NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

PRACTICA N 2TTULO: HIDRLISIS DE POLISACRIDOS. ACTIVIDAD DE LA ENZIMA ALFA AMILASA1. Fundamento.-

La hidrlisis de una macromolcula puede llevarse a cabo, mediante diversos procedimientos: catalizados con cidos o bases fuertes, con catalizadores orgnicos e inorgnicos, mediante el empleo de enzimas hidrolticas adecuadas.Un papel fundamental del aparato digestivo es la transformacin de las macromolculas, ingeridas a travs de los alimentos, en estructuras sencillas que puedan ser absorbidas en el tracto intestinal. La digestin de los carbohidratos (almidn) comienza en la boca por la accin de la enzima -amilasa que hidroliza enlaces (1,4).En esta prctica por medio de reacciones cualitativas, es posible comparar no solo la diferencia de tiempo requerido en cada mtodo, sino tambin las distintas condiciones de ensayo necesarias para que se realice la hidrlisis. 2. Objetivo.- Observar e identificar azucares reductores.

Observar e identificar la accin de la hidrlisis de polisacridos en accin de la enzima alfa-amilasa y acido clorhdrico.3. Marco terico.- Polisacridos: Estructura y caractersticas qumicas del Almidn y Glucgeno. Almidn

Es un homopolmero formado exclusivamente por residuos de glucosa.

Dentro del almidn existen dos estructuras diferentes: amilosa (interior) y amilopectina (cubierta), los cuales constituyen polmeros de glucosa pero difieren en estructura y propiedades.

Amilosa Constituye del 10 al 20% del almidn, consiste en un polmero lineal formado por cientos de unidades de glucosa, pudiendo ser alrededor de 300 a 350 residuos de glucosa. Polmero lineal debido a que se trata de una larga cadena no ramificada en la que todas las D-glucosas se unen mediante enlaces 14.

Debido al ngulo de ste enlace (14) la amilosa se acomoda de forma helicoidal, adoptando una estructura compacta dentro del almidn.

En el agua las molculas de amilosa tienden a asociarse y precipitar, es decir son poco solubles en el agua, forman micelas (estructura helicoidal), por lo que no forman soluciones muy estables.

AmilopectinaLa amilopectina comprende el 80% restante del almidn y presenta una estructura ms compleja que la amilosa. Se asemeja a la amilosa en el sentido de que se trata de un polmero lineal de D-glucosa, sin embargo la amilopectina es altamente ramificada.Es decir en la cadena los residuos de D-glucosa se unen mediante enlaces 14, sin embargo cada 24 a 30 residuos de glucosa (aproximadamente) se presenta un enlace 16 en los puntos de ramificacin.

GlucgenoAl igual que la amilopectina encontrada en el almidn, el glucgeno posee una estructura ramificada compleja.

Est constituido por cadenas lineales de glucosa unidas por enlaces glucosdicos -14 y por uniones de tipo -16.

Las molculas de glucgeno son mayores que las de amilopectina y poseen ms ramificaciones, las cuales estn separadas por menos de 10 unidades de glucosa.

Hidrlisis del AlmidnLa funcin ms importante de la saliva es humedecer y lubricar el bolo alimenticio, desde el punto de vista digestivo es importante por contener a la amilasa salival optialina, enzima que hidroliza diversos tipos de polisacridos. El pH de la saliva es cercano a la neutralidad, por lo que en el estmago esta enzima se inactiva totalmente, de tal suerte que los carbohidratos no sufren modificaciones de importancia en este rgano. Es hasta el intestino donde los disacridos y los polisacridos deben ser hidrolizados en sus unidadesmonomricaspara poder atravesarla pared intestinal y tomar as el torrente sanguneo para llegar a las clulas e ingresar al interior para ser utilizados en cualquiera de las funciones en que participan (energtica, de reconocimiento, estructural o como precursor de otras molculas). En el duodeno se vierte el jugopancraticoque contiene entre otros muchos elementos, amilasa pancretica (Su pH ptimo es de 7.1 y rompe al azar los enlaces alfa,1-4 del almidn),diastasa oamilopsina, estaltimamuy parecida a la enzima salival. En la digestin de los carbohidratos intervienen diferentes enzimas que desempean cada una funciones diferentes y que por tanto, tienen especificidades diferentes.Para romper las ramificaciones se necesita a la amilo-1-6-glucosidasa.La reaccin de hidrlisis, consiste en el rompimiento de uniones covalentes por medio de una molcula de agua. La hidrlisis de un enlaceglucosdicose lleva a cabo mediante la disociacin de una molcula de agua. El hidrgeno del agua se une al oxgeno del extremo de una de las molculas de azcar; el OH se une al carbono libre del otro residuo de azcar. El resultado de esta reaccin, es la liberacin de un monosacrido, dos si la molcula hidrolizada fue un disacrido o bien elpolisacridon-1, dependiendo de la molcula original.4. Materiales y Reactivos.-

Solucin de Almidn soluble al 2% Solucin de Lugol

Reactivo de Benedict

Enzima: alfa amilasa

Material Biolgico: Saliva (amilasa salival)

Agua Destilada

Tubos de ensayo

Fiola

Placa de vidrio o porcelana con excavaciones.

Pipetas

Bao de agua a 37C

Bao de agua hirviente

Pinzas Pipetas automticas

5. Procedimiento.-

1. En una placa de porcelana o vidrio con excavacin para pruebas a la gota, coloque una gota de la solucin de almidn al 2% y una gota de la solucin de lugol Mezcle y anote la coloracin obtenida.

2. En otra excavacin de la placa, agregue una gota de solucin de glucosa al 2% y una gota de solucin de lugol. Mezcle y anote la coloracin obtenida.Estos representarn sus estndares de color para la comparacin del inicio y fin de cada reaccin.Material Biolgico:

Enjuagar la boca antes de proceder. Mastique un pedazo de papel para estimular la secrecin de saliva y recolectar unos 10 ml en un beaker filtrando a travs de gasa para evitar la formacin de espuma.A. Hidrlisis cida:1. Medir 20 ml de una solucin de almidn al 2% y colocar en una fiola.2. Agregar 1 ml de cido clorhdrico concentrado en la fiola y mezcle.

3. Caliente en un bao de agua hirviente de modo que la mezcla contenida en la fiola hierva suavemente. Agite constantemente.

4. Tome el tiempo de la reaccin desde el momento en que se coloca la fiola en el bao.

5. Cada 5 minutos, tome una gota del material hidrolizado con ayuda de un agitador y depostelo en una excavacin de la placa de vidrio, agregue una gota de la solucin de Lugol. Mezcle y registre la coloracin que se produce.

6. Contine calentando y realizando la prueba hasta que la coloracin alcanzada sea similar a la realizada con la glucosa en el primer paso. Esto indica que la hidrlisis se ha completado.7. Retire la fiola del bao y enfre.

8. Verifique la presencia de azcares reductores con el reactivo de Benedict.

B. Hidrlisis Enzimtica:

A un tubo de ensayo agrege 4 ml de la solucin de almidn al 2%

Colocar en un bao a 37C por 5 minutos.

Retire del bao y agregue 200 l de la solucin de enzima -amilasa. Mezclar bien.

Cada 5 minutos realice la prueba con la solucin de Lugol para verificar el avance de la hidrlisis. Contine calentando y realizando la prueba hasta que la coloracin alcanzada sea similar a la realizada con la glucosa en el primer paso. Esto indica que la hidrlisis se ha completado.

Retire el tubo del bao y enfre.

Verifique la presencia de azcares reductores con el reactivo de Benedict.

C. Accin de Amilasa Salival:

1. En un tubo de ensayo coloque 2ml de saliva y 2 ml de agua desilada. Mezcle bien.2. Coloque el tubo en un bao a 37C por 5 minutos.

3. Agregue 2 ml de solucin de almidn al 2%. Mezcle bien.

4. Cada 5 minutos realice la prueba con la solucin de lugol para verificr el avance de la hidrlisis.

5. Contine calentado y realizando la prueba hasta que la coloracin alcanzada sea similar a la realizada con la glucosa en el primer paso. Esto indica que la hidrlisis se ha completado.6. Retire del bao y enfre.

7. Verifique la presencia de azcares reductores con el reactivo de BenedictD. Reaccin de Benedict para verificar la presencia de azcares reductores:

1. Numerar 5 tubos de ensayo y proceder de acuerdo a lo indicado en la tabla:N de Tubo

12345

Reactivo de Benedict2.5 ml2.5 ml2.5 ml2.5 ml2.5 ml

Solucin de Almidn (2%)0.5 ml----

Solucin de Glucosa (2%)-0.5 ml---

Hidrolizado cido--0.5 ml--

Hidrolizado Enzimtico---0.5 ml-

Hidrolizado con Material Biolgico----0.5 ml

2. Mezclar bien y colocar los tubos en un bao de agua hirviente por 5 minutos.

3. Retirar los tubos del bao y enfriar.

4. Registrar los resultados obtenidos.

5. Observaciones.-

1. Estos representan estndares de color para la comparacin del inicio y fin de cada reaccin.

2. Color morado intenso

3. Color anaranjado

Hidrlisis enzimtica

Se alcanz el resultado deseado a los 30 minutos.

Accin de amilasa salival

Se alcanz el resultado deseado a los 20 minutos

Reaccin de Benedict para verificar la presencia de azcares reductores

N de tuboColoracin adquiridatiempo

1. almidn

(no cambio)-----

2. glucosa (rojizo)00:20 s.

3. hidrolizado cido (anaranjado)1:50 min

4. material biolgico hidrolizado(verde oliva)1:00 min

7. Conclusiones.-

En esta prctica se ha podido observar e identificar azucares reductores, as como identificar la accin de la hidrlisis de polisacridos en accin de la enzima alfa-amilasa y acido clorhdrico. Es importante destacar por ejemplo que el tubo de ensayo que no cambi de color es porque NO es un azcar reductor, el almidn. Tambin cabe recalcar la diferencia de los tiempos requeridos para la hidrlisis enzimtica y la accin de la amilasa salival, la cual la primera fue ms lenta as como su coloracin fue ms intensa que la segunda.8. Bibliografa.-Blanco, A(2001). Qumica biolgica. El Ataneo.

Vzquez.