Ação do hormônio tireoidiano e de seu receptor sobre o promotor do

fator de necrose tumoral alfa

Nome: Fellipe Erick Campos Orientadora: Angélica Amorin Amato

Eixo hipotálamo-hipófise-tireoide

Tireoide

Hipófise

T4 + T3

CirculaçãoTecidos

Hipotálamo

Tecidos

• Desenvolvimento• Homeostase• Proliferação e diferenciação celular

Efeitos fisiológicos do hormônio tireoidiano

SNC

Temperatura corporal

Consumo de oxigênio

Frequência cardíaca

Metabolismo de nutrientes

Sistema Nervoso Central

Atividade de outros hormônios

SNCFunção

reprodutiva

Histonas desacetiladas

Histonas acetiladas

Transcrição

- T3

+ T3

Mecanismo de ação do hormônio tireoidiano

HIPOTIREOIDISMO

• Bradicardia

• Pele ressecada e fria

• Hipoglicemia

• Hipercolesterolemia

• Redução da taxa metabólica basal

HIPERTIREOIDISMO

• Taquicardia

• Pele quente e úmida

• Hiperglicemia

• Hipocolesterolemia

• Aumento da taxa metabólica basal

Deficiência x excesso de hormônio tireoidiano

• Hipotireoidismo franco e aparelho cardiovascular

– frequência e contratilidade cardíaca

– expressão de genes que codificam enzimas que regulam

contratilidade e relaxamento cardíaco

• Thyroid hormone and the cardiovascular system: from theory to practice. J Clin Endocrinol Metab 1994; 78:1026.

• Biochemical basis of thyroid hormone action in the heart. Am J Med 1990; 88:626.

Hipotireoidismo x doença cardiovascular

• Subclinical hypothyroidism is an independent risk factor for atherosclerosis and myocardial infarction in elderly women: the Rotterdam Study. Ann Intern Med 2000: 132:270.

• Risk for ischemic heart disease and all-cause mortality in subclinical hypothyroidism. J Clin Endocrinol Metab 2004; 89: 3365.

• Subclinical hypothyrodism is associated with a low-grade inflammation, increased triglyceride levels and predicts cardiovascular disease in males below 50 years. Clin Endocrinol (Oxf) 2004; 61:232.

• Impaired endothelium-dependent vasodilation in subclinical hypothyroidism: beneficial effect of levothyroxine therapy. J Clin Endocrinol Metab 2003; 88:3731

• Hipotireoidismo subclínico e aparelho cardiovascular

– incidência de doença aterosclerótica

– mortalidade cardiovascular

Hipotireoidismo x doença cardiovascular

• resistência vascular periférica piora de hipertensão arterial

sistêmica

• Hipercolesterolemia

• Hiperhomocisteinemia

Doença cardiovascular aterosclerótica x inflamação sistêmica

O hormônio tireoidiano e seu receptor poderiam influenciar o processo inflamatório?

Por que o hipotireoidismo aumenta o risco de doença cardiovascular?

Há outras condições que compartilham

alterações do eixo HHT e alterações

inflamatórias?

Síndrome do T3 baixo

• Função tireoidiana em doenças não tireoidianas– T3– TSH normal ou baixo

• Correlação T3 e marcadores inflamatórios

• Association between serum interleukin-6 and serum 3,5,3’-triiodothyronine in nonthyroidal illness. J Clin Endocrinol Metab 1993;77(6):1695–9.

• Relationship of the increased serum interleukin-6 concentration to changes of thyroid function in nonthyroidal illness. J Endocrinol Invest 1994;17:269–74.

• Role of cytokines in the pathogenesis of the euthyroid sick syndrome. Eur J Endocrinol 1998; 138:603–14.• Relating circulating thyroid hormone concentrations to serum interleukins-6 and -10 in association with

non-thyroidal illnesses including chronic renal insufficiency. BMC Endocr Disord 2008;8:1.

Insuficiência cardíaca

• Correlação negativa T3 x IL-6, TNF- e proteína C reativa

Controle T3L > 2 T3L < 2

TNF (pg/mL)

T3L

(pg/

mL)

P < 0,05, r = -0,14

• Relationship between triiodothyronine and proinflammatory cytokines in chronic heart failure. Biomedicine & Pharmacotherapy 2010; 64:165-169.

Doença renal crônica

• Função tireoidiana na doença renal crônica

– T3

– TSH normal, T3 reverso normal

• Correlação T3 x marcadores inflamatórios (IL-6, TFN-alfa)e sobrevida

• Clinical and biochemical implications of low thyroid hormone levels (total and free forms) in euthyroid patients with chronic kidney disease. J Intern Med 2007; 262:690–701.

• Low triiodothyronine: a new facet of inflammation in end-stage renal disease. J Am Soc Nephrol 2005; 16: 2789–2795.

• Low triiodothyronine and survival in end-stage renal disease. Kidney Int 2006; 70:523–528.

• Subclinical hypothyroidism is linked to micro-inflammation and predicts death in continuous ambulatory peritoneal dialysis. Nephrol Dial Transplant 2007; 22:538–544.

Hormônio tireoidiano x inflamação

T3 Inflamação

Relação causa – efeito?

Direcionalidade?

Receptores Nucleares

• O que são?

– Uma superfamília 48 genes 75 proteínas

– São complexos de sinalização que atuam de várias maneiras, modulando a ativação e a repressão de sinais.

Ligação ao DNA

Ligante

Transativação

Ligação ao ligante

A/B C D E F

Domínio amino - terminal

Dobradiça (Hinge)

Domínio carboxi - terminal

AF - 1 DBD LBD

Histonas desacetiladas

Histonas acetiladas

Transcrição

- T3

+ T3

Mecanismo de ação do hormônio tireoidiano

Modelo de estudo

• Fator de necrose tumoral alfa (TNF-)

Macrófagos e monócitos

Adipócitos, células mesangiais

Receptor de membrana

Inflamação sistêmica

Indução de apoptose e inibição de

tumorigênese

Inibição da replicação viral

Doenças humanas

Resistência insulínica, síndrome metabólica, doença cardiovascular aterosclerótica

Objetivo• Objetivo Geral:

– Estudar o efeito do T3 e de seu receptor sobre a atividade transcricional no promotor do gene do TNF-α e esclarecer os mecanismos moleculares envolvidos na regulação desse gene.

• Objetivos Específicos:– Estudar o efeito do T3 na regulação da atividade transcricional do receptor do hormônio

tireoidiano no promotor do gene do TNFα.

– Estudar o efeito das diferentes isoformas de TR (TRα e TRβ).– Avaliar a importância da interação direta de TR com o promotor do

TNFα.– Avaliar o efeito do T3 na síntese de proteína TNFα.

Construções de plasmídeos repórteres contendo promotor do TNF (inteiro ou fragmentos)

-125LUC

-82

TNF RE

LUC-1044

(-125/-82) 3X

+93

LUC

TK LUC

0

5

10

15

20

Veículo VeículoT3 100 nM T3 100 nM

TR TR

*

Taxa

de

ativ

ação

Receptor 1 mcg + (-1044)TNF-Luc 4 mcg

0

25

50

75

100

125

150

175

vetor vazio

TR alfa

TR beta

LBDTR beta

T3 100 mM + + + +- - - -

a

a

b b

a

a

c

a

Taxa

de

ativ

ação

Células U937

TR e (-1044) TNF-Luc

LUC

-1044 +93

Transfecção

• O que é?– Introdução de moléculas exógenas em células – DNA plasmidial

• Em geral, a transfecção é seguida pela expressão de um ou mais genes presentes no DNA introduzido– Ensaio de gene repórter

• Métodos– Precipitação do fosfato de cálcio– Lipossomos– Eletroporação

Ensaio Gene Repórter

• Pra que serve o ensaio?– Para estudar a expressão dos genes – Avaliando o efeito de uma seqüência regulatória de um determinado

gene

• O que podemos realizar com o ensaio?– Delimitar os elementos regulatórios– Avaliar os efeitos de agentes hormonais– Estudar impactos em mutações gênicas

Procedimento

Processos: Lavagem (PBS 1x); Tripsina (0,5%);DMEN inibir a Tripsina

Centrifugar: 5 min a 2000 rpm.

Procedimento

Pellet: célulasSobrenadante: meio

de cultura

1. Suspensão das células em solução tampão(PBS, cálcio, glicose)

Mistura da suspensão de células ao DNA plasmidial

Transferência da suspensão de células + DNA plasmidial para cuvetas de 0,4 cm

Eletroporação

DNA plasmidialTR

TRE-luciferase

+ 500 L suspensão de células

(10 x 106 células)

500 L /cuveta(10 x 106 células)

950 F e 0,3 kV

Ressuspensão das células eletroporadas em meio de cultura

Distribuição da suspensão de células em placas de 12 poços e tratamentos

1 mL/poço

Veículo T3 10-

5MT3 10-

6MT3 10-

7M

Avaliação da expressão do gene repórter

37oC e 5% CO2 24h

10 μL do lisado celular + 10 μL do substrato da enzima luciferase

Luminômetro

LUC

-1044 +93

Células U-937

Transfecção TRb e (-1044)TNFLuc 1:2

0

20

40

60

80

100

120

Veículo

TR (g)+ T3 100 nM

0,5 1,0 2,0 4,0 8,0

*

*** *

* p < 0,001 vs veículo

Taxa

de

ativ

ação

x v

eícu

lo (1

00%

)

LUC

-1044 +93

Células U-937

Células U-937

-125 LUC-82

TNF RE

LUC-1044

(-125/-82) 3X

+93

LUC

TK LUC

0

20

40

60

80

100

120

TR e -125 TNFLuc (1:2)

Veículo

T3 100 nM

+ + +

+ + +

pCMX

TR

TR*

*Ta

xa d

e at

ivaç

ão

Transfecção: TR 1 mcg, TNFRE-Luc 2 mcg

0

25

50

75

100

TR alfaTR beta

Veículo VeículoT3 100 nM T3 100 nM

Taxa

de

ativ

ação

Células U-937

-125 LUC-82

TNF RE

LUC-1044

(-125/-82) 3X

+93

LUCTK LUC

O TR interage diretamente com o promotor do TNF-?

• Ensaio de anisotropia de fluorescência

wtTNFRE(CACTACCGCTTCCTCCAGATGAGCTCATGGGTTTCTCCACCAAG)

DBD-TR+

Próximos passos…

• Ensaios de gene repórter com mutantes do TR– Papel da dimerização na repressão do promotor do TNF: L422R– Papel da superfície de interação com correpressores na repressão do

promotor do TNF: G345R e F451X.

• Avaliação da expressão do TNF em resposta ao tratamento com T3– Cultura de células: células mesangiais humanas

• Interação TR e promotor do TNF in vitro (gel shift)

L422R (Mutante do TR beta – Leucina 422 trocada por uma

Arginina) – diminuição da capacidade de dimerização

G345R (Mutante no domínio de Ligação ao Ligante – LBD –

Glicina 355 trocada por uma Arginina) – perda da afinidade

do TR ao T3, não afetando ligação de dímeros ao TREs.

F451X (Mutante TR beta – 10 ultimos aa apartir da

Fenilalanina 451, foram deletados – Hélice 12 foi

eliminado, superfície de ligação ao correpressor foi exposta. )

Obrigado!!!