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UNIVERSITE RÉPUBLIQUE DE CÔTE D'lVOIRJE Vnüm-'Discip/Jne- ,'frafKli{
9'.inistère de {' 'enseignement supérieur et de fa reclierclie scientifique
IJFR des Sciences de la oatiur,
.An,née académique 2012-2013
MÉMOIRE DE MAÎTRISE DES SCIENCES DE LA NATURE
Option : Protection ides V1égétaux et de l'Environnement
Theme:
FLUENCE DES P1
SUR LAGE ATIO
TOHORMONES
E'T LA MORPHOGENESE
IN VITRO DES PLANTULES DU HARICOT
KILOMETRE [ Vigna sesquipedalis Froch (Fabaceae)]
~~~: DIAWARA Brabima
~.: Professeur KO ongomaké
SOMMAIRE
REMERCIEMENTS 1
ABREVIATIONS ii LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX .iii
RESUME iv
INTRODUCTION 1
CHAPITRE! : REVUE BIBLIOGRAPIDQUE .4
1.1. Généralité sur I'haricot kilomètre 5
1.1.1. Origine, aire de distribution et position systématique 5
1.1.2. Botanique 5
1.1.2.1. Description de La plante 5
1 . 1.2.2. Croissance et développement de la plane 6
1.1.3. Culture et écologie 6
1.1.4. Récolte et production 7
l .1.5. Valeur nutritionnelle et utilisation 7
1.1.6. Maladies et ravageurs 7
1.2. Quelques aspects de la germination des semences 8
1.2.1. Définition de la germination 8
1.2.2. Conditions physiques de la germination 8
1.2.3. Viabilité des semences 8
1.2.4. Germination in vitro et réponses morphogénétiques de vitroplants 9
CHAPITRE 11 : MATERIEL ET METHODES 11
2.1. Matériel 12 2.1.1. Matériel Végétal 12
2.1.2. Matériel de laboratoire 12
2.2. Méthodes 13
2.2.1. Les conditions de la culture in vitro 13
2.2.2. La préparation des milieux de cultures 14
2.2.3. Stérilisation en surface des graines 15
2.2.4. Mise en culture des graines 15
2.2.5. Evaluation de la germination 16
2.2.6. Evaluation de la croissance 16
2.3. Traitement statistique des données 16
ID RESULTATS 17
3 .1. Description de la germination in vitro chez vigna sesquipedalis 19
3 .2. Effet des régulateurs de croissance sur la germination 19
3.3. Effet des phytohormones sur la croissance des plantules 20
3.4. Réponses morphogénétiques à partir de germinations in vitro chez Vigna
sesquipedalis 21
IV. DISCUSSION 23
CONCLU.SION ET PERSPECTIVE 26
REFERNCES BIBLIOGRAPIDQUES 28
REMERCIEMENTS
Les travaux présentés dans ce mémoire ont été effectués dans le cadre du stage de fin
de cycle pour l'obtention du diplôme de Maîtrise de Protection des Végétaux et de
l' Environnement. Les expérimentations ont été réalisées au Laboratoire de Biologie et Amélioration des
Productions Végétales de l'UFR des Sciences de la Nature de l'Université Nangui Abrogoua,
La rédaction de ce mémoire a été possible grâce à Dieu, aux soutiens et aux conseils
de nombreuses personnes que je tiens à remercier. Au Prof. DIB Yao, Doyen de l'UFR Sciences de la Nature, j'exprime toute ma
gratitude pour sa disponibilité. J'adresse mes sincères remerciements au Dr. Koné Moussa, Responsable de la filière
Protection des Végétaux et de l'Environnement pour sa disponibilité à résoudre nos
problèmes académiques. A ces remerciements, j'associe le Prof. KOUADTO Yatty Justin. Directeur du
Laboratoire de Biologie et Amélioration des Productions Végétales qui a bien voulu m
recevoir dans son Laboratoire. Mon encadreur, Prof. KONE Mongomaké, Responsable de l'équipe Agrophysiologie
et Biotechnologie des Légumineuses à Graines n'a ménagé aucun effort pour guider mes
premiers pas dans la recherche scientifique. Qu'il en soit remercié.
J'exprime toute ma reconnaissance aux Enseignants-Chercheurs de la filière Protection
des Végétaux et de l'Environnement. En particulier, Prof. DOGBO Denezon Odette et Prof.
KOUAKOU Tanoh Hilaire pour leur disponibilité, leurs observations et critiques
constructives. Que tous mes ainés du laboratoire, en particulier KONE Tchoa, KONE Fousséni
SOUMAHORO André, SILUE Nakpalo, TOURE Yaya, GNAMIEN Gwladys. DJAHA
Enguerran, reçoivent toutes mes salutations pour leur soutien fraternel.
Mes remerciements sont également adressés aux membres de 1 'Association des Etudiants pour la Protection des Végétaux et de l'Environnement pour leur esprit de
solidarité. Enfin, je tiens à exprimer ma profonde gratitude à toute la famille DIA W ARA pour
leur soutien moral, matériel et spirituel.
ABREVIATIONS
ANA: Acide l-Naphtalène acétique
BAP: ô-Benzylamino-purine
DC : Diamètre au collet
H: heure LE: Longueur de l'Epicotyle
LH: Longueur de l'Hypocotyle
LRP : Longueur de la Racine Principale
MIN: Minute
MS : Murashige et Skoog
NB : Nombre de Bourgeons
NF: Nombre de Feuilles
NRS : Nombre de racines secondaires
PVE : Protection des Végétaux et de l'Environnement
TDZ: Thidiazuron [ l-phenyl-3- (1,2,3 thia-diazol-ô-yl) urea]
ii
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Plant de Vigna sesquipedalis au stade reproducteur Figure 2 : Graines de Vigna sesquipedalis Figure 3 : Différentes étapes de la stérilisation en surface des graines Figure 4 : Etapes de la germination in vitro chez Vigna sesquipedalis
LISTE DES TABLEAUX Tableau 1 : Instruments et équipements utilisés pour l'obtention de vitroplants chez Vigna
sesquipedalis
Tableau 2: Composition du milieu de Murashige et Skoog utilisé pour la germination in vitro
de Vigna sesquipedalis Tableau 3 : Influence des régulateurs de croissance sur la germination in vitro chez Vigna
sesquipedalis
Tableau 4 : Influence des régulateurs de croissance sur la croissance des vitroplants de Vgna
sesquipedalis Influence Tableau 5: Influence des régulateurs de croissance sur la morphogenèse in vitro chez Vigna
sesquipedalis.
iii
Résumé La présente étude vise à évaluer les effets de différents régulateurs de croissance sur la
germination, la croissance et les réponses morphogénétiques de vitroplants de 1 'baricot
kilomètre [Vigna sesquipedalis (L.) Fruw]. Après la désinfection en surface, les graines ont
été débarrassées de leur tégument puis transférées sur le milieu de base de Murashige et
Skoog (MS) supplémenté respectivement avec la BAP. le TDZ. l' ANA et la combinaison
BAP + ANA. Les résultats obtenus indiquent des taux de germination supérieurs à 50 % pour
toutes les hormones utilisées. La morphologie des vitroplants est fortement modifiée en
présence des régulateurs de croissance. L'induction de bourgeons est intervenue à partir du
nœud cotylédonaire et autour de l'apex sur tous les milieux testés. Le TDZ a été l'hormone la
plus efficace dans l'expression des réponses morphogénétiques.
Mots clés : bourgeons, germination in vitro, régulateurs de croissance, Vigna sesquipedalis
Abstract
The objective of the present study was to evaluate in Chinese longbean [Vigna sesquipedalis
.) Fruw] the effects of different plant growth regulators on the process of seeds germination,
seedlings growth and morphogenetic responses. After disinfection, the coat of mature seeds
were removed and the seeds were placed on basal medium of Murashige and Skoog (MS)
supplemented with BAP, TDZ, NAA and the combination BAP + NAA respectively. ResuJts
showed that the rate of germination was superior to 50 % with all the growth regulators tested.
In vitro seedlings morphology was modified by the presence of plant growth regulator. Buds
were induced from cotyledonary node and around the shoot tip on al 1 the media. TDZ was the
rnost efficient plant growth regulator inducing morphogenetic responses.
Keywords:, bud, growth regulators, in vitro germination, Vigna sesquipedalis
iv
1 INTRODUCTION 1
1
Le haricot kilomètre [Vigna sesquipedalis Fruch. (Fabaceae)] est une légumineuse à
graines principalement cultivée en chine et en Asie du sud. Les graines. du fait de leur
richesse en substances énergétiques, en protéines et en vitamines (Brink et Belay, 2006)
constituent une alimentation équilibrée pour les populations urbaines et rurales. Ces graines
sont cuites et consommées comme légume (ANONYME, 1991). En plus, de sa richesse en
éléments nutritifs, la plante fournit aussi un excellent fourrage pour l'alimentation du bétail. A
1 'instar de nombreuses autres légumineuses, V sesquipedalis améliore la structure des sols
qui, dans un système d'assolement constitue une importante source d'azote naturel disponible
pour les autres cultures. Cela révèle son importance dans les systèmes d'exploitation intensive
ou la fertilité du sol diminue au fil des saisons. Bien que très connue en Asie du Sud Est, la culture de V sesquipedalis est limitée à
quelques zones de l'Afrique de l'Ouest et reste très méconnue par la quasi totalité des
populations. Cependant, cette légumineuse pourrait jouer un rôle important dans la sécurité
alimentaire de nombreuses populations locales au Sud du Sahara. La plupart des protocoles de transformation génétique inclut un système de
régénération initié avec des :fragments d'explants isolés qui sont ensuite exposés à un régime
hormonal adéquat pour activer une nouvelle voie de morphogenèse: l'embryogenèse
somatique ou l'organogenèse. Chez de nombreuses espèces végétales, cette stratégie a
généralement été réalisée avec succès en optimisant le type <l'expiant utilisé, les régulateur
de croissance requis et les conditions de culture. Cependant, comme chez de nombreuses légumineuses, des contraintes limitent
l'exploitation du haricot kilomètre. Parmi ces contraintes l'on note la susceptibilité aux
attaquent des ravageurs (insectes), des maladies (fongiques et virales), l'absence des variétés
améliorer comme source de semence. Vu les différentes potentialités du haricot kilomètre, il est important de créer de
nouvelles variétés résistantes et productrices afin d'accroitre le rendement et fournir des
graines de meilleurs qualités. Comme chez la plupart des légumineuses, les objectifs de sélection de V
sesquipedalis concernent la productivité (augmentation du nombre de graines par plante
amélioration de la :fixation de l'azote), la précocité, la résistance aux maladies (fongique,
virose, bactériose) et surtout la qualité des graines (amidon, protéines. facteurs
antinutritionnels). Ces objectifs peuvent être atteints par l'adoption des outils de la
biotechnologie et spécifiquement, la transformation génétique par l'introduction de gènes 2
Toutefois, les techniques de culture in vitro ont été très peu appliquées chez Je haricot
kilomètre et de ce fait, les systèmes de régénération de plantes entières, préalables à toute
application de transfert de gènes restes à développer.
De nombreux chercheurs ont rapporté l'intérêt d'utiliser les graines pour l'obtention
de plantules entières ultérieurement utilisées comme source d'explants primaires (Malik et
Saxena, 1992a,b; Victor et al., 1999). Cette stratégie favorise l'exposition directe des cellules
embryogéniques quiescentes à un stimulus hormonal. Ainsi, la dédifférenciation des cellules
parenchymateuses et donc l'induction de cals est contournée. L'intégrité de la plantule est
conservée et les blessures sont évitées.
La croissance des plantules aseptiques sur un milieu contenant des régulateurs de
croissance semble favorable, voire nécessaire à une bonne croissance ultérieure des
bourgeons. Le nombre de manipulation requis pour induire la régénération est réduit à une
seule étape comparativement à plusieurs phases de culture lorsque les parties de la plantes
sont utilisées comme source d'explant. Par ailleurs, l'utilisation de graines matures permet
d'éviter les nombreuses manipulations pour optimiser les facteurs impliqués dans la culture
des explants isolés. La rapidité et les taux élevés de bourgeon fréquemment obtenus en culture
de graines pourraient faciliter les études de transformations génétiques.
La présente étude vise à évaluer la germination in vitro, la croissance et les réponses
morphogénétiques de vitroplants à partir de graines du haricot kilomètre.
De manière spécifique, l'effet des régulateurs de croissance sur la germination des
graines sera évalué. On cherchera aussi à déterminer l'influence des régulateurs de croissance
sur la croissance des vitroplants d'une part et d'autre part, sur l'induction de bourgeons.
Pour atteindre ces objectifs spécifiques, les hypothèses de travail suivantes seront à
vérifier: la germination in vitro des graines est-elle inhibée en présence des régulateurs de
croissance?
les régulateurs de croissance stimulent-ils la croissance des vitroplants?
des bourgeons sont-ils induits sur les vitroplants en présence des régulateurs de
croissance?
3
1 CHAPITRE I: REVUE BffiLIOGRAPWQUE il
4
1.1. Généralités sur l'baricot kilomètre
1.1.1. Origine, aire de distribution et position systématique
Originaire du Sud-Est asiatique (Kon et al., 2007), Je haricot kilomètre (Vigna
sesquipedalis) est cultivé en Asie de l'Est, dans le Sud de la Chine, dans les Caraïbes. en Asie
centrale et occidentale. Les travaux réalisés par Brink et Belay (2006) et Borget (1989) ont
permis de connaitre La taxonomie du haricot kilomètre. Sa position systématique est la
suivante:
Règne Végétal
Embranchement Phanérogames
Division Angiospermes
Classe Dicotylédones
Ordre Fabales
Famille Fabaceae
Genre Vigna
Espèce sesquipedal is.
1.1.2. Botanique
1.1.2.1. Description de la plante
V. sesquipedalis est une plante herbacée annuelle, grimpante à feuilles trifoliolées et
de couleur verte (figure 1). Sa hauteur varie entre 150 et 180 cm (Borgetl 989; Anonyme
1991 ). Les fleurs sont de couleurs jaunâtre violacée et les téguments des graines sont jaunes
brun rougeâtre avec un hile blanc cerné de noir. Les gousses longues, cylindriques et grêles,
mesurent entre 30 et 120 cm. Elles sont pendantes et renflés à l'état jeune avec des graines
bien espacées (Brink et Belay, 2006).
5
Figure Plant de Vigna sesquipedalls au stade rq,roducteur (Sou.ru : Su.saen et al; 2009)
1.1.2.2. Croissance et développement de la plante
Vign.a sesquipedalis a une croissance rapide et lianescente. C'est une plante rampante
qui a besoin d'un tuteur pour son bon développement. La floraison est abondante après
seulement six semaines de phase végétative. La plante produit de nombreuses gousses de 50
cm de longueur (Walter et Lebot, 2003).
1.1.3. Culture et écologie
La plante se reproduit par les graines. Les agriculteurs utilisent des semences (graines)
provenant des gousses matures des récoltes précédentes ou achetées dans le commerce en
provenance d'Asie (Walter et Lebot, 2003). Selon Grubben (2004), les producteurs africains
utilisent les graines en provenance des récoltes antérieures contrairement à ceux d'Asie du
Sud-est qui sont nombreux à se procurer des semences saines issues des cultivars améliorés. 6
Après une préparation soignée du sol (épandage de fumier, labour), les graines (3 à 5) sont
placées dans des poquets distants d'environ 40 cm. Vigna sesquipedalis tolère de fortes
précipitations, les besoins en eau pour une culture adulte sont de 6-8 mm par jour. li est
cultivé aussi bien pendant la saison sèche avec un arrosage abondant qu'en saison pluvieuse.
L'arrosage se fait manuellement les trois premières semaines. Par la suite les agriculteurs qui
disposent d'une motopompe peuvent utiliser celle-ci, une fois tous les trois jours. Les engrais
sont apportés pour la première fois avec l'eau d'arrosage au moment des semis. Il faut 100 g
de NPK 15-15-15 ou 16-20-0 pour fertiliser 10 m2 de parcelle (Brink et Belay, 2006).
1.1.4. Récolte et production
La première récolte du haricot kilomètre se fait six à sept semaines après semi et 20
jours après l'ouverture des fleurs. Elle se fait en fonction du cultivar (Grubben et Denton
2004: Santipracba et Santipracha, 1997). La récolte s'étale sur un mois et demi avec un
passage tous les deux ou trois jours (Pillot, 2008). La récolte se fait avec le plus grand soin car
les gousses qu'on oublie jusqu'à la prochaine récolte durcissent, se décolorent et peuvent
épuiser la plante. Un kilogramme de semence contient 7800 graines (Borget 1989). Le
rendement total du haricot kilomètre est de 15 t / ha sur une période de récolte d'au moins un
mois (Grubben et Denton, 2004).
1.1.5. Valeur nutritionnelle et utilisation
V. sesquipedalis a des graines riches en protéines, (Anonyme, 1991 ). Les gousses
fraiches sont récoltées comme légume verte pour la consommation. Cent grammes de partie comestible des graines contiennent: 87,9 g d'eau, 2,8 g de protéines, 0,4 g de lipide, 8,4 g de
glucide, 50 mg de calcium, 44 mg de Magnésium, 0,5 mg de fer, 865 UI de vitamine A et 19
mg/1 d'acide ascorbique. Comme de nombreuses autres légumineuses, V. sesquipedalis est
une plante qui peut dans un système d'assolement, faire profiter d'autres cultures d'un apport
d'azote naturel contribuant à la restauration de la fertilité des sols (Brink et Belay 2006).
1.1.6. Maladies et ravageurs
Les ravageurs et maladies entrainent la réduction du rendement de la plante. V.
sesquipedalis souffre des mêmes maladies que le niébé mais, en condition humide, il semble
moins sensible (Brink et Belay, 2006). Les insectes représentent une menace beaucoup plus
importante que les maladies. Cependant, la plante souffre de certaines maladies due à la
7
présence de Xanthomonas compestris, de Fusarium sp, de / 'anthracnose de vigna. Sur les
feuilles adultes et sénescentes, les attaques les plus fréquentes sont dues à Cercospora
cruenta. Le haricot kilomètre montre aussi une grande sensibilité à l'oïdium américain du
haricot. Les meloidogynes attaquent les racines. Les maladies virales constituent une menace
réelle pour cette plante (Messian, 1991).
1.2. Quelques aspects de la germination des semences
1.2.1. Définition de la germination
La germination correspond au passage de la vie ralentie à la vie active de la graine. Sa
définition a diversement été formulée suivant les auteurs. Selon Evenari (1957). la
germination est un processus dont les limites sont le début de l'hydratation de la semence et le
début de la croissance de la radicule. Pour Côme (1982), la germination est définie comme
étant la déchirure des téguments à la suite de l'allongement de la radicule. Quant à Jordan et
Haferkamp (1989), ils considèrent qu'une graine a germé lorsque la radicule atteint au
minimum un millimètre de longueur
1.2.2. Conditions physiques de la germination
Les besoins de base pour la germination des semences sont: l'eau, l'oxygène et une
température adaptée. Les semences ont des besoins différents selon les espèces (Rao et al.
2006). Ainsi, Polisetty et a/.(1997) ont développé des plantules in vitro à partir de graines
placées sur du papier filtre imbibé d'eau distillée stérile.
1.2.3. Viabilité des semence
EUe se définit comme étant des graines vivantes et capables de se développer en plante
entière qui vont se reproduire dans les conditions appropriées au champ (Rao et al., 2006 ).
Elle décline lentement au début, puis plus rapidement au fur et à mesure que les semences
vieillissent. Ewart cité par Crosaz (1995) classe les semences selon la durée pendant laquelle
elles conservent leurs viabilités en trois catégories: les semences macrobiotiques qui vivent
plus de quinze ans, les semences mesobiotiques les plus nombreuses qui ont une durée de vie
comprise entre trois et quinze ans et les semences microbiotiques qui ne survivent pas plus de
trois ans. Contrairement à Ewart, Robert (1973) classe les semences en deux grands groupes
selon leurs réserves en eau : les semences orthodoxes dont la teneur en eau peut être abaissée
8
jusqu'à 5% et peuvent être conservée à des températures très basses pendant longtemps et les
emences récalcitrantes qui doivent garder une teneur en eau relativement élevée (20% à 50%
du poids frais) et ces graines ne se conservent pas longtemps
1.2.4. Germination i11 vitro et réponses morphogénétiques de vitroplants
Tous les systèmes couramment adoptés pour la modification génétique du pois ont été
basés sur la culture préalable des graines sur un milieu contenant la BAP (Schroeder et al.,
1993; Grant et al., 1995; Bean et al., 1997). Par ailleurs, La réponse des graines de
légumineuses au contact de milieux de culture contenant Le TDZ ou la BAP a été étudiée chez
Vigna radiata (Avenido et Hattori, 2001), le haricot commun (Cruz de Carvalho et al., 2001)
l'arachide sauvage (Gagliardi et Pacheco, 2000), le pois chiche (Jayanand et al., 2003). le
niébé (Le Bui et al., 2002) et Le tamarin (Mehta et al., 2005).
bez les légumineuses tels que Le pois chiche (Jayanand el al., 2003) et le haricot
(Malik et Saxena, 1992b), de Longues périodes de culture ou la culture en présence de
concentrations élevées de TDZ ont conduit à la déformation, la nécrose, le brunissement et la
d
Zhihui et al. (2009) ont rapporté que la variation de la concentration de TDZ
n'influence pas significativement la germination des graines de Pisum sativum. Ces auteurs
ont toutefois signalé la formation de bourgeon au niveau de l'apex, l'axe cotylédonaire et
l'épi cotyle par les cytokinines BAP et TDZ. Cette induction de bourgeon dépend fortement de
la concentration de TDZ et de la durée des traitements. Chez Bidens pi/osa, le TDZ et la BAP inhibent la croissance racinaire mais favorisent
la formation des bourgeons sur l'épicotyle (Mundhara et Rashid, 2006). Des résultats
similaires ont également été rapportés par Fosto et al. (2002). Ils remarquent que l' ANA
stimulent la formation et le développement des racines. Cependant, ils ont également noté
que ces deux hormones inhibent b croissance de lia tige. U11e telle action de ces
phytohormones (BAP, ANA) est signalée par Waren et Waren(I991).
Skoog et Muller (1957) ont montré au cours de leurs travaux qu'une prédominance
d'auxine favorise le développement de l'appareil racinaire.
La morphogenèse a été induite à partir de vitroplants de nombreuses espèces de
légumineuses sur les milieux de culture supplémentés avec les cytokinines (Malik et Saxena,
1992a, b; Saxena et al., 1992). Deux zones d'induction de bourgeons ont été observés :
9
1
(1) induction de multiples bourgeons à partir du nœud cotylédonaire et les zones autour de
l'apex chez Phaseolus vulgaris en présence de BAP (80µM) ou TDZ (10µM);
(2) différenciation des embryons somatiques dans la région apicale et à la surface des
cotylédons et hypocotyle de l'arachide en présence de lOµM de TDZ (Saxena et al., 1992).
En présence de concentrations relativement élevées de BAP (50-80 µM), l'embryogenèse
somatique et la formation de bourgeons ont été observées sur les jeunes plants de Phaseolus
coccineus (Malik et Saxena, 1992b). La formation de bourgeons est attribuée à
l'augmentation de la concentration de BAP dans le milieu de culture de la graine. Cette
augmentation de la concentration de BAP n'a cependant aucune incidence sur l'intégrité
morphologique de la plantule. En présence de TDZ, les bourgeons axillaires préexistants du
nœud cotylédonaire de plantule de tamarin se multiplient. La stimulation de la prolifération
des bourgeons et l'inhibition de leur élongation par la BAP et/ou le TDZ aux concentrations
élevées ont été rapportées (Huetteman et Preece, 1993). Le milieu de base MS dépourvu de
TDZ a été utilisé pour l'élongation des bourgeons en plantules chez Phaseolus vulgaris L.
(Malik et Saxena, 1992a). Au total, cette revue bibliographique a montré que la culture de graines en présence de
régulateurs de croissance permet d'obtenir des plantules à partir desquelles sont directement
initiées l'organogenèse et l'embryogenèse somatique. Toutefois, les réponses exprimées
varient selon la nature, la concentration et le temps d'application des cytokinines
(principalement la BAP et le TDZ). Les plantules issues de ces traitements constituent un
matériel de choix pour la transformation génétique à cause de l'absence d'une phase de
callogenèse. Si l'appli.cation de cette technique chez de nombreuses plante a été réalisée avec succès, la littérature concernant le haricot kilomètre est pratiquement inexistante à notre
connaissance. Par ailleurs, aucun rapport ne signale l'utilisation de l'ANA seule ou en
association avec les cytokinines. En outre, l'incidence des traitements hormonaux sur la
croissance des plantules n'a pas été évaluée par les travaux antérieurs.
10
CHAPITRE ll : MATERIEL ET METHODES 1
11
2.1. Matériels
2.1.1 Matériel végétal
Le matériel végétal utilisé au cours de cette étude est constitué de graines de Vigna
sesquipedalis. Ces graines se caractérisent par leur coloration qui varie du marron clair au
marron foncé (Figure 2). Les graines de V. sesquipedalis ont gracieusement été mises à notre
disposition par le Dr. TOURE Siédou de l'UFR Sciences et Gestion de l'Environnement
(Université Nangui Abrogoua).
Figure 2 : Graines de Vigna sesquipedalis
2.1.2. Matériels de laboratoire Le matériel de laboratoire utilisé est essentiellement composé des appareils et
instruments enregistrés dans le tableau 1.
12
Tableau 1 : Instruments et équipements utilisés pour l'obtention de vitroplants chez Vigna Sesqu ipedal is
Désignation Marque Utilisation
Balance de précision (0,0001g) Mettler Toledo Préparation du milieu de culture (pesée)
Plaque chauffante Ceram Scott Préparation du milieu de culture (clissolution agar)
Ph-mètre HANNA Préparation du milieu de culture (milieu tampon)
Agitateur magnétique IKAMAGRH Homogénéisation des milieux de culture
Tube à essais Scott Récipient contenant les milieux de culture
Bouchon en plastique Fermeture des tubes à essais
Autoclave P. Sélecta Stérilisation du milieu de culture
Hotte à flux laminaire Herasafe Table de manipulation en condition stérile
Béchers Pyrex Stérilisation des pinces et lames
Boite de pétri Petriq Récipient pour la dissection des graines
Pince et scalpel Instrument de dissection
Eau distillée Préparation du milieu de culture
Règle graduée Mesure des longueurs
2.2. Méthodes la méthodologie de la culture in vitro comprend différentes étapes : les conditions de
culture, la préparation des milieux de culture, la stérilisation des graines, l'imbibition des
graines et enfin la mise en culture sur milieu.
2.2.1. Les conditions de la culture in vitro La pratique de la culture in vitro nécessite des conditions aseptiques. Toutes le
manipulations sont réalisées sous une hotte à flux laminaire comportant une surface stérilisée
à l'aide de l'alcool 70 %. Les instruments tels que les pinces et scalpels sont stérilisés à
l'autoclave et au moment de l'utilisation, ils sont plongés dans l'alcool 70 % puis, passé à la
flamme grâce au bec Bunsen.
13
2.2.2. La préparation des milieux de culture
Le milieu de base utilisé pour la germination et la croissance des vitroplants est la
formulation minérale de Murashige et Skoog (1962) contenant les sels et vitamines MS. 3%
de saccharose et 6 % d'agar (tableau 2). Pour notre étude un demi MS a été utilisé. 2,2 g de
poudre de MS ont été pesé pour litre de milieu. Ainsi pour 600 ml de milieu il faut 1,32 g de
poudre. A ce mélange il faut ajouter 18g de saccharose. L'ensemble est dissout dans l'eau
distillée stérile pour obtenir un volume final de 600 ml. Le milieu de culture est solidifié avec
de l'agar à 6 %. Ce milieu de base est supplémenté avec des hormones. Le milieu témoin ne
contient aucune hormone. Les autres milieux contiennent respectivement les régulateurs de
croissance suivant (0,5 mg/1 d' ANA ; 1 mg/1 de BAP ; 0,5 mg/1 d' ANA+ 1 mg/1 de BAP ·
0,22 mg/1 et 1,1 mg/L de TDZ). Le pH du milieu de germination est ajusté à 5.8 avec du
NaOH (0,1 N) ou du HCL (0,1 N). Le milieu est reparti dans des tubes à essai en raison de 10
ml par tube à l'aide d'une dispensette. Tous les tubes ont été fermés avec des bouchons en
plastique. Les milieux ont été stérilisés à l'autoclave à une température de 121 °C sous une
pression de 1 bar, pendant 30 mn.
Tableau 2: Composition du milieu de Murashige et Skoog (1962) utilisé pour la germination
in vitro de Vigna sesquipedalis
Composés Concentrations ( m Micro éléments C0Ch_6H20 CuS04_5H20 FeNaEDTA H3BÜ3 KCI MnS04_H20 Na2Mo04.2H20 ZnS04}H20 Macro éléments CaCh KH2P04 KN03 MgS04 NRiNOJ Vitamines Glycine Myo-inosito 1 Acide nicotinique Pyridoxine HCL Thiamine HCL
0,025 0,025 36,7 6,20 0,83 16,90 0,25 8,60
332,02 170,00 1900,00 180,54 1650,00
2,00 100,00 0,50 0,50 0.10
14
2.2.3. Stérilisation des graines
Avant de commencer la stérilisation proprement dite, les graines ont été lavées dans
l'eau savonneuse et rincées avec l'eau de robinet pour les débarrasser des produits ayant servi
à leur conservation. Sous une hotte à flux laminaire, les graines ont été désinfectées par
trempage rapide dans l'alcool 70 % (une minute) suivis d'une immersion dans l'hypochlorite
de calcium 7 % pendant 15 min. Les graines ont été rincées trois fois avec de l'eau distillée
stérile. Pour faciliter la germination, les graines ont été imbibées pendant 24 h dans de t 'eau
distillée stérile (Figure3).
-- .~.~ - '...,e. ...• __
:.:,. ·- ,
Figu,e 3 : Diftèremtc.s étapes de [a stérilisation des graines : lflrern;p~ des graines dans ra1coo1 7/fJ '%
8 : Passage dam rhypooblorite de calcium 1 '°/4 C : llmblbiûoo des graines dans l'eau dis1lillé sté -
2.2.4. Mise en culture des graines Sous une hotte à flux laminaire, à l'aide d'une pince et d'un scalpel stériles, les
geaiaes ont été d&arras.sée.s de leurs téguments. El}JJes ont été placées avec le bile au contact
des différents milieux de culture contenant dix ml de solution solidifiés dans les tubes à essai
à raison d'une graine par unité expérimentale (tubes à essai). Dix graines ont été utilisées pour
Les cultures ont été placées sur des étagères dans la salle de culture dont les conditions sont
les suivantes: une photopériode de 16 h (16 h d'éclairement et 8 h d'obscurité). une
température de 25±2 °C et une intensité lumineuse de 2000 lux fournie par des lampes
blanches fluorescentes. 15
2.2.5. Evaluation de la germination
Les stades de la germination des graines et du développement des plantules ont été
observés quotidiennement L'émergence de La radicule a été adoptée comme critère pour
considérer qu'une graine a germé. Le nombre de graines ayant effectivement germé
quotidiennement a été compté pour chacun des traitements. Ces relevés ont permis de calculer
d'une part, le temps moyen de germination (TMG)
TMG=
ltil1 : m.0.Dll'lilre de graine germée 1n : 1i eme jom après semis '2: m : nombre total. de graines germée
et d'autre part le Pourcentage de germination:
Pourœntage de germination= ~
1ombre total de graines mises a gesmer 400
2.2.6. Evaluation de la croissance des vitroplaots
Les paramètres de croissance ont été évalués deux semaines après la mise en culture. La
longueur de la racine principale, de l'épicotyle, de l'hypocotyle ont été mesurées à l'aide
d'une règle graduée et le diamètre au collet a été mesuré à l'aide du pied à coulisse. Le
nombre de racines secondaires et de feuilles a été compté.
2.2.7. Evaluation de la morphogenèse
En termes de réponses morphogénétiques, le nombre moyen de bourgeons par expiant a été
calculé et ensuite le pourcentage de bourgeonnement a été déterminer.
2.3. Traitement statistique des données L'analyse statistique des effets des différents traitements sur la germination de la
graine, la croissance des plantules et les réponses morphogénétiques à partir des plantules a
été réalisée avec le logiciel ST ATISTICA 6.0. Elle a consisté en une analyse de variance
(ANOV A) suivie du test LSD de Fisher au seuil de 5 % pour la comparaison des moyennes.
16
1 CHAPITRE m: RESULTATS 1
17
1
3.1. Description de la germination in vitro chez Vigna sesquipedalis
La germination in vitro chez vigna sesquipedalis se caractérise par une augmentation
du volume des semences au contact du milieu de culture. Les premières radicules apparaissent
24 h après la mise en culture (Figure 4A). Cette radicule s'allonge dans le milieu de culture
48 h après semis (Figure 4B). A l'opposé de la radicule, la tigelle s'allonge à son tour pour
donner l'hypocotyle (Figure 4C). Les cotylédons se soulèvent au dessus du milieu de culture,
s'écartent lentement et la gemmule donne naissance à l'épicotyle (Figure 4C). Après une
emaine de culture, les deux premières feuilles, déjà visibles s'étalent, verdissent et croissent
(Figure 4D). Les cotylédons flétrissent et tombent durant la deuxième semaine de culture.
Cette germination est dite de type épigé.
!Eeuiœle
A : graine sur mitie,u de aii1ture 24 lb après semis B : plaatulle ,de 4S lb C ~ f1antlu1e de .Sjoun;
18
3.2. Effet des régulateurs de croissance sur la germination
Sur le milieu dépourvu de régulateurs de croissance, les plantules issues de la
germination des graines se développent normalement avec un méristème apicaJ et une racin
principale portant des racines latérales. En présence de régulateurs de croissance, les plants
sont de taille réduite. L'élongation du méristème apicaJ est inhibée, la racine principale est
courte, épaisse et dépourvue de racines latéraJes (Figure 4). La germination des graines a été observée sur tous les milieux de cultures testés
(Tableau 3). Elle est intervenue moins de 24 h sur le milieu témoin et le milieu supplémenté
avec la BAP. Pour les autres milieux utilisés, le temps moyen de germination a été de un jour.
Aucune différence significative n'a été notée entre les temps moyens de germination.
Le pourcentage de germination le plus élevé a été obtenu sur le milieu sans régulateurs
de croissance. Ce pourcentage est statistiquement identique à ceux observé sur les milieux
supplémentés avec les hormones.
Tableau 3 : Influence des régulateurs de croissance sur la germination in vitro chez Vigna sesquipedalis
raitements Temps moyen de germination Ors) Pourcentage de germination
TEMOIN 0,96±0,03 89.99±0,00
BAP 0,79±0,36 81,13±8.85
ANA 1,31±0,03 63,92±7,39
ANA+BAP 1,64±0,2 61,70±8,53
TDZ1 1,07±0,14 74,99±7,85
TDZ5 1, 17±0,08 81,13±8,85
F 1,21 2,74
p 0.36 0,07
Dans une même colonne, les chiffres suivis de la même lettre ne sont pas statistiquement différents au seuil de 5% (Test de Fisher) .
..• 3 .. Effet des ph
Pour tous les paramètres de croissance étudiés, l'anaJyse de la variance réalisée a
montré l'existence d'un effet régulateurs de croissance significatif (p<0,05). Les réponses
19
1
observées ont varié selon la nature et la concentration des phytohormones d'une part, et
d'autre part selon Le type d'organe (Tableau 4).
En l'absence d'hormones, la longueur de la racine principale a été de 11 cm. En
présence de réguJateurs de croissance, cette longueur a varié de l à 6 cm. L'apport des
régulateurs de croissance a inhibé la croissance de la racine principale. L'association des
hormones ANA+BAP a induit L'inhibition la plus importante. L'inhibition semble être
également plus marquée avec l'augmentation de la concentration de TDZ.
La taille la plus importante de l'hypocotyle a été observée dans le milieu témoin (2,72
cm). Cette taille est statistiquement identique à celle obtenue en présence du TDZ (1 µmol).
Un effet inhibiteur de la croissance de l'hypocotyle a été noté avec les autres hormones.
Aucune différence significative n'a existé entre l'effet des hormones BAP, ANA, et TDZ.
L'inhibition la plus importante a été exprimée avec la combinaison ANA+BAP.
L'épicotyle le plus long a été observé dans Je milieu sans hormone (10,20 cm). La
présence des hormones a inhibé significativement la croissance de l'épicotyle . Les hormones
ANA, BAP et l'association ANA+BAP ont exercé une action similaire sur la croissance de
l'épicotyle. L'inhibition la plus importante a été observée sur milieu TDZ.
L'ANA seul ou en combinaison avec la BAP, n'a exercé aucun effet significatif sur la
croissance en épaisseur des vitroplants. Une augmentation significative du diamètre au collet
a cependant été notée en présence de la BAP et du TDZ.
L'apport des hormones dans Je milieu de culture n'a pas significativement modifié Le
nombre de feuilles développées par les vitroplants.
L'ANA a entraîné une augmentation significative du nombre de racines secondaires (82).
Contrairement à cette hormone, Je TDZ, la BAP ou l'association BAP-ANA ont réduit le
nombre de racines secondaires. La réduction la plus importante a été exprimée par la BAP.
20
Tableau 4 : Influence des réguJateurs de croissance sur la croissance des vitroplants de
Vigna sesquipedalis
Régulateurs de croissance (mg/1) Paramètres de croissance
BAP TDZ ANA Lrp Lhyp Lep Oc Nbf NRS
0 0 0 11,62a 2,72a 10,20a 0,42c 4,09a 52,83b
1 0 0 4, 15bc l,54bc 4,34bc 0.60ab 3,86a IOJ6e
0 0.22 0 6,30b 2,25ab 3,30c 0,50abc 7,05a 32,12c
0 1,1 0 3,81 cd 1,50bc 1,73c 0,58ab 5,38a 16,99de
1 0 0,5 1,48d 0,83c 5,00bc 0,38c 3,52a 22,03cd
0 0 0,5 3,08cd 1,53bc 7,46ab 0,35c 3,53a 83,38a
F 20,73 4,69 7,19 3,53 2,08 60,18
p 0,0001 0,013 0,002 0,03 0.13 0.0001
Dans une même colonne, les chiffres suivis de la même lettre ne sont pas statistiquement différents au seuil de 5% (Test de Fisher).
Lrp : Longueur de la racine principale; Lhyp : Longueur de l'hypocotyle; Lep : Longueur de l'épicotyle De : Diamètre du collet ; Nbf: Nombre de feuilles; Nrs : Nombre de racines secondaires
3.4. Réponses morphogénétiques à partir de germinations in vitro chez Vigna
sesquipedalis
Après deux à trois semaines de culture, les plantules in vitro ont essentiellement induit
des bourgeons à partir du nœud cotylédonaire et de l'apex. Les valeurs moyennes d
pourcentage de bourgeonnement et de nombre moyen de bourgeon par expJant ont été
regroupées dans le tableau 5. Un effet significatif de régulateur de croissance a été observé dans le pourcentage
d'induction des bourgeons (P<0,05). Le pourcentage d'induction de bourgeons obtenus sur le
milieu dépourvu de régulateurs et les milieux supplémentés avec la BAP, la combinaison
BAP+ANA et l' ANA seul ont statistiquement été identiques. Ces pourcentages sont
significativement inferieurs à ceux exprimés en présence du TDZ 0,22 mg/1 et du TDZ 1.1
mg/l. Aucune différence statistique n'existe entre ces deux valeurs.
21
1
Le nombre moyen de bourgeon le plus important a été obtenu sur le milieu TDZ (1, 1 mg/1).
e nombre est statistiquement supérieur à celui obtenu sur TDZ (0,22 mg/1). Les autres
milieux testés inhibent significativement l'induction de bourgeons des plantules sans
différence significative.
Tableau V : Influence des régulateurs de croissance sur la morphogenèse in vitro chez Vigna
sequipedalis
Régulateurs de croissance (mg/1) Réponses morphogénétiques
BAP TDZ ANA Pourcentage bourgeons Nb moyen bourgeons / vitroplant
0 0 0 46b 1,1 Oc
1 0 0 45b 1,86c
0 0,22 0 74a 8.86b
0 1,1 0 76a 16,9a
1 0 0,5 38b 1,08c
0 0 0,5 36b 1,00c
F 58,03 104,04
p 0,0001 0.0001
Dans une même colonne, les chiffres suivis de la même lettre ne sont pas statistiquement différents au seuil de 5
% (Test de Fisher).
22
1 CHAPITRE IV : DISCUSSIO 1
23
Le déveJoppement de l'embryon conduisant à l'émergence d'une nouvelle plante est
appeJée germination. L'initiation de cette germination exige que trois conclitions soit
remplies : la graine doit être viable (1) ; eUe doit être soumise aux conditions
environnementales appropriées (2) et toute condition de dormance primaire dans la graine
doit être surmontée (3). La culture de graines sur les milieux contenant le TDZ ou la BAP a
été réalisée chez de nombreuses légumineuses à graines telles que le niébé (Le Bui, 2002) et
le pois chiche (Jayanand, 2003). Dans nos conclitions expérimentales, la germination des graines a été observée sur tous
les milieux de culture testés. Bien que n'ayant pas amélioré le taux de germination des
semences, le TDZ et la BAP ont cependant faiblement restreint la capacité germinative des
graines chez Vigna sesquipedalis par rapport a l'ANA et à la combinaison ANA+BAP. De
résultats similaires ont été rapportés par de nombreux auteurs (Metha et al., 2004 ; Kanmegne
et al., 2008 ; Zhihui el al., 2009). Ces résultats pourraient s'expliquer par Je fait qu'il n'y a pas
de dormance embryonnaire chez cette légumineuse.
Pour tous les traitements appliqués, la germination est intervenue en moyenne en un
Jour. Les hormones utilisées n'ont donc pas influencé de manière significative le temps
moyen de germination. Ces résultats pourraient s'expliqués par Je fait que les graines
contiennent des réserves nutritives quj leurs permettent de germer.
Des plantuJes normales ont été développées sur les milieux dépourvus de régulateurs
de croissance. En présence des hormones, des modifications ont été observées dans la
morphologie des plantuJes. Ces modifications ont consisté en une réduction de la croissance
en longueur de la racine principale, de l'hypocotyle et de l'épicotyle et une diminution du
nombre de racines secondaires respectivement en présence de l' ANA: ANA + BAP et le
TDZ. Par contre. une stimulation de la croissance en épaisseur de la tige a été induite par la
BAP et le TDZ et une augmentation du nombre de racines latérales a été observée en présence
de l' ANA. Des modifications semblables ont été notées sur les vitroplants issues de la
germination in vitro des graines de tamarin en présence de TDZ (Singh et al., 2003). ces
malformations ont aussi été induites par le TDZ chez de nombreuses espèces incluant
l'arachide (Malik et Saxena, 1992) et le pois cruche (Murthy et al., l 996; Jayanand, 2003).
L'induction de bourgeons a été observée à partir du nœud cotylédonaire et de l'apex
des plantules in vitro sur tous les milieux de culture étudiés. Cependant, les fréquences
24
d'induction et les nombres moyens de bourgeons par expiant les plus importants ont été
obtenus avec le TDZ.
L'induction de bourgeon a été observé sur des plantules in vitro de nombreuses
espèces de légumineuses mise en culture sur les milieux supplémentés avec des cytokinines
(Malik et Saxeoa, 1992a, b; Saxena et al., 1992). Deux types de réponses ont été observées :
(1) l'induction de bourgeons à partir du nœud cotylédonaire et (2) induction de bourgeon à
partir de la zone entourant l'apex chez Phaseolus vulgaris en présence de BAP ou TDZ
(Malik et Saxena, 1992a). Par ailleurs, chez le tamarin, les graines germées sur le milieu
dépourvu de régulateurs de croissance ont développé des vitroplants avec un apex et une
racine (Metha et al., 2005). Seul le nombre de bourgeons par expiant a augmenté avec les
concentrations élevées de TDZ. Sur les trois régulateurs de croissance utilisés (ANA-BAP-TDZ), le TDZ a été le plus
efficace pour l'induction et la prolifération des bourgeons. Le TDZ, une phénylurée
synthétique, est considéré comme l'une des plus actives cytokin:ines pour l'induction de
bourgeons dans les cultures de tissus végétaux (Huetteman et Preece 1993). De nombreux
rapports ont suggéré que cette hormone induit plus efficacement la régénération de bourgeons
comparativement aux autres cytokin:ines (Thomas 2003; Thomas et Puthur 2004; Husain et
al .. 2007).
25
1 CONCLUSION ET PERSPECTIVES 1
26
Au terme de cette étude, les principales conclusions en relation avec les hypothèses de
travail formulées indiquent que chez Vign.a sesquipedalis:
la présence du TDZ, de la BAP et de L'ANA dans le milieu de culture, n'empêche
pas la germination des graines,
la morphologie des vitroplants est fortement modifiée par l'effet des régulateurs de
croissance. Les modifications consistent en une réduction de La croissance apicale
et racinaire et à une stimulation de la croissance en épaisseur et une augmentation
du nombre de racines latérales. Ces réponses varient selon la concentration et la
nature de 1 'hormone et le type d · organe
les vitroplants issus de la germination in vitro de graines en présence de
régulateurs de croissance développent des bourgeons à partir du nœud
cotylédonaire et autour de l'apex
le TDZ est la cytokinine la plus efficace dans l'induction des bourgeons.
Les bourgeons induits par Je TDZ sont de taille réduite. L'élongation de ces bourgeons
se fera par le transfert sur de nouveaux milieux dépourvus de régulateurs de croissance ou
supplémentés avec la gibbérelline.
La régénération effective de plantes sera entreprise par le transfert des pousse
feuillées issues de la phase d'élongation sur des milieux d'enracinement supplémentés avec
l 'ANA. l' AIB ou le charbon actif.
Les conditions d'établissement ex vitro des vitroplants et de transfert en serre puis au
champ seront étudiées.
27
1 REFERENCES BfflLIOGRAPPfilQUES 1
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