Nuevas herramientas diagnósticas en

Aspergilosis invasiva : PCR y Lateral Flow Aspergillus

Dra. Paulette Legarraga Laboratorio Microbiología

Departamento de Laboratorios Clínicos Pontificia Universidad Católica de Chile

Temas a tratar

1. Introducción métodos tradicionales 2. Lateral flow device

– Desarrollo del test – Nuestra experiencia – Desempeño en la literatura

3. PCR – Generalidades del PCR – Estandarización – Experiencia – Comparación con literatura – Evidencia de la utilidad de este marcador

4. Conclusiones

Métodos diagnósticos actuales para infecciones fúngicas invasoras

Método Características

Visualización directa /Cultivo • Baja sensibilidad (50%) y VPP 72%, colonización vía aérea

• Dificultad toma de muestra

Galactomanano • Sensibilidad 29 a 100%: • Varía según: tipo de muestra, paciente y punto

de corte • Falsos positivos entre 5 a 83% (reactividad

cruzada) • Complejo? • Costo

B-D-glucano • No es especifico • Sensibilidad 64 a 100%, especificidad 45 a 92% • Técnicamente complejo • Costo

¿Habremos llegado? PCR y Lateral Flow

• Purificación de anticuerpos monoclonales MAb JF5 del tipo IgG contra un epitope glicoproteico de Aspergillus

– Específicos para especies de Aspergillus pero con reactividad cruzada para Penicillium y Paecilomyces variotii

– Sin reactividad cruzada con β lactámicos o ciclofosfamida

Thornton. CR. Clin. Vaccine Immunol. 2008, 15(7): 1095-1105

Inmunofluorescencia muestra presencia del antígeno en pared y secretada durante crecimiento activo pero no en conidias no germinadas

Localización glicoproteína

Thornton. CR. Clin. Vaccine Immunol. 2008, 15(7): 1095-1105

Desarrollo del test

• Desarrollo de un test en formato inmunocromatográfico

Meta-análisis

Pan Z et al. Journal of Medical Microbiology (2015), 64, 702–707

SUERO: Sensibilidad: 0,68(0,52-0,81) Especificidad: 0,87(0,8-0,92)

LBA: Sensibilidad: 0,86(0,76-0,93) Especificidad: 0,93(0,89-0,96)

Evaluación del LFD en muestras de suero y LBA para el diagnóstico de Aspergilosis invasora en un Hospital

Universitario

• Análisis retrospectivo

• Se evaluaron los antecedentes clínicos de las muestras de GM congeladas en nuestro laboratorio (2012-2015)

• Clasificación de las muestras según criterios EORTC: – AI (+): AI probada/probable

– AI (-): no AI

– Se identificaron además las muestras de pacientes con AI posible

Delama Ignacio 1, Legarraga Paulette 2,3, González Tamara3, García Patricia 2, 3, Rabagliati Ricardo1 1Departamento Enfermedades Infecciosas del Adulto, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2 Departamento de Laboratorios Clínicos,

Pontificia Universidad Católica de Chile, 3 Laboratorio de Microbiología Red Salud UC-CHRISTUS.

Resultados

• Se analizaron 142 muestras: – 113 suero

– 29 a LBA

• 98 pacientes: – 33 AI probada/probable

(33.6%)

– 15 AI posible (15,3%)

– 53 sin AI (54%)

• Neoplasia más frecuente LMA (25%)

Características pacientes

Mediana de edad 50,9 años

Sexo masculino 59 (60,2%)

Enfermedad de base

Neoplasia hematológica 43 (43,9%)

Trasplante de órgano sólido 6 (6,1%)

Trasplante de precursores

hematopoyéticos 13 (13,3%)

Tumor sólido 5 (5,1%)

VIH/SIDA 5 (5,1%)

Otro 20 (20,4%)

Riesgo inmunológico

RAN < 500 cel/mm3 11 (11,2%)

RAN < 100 cel/mm3 31 (31,6%)

Uso de corticoides 22 (22,4%)

Terapia inmunosupresora 27 (27,5%)

Resultados

Sensibilidad

% (IC 95%)

Especificidad

% (IC 95%) LR(+) LR(-)

Sangre 70.9%(57.86-81.23) 53.5%(38.92- 67.49) 1.5 (1.354 - 1.717) 0.54 (0.4468 - .662)

LBA 83.3%(55.2- 95.3) 38.5%(17.71,-64.48) 1.3 (1.019 - 1.799) 0.43(0.08686-.162)

Total 73.1%(61.48- 82.28) 50% (37.33- 62.67) 1.4 (1.344 - 1.592) 0.53(0.4493 -0.426)

• Sensibilidad comparable a otros marcadores pero con menor especificidad

Concordancia con GM

Resultados GM

LFD Negativo Positivo Total general

Negativo 27 26 53

Positivo 27 61 88

Total general 55 87 142

• Concordancia entre ambos métodos de un 62.41%. • El índice de concordancia Kappa fue de = 0.202, considerado como un acuerdo mediano

¿Positivo débil?

• Línea leve en todas las muestras incluso con buffer

• Requeriría de establecimiento de “punto de corte” (Held et al. Infection (2013) 41:1163–1169)

Estudio multicéntrico

Eigl et al. Critical Care (2015) 19:178

• Alto valor predictivo negativo 96% • 19% muestras FP

PCR Aspergillus

PCR Aspergillus

• Desarrollada hace más de 20 años • PCR in house • Muestras: suero, sangre total y LBA • Desempeño técnica presenta gran variabilidad entre los

estudios – Muestra utilizada – Partidores (rRNA, mitocondrial, otro) – Método de extracción – Criterios de positividad utilizados

No incluida en los criterios EORTC por falta de estandarización de los métodos disponibles

• Recomendaciones • Estándar acordado por la

WHO que permitirá tener material para programas de control de calidad externo

Estandarización

White PL et al. JCM 2010, 48(10):3753 White PL et al. JCM 2011, 49(11):3842.

Kits comerciales

• PCR-RT desarrollada por PathoNostics (AsperGenie)

• Detección de Aspergillus sp

– A. fumigatus

– A. terreus

• Detecta resistencia a azoles (L98H, Tandem repeat 34, T289A, Y121F)

• Uso en muestras LBA

• Tiempo de reacción: 2,5 hrs

• Validado para ser utilizado en LightCycler 480 (Roche), Rotor-Gene 6000 (Corbett) and Rotor-Gene Q (Qiagen)

• PCR-RT desarrollado por Myconostica

• Validado para muestras de suero y respiratorias

• Aprobación CE

• Disponible Kit de extracción

• Tiempo de procesamiento +/-4 hrs (completo)

• Cepheid SmartCycler®, AB7500 (1.4), LightCycler® 2.0 y Stratagene Mx3000 series

• Objetivo: Desarrollar un test para detección de A. fumigatus en muestras de sangre, suero, o LBA de pacientes con riesgo de AI basado en una reacción de Q-PCR dirigida al rRNA 28S

• Se analizaron de manera prospectiva 41 muestras (sangre, suero, tejido o LBA) de 23 pacientes con riesgo de AI provenientes del Hospital Clínico de la Universidad Católica.

• Clasificación de los pacientes según criterios EORTC (factores de riesgo, imagenología, resultados de GMN y cultivo)

• Pacientes con AI posible fueron considerados como negativos

“Desarrollo de un RT-PCR para la detección de Aspergillus

fumigatus en pacientes con riesgo de aspergilosis invasora”

Wozniak A, Sanhueza F, Rabagliati R, Vizcaya C, Rivera G,

Pérez R, Flores J, Miranda C, Castillo C y P García

• Partidores dirigidos a zona específica del RNA ribosomal 28S de A. fumigatus y sonda Taqman (Challier y cols., 2004; J Clin Micro 42: 844-846).

• Se utiliza la plataforma de PCR Tiempo real de Applied Biosystems (StepOne) con una temperatura de annealing 57°C.

StepOne (Applied Biosystems)

Metodología PCR en tiempo real

Diagnóstico Clínico

Positivo Negativo Total

Q-PCR Positiva 15 0 15

Negativa 3 23 26

Total 18 23 41

LOD: 3,85 esporas/reacción Sensibilidad = 83% Especificidad = 100% VPP = 100% VPN = 88%

Resultados: parámetros analíticos y clínicos

GM

Positivo Negativo Total

Q-PCR Positiva 5 7 12

Negativa 2 23 25

Total 7 30 37

Concordancia (ʎ) = 5 + 23 / 37 = 76%

Índice kappa = ʎ - Pe / 1 - Pe = 0,76 – 0,61 / 1 – 0,61 = 0,38

Pe = 0,61 (proporción de concordancia por azar)

Grado de concordancia real: Discreto

Escala de valoración de kappa

según Landis y Koch:

Kappa grado de acuerdo

< 0,00 sin acuerdo

>0,00 - 0,20 insignificante

0,21 - 0,40 discreto

>0,41 - 0,60 moderado

0,61 - 0,80 sustancial

0,81 - 1,00 casi perfecto

Resultados concordancia GMN y PCR

Desempeño general

• Sensibilidad en sangre es mejor que biomarcadores (GM y BDG) para la misma muestra

White et al. JCM 2015;61(8):1293

Desempeño general

• La especificidad del PCR en LBA es mejor que la del GMN

White et al. JCM 2015;61(8):1293

Desempeño general

• Sensibilidad en sangre es mejor que biomarcadores (GM y BDG) para la misma muestra

White et al. JCM 2015;61(8):1293

Ventajas del uso de PCR

Uso combinado de marcadores y tratamiento empírico

Morrissey, et al. The lancet Infect Dis 2013; 13(6): 519

• Estudio prospectivo, randomizado, 240 pacientes • 2 grupos: con y sin uso de marcadores (PCR en sangre y GMN ) • Resultados: Disminución del número de tratamientos empíricos

Ventajas del uso de PCR: disminución del tiempo para el diagnóstico

Aguado et al. CID 2015;60(3):405

• Prospectivo, 200 pacientes • Uso de GMN solo vs PCR y GMN • Resultados: Uso de PCR permite un diagnóstico más precoz

Ventajas usos PCR junto a GMN: Buen VPN y sensibilidad

Morrissey, et al. The lancet Infect Dis 2013; 13(6): 519

Conclusiones

• Métodos tradicionales necesarios

• LFD Aspergillus: – Fácil realización – Desempeño similar a GMN? – Necesidad de establecer un punto de corte – No disponible aún – ¿sesgo de publicación?

• PCR

– Kits comerciales disponibles – Estandarización mejora su desempeño – Tendría utilidad en muestras de suero/sangre – El uso combinado de GMN junto a PCR demuestra una buena

sensibilidad con un alto VPN pero no está definido su esquema de uso