Notwendigkeit von Tierversuchenin der biomedizinischen Forschung

Beispiel: KrebsforschungProf. Dr. M. Lohoff

Tierversuche verstehen

Warum Tierversuche?

1) Tiere werden eingesetzt, wenn man wissen muss, was in einem gesamten, lebenden Körper passiert, der viel komplexer ist, als die Summe seiner einzelnen Teile.

2) Es ist manchmal unmöglich, die Verwendung von lebenden Tieren in der Forschung durch alternative Methoden komplett zu ersetzen.

3) In-vitro-Verfahren und Computermodelle spielen eine wichtige Rolle zur Ergänzung von Daten aus Tiermodellen.

4) Tierexperimente sind Voraussetzung für entscheidende Fortschritte in der Therapie von Krankheiten. Tierversuche haben eine wichtige Rolle bei fast allen medizinischen Durchbrüchen im letzten Jahrzehnt gespielt.

5) Tierexperimente sind entscheidend, um den späteren Erfolg beim Menschen vorauszusagen. 6) Wir teilen 99% unserer Gene mit einer Maus, daher sind sie ein effektives Modell für den

menschlichen Körper.7) Deutschland gehört weltweit zu den Ländern mit den höchsten Standards im Bereich Tierschutz.8) Tierversuche dürfen nur nach Genehmigung durchgeführt werden. 9) Tierversuche sind auf ein notwendiges Minimum zu beschränken. Richtlinie „Drei Rs“ (reduction,

refinement and replacement“ ( Reduktion, Verfeinerung und Ersatz).

2

3

Beitrag von Tierversuchen zur Etablierung einer Therapie gegen schwarzen Hautkrebs

Epidermis

Dermis

Subcutaneoustissue

Schwarzer Hautkrebs (malignes Melanom)

4

• hochgradig bösartiger Tumor der Pigmentzellen

• streut früh Metastasen

• am häufigsten tödlich verlaufende Hautkrankheit

• weltweit stark steigende Anzahl an Neuerkrankungen

X

X

2001: Prognosefaktoren beim schwarzer Hautkrebs

• 2001- keine effektive Therapiemöglichkeit

5

• 20-40% der Patienten sterben innerhalb von 6 Monaten

• 40-60% der Patienten sterben innerhalb von 1 Jahr

Balch et al. Prognostic Factors Analysis of 17,600 Melanoma Patients: Validation of the American Joint Committee on Cancer Melanoma Staging System. J Clin Oncol. 2001, Vol 19, No 16, pp 3622-3634

X

X

Wie haben Mausexperimente geholfen eine effektivere Therapie zu etablieren?

6

PD-17

1992: Identifizierung und Charakterisierung des Gens für das Protein PD-1 in Mauszelllinien

8

1994: Identifizierung des Gens für menschliches PD-1

unter Zuhilfenahme der Information von Maus PD-1

AbstractTo determine the structure and chromosomal location of the human PD-1 gene, we screened a human T cell cDNA library by mouse PD-1 probe and isolated a cDNA coding for the human PD1-protein.

ZusammenfassungUm die Struktur und die chromosomale Lage des menschlichen PD-1-Gens zu bestimmen, wurde eine humane T-Zell-cDNA -Bibliothek mit der Maus PD-1–Sonde durchsucht und eine cDNA, die für das humane PD1-Protein kodiert, isoliert.

Ishida et al. Induced expression of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death. EMBO J. 1992 Vol 11, No. 11, pp 3887 – 3895

Shinohara et al. Structure and Chromosomal Localization of the Human PD-1 Gene (PDCD1). Genomics. 1994, Vol 23, pp 704-706

9

vereinfachte Darstellung

Immunzelle

PD-1 PD-1 Partnermolekül

Signal

Zudem wurde erforscht:

1999: Herstellung einer Maus ohne PD-1 Gen und daher ohne PD-1 Eiweiß

Fazit: PD-1 hat eine hemmende Funktion im Immunsystem

Eine Maus ohne PD-1 entwickelt Autoimmun-Erkrankungen(dabei greift das Immunsystem den eigenen Körper an)

10

Entscheidend: Dieses Ergebnis war nicht vorhersehbar. Nur dieses Mausmodell konnte die Entdeckung

ermöglichen.

Immun-zelle

PD-1

PD-1 PartnermolekülhemmendesSignal

vereinfachte Darstellung

Nishimura et al. Development of Lupus-like Autoimmune Diseases by Disruption of the PD-1 Gene Encoding an ITIM Motif-Carrying Immunoreceptor. Immunity. 1999, Vol 11, pp 141–151

2004: Antikörper, welche die Funktion von PD-1 hemmen, reduzieren die Metastasierung des Melanoms in Mäusen

Ergebnis:

weniger Lebermetastasen

Lebermetastasen Antikörper

gegen PD-1Kontroll-

AntikörperBehandlung mit:

Iwai et al. PD-1 blockade inhibits hematogenous spread of poorly immunogenic tumor cells by enhanced recruitment of effector T cells. Int Immunol. 2005, Vol 17, No 2, pp 133–144

Besondere Immunzellen zur Abwehr von Tumoren und Viren sind T-Zellen

12

T-Zelle

T-Zell-Rezeptor

Tumor-Zelle /virusinfizierte

Zelle

Antigen

Xvereinfachte Darstellung

Tötungssignal

Erkennung von Fremdmaterial (=Antigen) durch einen hochspezifischen Rezeptor.

Abtötung der erkannten Zelle.

2006: Entdeckung einer T-Zell-Population mit PD-1 auf ihrer Oberfläche bei einer chronischen Virusinfektion in Mäusen

13

PD1-PartnermolekülPD-1

T-Zelle

T-Zell-Rezeptor

Tumor-Zelle /virusinfizierte

Zelle

ausgebremste

vereinfachte Darstellung

hemmt

Barber et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 2006, Vol 439, No 7077, pp 682-687

Virus-Teil (=Antigen)

Das Tötungssignal wird verhindert.

T-ZelleVirusinfizierte

Zelle

2006: Entdeckung einer T-Zell-Population mit PD-1 auf ihrer Oberfläche bei einer chronischen Virusinfektion in Mäusen

14

PD1-PartnermolekülPD-1

vereinfachte Darstellung

Barber et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 2006, Vol 439, No 7077, pp 682-687

Die chronische Infektion wird geheilt!

Antikörper gegen PD-1eliminieren das

Hemmsignal

Neustart?Neustart!

Tötungssignal XAber diese Hemmung kann durch

einen Antikörper gegen PD-1 aufgehoben werden.

2012: Erste Anwendung von Antikörpern gegen PD-1 beim menschlichen Melanom

Klar messbare, aber eingeschränkte therapeutische Wirksamkeit

28% der Patienten reagieren

15

Topalian et al. Safety, Activity, and Immune Correlates of Anti-PD-1 Antibody in Cancer. N Engl J Med. 2012; Vol 366, No 26, pp 2443–2454

CTLA-416

1987: Identifizierung des Gens für Maus CTLA-4

17

1988: Identifizierung des Gens für Human CTLA-4

Brunet et al. A new member of the immunoglobulin superfamily - CTLA-4. Nature. 1987, Vol 328, pp 267 – 270

Dariavach et al. Human Ig superfamily CTLA-4 gene: chromosomal localization and identity of protein sequence between murine and human CTLA-4 cytoplasmic domains. Eur. J. Immunol. 1988, Vol18, pp 1901-1905

unter Zuhilfenahme der Information von Maus CTLA-4

AbstractWhereas the overall homology between the human and murine CTLA-4 proteins is 76%, there is, remarkably, a complete identity of their cytoplasmicdomains. This complete interspecies conservation comes in support of an important role for this domain in CTLA-4 function.

ZusammenfassungWährend die Gesamthomologie zwischen den menschlichen und murinen CTLA-4 Proteinen 76% beträgt, sind die cytoplasmatischen Domänen, be-merkenswerterweise, komplett identisch. Diese vollkommene artenübergreifende Konservierung weist auf eine wichtige Rolle dieser Domäne in der CTLA-4 Funktion hin.

18

vereinfachte Darstellung

Immunzelle

CTLA-4 CTLA-4Partnermolekül

Signal

Zudem wurde erforscht:

Entscheidend: Dieses Ergebnis war nicht vorhersehbar. Nur dieses Mausmodell konnte die Entdeckung

ermöglichen.

1995: Herstellung einer CTLA-4 Gen-defizienten Maus

19

vereinfachte Darstellung

Eine Maus ohne CTLA-4 entwickelt Autoimmun-Erkrankungen(dabei greift das Immunsystem den eigenen Körper an)

Fazit: CTLA-4 hat eine hemmende Funktion im Immunsystem

Immun-zelle

CTLA-4CTLA-4 Partnermolekülhemmendes

Signal

Waterhouse et al. Lmphoproliferative Disorders with Early Lethality in Mice Deficient in Ctla-4. Science. 1995, Vol 270, pp 985-988

20

Nebenbei 2014: Bestätigung von Autoimmunität bei Fehlen von CTLA-4 beim Menschen

Schubert et al. Autosomal dominant immune dysregulation syndrome in humans with CTLA4 mutations. Nat Med. 2014, Vol 20, No 12, 1410-6

1996: Blockade von CTLA-4 (durch Antikörper) verringert das Wachstum von Darmkrebs in Mäusen„Enthemmung“ des Immunsystems

21

Kontroll-Antikörper

Antikörper gegen CTLA-4

Tumorgröße max. 95mm2

Tumorgröße max. 30mm2

Leach et al. Enhancement of Antitumor Immunity by CTLA-4 Blockade. Science. 1996, Vol 271 No 5256, pp1734-6

2010 Erste Anwendung von anti-CTLA-4 beim menschlichen Melanom

Klar messbare, aber eingeschränkte therapeutische Wirksamkeit

22

mit Antikörper gegen CTLA-4Kontrolle: OHNE Antikörper gegen CTLA-4

Behandlung MIT Antikörpern gegen CTLA-4: 20% überleben

Behandlung OHNE Antikörper gegen CTLA-4: unter 10% überleben

Hodi et al. Improved Survival with Ipilimumab in Patients with Metastatic Melanoma. N Engl J Med. 2010, Vol 363, No 8, pp 711-23

2010: Erstmaliger gemeinsamer Einsatz von Antikörpern gegen CTLA-4 und PD-1 beim Melanom der Maus

23

Ohne Behandlung (keine Antikörper)0% überleben

Antikörper gegen CTLA-4ca. 10 % überleben

Antikörper gegen PD-1ca. 25% überleben

Antikörper gegen PD-1 & CTLA-4ca. 50% überleben

Curran et al. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. PNAS. 2010, Vol 107, No 9, pp 4275–4280

24

Jede Kurve zeigt die Tumorgröße bei einem Patienten.

2013: Erstmaliger Einsatz von Antikörpern gegen CTLA-4 UND PD-1 beim Melanom des Menschen

Ergebnis:Ansprechrate: 53% Tumorreduktion: > 80%

Wolchok et al. Nivolumab plus Ipilimumab in Advanced Melanoma. N Engl J Med. 2013, Vol 369 No 2, pp 122-33

Die Krebs-Immuntherapie ist der wissenschaftliche Durchbruch des Jahres

2013

Image: © Valerie Altounian/Science

• mehrere unabhängige Bestätigungen im Melanom

• Freigabe der Antikörper Erwerb und Einsatz ohne Studie möglich

• Rückkopplung von Dermatologen in großen Kliniken: Die Antikörper helfen

26

Seitdem:

2015: Erfolg beim (sonst tödlichen) Rezidiv von Lymphknotenkrebs durch anti-PD-1

27

Ergebnis:87% der Patienten sprechen auf die Behandlung an.

Ansell et al. PD-1 Blockade with Nivolumab in Relapsed or Refractory Hodgkin´s Lymphoma. N Engl J Med. 2015, Vol 4, pp 311-9

Aber beim Melanom reagieren die Hälfte der Patienten immer noch nicht!

28

Weitere Tierversuche oder nicht?

InhaltFolie 2Gründe für Notwendigkeit von Tierversuchen

Folie 4-5 schwarzer Hautkrebs (Melanom) und die geringe Überlebenszeit von Patienten im Stadium IV dieser Krankheit

Folien 8 Informationen zur Entdeckung des Eiweißmoleküls PD-1; zuerst im Mausmodell, danach beim Menschen

Folie 9-10 PD-1 Funktion: Hemmung des Immunsystems; Mausmodell ohne PD-1 resultiert in Autoimmun-Erkrankungen

Folie 11 Blockade von PD-1 mit anti-PD-1 Antikörpern im Mausmodell schränkt Metastasierung des Melanoms ein

Folie 12Funktion von T-Zellen (besondere Immunzellen zur Abwehr von Tumoren und Viren.

Folien 13,14 Mäuse mit chronischer Virusinfektion besitzen T-Zellen (wehren normalerweise das Virus ab) mit PD-1. PD-1 unterdrückt die T-Zell Funktion. Blockiert man PD-1 durch Antikörper werden diese T-Zellen wieder aggressiv und töten das Virus ab. Die Krankheit wird geheilt.

29

Folie 15 Messbare, aber eingeschränkte Wirksamkeit von anti-PD-1 beim menschlichen Melanom

Folien 17-19 vergleichbare Daten zu den Folien 8-10 für das CTLA-4 Eiweißmolekül mit ähnlich immun-unterdrückender Funktion wie PD-1

Folie 21 Blockade von CTLA-4 führt zu verringertem Tumorwachstum im Darmkrebs Mausmodell

Folie 22 Messbare, aber eingeschränkte Wirksamkeit von anti-CTLA-4 Antikörpern beim menschlichen Melanom

Folie 23 50% der Mäuse mit Melanom überleben, wenn PD-1 PLUS CTLA-4 gleichzeitig blockiert werden

Folien 24zeigen denselben positiven Effekt beim Menschen im Endstadium IV des Melanoms

Folien 30Quellenangaben mit Verlinkung

Folien 30Quellenangaben ohne Verlinkung

Quellenangaben

30

Folie 5:Balch et al. Prognostic Factors Analysis of 17,600 Melanoma Patients: Validation of the American Joint Committee on Cancer Melanoma Staging System. J Clin Oncol. 2001, Vol 19, No 16, pp 3622-3634

Folie 8: Ishida et al. Induced expression of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death. EMBO J. 1992 Vol 11, No. 11, pp 3887 – 3895

Folie 8: Shinohara et al. Structure and Chromosomal Localization of the Human PD-1 Gene (PDCD1). Genomics. 1994, Vol 23, pp 704-706

Folie 10: Nishimura et al. Development of Lupus-like Autoimmune Diseases by Disruption of the PD-1 Gene Encoding an ITIM Motif-Carrying Immunoreceptor. Immunity. 1999, Vol 11, pp 141–151

Folie 11: Iwai et al. PD-1 blockade inhibits hematogenous spread of poorly immunogenic tumor cells by enhanced recruitment of effector T cells. Int Immunol. 2005, Vol 17, No 2, pp 133–144

Folie 13,14: Barber et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 2006, Vol 439, No 7077, pp 682-687

Folie 15: Topalian et al. Safety, Activity, and Immune Correlates of Anti-PD-1 Antibody in Cancer. N Engl J Med. 2012; Vol 366, No 26, pp 2443–2454

Folie 17: Brunet et al. A new member of the immunoglobulin superfamily - CTLA-4. Nature. 1987, Vol 328, pp 267 – 270

Folie 17: Dariavach et al. Human Ig superfamily CTLA-4 gene: chromosomal localization and identity of protein sequence between murine and human CTLA-4 cytoplasmic domains. Eur. J. Immunol. 1988, Vol18, pp 1901-1905

Folie 19: Waterhouse et al. Lmphoproliferative Disorders with Early Lethality in Mice Deficient in Ctla-4. Science. 1995, Vol 270, pp 985-988

Folie 20: Schubert et al. Autosomal dominant immune dysregulation syndrome in humans with CTLA4 mutations. Nat Med. 2014, Vol 20, No 12, 1410-6

Folie 21: Leach et al. Enhancement of Antitumor Immunity by CTLA-4 Blockade. Science. 1996, Vol 271 No 5256, pp1734-6

Folie 22: Hodi et al. Improved Survival with Ipilimumab in Patients with Metastatic Melanoma. N Engl J Med. 2010, Vol 363, No 8, pp 711-23

Folie 23: Curran et al. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. PNAS. 2010, Vol 107, No 9, pp 4275–4280

Folie 24: Wolchok et al. Nivolumab plus Ipilimumab in Advanced Melanoma. N Engl J Med. 2013, Vol 369 No 2, pp 122-33

Folie 27:Ansell et al. PD-1 Blocade with Nivolumab in Relapsed or Refractory Hodgkin´s Lymphoma. N Engl J Med. 2015, Vol 4, pp 311-9

Quellenangaben

31

Folie 5: Balch et al. Prognostic Factors Analysis of 17,600 Melanoma Patients: Validation of the American Joint Committee on Cancer Melanoma Staging System. J Clin Oncol. 2001, Vol 19, No 16, pp 3622-3634

Folie 8: Ishida et al. Induced expression of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death.EMBO J. 1992 Vol 11, No. 11, pp 3887 – 3895

Folie 8: Shinohara et al. Structure and Chromosomal Localization of the Human PD-1 Gene (PDCD1). Genomics. 1994, Vol 23, pp 704-706

Folie 10: Nishimura et al. Development of Lupus-like Autoimmune Diseases by Disruption of the PD-1 Gene Encoding an ITIM Motif-Carrying Immunoreceptor. Immunity. 1999, Vol 11, pp 141–151

Folie 11: Iwai et al. PD-1 blockade inhibits hematogenous spread of poorly immunogenic tumor cells by enhanced recruitment of effector T cells. Int Immunol. 2005, Vol 17, No 2, pp 133–144

Folie 13, 14: Barber et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 2006, Vol 439, No 7077, pp 682-687

Folie 15: Topalian et al. Safety, Activity, and Immune Correlates of Anti-PD-1 Antibody in Cancer. N Engl J Med. 2012; Vol 366, No 26, pp 2443–2454

Folie 17: Brunet et al. A new member of the immunoglobulin superfamily - CTLA-4. Nature. 1987, Vol 328, pp 267 – 270

Folie 17: Dariavach et al. Human Ig superfamily CTLA-4 gene: chromosomal localization and identity of protein sequence between murine and human CTLA-4 cytoplasmic domains. Eur. J. Immunol. 1988, Vol18, pp 1901-1905

Folie 19: Waterhouse et al. Lmphoproliferative Disorders with Early Lethality in Mice Deficient in Ctla-4. Science. 1995, Vol 270, pp 985-988

Folie 20: Schubert et al. Autosomal dominant immune dysregulation syndrome in humans with CTLA4 mutations. Nat Med. 2014, Vol 20, No 12, 1410-6

Folie 21: Leach et al. Enhancement of Antitumor Immunity by CTLA-4 Blockade. Science. 1996, Vol 271 No 5256, pp1734-6

Folie 22: Hodi et al. Improved Survival with Ipilimumab in Patients with Metastatic Melanoma. N Engl J Med. 2010, Vol 363, No 8, pp 711-23

Folie 23: Curran et al. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. PNAS. 2010, Vol 107, No 9, pp 4275–4280

Folie 24: Wolchok et al. Nivolumab plus Ipilimumab in Advanced Melanoma. N Engl J Med. 2013, Vol 369 No 2, pp 122-33

Folie 27: Ansell et al. PD-1 Blocade with Nivolumab in Relapsed or Refractory Hodgkin´s Lymphoma. N Engl J Med. 2015, Vol 4, pp 311-9