Novas Abordagens para a Purifica£§££o de Plasm£­deos em ... Universidade da Beira Interior Novas Abordagens

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  • Universidade da Beira Interior

    Novas Abordagens para a Purificação de Plasmídeos em

    Sistemas de Duas Fases Aquosas

    Andreia Daniela da Silva Oliveira

    Covilhã

    2009

  • UNIVERSIDADE DA BEIRA INTERIOR

    Novas Abordagens para a Purificação de Plasmídeos em

    Sistemas de Duas Fases Aquosas

    Andreia Daniela da Silva Oliveira

    Dissertação apresentada à Universidade da Beira Interior para obtenção do

    grau de Mestre em Bioquímica

    Orientadores:

    Professora Doutora Cândida Ascensão Teixeira Tomaz

    Centro de Investigação das Ciências da Saúde da Universidade da Beira

    Interior

    Professor Doutor João Carlos Ramos Nunes Marcos

    Departamento de Química da Universidade do Minho

  • Agradecimentos

    AAGGRRAADDEECCII MM EENNTTOOSS

    Queria agradecer aos meus orientadores Prof. Doutora Cândida Tomaz da

    Universidade da Beira Interior, pela disponibilidade e incentivo dados, e Prof. Doutor

    João Carlos Marcos da Universidade do Minho, por toda a ajuda, explicações e

    conselhos dados no decorrer do trabalho.

    Ao Prof. Doutor José Alberto Martins e ao Prof. Doutor António Gil Fortes pela

    ajuda nas experiências realizadas e na interpretação de resultados.

    Aos meus colegas de laboratório da Universidade do Minho por me terem

    recebido com os braços abertos, por toda a ajuda de laboratório oferecida, pela simpatia

    e apoio dado, e principalmente por me terem aturado durante meses.

    Aos meus amigos de muito longe que me ouviram, apoiaram e incentivaram

    sempre que precisei.

    À minha família por todo o apoio, incentivo, paciência, e compreensão que

    demonstraram.

    Andreia OliveiraAndreia OliveiraAndreia OliveiraAndreia Oliveira

  • Índice

    I

    ÍÍ NNDDII CCEE

    Índice de Figuras………………………………………………………………………VII

    Índice de Tabelas……………………………………….………………………………XI

    Abreviaturas……………………………………………………………………………...1

    Resumo………………………………………………………….……………………….3

    Abstract………………………………………………………………………………….5

    1. Introdução…………………………………………………………………………….7

    1.1. Terapia Génica………………………………………………………………………9

    1.1.1. Tipos de Vectores Utilizados na Terapia Génica………………………….9

    1.1.2. DNA plasmídico como Vector na Terapia Génica………………………10

    1.1.3. Optimização da Produção de Plasmídeos em Larga Escala……………..12

    1.2. Purificação do DNA Plasmídico…………………………………………………..12

    1.2.1. Processos de Purificação de DNA Plasmídico…………………………..12

    1.2.2. Recuperação Celular……………………………………………………..13

    1.2.3. Lise Celular, Clarificação e Concentração………………………………14

    1.2.4. Purificação Final…………………………………………………………15

    1.2.5. Processos Cromatográficos………………………………………………15

    1.3. Sistemas de Duas Fases Aquosas………………………………………………….18

    1.3.1. Estratégias Práticas para o Desenvolvimento de Processos de Recuperação

    Primária usando SDFA…………………………………………………………….…...21

    1.3.1.1. Caracterização Físico-Química do Soluto……………………………..21

    1.3.1.2. Selecção do Tipo de SDFA……………………………………………22

    1.3.1.3. Diagrama de Fases……………………………………………………..25

    1.3.1.4. Selecção dos Parâmetros do Sistema…………………………………..26

    1.3.1.5. Influência dos Parâmetros do Sistema na Recuperação/Purificação do

    Produto…………………………………………………………………………………27

    1.3.2. Integração do Processo de SDFA………………………………………..28

    1.3.3. Aplicações dos Sistemas de Duas Fases Aquosas……………………….30

    1.3.4. Recuperação de Material Genético com SDFA………………………….31

    1.3.5. Ligandos de Afinidade do pDNA para Sistemas de Duas Fases

    Aquosas………………………………………………………………………………...33

    1.3.5.1. Berenil como Ligando de Afinidade para o DNA……………….…….33

  • Índice

    II

    2. Objectivo…….………………………………………………………………………35

    3. Material e Métodos……………………………………….………………………….39

    3.1. Reagentes…………………………………………………………………………..41

    3.1.1. Plasmídeo pVAX1LacZ………………………………………………….41

    3.1.2. Meios de Cultura…………………………………………………………41

    3.1.3. Lise Alcalina e Purificação de Plasmídeos………………………………41

    3.1.4. Electroforese em Gel de Agarose………………………………………..42

    3.1.5. Determinação de RNA por Fluorescência……………………………….42

    3.1.6. Método do DNS………………………………………………………….43

    3.1.7. Purificação do Clorofórmio……………………………………………...43

    3.1.8. Outros Reagentes………………………………………………………...43

    3.2. Equipamento……………………………………………………………………….46

    3.3. Métodos……………………………………………………………………………47

    3.3.1. Construção do Banco de Células e Cultura de Bactéria…………………47

    3.3.2. Lise Alcalina……………………………………………………………..48

    3.3.3. Purificação do Plasmídeo………………………………………………...49

    3.3.4. Determinação da Concentração de DNA Plasmídico……………………50

    3.3.5. Grau de Pureza do DNA plasmídico…………………………………….50

    3.3.6. Electroforese em Gel de Agarose………………………………………..50

    3.3.7. Determinação das Binodais……………………………………………...51

    3.3.8. Sistemas de Duas Fases Aquosas………………………………………...51

    3.3.9. Determinação da Concentração de PEG 3350 nos Sistemas pelo Índice de

    Refracção……………………………………………………………………….52

    3.3.10. Determinação da Concentração de Reppal nos Sistemas pelo Método do

    DNS…………………………………………………………………………….53

    3.3.11. Determinação da Concentração de Reppal nos Sistemas pela Rotação

    Óptica…………………………………………………………………………...55

    3.3.12. Método de Bradford para Determinação da Concentração de Proteína nos

    Sistemas………………………………………………………………………...56

    3.3.13. Determinação da Concentração de RNA nos Sistemas por

    Fluorescência…………………………………………………………………...56

    3.3.14. Determinação da Concentração de pDNA nos Sistemas por

    Fluorescência…………………………………………………………………...58

  • Índice

    III

    3.3.15. Determinação da Concentração de pDNA nos Sistemas por

    HPLC…………………………………………………………………………...59

    3.3.16. Reacção do PEG 2000 activado com o Berenil………………………...60

    3.3.16.1. Activação do PEG 2000………………………………………………60

    3.3.16.2. Reacção do PEG 2000 activado com o Berenil………………………60

    3.3.17. Reacção do PEG-Epóxido com o Berenil na presença de Carbonato de

    Sódio 1M………………………………………………………………………..61

    3.3.17.1. Modificação do PEG 2000……………………………………………61

    3.3.17.2. Reacção do PEG-Epóxido com o Berenil…………………………….62

    3.3.18. Reacção do PEG-Epóxido com o Berenil na presença de Tampão Fosfato

    10 mM pH 5.56…………………………………………………………………62

    4. Resultados e Discussão………….…………………………………………………...63

    4.1. Cultura de Células…………………………………………………