(milliQ) blandas med lika delar havsvatten (ca 23ml/del). Tillsätt 1ml f/2 medium och 1ml vitamin samt 100 µl Kiselsilikat. f/2 Havsvatten – 1ml f/2 medium blandas med 45ml havsvatten och 1ml vitamin och 100 µl Kiselsilikat.

Kemikalier Davidson Marine fixative: stamlösnng: filtrerat havsvatten 1200ml, 95% etanol 1200ml, formaldehyd 36-40% 800ml och glycerin 400ml. Stamlösning 9delar blandas med en del isättika till brukslösning. Denna lämpar sig för fixering av evertebrata marina djur. 2,5% glutaraldehyd 70%, 75% och 95% etanol CTAB extraktionsbuffert för DNA: 1 g CTAB (Hexadecyltrimethylammonium bromide) • 10 ml 1M Tris.HCl pH 8.0, • 5 ml 0.5M EDTA, • 4.09 g NaCl, • tillsätt en nypa (rågad topp på en smal spatel) av PVP (Poly Vinyl Polypyrrolidone). Späd lösningen upp till 50ml genom tillsättning av destillerat vatten (Milli-Q). Värm lösningen till 65 oC i ett vattenbad alternativt lös upp i glasbägare med omrörare på värmeplatta för att lösa upp NaCl och CTAB. Detta kan ta lång tid. Sterilisera lösningen i UV-ljus över natt. Kloroform/isoamyl alkohol: Mercaptoetanol Iso-propanol Nukleinsyra primer från Eurofin genomics: ITS regionen: ITS-1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS-3:GCATCGATGAAGAACGCAGC DIR-R: TATGCTTAAATTCAGCGGGT LSU regionen: DIR: ACCCGCTGAATTTAAGCATA D2C: CCTTGGTCCGTGTTTCAAGA D2C-F:TCTTGAAACACGGACCAAGG D3CA:ACGAACGATTTGCACGTCAG Rengjöring av provtagningsinstrument 15% klorinlösning: brukslösning för dekontaminering av DNA. 85 ml avjoniserat vatten blandas med 15ml koncentrerad Klorin till en 15% klorinlösning. Tillsätt ca 20 droppar koncentrerad ättiksyra för neutralisera den basiska beredningslösningen.

Förbrukningsmaterial Sterilförpackad 96 hålsplatta: Nunc Sterilförpackad 24 hålsplatta: Sarstedt: Tissue culture plate 83.1836 Sterilförpackad 24 hålsplatta: Nunc: Nunclon Surface Sterilförpackade 6 hålsplatta: Nunc: 10 ml Cellodlingsflaskor med filter och luftventil i locket, Nunc 50-1000 µl pipettstpetsar: Sartorius, Safety space filter tip, sterila med filter Underlagspapper, underlagsplast Sterila engångshandskar Objektglas med matt kant: WWR Provrörställ för centrifugrör 50, 10 och 3ml Centrifugrör 50ml: WWR 30ml NUNC-rör Transportkontainer NUNC (provrör med platt botten och tättslutande lock för inneslutning av fixerade prov) 170ml plastburkar med lock

2ml centrifugrör med platt botten, gummipackning i locket, för fixering Histologiska kasetter, med perforering i botten och snäpplock. 2ml ependorfrör med snäpplock. För svabbprov. 100 µl micropipett glasrör, prod nr. 7087 44, Blaubrand intraMARK Silikonslang 3mm i diameter, 50cm längd.

Utrustning Spritbrännare i rostfritt stål Våg, OHEIM, mätnogranhet 0,1 gram Inverterat plattmikroskop, Olympus IX71 Inverterat plattmikroskop, Nikon TMS Fluoroscens mikroskop, Olympus BX51 Referensskala för mikroskop: WILD Heerbrucc, Switzerland Systemkamera med utbytbara objektiv, Canon EOS 500D Kamera-adapter för mikroskop: Martin microsope company, MM-SLR adapter S/N: 0468 Ependorfcentrifug/SVA Pipett 1000 µl (mätområde 100-1000 µl) Ependorf referens Pipett 20 µl (mätområde 1-20 µl) Ependorf referens Kylcentrifug/Botaniska: Ependorf Centrifuge 5424 Kylplatta för 96hålsplatta till q-PCR Q-PCR recycler : CFX Connect™ real-time cycler (Bio-Rad Laboratories, Sundbyberg, Sweden Kylcentrifug för provplatta/Zoologen: Allegra 25R Centrifuge, Beckman Coulter Gelvagga med elkontakter : Bio-Rad Laboratories, Sundbyberg, Sweden