P. 04 Genexus 次世代シーケンスシステムP. 07 TrueDesign Genome EditorP. 08 Platinum SuperFi II DNA PolymeraseP. 09 Expi293 GnTI- Expression System KitP. 10 TaqManアレイプレート（96ウェルタイプ）

P. 13 QuantStudioシリーズP. 14 再生医療等製品材料適格性確認書P. 15 Attune NxT Flow CytometerP. 16 SuperSignal West Atto Ultimate Sensitivity SubstrateP. 17 iBright FL1500 Imaging System（化学発光・蛍光撮影装置）

iBright CL1500 Imaging System（化学発光撮影装置）

2020 / March

No. 53

NEXT Interview

“がんに特異的な立体構造”を標的にした新たながん免疫治療法の開発へ多発性骨髄腫に特異的な活性型インテグリンβ7の同定と応用保仙直毅 氏（大阪大学大学院医学系研究科血液腫瘍内科学講座 教授）

Science, Products, and Informationサーモフィッシャーサイエンティフィック ライフサイエンス情報誌

ら、たっぷり食べて、たっぷり寝て、それからもう一度考えてみるようにアドバイスしています。大きなことを目指すからこそ、高い壁が立ちはだかるのは当然なのだから」と保仙氏は語り掛けます。

サインエンスへの感性を磨く

「医学部卒業後、内科学教授で免疫学の世界的権威だった岸本忠三先生に惹かれて内科へ入局しました。しかし自分自身が研究者になるつもりはなく、留学後は臨床に戻る予定でした。ところが留学先の研究室で、多くの優秀なPhD研究者との交流を通してサイエンスの面白さに目覚めました。生物の精緻な仕組みを解き明かそうとする彼らの情熱や考え方が新鮮で、ディスカッションやサイエンスに対する知的な会話が楽しくてしょうがなくなりました。幹細胞研究者だけでなく、発生研究者との交流も広がり、エレガントな研究、美しいサイエンスとは何かを自分なりに考えるようになりました。単に既存のシステムを利用するだけでなく、発見とは何かを自分に問いかけつつ、独自のアプローチ法を構築していく哲学が必要だと感じ、サインエンスを楽しむ感性を養いました。彼らとの交流は今も続いていますが、私は医師という立ち位置からサイエンスに向き合おうと思い帰国しました」と保仙氏は語ります。腫瘍特異的な「タンパク質の“かたち”」を標的とするがん免疫療法は、これまでの概念では到達しなかった発見の上に成り立っています。本物のサイエンスが新しい世界を拓き、力強い応用へつながっていきます。

インタビュアー： サーモフィッシャーサイエンティフィック 橋本裕子

Interview

がん特異的抗原の探索

保仙氏は、2007年に留学先のスタンフォード大学から帰国します。「造血幹細胞研究で世界的に著名なIrving Weissman博士のもとで、3年ほど白血病のがん幹細胞に特異的なマーカーを探索し、CD96を同定しました。帰国後は骨髄腫の抗体療法開発を目指し、網羅的な遺伝子発現解析からCD48分子が骨髄腫細胞に高発現していることを発見し、その抗体の臨床応用を製薬会社に委ねました」。しかし3年ほど経つと、網羅的な遺伝子探索法に行き詰まりを感じます。「網羅的解析は世界中で実施されており、研究費が潤沢であれば誰もが試せるアプローチ。小規模な私のグ

ループがその競争に参加しても新しい発見が続くとは思えなくなりました」と保仙氏。そこで独自のアプローチを一から考え抜きます。「抗原となるタンパク質はアミノ酸配列だけに規定されず、立体構造や翻訳後修飾、複合体形成など、特有の“かたち”で異なることがあり、正常細胞とがん細胞で同じとは限らない。タンパク質そのものを標的に探索してはどうか」。保仙氏は、それまでの研究をすべて中止し、研究室全員で骨髄腫に対するモノクローナル抗体作製を始めます。ヒト骨髄腫細胞株をマウスに免疫し、抗体の選別を通して腫瘍特異的な抗原を同定する戦略です。「常時10名ほどの学生と約3年間で10種類の細胞株から10,000クローンのモノクローナル

抗体を作製しました。マウスにヒト細胞を免疫するので多様な抗体ができてきますが、そこからヒトの正常な血球細胞に結合しないものを除くと500クローンが残りました。さらに骨髄腫の患者さんの検体を認識する抗体を選抜すると、残りは6クローン。発現クローニングを行い、MMG49がインテグリンβ7を認識する抗体だと突き止めました」。

MMG49が認識するエピトープとは?

「インテグリンβ7は正常なリンパ球にも発現しています。なぜこんなものが取れてきた

のか不思議で、ノックアウト細胞を作ったり、様々な方法で確認しましたが、やはり抗原はインテグリンβ7以外にはありえないとの結論に達しました。幸運なことに同じ大学の研究所に在籍する高木淳一教授がインテグリンの構造解析の専門家であり、共同研究を行ってMMG49が活性型インテグリンβ7を特異的に認識することが判明しました」と保仙氏は振り返ります。「細胞表面のインテグリンβ7は、不活性型では折り畳みナイフのように途中で折れ曲がっていますが、活性型になると刃が立ち上がり、刃の根元が露出します。MMG49のエピトープはその領域にあり、活性型にのみ結合する抗体だったのです」と続けます。そこで念願の抗体療法をマウスで調べることに。「期待に反して全く効果が見られませんでした。調べてみると、一般的な抗体薬の有効性は1細胞当たり1万から10万個のエピトープが必要ですが、骨髄腫細胞の活性型インテグリンβ7は多くても5千個程度だったのです」と保仙氏。「本当に残念でした。活性型タンパク質を特異的に認識する抗体を同定したという報告はできますが、治療へつながらないことが悔しかったのです」と話します。「どうしても諦めきれず、研究者間の噂で知った、CAR-T細胞療法を試してみることにしました。まだこの療法がヒト臨床試験で画期的な効果を示す論文発表の2年ほど

前のことです。方法論として発表済みの論文を参考に、キメラ分子を構築してT細胞に導入して腫瘍マウスに投与。1週間後に確認すると、CAR-T細胞療法の効果が歴然でした。CAR-T細胞療法を施したマウスから腫瘍が劇的に消失していたんです」と新たな治療法の可能性を見出した瞬間を語ります。「それからは私自身も付いていけないほどトントン拍子に臨床応用への準備が進んでいきました」。

高い壁の向こうに

「成功すれば、研究が順調に進んだように思われがちですが、そんなことはありません。学生たちと膨大な種類のモノクローナル抗体を効率よく処理していく方法を工夫したり、抗体作製というルーチン作業をモチベーションを維持しつつ継続する苦労もありました。そしていざ抗体の選別に取り掛かろうとした頃、本当にこの中に目指す抗体があるのか、とても不安な気持ちに襲われました。当時、研究者仲間から、このアプローチに対するネガティブな意見を言われたり、学生からもせっかく進学した大学院でルーチン作業に忙殺されることへの不満を漏らされたりしていました。激しく落ち込み、突発性難聴になるほどでした。これ以上研究を続けえても周りに迷惑をかけるだけなので研究者を辞めようと思い、大学院時代の指導教官で帰国後もお世話になっていた杉山治夫教授に相談しました。すると先生はその日のうちに食事に誘い、いろいろと励ましてくれました。それを聞いているうちに、もう一度研究を頑張ろうと思い直しました。たった一日だけでしたが、その日は私の研究人生の岐路だったと今でも思い返します」と保仙氏は振り返ります。そして「たぶん誰もがそんな風に落ち込む日があるはず。独自のアプローチで新たな発見を目指していけば、信じるものは自分だけ。その自信が少しでも揺らぐと、どんどん悪い方向へ向かっていきます。この経験から、若い研究者が落ち込んでいた

2017年11月、大阪大学の保仙直毅氏らの研究グループは、多発性骨髄腫（以下、骨髄腫）細胞の表面でインテグリンβ7が恒常的に活性化していること、さらにこの構造を標的とするCAR-T細胞が骨髄腫特異的細胞傷害を持つことをマウスで確認したことを発表しました※。保仙氏は、この研究の要となる活性型インテグリンβ7に対する特異的抗体について次のように語ります。「骨髄腫細胞株に対するモノクローナル抗体10,000クローンを作製し、そこから正常な血球細胞には反応せず、骨髄腫と特異的に反応する抗体としてMMG49を精選しました。正常なリンパ球細胞にもインテグリンβ7は発現しますが、MMG49は構造変化を識別でき、骨髄腫細胞を特異的に認識します」。この研究から、がんに特異的な「タンパク質の“かたち”」を標的とするがん免疫療法の可能性が初めて示され、ヒトへの臨床応用へ向けた準備が進んでいます。※The activated conformation of integrin β7 is a novel multiple myeloma-specific target for CAR T cell therapy. Hosen,N. et al. Nat Med. 2017 Dec;23（12）:1436-1443　

保仙直毅（ほせんなおき）

1994年大阪大学 医学部医学科卒業後、大阪大学医学部附属病院、大阪逓信病院、大阪府立成人病センターにて研修医やレジデント（血液内科）などを務める。2002年大阪大学で博士取得（医学博士）、03年米国スタンフォード大学医学部病理学（ Irving Weissman研究室）へ留学、07年大阪大学大学院医学系研究科特任研究員、准教授、寄附講座准教授などを経て、20年1月より現職。

〝がんに特異的な立体構造〞を標的にした

新たながん免疫治療法の開発へ

多発性骨髄腫に特異的な活性型インテグリンβ7の同定と応用

保仙直毅

氏

大阪大学大学院医学系研究科血液腫瘍内科学講座

教授

02 03

ワークフローを自動化── NGSの新しい世界Genexus 次世代シーケンスシステム

● 検体からレポートまでのワークフローを自動化し、1日で結果を提供*● 完全自動化 ： ライブラリ調製、シーケンシング、解析のすべてを一台の装置上で 実施。セットアップだけのシンプルなワークフローを実現。● 迅速なターンアラウンド ： 核酸からレポートまでが、最短14時間。● 少数サンプルへの対応 ： 装置内で試薬とチップを一定期間保管できるので、　1回のセットアップで最大4ラン実施可能。● 柔軟性 ： 1回のランで、最大4アッセイ同時解析（1アッセイ/ レーン）可能● 高い効率 ： 最大32ライブラリ/ラン　→ 32 single-pool | 16 two-pool | 8 four-pool

P O I N T

NEW!

Genexus 次世代シーケンスシステムがもたらす革新Ion Torrent™ Genexus™ システムは、検体からレポートまでのワークフローを自動化し、ユーザー操作はわずか2回。結果を1日で提供する*、初めての次世代シーケンシング（NGS）ソリューションです。

Genexus システムは精製システムとシーケンサを統合し、一つのソフトウェアシステムで、核酸抽出、精製、ライブラリ調製、シーケンスおよび解析結果レポートまでを柔軟に組み合わせて自動化できます*。これにより必要となる機器や消耗品数が減り、より技術的なアプリケーションに時間をかけられ、ラボ全体の効率が向上します。

個々のサンプルを優れた費用対効果で解析使用目的により、一定期間中に解析するサンプル数や種類の予測が困難で、コストを抑えるために一定数のサンプルをまとめて処理する場合があります。しかしこれによりターンアラウンドタイムが遅延することで一貫性にマイナスの影響をもたらす可能性があります。Genexus システム用の新しいIon Torrent™ GX5™ Chipは、多様なサンプル数の解析に対応する4レーンデザインです。異なるランでレーンを個別に使用したり、最大4レーンを同時処理したりと柔軟に使えるため、優れた費用対効果を発揮します。このチップは、各ランあたり、最高

32サンプルをシングルプールでライブラリ調製し、マルチプレックスで解析できます。

*検体からレポートまでのワークフローは、2020年にIon Torrent™ Genexus™ Purification Systemと統合されたレポート機能が追加された後、利用可能になります。ここに記載されている内容は、未完成の製品に関連するものも含まれており、予告なしに変更される可能性があります。

最新情報と詳細はこちらから → www.thermofisher.com/Genexus

製品名 サイズ 製品番号 価格

Genexus Integrated Sequencer 1式 Ion Genexus-S2 お問い合わせ

GX5 Chip and Genexus Coupler 2 ラン A40269 ¥196,000

Genexus GX5 Starter Pack-AS 32 反応 A40279 ¥1,255,800

Genexus GX5 Starter Pack-HD 32 反応 A40280 ¥1,288,000

2回のタッチポイント、10分間のハンズオンタイム

10回のタッチポイント、90分間のハンズオンタイム

>90

合計ターンアラウンドタイム：1日

合計ターンアラウンドタイム：6-7日

Ion TorrentGenexus System*

他社システム

10分

分

ライブラリ調製、精製、シーケンシング、変異解析および

結果レポートの自動化

核酸抽出、精製、

および定量の自動化

Ion Torrent Genexus精製システム

Ion Torrent Genexus Integrated

シーケンサ

Ion Torrent Genexus ソフトウェア

・血漿・FFPE由来の溶解物

検体からレポートまでを自動化、 　使いやすさを体験できます*。

GX5 Chip

GX5 Chipでは、1レーンあたり12M–15M、1枚あたり48M–60Mのシーケンスリードを取得できます。

NEW!

0504

ゲノム編集のノックインデザインをわずか数分で!TrueDesign Genome Editor

Invitrogen™ TrueDesign™ Genome Editorは、正確で成功率が高いノックインゲノム編集実験のための無料デザインツールです。直観的なインターフェースと多様なニーズに対応する柔軟性を兼ね備え、簡単な3ステップで、次のことを行えます。

● ノックインデザインを数分間で生成できます。● CRISPR-Cas9またはTALENを使用して、ヒトのどの遺伝子についても最大30塩基を編集し、SNPの置換やアミノ酸の変更を行えます。● GFP、RFPまたはルシフェラーゼタグを追加して当社のInvitrogen™ TrueTag™

Donor DNA Kitsに使用するアダプタープライマーを作製し、クローニングを行うことなくドナーテンプレートを生成できます。● ノックインに必要なgRNA配列やドナーテンプレート配列を含むドキュメントをダウンロードできます。

P O I N T

製品名 サイズ 製品番号 価格

TrueCut Cas9 Protein v2（1 mg/mL） 10 µg A36496 ¥9,100

TrueCut Cas9 Protein v2（5 mg/mL） 100 µg A36498 ¥24,400

TrueGuide sgRNA, custom※1 3 nmol A35513 ¥38,200

TrueTag Donor DNA Kit（GFP, RFP, Luciferase） 10 反応 タグにより異なります ¥81,800

GeneArt Genomic Cleavage Detection Kit 20 反応 A24372 ¥51,900

Donor DNA（Invitrogen Custom Primer）※1 25 nmol - ¥5,000※2

※1 webオーダー品です。※2 Donor DNAはデザインによって塩基数および価格が異なります。これは100塩基の場合の価格例です。

最新情報と詳細はこちらから → www.thermofisher.com/TrueDesign

ノックインデザインを3ステップで完了──簡単な操作で、ゲノム編集のノックインをデザイン

デザインの決定専用にデザインしたDonor DNAと、ノックインのための CRSIPR-Cas9 gRNA またはTALエフェクターヌクレアーゼの配列を生成します。オフターゲット情報、シークエンス用プライマー、切断効率確認用プライマーなどを含む総合的なドキュメントをダウンロードできます。

ターゲット配列を検索遺伝子名、配列、遺伝子座で簡単にヒトゲノム中の配列を検索できます。

編集内容の入力直観的なインターフェースによりDNAおよびアミノ酸の配列を確認しながら遺伝子を編集できます。

Step 1

Step 2

Step 3

東北メディカル・メガバンク計画

東北メディカル・メガバンク（TMM）計画として、大規模ゲノムコホート調査と複合バイオバンクの構築を行っています。ゲノムコホート調査では多くの健常人の多種多様なデータ等を収集して何年にもわたって追跡調査し、ここで得られる試料、情報を複合バイオバンクで体系的に収集・保管・分配します。大規模コホートである地域住民コホートと三世代コホートには、すでに合計15万人以上の方が登録し、ベースライン調査を終えています。本計画では、コホート調査参加者数千人の検体を全ゲノム解析して日本人の一塩基バリアント（SNV）情報をまとめたリファレンスパネルを作製します。それを基に日本人に適したSNPアレイ開発と、遺伝子型インピュテーション技術とを組み合わせて全ゲノム補完解析を大規模に実施していきます。さらに、家系情報付きの三世代コホート検体の解析や種々の関連解析を通して、遺伝子-環境相互作用を解明していく予定です。

世界における大規模アレイ解析状況

難病やがんに関わる稀な、もしくは低頻度バリアントの解析は次世代シークエンシングが一般的ですが、多因子疾患では個々の影響が小さな多数のコモンバリアントが関係する

ため、SNPアレイ解析が有効です。民族特異的なアレイ開発では、ハプロタイプを考慮して適切にタグSNPを選択することで、数十万のタグSNP解析データから連鎖不平衡を利用した遺伝子型インピュテーションにより、数千万規模のSNP情報を補完するアプローチが取られています。英国のUK Biobankを始めオランダや米国、韓国などでも民族特異的なSNPアレイの開発が進んでおり、国・地域別アレイに、国別のリファレンスパネルを組み合わせて行うゲノムワイド関連解析（GWAS）は世界の潮流となっています。現在、国際的なGWASデータベースは欧米人のリスクバリアント情報に偏っているので、日本人の多因子疾患のリスク予測に向けて、日本人に特異的なSNPアレイを用いた大規模なGWAS解析が必要です。ToMMoのジャポニカアレイは、多くの海外プロジェクトでも使用され、安価で迅速な解析が行えるApplied

Biosystems™ Axiom™ プラットフォームを採用しています。

ジャポニカアレイ®の新規開発とその特長

ToMMoは、1,070人の全ゲノムリファレンスパネル（1KJPN）の情報を基に約65万個のタグSNPを搭載したジャポニカアレイ® v1とv 2を開発してきました。さらに2 0 1 9年には3,552人の全ゲノムリファレンスパネル（3 . 5 K J P N v 2）を基にジャポニカアレイ®

NEOを開発しました。このアレイはタグSNPの選択法を見直して、さらに日本人に特化させるとともに、約28,000個の疾患関連SNP を搭載しました。全搭載マーカーリストはToMMoが公開したjMorpウェブサイト上で閲覧可能です。

ジャポニカアレイ® NEOの性能評価として、v2及びNEOで日本人286検体を解析したところ、いずれも対象マーカー約65万SNPのうち99％以上が多型を示し、日本人のSNPを効率的に検出できました。さらに3.5KJPNv2リファレンスパネルで遺伝子型インピュテーション性能を検証したところ、いずれも総計1,200万個を超えるSNVを補完できました。この解析でジャポニカアレイ® NEOは、v2よりも約45万個多いSNVを補完でき、日本人向けの高精度な遺伝子型インピュテーションアレイであることを確認しました。

ジャポニカアレイ® NEOの活用によるゲノム医療の実現に向けて

現在、ToMMoでは2台の全自動ハイブリダイゼーション・スキャナーシステムApp l i ed

Biosystems™ GeneTitan™ を稼働させ、1週間で最大16プレート（96検体/プレート）を解析する体制を整えています。すでにジャポニカアレイ® v1とv2で約10万人、NEOでは2万人以上の解析を終え、令和2年度末までに総計15万人のアレイデータを取得予定です。また、2019年9月にはGWASセンターを設置し、解析後のデータシェアリングを前提として共同研究を進める体制を整えました。近年、多因子疾患のリスク予測としてポリジェニックリスクスコア（PRS）の臨床現場への導入が現実味を帯びてきました。私たちも将来的には健診におけるアレイの活用と個別化予防を目指しており、ゲノム情報を活用した日本の未来型健診モデルに向かって、ジャポニカアレイ® NEO解析によるエビデンス収集を行い、健診用アレイの設計・開発へつなげていきたいと思います。

疾患志向性ジャポニカアレイ®の新規開発櫻井美佳 氏（東北大学 東北メディカル・メガバンク機構 アレイ解析室、准教授）

ジャポニカアレイ® NEOの詳細情報は、こちらから → www.thermofisher.com/jp-japonica

多因子疾患の遺伝要因探索では、異なる民族集団間で共通な一塩基多型（SNP）に加えて、民族集団内に特有のSNP情報を高精度に取得することが重要です。東北大学東北メディカル・メガバンク機構（ToMMo）では日本人のSNP解析に最適化したジャポニカアレイ®＊を設計・開発してデータ取得を行うとともに、全ゲノムインピュテーション技術を確立してきました。本セミナーでは、新たなコンセプトとして疾患志向性を掲げて設計・開発したジャポニカアレイについて紹介します。 ＊ジャポニカアレイ®は、国立大学法人東北大学の登録商標です。

日本人類遺伝学会 第64回大会ランチョンセミナー報告

関連製品

07

製品名 サイズ 製品番号 価格

Platinum SuperFi II DNA Polymerase 100 ユニット 12361010 ¥19,200

Platinum SuperFi II DNA Polymerase 500 ユニット 12361050 ¥74,200

Platinum SuperFi II DNA Master Mix 100 反応 12368010 ¥47,500

Platinum SuperFi II DNA Master Mix 500 反応 12368050 ¥215,000

Platinum SuperFi II DNA Green Master Mix 100 反応 12369010 ¥47,500

Platinum SuperFi II DNA Green Master Mix 500 反応 12369050 ¥215,000

Taq ポリメラーゼの300倍を超えるフィデリティ 卓越したフィデリティを実現Platinum SuperFi I I DNA Polymeraseは、極めて低いエラー率でDNA シーケンスの精度を保ち、高い信頼性を実現します。次世代シーケンシングを使用して計算したPlat inum SuperFi I I DNA

Polymeraseの相対的フィデリティは、Taq DNA ポリメラーゼの300倍を超えていました（左図）。

Taq ポリメラーゼの300倍のフィデリティを達成!Platinum SuperFi II DNA Polymerase

Invitrogen™ Platinum™ SuperFi™ II DNA Polymerase

は、プルーフリーディング活性を有するDNAポリメラーゼであり、Taq ポリメラーゼの300倍以上のフィデリティを発揮します。特別に調製されたバッファ中でのプライマーのアニーリング温度は60℃なので、さまざまなサンプルのPCRを同時に実施可能です。

● 高精度 ： Taq ポリメラーゼの300倍を超えるフィデリティを次世代シーケンシングで確認● シンプルなワークフロー ： バッファは60°Cでのアニーリング用に調製（Tmの計算は不要）● PCR 成功率の向上 ： GCリッチ標的、純度の低いDNAおよびロングシーケンスでも頑健な増幅が可能● 自動化に対応 ： Invitrogen™ Platinum™ ホットスタート技術が、高い特異性ならびに反応設定から24時間のベンチトップ安定性を提供

60℃でのプライマーアニーリング 広範囲のターゲット長に対応特別に調製されたPlatinum SuperFi IIバッファは、PCRにおける面倒な最適化ステップを低減します。

短いアンプリコンと長いアンプリコンを同じ条件で増幅できます。

P O I N TNEW!

図1 他社taq 酵素との比較異なるDNAポリメラーゼを使って得られた3.9kbの増幅産物をMuA transposaseで分断。この時12のランダム核酸からなるUnique molecular identifiers（UMI）を各プロダクトにタグとして導入。次世代シーケンス後、同じUMIファミリーをアラインしてエラーコール。結果は、シーケンスエラーを除き、Taq ポリメラーゼフィデリティとして標準化して評価。

図2 高特異的なPCR増幅と均一なアニーリング温度60℃における産物異なるアニーリング温度の12種類のターゲットを各プライマーセットを使って、60℃で増幅しました。

図3 異なる長さのフラグメントの増幅100ngのヒトゲノムDNAから 0.7kb、2.0kb、4.8ｋｂおよび14kbのフラグメントを、4つのすべてのターゲットに関して同一のプロトコルを使用して増幅させました。98℃での10秒間の変性、60℃での10秒間のアニーリング、72℃での7分間の伸長を行いました。

0 50 100 150 200 250 300 350

Q社 enzyme

K社 enzyme

M社 enzyme

T社 enzyme

N社 enzyme

Platinum SuperFi II enzyme

Fidelity compared to Taq enzyme

Taq enzyme

詳細はこちらから → www.thermofisher.com/superfi 詳細はこちらから → www.thermofisher.com/expi293

User's Voice

禾 晃和 氏（横浜市立大学大学院生命医科学研究科・構造生物学研究室 准教授）　塩澤亜希 氏（同研究室 大学院生）

1回膜貫通型タンパク質による物質の取込みやシグナル伝達の仕組みの解明均一な糖鎖が付いた質の高いタンパク質を構造解析に使用

「細胞膜上でのシグナル伝達、特に1回膜貫通型タンパク質を介したシグナル伝達を取り上げ、細胞外からのシグナルの受容と膜を隔てた細胞内へのシグナル伝達の仕組みを分子・原子のレベルで理解することを目指して研究を進めています」と横浜市立大学の禾晃和氏は語ります。そのためにX線解析や電子顕微鏡、原子間力顕微鏡などを駆使したアプローチから、活性化に伴い変化する受容体分子の形や動きの全体像を描き出し、シグナル伝達の流れを捉えようとしています。「代表的な構造解析法であるX線解析のポイントは、タンパク質の結晶化。同じ形をしているときれいな結晶ができますが、ちょっとでも違うところがあると結晶の質が悪くなります。受容体の細胞外ドメインには多様な糖鎖が付いていて、その形が微妙に違うだけでも結晶の質を左右します。できる限り均一な糖鎖が付いたタンパク質を得るため、Gibco™

E x p i 2 9 3 ™ G n T I - E x p r e s s i o n

Systemを使うことにしました」と続けます。実験を担当する大学院生の塩澤亜希氏と共に、禾氏の研究概要とタンパク質発現システムの感想を伺いました。

タンパク質の形や動きを捉える

「具体的な研究対象は、LDL受容体ファミリーのタンパク質です。LDLなどを細胞の中に取り込む受容体で、ファミリーの中には生体内シグナル伝達を担っているものもあります。これらの1回膜貫通型タンパク質は、7回膜貫通型で大部分が膜に埋もれているGPCRのような受容体とは異なり、膜から大きくつき出していて柔軟

に形を変化させることができます。数年前、LDL受容体ファミリーの1種を解析したところ、物質を取り込む間に大きく伸び縮みする可能性があることを発見しました。そして、この構造変化の仕組みが分かれば、LDLなどの取り込みやシグナル伝達を促進したり抑制したりできるのではないかと考えました。LDL受容体ファミリーのタンパク質は、細胞外に多様な糖鎖を有し、複数のドメインから形成されています。解析は全長やドメインごと、またはリガンドと結合した状態など様々な組み合わせで行います。最近ではX線解析で静止状態の形を捉えるだけでなく、原子間力顕微鏡でリアルタイムに動きを捉えることにも挑んでいます。そのためには何種類もの組み合わせでタンパク質を発現させる必要があります」と禾氏は話します。

糖鎖を均一にして構造解析に適したタンパク質をつくる

「Expi293システムの293F細胞は浮遊系で高密度培養でき、さらに発現効率が高いので以前から使っていました。ただし糖鎖を均一化するためには、薬剤を添加して培養する必要があり、薬剤が効きにくい分子もあります。別のアプローチとして、接着細胞のHEK293のGnTI欠損株も使いましたが、安定発現株を得るために2か月ほどかかり、さらに構造解析用に必要な量のタンパク質を回収するためには大量培養を行う必要がありました。ディッシュやフラスコを何段も重ねて培養したり、多孔質の媒体を用いた特別な装置で数リットル以上の培地を使って細胞を培養してい

製品名 サイズ 製品番号 価格

Expi293 GnTI- Expression System Kit 1 式 A39250 ¥290,600

Expi293 Inducible GnTI- Expression System Kit 1 式 A39252 ¥383,100

均一に糖鎖修飾したタンパク質を大量発現Expi293 GnTI- Expression System Kit

Gibco™ Expi293™ GnTI- Expression System Kit は、均一な糖鎖を有するタンパク質を一過性に発現させるシステムです。キットに含まれるExpi293F GnTI- 細胞は、親細胞のExpi293F からGnTI（N-acetylglucosaminyltransferase I）遺伝子を欠損させています。発現誘導ができるGibco™ Expi293™ Inducible GnTI- Expression System Kitも提供中。受託サービスはこちらから → jpcustom@thermofisher.com

たので、手間や労力がかかる作業でした」と禾氏は振り返ります。「そこで一年ほど前、Expi293 GnTI- システムが発売されるとすぐに使うことにしました。高密度培養可能な浮遊細胞なので、300mL程度の培地で培養すれば構造解析に必要な数百マイクログラムのタンパク質を回収できます。高発現のタンパク質では100ｍL程度の培地でも十分な場合もあり、培養にかかる労力が格段と減りました。細胞はCO2インキュベーター内で振とう培養していますが、一般的な高湿度対応のシェーカーを庫内に入れて使っています。一過性発現で効率よくタンパク質を回収できるので、実験開始から2週間程度で解析用のタンパク質試料が得られ、研究スピードが加速しました」と禾氏は続けます。大学院生の塩澤氏も「細胞培養に手がかからないので、構造解析を行いながら、次の実験のための細胞を培養しています。順調にタンパク質を回収できるので、研究の要となる解析に集中できます」と話します。1回膜貫通型タンパク質の構造変化に対する多角的な解析アプローチから、生体内での物質の取り込みやシグナル伝達の仕組みが解明されることで、医療応用へつながることも期待されます。

08 09

「新薬候補の化合物の作用機序を検討することを目的として、複数の候補遺伝子の発現をTaqManアッセイで定量中です。2年前は1遺伝子ずつ個別アッセイで行っていたので20遺伝子程度が手技的に限界でしたが、より多くの遺伝子発現を調べる必要がでてきたので改めて検討した結果、TaqManアレイプレートを使うことにしました。このプレートを使えば、10倍以上の遺伝子数のアッセイもマニュアルで間違えずに行えます」と大塚製薬株式会社の志田美春氏は語ります。志田氏に腎循環器領域における創薬と新薬開発における遺伝子発現解析のポイントを伺いました。

遺伝子発現解析は再現性と定量性が重要

「新薬の開発を行っているので、指標となる遺伝子も新たに自分たちで選択する必要があります。TaqManアレイプレートは、解析遺伝子を自由にカスタマイズできるので、その目的に合っていると思いました。現在、1プレートで約80種類の遺伝子を解析できるように

「炎症性腸疾患の一つである潰瘍性大腸炎は、原因不明で完治に至る治療法がなく、若年層での発病が多い疾患です。若い頃に発病すれば生涯にわたって付き合う必要がありますが、適切な治療を受ければ多くの方は普通の生活を送れます。私たちは日常的に摂取できる食品やビタミン・ミネラルの中で炎症性腸疾患に効能があるものを探索し、有効な利用法を提案することで、この疾患の予防や治療法への開発へつなげたい」と弘前大学の浅利享氏と前田高人氏は語ります。お二人に研究の概要とTaqManアレイプレートの活用について伺いました。

炎症性腸疾患とは?

潰瘍性大腸炎やクローン病は炎症性腸疾患と総称される慢性の炎症性疾患であり、両疾患とも厚生労働省から「難病」に指定されています。炎症性腸疾患は従来、欧米諸国に多く、日本では患者数の少ない希少疾患と考えられていましたが、最近発病率の上昇と共に患者総数は急激に増加し、2018年現在、潰瘍

アッセイを配置し、残りを内在性遺伝子の定量用に使っています。3プレートを使ってトリプリケートで測定しますが、定量性も精度も優れています。候補化合物の作用機序の検討では数百の候補遺伝子から寄与度の高い数種類の遺伝子を効率よく見つけ出す必要があります。このプレートを使えば、数百程度の遺伝子であればマニュアル操作で問題なく処理でき、遺伝子ごとの発現量の差も1ウェル1遺伝子で十分に解析できる点も便利ですね。またアレイプレートと個別アッセイの測定結果を比較したことがありますが、相関性が高いことを確認しています。創薬のステージが進んでも、同じアッセイが使えるので効率的です」と志田氏は語ります。「大学院時代は、SYBR系で遺伝子発現アッセイを行っていましたが、メルティングカーブが二峰性となることもあり、プライマー設計に頭を悩ませたこともありました。しかしTaqManは、論文で使用経験のある設計済みプローブも多くあり、より確かな方法でターゲットのmRNAを特異的に測定できます」と志田氏は以前の経験とも比較します。

性大腸炎は約21万人、クローン病約7万人に達し、今後もこの増加傾向が持続すると予想されています＊。＊「難治性炎症性腸管障害に関する調査研究班」資料より

効能の指標となる遺伝子を探す

浅利氏は、青森県の特産農産物を対象に、実験動物を使って効能を調べています。「効能がありそうな農作物はあるのですが、その中のどの成分がどのような作用で効能を発揮するかについて科学的に解析していきたい。また効率的な摂取法やタイミングなども検証していきたいと思っています。そのために遺伝子発現を指標に効能を評価する系を開発中です。最初は10数種類程度の遺伝子を個別アッセイで調べていましたが、研究の進展に伴い対象の遺伝子を増やす必要が出てきました。しかし多数の遺伝子を個別にアッセイするには手間がかかり、経費的にも気軽に増やすことはできません。そこでTaqMan アレイプレートを利用することにしました。この製品は、遺伝子数ではなくプレート当たりで価格が設定さ

新たな腎循環器領域の創薬を目指して

日本では高齢化社会への移行に伴い、高血圧や慢性腎臓病が増加し、深刻な問題になってくることが予想されています。国内の高血圧人口は約4,300万人と推定され、ありふれた疾患でありながらも、腎臓病の危険因子の一つでもあります。「高血圧の治療薬は各種ありますが、腎臓病の治療薬はまだ限られています。今後患者数の増加が想定される腎臓病の新薬を自分たちの手で開発したい」と志田氏は将来を語ります。

れているので、予算管理もシンプルに行えます。現在、20数種類の遺伝子を1プレートに配置して解析中です」と話します。また前田氏は、「私はビタミンAやある種のミネラルの効能を調べています。カスタムで40数種類の遺伝子を選抜して、2プレートに分けて解析しています。各アッセイはバリデーション済みなので、自分で実験条件を検討する必要がなく安心です」と話します。浅利氏と前田氏の研究から、科学的知見を基に炎症性腸疾患に対する有効な機能性食品やサプリメントの充実が望まれます。

新薬候補化合物の作用機序検討を目的とした遺伝子発現探索TaqManアレイプレートで再現性と定量性を確保しつつ効率化を図る志田美春 氏（大塚製薬株式会社 腎循環研究所 研究員）

炎症性腸疾患に効能を示す食品やサプリメントの研究遺伝子発現解析で効能評価を効率化浅利 享 氏、前田高人 氏（弘前大学大学院医学研究科消化器血液内科学講座）

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TaqManアレイプレート（96ウェルタイプ）

遺伝子発現解析の効率と経済性の向上へApplied Biosystems™ TaqMan® アレイプレート（96ウェルタイプ）は、96ウェルプレートに複数のターゲット遺伝子を検出できるように、Applied Biosystems™ TaqMan® Gene Expression Assayのプローブとプライマーをスポットして乾燥状態で提供します。希望する標的遺伝子を自由に選択するカスタム製品と選択済みのPre-configured（fixed content）TaqMan Array platesをご利用いただけます。製品が届けば、サンプルとマスターミックスを加えるだけで、遺伝子発現解析が簡便に行えます。

カスタム製品のフォーマットは、Format8、16、32、48、96の5種類です。例えばFormat16を使えば16種類の遺伝子発現を（n=6）で定量できます（右図上）。Format96を使えば96遺伝子を一度に定量（n=1）できます（右図下）。しかも1プレートが23,000円なので、1アッセイにかかる費用は約240円と格安です。（23000円÷96=239.5円）

Pre-configured（fixed content）TaqMan Array platesは、免疫反応やキナーゼなど、特定のシグナルパスウェイ、バイオマーカー、疾病関連遺伝子ターゲットなど500種類以上に対する、品質保証された遺伝子選択済みのパネルです。

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A MC TG1 MC TG1 MC TG1 MC TG1 MC TG1 MC TG1

B TG2 TG3 TG2 TG3 TG2 TG3 TG2 TG3 TG2 TG3 TG2 TG3

C TG4 TG5 TG4 TG5 TG4 TG5 TG4 TG5 TG4 TG5 TG4 TG5

D TG6 TG7 TG6 TG7 TG6 TG7 TG6 TG7 TG6 TG7 TG6 TG7

E TG8 TG9 TG8 TG9 TG8 TG9 TG8 TG9 TG8 TG9 TG8 TG9

F TG10 TG11 TG10 TG11 TG10 TG11 TG10 TG11 TG10 TG11 TG10 TG11

G TG12 TG13 TG12 TG13 TG12 TG13 TG12 TG13 TG12 TG13 TG12 TG13

H TG14 TG15 TG14 TG15 TG14 TG15 TG14 TG15 TG14 TG15 TG14 TG15

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A MC TG1 TG2 TG3 TG4 TG5 TG6 TG7 TG8 TG9 TG10 TG11

B TG12 TG13 TG14 TG15 TG16 TG17 TG18 TG19 TG20 TG21 TG22 TG23

C TG24 TG25 TG26 TG27 TG28 TG29 TG30 TG31 TG32 TG33 TG34 TG35

D TG36 TG37 TG38 TG39 TG40 TG41 TG42 TG43 TG44 TG45 TG46 TG47

E TG48 TG49 TG50 TG51 TG52 TG53 TG54 TG55 TG56 TG57 TG58 TG59

F TG60 TG61 TG62 TG63 TG64 TG65 TG66 TG67 TG68 TG69 TG70 TG71

G TG72 TG73 TG74 TG75 TG76 TG77 TG78 TG79 TG80 TG81 TG82 TG83

H TG84 TG85 TG86 TG87 TG88 TG89 TG90 TG91 TG92 TG93 TG94 TG95

Format16標的遺伝子（TG）15種類とコントロールの18S遺伝子（MC）をn=6で定量

Format96標的遺伝子（TG）95種類とコントロールの18S遺伝子（MC）をn=1で定量

1プレート23,000円で、最少注文単位は6プレートからです。製品詳細・注文はこちらから → www.thermofisher.com/jp-arrayplate

　浅利氏（左）と前田氏（右）

10 11

特長 基本機能で低価格 エントリーモデル 高性能でコンパクト 優れた機能性 高性能で柔軟 すべてを備えた

製品名 QuantStudio 1 システム

QuantStudio 3 システム

QuantStudio 5 システム

QuantStudio6 Pro システム

QuantStudio7 Pro システム

QuantStudio 12K Flex システム

蛍光検出 3波長 最大4波長最大21波長

（96ウェル、Fast 96ウェル）最大5波長（384ウェル）

最大5波長 最大21波長 最大21波長

ブロックフォーマット（サンプルボリューム）

●96 ウェル（10-100 µL）

●96 ウェル（10-100 µL）●Fast 96 ウェル（10-30 µL）

●96 ウェル（10-100 µL）●Fast 96 ウェル（10-30 µL）●384 ウェル（5-20 µL）

●96 ウェル（10-100 µL）●Fast 96 ウェル※2

（10-30 µL）●384 ウェル（5-20 µL）

●96 ウェル（10-100 µL）●Fast 96 ウェル※2

（10-30 µL）●384 ウェル（5-20 µL）

●96 ウェル（10-100 µL）●Fast 96 ウェル（10-30 µL）●384 ウェル（5-20 µL）●TaqMan Array Card （約 1 µL）●OpenArray（約 33 nL）

ブロック交換 不可 不可 不可 可 可 可

ランプ速度 3.5℃/秒 3.0 ～ 6.5℃/秒※1 3.0 ～ 6.5℃/秒※1 3.0 ～ 6.5℃/秒※1 3.0 ～ 6.5℃/秒※1 3.0 ～ 6.5℃/秒※1

クラウド対応 ○ ○ ○ ○ ○ ×

CTS PureQuant Assay :生物学製剤開発の鍵となる技術とはPureQuant Assay ：A key requirement in developing biological products

養子免疫療法という新たな免疫療法のアプローチは、がんと戦う免疫細胞のポテンシャルを活用します。特にCAR-T（T cel l chimeric

antigen receptor）技術においては、すでにFDA承認済みの2製品が上市し、一連の製造工程やより効果的な免疫細胞療法製品の開発ペースを加速するツールや技術の必要性が高まっています。生物学製剤の開発の鍵となる要件は、最適な生産工程とその製品規格を確立する上で必要な工程管理と製品特性評価です。特に生物学製剤の最終製品は、確実な試験方法で製品を同定し純度を決定しなくてはなりません。細胞表面マーカーの同定や遺伝子発現は一般的な手法であり、フローサイトメトリーによる解析が主な選択肢となります。ただしこの手法は、新鮮な細胞の必要性や細胞が持つ本質的な多様性を考慮しなければなりません。そのため、最適化や細かな管理やバリデーションが求められます。一つの理想的な解決案は、簡単に応用できて実施できる、安定でよく適した試験方法です。

Uma LakshmipathyDirector, R&D for Cell & Gene Therapy, Thermo Fisher Scientific

彼女が率いるチームは、米国カリフォルニア州のカールスバッドを本境地として幹細胞を用いた基礎研究とトランスレーショナルリサーチに関するソリューション開発を中心的に行っています。

　エピジェネティックなDNAのメチル化は特異的な細胞種に特有であることが知られており、不均一な細胞集団から標的細胞を特定するマーカーとして使われます。この原理は、不均一な細胞から標的となる細胞種を区別するために特異的な脱メチル化領域の測定です（図1）。これらの細胞種特異的に異なるメチル化の特徴を利用して、サーモフィッシャーサイエンティフィックは3種類のApplied Biosystems™

PureQuant™ Methylation アッセイキットを開発しました。このアッセイシリーズは、ゲノムDNAをバイサルファイト変換後、定量PCRを行うことで、CD8+ T 細胞 、制御性 T 細胞（Treg）、そしてTh17細胞（Th17）の割合を算出します。　アッセイでは、それぞれの細胞に対してCD8B、FoxP3、IL17A遺伝子のメチル化状態を定量します。このアッセイシリーズは、鍵となる4スップからなり、その4ステップの出発材料は、細胞、もしくは単離したゲノムDNAです。最初にゲノムDNAのバイサルファイト処理では、アン

モニウムバイサルファイトにより、全ゲノム中のメチル化されていないシトシンがウラシルにすべて変換されます。このバイサルファイト転換したDNAを単離後、標的遺伝子内に生じたウラシル塩基を含む領域にデザインされたプライマーペアでPCRを行います。脱メチル化シトシンを含む配列にはプライマーは結合せず、その後の定量PCRでは増幅しません。コントロールとなるキャリブレーターやリファレンスはキットに含まれており、検量線の作成やGAPDH遺伝子のコピー数により標的遺伝子のコピー数を標準化します（図2）。　PureQuant Methylation アッセイシリーズは、正確性、サンプル量の低減、柔軟性を兼ね備えており、臨床応用を見据えてT細胞の細胞種の同定や純度を計測する上で理想的な測定法です。PCRベースのアッセイとして、コントロールとリファレンスを含む標準的なリアルタイムPCRシステムのみで使用できる完全なソリューションとして提供します。

製品名 サイズ 製品番号 価格

CTS PureQuant CD8+ T Cell Assay* 28 反応 A43674  ¥568,000

CTS PureQuant Treg Assay * 28 反応 A43675  ¥650,000

CTS PureQuant Th17 Assay*  28 反応 A43676  ¥650,000

図2 PureQuant Assay のワークフローバイサルファイト変換されたサンプル、キャリブレーター、およびリファレンスゲノムDNAをDynaBeads Silane gDNAを使って精製し、PCR増幅に使用します。Th17アッセイも同様ですが、事前に増幅ステップを追加し、キャリブレーターは必要ありません。結果は、シンプルなエクセルのテンプレートにCt値をインプットすれば解析でき、不均一な細胞集団における標的細胞の割合がレポートされます。

図1 PureQuant Assayの原理　ターゲットの細胞種には、特異的な脱メチル化領域があります。それらの領域ではバイサルファイト変換でシトシンがウラシルに変換されるため、定量PCRによってその変換された領域を検出できます。一方で非標的細胞ではその領域がメチル化されているため、シトシンはバイサルファイト変換から保護され、プライマーは結合しません。そのためPCRによる増幅産物は得られません。

Step 1サンプル精製

Step 2バイサルファイト処理

Step 3定量PCR

Step 4EXcelで解析

バイサルファイト変換

メチル化脱メチル化

C

NH2

O

N

C

C

NC

C

C

O

O

N

C

C

NC

U

C

NH2

CH3

O

N

C

C

NC

C

C

NH2

CH3

O

N

C

C

NC

C

細胞

未変性DNA

バイサルファイト変換

PCRプライマー

PCR

［プロセス］

増幅なし定量 PCR産物

非標的細胞種標的細胞種

ATTCGGATCGGCGTATATTG

ATTCGGATCGGCGTA

TAAACCTAACCA× × ×

ATTCGGATCGGCGTATATTG

ATTUGGATUGGUGTA

TAAACCTAACCA

………………………………

例：TregCpGマーカーシーケンスは脱メチル化

例：非Treg、B細胞、好中球等CpGマーカーシーケンスはメチル化

製品詳細・注文はこちらから → www.thermofisher.com/jp-bid-purequant

*製品には、バイサルファイト処理、サンプル精製、定量PCRに必要な試薬がすべて含まれています。

※1 1秒あたりのランプ速度は、使用するブロックフォーマットや反応量によって変動します。　 ※2 2020年5月頃発売予定

詳細はこちらから → www.thermofisher.com/qpcrsystems

QuantStudioシリーズ

リアルタイムPCRシステムのパイオニアとして、20年以上にわたる技術革新を結集

柔軟性、汎用性、接続性、スピード、精度、リアルタイムPCRに対するニーズは多様です。サーモフィッシャーサイエンティフィックはApplied Biosystems™ QuantStudio™ シリーズのラインナップをさらに充実させ、

研究者のあらゆるニーズに応えします。さらにリアルタイムPCR用の各種キットやアプリケーションを提供し、トータルソリューションで研究をサポートします。

〈多様な遺伝子発現アッセイ用フォーマット〉

Appl ied Biosystems™ TaqMan®遺伝子発現アッセイ用に、シングルチューブから384ウェルやオープンアレイまで多様な測定フォーマットを準備しています。遺伝子数やサンプル数に合わせてお選びください。関連製品を10-11ページで紹介しています。シングルチューブ 384ウェル マイクロカード　96、もしくは384ウェルプレート オープンアレイプレート　

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使いやすくコンパクトなフローサイトメーター

Attune NxT Flow Cytometer

Invitrogen™ Attune™ NxT Flow Cytometerは、最大4レーザーで14色検出可能なフローサイトメーターです。アコースティックフォーカシング技術により高流量で測定でき、レアイベントや全血サンプルを感度よく解析します。本体サイズはコンパクトで、しかも廃液が少ないので、限られたスペースの研究室にも設置できます。

詳細はこちらから → www.thermofisher.com/attune

CTS N-2 SupplementCTS OpTmizer T Cell Expansion SFM

Gibco™ CTS™ OpTmizer™ T Cell Expansion SFMは、ヒトTリンパ球の成長および増殖用の無血清およびゼノフリー培地です。OpTmizer T Cell Expansion Basal MediumおよびOpTmizer T

Cell Expansion Supplementから構成されています。

Gibco™ CTS™ N-2 Supplementは、神経芽細胞腫や末梢や中枢系の有糸分裂後の初代神経細胞の増殖や発現のための無血清かつ既知組成のサプリメントです。

Gibco™ CTS™ KnockOut™ SR XenoFree*2 Medium は、完全培地として調製した場合、ヒト由来タンパク質またはヒト組換えタンパク質のみを含むゼノフリー培地です。ヒト多能性幹細胞（ヒトiPS細胞、ヒトES細胞）の成長および増殖が可能です。また本培地は、凍結保存、誘導および分化研究にも使用できます。

Gibco™ CTS™ Immune Cell SRは、ヒトT 細胞のin vitro 培養における増殖をサポートする血清代替物です。ヒト血清と同等濃度で、標準的な基礎培地に添加できます。既知組成かつヒト以外の動物由来成分を含まないゼノフリー製品で、CTS OpTimizer T Cell Expansion SFMやGibco™ CTS™ AIM V SFMなどの基礎培地と組み合わせて使用します。

サーモフィッシャーサイエンティフィックは、細胞培養や分子生物学の研究を支える数多くの製品を提供し、その技術を基礎研究から生産レベルまで一貫してサポートできる体制を整えています。高品質な細胞培養製品を50年以上にわたって提供するGibco™ 製品では、お客様の再生医療研究の推進・効率化をサポートするために、PMDA（医薬品医療機器総合機構）が定める“生物由来原料基準（生原基）”を満たす製品について、「再生医療等製品材料適格性確認書」の取得を積極的に進めています。

「再生医療等製品材料適格性確認書」 取得済み製品

2020年2月現在、下記製品が対応していますが、今後さらに他のGibco™ CTS™ 製品でも取得予定です。CTS製品は、再生医療を支えるために提供している製品シリーズです。*● CTS Immune Cell SR ● CTS KnockOut SR XenoFree Medium ● CTS OpTmizer T Cell Expansion SFM● CTS N-2 Supplement ● B-27 Supplement（ガンマ線照射済みのカスタム製品）

*品質マネジメントシステム規格ISO13485認証を取得した施設で製造され、製造方法や工程管理は米国のcGMPに準拠しています。 分析証明書や原産地証明書などのトレーサビリティ文書も準備しています。

P O I N T

再生医療等製品材料適格性確認書

再生医療等製品の研究・開発をよりスムーズに前進

CTS KnockOut SR XenoFree Medium

CTS Immune Cell SR

製品名 サイズ 製品番号 価格

CTS OpTmizer T Cell Expansion SFM 1000 mL A1048501 ¥16,900

CTS Immune Cell SR　 500 mL A2596102 ¥197,600

CTS KnockOut SR XenoFree Medium 500 mL 12618013 ¥73,200

CTS N-2 Supplement 5 mL A1370701 ¥26,300

B-27 Supplement お問い合わせください

「再生医療等製品材料適格性確認書」に関するご依頼・ご相談は、下記ウェブサイトからお問い合わせください。www.thermofisher.com/jp-sbi-cert

歯周病は、糖尿病や動脈硬化、早産などのリスク因子として注目されています。「例えば歯周病が糖尿病を悪化させたり、歯周病で産生された炎症物質が妊婦の早産や低体重児出産を引き起こしたりする危険性が指摘されています。しかし糖尿病以外の疾患への影響は明確ではなく、詳細な研究が必要です」と東京医科歯科大学の岩田隆紀氏は語ります。この課題に取り組むために、大学院生の畑佐将宏氏はモデル動物のマウスを使って、局所的な慢性炎症である歯周病から全身の組織や臓器にどのように炎症が広がっていくかを調べる系を立ち上げています。

全身への炎症の広がり方を調べる

「実験ではマウスを2群に分けて、片方の群に歯周病原細菌を投与し、炎症をM1とM2マクロファージの定量で評価します。具体的には組織からマクロファージを含む細胞集団を採取し、M1とM2を見分けるマーカーで蛍光標識してフローサイトメーターで定量しました。またマクロファージの分画以外もミトコンドリア活性をフローサイトメーターで確認しています。この時は、固定せずにMitoTrackerで染めました。

ち上げもシンプルで、測定後のシャットダウン操作も楽でした。システムが流路を自動で切り替えて洗浄するため、洗浄に伴う溶液交換等を行う必要がなく、実験データの整理や議論を行う時間を確保できます」と続けます。

歯周病と全身疾患の関連を明らかにする

歯周病が全身疾患へ影響するメカニズムは3通りほど想定されると、岩田氏は語ります。「1つ目は、歯周病原細菌そのものが炎症で傷んだ口腔内の血管を介して全身を循環する（菌血症）。2つ目は、口腔内の慢性炎症に対して免疫細胞が放出した炎症性サイトカインが血流を介して全身に広がる。3つ目は、歯周病原細菌が持つ毒素が全身に影響を及ぼす」です。「この研究で歯周病の影響を客観的に評価できるようになれば、メカニズムの解明が進み、疾患との関係が明らかになるはず」と続けます。畑佐氏は「この研究で歯周病から他の疾患への影響を明確にできれば、歯周病以外の疾患予防にも役立つと考えています。歯周病は個人で予防できる病気であり、さまざまな疾患への効果的な予防法につなげていきたい」と研究の目的を話します。

一度、この系で10匹のマウスを使ったタイムコースを行いましたが、1匹あたり6サンプルずつ調製し、合計60サンプルを解析しました。組織や臓器から得たサンプルは粘性が高く、サイズが大きなものも含まれますが、液詰まりなく解析できました」と畑佐氏は立ち上げ中の実験系を説明します。

迅速なサンプル測定のメリット

「私たちは臨床医として日々外来診療などを担当するため、実験の時間が限られます。ですからInv i trogen™ Attune™ NxT

Flow Cytometerの一番良い点は、サンプル測定が速いところだと感じています。例えば前述のタイムコース実験では、午後からマウスを処理し始め、夕方6時頃から解析を始めましたが、数時間で60サンプルの測定を終えました。細胞は200μLの溶液に懸濁させて流速200μL/minで測定しました。サンプル量を設定しておけば機械が自動で測定するので、その間に次のサンプルの準備ができる点も全体の実験時間を短縮できて助かりました」と畑佐氏。Attune NxT Flow Cytometerは、アコースティック技術で細胞を一列に並べて検出するので、高流量でも検出精度が落ちることはありません。「またシステムの立

岩田隆紀 氏（東京医科歯科大学歯学部歯周病学分野 主任教授）　畑佐将宏 氏（同大学 大学院生）

歯周病から全身疾患への影響に関する研究Attune NxT Flow CytometerでM1／M2マクロファージを迅速測定

製品評価プログラム当選者より

14 15

製品名 サイズ 製品番号 価格

SuperSignal West Pico PLUS　Chemiluminescent Substrate 20 mL 34579 ¥10,200 200 mL 34577 ¥38,700 500 mL 34580 ¥51,900 1 L 34578 ¥96,800

SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate 20 mL 37071 ¥22,200 100 mL 34075 ¥72,100 200 mL 34076 ¥130,700

SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate 20 mL 34094 ¥23,100 100 mL 34095 ¥75,300 200 mL 34096 ¥140,700

SuperSignal West Atto Ultimate Sensitivity Substrate 20 mL A38554 ¥23,800 100 mL A38555 ¥76,500 200 mL A38556 ¥125,600

SuperSignal West Pico PLUS SuperSignal West Dura SuperSignal West Femto SuperSignal West Atto

検出レベル ピコグラム低域～フェムトグラム高域フェムトグラム中域

（～250フェムトグラム）フェムトグラム中～低域（～60フェムトグラム）

フェムトグラム低中域～アトグラム高域

シグナル持続時間 6～24時間 ～24時間 ～8時間 ～6時間

推奨用途コストパフォーマンスを求めるルーチンワークや新しいターゲットの条件検討に

長いシグナルの持続時間を必要とする実験系に

ターゲット量が少ない場合や貴重なサンプルの検出に

貴重なサンプルやターゲット量が少なく最大感度が必要なサンプルの検出に

化学発光検出試薬SuperSignalシリーズ

シグナル持続時間が長い基質を幅広くラインアップウェスタンブロッティングの検出試薬SuperSignalシリーズは、過去3年間で7,000件の文献引用実績のある信頼性の高い化学発光検出試薬です。シグナル持続時間が長く、優れた感度とS/N比により、高精度で効率的なウェスタンブロッティング解析を実現します。

「アトグラム」レベル を検出!超高感度 ウェスタンブロッティング検出試薬

SuperSignal West Atto Ultimate Sensitivity Substrate

長いシグナル持続時間と優れた感度が特長のウェスタンブロッティング検出試薬Thermo Scientific™ SuperSignal™ シリーズから、従来のフェムトグラム（10-15g）を超えるアトグラム（10-18g）レベルの感度と優れたSN比を実現した超高感度基質が登場しました。Thermo Scientific™ SuperSignal™ West Atto Ultimate Sensitivity Substrateは、フェムトグラム低域からアトグラム高域レベルの検出が可能で、ターゲットタンパク質が少ない場合や希釈したサンプルなど、貴重なサンプルを高感度に検出します。

● 優れた感度とS/N比を実現 ： これまで検出できなかった極微量タンパク質の検出を可能にします。● 長いシグナル持続時間 ： 最大6時間シグナルが持続するので、繰り返しの露光が可能です。● 安定した試薬 ： 保管は2～8℃で12か月安定です。また調製後のワーキングソリューションは室温で48時間安定です。

P O I N T

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製品詳細・注文はこちらから → www.thermofisher.com/supersignal 製品詳細・注文はこちらから → www.thermofisher.com/ibright

NEW!

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Invitrogen™ iBright™ 1500 Imaging Systemsシリーズは、従来の1000シリーズで採用したタッチパネルやSmartExposure技術による露光時間の自動算出機能はそのままに、蛍光感度※やズーム機能を強化し、より鮮明な画像を簡単に撮影します。ノーマライゼーション機能により、正確な定量解析をサポートします。　※ iBright FL1500 Imaging Systemを使用した場合

セリンに対する良い抗体もなかったので、twitchinのN末領域のリン酸化実験には長らく手が出ませんでした。ところがちょうど一年前にiBrightシステムを購入して使ってみると、システムが最適な画像を自動で判断して提示するので撮影条件の検討に手間がかからず、定量バンドの範囲もシステムの自動判定に任せることにしました。研究者がマニュアルで行うと恣意的になる可能性も否定できないからです。またタッチパネルの操作性も良いですね。今の学生さんはパソコンのマウス操作よりも、直感的に操作できるタッチパネルの方が習熟も早いようです」と舩原氏は今回の研究のきっかけを振り返ります。「今後はキャッチ収縮時に、twitchinのN末端領域にどのような分子に結合しているか、リン酸化の影響とともに確認していきたい」と続けます。キャッチ収縮の制御機構の全貌解明に向けて、研究が再び順調に進んでいくようです。

舩原大輔 氏（三重大学大学院生物資源学研究科 生物圏生命科学専攻 生体高分子化学研究室 准教授）

二枚貝キャッチ収縮の制御に関わるtwitchinリン酸化機構の解明へリン酸化タンパク質の定量をiBrightシステムがサポート

「アサリやホタテガイなどの二枚貝は、貝柱を収縮させて一度殻を閉じると、外から開くには大きな力が必要です。このような二枚貝の閉殻筋や、ムラサキガイの前足牽引筋が長時間にわたって張力を発生し続ける現象は古くから知られており、その様子が止め金（キャッチ）に似ていることからキャッチ収縮と呼ばれます。面白いことに、この収縮はエネルギーをほとんど使わず、その制御機構には未だ多くの謎が残っています」と三重大学の舩原大輔氏は語ります。舩原氏は、キャッチ収縮におけるtwitchinタンパク質のリン酸化／脱リン酸化の影響を詳細に調べ、制御機構の全貌解明へ迫ろうとしています。

キャッチ収縮の制御機構解明へ

2004年、舩原氏はムラサキガイの前足牽引筋のキャッチ収縮にtwitchinが関わること、さらに収縮後に上昇したcAMPがAキナーゼを活性化してtwitchinをC末領域でリン酸化し、リン酸化twitchinはアクチンやミオシンとの複合体形成が抑制されるためにキャッチ収縮が解除されることを突き止めました。twitchinは530ｋDaにおよぶ巨大なタンパク質であり、タイチン/コネクチンファミリータンパク質と高い相同性を示します。「twitchinのリン酸化は、C末だけでなくN末側でも起き、その領域はアクチン線維からなる細いフィラメントとの相互作用に関わるとの報告があります。

そこで昨年、N末領域でのAキナーゼによるリン酸化を詳細に検討しました。N末領域には、Aキナーゼのリン酸化候補となるセリン残基が4つあり、各々の変異体や変異なしのリコンビナントタンパク質を作製してAキナーゼと反応させました。するとリン酸化が複数個所で起こり、しかも段階的に順序だって起きていくことがわかりました。実験ではリン酸化タンパク質の分離に適した特殊なSDS電気泳動ゲルを使い、CBB染色後にiBrightシステムでバンドの濃淡を測定しました」と舩原氏。「実験は学部4年生が担当しましたが、再現性が高いデータが数か月で揃い、短期間で論文にまとめました*」と続けます。＊Phosphorylation Properties of the N-Terminal Region of Twitchin from Molluscan CatchMuscle　 D. Funabara, et al.　American Journal of Molecular Biology, 2019, 9, 110-120

使いやすいiBrightシステムで効率よく実験

「15年前のC末側のリン酸化実験では RI

を使用しましたが、扱いが煩雑で、共同利用のRI施設もすでに閉鎖されました。今ではリン酸化タンパク質検出などはウェスタンブロッティングと化学発光が一般的ですが、定量にはデジタルカメラで撮影したデータを専用ソフトで解析する必要があり、やはり煩雑な作業です。また撮影条件によっては強いシグナルが頭打ちして定量性に欠ける場合もあります。リン酸化

製品名 サイズ 製品番号 価格

iBright FL1500 Imaging System（化学発光・蛍光撮影装置）、設置・基本取扱説明付 1 式 IBFL1500 ¥3,980,000

iBright CL1500 Imaging System（化学発光撮影装置）、設置・基本取扱説明付 1 式 IBCL1500 ¥2,980,000

NEW!

いつものウェスタンブロッティングをもっと簡単、パワフルに

iBright FL1500 Imaging System（化学発光・蛍光撮影装置）iBright CL1500 Imaging System（化学発光撮影装置）

1716

vol.4

NEXT Pursuit

「システムウイルス学」から読み解く豊かなウイルスの世界へ佐藤 佳 氏（東京大学医科学研究所 感染症国際研究センター システムウイルス学分野・准教授）

ライフサイエンスの未来に挑む人

医学研究に偏りがちなウイルス学の常識を覆し、膨大な配列データをインフォマティクスと数理科学で巧みに読み解き、ウイルスと宿主の何百万年にもわたる攻防が生み出す「共進化」からウイルスを捉えようとする東京大学の佐藤佳氏。佐藤氏は、実験ウイルス学を基軸に、バイオインフォマティクスや分子進化学、分子系統学、古生物学、数理科学などの科学領域の研究手法を融合させ、さまざまな視点からウイルスを総合的に理解する「システムウイルス学」の創生に挑んでいます。

軍拡競争が駆動する遺伝子の進化とは?

昨年末、佐藤氏らが行った報道発表のタイトルは「ほ乳類とレトロウイルスの進化的軍拡競争の網羅的描出」※1。ゲノム解読済みの160種のほ乳類を対象にバイオインフォマティクス解析を行い、内在性レトロウイルス（ERV）と、宿主側のウイルス感染防御を担うAPOBEC3ファミリー遺伝子の数を抽出。その結果、霊長目を筆頭に、過去に高頻度でウイルス感染を経験した動物種ほど、多様なAPOBEC3ファミリー遺伝子を持つことが分かりました。「宿主のAPOBEC3はAID※2と同じファミリーに属し、レトロウイルスの逆転写過程で合成されるDNAに結合してウイルスゲノム上のグアニンをアデニンに変え、増殖を抑えます。これに対抗し、例えばヒト免疫不全ウイルス（HIV）は、ウイルスのVifタンパク質を使って宿主のユビキチン・プロテアソーム経路を操り、APOBEC3タンパク質を分解させます。このようなAPOBEC3とVi f

の共進化は、宿主とウイルスの軍拡競争の産

物。今回の成果は、ウイルス感染がほ乳類の感染防御遺伝子の進化の駆動力となることを示したことです」と佐藤氏は話します。

数理科学との出合いと共同研究ウイルス研究に取り入れた数理科学との連携は、JSTの最先端研究開発支援プログラム（F IRSTプログラム）がきっかけでした。合原最先端数理モデルプロジェクトを率いる東京大学の合原一幸氏から当時京都大学の助教だった佐藤氏らに共同研究の声がかかったのです。ヒト化マウスにHIVを感染させ、二光子顕微鏡を利用してタイムラプス撮影を行い、細胞動態を記述する数理モデルを立てました。「同年代の数学の研究者との共同研究でしたが、最初は話がかみ合わず苦労しました。徐々に問題点を共有しながら互いの専門を分業し、知を共有する感覚を会得していきました」と佐藤氏は振り返ります。「異分野に限らず、共同研究者を探すときは、最初に自分のアイデアを語ります。興味を持っていただければ快く協力していただくことが多く、苦労したことはあまりありません。最近は生物系でもバイオインフォマティクスや数理科学に興味がある若手研究者が増えているので、これからが楽しみ」とも話します。「ラボはまだ小さいけれど、理想は実験とインフォマティクスと数理科学がある程度一つのラボでできること」と続けます。

豊かなウイルスの世界へ佐藤氏は、はじめは病原体としてのウイルスに興味を持ち、ヒトへのHIV-1感染ダイナミクスをAPOBEC3とVifの相互作用から研究

しました。今は、共進化やその原点となる種間伝播にも興味を持っています。「100年ほど前、チンパンジーのサル免疫不全ウイルス（SIV）がヒトに異種間伝播し、ヒトに適応進化することでHIV-1が生まれたと言われています。新しい宿主に飛び込んだウイルスがその防御システムをどのようにかいくぐり、どう生き延びたのか。DNAに残された痕跡を丹念に抽出していきたい」と目を輝かせます。また長期的に目指すのは、ウイルス間の比較。「ウイルスごとの縦割りではなく、異なるウイルスによる多様な宿主での表現型を『システムウイルス学』という横断的な研究アプローチから解明していきたい」。植物系や海洋系にまでも広がる豊かなウイルス世界を進化という時間軸と交差させながら探求する、新しいウイルス学への挑戦が始まっています。

※1 Retroviruses drive the rapid evolution of mammalian APOBEC3 genes. Ito J, Gifford RJ, Sato K. Proc Natl Acad Sci 117（1）:610-618（2020）※2 AID：抗体遺伝子のクラススイッチに必須とされるcytidine deaminase

2005年、東北大学農学部応用生物化学科卒業後、京都大学大学院生命科学研究科へ進学。同学大学院医学研究科にて博士後期課程を修了し、10年医学博士を取得。その後、京都大学ウイルス研究所（現 ウイルス・再生医科学研究所）博士研究員、助教、講師などを経て、18年4月から東京大学医科学研究所感染症国際研究センター准教授。研究室を主宰。

佐藤氏は、一緒に（システム）ウイルス学を盛り上げるメンバーを求めています。興味がある方は、研究室のホームページをご覧ください。（イラストは佐藤氏の研究室のロゴマークです。）www.ims.u-tokyo.ac.jp/SystemsVirology

WHITE PAPERThe SeqStudio Genetic Analyzer simplifies the analysis of triplet repeat expansions with AmplideX PCR/CE reagents

SeqStudio Genetic Analyzer と AmplideX PCR/CE 試薬でトリプレットリピート解析を簡便化

要旨

Applied Biosystems™ SeqStudio™ Genetic Analyzerは、使いやすい最新のキャピラリ電気泳動システムであり、シーケンス解析のみならず、疾患関連の反復解析のためのフラグメント解析にも適しています。多くの反復領域はGC含有量が高く、増幅や解析には困難が伴います。そこで今回、SeqStudio Genetic

Analyzerを解析のプラットホームとして、疾患関連の反復領域を、Asuragen AmplideX™ PCR/CE FMR1 アッセイおよび

C9orf72アッセイで解析する際に推奨するインジェクションとラン設定を設定し、評価しました。脆弱X症候群は、FMR1遺伝子の一部のCGGの反復伸長（過伸長）により惹起される遺伝性の疾患です。同様にC9orf72遺伝子のイントロン内の反復伸長（過伸長）は、前頭側頭骨痴呆や筋萎縮性側索硬化症（ALS）の原因のひとつです。厳密なテストの結果、S e q S t u d i o G e n e t i c A n a l y z e rは、AmplideX PCR/CE FMR1試薬やC9orf72試薬による増幅産物を効果的に解析できることがわかりました。ラン条件は下記です。

SeqStudio module = LongFragAnalysis（下記に変更）injection time = 2 sec, injection voltage = 6 kV,

run time = 3,300 sec, run voltage = 6 kV.

2種類の試薬を使ったフラグメント解析において、SeqStud io

Geneticは、従来機種の3500 Series Genetic Analyzerと高い相関を示し、信頼性の高い結果を提出しました。SeqStudio

Genet ic Analyzerは、キャピラリシーケンサによるルーチンなフラグメント解析をこれまでの機種同様に正確に実施できる、経

済性に優れたコンパクトなシーケンサと言えます。キャピラリ長やPOP-1ポリマーに合わせてランパラメーターを調整することで、従来のApplied Biosystems™ 310 / 3130 Genetic

Analyzerからも解析をスムーズに移行でき、AmplideX PCR/

CE FMRアッセイやC9orf72アッセイを簡便に行えます。

実験方法と結果

FMR1、もしくはC9orf72遺伝子内で観察される20回から200回までのさまざまな反復数を含むサンプルパネルを、FMR1アッセイ試薬もしくはC9orf72試薬でPCR増幅後、キャピラリシーケンサでフラグメント解析しました。使用したキャピラリシーケンサは、SeqStudio Genetic AnalyzerおよびApplied Biosystems™

3500 Series Genetic Analyzerであり、両システムの解析結果の相関が高いことを確認しました。下図にSeqStudio Genetic

Analyzerにおける両試薬の解析結果と評価を示します。

フラグメント解析に関する情報はこちらから → www.thermofisher.com/fragmentanalysis

図 FMR1とC9orf72試薬のフラグメント解析で予測と一致する結果を取得SeqStudio Genetic Analyzerのプロットは反復回数の長さに関わらず、予測した値と一致しました。この実験では機器特有のサイズ補正と反復モビリティ係数を使用しました。

C9orf72 summary of fit

R2 0.99998

R2 adj. 0.99998

RMS error 0.2725

Mean of response 45.48

N 126

FMR1 summary of fit

R2 0.99995

R2 adj. 0.99995

RMS error 0.4729

Mean of response 72.82

N 448

Measured allele repeat # vs. expected

Expected allele repeat #

C9orf72

FMR1S

eqS

tud

io a

llele

rep

eat #

18016014012010080604020

0

18016014012010080604020

0

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

結論

18 19

サーモフィッシャーサイエンティフィックライフテクノロジーズジャパン株式会社本社： 〒108-0023 東京都港区芝浦4-2-8 TEL.03（6832）9300 FAX.03（6832）9580ウェブサイト： www.thermofisher.com

販売店photographs: ryoichi morikawa（p02-03）art direction & design: opportune design inc. science writing: momoyo Matsuyama / editing: yuko hashimoto

●記載価格は2020年3月現在の価格です。●消費税は含まれていません。●価格は予告なしに変更する場合がありますのであらかじめご了承ください。●最新の価格および在庫数は、弊社ホームページ右上の"製品価格と在庫の検索"でご確認いただけます。●研究用にのみ使用できます。●診断目的およびその手続き上での使用は出来ません。●記載の社名および製品名は、弊社または各社の商標または登録商標です。●販売条件はこちらをご覧ください。www.thermo�sher.com/jp-tc

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. © 2020 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights

reserved. All trademarks are the property of Thermo Fisher Scienti�c and its subsidiaries unless otherwise speci�ed.

TaqMan is a registered trademark of Roche Molecular Systems Inc., used under permission and license. AmplideX is

a trademark of Asuragen Inc. Printed in Japan.

LSG075-A2002HS

NEXT バックナンバーは、こちらから → www.thermofisher.com/NEXT

NEXT 3月号はいかがでしたか?

特集は、大阪大学医学部教授の保仙直毅氏。“がんに特異的な立体構造”を標的にした新たながん免疫治療法の開発に至るお話を伺いました。新製品情報は、新しい時代を切り拓く次世代シーケンサGenexusをはじめ、分子生物学実験やタンパク質解析に有用なtaq ポリメラーズや超高感度なウェスタンブロッティング検出試薬など。ユーザーボイスも豊富です。NEXT Pursuitは、システムウイルス学で新たなウイルス学に挑む、東京大学医科学研究所の佐藤佳氏を取材しました。感想をお寄せください。10名の方に千円分のギフト券を差し上げます!

読者アンケートはこちらから → www.surveymonkey.com/r/NEXT_53

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INFORMATION

ユーザーグループ ミーティング2020

がんゲノム医療研究の最前線へ～遺伝子解析研究はどこまで進化するのか～

Applied Biosystems and Ion Torrent

がんゲノム医療に関わる研究は近年ますます加速し、さまざま発見、解析手法が生み出されています。本イベントでは、がんゲノム医療研究の最前線をリードする先生方をお招きし、研究プロジェクトの外観や研究構想、ゲノム医療研究の今後についてご講演いただきます。さらに次世代ゲノム医療研究を強力にサポートする、新製品Ion Torrent™ Genexus™ システムを紹介いたします。

日時 ： 2020年3月24日（火）13:00～18:00

会場 ： 富士ソフトアキバプラザ／定員 ： 150名（参加費無料）参加お申込みサイト ： www.thermofisher.com/jp-ionugm2020

「Next generation sequencing of circulating tumor DNA in clinical cancer research」Siew-Kee（Amanda）Low 氏（公益財団法人がん研究会 がんプレシジョン医療研究センター 免疫ゲノム医療開発プロジェクト がんネオ抗原ワクチン開発グループ グループリーダー）

「半導体シークエンサーを用いた保険診療下での肺癌バイオマーカー検査」畑中 豊 氏（北海道大学病院 ゲノム･コンパニオン診断研究部門 特任准教授、先端診断技術開発センター 統括マネージャー）

「小児がんパネルOncomine Childhood Cancer Research Assayによるゲノム解析の試み」檜山英三 氏（広島大学 自然科学研究支援開発センター 研究開発部門 生命医科学部、広島大学病院小児外科 教授）