Nová mutace v genu Nová mutace v genu ATP8B1/FIC1ATP8B1/FIC1 u nemocného s benigní rekurentní u nemocného s benigní rekurentní

intrahepatální cholestázouintrahepatální cholestázou

Jirsa M., Budišová L., Taimr P., Cebecauerová D., Dvořáková L., Hřebíček M.,

Brodanová M., Vítek L., Wurm P., Hůlek P.

Podpořeno grantem IGA MZ ČR reg.č. NM/ 7510-3

Benigní rekurentní intrahepatální cholestáza Benigní rekurentní intrahepatální cholestáza (BRIC, syndrom Summerskill- Walsheův)(BRIC, syndrom Summerskill- Walsheův)

• Geneticky podmíněná intrahepatální cholestáza • Ataky žloutenky provázené úporným svěděním • Manifestace obvykle do konce 2. dekády, trvání ataky

týdny až řadu měsíců, počet atak 1 až 30 za život• Laboratorně hyperbilirubinémie, zvýšená aktivita ALP a

koncentrace sérových žlučových kyselin• Normální S-GMT a cholesterol • Prognóza většinou dobrá, asi 6% progreduje v cirhózu

Protein ATP8B1/FIC1Protein ATP8B1/FIC1

Exprimovaný v apikální membráně hepatocytů,cholangiocytů, enterocytů a acinárních buněkpankreatu, nízká exprese v řadě dalších tkání

Funkce neznámá, hypotézy:flipáza membránových fosfolipidůtransportér hydrofobních žlučových kyseliiontový kanál

Gen Gen ATP8B1/FIC1ATP8B1/FIC1

• je lokalizovaný na 18q21, zaujímá 98kb• sestává z 27 exonů• kóduje ATPasu o MW 140 kDa

mutace exon důsledek zdroj

T1982C 17 I661T Bull 1998

2384del9 20 795delGNR Bull 1998

Splice site 24 Skipped exon van Ooteghem 2002

Mutace v genu Mutace v genu ATP8B1/FIC1 ATP8B1/FIC1 asociované s BRICasociované s BRIC

Pacient M.K. – anamnézaPacient M.K. – anamnéza

RA: negativní

• 1972 protrahovaná novorozenecká žloutenka• 1973 žloutenka po varicele, závěr nejasný, léčba kortikoidy• 1975 dvouměsíční ataka žloutenky• 1976 roční ataka, chir. revize žluč. cest bez patol. nálezu• 1990 po sinusitidě další ataka, vyloučena IHE, normální ERCP,

závěr nejasný, opět léčen kortikoidy • 1990-98 3x jaterní biopsie• 1998 další ataka, hosp. na Ústavu Klin. Imunologie LFHK

OA, NO:

Pacient M.K. – laboratorní nálezy, USG a ERCPPacient M.K. – laboratorní nálezy, USG a ERCP

• FW 50/86

• KO: anémie, leuko 12

• Hyperbilirubinémie, ALP 14,4 kat/l, celk. žluč. kyseliny 220 mol/l

• GMT a cholesterol opakovaně normální

• Fe, transferin, Cu, ceruloplasmin, alfa1-AT v normě

• Imunologická vyšetření v normě

• USG jater a žluč. cest bez patol. nálezu

• ERCP bez patol. nálezu

• 4. jaterní biopsie: intrahepatální cholestáza bez známek přestavby

Určení sekvence Určení sekvence ATP8B1/FIC1ATP8B1/FIC1zz genomové DNA genomové DNA

Izolace genomové DNA z periferních leukocytů

PCR amplifikace jednotlivých exonů

Agarosová elektroforéza

Izolace produktů z gelu

Sekvenační PCR s univerzálními značenými primery

Sekvenování

M.K. – heterozygotní bodová mutace M.K. – heterozygotní bodová mutace v 17. exonu v 17. exonu ATP8B1ATP8B1

AGAAGTCAAAGGAACATCB ases 240241242243244245246247248249250251252253254255256

T1982T+C

ę

M.K. kontrola

...GCTACAAGGAAATTGAAGAAAAAGAATTTACA...

...CGATGTTCCTTTAACTTCTTTTTCTTAAATGT...

Tsp509ITsp509I

95 bp 14 bp

M.K. – heterozygotní delece ve 24. exonu M.K. – heterozygotní delece ve 24. exonu ATP8B1ATP8B1

G C A T G G G G W C M T M R C A K C T GB ases188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205206

Mutovaná alela: G G G G A C A T C G A T G ... Normální alela : G G G G T C C T A A C A T ...

del3122TCCTA

ę

...CTTGTTGCATGGGGTCCTAACATCGATGATC...

...GAACAACGTACCCCAGGATTGTAGCTACTAG...

M.K. kontrola

EcoO109I

715 bp 220 bp

Vyšetření rodinyVyšetření rodiny

Restrikční analýza delece v 24. exonuRestrikční analýza mutace v 17. exonu

MK

PeK PaK PV

Ověření sekvence exonu 24 genu Ověření sekvence exonu 24 genu ATP8B1/FIC1 zATP8B1/FIC1 z klonovaného fragmentu DNA klonovaného fragmentu DNA

PCR amplifikace exonu 24 z genomové DNA

Agarosová elektroforéza, izolace produktu

ligace do vektoru pCR2.1-TOPO (Invitrogen)

Transformace buněk TOP10 (Invitrogen)

Kultivace transformovaných buněk, selekce klonů, izolace plasmidů

Sekvenační PCR s univerzálními značenými primery

Sekvenování

M.K. – sekvence mutované klonované alelyM.K. – sekvence mutované klonované alely24. exonu genu 24. exonu genu ATP8B1ATP8B1

T G G G G A C A T C G A T G T T G A T G T T A G G A C A T C G A T G ABases230 235 240 245 250 255 260

3117 TGGGGTCCTAACATCGATGATCCTCTTCTTCATAC

3117 TGGGGTCCTAACATCGATGATCCTCTTCTTCATAC

3122

ę

TTGATGTTAGGACATCGATG

3131 (3136 normální sekvence)

ę

ACATCGATGTTGATGTTAGG

Potvrzení delečně - inzerční mutacePotvrzení delečně - inzerční mutacemetodou RFLPmetodou RFLP

...CTTGTTGCATGGGGTCCTA ACATCGATGATC...

...GAACAACGTACCCCAGGAT TGTAGCTACTAG...

EcoO109I202 bp 167 bp

...CTTGTTGCATGGGGACATCGATGTTGATGTTAGGACATCGATGATC...

...GAACAACGTACCCCTGTAGCTACAACTACAATCCTGTAGCTACTAG...

Bsp143I

Bsp143I

167 bp233 bp

16 bp

Závěr IZávěr I

1. Fenotyp choroby je u studovaného nemocného podmíněn dvěma různými mutacemi v genu ATP8B1/FIC1

2. Bodová mutace T1982C (I661T) je známá mutace asociovaná s BRIC bez progrese jaterního onemocnění

3. Mutace v pozici 3122 je dosud neznámá delečně - inzerční mutace, jejímž důsledkem je záměna dvou hydrofobních aminokyselin 1041 Val-Leu uprostřed 7. membránové domény proteinu ATP8B1/FIC1 za Asp--Ile-Asp--Val-Asp--Val-Arg+ vedoucí pravděpodobně k chybnému vložení proteinu do buněčné membrány a tím k narušení jeho funkce

Závěr IIZávěr II

4. Studovaný nemocný je prvním případem složeného heterozygota s BRIC

5. Mutace nalezená v exonu 24 je novou v pořadí čtvrtou mutací nalezenou u pacienta s tímto onemocněním

6. Prognóza pacienta M.K. je vzhledem k heterozygotnímu stavu pro mutaci T1982C (I661T) pravděpodobně příznivá

?Máte v péči nemocné s chronickou cholestázou či s konjugovanou hyperbilirubinémií nejasné etiologie?

Nabízíme spolupráci při jejich vyšetřování.

Kontakt: MUDr. Milan Jirsa, CSc. Laboratoř experimentální hepatologie IKEM e-mail: Milan.Jirsa@medicon.cz