Nghiên cứu xác định hàm lượng chất cấm dexamethason acetat trong mỹ phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

8/15/2019 Nghiên cứu xác định hàm lượng chất cấm dexamethason acetat trong mỹ phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng h…

http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-xac-dinh-ham-luong-chat-cam-dexamethason-acetat-trong 1/75

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

HÀN CHÍ TÚ

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢ NG

CHẤT CẤM DEXAMETHASON ACETAT

TRONG MỸ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGHỆ AN - 2014

WW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COMóng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TR ƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

HÀN CHÍ TÚ

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢ NGCHẤT CẤM DEXAMETHASON ACETAT

TRONG MỸ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướ ng d ẫ n khoa học:

PGS. TS. NGUYỄN KHẮC NGHĨA

NGHỆ AN - 2014





i

LỜ I CẢM ƠN

Luận văn đượ c hoàn thành tại phòng thí nghiệm chuyên đề bộ môn Hóa

phân tích - Khoa Hóa - Trường Đại học Vinh và Trung tâm Kiểm nghiệmDượ c phẩm - Mỹ phẩm Nghệ An.

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

- PGS.TS. Nguyễn Khắc Nghĩa đã giao đề tài, tận tình hướ ng dẫn và

tạo mọi điều kiện thuận lợ i nhất cho việc nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

- TS. Nguyễn Trung Dũng và TS. Mai Thị Thanh Huyền đã đóng góp

nhiều ý kiến quí báu để hoàn thiện luận văn. - Phòng đào tạo Sau đại học, khoa Hóa học cùng các thầy cô giáo, các

cán bộ phòng thí nghiệm khoa Hóa trường Đại học Vinh, cán bộ và k ỹ thuật

viên thuộc Trung tâm kiểm nghiệm Dượ c phẩm - Mỹ phẩm Nghệ An đã giúp

đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợ i cung cấ p hóa chất, thiết bị và dung cụ dùng

cho đề tài.

Xin cảm ơn tất cả những người thân trong gia đình và bạn bè đã độngviên, giúp đỡ , tạo mọi điều kiện cho tôi thực hiện và hoàn thành luận văn.

Nghệ An, tháng 10 năm 2014

Ngườ i thực hiện

Hàn Chí Tú





ii

MỤC LỤC

Trang

LỜ I CẢM ƠN ................................................................................................ i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT ......................... vi

DANH MỤC HÌNH .................................................................................... vii

DANH MỤC BẢNG .................................................................................... ix

DANH MỤC SƠ ĐỒ .................................................................................... x

MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1

I. Lý do chọn đề tài .................................................................................... 1

II. Bố cục của luận văn .............................................................................. 2

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN ......................................................................... 3

1.1. Giớ i thiệu về mỹ phẩm........................................................................ 3

1.1.1. Khái niệm .................................................................................... 3

1.1.2. Phân loại mỹ phẩm ...................................................................... 3

1.1.3. Thành phần của mỹ phẩm ............................................................ 4

1.1.4. Tác dụng của mỹ phẩm................................................................ 4

1.1.5. Sự phát triển của nấm mốc, vi khuẩn trong mỹ phẩm .................. 4

1.1.6. Các thành phần độc hại cho da có trong mỹ phẩm ....................... 5

1.2. Giớ i thiệu các đối tượ ng nghiên cứu ................................................... 7

1.2.1. Kem r ửa mặt ngăn ngừa mụn ...................................................... 7

1.2.2. Sữa r ửa mặt nhờ n da .................................................................... 8

1.2.3. Sữa tắm LUX .............................................................................. 9

1.2.4. Kem dưỡ ng da - Lành mụn ........................................................ 10

1.2.5. Kem dưỡ ng da ........................................................................... 11

1.3. Chất cấm dexamethason acetat ......................................................... 12

1.3.1. Công thức hóa học ..................................................................... 12

1.3.2. Tác dụng dượ c tính của dexamethason ...................................... 13

1.3.3. Các đặc tính lâm sàng ................................................................ 14





iii

1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ................................ 16

1.4.1. Nguyên lý .................................................................................. 16

1.4.2. Phân loại ................................................................................... 17

1.4.3. Pha tĩnh trong sắc k pha đảo .................................................... 18

1.4.4. Pha động trong sắc k pha đảo .................................................. 21

1.5. Các đại lượng đặc trưng của sắc k đồ .............................................. 24

1.5.1. Thời gian lưu: Retenion time (Rt) .............................................. 24

1.5.2. Hệ số dung lượng K’ ................................................................. 25

1.5.3. Độ chọn lọc (α) và độ phân giải (Rs) ......................................... 25

1.5.4. Số đĩa l thuyết N ...................................................................... 26

1.5.5. Hệ số bất đối xứng T ................................................................. 27

1.6. Hệ thống thiết bị HPLC .................................................................... 27

1.6.1. Bình đựng dung môi .................................................................. 28

1.6.2. Bộ khử khí degasse.................................................................... 28

1.6.3. Bơm (pump) .............................................................................. 29

1.6.4. Bộ phận tiêm mẫu (injection) .................................................... 29

1.6.5. Cột sắc ký .................................................................................. 29

1.6.6. Đầu dò (detector) ....................................................................... 30

1.6.7. Bộ phận ghi tín hiệu .................................................................. 31

1.6.8. In k ết quả .................................................................................. 31

1.7. Các phương pháp định lượ ng ............................................................ 31

1.7.1. Phương pháp đườ ng chuẩn ........................................................ 31

1.7.2. Phương pháp một mẫu chuẩn .................................................... 31

1.7.3. Phương pháp thêm ..................................................................... 32

1.7.4. Phương pháp thêm chuẩn .......................................................... 32

1.8. Đánh giá phương pháp phân tích ...................................................... 32

1.8.1. Khảo sát giớ i hạn phát hiện (LOD) và (LOQ) của phương pháp..... 32

1.8.2. Đánh giá sai số và độ lặ p lại của phép đo .................................. 33





iv

CHƯƠNG II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U VÀ THỰ C NGHIỆM ..... 34

2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ................................................................. 34

2.1.1. Thiết bị ...................................................................................... 34

2.1.2. Dụng cụ ..................................................................................... 35

2.1.3. Hóa chất .................................................................................... 35

2.2. Phương pháp lấy mẫu, bảo quản mẫu và xử lý mẫu .......................... 35

2.2.1. Lấy mẫu .................................................................................... 35

2.2.2. Các sơ đồ xử lý mẫu .................................................................. 36

2.3. Phương pháp phân tích...................................................................... 38

2.3.1. Khảo sát các điều kiện tối ưu ..................................................... 382.3.2. Xây dựng đườ ng chuẩn ............................................................. 38

2.3.3. Khảo sát giớ i hạn phát hiện (LOD) và giớ i hạn định lượ ng

(LOQ) của phương pháp ........................................................... 38

2.4. Xử lý số liệu thực nghiệm ................................................................. 39

CHƯƠ NG III. K ẾT QUẢ NGHIÊN CỨ U VÀ THẢO LUẬN ................ 41

3.1. Khảo sát tìm điều kiện tối ưu của phương pháp phân tích ................. 413.1.1. Khảo sát vạch phổ hấ p thụ ......................................................... 41

3.1.2. Khảo sát tỉ lệ pha động .............................................................. 42

3.1.3. Khảo sát tốc độ dòng ................................................................. 43

3.1.4. Khảo sát xác định khoảng nồng độ tuyến tính ........................... 44

3.2. Xây dựng đườ ng chuẩn, xác định giớ i hạn phát hiện (LOD) và

giớ i hạn định lượ ng (LOQ) của dexamethason acetat .............................. 45

3.2.1. Giới hạn phát hiện (LOD).......................................................... 47

3.2.2 Giới hạn định lượng (LOQ) ........................................................ 48

3.3. Đánh giá sai số và độ lặ p lại của phép đo .......................................... 48

3.4. Tổng k ết các điều kiện áp dụng phân tích dexamethason acetat

trong mẫu phân tích ................................................................................. 49

3.5. Áp dụng k ết quả nghiên cứu để phân tích một số mẫu mỹ phẩm ....... 50

3.5.1. Xác định hàm lượ ng dexamethason acetat một số mẫu mỹ phẩm..... 50





v

3.5.2. Xác định độ lặ p lại hàm lượ ng dexamethason acetat có

trong mẫu mỹ phẩm .................................................................. 51

3.6. Các sắc đồ của phép đo HPLC .......................................................... 53

3.6.1. Sắc đồ mẫu tr ắng ....................................................................... 53

3.6.2. Các sắc đồ mẫu chuẩn dexamethason acetat có nồng độ

khác nhau ................................................................................. 53

3.6.3. Sắc đồ các mẫu mỹ phẩm .......................................................... 57

K ẾT LUẬN ................................................................................................. 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 61





vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT

HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography)

LOD : Giớ i hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ : Giớ i hạn định lượ ng (Limit of quantitation)

MeOH : Methanol

ACN : Acetonitril

HPLC-MS : Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối đầu dò khối phổ

SKPB : Sắc ký phân bố SKPT : Sắc k pha thườ ng

SKPĐ : Sắc k pha đảo

TLC : Sắc ký lớ p mỏng (Thin Layer Chromatography)

KPH : Không phát hiện





vii

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1. Nang lông bị bít tắc, viêm nhiễm khi sử dụng mỹ phẩm .............. 6

Hình 1.2. Kem rửa mặt ngăn ngừa mụn Acnes ............................................ 7

Hình 1.3. Sữa rửa mặt Z .............................................................................. 8

Hình 1.4. Sữa tắm LUX ............................................................................... 9

Hình 1.5. Kem dưỡng da - Lành mụn B2 ................................................... 10

Hình 1.6. Kem dưỡng da VITAL CARE VITAMIN E CREME ................ 11

Hình 1.7. Hình ảnh cấu trúc không gian dexamethason acetat ................... 12

Hình 1.8. Bề mặt silica đã thủy phân ......................................................... 18Hình 1.9. Tạo nhánh trên bề mặt silica ...................................................... 19

Hình 1.10. Cấu trúc của cột ODS ................................................................ 19

Hình 1.11. Cấu trúc cột LC-DB ................................................................... 20

Hình 1.12. Cấu trúc cột có gốc isopropyl ..................................................... 20

Hình 1.13. Độ nhớt của hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ ở 25oC ............. 23

Hình 1.14. Sơ đồ hệ thống HPLC ................................................................ 27Hình 1.15. Đồ thị kỹ thuật đường chuẩn thêm chuẩn ................................... 32

Hình 2.1. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1100 ........ 34

Hình 3.1. Đồ thị khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của dexamethason

axetat ......................................................................................... 45

Hình 3.2. Đồ thị đường chuẩn của dexamethason acetat ............................ 46

Hình 3.3. Sắc đồ mẫu trắng.................................................................. ...... 53

Hình 3.4. Sắc đồ mẫu chuẩn dexamethason acetat có nồng độ 0,5 ppm ..... 53











viii

Hình 3.11. Sắc đồ mẫu MP-KR05 - Kem rửa mặt ngăn ngừa mụn Acnes .... 57

Hình 3.12. Sắc đồ mẫu MP-SR01 - Sữa rửa mặt Z ..................................... 57

Hình 3.13. Sắc đồ mẫu MP-ST04 - Sữa tắm LUX ....................................... 58

Hình 3.14. Sắc đồ mẫu MP DK 02 - Kem dưỡng da - Lành mụn B2 ........... 58

Hình 3.15. Sắc đồ mẫu MP DK 03 - Kem dưỡng da vital care viitamin E

creme ......................................................................................... 59





ix

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Tính chất của một số pha động trong sắc k lỏng ....................... 22

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát vạch đo phổ của dexamethason acetat ............. 42Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tỉ lệ pha động của dexamethason acetat ........... 43

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tốc độ dòng ..................................................... 43

Bảng 3.4. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính .......................................... 44

Bảng 3.5. Số liệu xây dựng đường chuẩn ................................................... 46

Bảng 3.6. Kết quả đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo....... ............... 48

Bảng 3.7. Các điều kiện đo dexamethason acetat phương pháp HPLC ....... 49Bảng 3.8. Lượng cân các mẫu mỹ phẩm .................................................... 50

Bảng 3.9. Kết quả đo của mẫu phân tích .................................................... 51

Bảng 3.10. Kết quả phân tích dexamethason acetate có trong mẫu KD2 ...... 52





x

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Trang

A. Sơ đồ xử l chất chuẩn ............................................................................ 36

B. Sơ đồ xử l mẫu mỹ phẩm ....................................................................... 37





1

MỞ ĐẦU

I. Lý do chọn đề tài

Vào những năm gần đây Việt Nam phát triển r ất nhanh về mặt kinh tế

đờ i sống của người dân ngày càng đượ c nâng cao yêu cầu làm đẹp đượ c mọingườ i quan tâm, nhất là các chị em phụ nữ...[9].

Đây cũng là yếu tố giúp cho ngành mỹ phẩm nướ c ta phát triển r ất mạnh

về số lượ ng và chất lượng cũng như đa dạng về sản phẩm. Nhưng chúng ta

vẫn còn hạn chế về kiến thức làm đẹp và chăm sóc da một cách thiếu khoa

học như sử dụng các loại mỹ phẩm, kem dưỡ ng da, kem bôi da không rõ

nguồn gốc [14]. Trong mỹ phẩm có chứa những thành phần nguy hại hoặcloại mỹ phẩm, kem dưỡ ng da không phù hợ p vớ i làn da của từng ngườ i thì

việc làm đẹ p sẽ tr ở nên vô cùng nguy hiểm, có tác dụng ngượ c lại vớ i mong

muốn làm đẹ p của chúng ta. Cùng vớ i một số nhà sản xuất bất chấ p sự an

toàn của người tiêu dùng đã trộn một số thuốc vào trong các mỹ phẩm, đặc

biệt là các chất thuộc nhóm glucocorticoid, những glucocorticoid r ẻ tiền, dễ

kiếm và thường đượ c sử dụng để tr ộn trong mỹ phẩm. Glucocorticoid là thuốccó tác dụng chống viêm mạch, chống dị ứng, ức chế miễn dịch,... và thuốc

phải bán theo đơn.

Các mỹ phẩm tr ộn glucocorticoid có nhiều tác dụng phụ không mong

muốn như: teo da, xơ cứng bì, viêm da đỏ ửng, giản mao mạch, mụn tr ứng cá

hoặc bội nhiễm nấm, vi khuẩn, vi rút,....[22, 28].

Xuất phát từ những vấn đề trên, Ngày 2/9/2003, Việt Nam đã k kết

"Hiệp định về Hệ thống hòa hợ p ASEAN trong quản lý mỹ phẩm"[1]. Theo

đó đã có quy định nhóm glucocorticoid là chất bị cấm sử dụng trong mỹ

phẩm.

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi chọn đề tài:“ Nghiên cứ u xác

đị nh hàm lượ ng chấ t cấ m dexamethason acetat trong m ỹ phẩ m bằng

phương pháp sắc ký l ỏng hi ệu năng cao (HPLC)” .





2

Để thực hiện đề tài chúng tôi đề ra các nhiệm vụ sau:

1. Khảo sát tìm điều kiện tối ưu của phương pháp phân tích

- Khảo sát vạch phổ hấ p thụ

- Khảo sát tỉ lệ pha động

- Khảo sát tốc độ dòng

2. Khảo sát xác định khoảng nồng độ tuyến tính

3. Khảo sát lập phương trình đườ ng chuẩn của dexamethason acetat

4. Xác định giớ i hạn phát hiện (LOD) và giớ i hạn định lượ ng (LOQ)

của dexamethason acetat

5. Đánh giá sai số và độ lặ p lại của phép đo 6. Áp dụng k ết quả nghiên cứu để phân tích một số mẫu mỹ phẩm

II. Bố cục của luận văn

Luận văn gồm 63 trang vớ i 11 bảng số liệu, 31 hình: Mở đầu 2 trang;

Chương I: Tổng quan 31 trang; Chương II: Phương pháp nghiên cựu và thực

nghiệm 7 trang; Chương II: Kết quả nghiên cứu và thảo luận 19 trang; K ết

luận 1 trang; Tài liệu tham khảo 3 trang gồm 28 tài liệu tham khảo.





3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1. Giớ i thiệu về mỹ phẩm

1.1.1. Khái niệm

- Theo cách hiểu thông thườ ng, mỹ phẩm có nghĩa là sản phẩm làm

đẹ p, dùng chủ yếu cho phái nữ, nhằm giúp họ tr ở nên xinh đẹp hơn.

- Theo từ điển y dượ c, mỹ phẩm được định nghĩa là sản phẩm đượ c

chế tạo nhằm mục đích làm sạch cơ thể, tăng thêm vẻ đẹp, làm tăng sức hấ p

dẫn, làm thay đổi diện mạo bên ngoài, giúp bảo vệ nuôi dưỡ ng các mô bên

ngoài cơ thể [14].

- Theo định nghĩa trên, mỹ phẩm đã không còn là một sản phẩm làm

đẹp thông thường mà mang nghĩa của dượ c phẩm. Đó cũng chính là l do

mà các nhà sản xuất cũng như các bác sĩ da liễu luôn khuyên ngườ i tiêu dùng

sử dụng mỹ phẩm một cách đúng đắn và thận tr ọng [14].

1.1.2. Phân loại mỹ phẩm

Thông thườ ng mỹ phẩm đượ c chia làm ba loại [9, 13, 14, 19]:+ Loại thứ nhất là mỹ phẩm bề ngoài: Các sản phẩm trang điểm bề mặt

(sản phẩm make up, sơn móng tay, thuốc nhuộm tóc…). Các sản phẩm này

chỉ tác động đến vẻ bề ngoài chứ không đi sâu vào sinh lý da.

+ Loại thứ hai là mỹ phẩm dự phòng, bao gồm các sản phẩm chăm sóc

da, dưỡ ng da dành cho việc làm chậm lại các biến đổi sinh lý của da (lão hóa,

khô da) và bảo vệ chống lại các tác nhân bên ngoài (ô nhiễm, ánh nắng, chất

kích ứng): Kem chống nắng, sữa dưỡ ng ẩm, nướ c hoa hồng,…

+ Loại thứ ba là các sản phẩm sửa chữa được dùng khi người ta đã thất

bại trong dự phòng. Đối mặt vớ i các tổn thương ngườ i ta phải chăm sóc, khắc

phục chúng bằng các sản phẩm như là làm căng, làm ẩm, làm láng, tái sinh,

giảm béo, chống r ụng tóc,…Vớ i chuyên khoa da liễu, các tổn thương thuộc về

lĩnh vực của da như: vảy nến, chàm, mụn tr ứng cá,… Dượ c mỹ phẩm về da là

một công cụ bổ sung hiệu quả cho các điều tr ị y khoa.





4

Ngoài ra còn có thể phân loại mỹ phẩm theo các bộ phận mà nó cho tác

dụng như sau:

+ Da: xà bông tắm, sữa tắm, phấn hồng, phấn nền, bột thơm, nướ c hoa,

chất làm tr ắng, chất làm mềm, nướ c hoa, kem chống nắng, kem dưỡ ng da,…

+ Lông tóc: dầu gội, dầu xả, thuốc nhuộm tóc, thuốc duỗi tóc, thuốc uốn

tóc, gel vuốt tóc, kem tẩy lông, kem cạo râu,…

+ Mắt: bút k ẻ mắt, k ẻ lông mày, kem chải mi, mi mắt giả

+ Môi: son môi, chất làm ẩm môi, chất làm bóng môi,…

+ Móng tay, chân: sơn, thuốc tẩy sơn,...

1.1.3. Thành phần của mỹ phẩmMỹ phẩm chủ yếu có hai thành phần:

- Thành phần cơ bản của hệ nhũ tương.

- Các thành phần phụ khác: gồm chất làm đặc, chất làm mềm, chất bền

nhũ, chất bảo quản, chất có tính chất tr ị liệu, màu, mùi [6, 19].

1.1.4. Tác dụng của mỹ phẩm

- Tùy theo từng loại mỹ phẩm và mục đích sử dụng có những tác dụng sau:- Lớ p kem thoa lên da như là “tấm chăn” lọc tia mặt tr ờ i, làm giảm tác

hại của tia UV đối vớ i da. Mỹ phẩm chứa các loại vitamin chống các tác nhân

gây lão hoá, các lớ p che chắn chống ô nhiễm từ môi trườ ng.

- Giúp làn da mịn màng, săn chắc, ngăn ngừa và hạn chế mụn phát triển.

- Có tác dụng làm tr ắng da, nhất là sử dụng vào ban đêm vì đêm là thờ i

điểm l tưở ng nhất để da hấ p thụ các dưỡ ng chất làm tr ắng da do quá trình

trao đổi chất của các tế bào diễn ra mạnh mẽ.

- Mỹ phẩm cũng giúp loại bỏ những tế bào chết trên da và giữ ẩm cho da.

- Mỹ phẩm tác động sâu vào bên trong da giúp kích thích, tái sinh tế bào

da, phục hồi làn da, tạo một làn da tươi khỏe [9, 12, 13].

1.1.5. Sự phát triển của nấm mốc, vi khuẩn trong mỹ phẩm

- Do các loại mỹ phẩm thường có độ ẩm và nhiệt độ r ất thích hợp để

nấm mốc, vi khuẩn sinh sôi nảy nở .





5

- Ngoài nhiệt độ và độ ẩm, còn có những yếu tố khác cũng là điều kiện

thuận lợi để nấm mốc, vi khuẩn phát triển như: độ pH, nguồn dinh dưỡ ng

trong mỹ phẩm

- Nấm mốc có khả năng đồng hoá các loại hydrocacbon phức tạ p giống

như lignin, cellulose, tinh bột, gelatin,... Có đượ c khả năng này là do nấm là

những sinh vật hoá dị dưỡ ng (chemoheterotroph), có hệ thống enzym ngoại

bào r ất phát triển. Các enzym sau khi đã tiết ra môi trườ ng xung quanh, chúng

phân huỷ các hydrocacbon phức tạ p thành các phân tử nhỏ, sau đó các phân

tử này đượ c vận chuyển qua màng vào tế bào. Đó là nguồn dinh dưỡng để

nấm xây dựng các thành phần cần thiết cho tế bào.

- Sự đơn giản về nguồn dinh dưỡ ng, khả năng chống chịu với các điều

kiện khắc nghiệt của môi trườ ng, cùng với các phương thức sinh sản đa dạng

của nấm đã giúp cho chúng phát triển r ất nhanh vớ i số lượ ng lớ n.

Tớ i thời điểm hiện nay (2010), có khoảng 2500 loài nấm đã đượ c ghi

nhận trên lãnh thổ Việt Nam, trong số đó khoảng 1400 loài thuộc 120 chi là

những loài nấm lớ n (macro fungi). Hay gặ p trên các bãi cỏ, trên những đống

lá mục, cũng có khi k sinh trên cơ thể thực vật khác. Nó thườ ng bắt đầu sinh

sôi và nảy nở ở những nơi thờ i tiết ẩm thấ p....[3, 14, 19].

1.1.6. Các thành phần độc hại cho da có trong mỹ phẩm

Mỹ phẩm được bào chế theo nhiều dạng, nhiều mùi, nhiều màu sắc

khác nhau theo những công thức, nguyên liệu cũng khác nhau. Có nhiều

loại mỹ phẩm được tạo từ các thành phần nguyên liệu khác nhau nhưngthường được trộn từ các loại mỹ phẩm Trung Quốc, thuốc tây, và các loại hóa

chất dùng trong công nghiệp.

Trong mỹ phẩm thường có những thành phần hóa học gây hại cho da.

Theo điều tra, đa số các loại mỹ phẩm đều có chứa: nhiều hóa chất độc hại

như thủy ngân, hydroquinone, glucocorticoid, acide salicylique, iode,

hydrogen peroxyde,… Những chất này thường gây nên hiện tượng phồng rộp





6

da, nhiễm trùng da, tức ngực, nôn mửa, phổi bị ứ nước, thậm chí còn có thể

dẫn đến suy thận, suy gan,…

Hình 1.1. Nang lông bị bít tắc, viêm nhiễm khi sử dụng mỹ phẩm

Đặc biệt, các chất thuộc nhóm glucocorticoid trong mỹ phẩm là mối đe

dọa cực kì nguy hiểm cho làn da và sức khỏe của bạn [3, 22, 28].

Các thành phần độc hại cho da có trong mỹ phẩm đã được quy định

theo "Hiệp định về Hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản l mỹ phẩm". Các

quốc gia của Hiệp hội các nước Đông Nam Á (ASEAN) ký ngày 2 tháng 9

năm 2003 đã tham gia hiệp định này ngoại trừ Đông Timor. Hiệp định này ký

ngày 2 tháng 9 năm 2003 và có hiệu lực vào ngày 1/1/2008 [1].





7

1.2. Giớ i thiệu các đối tượ ng nghiên cứ u

1.2.1. Kem rử a mặt ngăn ngừ a mụn

Hình 1.2. Kem rửa mặt ngăn ngừa mụn Acnes

Số thứ tự: 01

K ỹ hiệu mẫu: 14KSMP006

Mã số mẫu: KR05

Tên mẫu: Kem r ửa mặt ngăn ngừa ngừa mụn Acnes

Thành phần: Water, Glycerin, Palmitic acid, Butylene Glycol, Polyethylene

Glycol Monostearate, Myristic Acid, Potassium hydroxide, Lauric Acid, Clea

Europaea Fruit oil, Lauric Acid Diethanolamide, Potassium, Lauroyl

Glutamate, Isopropylmethylphenol, Dipotassium Glycymhizinate, Tocopheryl

Acetate, Magnesium Ascorbyl, Phosphate, Saxifraga, Ethanol, Potassium

Cloride, Sodium Hydroxide, Lauryl Hydroxy sultaine, Chromium Oxide, Cl

77492, Lactic Fragranca.

Số công bố chất lượ ng: 0891/12/CBMP - QLD

Ngày SX/Số lô: 31/03/2013

Hạn dùng: 31/03/2016

Nơi sản xuất: Công ty TNHH ROHTO MENTHOLATTUM





8

1.2.2. Sữ a rử a mặt nhờ n da

Hình 1.3. Sữa rửa mặt Z

Số thứ tự: 02


Mã số mẫu: SR02

Tên mẫu: Sữa r ửa mặt Z

Thành phần: Stearic Acid 10%, PEG 400, Vitamin E 0,1%, Tinh dầu nghệ

1%, Triethanolamide 1%, Glycerin 2%, Glycerin Stearate 3%, Methyl &

Propyl Paraben 0,3%, Hương liệu 0,3%, Nướ c vừa đủ 100%.

Số công bố chất lượ ng: 000237/09/CBMP-HCM


Hạn dùng: 26/01/16

Nơi sản xuất: Công ty Kim nga II Cosmetics





9

1.2.3. Sữ a tắm LUX

Hình 1.4. Sữa tắm LUX

Số thứ tự: 03


Mã số mẫu: ST04

Tên mẫu: Sữa tắm LUXThành phần: Water, Myristic acid, Laury acid, Potassium Hydroxide, Sodium

Laureth Sulfate, Myistic Acid, Cocamidopropyl, Betaine, Lauric acid,

Potassium Chloride, Sodium Laureth Sulfate, Patr....acid, Perfume, Glycol

Distearate, Pru...Avium(Sweet Cherryl), Seed Oil, Cocamidopropyl Beta...,

Hydroxypropyl, Methylcellulose, Cetearyl Alcohol, Cetearyl Glucoride, Paim

Kenelamide MEA, Fragrance, Glycol Distearate, Sidium PCA,Phenoxyethanol, Tetrasodiom EDTA, Imidaazolidinyl Urea, Guar

Hydroxypropul Trinonium Chloride. Sodium Chloride, Citric Acid, Cl4700,

Cl17200.

Số công bố chất lượ ng: 0642/11/CBMP - QLD


Hạn dùng: 31/02/2016

Nơi sản xuất: Công ty TNHH Quốc tế Unilever Việt Nam





10

1.2.4. Kem dưỡ ng da - Lành mụn

Hình 1.5. Kem dưỡng da - Lành mụn B2

Số thứ tự: 05


Mã số mẫu: KD02

Tên mẫu: Kem dưỡ ng da - Lành mụn B2

Thành phần: Water, Glycerin, Steartrimonium Cloride, DicocodimoniumCloride, Cyanoccobalamim, Steartrimonium Bromide, Fragrance Butylene

Glycol, Isopropyl Alcohol, Jasminuim Officinale Oil.

Số công bố chất lượ ng:


Hạn dùng: 18/04/2015

Nơi sản xuất: Cơ sở chế biến mỹ phẩm Vinh Tân





11

1.2.5. Kem dưỡ ng da

Hình 1.6. Kem dưỡng da VITAL CARE VITAMIN E CREME

Số thứ tự: 04


Mã số mẫu: KD03

Tên mẫu: KEM DƯỠ NG DA VITAL CARE VITAMIN E CREME

Thành phần: Vitamin E, Vitamin A, Vitamin D, Water, Paraffinum

liquidum, isopropyl Myristate, Caprylic Capric Triglycerides,, Tocopherol,

Cetyl Alcohol, Niacinamide, Octyl Methoxy Cinnamate, Sorbitan, Stearate,

Polyoxyethylene, Stearate, Phenoxyethanol, Fragrances.

Số công bố chất lượ ng: 0121/09/CBMP- HCM

Ngày SX/Số lô: 12/2013

Hạn dùng: 12/2016

Nơi sản xuất: Vital Care - USA





12

1.3. Chất cấm dexamethason acetat

1.3.1. Công thứ c hóa học

Cấu tạo

Cấu trúc không gian dexamethason acetat

Hình 1.7. Hình ảnh cấu trúc không gian dexamethason acetat

Dexamethasone acetat

Công thức phân tử: C24H31FO6

Khối lượ ng trung bình: 434.497711

Khối lượ ng Monoisotopic: 434,21048

Tên khoa học: 9-fluoro-11,17-dihydroxy-16-methyl-3,20-dioxopregna-1,4-dien-21-yl acetat [22].





13

Tính chấ t lý hóa

Bột k ết tinh màu tr ắng hoặc gần như trắng, đa hình. Dễ tan trong ethanol

96% và aceton, khó tan trong methylen clorid, thực tế không tan trong nướ c.

Dexamethasone acetat chứa từ 97,0 đến 103,0% C24H31FO6 ở dạng khan.

1.3.2. Tác dụng dượ c lý của dexamethason

Dexamethason là dẫn xuất của glucocor ticoid, do đó dexamethason có

các đặc tính chất của glucocorticoid và đặc biệt nó có hoạt tính chống viêm

mạnh, ức chế miễn dịch..., nhất trong số các dẫn xuất của glucocorticoid.

Dexamethason mạnh hơn hydrocortison 30 lần, mạnh hơn prednisolon 7 lần.

V ề tác đụng chố ng viêm

Glucocorticoid tự nhiên (có sẵn trong cơ thể do tuyến thượ ng thận tiết

ra) và glucocorticoid tổng hợ p hữu cơ đều có hoạt tính chống viêm mạnh, có

thể ức chế ở giai đoạn phiên mã của các yếu tố có vai trò quan tr ọng trong

phản ứng viêm [22].

- Các glucocorticoid chống lại các biểu hiện của quá trình viêm dù do

bất k ỳ nguyên nhân gì (cơ học, hóa học, nhiễm khuẩn, tia xạ, miễn dịch), đólà do glucocorticoid:

Làm giảm tác dụng hoặc ức chế các chất trung gian gây viêm như các

cytokin (interleukin,TMF, GM-CSF) ecosanoid (prostaglandin, leukotrien)

giảm phóng thích histamin từ tế bào.

Làm giảm sự tậ p trung bạch cầu tại ổ viêm như neutrophil, đại thực bào

và giảm cả hoạt tính của bạch cầu này.

- Glucocorticoid còn làm giảm chức năng của nguyên bào sợi, do đó

làm giảm suất collagen và glycosaminglycan do đó giảm sự hình thành mô

liên k ết. Điều này góp phần ức chế quá trình viêm mãn tính nhưng cũng làm

chậm lành vết thương [25, 28].

V ề tác d ụng ứ c chế miễ n d ịch

- Glucocorticoid làm giảm sản sinh kháng thế (immunoglobulin).

- Glucocorticoid làm giảm các thành phần bổ thể trong máu.





14

Nhờ các tác dụng trên mà glucocorticoid chữa đượ c phản ứng quá mẫn,

kháng viêm, nhưng điều đó làm mất đi đáp ứng viêm có tính bảo vệ, làm giảm

khã năng đề kháng nên dễ nhiễm khuẩn, nhiễm nấm.

Sự giảm tạo collagen đượ c ứng dụng để tr ị sẹo lồi và ngăn cản sự phát

triển của tổ chức sừng trong một số bệnh về da nhưng làm chậm tiến trình

lành vết thương [28].

1.3.3. Các đặc tính lâm sàng

Dexamethasone acetat là tá dượ c [8, 22, 28]:

Chỉ định:

Các chỉ định dùng liều pháp glucocorticoid như: kháng viêm, dị ứng,

viên khớp, viêm đa khớ p, viêm da dị ứng, ức chế sự phân chia tế bào da và

biểu bì.

Chố ng chỉ định:

Mẫn cảm vớ i dexanethason acetat.

Nhiễm nấm da, bôi chỗ tr ầy xướ c, nhiễm virus tại chỗ hoặc nhiễm

khuẩn lao, lậu chưa kiểm soát đượ c bằng thuốc kháng khuẩn và khớ p bị hủy

hoại nặng.

Thn trng:

Ngườ i bị loãng xương, hoặc mớ i phẫu thuật ruột, loét dạ dày - tá tràng,

đái tháo đường, tăng huyết áp, suy tim, suy thận, lao thì cần phải theo dõi chặt

chẽ và điều tr ị tích cực các bệnh đó nếu cần phải dùng dexamethason.

Tương tác thuốc: - Các barbiturat, phenytoin, rifampicin, rifabutin, carbamazepin,

ephedrin, aminoglutethimid có thể làm tăng thanh thải corticosteroid nên làm

giảm tác dụng điều tr ị.

- Corticosteroid đối kháng tác dụng của các tác nhân gây hạ đườ ng

huyết (k ể cả Insulin), thuốc hạ huyết áp và thuốc lợ i tiểu. Corticosteroid làm





15

tăng tác dụng hạ kali huyết của acetazolamid, các thiazid lợ i tiểu quai,

carbenoxolon.

- Sự thanh thải salicylat tăng khi dùng đồng thờ i vớ i corticoid, vì vậy

khi ngừng corticoid dể bị ngộ độc salicylat.

- Các thuốc lợ i tiểu làm giảm kali huyết (ví dụ thiazid, furosemid) và

amphotericin B có thể làm tăng tác dụng giảm kali huyết của glucocorticoid.

Tác dụng không mong muốn

Thườ ng gặ p: ADR ≥ 1/100

- Rối loạn điện giải: hạ kali huyết, giữ natri và nước gây tăng huyết áp

và phù nề.

- Nội tiết và chuyển hóa: hội chứng dạng cushing, giảm bài tiết ACTH,

teo tuyến thượng thận, giảm dung nạp glucid.

- Cơ xương: teo cơ hồi phục, loãng xương, gãy xương bệnh l, nứt đốt

sống, hoại tử xương vô khuẩn.

- Tiêu hóa: loét dạ dày tá tràng, loét chảy máu, loét thủng, viêm tụy cấp.

-

Da:

+ Teo da (thường gặp ở mặt và quanh miệng).

+ Da ửng đỏ hoặc có nhiều vết lằn

+ Có vết bầm máu, rậm lông

+ Làm trầm trọng trứng cá đỏ (r osacea)

+ Mất sắc tô da từng phần

+ Che đậy nhiễm khuẫn và xuất hiện nấm da - Thần kinh: mất ngủ, sảng khoái.

Ít gặp, 1/1000 < ADR < 1/100

Quá mẫn, đôi khi gây choáng phản vệ, tăng bạch cầu, huyết khối tắc

mạch, tăng cân, ngon miệng, buồn nôn, khó ở, nấc, áp xe vô khuẩn .

Lượ ng dng :

Loại dượ c này chỉ dùng theo đơn của bác sỹ.





16

1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

1.4.1. Nguyên lý

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968

trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một

phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột

là chất r ắn đã được phân chia dướ i dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên

một chất mang r ắn, hay một chất mang đã đượ c biến bằng liên k ết hóa học vớ i

các nhóm chức hữu cơ.

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phát triển r ất nhanh từ cuối những

năm 1980. Việc sử dụng các chất nhồi có kích thướ c nhỏ (5-10 m) làm cho

hiệu quả tách của phương pháp này tốt hơn so với phương pháp lỏng cổ điển.

Có thể nói một cách đơn giản HPLC là một sắc ký cột (column

chromatography) đi kèm vớ i một detector nhạy để có thể phát hiện đượ c các chất

tách ra trong quá trình chạy sắc ký. Vớ i những tiến bộ k ỹ thuật về cột, detector

đã chuyển sắc ký cột thành phương pháp phân tích có tốc độ nhanh và hiệu suất

cao. Loại này cần phải có hệ thống bơm cao áp để đẩy pha động vớ i áp suất cao

đến khoảng 30 Mpa (300 atm) nhằm tạo dòng chảy với lưu lượ ng vài mililit/phút

qua cột tách. Lượ ng mẫu phân tích bằng HPLC chỉ cần khoảng 20 l.

Phương pháp này ngày càng đượ c sử dụng r ộng rãi và phổ biến vì nhiều

l do: có độ nhạy cao, khả năng định lượ ng tốt, thích hợ p tách các hợ p chất khó

bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt. Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất

r ộng, như phân tích các hợp chất thuốc tr ừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ

gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dượ c phẩm, môi trường…

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có khả năng tách các hợ p chất đặc

thù như:

- Các hợ p chất cao phân tử và ion thuộc các đối tượ ng nghiên cứu y

học, sinh học, …

- Các hợ p chất tự nhiên không bền.





17

- Các hợ p chất kém bền nhiệt, các chất dễ nổ.

Các hợ p chất trên gồm có: nucleozit, nucleotit, axit amin, đườ ng,

polisacarit, sắc tố thực vật, axit hữu cơ, lipit không phân cực và phân cực,

chất màu, dượ c phẩm, chất hoạt động bề mặt, vitamin, kháng sinh, …

Điều khác biệt giữa HPLC và GC là trong phương pháp HPLC, mẫu

chỉ cần làm hoà tan mà không cần làm bay hơi, do đó HPLC có thể phân tích

đượ c các chất mà không sợ gây ra sự phân hủy nhiệt trong quá trình phân

tích [17, 21].

1.4.2. Phân loại

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, ngườ i

ta chia HPLC thành 4 loại:

Sắc ký hấ p phụ hay sắc ký lỏng r ắn(adsorption/liquid chromatography).

Sắc ký phân bố (partition chromatography).

Sắc ký ion (ion chromatography).

Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).

Trong đó, sắc ký phân bố (SK PB) đượ c ứng dụng nhiều nhất vì có thể

phân tích đượ c những hợ p chất từ không phân cực đến những hợ p chất r ất

phân cực, hợ p chất ion có khối lượ ng phân tử không quá lớ n (< 3000).

SKPB đượ c chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa

pha tĩnh và pha động: sắc k pha thườ ng (hay còn gọi là sắc ký pha thuận) -

SKPT (normal phase chromatography) và sắc k pha đảo - SKPĐ (reversed

phase chromatography).Trong sắc ký ion: Pha tĩnh là các chất hữu cơ mang các nhóm hoạt

động khác nhau: cation để tách các kim loại kiềm và kiềm thổ, amonium, các

amin-anion để tách các anion vô cơ, phosphate hữu cơ.

Trong SKPT, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động. Pha

tĩnh loại này sẽ có ái lực vớ i các hợ p chất phân cực. SKPT dùng để tách và

phân tích các hợ p chất có độ phân cực cao vớ i phân tử lượ ng không lớ n lắm.





18

SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại sắc k trong đó pha tĩnh ít phân cực

hơn pha động. Phương pháp này dùng phân tích các hợ p chất từ không phân

cực đến phân cực. Hầu hết các hợ p chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân

cực) r ất thích hợ p cho phân tích bằng SKPĐ. Dung môi sử dụng trong SKPĐ

là các dung môi phân cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng

mà lại r ẻ tiền. Do đó, SKPĐ đượ c ứng dụng nhiều và phổ biến hơn SKPT [10,

15, 16, 17].

1.4.3. Pha tĩnh trong sắc k pha đo

Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợ p chất hữu cơ

đượ c gắn lên chất mang r ắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:

Pha tĩnh đượ c giữ lại trên chất mang r ắn bằng cơ chế hấ p phụ vật l →

sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography). Pha tĩnh liên kết hóa học vớ i

chất nền → sắc ký pha liên k ết (bonded phase chromatography).

Trong quá trình sử dụng, ngườ i ta nhận thấy sắc ký pha liên k ết có

nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng - lỏng vì một số nguyên nhân sau:

Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất

mát pha tĩnh trong thờ i gian sử dụng và gây nhiễm đối vớ i hợ p chất phân tích.

Do pha tĩnh của sắc ký lỏng - lỏng dễ tan trong pha động nên ngườ i ta

không thể ứng dụng phươ ng pháp r ửa giải gradient dung môi.

Vì vậy, ta thườ ng chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên k ết và

phần lớ n các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc

dạng này.Bề mặt các hạt silica - SiO2 (các hạt này có đườ ng kính 3, 5 hoặc 10

µm) đượ c xử lý (thủy phân) bằng cách đun nóng vớ i HCl 0,1M trong một

hoặc hai ngày để tạo ra những nhóm SiOH như sau (thông thườ ng chỉ có

khoảng 8 µmol SiOH/m2 bề mặt):

Hình 1.8. Bề mặt silica đã thủy phân





19

Sau đó bề mặt silica đã thủy phân này sẽ đượ c cho phản ứng vớ i các

organochlorosilan để tạo ra các pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình

hoặc r ất phân cực tùy theo nhóm R gắn vào.

Hình 1.9. Tạo nhánh trên bề mặt silica

Thườ ng chỉ khoảng 50% nhóm -OH mất H+ để tạo ra HCl (tức < 4

µmol/m2 bề mặt bị silan hóa) vì sự k ết hợ p sẽ dần dần bị ảnh hưở ng bở i hiệuứng lậ p thể. Ngoài nhóm Cl ngườ i ta còn sử dụng -OCH3.

Hợ p chất cần phân tích khi đi qua pha tĩnh sẽ bị giữ lại bở i những lực

lượng tương tác khác nhau tùy thuộc tính chất, đặc điểm của chất tan và pha tĩnh.

Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợ p chất siloxan hầu như không phân

cực hoặc ít phân cực. Đó là các ankyl dây dài như C8 (n-octyl), C18 (n-

octadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơnnhư C2; ngoài ra còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân

cực cao hơn nhóm alkyl. Ngườ i ta nhận thấy các alkyl dây dài cho k ết quả

tách ổn định hơn các loại khác nên đây là loại đượ c sử dụng nhiều nhất.

Hình 1.10. Cấu trúc của cột ODS

Tuy nhiên do hiệu ứng lậ p thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn

nhóm -OH chưa phản ứng, gây ảnh hưở ng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy

môi trườ ng pH phân tích.





20

Trong môi trườ ng quá acid (pH < 2) thì có sự phân ly các nhóm ether

(-O-Si-C18) ra khỏi nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân

tích không còn tương tác tốt với pha tĩnh nữa.

Trong môi trường bazơ (pH > 7), chính nền silic mang pha tĩnh có thể

bị hòa tan (SiO2 thành silicat), hệ quả là số đĩa l thuyết N giảm và số nhánh

ghép cũng giảm, mũi sắc ký r ộng ra và thời gian lưu cũng có thể giảm. K ết

quả phân tích như vậy sẽ mất đi độ chính xác.

Một trong những cách khắc phục hiện tượ ng này là dùng các chất như

trimethylchlorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexamethyldisilazan (ít sử dụng hơn)

để tương tác vớ i nhóm -OH này (gọi là hiện tượ ng end-capping). Lúc này tasẽ có loại cột ít tương tác vớ i chất phân tích có tính bazơ (cột LC-DB của

hãng SUPELCO).

Hình 1.11. Cấu trúc cột LC-DB

Có một cách khác để loại tr ừ bớ t ảnh hưở ng của nhóm -OH mà không

cần tương tác vớ i nó là thay những nhóm methyl của -Si(CH3)2-C18 bằng

những nhóm thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che đi những

nhóm -OH, cản tr ở tương tác của nhóm -OH vớ i chất cần phân tích.

Hình 1.12. Cấu trúc cột có gốc isopropyl

Ngườ i ta còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực để tăng thêm độ

phân cực của dây C18, làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối vớ i nhữnghợ p chất phân cực mạnh (cột EPS - Expended Polar Selectivity).





21

Ngoài sườ n silica, thờ i gian gần đây ngườ i ta có sử dụng đến nền nhựa

polystyren (Polystyren Reversed Phase - PRP) cho phép phân tích trong môi

trườ ng pH từ 1 - 13. Cột này dễ sử dụng trong môi trường acid và bazơ mạnh

[16, 17, 18].

1.4.4. Pha động trong sắc k pha đo

Dựa vào các tài liệu, dược điển, thành phần và tính chất của các chất có

trong mẫu phân tích... từ đó ta lựa chọn pha động phù hợp để cho quá trình

r ửa giải tách hoàn toàn các chất có trong mẫu. Quy trình đó phải đáp ứng đầy

đủ các tiêu chuẩn của pic đã trình bày đồng thờ i phải có thờ i gian phân tích

phù hợ p nhằm tiết kiệm đượ c dung môi hóa chất, thờ i gian phân tích mẫu,giảm thiểu sự hoạt động của thiết bị.

Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:

Hòa tan mẫu phân tích.

Phù hợ p với đầu dò.

Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh.

Có độ nhớ t thấp để tránh áp suất dội lại cao.Tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade).

Do đó, trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được pha động có thành

phần phù hợ p thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất, đối vớ i hỗn hợ p các

chất cần phân tích.

Chính vì vậy pha động cần có cầu yêu cầu sau:

Pha động phải trơ với pha tĩnh đã có, không được làm cho pha tĩnh bị

biến đổi hóa học.

Pha động phải hòa tan đượ c các chất phân tích thì mớ i r ửa giải đượ c

chúng (đặc biệt phải chú khi thay đổi pha động phải r ửa cột bằng dung môi

phù hợp để không làm tủa các chất có trong cột, hay pha động có sẵn trong cột

Ví dụ: đệm phosphat r ửa ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị k ết tủa trên column).

Pha động:





22

+ Phải bền vững theo thờ i gian: càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất là

chúng là pha động không bị phân hủy trong suốt thờ i gian phân tích mẫu.

+ Phải có độ tinh khiết cao: dung môi cho HPLC, hoá chất tinh khiết

phân tích.

+ Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.

+ Phải phù hợ p vớ i loại detector: Ví dụ: UV - Vis thì dung môi không

đượ c hấ p thụ quang (Ví dụ: acid acetic ở bướ c sóng thấ p < 220 nm). Detector

huỳnh quang thì dung môi không đượ c phát quang.

+ Phải kinh tế, không quá hiếm và đắt.

Trong sắc k pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao. Trên lý

thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực

tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitril (ACN) và tetrahydrofuran (THF) là

đạt yêu cầu nhất. Nướ c là một dung môi đượ c cho vào các dung môi hữu cơ

để giảm khả năng r ửa giải.

Mỗi dung môi đều đặc trưng bở i các hằng số vật l như chỉ số khúc xạ

(refractive index), độ nhớ t (viscocity), nhiệt độ sôi (boiling point), độ phân

cực (polarity index), độ r ửa giải (eluent strength) …

Trong đó độ phân cực và độ r ửa giải có tác động lớ n lên khả năng phân

tách của các mũi sắc ký [15, 24].

Bng 1.1. Tính chất của một số pha động trong sắc k lỏng





23

Có ba thông số gây ảnh hưở ng lớn đến tách các mũi sắc ký: số đĩa l

thuyết N, hệ số dung lượng K’, độ chọn lọc α. Khi sự thay đổi thành phần pha

động không đem lại k ết quả tách mũi theo yêu cầu thì chúng ta phải thay đổi

bản chất pha động (sử dụng dung môi khác), tức thay đổi α. Đôi khi có thể

phải thay đổi cả pha tĩnh.

Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tương tác giữa hợ p chất cần phân

tích và pha động phụ thuộc r ất nhiều vào moment lưỡ ng cực, tính acid (cho

proton) hoặc tính bazơ (nhận proton) của dung môi.

Thông thường pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nướ c hoặc

dung dịch đệm vớ i một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan đượ c trong

nước. Nướ c là một dung môi r ất phân cực nên nó không tương tác vớ i những

nhóm alkyl không phân cực trong pha tĩnh, do đó nó được coi như pha động

yếu nhất và có tốc độ r ửa giải chậm nhất trong tất cả các dung môi động của

SKPĐ. Hỗn hợp nướ c và dung môi hữu cơ thường làm gia tăng độ nhớ t dẫn

đến việc tăng áp suất cột.

Hình 1.13. Độ nhớt của hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ ở 25 oC

Việc lựa chọn dung môi và thành phần dung môi trong pha động đượ c tối

ưu hóa cho những hợ p chất cần phân tích. Thông thường, ngườ i ta sử dụng hỗn

hợp dung môi MeOH/nước trướ c, r ồi ACN/nước hay THF/nướ c. Vớ i một hỗn





24

hợ p chất phân tích phức tạ p thì sẽ có sự tr ộn lẫn của các dung môi hữu cơ vớ i

nướ c. Khi lựa chọn thì phải chọn các hỗn hợ p MeOH, ACN và THF với nướ c có

độ r ửa giải tương đồng.

Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký

(chế độ isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn

(chương trình gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn.

1.5. Các đại lượng đặc trưng của sắc k đồ

K ết quả của quá trình tách các chất đượ c detector phát hiện ghi thành

sắc k đồ. Từ các thông số của các pic, nhiều đại lượng đặc trưng về lý thuyết

được đưa ra để đánh giá một quá trình sắc k. Dưới đây là một số đại lượ ng

thườ ng dùng trong thực tế và cách thay đổi các đại lượ ng này có lợ i cho quá

trình phân tích sắc ký [16, 17, 21].

1.5.1. Thờ i gian lưu: Retenion time (Rt)

Thờ i gian lưu của một chất là thờ i gian tính từ khi bơm mẫu vào cột

cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá tr ị cực đại.

Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thờ i

gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc k đã chọn. Vì vậy thờ i

gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất.

Thờ i gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:

Bản chất sắc ký của pha tĩnh.

Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.

Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan.Trong một số trườ ng hợ p thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha

động. Trong một phép phân tích nếu Rt nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu Rt

quá lớ n thì pic bị doãng và độ lặ p lại của pic r ất kém, thờ i gian phân tích r ất

dài đồng thờ i kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hóa chất, độ

chính xác của phép phân tích kém. Để thay đổi thời gian lưu ta dựa vào các

yếu tố trên.





25

1.5.2. Hệ số dung lượ ng K ’

Hệ số dung lượ ng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó

trong hai pha cộng vớ i sức chứa của cột, tức là tỷ lệ giữa lượ ng chất tan trong

pha tĩnh và lượ ng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng.

Thường đượ c tính theo công thức sau:

t -tt tR oR R k' = = = -1

t t to o o

Hệ số dung lượng k’ phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích, đặc

tính của pha tĩnh và pha động. Nếu k’ nhỏ hơn, tR cũng nhỏ và sự tách kém. K’ lớ n thì pic bị loãng, độ

nhạy kém. Trong thực tế k’ từ 1 đến 5 là tối ưu. Hai chất chỉ đượ c tách ra khỏi

nhau nếu chúng có giá tr ị khác nhau. Trong phân tích thườ ng chọn cột, pha

động và các điều kiện phân tích sao cho: 1< k’ <8.

1.5.3. Độ chọn lọc (α) và độ phân gii (Rs)

Để hoàn toàn phân tích hai cấu tử thì pic của chúng phải không đượ c

chồng lên nhau.

Tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng phân tích là độ chọn lọc và độ phân giải.

Độ chọn lọc α là tiêu chuẩn để đánh giá độ tách với hai đỉnh píc và

được định nghĩa.

'

2 R2 o

'

1 R1 o

K t - tα = =

K t - t

Hai pic tách với nhau khi α > 1. Tuy nhiên, nếu chân pic mà chồng lên

nhau thì cũng không thể phân tách hoàn toàn hai cấu tử. Nghĩa là độ chọn lọc

không đủ đánh giá chất lượ ng phân tích. Do đó chất lượng phân tích được đánh

giá dựa trên độ phân giải Rs ( Resolution) là đại lượng đượ c xét từ toàn bộ píc.

Độ phân giải (Rs) được tính như sau:

R2 R1 R2 R1

2 1 1/2,2 1/2,1

2 t - t 2 t - tR s = =w + w 1,70 (w + w )





26

Trong đó:

W là độ r ộng của chân pic

W1/2 là độ r ộng bán pic

Khi Rs = 1 thì 2 pic có độ lớn tương đương sẽ có 5% diện tích bị xen

phủ. Để tách hoàn toàn hai cấu tử thì Rs ≥ 1,5.

Nếu R nhỏ thì các pic chưa tách hẳn, việc tính toán diện tích pic sẽ

không chính xác.

Nếu R lớ n quá thì thờ i gian phân tích sẽ lâu, tốn nhiều pha động, độ nhạy

sẽ kém. Để khắc phục ta có thể thay đổi hệ pha động hay dùng chương trình

gradient dung môi. Tuy nhiên trong quá trình chạy sắc k dùng chương trìnhdung môi thì một số pha động có tỷ lệ thay đổi sẽ kéo theo sự thay đổi đườ ng

nền làm ảnh hưở ng r ất lớn đến thời gian lưu và diện tích của các pic ta phân tích

Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình gradient dung môi mà

chủ yếu là chúng ta phải tìm đượ c hệ pha động r ửa giải phù hợp, đáp ứng các

yêu cầu trong quá trình phân tích.

1.5.4. Số đĩa l thuyết NSố đĩa l thuyết là đại lượ ng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều

kiện sắc ký nhất định. Mỗi đĩa l thuyết trong cột sắc ký giống như một lớ p

pha tĩnh có chiều cao là H. Tất nhiên lớ p này có tính chất động, tức là một

khu vực của hệ phân tích mà trong đó một cân bằng nhiệt động đượ c thiết lậ p

giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động. Vì vậy, vớ i

một điều kiện sắc k xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối vớ i một

chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng xác định.

Số đĩa l thuyết N đượ c tính theo công thức:

22 2

R R R

1/2

t t t N = = 5,54. =16.

δ W W

Trong đó:

tR thời gian lưu của chất phân tíchW1/2 là độ r ộng tại điểm 1/2 của pic





27

1.5.5. Hệ số bất đối xứ ng T

Hệ số đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của pic trên sắc đồ

thu được. T đượ c tính bằng tỷ số độ r ộng của hai nửa pic tại điểm 1/10 hoặc

1/20 chiều cao của pic.

T =a

b

Pic dạng đối xứng hình Gaus trên thực tế khó đạt đượ c, vì vậy phải

quan tâm đến hệ số không đối xứng T.

Khi T 2,5 thì phép định lượng đượ c chấ p nhận.

Nếu T > 2,5 thì điểm cuối của pic r ất khó xác định. Vì vậy cần thay đổicác điều kiện sắc k để làm cho pic cân đối xứng hơn theo cách sau:

+ Làm giảm thể tích chiết, tức là đoạn nối từ cột đến detecter.

+ Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên.

+ Giảm bớt lượ ng mẫu đưa vào cột bằng cách pha loãng mẫu phân tích

hoặc giảm thể tích.

1.6. Hệ thống thiết bị HPLCHệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm có các bộ phận cơ bản như sau:

Hình 1.14. Sơ đồ hệ thống HPLC





28

Trong đó:

1: Bình chứa pha động 2: Bộ phận khử khí 3: Bơm cao áp

4: Bộ phận tiêm mẫu 5: Cột sắc k (pha tĩnh) 6: Đầu dò

7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và

điều khiển hệ thống. 8: In dữ liệu. [10, 15, 16, 17].

1.6.1. Bình đự ng dung môi

Hiện tại máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp.

Cho phép chúng ta sử dụng 04 bình chứa dung môi cùng 1 lần để r ửa giải theo

tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 04 đườ ng là 100%.

Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 4 đườ ng dung

môi cùng một lúc mà chúng ta chỉ sử dụng tối đa là 3 và 2 đường để cho hệ

pha động luôn đượ c pha tr ộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn để quá

trình r ửa giải ổn định. Hiện 4 đườ ng dung môi phục vụ chủ yếu cho việc r ửa

giải gradial dung môi theo thờ i gian và công tác xây dựng tiêu chuẩn.

Lưu ý:

- Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết

và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích.

- Tất cả các hóa chất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải đượ c sử

dụng là hóa chất tinh khiết phân tích.

- Nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đườ ng nền, tạo ra các

píc tạ p trong quá trình phân tích.1.6.2. Bộ khử khí degasse

Mục đích của bộ khử khí nhằm loại tr ừ các bọt nhỏ còn sót lại trong

dung môi pha động. Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động

còn sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ xảy ra:

- Tỷ lệ pha động của các đườ ng dung môi lấy không đúng sẽ làm cho

thời gian lưu của píc thay đổi.





29

- Trong trườ ng hợ p bọt quá nhiều bộ khử khí không thể loại tr ừ hết

đượ c thì có thể sẽ không hút được dung môi, khi đó áp suất không lên và máy

sắc ký sẽ ngừng hoạt động.

Trong bất cứ trườ ng hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai

1.6.3. Bơm (pump)

Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc

ký. Pump phải tạo đượ c áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at đến -

500 at (1 at = 0.98 bar) và pump phải tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0.1

đến 9.999 ml/phút (hiện nay đã có nhiều loại pump có áp suất r ất cao lên đến

1200 bar).Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thườ ng có áp suất tối đa 412

bar. Tốc độ dòng: 0.1-9.999 ml/phút. Tốc độ bơm là hằng định theo thông số

đã được cài đặt. Hiện tại bơm có 2 piston để thay phiên nhau đẩy dung môi

liên tục.

1.6.4. Bộ phận tiêm mẫu (injection)

Dùng để đưa mẫu vào cột phân tích. Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột:Bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay) và tiêm mẫu tự động (autosample).

1.6.5. Cột sắc ký

Có r ất nhiều nhãn hiệu cột khác nhau hiện bán trên thị tr ườ ng. Chúng

đượ c chia làm nhiều loại theo mục đích sử dụng, trong đó chủ yếu là: cột pha

đảo RP C18 (ODS), cột pha thườ ng C8, các loại cột chuyên dụng cho từng nhóm

chất. Cột C18 và C8 đượ c sử dụng cho phần lớ n các hợ p chất thông thườ ng.

Cột chứa pha tĩnh đượ c coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu

năng cao.

Cột pha tĩnh thông thườ ng làm bằng thép không r ỉ, chiều dài cột

khoảng 10-30 cm, đườ ng kính trong 1-10 mm.

Thông thườ ng chất nhồi cột là silicagel (pha thuận) hoặc là silicagel đã

đượ c silan hóa hoặc đượ c bao một lớ p mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra ngườ i

ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm oxit, polyme xố p, chất trao đổi ion.





30

Đối vớ i một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc

thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt (oven column).

1.6.6. Đầu dò (detector)

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu

ghi trên sắc k đồ để có thể định tính và định lượ ng. Tùy theo tính chất của

các chất cần phân tích mà ngườ i ta sử dụng loại detector thích hợ p và phải

thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích.

A = k.C

Trong đó:

A: Là tín hiệu đo đượ c

C: Nồng độ chất phân tích

K: Là hằng số thực nghiệm của detector đã chọn

Tín hiệu này có thể là: độ hấ p thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ

điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…

Trên cơ sở đó ngườ i ta chế tạo các loại detector sau:

- Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để phát hiện UV.

- Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV - VIS): 190 - 900 nm để

phát hiện các chất hấ p thụ quang và đây là loại thông dụng nhất.

- Detector huỳnh quang dễ phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang

tự nhiên cũng như các chất có huỳnh quang và là loại detector có độ chọn lọc

cao nhất.

Loại hiện đại hơn có detector diod array, ELSD (detector tán xạ bayhơi) các detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo

độ hấ p thu cực đại của các chất. Ngoài ra còn có một số loại detector khác là:

- Detector điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượ ng,…

- Detector chiết suất vi sai: detector khúc xạ (thông thường dùng cho đo

các chất đườ ng).

- Detector đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,…





31

1.6.7. Bộ phận ghi tín hiệu

Dùng để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang. Trong các máy

thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc k đồ, thời gian lưu, diện

tích của pic, chiều cao,…

Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể

lưu tất cả các thông số của pic như tính đối xứng, hệ số phân giải... trong quá

trình phân tích đồng thờ i xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của ngườ i

sử dụng như: nồng độ, RSD,...

1.6.8. In k ết qu

Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in k ết quả do phần mềm tính

toán ra giấy để hoàn thiện.

1.7. Các phương pháp định lượ ng

Có 4 phương pháp định lượ ng [18]:

1.7.1. Phương pháp đườ ng chuẩn

Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn, xây dựng đồ thị chuẩn sự phụ thuộc

giữa nồng độ chất chuẩn và diện tích pic thu đượ c, sau đó xử lý thống kê.

Phương trình hồi qui của đườ ng chuẩn theo diện tích pic có dạng:

y = ax + b

Trong đó:

x: nồng độ

y: diện tích pic

a, b: hằng số Đo diện tích pic của chất nghiên cứu trong mẫu (trong cùng điều kiện thực

nghiệm) như đườ ng chuẩn, thay y vào phương trình trên ta tìm đượ c CM(X).

1.7.2. Phương pháp một mẫu chuẩn

Nếu gọi hX, hch là chiều cao pic ta xác định CM(X) theo phương trình sau:

X

X ch

ch

hC = C .

h





32

1.7.3. Phương pháp thêm

Do X Xy = K.C

Ta thêm vào dung dịch nghiên c

ứu m

ột lượ ng dung d

ịch chu

ẩn Cch

ta đượ c:

X+ch X chy = K(C + C )

Vậy ta có:

XX ch

X+ch X

yC = C .

( y - y )

1.7.4. Phương pháp thêm chuẩnThêm vào V ml dung dịch nghiên cứu lần lượ t C1, C2,….,Cn dung dịch

chuẩn. Sau đó đo các diện tích peak thu đượ c.

Ta có:1 2( ) ( ) ( ), , ,...,

n X X C X C X C y y y y

Xây dựng đồ thị y=f(CTC), xác định CX theo đồ thị đó

Hình 1.15. Đồ thị kỹ thuật đường chuẩn thêm chuẩn

1.8. Đánh giá phương pháp phân tích

1.8.1. Kho sát giớ i hạn phát hiện (LOD) và (LOQ) của phương pháp

Giớ i hạn phát hiện (LOD) được định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất của

chất phân tích mà có tín hiệu sắc ký lớ n gấn 3 lần tín hiệu đườ ng nền. LOD

Đườ ng y =f (CT)

yx

y

Cx Cx

CTC





33

xác định theo quy tắc 3 (xicma) đây là thông số đặc trưng cho độ nhạy của

phương pháp.

LOD = tin hiệu chiều cao pic/ nhiễu đườ ng nền 3.

Giớ i hạn định lượ ng (LOQ) (limit of quantitation) là nồng độ nhỏ nhất

đo đượ c của phương pháp, đó là nồng độ tối thiểu của một chất trong một nền

mẫu xác định mà thiết bị có thể đo đúng đượ c vớ i một RSD% quy định,

thườ ng LOQ là nồng độ chất phân tích mà cho tín hiệu gấn 10 lần tín hiệu

đườ ng nền [17, 22].

1.8.2. Đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo

Độ lặ p lại được dùng để đánh giá định lượng độ phân tán của các k ết

quả phân tích. Đại lượng nay đặc trưng cho độ gần về giá tr ị trung bình của

hai hay nhiều phép đo nhận đượ c trong những điều kiện giống nhau.

Đánh giá độ lặ p lại dựa trên độ lệch chuẩn tương đối (RSD) hoặc độ

biến động.





34

CHƯƠNG II

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U VÀ THỰ C NGHIỆM

2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

2.1.1. Thiết bị

- Cân phân tích có độ chính xác 0,1 mg.

- Cân k ỹ thuật độ chính xác 0,001g

- Bể siêu âm

- Máy ly tâm (vortex)

-

Thiết bị lọc: Màng lọc 13 mm, 0,45 µm (PTFE)

- Hệ thống máy HPLC Agilent 1100 k ết nối với đầu dò UV có thể

điều chỉnh bướ c sóng 290 nm

- Cột sắc k pha đảo RP18 (150 x 4,6 mm; 5 μm) và cột bảo vệ

- Phần mềm xử lý số liệu Empower ® 2

- Máy lọc hút chân không

Hình 2.1. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1100





35

2.1.2. Dụng cụ

- Dụng cụ thủy tinh các loại

- Bình định mức loại 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml.

- Pipet: 25 ml, 10 ml,…

-

Phễu thủy tinh

- Bình tam giác 50 ml, 25 ml,…

- Đũa thủy tinh

- Xy lanh

2.1.3. Hóa chất

-

Chất chuẩn dexamethason acetate

Nguồn gốc: Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương

Số kiểm soát: 1036/VKN

Ngày sản xuất: 11/02/2013

Hạn sử dụng: 11/02/2016

- Nướ c cất 2 lần khử ion

-

Methanol

- Acetonitrile (Merck)

(Loại dùng cho HPLC, tinh khiết p.a)

- Các hóa chất, dung môi khác: ethanol, methanol,... đạt tiêu chuẩn

phân tích.

2.2. Phương pháp lấy mẫu, bo qun mẫu và xử lý mẫu

2.2.1. Lấy mẫuQua thăm dò thực tiễn và xuất phát từ mục đích xác định hàm lượ ng

dexamethoxason acetat trong một số loại mỹ phẩm đang có mặt trên thị

trường tỉnh Nghệ An. Chúng tôi tiến hành lấy mẫu chủ yếu ở các địa điểm

kinh doanh mỹ phẩm trên địa bàn Thành phố Vinh.

Mẫu mỹ phẩm sau khi lấy được đựng trong túi nilon sạch và đưa về

phòng thí nghiệm tiến hành phân loại và mã hóa mẫu.





36

2.2.2. Các sơ đồ xử lý mẫu

A. Sơ đồ xử l chất chuẩn

B. Sơ đồ xử lý các mẫu mỹ phẩm

Chuẩn bị chất chuẩn dexamethason

acetat, hàm lượ ng 99,36%

Cân chính xác 50 mg chất chuẩn

dexamethason acetat vào bình định

mức 100 ml

Dung dịch chuẩn 0,5 mg/ml

Dãy dung dịch chuẩn 0,5; 1,0; 2,0;

3,0; 5,0; 6,0; 6,5 µg/ml

Mẫu chuẩn HPLC

Thêm 70 ml dung môi methanol

HPLC lắc siêu âm, thêm dung

môi methanol HPLC vừa đủ

Lấy 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 1,0; 1,2;

1,3 ml cho BĐM 50 ml thêm

dung môi methanol HPLC vừa

Lọc qua màng lọc 0,45 µm





37

B. Sơ đồ xử l mẫu mỹ phẩm

Chuẩn bị mẫu mỹ phẩm

(mẫu thử)

Cân chính xác 1,0 g mỹ phẩm

vào cốc thủy 100 ml

Dung dịch thử

Lọc qua màng lọc 0,45 µm

Mẫu thử HPLC

Thêm 15 ml ethanol tuyệt đối,

lắc siêu âm 30 phút ở nhiệt độ

700C, cho vào ống nghiệm ly

tâm, làm lạnh ở trong môitrường nước đá (t< 50C), ly tâm

10 phút. Lọc, chiết. Tiến hành

đun cách thủy đến khi thu đượ c

cắn. Hoàn tan cắn vớ i 5 ml

methanol, chuyển vào bình định

mức 25 ml, tráng cốc thêm 2lần, mỗi lần 5 ml methanol,

thêm methanol vừa đủ





38

2.3. Phương pháp phân tích

Để phân tích định lượ ng dexamethason acetat trong mẫu thử dùng

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.

2.3.1. Kho sát các điều kiện tối ưu

+ Bước sóng đầu dò UV

+ Pha động

+ Thể tích tiêm mẫu

+ Tốc độ dòng

2.3.2. Xây dựng đườ ng chuẩn

Để xác định được hàm lượ ng của dexamethason acetat trong mẫu

ngườ i ta dựa vào mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic trên đườ ng

chuẩn đã đượ c thiết lậ p sẵn. Dựa vào đườ ng chuẩn và diện tích pic đo đượ c

ta sẽ tính được hàm lượ ng dexamethason acetat.

2.3.3. Kho sát giớ i hạn phát hiện (LOD) và giớ i hạn định lượ ng (LOQ)

của phương pháp

2.3.3.1. Giớ i hạn phát hiện (LOD)

Giớ i hạn phát hiện (LOD) (limit of detection) được định nghĩa là nồng

độ nhỏ nhất của chất phân tích mà có tín hiệu sắc ký lớ n gấ p 3 lần tín hiệu

đườ ng nền (S/N=3). Đây là một thông số đặc trưng cho độ nhạy của phương

pháp. Chất nào nhạy hơn sẽ có giớ i hạn phát hiện nhỏ hơn (LOD = tín hiệu

chiều cao pic/ nhiễu đườ ng nền ≥ 3). Thường xác định LOD theo hai cách.

Phương pháp trực tiế p.Dùng chính chất phân tích để pha thành loãng vớ i nồng độ nhỏ nhất mà

vẫn thu đượ c tín hiệu lớ n gấ p 3 lần tín hiệu đườ ng nền (S/N=3).

Phương pháp tính toán.

y3×SLOD=

A

Trong đó: A là hệ số góc của phương trình hồi quy





39

Độ lệch chuẩn SD:

n

2

i

i=1

y

x -x

S =n-1

n

ii=1

bt

X

X = n

Trong đó:

n là số lần phân tích lặp lại của mẫu i

k là số bậc tự do (k= n-1)

xi là giá trị phân tích lần thứ i

tbx là giá trị phân tích trung bình của i lần

Độ lệch tương đối: tt

td

SS = ×100

x

2.3.3.2. Giớ i hạn định lượ ng LOQ

Giớ i hạn định lượ ng (LOQ) (limit of quantitation) là nồng độ nhỏ nhất

đo đượ c của phương pháp, đó là nồng độ tối thiểu của một chất trong một nền

mẫu xác định mà thiết bị có thể đo đúng đượ c vớ i một RSD% quy định nồng

độ chất phân tích mà cho tín hiệu gấ p 10 lần tín hiệu đườ ng nền.

Theo lý thuyết thống kê trong hóa phân tích thì LOQ là nồng độ chất

phân tích mà cho tin hiệu gấ p 10 lần tín hiệu đườ ng nền. (S/N=10) tức là:

10LOQ = ×LOD

3

2.4. Xử lý số liệu thự c nghiệm

- Độ lặ p lại được dùng để đánh giá độ phân tán của các k ết quả. Đạilượng này đặc trưng cho độ gần về giá tr ị trung bình của hai hay nhiều phép

đo nhận đượ c trong những điều kiện giống nhau.

- Đánh giá độ lặ p dựa trên độ lệch chuẩn tương đối (RSD%).

- Các công thức tính toán trong xử lý thông kê kết quả thực nghiệm:

+ Giá tr ị trung bình:n

ii=1

btXX =

n





40

+ Độ lệch chuẩn:

n n

2 2

i i

i=1 i=1

tt

x -x x -x

S = =n-1 k

Trong đó:

n là số lần phân tích lặp lại của mẫu i

k là số bậc tự do (k= n-1)

xi là giá trị phân tích lần thứ i

x là giá trị phân tích trung bình của i lần

+ Độ lệch tương đối:

ttd

tSS

= ×100X

+ Với chuẩn Student:

tt

x-μt =

S

Trong đó:t là chuẩn Student

giá trị thực của đại lượng cần đo

+ Độ chính xác :

t×Sε =

n

Ta suy ra khoảng tin cậy của giá trị phân tích

x x





41

CHƯƠNG III

K ẾT QUẢ NGHIÊN CỨ U VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kho sát tìm điều kiện tối ưu của phương pháp phân tích

Để đánh giá sự phù hợ p và ổn định của hệ thống thiết bị phân tích,

chúng ta cần khảo sát lại các yếu tố ảnh hưở ng quan tr ọng có thể dẫn đến sai

số của phép phân tích.

- Dung d ịch chuẩ n g ố c: Cân chính xác 50 mg ( 0,1 mg) chất chuẩn

dexamethason acetat vào bình định mức dung tích 100,0 ml, thêm khoảng 70

ml methanol, lắc đến tan hoàn toàn và thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều,

đượ c dung dịch chuẩn gốc hydrocortison acetat có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml.

- Dung d ịch chuẩ n làm việc: Pha các dung dịch chuẩn làm việc

dexamethason acetat

Dung dịch chuẩn 1: Có nồng độ 0,5 ppm bằng cách lấy 0,1 ml







Dung dịch chuẩn gốc vào mỗi bình định mức dung tích 50,0 ml tương

ứng, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc các dung dịch qua mànglọc 0,45 μm để tiêm sắc ký. Có ghi các ký hiệu của mỗi mẫu chuẩn.

3.1.1. Kho sát vạch phổ hấp thụ

Pha dung dịch chuẩn làm việc dexamethason acetat có nồng độ 2,0 ppm.

Tiến hành vận hành thiết bị ở các điều kiện theo các tài liệu đã tham khảo [6,

15, 17, 22]:

- Thành phần pha động: Acetonitril - nướ c (35: 65).





42

- Cột sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm I.D.).

- Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút.

- Thể tích tiêm mẫu: 20 μl.

- Detecter: Thay đổi các bướ c sóng xung quanh giá tr ị 240 nm.

K hảo sát tìm bướ c sóng tối ưu xác định hàm lượ ng của dexamethason

acetat. K ết quả thu được trình bày trong bảng 3.1.

Bng 3.1. Kết quả khảo sát vạch đo phổ của dexamethason acetat

(nm) 237 238 239 240 241 242

Spic - 2,0 ppm 50189 50209 50252 50485 50247 50212

RSD% 0.2194 0.2193 0.2191 0.2181 0.2191 0.2193

Nhận xét:

Như vậy qua k ết quả khảo sát, chúng tôi chọn vạch hấp thụ 240 nm.

Đây là vạch phổ đảm bảo cho độ hấ p thụ cao, độ lặ p tốt, phù hợ p vớ i phép

phân tích. K ết quả này cũng phù hợ p vớ i một số tài liệu đã công bố [6],[22].

Các nghiên cứu tiế p theo chúng tôi chọn λ = 240 nm.

3.1.2. Kho sát tỉ lệ pha động

Pha dung dịch chuẩn làm việc dexamethason acetat có nồng độ 2,0 ppm.

Tiến hành vận hành thiết bị ở các điều kiện theo các tài liệu đã tham khảo:

- Thành phần pha động: Thay đổi tỉ lệ pha động acetonitril - nướ c xung

quanh giá tr ị (35: 65).

- Cột sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5μm I.D.).

- Tốc độ dòng: 1,2 l/phút.


- Detecter: 240 nm.

K hảo sát tìm tỷ lệ pha động tối ưu để xác định hàm lượng của

dexamethason acetat. K ết quả thu đượ c trình bày trong bảng 3.2.





43

Bng 3.2. Kết quả k hảo sát tỉ lệ pha động của dexamethason acetat

ACN: H2O 32:68 33:67 34:66 35:65 36:64 37:63

Spíc - 2,0 μg/ml 50123 50434 50492 50474 50231 50206

RSD% 0.3164 0.3145 0.3141 0.3142 0.3157 0.3159

Nhận xét:

Như vậy qua k ết quả khảo sát, chúng tôi chọn tỉ lệ pha động ACN: H2O

(34:66). Đây là tỉ lệ pha động đảm bảo cho độ hấ p thụ cao, độ lặ p tốt, phù hợ p

vớ i phép phân tích. K ết quả này cũng phù hợ p vớ i một số tài liệu đã công bố.

Các nghiên cứu tiế p theo chúng tôi sử dụng tỷ lệ pha động này [6, 10, 17, 22].

3.1.3. Kho sát tốc độ dòng

Pha dung dịch chuẩn làm việc dexamethason acetat có nồng độ 2,0

μg/ml. Tiến hành vận hành thiết bị ở các điều kiện theo các tài liệu đã tham

khảo:

- Thành phần pha động: Tỉ lệ pha động acetonit - nướ c (34 : 66).

- Cột sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm I.D.).

- Tốc độ dòng: Thay đổi tốc độ xung quang 1,2 ml/phút.


- Detecter: 240 nm.

Qua kết quả khảo sát cũng như dựa vào các tài liệu tham khảo yêu cầu

xác định hàm lượng của dexamethason acetat ta thấy tốc độ dòng tại giá tr ị

1,2 ml/phút có độ hấ p thụ lớ n nhất được nêu trong bảng 3.3

Bng 3.3. Kết quả khảo sát tốc độ dòng

V(ml/phút) 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5

Spíc - 2,0 ppm 50347 50452 50512 50491 50281 50263

RSD% 0.2154 0.2149 0.2147 0.2147 0.2156 0.2157





44

Nhận xét:

Như vậy qua k ết quả khảo sát, chúng tôi chọn tốc độ dòng tại giá tr ị 1,2

ml/phút. Đây là tỉ lệ pha động đảm bảo cho độ hấ p thụ cao, độ lặ p tốt, phù

hợ p vớ i phép phân tích. K ết quả này cũng phù hợ p vớ i một số tài liệu đã công

bố [22]. Các nghiên cứu tiế p theo chúng tôi chọn tốc độ dòng tại giá tr ị 1,2

ml/phút.

3.1.4. Kho sát xác định khong nồng độ tuyến tính

Chúng tôi tiến hành pha dãy dung dịch có nồng độ xác định tiến hành

đo phổ hấp thụ của các dung dịch trên ở điều kiện tối ưu đã được khảo sát.

Kết quả đo phổ được trình bày trong bảng 3.4

Bng 3.4. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính

TT Nồng độ dung dịch chuẩn (ppm) Spíc

1 0,1 13768

2 0,3 16876

3 0,5 18981

4 1,0 32356

5 2,0 60513

6 3,0 99813

7 5,0 154136

8 6,0 187125

9 6,5 201324

10 6,7 203131

11 7,0 207122





45

Từ số liệu ở bảng 3.4 ta sử dụng chương trình Microsoft Excel 2003 vẽ

được đồ thị hình 3.4.

0

50000

100000

150000

200000

250000

0 1 2 3 4 5 6 7 8

ppm

Spic

Hình 3.1. Đồ thị khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính

của dexamethason axetat

Nhận xét:

Qua đồ thị hình 3.1 ta thấy khoảng tuyến tính thể hiện mối quan hệ diện

tích pic nồng độ của dexamethason axetat là 0,5 ppm đến 6,5 ppm.

3.2. Xây dựng đườ ng chuẩn, xác định giớ i hạn phát hiện (LOD) và giớ i

hạn định lượ ng (LOQ) của dexamethason acetat

Pha các dung dịch chuẩn làm việc dexamethason acetat có nồng độ 0,5

ppm, 1,0 ppm; 2,0 ppm; 3,0 ppm; 5,0 ppm; 6,0 ppm; 6,5 ppm. Tiến hành vận

hành thiết bị ở các điều kiện đã khảo sát và theo các tài liệu đã tham khảo:

- Thành phần pha động: Tỉ lệ pha động acetonit - nướ c (34: 66).

- Cột sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5μm I.D.).

- Tốc độ dòng: Thay đổi 1,2 ml/phút.


- Detecter: 240 nm

Từ kết quả thu được ở trên để chúng tôi dùng phần mềm origin 7.5 để

xây dựng phương trình hồi quy đầy đủ cho đường chuẩn của dexamethason





46

acetat, đồng thời xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng. Kết quả

thu được trình bày trong bảng 3.5.

Bng 3.5. Số liệu xây dựng đường chuẩn

TTNồng độ dung dịch

chuẩn (ppm)Tổng Spíc Số liệu thống kê

1 0.5 18981

y = 30623x + 2757.8

r = 0.9993

2 1.0 32356

3 2.0 60513

4 3.0 99813

5 5.0 154136

6 6.0 187125

7 6.5 201324

Từ số liệu ở bảng 3.5 ta sử dụng chương trình Microsoft Excel vẽ được

đồ thị mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ chất chuẩn đượ c

thể hiện trên hình 3.2.

y = 30623x + 2757.8

R 2 = 0.9987

0

50000

100000

150000

200000

250000

0 1 2 3 4 5 6 7 ppm

Spic

Hình 3.2. Đồ thị đường chuẩn của dexamethason acetat





47

Phương trình đường chuẩn Data_B:

Y= A*X + B

R: Độ lệch chuẩn tương đối

SD: Độ lệch chuẩn tuyệt đối

N: Số lần thực nghiệm (N =7)

P: Độ sai số cho phép

Thông số Giá trị Sai số

AB

306232757.8

5032062

R SD N P0,99933 2987 7 <0.0001

Tra bảng phân phối Student ta được giá trị t (P = 0,95; f = N-1 = 6) = 2,45

Theo kết quả tính toán của phần mềm origin 7.5 ta có:

∆A = t(0,95;6)*SA = 2,45*503 = 1232.4

∆B = t(0,95;6)*SB = 2,45*2062 = 5051.9

Vậy phương trình hồi quy đầy đủ của đường chuẩn có dạng:

Ai = (30623± 1232.4)* X +( 2757.8 ± 5051.9)

Trong đó:

Ai là diện tích píc của phân tích

X là nồng độ của dexamethoxason acetat (ppm)

3.2.1. Giới hạn phát hiện (LOD)

LOD được xem là nồng độ của chất phân tích mà hệ thống phân tích

còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tínhiệu nền.

Giới hạn phát hiện dexamethoxason acetat bằng phép đo HPLC theo

đường chuẩn:

y3×S 3×2987LOD = = = 0.29 ppm

A 30623

Giá tr ị (LOD) này cho thấy có thể dùng phương pháp để phát hiện

lượ ng vết dexamethoxason acetat trong đối tượ ng phân tích.





48

3.2.2 Giới hạn định lượng (LOQ)

LOQ được xem là nồng độ của chất phân tích mà hệ thống phân tích

còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa định lượng với mẫu trắng hay tín

hiệu nền và đạt độ tin cậy ≥ 95%.

Giới hạn định lượng dexamethoxason acetat bằng phép đo HPLC theo

đường chuẩn:

y10×S 10×2987LOQ = = = 0.97 ppm

A 30623

Giá tr ị (LOQ) này cho thấy có thể dùng phương pháp để định lượ ng

dexamethoxason acetat đối tượ ng phân tích.

3.3. Đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo

Để đánh giá sai số và độ lặp lại của phương pháp từ đó xác định

khoảng tin cậy của giá trị phân tích, chúng tôi chọn khảo sát ở tại ba giá trị

nồng độ nằm ở đầu, giữa và cuối khoảng tuyến tính của đường chuẩn ở mỗi

loại nồng độ tiến hành đo lặp lại 5 lần.

Các kết quả thực nghiệm được xử l thống kê và trình bày trong bảng 3.6.

Bng 3.6. Kết quả đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo

Nồng độ chuẩn bị (ppm) 0,500 3,000 6,500

Nồng độ xác định được (ppm)

0,504 3.052 6,500

0,505 3.023 6,498

0,502 3.013 6,504

0,501 3.056 6,502

0,502 3.045 6,505

Giá trị nồng độ trung bình: x 0,503 3.036 6,502

Độ lệch chuẩn: SD 1,54.10-4 1.6.10-2 1.9.10-4

Độ lệch chuẩn tương đối: RSD% 0,0307 0,557 0,044

Chuẩn student: t 1,7 2.1 0.6

Độ chính xác: 1,2.10-4 1,6.10-2 7,5.10-5





49

Nhận xét:

Từ k ết quả ở trong bảng 3.6 ta thấy r ằng:

Các giá tr ị thu được có độ lặp tương đối tốt.

So sánh t vớ i t(,k) = 2,45 (k=6; α= 0,95) cho thấy t < t,k do đó phương

pháp không mắc sai số hệ thống.

Khoảng tin cậy của giá tr ị phân tích của các phép đo hoàn toàn có thể

đánh giá thông qua các giá trị x và tương ứng.

3.4. Tổng k ết các điều kiện áp dụng phân tích dexamethason acetat trong

mẫu phân tích

Từ các k ết quả nghiên cứu trên, chúng tôi tổng hợ p các điều kiện phù

hợp để đo dexamethason acetat bằng phương pháp HPLC thể hiện trong

bảng 3.7.

Bng 3.7. Các điều kiện đo dexamethason acetat phương pháp HPLC

Chất phân tích các yếu tố Dexamethason acetat

Điều

kiện sắc

ký

Tỉ lệ pha động Acetonitril : Nướ c(34 : 66)

Cột sắc ký Cột C18 (250 × 4,6 nm, 5 µm I.D)

Dedecter 240 nm

Thể tích tiêm mẫu 20 µl

Tốc độ dòng 1,2 ml/phút

Giới hạn phát hiện LOD (ppm) 0,29

Giới hạn định lượng LOQ (ppm) 0,97

Khoảng nồng độ tuyến tính (ppm) 0,5 - 6,5





50

3.5. Áp dụng k ết qu nghiên cứ u để phân tích một số mẫu mỹ phẩm

3.5.1. Xác định hàm lượ ng dexamethason acetat một số mẫu mỹ phẩm

Chúng tôi tiến hành phân tích các mẫu mỹ phẩm để xác định mẫu chứa

chất cấm dexamethason acetat theo quy trình đã xây dựng và dựa vào đườ ng

chuẩn để xác định hàm lượ ng dexamethason acetat có trong mỹ phẩm.

Cân chính xác 1,000 g mẫu vào cốc thủy tinh 100 ml, thêm 5 ml

ethanol tuyệt đối, lắc siêu âm 30 phút ở nhiệt độ 700C làm lạnh ở trong môi

trường nướ c đá (t< 50C), ly tâm 5 phút. Lọc, chiết. Tiến hành đun cách thủy

đến khi thu đượ c cắn. Hoàn tan cắn vớ i 10 ml methanol, chuyển vào bình

định mức 25 ml, tráng cốc thêm 2 lần, mỗi lần 5 ml methanol, thêm methanol

vừa đủ. Lọc qua màng lọc G4 [22].

Lượng cân các mẫu mỹ phẩm được nêu trong bảng 3.8.

Bng 3.8. Lượng cân các mẫu mỹ phẩm

TT Ký hiệu mẫu Lượ ng mẫu (g) Thể tích pha loãng (ml)

1 KR05 1,0012 25

2 SR01 1,0017 25

3 ST04 1,0019 25

4 KD02 1,0011 25

5 KD03 1,0016 25

Tiến hành phân tích mẫu mỹ phẩm theo phương pháp đã nghiên cứu

trên ở điều kiện tối ưu của thiết bị đo. Dựa vào phương trình đường chuẩn đã

thiết lập xác định được nồng độ dexamethason acetat có trong lượ ng mẫu

phân tích.

Xác định hàm lượ ng dexamethason acetat có trong mẫu mỹ phẩm theo

công thức:

mptpm t

t

C .vC =

m





51

Trong đó:

- Cmp (ppm): Hàm lượ ng dexamethason acetat có trong mẫu mỹ phẩm

- Ctmp (ppm): Hàm lượ ng dexamethason acetat có trong lượ ng mẫu mỹ phẩm

đem phân tích.

- vt (ml): Thể tích pha loãng của mẫu

- mt(g): Lượ ng mẫu mỹ phẩm phân tích

Kết quả phân tích được trình bày trong bảng 3.9.

Bng 3.9. Kết quả đo của mẫu phân tích

TTKý hiệu

mẫu

Tổng diện

tích píc

Hàm lượ ng

dexamethason acetat

có trong mẫu phân

tích

(Cxdmp -ppm)

Hàm lượ ngdexamethason acetat

có trong mẫu mỹ

phẩm

(Cmp-ppm)

1 KR05 KPH KPH

2 SR01 KPH KPH

3 ST04 KPH KPH

4 KD02 21263 0,604 15,083

5 KD03 KPH KPH

Nhận xét:

K ết quả thu ở bảng 3.9 đượ c cho thấy, trong 05 mẫu mỹ phẩm đượ c

nghiên cứu thì chỉ có 01 mẫu mỹ phẩm (KD02) phát hiện chất cấm

dexamethason acetate với hàm lượ ng 15.083 ppm.

3.5.2. Xác định độ lặp lại hàm lượ ng dexamethason acetat có trong mẫu

mỹ phẩm

Dựa vào k ết quả khảo sát sơ bộ, chúng tôi xác định hàm lượ ng

dexamethason acetate có trong mẫu mỹ phẩm bằng cách tiến hành phân





52

tích 5 lần lặ p lại trên mẫu KD2. Theo quy trình khảo sát và dựa vào

phương trình đườ ng chuẩn đã xây dựng chúng tôi thu đượ c k ết quả trình

bày trong bảng 3.10.

Bng 3.10. K ết quả phân tích dexamethason acetate có trong mẫu KD2

TT Lượ ng cân

Tổng

diện tích

píc

Hàm lượ ng

examethason

acetat trong mẫu

phân tích

(Cxdmp -ppm)

Hàm lượ ng

Dexamethason

acetat có trong

mẫu mỹ phẩm

(Cmp-ppm)

1 1,0013 21233 0.6033 15.06

2 1,0016 21247 0.6038 15.07

3 1,0011 21296 0.6054 15.12

4 1,0003 21265 0.6044 15.10

5 1,0009 21213 0.6027 15.05

Xtb 15.08

SD 0.028

RSD% 0.185

Nhận xét:

K ết quả thu ở bảng 3.10 chúng tôi thấy giá tr ị độ lệch chuẩn tương đối

RSD < 5% là chấ p nhận đượ c. Chúng tôi xác định đượ c trong mỹ phẩm (mẫu

kí hiệu KD02) chứa chất cấm dexamethason acetate với hàm lượ ng 15,08

ppm.





53

3.6. Các sắc đồ của phép đo HPLC

3.6.1. Sắc đồ mẫu trắng

Hình 3.3. Sắc đồ mẫu trắng

3.6.2. Các sắc đồ mẫu chuẩn dexamethason acetat có nồng độ khác nhau

Hình 3.4. Sắc đồ mẫu chuẩn dexamethason acetat có nồng độ 0,5 ppm





54







55







56







57

3.6.3. Sắc đồ các mẫu mỹ phẩm

Hình 3.11. Sắc đồ mẫu MP-KR05 - Kem r ửa mặt ngăn ngừa mụn Acnes

Hình 3.12. Sắc đồ mẫu MP-SR01 - Sữa rửa mặt Z





58

Hình 3.13. Sắc đồ mẫu MP-ST04 - Sữa tắm LUX

Hình 3.14. Sắc đồ mẫu MP DK 02 - Kem dưỡng da - Lành mụn B2





59

Hình 3.15. Sắc đồ mẫu MP DK 03 - Kem dưỡng da

vital care viitamin E creme





60

K ẾT LUẬN

Chúng tôi đã giải quyết các nhiệm vụ đặt ra của đề tài, căn cứ vào các

k ết quả nghiên cứu thu đượ c và rút ra k ết luận sau:

1. Đã khảo sát tìm điều kiện tối ưu của phương pháp phân tích

Tìm các điều kiện tối ưu cho phép xác định dexamethason acetat bằng

phương pháp HPLC.

+ Vạch phổ của detector 240 nm.

+ Tỉ lệ pha động ACN: H2O = 34: 66.

+ Cột sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5μm I.D.).

+ Thể tích tiêu chuẩn 20 μl và tốc độ dòng 1,2 ml/phút.

2. Đã khảo sát xác định khoảng nồng độ tuyến tính giữa Spic và nồng

độ dexamethason acetat là 0,5 - 6,5 ppm.

3. Đã xây dựng được phương trình đườ ng chuẩn đầy đủ thể hiện quan

hệ Spic và nồng độ chất dexamethason acetat.

4. Đánh giá LOD, LOQ cho thấy đủ tiêu chuẩn để xác định lượ ng vết

chất dexamethason acetat với độ lặ p lại tốt và sai số cho phép.

5. Đã áp dụng các k ết quả nghiên cứu để xác định chất dexamethoxason

acetat trong 5 mẫu mỹ phẩm. Nghiên cứu phát hiện đượ c chất dexamethason

acetat trong 01 mẫu mỹ phẩm (kí hiệu KD02) không tuân theo Hiệ p định về

hệ thống hòa hợ p ASEAN trong quản lý mỹ phẩm. Còn 4 mẫu không phát

hiện dexamethason acetat.Chúng tôi hy vọng những nghiên cứu trên sẽ góp phần vào việc ứng

dụng k ỹ thuật HPLC để xác định dexamethason acetat trong các đối tượ ng mỹ

phẩm, nhằm phục phụ đắc lực cho các ngành khoa học và đặc biệt trong lĩnh

vực mỹ phẩm bảo vệ sức khỏe con ngườ i.





61

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

[1]. ASEN (2003), Hiệp định về hệ thố ng hòa hợ p ASEAN trong quản lý

m ỹ phẩ m, Bản dịch của Cục quản l Dượ c, 2008.

[2]. ASEAN (2005 ), Determination of heavy metals (arsenic, cadmium,

lead and mercury) in cosmetic products, 1- 6 (phương pháp hòa hợ p của

ASEAN có mã số ACM THA 05).

[3]. Tr ần Tử An (2006), Môi trường và độc chất môi trườ ng , Trườ ng

Đại học Dượ c Hà Nội, tr 72-79, 138-141, 264-292, 295-297.

[4]. Tr ần Tử An (2007), Kiể m nghiệm dượ c phẩ m, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

[5]. Bộ Y tế (2002), Dược điể n Việt Nam (xuất bản lần thứ ba), Nhà xuất

bản Y học, Hà Nội.

[6]. Bộ Y tế (2006), Quyết định số 4/2006/QĐ-BYT, của Bộ trưở ng Bộ Y t ế

về việc triên khai, áp d ụng và hướ ng d ẫ n thự c hành các nguyên t ắ c, tiêu

chuẩn “thự c hành t ố t sản xuấ t m ỹ phẩm” của Hiệ p hội các nước Đông

nam Á.

[7]. Bộ Y tế, Cục quản l Dượ c (2011), Thông tư 06/2011/TT -BYT, phụ l ục

số 06-MP, 01-MP, Hà Nội.

[8]. Bộ Y tế (2009), Dược điể n Việt Nam IV , phụ lục 5, Các k ỹ thuật sắc ký.

[9]. Vương Ngọc Chính (2005), Hương liệu m ỹ phẩ m, NXB Đại Học Quốc

Gia TP.HCM.

[10]. Nguyễn Xuân Dũng, Tử Vọng Nghị, Phạm Luân (1986), Các phương pháp tách - S ắ c ký l ỏng cao áp, Đại học tổng hợ p Amsterdam Hà Nội.

[11]. Nguyễn Thanh Hà, Phạm Khánh Phong Lan (2007), “ Phân tích Arsen

trong một số chế phẩm kem dưỡ ng da bằ ng quang phổ hấ p thụ nguyên

t ử”, Tạ p chí Kiểm nghiệm thuốc, tr. 18-21.





62

[12]. Tr ần Đức Hậu, Nguyễn Đình Hiển, Thái Duy Thìn, Hình Kim Thoa,

Nguyễn Văn Thục (2006), Hóa dượ c t p 2, Bộ môn hóa dược, Đại học

Dượ c Hà Nội.

[13]. Làm thế nào để có làn da khỏe và đẹp, NXB Văn Hóa Thông Tin.

[14]. Nguyễn Thành Long (2006), M ỹ phẩ m, Chuyên đề tự chọn, Đại học

Dượ c Hà nội, tr.15-27.

[15]. Phạm Luân (1999), Cơ sở lý thuyế t phân tích sắ c ký l ỏng hiệu năng cao.

Đại học quốc gia Hà Nội, tr. 106-105.

[16]. Makoto Takagi, Tr ần Thị Ngọc Lan (dịch) (2010), Các phương pháp

phân tích trong hóa hc, Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đạihọc Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, tr. 184-194.

[17]. Thái Đại Quân (2013), Nghiên cứu xác định vitamin C trong thuố c, thự c

phẩ m chức năng, hoa quả và nướ c giải khát bằng phương pháp sắ c ký

l ỏng hiệu năng cao HPLC, Luận văn Thạc sỹ Khoa hóa học, Trườ ng

Đại học Vinh, tr 23-24.

[18]. Hồ Viết Quý (2009), Các phương pháp phân tích công cụ trong hóa hchiện đại, NXB đại học Sư phạm, Hà Nội, tr. 203-217.

[19]. Louis Hồ Tấn Tài (1999), Các sản phẩ m t ẩ y r ửa và chăm sóc cá nhân,

NXB, in tại công ty Liksin, TP.HCM.

[20]. Tổng cục Tiêu chuẩn và Đo lườ ng, Trung tâm Thông tin (2003), Tuyể n

t p các tiêu chuẩ n về Hóa m ỹ phẩ m.

[21]. Đào Hữu Vinh, Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự (1985), Các phương

pháp sắ c ký. Nhà xuất bản khoa học k ỹ thuật.

[22]. Nguyễn Thị Xuyên, Hoàng Việt Dũng, Hoàng Mỹ Hạnh, Đào Văn Đôn,

Nguyễn Thị Thanh Phương (2013), “Định lượng đồng thờ i

dexamethason acetat, betamethason, prednisolon và triamcinolon trong

m ỹ phẩ m bằ ng sắ c ký l ỏng hiệu năng cao”, Tạ p chí Y - Dượ c học Quân

sự số 6 - 2013.





63

Tiếng Anh

[23]. ASEAN. Identificantion of dexamethason, betamethason, hydrocortison

acetat, betamethason 17-valerate, and triamcinolon acetonid in cosmetic

products by TLC and HPLC, ACM MAL 07.

[24]. C.G.Smyrniotakis, Helen A. Archontaki, (2007). “C18 columns for the

simultaneous determination of oxytetracycline and its related

subsatances by reversed-phase high performance liquid chromatography

and UV detection” the Journal of Pharmaceutical and biomedial

analysis, 43, 506 - 514.

[25]. Gulliver, T. & Eid, N. (2005), "Effects of glucocorticoids on the

hypothalamic - pituitary-adrenal axis in children and adults". Immunol

Allergy Clin North Am, 25(3), pp.541-555.

[26]. Miller J.C. Miller J.N. (1988), Statistics for analytical chemistry, Ellis

Horwood Limited, England.

[27]. Nam Y S, I K Kwon et al, (2012), Quantitative monitoring of

corticosteroids in cosmetic products manufactured in Korea using LC-MS/MS. Forensic Scient. 220 (1-3), pp.23-28.

[28]. Wu Da-nan, Zheng He-Hui, Wang Ping, Li Jie, (2008), Determination

of 8 glucocorticoids in cosmetics by ultra performance liquid

chromatography. Chinese journal of health laboratory technology.


Documents

Nghiên cứu xác định hàm lượng chất cấm dexamethason acetat trong mỹ phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao