nghien cuu su dung song sieu am de trich ly pro tein tu DPF

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

TP.HCM, ngày tháng 01 năm 2011

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

TP.HCM, ngày tháng 01 năm 2011

i

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BKTP HCM

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

ẢNH HƢỞNG CỦA SÓNG SIÊU ÂM VÀ

ENZYME TRONG QUÁ TRÌNH TRÍCH

LY PROTEIN ĐẬU PHỘNG

SVTH : VŨ BẢO TRÂN

MSSV : 60602611

GVHD : ThS. NGUYỄN THỊ HIỀN

ThS. CHÂU TRẦN DIỄM ÁI

TP Hồ Chí Minh, 1/2011

ii

LỜI CẢM ƠN LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các thầy, các cô trong Bộ môn

Công nghệ Thực phẩm đã tận tình truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm và tạo

mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt luận văn và trong suốt hơn 4

năm học vừa qua.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Thị Hiền và cô

Châu Trần Diễm Ái đã tận tình giúp đỡ em, chỉ dạy em trong suốt quá trình

thực hiện Luận văn tốt nghiệp.

Em xin chân thành cám ơn chị Nguyễn Thị Thu Hà đã luôn nhiệt

tình chia sẽ kinh nghiệm quý báu cho em.

Con cảm ơn ba mẹ và gia đình đã luôn là chỗ dựa vững chắc cho

con, động viên, khuyến khích và tạo mọi điều kiện cho con học tập tốt.

Đồng thời, mình cũng cảm ơn tất cả các bạn lớp HC06TP đã luôn

bên cạnh, giúp đỡ mình, đóng góp ý kiến cho mình trong suốt thời gian qua.

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm của tất cả mọi

người để em có được bài luận văn như ngày hôm nay.

Cuối cùng, em xin chúc quý thầy cô và các bạn luôn mạnh khỏe, vui

vẻ và thành đạt trong cuộc sống.

TP.HCM, ngày 06 tháng 01 năm 2011

Vũ Bảo Trân

iii

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Mục đích của luận văn “Nghiên cứu ảnh hưởng của sóng siêu âm và enzyme

trong quá trình trích ly protein đậu phộng” nhằm khảo sát ảnh hưởng của quá trình

xử lý bằng enzyme, xử lý kết hợp sóng siêu âm và enzyme lên khả năng trích ly

protein trong bột đậu phộng tách béo, nhằm xác định các thông số công nghệ để trích

ly một cách có hiệu quả và triệt để hàm lượng protein trong nguyên liệu.

Các nội dung chính thực hiện trong luận văn bao gồm:

Tổng quan tài liệu về đậu phộng, các phương pháp sản xuất PC/PI từ đậu

phộng, ảnh hưởng cùa sóng siêu âm đến hoạt tính enzyme, ứng dụng kỹ thuật siêu âm

và chế phẩm enzyme cellulase trong quá trình trích ly protein.

Nghiên cứu thực nghiệm:

− Khảo sát quá trình trích ly protein đậu phộng sử dụng chế phẩm enzyme

cellulase IndiAge Neutra L.

− Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm đến hoạt tính enzyme cellulase IndiAge

Neutra L.

− Khảo sát quá trình trích ly protein đậu phộng sử dụng sóng siêu âm kết hợp

với chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L.

− Tối ưu hóa quá trình trích ly protein đậu phộng dưới sự hỗ trợ của enzyme, kết

hợp siêu âm và chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L.

iv

MỤC LỤC

TRANG BÌA ......................................................................................................................... i

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN .......................................................................................................

LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN ............................................................................................ iii

MỤC LỤC .................................................................................................................. iv

DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................viii

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... x

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................. xii

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 1

1.1. Giới thiệu đề tài ................................................................................................ 1

1.2. Nguyên liệu đậu phộng ..................................................................................... 2

1.2.1. Tình hình sản xuất đậu phộng trên thế giới và Việt Nam ........................ 2

1.2.2. Đặc điểm sinh thái của đậu phộng .......................................................... 3

1.2.3. Thành phần hóa học của đậu phộng ........................................................ 5

1.3. Tính chất chức năng của protein đậu phộng: ................................................... 10

1.3.1. Khả năng hòa tan và hấp phụ nước ....................................................... 10

1.3.2. Khả năng tạo bọt .................................................................................. 11

1.3.3. Khả năng nhũ hóa................................................................................. 11

1.3.4. Khả năng tạo gel và tạo nhớt ................................................................ 12

1.4. Bột đậu phộng tách béo (DPF) ........................................................................ 13

1.5. Các phương pháp truyền thống trích ly protein đậu phộng .............................. 13

1.5.1. Phương pháp trích ly bằng cồn ............................................................. 13

1.5.2. Phương pháp dùng acid ........................................................................ 14

1.5.3. Phương pháp dùng kiềm ....................................................................... 15

1.5.4. Nhược điểm trích ly protein bằng phương pháp truyền thống ............... 16

1.6. Phương pháp dùng kỹ thuật membrane ........................................................... 17

1.7. Phương pháp dùng sóng siêu âm ..................................................................... 18

v

1.7.1. Khái quát chung về sóng siêu âm ......................................................... 18

1.7.2. Phân loại .............................................................................................. 19

1.7.3. Cơ chế của sóng siêu âm ...................................................................... 20

1.7.4. Các thông số ảnh hưởng đến quá trình siêu âm ..................................... 21

1.7.5. Ứng dụng sóng siêu âm trong một số quá trình chế biến thực phẩm ..... 23

1.7.6. Một số ứng dụng của siêu âm trong lĩnh vực trích ly ............................ 23

1.8. Ứng dụng enzyme để tăng khả năng trích ly protein ........................................ 27

1.8.1. Cơ chế sử dụng enzyme để trích ly protein đậu phộng ......................... 27

1.8.2. Enzyme cellulase .................................................................................. 28

1.8.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme ....................... 29

1.9. Ảnh hưởng của siêu âm đến các quá trình xử lý bằng enzyme: ........................ 33

1.9.1. Ảnh hưởng của siêu âm đến hoạt tính enzyme ...................................... 33

1.9.2. Tác dụng khác của siêu âm đến quá trình xử lý sinh học bằng enzyme . 33

1.10. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly protein ........................................ 34

1.10.1. Tỉ lệ bột : nước của huyền phù ............................................................. 34

1.10.2. Kích thước mẫu .................................................................................... 35

1.10.3. Tính chất nguyên liệu ........................................................................... 35

1.10.4. pH ........................................................................................................ 36

1.10.5. Nhiệt độ ............................................................................................... 37

1.10.6. Thời gian trích ly .................................................................................. 37

CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 38

2.1. Nguyên liệu..................................................................................................... 38

2.2. Enzyme ........................................................................................................... 38

2.3. Hóa chất sử dụng ............................................................................................ 38

2.4. Thiết bị sử dụng .............................................................................................. 39

2.5. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 39

2.5.1. Mục đích nghiên cứu ............................................................................ 39

2.5.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 40

2.6. Các phương pháp phân tích ............................................................................. 48

vi

2.6.1. Xác định độ ẩm .................................................................................... 48

2.6.2. Xác định độ tro ..................................................................................... 48

2.6.3. Xác định hàm lượng lipid ..................................................................... 48

2.6.4. Xác định hàm lượng protein tổng ......................................................... 48

2.6.5. Hiệu suất trích ly protein ...................................................................... 49

2.6.6. Xác định hoạt tính enzyme cellulase ..................................................... 49

2.6.7. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................... 50

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............................................................. 51

3.1 Khảo sát thành phần của nguyên liệu đậu phộng ............................................. 51

3.2 Khảo sát thành phần của bột đậu phộng tách béo ............................................ 51

3.3. Khảo sát quá trình trích ly protein đậu phộng sử dụng chế phẩm enzyme

cellulase hỗ trợ........................................................................................................... 52

3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L

sử dụng đến hiệu suất trích ly protein đậu phộng ....................................................... 52

3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích ly

protein đậu phộng ...................................................................................................... 56

3.3.3. Tối ưu hóa hàm lượng enzyme và thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất

trích ly protein đậu phộng .......................................................................................... 57

3.4. Khảo sát ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme cellulase

IndiAge Neutra L ....................................................................................................... 61

3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của cường độ siêu âm đến hoạt tính chế phẩm

enzyme cellulase IndiAge Neutra L ........................................................................... 61

3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hoạt tính enzyme

cellulase IndiAge Neutra L ........................................................................................ 63

3.5. Khảo sát quá trình trích ly protein khi kết hợp sóng siêu âm và enzyme .......... 67

3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng chế phẩm enzyme sử dụng đến hiệu

suất trích ly protein từ dịch trích đã xử lý bằng sóng siêu âm ..................................... 67

3.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích ly

protein từ dịch trích đã xử lý bằng sóng siêu âm ........................................................ 69

3.5.3. Tối ưu hóa hàm lượng enzyme và thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất

trích ly protein từ dịch trích đã xử lý bằng sóng siêu âm ............................................ 72

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 77

vii

4.1. Kết luận .......................................................................................................... 77

4.2. Kiến nghị ........................................................................................................ 77

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 79

PHỤ LỤC ................................................................................................................. 88

1. Xác định độ ẩm ............................................................................................... 88

2. Xác định độ tro ............................................................................................... 88

3. Xác định hàm lượng lipid ................................................................................ 88

4. Xác định hàm lượng protein tổng .................................................................... 89

5. Xác định hoạt tính enzyme cellulase ............................................................... 90

6. Kĩ thuật điện di ............................................................................................... 93

viii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1. 1:Đậu phộng (Arachis hypogaea) .................................................................... 3

Hình 1. 2: Quy trình sản xuất PPC theo phương pháp trích ly bằng cồn ..................... 14

Hình 1. 3: Quy trình sản xuất PPC theo phương pháp trích ly bằng acid .................... 15

Hình 1. 4: Quy trình sản xuất PPI theo phương pháp dùng kiềm ............................... 16

Hình 1. 5:Quy trình sản xuất PPI/PPC sử dụng membrane ......................................... 18

Hình 1. 6: Khoảng tần số của sóng siêu âm (Doktor-Ingenieur, 2002). ....................... 19

Hình 1. 7: Hình dao động của sóng siêu âm ............................................................... 20

Hình 1. 8: Ảnh hưởng của biên độ dao động đến tế bào đậu nành ở các thời gian khác

nhau ........................................................................................................................... 22

Hình 1. 9: Cấu trúc của Lignocellulose ...................................................................... 27

Hình 1. 10: Cơ chế thủy phân của enzyme cellulase ................................................... 29

Hình 1. 11: Ảnh hưởng nồng độ cơ chất với tốc độ xúc tác ban đầu Vmax ................... 29

Hình 1. 13: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme cellulase (tại 50oC) ................. 30

Hình 1. 12: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase (pH=4.8) .......... 32

Hình 1. 14: Ảnh hưởng của tỷ lệ bột nước đến khả năng hòa tan và độ thu hồi protein

đậu phộng tại pH 10. .................................................................................................. 35

Hình 1.

/n c =1/20 (w/v) ................................................................................................. 37

Hình 2. 1: Sơ đồ nghiên cứu ...................................................................................... 40

Hình 2. 2: Quy trình chuẩn bị bột đậu phộng tách béo................................................ 41

Hình 2. 3: Quy trình ứng dụng chế phẩm enzyme hỗ trợ quá trình trích ly protein đậu

phộng ......................................................................................................................... 42

Hình 2. 4: Quy trình khảo sát ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt tính chế phẩm

enzyme IndiAge Neutra L .......................................................................................... 44

Hình 2. 5: Quy trình trích ly protein khi kết hợp sóng siêu âm và enzyme.................. 46

Hình 3. 1: Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme sử dụng đến hiệu suất trích ly protein. 53

ix

Hình 3. 2: Cơ chế thủy phân cellulose thành glucose của enzyme cellulase................ 55

Hình 3. 3: Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích ly protein ........ 56

Hình 3. 4: Ảnh hưởng của hàm lượng và thời gian xử lý enzyme lên hiệu suất trích ly

protein ....................................................................................................................... 60

Hình 3. 5: Hình chiếu bề mặt biểu diễn phương trình hồi quy trên mặt phẳng tọa độ . 60

Hình 3. 6: Ảnh hưởng của cường độ siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge

Neutra L .................................................................................................................... 62

Hình 3. 7: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge

Neutra L .................................................................................................................... 64

Hình 3. 8: Kết quả điện di khi xử lý siêu âm ở các mức năng lượng và thời gian khác

nhau đối với chế phẩm enzyme cellulase IndiAge Neutra L ....................................... 66

Hình 3. 9: Ảnh hưởng của hàm lượng chế phẩm enzyme sử dụng đến hiệu suất trích ly

protein từ dịch trích sau khi xử lý bằng sóng siêu âm ................................................. 68

Hình 3. 10: Ảnh hưởng của thời gian xử lý chế phẩm enzyme đến hiệu suất trích ly


Hình 3. 11: Ảnh hưởng của hàm lượng và thời gian xử lý chế phẩm enzyme lên hiệu

suất trích ly protein từ dịch trích bột đậu phộng tách béo sau khi đã xử lý siêu âm. .... 75

Hình 3. 12: Hình chiếu bề mặt biểu diễn phương trình hồi quy trên mặt phẳng tọa độ 75

x

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. 1: Diện tích, năng suất, sản lượng đậu phộng trên thế giới từ 2005 – 2009 ...... 2

Bảng 1. 2: Diện tích, năng suất, sản lượng đậu phộng của Việt Nam từ 2005-2009 ...... 2

Bảng 1. 3: Phân loại khoa học cây đậu phộng .............................................................. 3

Bảng 1. 4: Thành phần hóa học của hạt đậu phộng ....................................................... 5

Bảng 1. 5: Thành phần các amino acid có trong đậu phộng .......................................... 6

Bảng 1. 6: Thành phần các acid béo có trong đậu phộng .............................................. 7

Bảng 1. 7: Thành phần các polysaccharide có trong đậu phộng .................................... 8

Bảng 1. 8: Hàm lượng một số vitamin trong 100 g hạt đậu .......................................... 9

Bảng 1. 9: Hàm lượng flavonoids và polyphenols có trong đậu phộng ......................... 9

Bảng 1. 10: Thành phần các nguyên tố khoáng trong đậu phộng ................................ 10

Bảng 1. 11: Một số ứng dụng của siêu âm năng lượng cao trong công nghiệp thực

phẩm (Alex Patist và Darren Bates, 2008) ................................................................. 23

Bảng 1. 12: Một số nghiên cứu chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học hỗ trợ bằng

siêu âm (Kamaljit Vilkhu và cộng sự, 2008) .............................................................. 25

Bảng 1. 13: Ảnh hưởng của sóng siêu âm lên quá trình trích ly protein liên tục và gián

đoạn từ bã đậu nành ................................................................................................... 26

Bảng 1. 14: Thành phần hóa học của bột đậu phộng tách béo (%) và bã thu được sau

khi tách protein, trước và sau khi xử lý enzyme (hemicellulase) ................................ 28

Bảng 1. 15: Hàm lượng protein trích ly được khi xử lý bằng các chế phẩm enzyme

khác nhau (S. Jung và cộng sự - 2006) ....................................................................... 31

Bảng 1. 16: Ảnh hưởng của NSI đến hiệu suất thu hồi sản phẩm ............................... 36

Bảng 3. 1: Thành phần hóa học của mẫu đậu phộng ................................................... 51

Bảng 3. 2: Thành phần hóa học của bột đậu phộng tách béo ...................................... 51

Bảng 3. 3: Ảnh hưởng của hàm lượng chế phẩm enzyme sử dụng đến hiệu suất trích ly

protein ....................................................................................................................... 53

Bảng 3. 4: Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích ly protein ....... 56

Bảng 3. 5: Ma trận quy hoạch thực nghiệm bậc hai tâm xoay, hai yếu tố và kết quả

thực nghiệm ............................................................................................................... 58

xi

Bảng 3. 6: Ảnh hưởng của các biến độc lập đến hiệu suất trích ly protein .................. 59

Bảng 3. 7: Ảnh hưởng của cường độ siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge

Neutra L .................................................................................................................... 61

Bảng 3. 8: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge

Neutra L .................................................................................................................... 64



Bảng 3. 10: Ảnh hưởng của thời gian xử lý chế phẩm enzyme đến hiệu suất trích ly



thực nghiệm ............................................................................................................... 73

Bảng 3. 12: Ảnh hưởng của các biến độc lập đến hiệu suất trích ly protein ................ 74

xii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

PC : Protein concentrate

PI : Protein isolate

PPC : Peanut protein concentrate

PPI : Peanut protein isolate

SPC : Soy protein concentrate

SPI : Soy protein isolate

WPC : Whey protein concentrate

WPI : Whey protein isolate

DPF : Defatted peanut flour – bột đậu phộng tách béo

CE : Catechin equivalent – tính theo hàm lượng catechin

MF : Microfiltration – vi lọc

UF : Ultrafiltration – siêu lọc

NF : Nanofiltration – lọc nano

RO : Reverse osmosis – thẩm thấu ngược

NSI : Nitrogen solubility index – chỉ số Nitơ hòa tan

EA : Emulsifying activity – chỉ số hoạt tính tạo nhũ

ES : Emulsifier stability – độ bền nhũ

UAE : Ultrasound assisted extraction – siêu âm hỗ trợ trích ly

Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu

Trang 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu đề tài

Protein là một hợp chất rất phổ biến trong các nguyên liệu và sản phẩm thực

phẩm. Có những thực phẩm protein là thành phần chính, có những thực phẩm protein

được thêm vào với vai trò là phụ gia. Protein thực vật được xem là nguồn nguyên liệu

thay thế protein động vật trong công nghiệp thực phẩm bởi khả năng bảo quản dễ

dàng, nguồn nguyên liệu phổ biến và đa dạng (đặc biệt là nguồn nguyên liệu từ cây họ

đậu, ngũ cốc và hạt có dầu). Hiện nay, ngành công nghiệp thực phẩm rất quan tâm đến

các chế phẩm từ protein như protein concentrate và protein isolate.

− Protein concentrate (PC): được sản xuất từ nguồn nguyên liệu giàu protein,

đã loại đi phần lớn các tạp chất phi protein, sản phẩm thường chứa 65% protein trở

lên (tính trên hàm lượng chất khô). (Uzzan, 1988).

− Protein isolate (PI): là sản phẩm protein đã qua tinh chế. PI được sản xuất từ

nguồn nguyên liệu giàu protein, nhưng đã loại đi gẩn như toàn bộ các tạp chất phi

protein, sản phẩm chứa tối thiểu từ 90% protein trở lên (tính trên hàm lượng chất

khô). (Uzzan, 1988).

PC và PI được ứng dụng rộng rãi trong các sản phẩm thực phẩm như thức ăn

dinh dưỡng, sữa, các sản phẩm từ thịt và cá, các loại soup, bánh mì…nhằm nâng cao

giá trị dinh dưỡng cho thực phẩm cũng như tận dụng các tính chất chức năng của

protein: khả năng hòa tan, khả năng tạo bọt, khả năng tạo gel, tạo nhũ …

− Nguyên liệu sản xuất protein concentrate và protein isolate

Một số nguyên liệu thực vật sử dụng để sản xuất PC và PI đã được nghiên cứu

như đậu nành, lúa mì, nấm, các loại hạt có dầu khác như đậu phộng, cải dầu, mè,

hướng dương… Đậu nành, hạt cải dầu, hạt bông, hạt hướng dương và đậu phộng cung

cấp 69% ; 12,4% ; 6,9% ; 5,3% và 2,8% lượng bột protein trên thế giới.

Trong đó đậu nành là loại hạt có dầu được trồng nhiều nhất trên thế giới. Ở Việt

Nam, nhìn chung sản lượng đậu nành vẫn chưa đủ đế đáp ứng nhu cầu tiêu thụ mà

hàng năm phải nhập khẩu nguyên liệu từ 1 – 1,2 triệu tấn. Trong khi đó sản lượng đậu

phộng cao, đáp ứng được nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Tuy hàm lượng protein

trong đậu phộng (20 – 30%) không cao bằng đậu nành nhưng có thể đáp ứng nhu cầu

sản xuất PC và PI. Hầu hết lượng đậu phộng dùng để sản xuất dầu phộng, bơ đậu

phộng, bánh kẹo và các sản phẩm snack. Quá trình sản xuất dầu phộng cho ra bột đậu

phộng tách béo. Bột đậu phộng tách béo là một sản phẩm phụ giàu protein, rẻ tiền.


Trang 2

Bột đậu phộng tách béo chứa 47 – 55% protein bao gồm một lượng lớn các acid amin

thiết yếu (Basha và Pancholy, 1982; USDA-NAL, 2005). Do đó cần tận dụng nguồn

nguyên liệu này để sản xuất PPC và PPI.

Protein trong thực vật tồn tại dưới dạng liên kết với các thành phần khác như các

polysaccharide, cellulose, hemicellulose ... Một số nghiên cứu đã cho thấy xử lý sóng

siêu âm, enzyme có thể làm tăng khả năng trích ly protein. Dưới tác dụng của sóng

siêu âm, sự sủi bong bóng được hình thành, là nguyên nhân phá vỡ tế bào, làm lộ các

protein và các liên kết háo nước, tăng khả năng hòa tan của protein. Các enzyme

thường sử dụng là hỗn hợp của nhiều loại enzyme khác nhau có thể cắt đứt các liên

kết của protein với các saccharide, lipid... trong tế bào, giải phóng protein, từ đó tăng

khả năng trích ly protein. Để tăng hiệu suất thu nhận protein mà vẫn giữ được các tính

chất chức năng của protein chúng tôi tiến hành nghiên cứu trích ly protein từ bột đậu

phộng tách béo sử dụng kỹ thuật siêu âm và chế phẩm enzyme.

1.2. Nguyên liệu đậu phộng

1.2.1. Tình hình sản xuất đậu phộng trên thế giới và Việt Nam

1.2.1.1. Tình hình sản xuất đậu phộng trên thế giới

Trong số các loại cây hạt có dầu trồng hàng năm trên thế giới, đậu phộng

đứng thứ năm về diện tích trồng và thứ tư về sản lượng.

Bảng 1. 1: Diện tích, năng suất, sản lượng đậu phộng trên thế giới từ 2005 – 2009

Chỉ tiêu 2005 2006 2007 2008 2009

Diện tích (triệu ha) 24,04 21,551 22,306 23,793 23,507

Năng suất (tấn/ha) 1,594 1,533 1,689 1,606 1,511

Sản lượng (triệu tấn) 38,326 33,047 37,681 38,216 35,52

Nguồn: FAOSTAT, 2010

1.2.1.2. Tình hình sản xuất đậu phộng ở Việt Nam

Bảng 1. 2: Diện tích, năng suất, sản lượng đậu phộng của Việt Nam từ 2005-2009

Chỉ tiêu 2005 2006 2007 2008 2009

Diện tích (triệu ha) 0,269 0,247 0,254 0,256 0,255

Năng suất (tấn/ha) 1,815 1,875 2,006 2,085 2,085

Sản lượng (triệu tấn) 0,489 0,463 0,51 0,534 0,551

Nguồn: FAOSTAT, 2010


Trang 3

1.2.2. Đặc điểm sinh thái của đậu phộng

1.2.2.1. Cây đậu phộng

Cây đậu phộng có tên khoa học Arachis hypogaea, là một loại cây thực phẩm

thuộc họ Đậu có nguồn gốc tại Nam Mỹ.

Hình 1. 1:Đậu phộng (Arachis hypogaea)

Bảng 1. 3: Phân loại khoa học cây đậu phộng

Giới (regnum) Plantae

Ngành (divisio) Magnoliophyta

Lớp (class) Magnoliopsida

Bộ (ordo) Fabales

Họ (familia) Fabaceae

Phân họ (subfamilia) Faboideae

Tông (tribus) Aeschynomeneae

Chi (genus) Arachis

Loài (species) A. hypogaea

http://vi.wikipedia.org/wiki/Gi%E1%BB%9Bi_%28sinh_h%E1%BB%8Dc%29

http://vi.wikipedia.org/wiki/Th%E1%BB%B1c_v%E1%BA%ADt

http://vi.wikipedia.org/wiki/Ng%C3%A0nh_%28sinh_h%E1%BB%8Dc%29

http://vi.wikipedia.org/wiki/Th%E1%BB%B1c_v%E1%BA%ADt_c%C3%B3_hoa

http://vi.wikipedia.org/wiki/L%E1%BB%9Bp_%28sinh_h%E1%BB%8Dc%29

http://vi.wikipedia.org/wiki/Th%E1%BB%B1c_v%E1%BA%ADt_hai_l%C3%A1_m%E1%BA%A7m

http://vi.wikipedia.org/wiki/B%E1%BB%99_%28sinh_h%E1%BB%8Dc%29

http://vi.wikipedia.org/wiki/B%E1%BB%99_%C4%90%E1%BA%ADu

http://vi.wikipedia.org/wiki/H%E1%BB%8D_%28sinh_h%E1%BB%8Dc%29

http://vi.wikipedia.org/wiki/H%E1%BB%8D_%C4%90%E1%BA%ADu

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Ph%C3%A2n_h%E1%BB%8D&action=edit&redlink=1

http://vi.wikipedia.org/wiki/Ph%C3%A2n_h%E1%BB%8D_%C4%90%E1%BA%ADu

http://vi.wikipedia.org/wiki/T%C3%B4ng_%28sinh_h%E1%BB%8Dc%29

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Aeschynomeneae&action=edit&redlink=1

http://vi.wikipedia.org/wiki/Chi_%28sinh_h%E1%BB%8Dc%29

http://vi.wikipedia.org/wiki/Chi_L%E1%BA%A1c

http://vi.wikipedia.org/wiki/Lo%C3%A0i


Trang 4

1.2.2.2. Phân loại

Dựa vào đặc tính phân cành phân thành 2 nhóm:

Nhóm phân cành xen kẽ (Virginia): dạng bụi, chu kì sinh trưởng 110 - 160

ngày.

Nhóm phân cành liên tục (Valencia và Spanish): cây đứng, thời gian sinh

trưởng 85 - 110 ngày ở nhiệt đới và xích đạo, gồm 2 dòng:

− Spanish: thân cao ngang cành, lóng ngắn, dạng cây đứng, ít nghiêng ngả; lá

chét bé, màu xanh đậm.

− Valencia: thân cao hơn cành, thân tím nhạt; quả thường có 2 - 3 hoặc 4 hạt.

1.2.2.3. Cấu tạo quả đậu phộng

Vỏ quả:

Vỏ quả dày từ 0,3 – 2mm, gồm 3 lớp: vỏ ngoài, vỏ giữa có mô cứng và vỏ trong

có mô mềm. Khi quả chín, trên vỏ quả có các đường gân ngang, dọc hình mạng lưới.

Quá trình hình thành quả chia làm 2 giai đoạn: giai đọan hình thành vỏ quả và giai

đoạn hình thành hạt. Vỏ quả chiếm 25-28% khối lượng quả.

Hạt đậu phộng

Hạt đậu phộng có nhiều hình dạng khác nhau: tròn, bầu dục… Về màu sắc cũng

khác nhau như đỏ tím, đỏ nâu nhạt, nâu… Hạt đậu phộng có 3 bộ phận là vỏ lụa, tử

diệp và phôi. Hạt đậu phộng là nguồn thực phẩm vừa cung cấp đạm vừa cung cấp dầu.

Khối lượng 1000 hạt nặng khoảng 400 ÷ 750gram.

Vỏ lụa

Vỏ lụa rất mỏng ở ngoài cùng bao lấy tử diệp và phôi. Khi sấy khô, để nguội vỏ

dễ tách ra khỏi tử diệp. Tử diệp gồm hai phiến, có màu trắng sữa hoặc trắng ngà.


Trang 5

1.2.3. Thành phần hóa học của đậu phộng

Bảng 1. 4: Thành phần hóa học của hạt đậu phộng

Thành phần Khoảng dao động (%) Trung bình (%)

Ẩm 3,9 – 13,2 5,0

Protein 21,0 – 36,4 28,5

Lipid 35,8 – 54,2 47,5

Cellulose 1,2 – 4,3 2,8

Tro 1,8 – 3,1 2,9

Đường khử 0,1 – 0,3 0,2

Disaccharide 1,9 – 5,2 4,5

Tinh bột 1,0 – 5,3 4,0

Pentosan 2,2 – 2,7 2,5

Nguồn: Journal of Agriculture and Food Chemistry,1, 1953

1.2.3.1. Protein

Đậu phộng chứa 26 – 29% protein có giá trị dinh dưỡng cao mặc dù các amino

acid như lysine, tryptophan, methionine và threonine có hàm lượng thấp (theo mức độ

tiêu thụ protein cần thiết hàng ngày). Protein đậu phộng gồm hai loại: 90% protein là

các globulins gồm 2 phân đoạn chính là arachin (nằm trong lớp aleurone), conarachin

(nằm trong tế bào chất) 10% là các albumin (Daussant J và cộng sự, 1969).

− Arachin được phân làm 2 loại: monomer (arachin I) và dimer (arachin II).

− Conarachin cũng được phân làm 2 loại: conarachin I và conarachin II với các

subunit khác nhau. (T. Yamada và cộng sự, 1980).


Trang 6

Bảng 1. 5: Thành phần các amino acid có trong đậu phộng

Amino acid Hàm lượng (mg/g protein)

Alanine 33.80 ± 3.09

Arginine 132.90 ± 12.16

Aspartic acid 107.95 ± 9.52

Cysteine 15.12 ± 1.39

Glutamic acid 188.35 ± 17.23

Glycine 51.85 ± 4.74

Histidine 20.47 ± 1.88

Isoleucine 28.88 ± 2.65

Leucine 56.43 ± 5.02

Lysine 32.03 ± 2.93

Methionine 12.01 ± 1.10

Phenylalanine 45.61 ± 4.17

Proline 48.89 ± 4.47

Serine 48.56 ± 4.44

Threonine 25.66 ± 2.35

Tryptophan 11.95 ± 1.09

Tyrosine 35.11 ± 3.21

Valine 34.78 ± 3.18

Nguồn: Journal of Agriculture and Food Chemistry 1997,45

1.2.3.2. Lipid:

Đậu phộng có hàm lượng lipid rất cao (45 – 55%). Acid béo chủ yếu trong đậu

phộng là acid oleic. Đặc biệt dầu phộng có khoảng 7% các acid béo mạch dài C-20

archidic, C-22 behenic, C-24 lignoceric là những acid béo đặc trưng chỉ có chủ yếu

trong dầu phộng. (Lihua Jiang và cộng sự, 2010)

Dầu đậu phộng là một hỗn hợp glycerid gồm: 80% acid béo no và 20% acid béo

không no. Thành phần acid béo thay đổi tùy theo giống và điều kiện trồng trọt.

Các acid béo chính trong đậu phộng: acid oleic, acid linoleic, acid palmitic.


Trang 7

Hai acid bão hòa có trong dầu đậu phộng là acid arachidic (C20) và acid

lignoceric (C24). Ở trạng thái bình thường, dầu đậu phộng là một chất lỏng màu vàng

nhạt, có độ nhớt thấp, có hương thơm và mùi vị như hạt dẻ.

Bảng 1. 6: Thành phần các acid béo có trong đậu phộng

Thành phần acid béo Khoảng dao động (%) Trung bình (%)

Myristic (C-14:0) <0,1 0,1

Palmitic (C-16:0) 8,3 – 14,0 11,1

Palmitoleic (C-16:1) <0,2 0,2

Magaric (C-17:0) - 0,1

Magaroleic (C-17:1) - 0,1

Stearic (C-18:0) 1,9 – 4,4 2,4

Oleic (C-18:1) 36,4 – 67,1 46,7

Linoleic (C-18:2) 14,0 – 43,0 32,0

Linolenic (C-18:3) <0,1 –

Arachidic (C-20:0) 1,1 – 1,7 1,3

Gadoleic (C-20:1) 0,7-1,7 1,6

Behenic (C-22:0) 2,1- 4,4 2,9

Erucic (C-22:1) <0,3 –

Lignoceric (C-24:0) 1,1 – 2,2 1,5

Nervonic (C-24:1) <0,3 –

Nguồn: Fats and Oils

1.2.3.3. Carbohydrate

Hàm lượng monosaccharide trong đậu phộng khoảng 5%, trong đó D – glucose

chiếm 2,9% và D – fructose chiếm 2,1%. Hàm lượng oligosaccharide chỉ khoảng

3,3%; bao gồm 0,9% sucrose; 1% raffinose; 0,8% stachyose và 0,3% verbascose

(E.W. Lusas, 1979). Trong khi đó, polysaccharide trong đậu phộng chủ yếu gồm: tinh

bột, glucan, galactoaraban, hemicellulose và cellulose.


Trang 8

Bảng 1. 7: Thành phần các polysaccharide có trong đậu phộng

Polysaccharide Hàm lượng (%)a Cấu trúc Liên kết

Arabinan 0,15 – –

Galactoaraban – Mạch thẳng -1,4-

Glucan – Mạch thẳng -1,4-

Glucomannan 0,15 Mạch thẳng -1,4-

Xylan 0,25 Mạch nhánh -1,4- (mạch chính);

-1,2- và -1,3- (mạch nhánh)

Acidic

polysaccharide

1,8 – –

a dựa trên khối lượng bột đậu phộng đã tách béo

Nguồn: Journal of the Science of Food and Agriculture1979, 30

1.2.3.4. Các thành phần khác

Acid phytic và muối phytate có trong lá mầm, là nguồn dự trữ phosphate. Bột

đậu phộng sau khi tách béo chứa 1,5 – 1,7% phytate. Nếu những chất này hiện diện

trong thực phẩm thì sẽ kết hợp với các cation hóa trị 2 như Ca, Fe, Zn, Mg… và làm

giảm giá trị dinh dưỡng của thực phẩm (A. Seo, C.V. Morr, 1985). Sự hiện diện của

acid phytic sẽ gây ra một số vấn đề trong quá trình sản xuất protein từ đậu phộng vì

phytate có khả năng tương tác với protein và làm giảm khả năng hòa tan của protein

trong nước.

Ngoài ra, trong đậu phộng còn có một hàm lượng đáng kể các hợp chất phenolic.

Những hợp chất phenolic thường gặp trong đậu phộng là: acid phenolic (caffeic,

vanillic, syringic, coumaric) hoặc tannin thường tồn tại dưới dạng tự do, ester hoặc

các dạng liên kết khác. Trong 1g bột đậu phộng tách béo, hàm lượng acid phenolic và

các hợp chất phenolic khác lần lượt là 1756 – 2033 μg và 50 – 120 μg (A. Seo, C.V.

Morr, 1985). Các hợp chất phenolic này có khả năng tác dụng với protein. Phương

pháp làm giảm hàm lượng phenolic chủ yếu tập trung vào việc tối thiểu hóa sự tương

tác giữa phenolic và protein, sau đó loại phenolic ra khỏi protein do sự khác nhau về

khả năng hòa tan cũng như kích thước.

Đậu phộng giàu vitamin nhóm B (trừ B12) như thiamin (B1), riboflavin (B2), acid

pantotenin (B3), B6, acid nicotinic (PP).


Trang 9

Bảng 1. 8: Hàm lượng một số vitamin trong 100 g hạt đậu

Vitamin Hàm lượng vitamin trong 100g hạt

Beta-carotene 10,00 (mcg)

B1 (Thiamine) 0,44 (mg)

B2 (Riboflavin) 0,12 (mg)

PP (Niacine) 16,00 (mg)

Nguồn: Journal of the Science of Food and Agriculture1979, 30

Bảng 1. 9: Hàm lượng flavonoids và polyphenols có trong đậu phộng

Phân loại Hàm lượng flavonoids

(mg CE/g)*

Hàm lượng polyphenols

(mg CE/g)

Đậu phộng sống 0,01 ± 0,00 25,71 ± 0,41

Đậu phộng sống (có vỏ lụa) 0,05 ± 0,00 28,71 ± 1,91

Đậu phộng rang khô 0,01 ± 0,00 27,33 ± 0,83

Đậu phộng rang với dầu 0,01 ± 0,00 28,61 ± 1,44

Đậu phộng luộc 0,06 ± 0,00 36,42 ± 1,39

(*) CE: catechin equivalent – tính theo hàm lượng catechin

Nguồn: Journal of Agriculture and Food Chemistry 2007, 55


Trang 10

Bảng 1. 10: Thành phần các nguyên tố khoáng trong đậu phộng

Thành phần Hàm lượng (mg/100g đậu phộng)

Ca 51,59 ± 0,32

K 867,52 ± 21,10

Mg 227,97 ± 2,69

P 568,16 ± 7,97

Al 0,11 ± 0,04

B 2,50 ± 0,01

Cu 0,05 ± 0,01

Fe 1,17 ± 0,01

Mn 1,86 ± 0,04

Mo 2,01 ± 0,02

Na 10,26 ± 2,40

Zn 2,99 ± 0,03

Nguồn: Journal of Agriculture and Food Chemistry 1997,45

1.3. Tính chất chức năng của protein đậu phộng:

1.3.1. Khả năng hòa tan và hấp phụ nƣớc

Khả năng hòa tan của protein phụ thuộc vào thành phần các amino acids có

trong phân tử. Khả năng hòa tan sẽ tăng khi số gốc kị nước giảm và ngược lại.

P.V. Monteiro (1994) khi nghiên cứu về khả năng hòa tan của protein đậu

phộng trong nước và dung dịch NaCl 0,2 M đã cho thấy rằng: tại các pH khác nhau thì

protein đậu phộng, cũng như hầu hết các cây có dầu khác sẽ hòa tan thấp nhất xung

quanh điểm đẳng điện pH 3,5 – 4,5 và cao nhất là ở pH 9 – 10.


Trang 11

(A): Khả năng hòa tan của protein đậu phộng trong nước; (B): khả năng hòa tan của

protein đậu phộng trong dung dịch NaCl 0,2 M; (a) protein tổng, (b) arachin, (c) conarachin

II, (d) conarachin I.

Hình 1.3: Khả năng hòa tan của protein đậu phộng tại các pH khác nhau

1.3.2. Khả năng tạo bọt

Khả năng tạo nhũ và tạo bọt tăng khi hàm lượng phytate và các hợp chất

polyphenolic giảm vì phytate và các hợp chất polyphenolic có khả năng tương tác với

protein đậu phộng, làm giảm khả năng tạo nhũ và tạo bọt của protein (Pawar và cộng

sự, 2001). Khả năng tạo bọt của protein đậu phộng được sắp xếp như sau: protein tổng

> conarachin I > arachin > conarachin II và khả năng bền bọt được sắp xếp conarachin

I > conarachin II ≥ protein tổng > arachin.

1.3.3. Khả năng nhũ hóa

Tổng protein của đậu phộng có chỉ số hoạt tính tạo nhũ là 1,11 (EA) trong khi

arachin, conarachin II và conarachin I có giá trị lần lượt là 0,9; 1,05 và 1,11. Và độ

bền nhũ của chúng (ES) có giá trị được sắp sếp từ 72 đến 300 giây.

P.V. Monteiro (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ protein, pH và nồng

độ NaCl đến khả năng tạo nhũ của protein đậu phộng thông qua phương pháp đo độ

hấp thu (bước sóng 500 nm) tại thời điểm ban đầu và tại thời điểm hệ nhũ giảm một

nửa độ bền. Nghiên cứu cho thấy khả năng nhũ hóa của protein đậu phộng thấp nhất

tại pH = 5 – 6. Khả năng nhũ hóa và độ bền nhũ cũng giảm khi nồng độ NaCl tăng từ

0,05 M đến 0,3 M, tuy nhiên khi nồng độ NaCl tiếp tục tăng thì khả năng nhũ hóa sẽ

tăng trở lại.


Trang 12

A - Thời gian, B - Nồng độ protein, C – pH, D - Nồng độ NaCl; (a) protein tổng, (b)

arachin, (c) conarachin II, (d) conarachin I

Hình 1.6: Ảnh hưởng của các yếu tố thời gian, nồng độ protein, pH, nồng độ NaCl

lên khả năng tạo nhũ của protein đậu phộng

1.3.4. Khả năng tạo gel và tạo nhớt

Độ nhớt của PC và PI phụ thuộc vào sự tương tác giữa những protein hòa tan,

protein không hòa tan với nước và các phân tử đã hydrate hóa. Độ nhớt sẽ gia tăng

theo hàm mũ khi hàm lượng protein tăng lên. Ngoài ra pH kiềm cũng sẽ làm gia tăng

độ nhớt.

Protein có khả năng tạo gel tốt vì kích thước phân tử lớn và có khả năng hình

thành những mối liên kết theo không gian 3 chiều. Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả

năng tạo gel của protein như pH, nhiệt độ, các thành phần không phải protein và các

quá trình cơ học trong quá trình sản xuất. Gel không thể được hình thành tại vùng pH

gần điểm đẳng điện của protein. Ta có thể làm tăng độ cứng của gel khi bổ sung thêm

muối nhưng tính đàn hồi của mạng lưới gel vẫn rất kém khi hàm lượng các hợp chất

phytates và phenolics cao do những hợp chất này có khả năng tương tác và tạo phức

với protein. (Pawar và cộng sự, 2001).


Trang 13

1.4. Bột đậu phộng tách béo (DPF)

DPF là sản phẩm chứa hàm lượng protein từ 47-55% (Basha và Pancholy, 1982;

USDA-NAL, 2005) tính theo hàm lượng chất khô và hàm lượng béo còn rất ít.

Nguyên liệu đậu phộng có thể được tách béo bằng phương pháp ép hoặc trích ly.

Bột đậu phộng tách béo được sử dụng để thu nhận protein trong quá trình sản

xuất PPC, PPI vì hàm lượng protein cao và hàm lượng dầu còn lại thấp (dưới 5%).

Tuy nhiên hiện nay, nguồn khô đậu phộng rất nhiều từ các nhà máy sản xuất dầu do

đó có thể thu nhận protein đậu phộng từ nguồn nguyên liệu đó. Nhưng với sản phẩm

khô đậu phộng trong công nghiệp nếu đem đi sản xuẩt PC và PI còn nhiều điểm hạn

chế. Do trong quy trình sản xuất dầu, người ta không tách lớp vỏ lụa, do đó trong khô

đậu phộng còn lẫn vỏ lụa có chứa nhiều chất màu rất khó xử lý. Nếu dùng khô đậu

phộng để sản xuất protein thì có màu sậm đen, không thể loại sắc tố ra ngoài sản

phẩm. Ngoài ra, khi dùng nguyên liệu khô đậu phộng từ các nhà máy sản xuất dầu, dễ

bị nhiễm mốc sinh độc tố aflatoxin. Độc tố này rất khó xử lý, bền vững với nhiệt. Nếu

kiểm soát được mức độ nhiễm độc tố aflatoxin trong khô đậu phộng, xử lý được

chúng và loại được chất màu của vỏ thì khô đậu phộng thực sự là nguồn nguyên liệu

cho sản xuất protein ở quy mô công nghiệp có giá trị.

1.5. Các phƣơng pháp truyền thống trích ly protein đậu phộng

1.5.1. Phƣơng pháp trích ly bằng cồn

Phương pháp này dựa trên tính chất

.

–

.

được

tách nhưng

k ,

4 – 6%

. (Uzzan,1988; Aluko và Yada,1995)


Trang 14

Hình 1. 2: Quy trình sản xuất PPC theo phương pháp trích ly bằng cồn

1.5.2. Phƣơng pháp dùng acid

Phương pháp acid dựa trên nguyên tắc kết tủa protein tại pH đẳng điện để tách

protein ra khỏi dịch đậu phộng tách béo.

DPF được trộn với

- , 40o

. Phư

65 – 70%. (Vioque và cộng sự, 1999; Aluko và Yada,1995; Aluko và

Yada,1995).

Bột đậu phộng tách béo

Cồn và nước Trích ly

Tách dung môi

PPC

Sấy

Rắn


Trang 15

Hình 1. 3: Quy trình sản xuất PPC theo phương pháp trích ly bằng acid

1.5.3. Phƣơng pháp dùng kiềm

Phương pháp dựa trên khả năng hòa tan của protein (protein hòa tan nhiều nhất

tại pH 9 – 10) để tách protein ra khỏi dịch huyền phù của bột đậu phộng tách béo.

DPF được hòa tan trong nước, sau đó c 50o

60 phút

– 90% (Jianmei Yu và cộng

sự, 2007).


Kiềm, nước

Phối trộn

Ly tâm

Hòa tan

Sấy

PPC

Nước, acid

Kết tủa


Trang 16

Hình 1. 4: Quy trình sản xuất PPI theo phương pháp dùng kiềm

1.5.4. Nhƣợc điểm trích ly protein bằng phƣơng pháp truyền thống

− ,

- (Berardi và cộng sự, 1972).

−

60-70% protei ).

− i khi rất nghèo protein hòa tan, tính chất chức năng

của sản phầm giảm do protein có thể biến tính trong điều kiện khắc nghiệt (trích ly

với cồn hay kiềm, xử lý nhiệt, kết tủa hay ly tâm) (Liener, 1994)


Kiềm, nước

Acid

Hòa tan

Ly tâm

Acid hóa

Ly tâm

Rửa khối đông

Trung hòa

Sấy phun

PPI

Nước, kiềm

Lỏng


Trang 17

).

− PPC và PPI thu được

-

- -phy

.

− Cuối cùng, một thể t

(Lin và cộng sự, 1974).

1.6. Phƣơng pháp dùng kỹ thuật membrane

Đ , n

(UF) (RO) PC và PI

(các chất như oligosaccharides và phytate có

thể được loại bỏ một cách hiệu quả nhờ phương pháp này).

Tiến hành: DPF 1:10, chỉnh pH 9 bằng

NaOH, kh , 43o

43o

63o

.

65o

4,

–

.

(S.S. Koseoglu và E.W. Lusas, 1988; Ashwani Kumar, 2006; T. V. R. Alicieo và

cộng sự, 2002; Sabine Baumgartner và cộng sự, 2003).


Trang 18

Hình 1. 5:Quy trình sản xuất PPI/PPC sử dụng membrane

1.7. Phƣơng pháp dùng sóng siêu âm

1.7.1. Khái quát chung về sóng siêu âm

Sóng siêu âm là dạng năng lượng được tạo ra bởi sóng âm (thực chất là áp suất

âm) có tần số lớn hơn giới hạn trên ngưỡng nghe của con người (16-20kHz). Theo M.

J.W. Povey và T. J. Mason (1998), sóng âm cơ bản được chia thành:

− Sóng tai người nghe được: 16Hz-18kHz

Bột đậu đã tách béo

NaOH, nước

NaOH, nước

Hòa tan

Ly tâm

Hòa tan

Ly tâm

Thanh trùng

Lọc UF

Sấy phun

PPC/PPI

Rắn

Lỏng


Trang 19

− Sóng siêu âm năng lượng cao: 20kHz-100 kHz

− Dãy năng lượng mở rộng: 20kHz-2MHz

− Sóng siêu âm chẩn đoán: 5MHz-10MHz

Hình 1. 6: Khoảng tần số của sóng siêu âm (Doktor-Ingenieur, 2002).

Xử lý siêu âm trong môi trường lỏng là áp đặt một áp suất âm (Pa) bổ sung vào

áp suất thủy tĩnh đã tác động lên môi trường. Áp suất âm có dạng hình sin và phụ

thuộc vào thời gian t, tần số f và biên độ dao động sóng cực đại Pa max. Biên độ áp suất

cực đại của sóng (Pa,max) tỉ lệ thuận với năng lượng đầu vào của máy biến năng

(Doktor-Ingenieur, 2002).

P2 = Pa max sin (2πft)

1.7.2. Phân loại

Sóng siêu âm có thể được chia thành 3 loại theo tần số: (Doktor-Ingenieur, 2002;

Alex Patist và Darren Bates, 2008)

Sóng siêu âm tần số cao năng lượng thấp (tần số lớn 100KHz – 1MHz), cường

độ nhỏ hơn 1 W/cm 2

): loại sóng này không làm thay đổi những tính chất lý hóa của

nguyên liệu khi truyền qua, do khi ở tần số cao vùng sủi bong bóng trở nên ít hơn.

Được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như một kỹ thuật phân tích nhằm xác

định các tính chất hóa lý của thực phẩm cũng như thành phần, cấu trúc và trạng thái

vật lý của sản phẩm.

Sóng siêu âm có tần số thấp, năng lượng cao (tần số từ 18 – 100KHz, cường độ

lớn hơn 1W/cm2): Loại sóng này tạo ra sự sủi bong bóng nhiều dẫn đến nhiệt độ và áp

suất cao trong vùng sủi bong bóng làm cho tế bào dễ bị phá vỡ, có thể làm thay đổi

tính chất lý hóa của nguyên liệu. Sóng siêu âm có tần số thấp năng lượng cao được

dùng để phá vỡ tế bào tăng hiệu quả trích ly các chất ra khỏi tế bào, tạo hệ nhũ, điều

khiển quá trình kết tinh, loại khí khỏi thực phẩm dạng lỏng, vô hoạt enzyme…

Siêu âm chuẩn đoán (tần số từ 1-10MHz): không có hiện tượng sủi bong bóng.

Siêu âm trong khoảng này được dùng để đo hệ số hấp thụ và tốc độ của sóng trong

môi trường, được dùng trong scan y học hay hóa phân tích.


Trang 20

1.7.3. Cơ chế của sóng siêu âm

Hiện nay, người ta tin rằng hầu hết sự tăng hiệu quả các quá trình được xử lý với

sóng siêu âm chủ yếu được gây ra do sự sủi bong bóng vì sự sủi bong bóng sẽ làm gia

tăng quá trình truyền nhiệt và truyền khối. Trong suốt quá trình truyền âm, những gợn

sóng truyền theo chiều dọc được hình thành. Khi một sóng âm gặp chất lỏng sẽ tạo ra

những chu kì nén và giãn liên tục. Các chu kỳ nén tác động một áp suất dương lên

chất lỏng, đẩy các phân tử chất lỏng lại gần nhau, các chu kỳ giãn tác động một áp

suất âm, kéo các phân tử chất lỏng ra xa nhau. Các phân tử chất lỏng được liên kết với

nhau nhờ các lực hấp dẫn mà tạo ra sức mạnh liên kết của chất lỏng. Trong suốt chu

kỳ giãn, sóng âm phải tạo ra một áp suất âm lớn hơn các lực hấp dẫn của chất lỏng.

Điều này dẫn đến sự xuất hiện của một số bong bóng.

Khi bong bóng được hình thành. Trong những chu kì giãn tiếp theo khí bên

ngoài có sự khuếch tán vào bên trong bong bóng, tới chu kì nén, bong bóng sẽ bị co

rút lại và khí bên trong bị hấp thu trở lại vào trong lòng chất lỏng. Nhưng ở giai đoạn

này, bong bóng đã có diện tích bề mặt lớn hơn nên lượng khí hấp thu vào lòng chất

lỏng sẽ ít hơn lượng khí lúc vào bên trong bong bóng. Do đó qua nhiều chu kì bong

bóng sẽ lớn dần lên (Moholkar và cộng sự, 2000).

Hình 1. 7: Hình dao động của sóng siêu âm

Sự tăng dần kích thước của bong bóng còn phụ thuộc nhiều vào cường độ của

sóng siêu âm. Đối với sóng siêu âm có cường độ năng lượng thấp, bong bóng được

hình thành với kích thước nhỏ, ít thay đổi trong quá trình nén và giãn, hiện tượng này

được gọi là sự sủi bong bóng khí ổn định (stable cavitation).

Đối với sóng siêu âm có cường độ năng lượng cao, những bong bóng được hình

thành và lớn dần lên. Sau nhiều chu kì, bong bóng sẽ đạt đến một kích thước tới hạn

mà năng lượng của sóng siêu âm không thể giữ pha hơi bên trong bong bóng. Đến chu

trình nén tiếp theo, hơi bất chợt ngưng tụ và những bong bóng sẽ vỡ. Những phân tử

xung quanh bong bóng va chạm nhau một cách mãnh liệt, tạo ra những vùng có nhiệt


Trang 21

độ và áp suất cao. Hiện tượng này gọi là sự sủi bong bóng nhất thời (transient

cavitation). Trong suốt quá trình siêu âm, sự sủi bong bóng ổn định có thể trở thành sự

sủi bong bóng nhất thời và cũng có thể đồng thời xảy ra (Atchley và Crum, 1988).

Thông qua hiện tượng các bong bóng sủi bong bóng, năng lượng cơ học của sóng siêu

âm được biến đổi và truyền qua dung dịch lỏng (Suslick, 1988; Laborde và cộng sự,

1998).

Khi tần số gia tăng, khu vực sủi bong bóng bong bóng trở nên ít dữ dội hơn và

khi tần số cao (1 MHz) thì sự sủi bong bóng bong bóng rất khó xảy ra và nếu trên 2,5

MHz thì hiện tượng sủi bong bóng là không thể (Alliger, 1975).

1.7.4. Các thông số ảnh hƣởng đến quá trình siêu âm

1.7.4.1. Biên độ dao động:

Sự sủi bong bóng phụ thuộc nhiều vào số lượng bong bóng được hình thành và

cường độ của sự vỡ bong bóng. Số lượng bong bóng gia tăng khi ngưỡng sủi bong

bóng giảm và khi biên độ của sóng siêu âm tăng.

Ngưỡng sủi bong bóng sẽ giảm khi nhiệt độ tăng và ngưỡng là zero tại nhiệt độ

sôi. Trong khi đó, cường độ của sự vỡ bong bóng phụ thuộc vào tỷ lệ giữa kích thước

lớn nhất và kích thước ban đầu của bong bóng. Tỷ lệ này được quyết định bởi năng

lượng sóng siêu âm và chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố.

Sóng siêu âm tác động lên nguyên liệu nhờ cơ chế tạo sủi bong bóng, tác dụng

lên bề mặt nguyên liệu và tạo ra các tia nước nhỏ xuyên vào bề mặt nguyên liệu. Tuy

nhiên ở các biên độ dao động của sóng khác nhau, thời gian siêu âm khác nhau mà

mức độ tác động lên nguyên liệu là nhiều hay ít.

Bishnu Karki (2009) tiến hành trích ly protein đậu nành bằng sóng siêu âm ở

các biên độ dao động và thời gian khác nhau. Bishnu Karki thí nghiệm ở các biên độ

dao động là 0; 21; 42; 63; 84 m, thời gian khảo sát là 15; 30; 60; 120 giây cho mỗi

biên độ dao động. Kết quả cho thấy, hàm lượng protein tăng so với mẫu đối chứng

13%; 23%; 27% và 46% tương ứng với việc xử lý ở các biên độ 21; 42; 63; 84 m

trong 120 giây. Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu còn cho thấy thời gian siêu âm càng

dài thì hàm lượng trích ly càng cao. Thời gian siêu âm càng dài thì tế bào được phá vỡ

càng nhiều, làm cho dung môi thấm dễ dàng vào nguyên liệu và trích ly protein tốt

hơn.


Trang 22

Xử lý siêu âm ở biên độ 42 ( m) và 63 ( m .(a), (b), (c), (d) lần lượt là không xử lý siêu âm, xử lý ở

15 giây, 60 giây, 120 giây.

Hình 1. 8: Ảnh hưởng của biên độ dao động đến tế bào đậu nành ở các thời gian

khác nhau

.

1.7.4.2. Nhiệt độ và độ nhớt của môi trƣờng

Nhiệt độ sẽ ảnh hưởng đến áp suất hơi, sức căng bề mặt và độ nhớt của môi

trường lỏng (Muthukumaran và cộng sự, 2006). Sự gia tăng nhiệt độ sẽ làm gia tăng

số lượng bong bóng tạo thành tuy nhiên cường độ sự vỡ bong bóng sẽ bị giảm do ảnh

hưởng của áp suất hơi tăng lên – đóng vai trò như lớp đệm, ngăn cản sự va chạm của

các phân tử xung quanh khi bong bóng vỡ (Alliger, 1975). Ngược lại, sự vỡ bong

bóng sẽ khó khăn khi nhiệt độ giảm vì độ nhớt môi trường tăng cao. Sự gia tăng nhiệt

độ sẽ làm giảm độ nhớt, cho phép sự vỡ bong bóng diễn ra mạnh mẽ hơn. Do đó nhiệt

độ phải được điều chỉnh để độ nhớt đủ thấp làm gia tăng độ mạnh của sự vỡ bong

bóng, tuy nhiệt độ cũng phải đủ thấp để không làm giảm độ mạnh của sự vỡ bong

bóng bởi áp suất hơi cao.

1.7.4.3. Áp suất ngoài

Khi tăng áp suất bên ngoài sẽ làm tăng ngưỡng sủi bong bóng, chính vì thế làm

giảm số lượng bong bóng hình thành (Muthukumaran và các cộng sự, 2006). Mặt

khác, khi tăng áp suất bên ngoài cũng kéo theo tăng áp suất bên trong các bong bong

ở thời điểm nổ, kết quả là sự vỡ bong bóng sẽ diễn ra nhanh chóng hơn, nhưng không

mãnh liệt (Lorimer và Mason, 1987). Chính vì thế, sự tăng áp suất bên ngoài có thể là

một phương pháp hiệu quả để đẩy mạnh quá trình mà không phải tăng biên độ sóng

(Hielsher, 2005)


Trang 23

1.7.5. Ứng dụng sóng siêu âm trong một số quá trình chế biến thực phẩm

Bảng 1. 11: Một số ứng dụng của siêu âm năng lượng cao trong công nghiệp thực

phẩm (Alex Patist và Darren Bates, 2008)

Ứng dụng Cơ chế - lợi ích.

Trích ly Gia tăng sự truyền khối, phá vỡ nguyên liệu tế bào thực vật

làm tăng hiệu suất chiết xuất.

Đồng hóa Sự vỡ những bong bóng khí tạo năng lượng làm xáo trộn 2

pha, làm dung dịch đồng nhất.

Kết tinh Điều khiển kích cỡ và tốc độ phát triển của những tinh thể đá.

Hình thành những tinh thể nhỏ, giảm mối nguy với tế bào, sản

phẩm giữ được nguyên dạng trong thời gian bảo quản.

Thay đổi độ nhớt Sự sủi bong bóng gây nên sự trượt phân tử, từ đó gây ra những

tính chất lưu biến chất lỏng làm giảm độ nhớt, Cải thiện các

đặc tính chế biến.

Phá bọt Sóng siêu âm phá vỡ lớp màng mỏng trên bọt. Gia tăng sản

lượng, giảm lượng hóa chất phá bọt, giảm mất mát trong quá

trình đóng chai.

Vô hoạt enzyme,

vi khuẩn

Sự vỡ những bong bóng khí sẽ ảnh hưởng lên thành tế bào vi

sinh vật. Vô hoạt vi sinh vật ở nhiệt độ thấp hơn, giúp cải thiện

chất lượng sản phẩm.

Lên men Tăng cường vận chuyển cơ chất và sản phẩm. Gia tăng sản

lượng các chất trao đổi, thúc đẩy quá trình lên men.

Truyền nhiệt Tăng quá trình truyền nhiệt do sự vỡ bong bóng, làm tăng sự

gia nhiệt.

1.7.6. Một số ứng dụng của siêu âm trong lĩnh vực trích ly

1.7.6.1. Trích ly chế phẩm dƣợc

Sóng siêu âm là một ứng dụng hết sức tiềm năng trong công nghiệp dược khi

được sử dụng để hỗ trợ trích ly các thành phần thảo dược. Việc cải thiện hiệu quả

trích ly khi ứng dụng sóng siêu âm so với các phương pháp cổ điển khi trích ly trong

nước đối với các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây thì là, hublong, cúc vạn thọ

và bạc hà lần lượt tăng 34%, 18%, 2% và 3%. So sánh với phương pháp cổ điển khi


Trang 24

trích ly trong rượu thì hiệu suất trích ly có sử dụng sóng siêu âm lần lượt tăng 34%,

12%, 3% và 7% (Vinatoru, 2001).

Trong nghiên cứu khác, Jian – Bing và công sự (2006) chiết xuất Geniposide từ

trái Gardenia (chi tử) bằng siêu âm trong môi trường nước. Khi sử dụng sóng siêu âm

ở cường độ 0,15 W/cm2, hiệu suất chiết xuất được gia tăng 16,5% so với quá trình

tĩnh dùng 40ml dung môi trên một gam quả.

1.7.6.2. Trích ly acid tartaric và acid malic:

Acid tartaric có trong trái cây và được tìm thấy nhiều trong nho và me

(Springett, 2001). Khoảng 90% tổng lượng acid hữu cơ trong nho là acid tartaric và

acid marlic. Acid tartaric là một sản phẩm phụ trong công nghiệp sản xuất rượu vang,

do một lượng lớn acid tartaric từ bã được tách ra từ rượu sau khi lên men. Palma và

Barroso (2002) đã tối ưu hóa điều kiện UAE để thu hồi acid tartaric từ phụ phẩm chế

biến rượu vang. Những nghiên cứu của Viện khoa học thực phẩm Australia dùng

UAE chiết xuất acid tartaric từ bã nho đỏ đã chỉ ra hiệu suất thu hồi gia tăng từ 16 –

23% từ hai loại nho khác nhau.

1.7.6.3. Trích ly các hợp chất polyphenol

Bã nho là chất thải rắn của quá trình làm rượu vang, bao gồm vỏ, hạt và một

lượng nhỏ lá. Bã nho đã được dùng cho sản xuất cồn, acid tartatric và gần đây hơn

dùng để khai thác các hợp chất phenolic.

Viện khoa học thực phẩm Australia đã nghiên cứu dùng hệ thống siêu âm năng

lượng cao để chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học. Đối tượng thu nhận là

polyphenol và carotenoids. Kết quả xử lý siêu âm bã nho làm gia tăng hàm lượng chất

phenolic thu nhận từ 11-35% (bảng 1.12)

Khi sử dụng siêu âm để trích ly polyphenol từ lá trà thì hiệu suất trích gia tăng

15 – 20% (Mason và Zhao, 1994)

1.7.6.4. Trích ly hợp chất màu Anthocyanin

Anthocyanin đang được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm do tiềm năng có thể

thay thế các chất màu tổng hợp và có lợi cho sức khỏe. Một nghiên cứu đã được thực

hiện dùng vi sóng và siêu âm để chiết xuất các hợp chất màu từ dâu. Điều kiện chiết

xuất tối ưu đạt được khi dùng vi sóng (624W, thời gian xử lý 60s) kết hợp với quá

trình siêu âm (thời gian xử lý 40s) và tỷ lệ nguyên liệu và dung môi chiết xuất là 1: 6

(Cai và cộng sự, 2003).


Trang 25

Bảng 1. 12: Một số nghiên cứu chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học hỗ trợ bằng

siêu âm (Kamaljit Vilkhu và cộng sự, 2008)

Mục tiêu

chiết xuất

Nguyên

liệu

Dung

môi

Phương pháp Nhiệt độ Lượng gia

tăng hiệu suất

thu hồi (%)

Beta-carotene Carrot Nước

Phòng thí nghiệm,

24 kHz, 20 – 75

Ws/ml

Bình

thường

15 – 25

Polyphenols Bã nho

đỏ

Nước Phòng thí nghiệm,

24 kHz, 20 – 75

Ws/ml

Bình

thường

11 – 35

Polyphenols Trà đen Nước Phòng thí nghiệm,

24 kHz, 20 – 75

Ws/ml

900C 6 – 18

Polyphenols Táo Nước Phòng thí nghiệm,

40 kHz, 20 – 75

Ws/ml

800C 6

1.7.6.5. Hợp chất hƣơng

Siêu âm cũng có thể được dùng để trích ly những hợp chất hương có tác động

lớn đến hương vị của rượu vang. Hỗn hợp dung môi n-pentane và diethyl-ether (1:2)

và dichloromethane được dùng để nghiên cứu điều kiện tối ưu cho trích ly UAE. UAE

làm tăng hiệu quả với hầu hết các hợp chất hương so với phương pháp thông thường

(Kamaljit Vilkhu và cộng sự, 2008).

Đánh giá UAE cho isoflavone từ đậu nành được thực hiện bởi Rostagno và cộng

sự (2003), hiệu quả trích ly tăng 15%.

Sóng siêu âm còn được dùng để trích ly các hợp chất hương khác như: trích ly

rutin từ nụ hoa Chinese Scholar Tree (Sophora japonica) – Paniwynk và cộng sự

(2001); trích ly phycocyanin từ Spirulina platensis (Arthrospira platensis) – Furuki và

cộng sự, 2003.

1.7.6.6. Trích ly protein

Một nghiên cứu của Haizhou Li và cộng sự (2004) cho thấy sự ảnh hưởng của

sóng siêu âm lên bề mặt nguyên liệu, thí nghiệm được tiến hành trên đậu nành, sau khi

xử lý siêu âm, quan sát thấy trên bề mặt nguyên liệu xuất hiện nhiều vết nứt nhỏ. Điều


Trang 26

này được giải thích là do sự vỡ bong bóng trên bề mặt nguyên liệu làm xuất hiện các

tia nước nhỏ xuyên thẳng vào bề mặt rắn tạo ra các vết nứt gãy. Tóm lại năng lượng

sóng siêu âm làm cho nguyên liệu bị rạn nứt, tăng sự tiếp xúc của tế bào với dung

môi, làm tăng sự khuếch tán bên trong phân tử của các chất hòa tan, nhờ đó tăng động

lực học quá trình trích ly (Kamaljitvilichu, 2008).

Moulton và Wang (1982) đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của sóng siêu âm

lên quá trình trích ly protein liên tục và gián đoạn từ bã đậu nành. Kết quả được trình

bày trong bảng 1.13

Bảng 1. 13: Ảnh hưởng của sóng siêu âm lên quá trình trích ly protein liên tục và

gián đoạn từ bã đậu nành

Quá trình* Thời gian

siêu âm

(phút)

Nước cất Dung dịch kiềm

Hiệu suất thu

hồi protein

(%)

Năng lượng

(W/g

protein)

Hiệu suất

thu hồi

protein (%)

Năng lượng

(W/g

protein)

Liên tục 2,5 37 1,64 49 1,29

Gián đoạn 2,5 24 1,24 44 0,68

Gián đoạn 5 29 2.01 44 1,34

Gián đoạn 60 46 15.4 53 13,44

(*) Tỷ lệ bột:nước là 1:10

Nguồn: Journal of Food Science 47, 1982

Nguyên nhân chính của việc ứng dụng siêu âm làm tăng khả năng hòa tan của

protein là trong suốt thời gian xử lý siêu âm đã gây ra một số lượng lớn các bong

bóng, các bong bóng lớn dần trong vùng nhiệt độ và áp suất xung quanh gây nên sự

vỡ bong bóng. Điều này dẫn đến làm lộ các protein và làm lộ các liên kết với nước

của các liên kết peptide. Cường độ sóng siêu âm cao làm tăng khả năng trích ly do tác

động lên cấu trúc của protein làm các acid amin háo nước được tiếp xúc với nước

(Moulton và Wang, 1982).

Anet Rezek và cộng sự (2009) tiến hành thí nghiệm trên SPC, khảo sát ở tần số

20 kHz trong 15 phút và 30 phút hàm lượng protein hòa tan lần lượt là 64,3 %- 74%

và 78%, ở tần số 40 kHz bể xử lý ở 15 và 30 phút hàm lượng protein tăng 64,3% -

78% và 82% tương ứng.


Trang 27

1.8. Ứng dụng enzyme để tăng khả năng trích ly protein

1.8.1. Cơ chế sử dụng enzyme để trích ly protein đậu phộng

Vì protein trong thực vật tồn tại dưới dạng liên kết với các thành phần khác như

các polysaccharide, cellulose, hemicellulose… do đó cần phải phân cắt các liên kết

của phân tử protein với các thành phần khác làm xuất hiện nhiều nhóm ưa nước, tăng

khả năng hòa tan của protein. Theo nghiên cứu của Ismail (1993), sử dụng enzyme

thủy phân có thể làm tăng khả năng hòa tan protein từ bột đậu phộng vào dung dịch

trích ly. Nhiều enzyme được sử dụng để hỗ trợ quá trình thủy phân protein đậu phộng:

hemicellulase, cellulase, glucanase, amyloglucosidase…

Cellulose không phải là thành phần chính của bột đậu phộng tách béo nhưng nó

đóng vai trò chủ đạo trong việc tách protein. Màng cellulose chỉ có ở tế bào thực vật,

là màng bảo vệ, còn gọi là vách tế bào. Thành phần hóa học của màng cellulose khá

phức tạp, nước chiếm 60% được chứa trong các khoảng tự do của màng, 30%

cellulose, các sợi cellulose liên kết với nhau tạo thành các mixen (khoảng 100 sợi

cellulose bện lại với nhau tạo nên một mixen với kích thước 5nm, cứ 20 mixen kết với

nhau lại tạo nên một sợi bé (microfibrin) Với kích thước khoảng 10- 20 nm, và cứ 250

sợi bé lại tạo nên sợi lớn (macrofibrin). Các sợi đan chéo với nhau theo nhiều hướng

làm cho màng cellulose rất bền vững, nhưng lại có khả năng đàn hồi. Nhờ cấu trúc

trên, màng cellulose vừa bền vừa mềm dẻo thích ứng với chức năng bảo vệ của nó.

Màng này đã giúp cho tế bào có hình dạng ổn định.

Lignocellulose có cấu trúc vững chắc, dày đặc rất khó phân cắt. Về mặt hóa học,

chúng gồm 2 polymer mạch thẳng cellulose và hemicellulose và một polymer có cấu

trúc không gian ba chiều lignin. Cellulose được bao quanh bởi hemicellulose và

lignin.

Hình 1. 9: Cấu trúc của Lignocellulose

Nguồn: Jeremy C. Smith, ORNL Center for Molecular Biophysics, 2008

Hemicellulose


Trang 28

bằng phương pháp sử dụng chế phẩm enzyme :

− enzyme

.

−

.

Nghiên cứu của Rudrapatnam N. và cộng sự (1975) đã chứng minh việc dùng

enzyme hemicellulase làm tăng hiệu quả trích ly protein, hàm lượng protein còn sót

trong bã rất ít 10,2%.

Bảng 1. 14: Thành phần hóa học của bột đậu phộng tách béo (%) và bã thu được sau

khi tách protein, trước và sau khi xử lý enzyme (hemicellulase)

Thành phần Bột Bã (trước khi xử lý

enzyme)

Bã (sau khi xử lý

enzyme)

Sản lượng 100,0 44,8 29,7

Độ ẩm 4,5 3,3 3,2

Tro 2,9 4,8 4,9

Protein thô (Nx6,25) 53,9 36,4 10,2

Nguồn: Groundnut Carbohydrates-a Review,1979.

1.8.2. Enzyme cellulase

Cellulase dùng để chỉ chung cho các enzyme tham gia phân cắt hợp chất

cellulose. Các enzyme cellulase đều có tác dụng phân cắt liên kết -1,4 giữa 2 đơn vị

glucose và được phân ra làm 3 nhóm chủ yếu sau đây:

− 1,4 -D-glucan cellobiohydrolase (EC.3.2.1.91) (CBH): Enzyme này còn có

một loạt các tên khác như: cellobiohydrolase, cellobiosidase và avicellase.

− 1,4 -D-glucan –4- glucanohydrolase (EC.3.2.1.4) (EG): Enzyme này còn có

một loạt tên khác như: endoglucanase, endo 1,4 -D-glucanase, C-cellulase.

− -D-glucoside glucohydrolase (EC.3.2.1.21): không có khả năng phân hủy

cellulose nguyên thủy. Chúng còn có tên là cellobiase và -glucosidase.

Sự thủy phân cellulose là sự kết hợp của 3 loại enzyme trên. Đầu tiên enzyme EG

tấn công vào giữa mạch cellulose và giải phóng các đầu cuối của chuỗi. Tiếp sau đó

các enzyme CBH tiếp tục phân cắt để tạo sản phẩm cuối là cellobiose. Việc phân cắt

cuối cùng tạo thành glucose là nhờ vào enzyme thứ ba -glucosidase. (Wood, 1992) .


Trang 29

Hình 1. 10: Cơ chế thủy phân của enzyme cellulase

Nguồn: Working Group Molecular Biotechnology

1.8.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến tốc độ phản ứng của enzyme

1.8.3.1. Nồng độ enzyme

Trong điều kiện thừa cơ chất thì tốc độ phản ứng enzyme tỉ lệ tuyến tính với

nồng độ enzyme. Nhưng khi nồng độ enzyme quá lớn tốc độ phản ứng enzyme cũng

tăng chậm. V= k [E]

Với V: vận tốc phản ứng

[E] : nồng độ enzyme.

1.8.3.2. Nồng độ cơ chất

Mở đầu phản ứng phải tạo thành phức enzyme-cơ chất, sau đó phức enzyme-cơ

chất chuyển hóa tiếp tạo thành sản phẩm cuối cùng của phản ứng enzyme tự do,

enzyme lại kết hợp với phân tử cơ chất khác bắt đầu vòng xúc tác mới. Nồng độ cơ

chất càng cao tốc độ phản ứng càng tăng nhưng nồng độ cơ chất tăng đến mức độ nào

đó thì dù nồng độ cơ chất có tăng nhưng tốc độ phản ứng vẫn không đổi.

Hình 1. 11: Ảnh hưởng nồng độ cơ chất với tốc độ xúc tác ban đầu Vmax

http://www.vt.tuwien.ac.at/division/wg_info.php?wg_id=1


Trang 30

1.8.3.3. pH môi trƣờng

pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc

biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến

phản ứng của enzyme. Đối với cellulase pH tối thích là 5-6.

(): enzyme từ Streptomyces masaysiensis AMT-3, () enzyme IndiAge Super L

Hình 1. 12: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme cellulase (tại 50oC)

(R.P. Nascimento và cộng sự, 2009)

Một số thương phẩm cellulase như IndiAge Super L, Puradax HA, Multifect B,

Multifect GC và chế phẩm Multifect pectinase đã được nghiên cứu để ứng dụng cho

việc trích ly protein đậu nành với pH tối ưu khác nhau. Indiage Super L, Puradax HA

hoạt động ở pH 7, pH 5 cho Multifect B và Mutifect GC, Multifect pectinase hoạt

động ở pH 4.

Theo nghiên cứu của S. Jung và cộng sự (2006), hàm lượng protein thu được khi

sử dụng enzyme hoạt động ở pH 4 là 30% bằng một nửa so với khi sử dụng enzyme

hoạt động ở pH 7. Vậy việc trích ly protein bằng enzyme được nhận thấy là trích ly

thu hiệu suất thấp ở pH 4-5 là do có sự đông tụ protein ở những pH này, trong khi đó

pH 7 là pH mà ở đó khả năng protein hòa tan cao.


Trang 31

Bảng 1. 15: Hàm lượng protein trích ly được khi xử lý bằng các chế phẩm enzyme

khác nhau (S. Jung và cộng sự - 2006)

Enzyme Hàm lượng enzyme (%) Hàm lượng protein trích ly (%)

Multifect GC

(pH 4,0)

0 31,4

10 35,5

Multifect B

(pH 5,0)

0 46,0

5 48,2

Multifect pectinase

(pH 4,0)

0 31,8

1 38,5

5 46,6

10 48,2

Puradax HA

(pH 7,0)b

0 55,5

1 60,6

5 59,2

10 60,3

IndiAge Super L

(pH 7,0)

0 53,3

1 58,2

5 62,5

10 62,4

Nguồn: JAOCS 83, 71-78 (2006

Thới gian phản ứng: 3 giờ

1.8.3.4. Nhiệt độ

Mỗi enzyme đều có một nhiệt độ tối thích, tại đó hoạt tính enzyme là cao nhất.

Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ giảm. Nhiệt độ tối

ưu của enzyme phụ thuộc nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH, các chất bảo

vệ. Nhiệt độ tối ưu cho enzyme cellulase hoạt động là 45-550C.


Trang 32

(): enzyme từ Streptomyces masaysiensis AMT-3, () enzyme IndiAge Super L

Hình 1. 13: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase (pH=4.8)

(R.P. Nascimento và cộng sự, 2009)

1.8.3.5. Các chất kìm hãm

Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các

phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay

đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng. Các chất gây kìm

hãm hoạt động của các enzyme bao gồm các ion, các chất vô cơ, các chất hữu cơ và

cả protein.

Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận

nghịch. Tùy thuộc bản chất tạo phức enzyme – chất kìm hãm mà chia ra thành chất

kìm hãm cạnh tranh và chất kìm hãm không cạnh tranh.

1.8.3.6. Các chất hoạt hóa

Các chất làm tăng hoạt độ xúc tác của enzyme gọi là các chất hoạt hóa enzyme.

Các chất hoạt hóa enzyme có thể là những anion, các kim loại từ ô thứ 11 đến ô thứ

55 trong bảng hệ thống tuần hoàn Mendeleev, các chất hữu cơ phức tạp. Các chất hoạt

hóa chỉ có tác dụng hoạt hóa ở một nồng độ nhất định. Vượt quá nồng độ này, sẽ gây

ức chế hoạt động của enzyme.

Ở nồng độ hoạt hóa, các chất hoạt hóa thường làm nhiệm vụ chuyển nhóm

hydrogen hoặc những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền

enzyme hoặc các chất có tác dụng phục hồi các nhóm chức trong trung tâm hoạt động

của enzyme.


Trang 33

1.9. Ảnh hƣởng của siêu âm đến các quá trình xử lý bằng enzyme:

1.9.1. Ảnh hƣởng của siêu âm đến hoạt tính enzyme

Nói chung, khi xử lý siêu âm có hai ảnh hưởng chính: hiện tượng sủi bong bóng

và gia nhiệt. Siêu âm ở tần số thấp làm tiêu mòn hầu hết năng lượng siêu âm thông

qua hiện tượng sủi bong bóng, trong khi siêu âm ở tần số cao tiêu hao một lượng đáng

kể năng lượng thông qua gia nhiệt.

Trong quá trình xử lý sinh học bằng enzyme, ảnh hưởng quan trọng hơn là hiện

tượng sủi bong bóng – hiện tượng hình thành, lớn lên và vỡ mãnh liệt của bong bóng

trong chất lỏng. Bong bóng nổ làm tăng mạnh áp suất và nhiệt độ trong lòng chất

lỏng.

Trong quá trình xử lý siêu âm, phân tử nước sẽ bị phân hủy và tạo ra những chất

trung gian có năng lượng lớn như là H , OH , e-(aq), H2O2, HO2, H2 (Karaboga và cộng

sự, 2007). Sự hình thành những hợp chất trung gian nói trên sẽ ảnh hưởng đáng kể

đến độ bền và hoạt tính xúc tác của đại phân tử enzyme. Tuy nhiên, khi siêu âm được

dùng để vô hoạt enzyme thì hiệu quả thật sự của nó khá thấp do khả năng đại phân tử

enzyme bị mắc vào bong bóng và tiếp xúc với những sản phẩm phân hủy của phân tử

nước có tính oxy mạnh nói trên là rất thấp (Karaboga và cộng sự, 2007).

1.9.2. Tác dụng khác của siêu âm đến quá trình xử lý sinh học bằng

enzyme

Ngoài việc ảnh hưởng đến hoạt tính riêng của enzyme, siêu âm còn ảnh hưởng

đến quá trình xử lý sinh học bằng enzyme, đặc biệt khi xử lý enzyme trong hệ không

đồng nhất. Cơ chế của siêu âm ảnh hưởng đến các quá trình xử lý sinh học bao gồm:

− Tăng hệ số khuếch tán của các phân tử, cải thiện sự di chuyển của các phân

tử chất tham gia phản ứng.

− Siêu âm trực tiếp tham gia vào quá trình xử lý sinh học.

1.9.2.1. Tăng khả năng khuếch tán của các phân tử (Karaboga và cộng sự,

2007)

− Đưa năng lượng siêu âm vào hệ không đồng nhất tạo ra một lượng lớn bong

bóng trong vùng lân cận gần sát của bề mặt rắn-lỏng, trong khi trong hệ đồng nhất,

bong bóng được phân bố bằng nhau trong khối dung dịch.

− Trong trường hợp hệ không đồng nhất hầu hết bong bóng được tạo ra gần bề

mặt của cơ chất, do đó tăng kết quả của sự va chạm cơ học tạo bởi những tia năng

lượng của bong bóng. Mặt khác, dù những cấu trúc được sắp xếp tốt và được gói gọn

gần nhau, đại phân tử enzyme thường không hoàn toàn cứng nhắc và có tính linh động


Trang 34

trong dung dịch giúp cho nó đến vị trí thích hợp, vị trị hoạt động tương ứng với cơ

chất. Do đó, khuấy trộn mãnh liệt của lớp ranh giới không di động của chất lỏng ở bề

mặt rắn-lỏng tạo bởi siêu âm giúp đại phân tử enzyme khuếch tán đến tiếp xúc với cơ

chất nhanh hơn.

- Cuối cùng, một lợi ích khác của khuấy trộn mạnh của lớp biên bởi bong bóng

vỡ là loại bỏ những sản phẩm của phản ứng thủy phân nhanh chóng từ vùng phản ứng

giúp tăng tốc độ phản ứng.

1.9.2.2. Siêu âm trực tiếp tham gia vào quá trình xử lý sinh học

Tự bản thân siêu âm cũng có khả năng thực hiện các phản ứng phân cắt các

mạch cao phân tử polymer, bên cạnh phản ứng phân cắt bởi enzyme. Phân cắt

polymer bởi siêu âm là sự phân cắt ngẫu nhiên và tồn tại một độ dài chuỗi giới hạn mà

khi giới hạn này đạt đến thì quá trình phân cắt bởi siêu âm sẽ dừng lại.

Như đã được trình bày ở phần trước, xử lý siêu âm đối với chất lỏng gây ra hiện

tượng sủi bong bóng. Những bong bóng bị vỡ nhanh sẽ tạo ra gradient áp suất và vận

tốc cục bộ cao của lớp chất lỏng trong vùng lân cận. Hiện tượng này có thể tạo nên

lực cắt và có thể phá vỡ những chuỗi polymer. Đây là hoạt tính hóa cơ của sóng siêu

âm lên polymer. Ngoài ra, trong quá trình xử lý siêu âm, phân tử nước có thể phân ly

hình thành các gốc tự do. Những gốc tự do này khuếch tán ra khỏi lổ hổng đến chất

lỏng xung quanh, tại đây chúng có thể phản ứng với các phân tử hòa tan.

Ngoài hai cơ chế này (hóa cơ và tấn công bởi gốc tự do), polymer trong dung

dịch có thể chịu sự nhiệt phân trong vùng bề mặt tiếp xúc nóng giữa bong bóng khí và

chất lỏng xung quanh (Piotr Ulanski và cộng sự, 2005).

1.10. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình trích ly protein

1.10.1. Tỉ lệ bột : nƣớc của huyền phù

Bản chất của quá trình trích ly là sự khuếch tán, vì vậy sự chênh lệch nồng độ

giữa hai pha chính là động lực của quá trình. Khi chênh lệch nồng độ lớn tức tăng

lượng dung môi thì lượng chất trích ly tăng, thời gian trích ly giảm. Tuy nhiên nếu

lượng dung môi sử dụng quá lớn thì sẽ làm loãng dịch trích, càng nhiều nước dùng để

trích ly thì nồng độ protein trong chất chiết càng thấp và một lượng nhỏ protein còn

lại trong bã chiết. Khi đó cần phải cô đặc hoặc xử lý dịch trích bằng phương pháp

khác để tách bớt dung môi. Song song đó là một lượng lớn nước thải phải được xử lý

trên một lượng protein tạo thành. Điều này có nghĩa là thiết bị trích ly, ly tâm và

lượng thải ra lớn hơn. Tỷ lệ rắn/lỏng được sử dụng trong công nghiệp dao động trong

khoảng 1:5 ÷ 1:20 (Zeki Berk, 1992)


Trang 35

Jianmei Yu và cộng sự (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ bột : nước lên

khả năng trích ly của protein đậu phộng. Tác giả tiến hành thí nghiệm ở các tỉ lệ

1:100, 1:50, 1:20, 1:10, các dịch huyền phù được chỉnh về pH 10. Từ thực nghiệm

thấy hàm lượng protein thu hồi cao nhất ở tỉ lệ 1:20. Ở tỉ lệ 1:50, hàm lượng protein

thu hồi không khác nhau có ý nghĩa với hàm lượng thu hồi ở tỉ lệ 1:20. Do đó,

Jianmei Yu đã chọn tỉ lệ 1:20 làm tỉ lệ tối ưu trong quy trình sản xuất PPC, PPI.

(roasted fermented peanut flour).

Hình 1. 14: Ảnh hưởng của tỷ lệ bột nước đến khả năng hòa tan và độ thu hồi protein

đậu phộng tại pH 10.

1.10.2. Kích thƣớc mẫu

Khi nguyên liệu được nghiền nhỏ sẽ tăng diện tích tiếp xúc giữa chúng và dung

môi. Đồng thời còn làm phá vỡ cấu trúc tế bào, thúc đẩy quá trình tiếp xúc triệt để

giữa dung môi và nguyên liệu, nâng cao hiệu suất trích ly.

Hiệu suất trích ly còn phụ thuộc vào độ đồng nhất và độ hòa tan protein ban đầu

của nguyên liệu (Ted và cộng sự, 2007). Do đó, các kết quả về ảnh hưởng của kích

thước hạt đến hiệu suất trích ly thường không giống nhau. Bằng phương pháp thực

nghiệm xác định kích thước phù hợp với nguyên liệu đem trích ly.

1.10.3. Tính chất nguyên liệu

Pro

tein

tan

tron

g d

ịch

tríc

h (%

)

lƣợ

ng

prote

in t

an

(g)

/ 100g b

ột


Trang 36

Tính chất của nguyên liệu cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu suất trích ly. Nói chung,

hầu hết các nguồn nguyên liệu dùng trích ly protein đều có chứa một hàm lượng dầu

đáng kể 40-50% (w/w). Đối với nguồn nguyên liệu có chứa dầu như vậy cần phải tách

dầu trước khi tiến hành trích ly protein. Việc loại bỏ dầu sẽ ngăn chặn sự hình thành

nhũ tương trong trích ly. Đồng thời quá trình sản xuất protein không chứa dầu cũng

phù hợp với việc trích ly protein sau này vì dung môi trích ly thường là nước. (Abbot

và cộng sự, 1991; Kumagai và cộng sự, 2002).

Ở một số loại nguyên liệu, thành phần protein có chứa hàm lượng cao các

phytate, các hợp chất phenolic và các chất khác có thể gây hại, ảnh hưởng tới hiệu

suất trích ly protein hoặc làm thay đổi màu, giảm hương vị hoặc chức năng của

protein. Do đó, phải xử lý sơ bộ để loại bỏ các chất không mong muốn.

Ngoài ra hiệu suất trích ly phụ thuộc rất nhiều vào độ hòa tan của nguyên liệu

ban đầu. Nguyên liệu có độ hòa tan càng lớn thì hiệu suất thu hồi sản phẩm càng cao.

Nguyên liệu phù hợp để sản xuất protein phải có độ hòa tan (nitơ hòa tan- NSI) lớn

hơn 80%. Nghiên cứu trên bột đậu nành F.E. Mitidieri, J.R. Wagner (2002) cho thấy

mối quan hệ giữa chỉ số nitơ hòa tan và hiệu suất trích ly sản phẩm, phần trăm protein

thất thoát trong whey và còn lại trong bã.

Bảng 1. 16: Ảnh hưởng của NSI đến hiệu suất thu hồi sản phẩm

NSI (%) Sản phẩm (%) Whey (%) Bã sau khi trích ly protein (%)

84

65

22

75

65

51

11

11

9

14

24

40

1.10.4. pH

Tất cả các protein đều có một điểm đẳng điện mà tại đó các phân tử acid amin

trung hòa về điện, protein sẽ kết tủa xuống.

pH của môi trường trích ly phải phù hợp với từng loại protein nếu không sẽ xảy

ra hiện tượng kết tủa hoặc gây biến tính protein. Ở pH cao thì hàm lượng protein có

thể trích ly càng nhiều. Tuy nhiên, các protein có thể bị biến đổi hóa học trong dung

dịch kiềm mạnh. Các biến đổi này bao gồm sự biến tính protein và các thay đổi hóa

học trong các amino acid. pH cao còn xảy ra sự tương tác giữa protein và

carbohydrate (phản ứng Maillard), kết quả tạo ra các chất sẫm màu và giảm giá trị

dinh dưỡng. Như vậy, pH của dung môi trích ly sẽ ảnh hưởng đến tính hòa tan

protein. Tại pH trên và pH dưới điểm đẳng điện của protein, số nhóm tích điện sẽ tăng


Trang 37

lên, sự tương tác tĩnh điện và hydrate hóa sẽ xảy ra, khả năng hòa tan sẽ tăng lên.

Theo nghiên cứu của Jianmei Yu và cộng sự (2007) đã cho thấy protein đậu hòa tan

kém nhất tại pH 4.5. Tại pH 10 khả năng protein hòa tan là tốt nhất.

(roasted fermented peanut flour). RWU

(raw fermented peanut flour).

Hình 1. 15: đậu phộng

=1/20 (w/v)

1.10.5. Nhiệt độ

Nhiệt độ cao làm cho các phân tử chuyển động nhanh từ đó hình thành các liên

kết hydro của phân tử protein với nước, điều này làm cho các liên kết giữa amino và

carboxyl dễ dàng bị phá vỡ. Nhưng khi nhiệt độ quá cao, là nguyên nhân chính gây

biến tính protein đậu phộng, đặc biệt là arachin. Giải thích cho vấn đề này, khi nhiệt

độ quá cao, nó tác động lên phân tử, có sự xắp xếp lại chuỗi peptide làm lộ ra các liên

kết kị nước điều này làm giảm hàm lượng protein trích ly trong dịch (Neucere, 1972).

1.10.6. Thời gian trích ly

Nếu thời gian quá ngắn thì hiệu quả trích ly không cao. Nếu thời gian dài sẽ tăng

hiệu quả của quá trình, tuy nhiên hiệu suất thu hồi chất chiết sẽ không tăng thêm đáng

kể. Mặc khác, thời gian trích ly quá dài sẽ xảy ra các quá trình không mong muốn như

hòa tan các chất khác vào nước làm cho protein lẫn tạp chất.

Hà

m l

ƣợ

ng

pro

tein

tan

(%

)

Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu

Trang 38

CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu

Nguyên liệu đậu phộng sử dụng trong nghiên cứu này là giống đậu phộng VD1

trồng ở Tây Ninh được mua từ Viện nghiên cứu dầu và cây có dầu.

2.2. Enzyme

Chế phẩm enzyme được sử dụng là enzyme IndiAge Neutra L của công ty

Genencor. Enzyme IndiAge Neutra L là chế phẩm cellulase, thành phần chủ yếu là

endoglucanase. Điều kiên hoạt động tối ưu: pH = 4,5 – 6,2; nhiệt độ 50 – 55oC.

2.3. Hóa chất sử dụng

Gồm những hóa chất dưới đây (đạt tiêu chuẩn phân tích)

− DNS

− Potassium sodium tartrate tetrahydrate.

− NaOH

− Đệm citrate 0.05M, pH=4.8

− Đệm photphat pH= 7

− Glucose khan (Merck)

− Carboxymethyl cellulose CMC 2% pha trong đệm citrate 0,05M; pH 4.8

− H3BO3 3%

− Thuốc thử Metyl red Bromcresol

− H2SO4 đậm đặc 98%

− H2O2 30%

− Rượu ethylic 960

− H2SO4 0,1N chuẩn


Trang 39

2.4. Thiết bị sử dụng

− Thiết bị siêu âm: thiết bị siêu âm dạng thanh Sonicator®, model VC 750.

− Máy đo quang phổ

− Máy khuấy từ

− Máy đo pH

− Máy trộn mẫu ống nghiệm vortex

− Cân điện tử

− Bể điều nhiệt

− Thiết bị trích ly Soxhlet

− Máy ly tâm lạnh Mirko 22R.

− Máy vô cơ mẫu.

− Máy cất đạm Gerhardt.

2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.5.1. Mục đích nghiên cứu

Bài luận văn có 2 phần chính:

Phần 1: Kiểm tra hoạt tính chế phẩm enzyme cellulase IndiAge Neutra L

− Ở điều kiện bình thường.

− Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm đến hoạt tính enzyme.

Phần 2: thu nhận protein từ bột đậu phộng:

− Nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm enzyme cellulase lên khả năng trích ly

protein trong bột đậu phộng tách béo,

− Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của sóng siêu âm và enzyme lên khả năng trích

ly protein trong bột đậu phộng tách béo,

− Từ đó xác định các thông số công nghệ tối ưu để trích ly một cách có hiệu quả

và triệt để hàm lượng protein có trong nguyên liệu.


Trang 40

2.5.2. Nội dung nghiên cứu

2.5.2.1. Sơ đồ nghiên cứu

Hình 2. 1: Sơ đồ nghiên cứu

2.5.2.2. Chuẩn bị nguyên liệu

Nguyên liệu ban đầu được sử dụng là nhân đậu phộng và tiến hành tách béo để

sản xuất bột đậu phộng tách béo sử dụng cho quy trình khảo sát ảnh hưởng của sóng

siêu âm và enzyme để thu nhận protein.

Quy trình chuẩn bị bột đậu phộng tách béo như sơ đồ sau:

Xác định thành phần của bột đậu

phộng tách béo

Khảo sát quá trình trích ly protein

sử dụng chế phẩm enzyme hỗ trợ

Khảo sát quá trình trích ly

protein sử dụng sóng siêu âm kết

hợp với chế phẩm enzyme

Khảo sát ảnh hưởng của

sóng siêu âm đến hoạt tính

enzyme

Kiểm tra hoạt tính enzyme ở

điều kiện bình thường

Xác định thành phần của

nguyên liệu đậu phộng

Tối ưu hóa Tối ưu hóa


Trang 41

Hình 2. 2: Quy trình chuẩn bị bột đậu phộng tách béo

Tách vỏ

Nghiền

Trích ly béo

Làm khô

Rây 355 μm

Bảo quản

Đậu phộng

DPF

NaOH 0.5%

Petroleum ether


Trang 42

2.5.2.3. Ứng dụng chế phẩm enzyme cellulase trong quá trình trích ly

protein đậu phộng

Hình 2. 3: Quy trình ứng dụng chế phẩm enzyme hỗ trợ quá trình trích ly protein đậu

phộng

Quá trình thủy phân: bột đậu phộng được hòa vào nước theo tỉ lệ 1/20 (w/v).

Được chỉnh về pH 7 rồi đưa lên nhiệt độ 500C. Sau đó bổ sung enzyme và ủ.

Quá trình trích ly: dịch sau thủy phân được chỉnh về pH 9 với NaOH 1N.

Quá trình ly tâm: ly tâm ở 3500 v/phút, 150C trong 20 phút.

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng chế phẩm enzyme đến

hiệu suất trích ly protein đậu phộng

Mục đích: Quá trình sử dụng chế phẩm enzyme cellulase có thể làm tăng khả

năng trích ly protein đậu phộng. Do đó, cần tiến khảo sát xem với chế phẩm enzyme

IndiAge Neutra L thì với các hàm lượng enzyme khác nhau hiệu suất trích ly protein

trong mẫu đậu phộng tăng như thế nào.

Thông số cố định:

− Tỉ lệ bột/nước: 1/20 (w/v).

− Thời gian ủ enzyme: 90 phút.


Hòa tan

Ly tâm

Định lượng protein

Nước

Xử lý chế phẩm

enzyme cellulase

Bã


Trang 43

Thông số khảo sát: hàm lượng enzyme sử dụng: 3%, 4%, 5%, 6% (v/w)

Hàm mục tiêu: hiệu suất trích ly protein (%).

Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích ly

protein đậu phộng

Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý bằng chế phẩm enzyme

IndiAge Neutra L đối với dịch huyền phù bột đậu phộng tách béo lên hiệu suất trích ly

protein.


− Tỉ lệ bột/ nước: 1/20 (w/v).

− Hàm lượng enzyme: là hàm lượng tối ưu được chọn ở thí nghiệm 1.

Thông số khảo sát: thời gian xử lý enzyme: 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120

phút.


Thí nghiệm 3: Tối ƣu hóa nhiệt độ và thời gian xử lý enzyme theo phƣơng

pháp quy hoạch thực nghiệm

Mục đích: Để quá trình xử lý đạt hiệu quả hơn nữa, trong phần này, chúng tôi

tiến hành thí nghiệm tối ưu hóa theo phương pháp quy hoach thực nghiêm bậc hai tâm

xoay hai yếu tố, với hàm mục tiêu là hiệu suất trích ly protein, sử dụng phần mềm

Modde 5.0

Thông số cố định: Tỉ lệ bột : nước = 1/20 (w/v)

Thông số khảo sát:

− Yếu tố X1: hàm lượng chế phẩm enzyme (%v/w)

− Yếu tố X2: thời gian xử lý bằng chế phẩm enzyme (phút)

Hàm mục tiêu: hiệu suất trích ly protein (%)


Trang 44

2.5.2.4. Khảo sát ảnh hƣởng của siêu âm đến hoạt tính enzyme

Hình 2. 4: Quy trình khảo sát ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt tính chế phẩm

enzyme IndiAge Neutra L

Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của cƣờng độ siêu âm đến hoạt tính

enzyme:

Mục đích: Quá trình xử lý siêu âm có thể làm tăng hoặc giảm hoạt tính của

chế phẩm enzyme. Do đó, cần tiến hành kiểm tra xem với chế phẩm enzyme IndiAge

Neutra L thì siêu âm sẽ làm tăng hay giảm hoạt tính của nó.


- Hàm lượng enzyme (%v/v): hàm lượng tối ưu từ thí nghiệm 1.

- pH siêu âm: 7

- Nhiệt độ siêu âm: t = 30oC

- Thời gian siêu âm: 60 giây

Thông số khảo sát: Cường độ siêu âm: 1,875W/ml; 3,75 W/ml; 5,625W/ml và

7,5W/ml.

Hàm mục tiêu: hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L (IU/ml)

Xử lý sóng siêu âm

Chế phẩm Enzyme IndiAge

Neutra L

Pha loãng

So sánh

Đệm

Xác định hoạt tính Xác định hoạt tính


Trang 45

Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian siêu âm đến hoạt tính

enzyme

Mục đích: Quá trình xử lý siêu âm có thể làm tăng hoặc giảm hoạt tính của

chế phẩm enzyme. Do đó, cần tiến hành kiểm tra xem với chế phẩm enzyme IndiAge

Neutra L thì thời gian siêu âm ảnh hường thế nào đến hoạt tính của nó.


- Hàm lượng enzyme (%v/v): hàm lượng tối ưu từ thí nghiệm 1

- pH siêu âm: 7

- Nhiệt độ siêu âm: t = 30oC

- Cường độ siêu âm: 3,75 W/ml

Thông số khảo sát: Thời gian siêu âm: thay đồi từ 10, 20, 30, 40, 50, 60 giây.

Hàm mục tiêu: hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L (IU/ml)


Trang 46

2.5.2.5. Ứng dụng sóng siêu âm kết hợp với chế phẩm enzyme hỗ trợ

quá trình trích ly protein từ dịch trích đã xử lý bằng sóng siêu âm

Hình 2. 5: Quy trình trích ly protein khi kết hợp sóng siêu âm và enzyme

Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng enzyme sử dụng đến hiệu

suất trích ly protein từ dịch trích đã xử lý bằng sóng siêu âm

Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng enzyme sử dụng đến hiệu suất

trích ly protein khi kết hợp xử lý sóng siêu âm và chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L

vào quá trình trích ly protein đậu phộng.



− Cường độ siêu âm : 30W/g.

− Thời gian siêu âm: là thời gian tối ưu trong thí nghiệm khảo sát quá trình

trích ly protein sử dụng sóng siêu âm : 17 phút

Xử lý sóng siêu âm


Hòa tan

Trích ly

Ly tâm

Định lượng protein

Nước

Lỏng

Xử lý enzyme


Trang 47

− Nhiệt độ siêu âm: là nhiệt độ tối ưu trong thí nghiệm khảo sát quá trình

trích ly protein sử dụng sóng siêu âm: 57oC.

− Thời gian xử lý enzyme : 90 phút.

Thông số khảo sát: Hàm lượng enzyme sử dụng: 0%, 1%, 2%, 3%, 4% (v/w)


Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất

trích ly protein từ dịch trích đã xử lý bằng sóng siêu âm:

Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích

ly protein khi kết hợp xử lý sóng siêu âm và chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L vào

quá trình trích ly protein đậu phộng.



− Cường độ siêu âm: 30W/g.





− Hàm lượng enzyme : hàm lượng tối ưu ở thí nghiệm 6.

Thông số khảo sát: Thời gian xử lý enzyme: 30 phút, 60 phút, 90 phút.


Thí nghiệm 8: Tối ƣu hóa hàm lƣợng và thời gian xử lý enzyme đến hiệu

suất trích ly protein:



− Cường độ siêu âm : 30W/g.






Trang 48

Thông số khảo sát:

− Yếu tố X1: hàm lượng chế phẩm enzyme (%v/w)

− Yếu tố X2: thời gian xử lý bằng chế phẩm enzyme (phút)


2.6. Các phƣơng pháp phân tích

2.6.1. Xác định độ ẩm

Nguyên tắc: Sấy mẫu cần phân tích có khối lượng ban đầu là mo đến khối

lượng không đổi m1.

2.6.2. Xác định độ tro

Nguyên tắc: Dùng sức nóng ở 600oC để nung cháy hoàn toàn các hợp chất

hữu cơ. Phần còn lại đem cân và tính ra phần trăm tro trong thực phẩm.

2.6.3. Xác định hàm lƣợng lipid

− Nguyên tắc: dùng dung môi kị nước trích ly hoàn toàn lipid từ nguyên liệu

đậu phộng đã được tách vỏ lụa và nghiền nhỏ. Một số thành phần tan trong chất béo

cũng được trích ly theo bao gồm sắc tố, vitamin tan trong chất béo, các chất mùi… Do

có lẫn tạp chất, phần trích ly được gọi là lipid tổng hay dầu thô.

2.6.4. Xác định hàm lƣợng protein tổng

Nguyên tắc:

Khi đốt nóng mẫu đem phân tích với H2SO4 đậm đặc, các hợp chất hữu cơ

bị oxy hóa. Carbon và Hydro tạo thành CO2 và H2O. Còn Nitơ sau khi được giải

phóng ra dưới dạng NH3 sẽ kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung

dịch. Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH đồng thời cất và thu NH3 bằng một

lượng dư H3BO3 3%. Chuẩn độ bằng H2SO4 0,1N chuẩn sẽ xác định được lượng NH3

sinh ra.

Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đậm đặc ở nhiệt độ cao và có

chất xúc tác. Các phản ứng của quá trình oxy hóa xảy ra như sau:

2 4 2 2 22 2 2H SO H O SO O


Trang 49

Oxy tạo thành lại oxy hóa các nguyên tố khác: Carbon tạo thành CO2,

Hydro tạo thành H2O, còn Nitơ giải phóng ra dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo

thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch:

3 2 4 4 42NH H SO NH SO

Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH:

4 4 2 4 2 322 2NH SO NaOH Na SO H O NH

NH3 bay ra cùng với nước sang bình hứng, trong bình hứng chứa H3BO3:

4 3 3 4 4 7 222 4 7NH OH H BO NH B O H O

Trong dung dịch này, NH3 tồn tại dưới dạng ion NH4+

và giải phóng ra ion

H2BO3-. Chuẩn độ lượng ion này bằng H2SO4 chuẩn sẽ xác định được lượng NH3 sinh

ra. Từ đó, suy ra được lượng đạm trong mẫu nguyên liệu.

2.6.5. Hiệu suất trích ly protein

1002

1

m

mH

H: hiệu suất trích ly protein (%)

m1: khối lượng protein có trong dịch trích thu được.

m2: khối lượng protein có trong nguyên liệu bột đậu phộng tách béo.

2.6.6. Xác định hoạt tính enzyme cellulase

Nguyên tắc: khi enzyme tác dụng trên cơ chất cellulose, dưới tác dụng của phức

hệ enzyme cellulase, cơ chất bị phân giải tạo thành một lượng đường khử. Đường khử

sẽ phản ứng với 3,5-dinitrosalicylic acid DNS . Dùng phương pháp so màu DNS ta xác

định lượng đường khử tạo thành từ đó tính được hoạt độ enzyme.

Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong

một phạm vi nhất định, được đo bằng máy quang phổ so màu. Dựa theo đồ thị đường

chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử, ta sẽ tính được hàm lượng đường khử của

mẫu nghiên cứu. Hợp chất tạo thành có độ hấp thu mạnh nhất trong khoảng bước sóng

540-600nm.


Trang 50

NO2 OH

COOH

NO2

3C6H12O6 + + 4NaOH

NH2 OH

COONa

NO2

3C5H11COONa + 3H 2O

2.6.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu

Chúng tôi sử dụng phần mềm ứng dụng STATGRAPHICS 3.0 để xử lý số liệu,

đưa ra bảng so sánh giá trị trung bình giữa các mẫu khác nhau có nghĩa hay không (p <

0,05). Ngoài ra chúng tôi còn sử dụng phần mềm tối ưu hóa Modde 5.0

Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận

Trang 51

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Khảo sát thành phần của nguyên liệu đậu phộng

Bảng 3. 1: Thành phần hóa học của mẫu đậu phộng

Thành phần Hàm lượng (%)

Protein (N x 5,47) 22,16 ± 0,21

Lipid 48,29 ± 0,75

Tro 2,27 ± 0,09

Ẩm 6,48 ± 0,31

Thành phần khác 20,8 ± 0,59

Theo bảng 3.1, hàm lượng protein, lipid, tro và ẩm của đậu phộng có giá trị trung

bình lần lượt là 22,16%; 48,29%; 2,27% và 6,48%.

Theo nghiên cứu của C.L. Hoffpauir (1953) thì hàm lượng protein là 28,53% khi

tác giả chọn hệ số hiệu chỉnh F trong công thức tính hàm lượng đạm tổng là 6,25.

Trong khi chúng tôi chọn hệ số hiệu chỉnh F là 5,47 (AOAC, 1995).

Các thành phần khác có sự khác nhau nhưng không đáng kể có thể do sự khác

nhau về giống, vào sự biến động của các điều kiện khí hậu giữa các năm, vào vị trí hạt

ở quả, các yếu tố không bình thường như sâu, bệnh…

3.2 Khảo sát thành phần của bột đậu phộng tách béo

Bảng 3. 2: Thành phần hóa học của bột đậu phộng tách béo

Thành phần Hàm lượng (%)

Protein (N x 5,47) 46,12 ± 0,17

Lipid 1,94 ± 0,33

Tro 4,81 ± 0,14

Ẩm 7,91 ± 0,69

Thành phần khác 39,22 ± 0,51

Theo bảng 3.2, hàm lượng protein, lipid, tro và ẩm của mẫu đậu phộng sau khi đã

tách béo có giá trị trung bình lần lượt là 46,12%; 1,94%; 4,81% và 7,91%.


Trang 52

Theo khuyến cáo của S.Jung, (2006) khi nghiên cứu quá trình ứng dụng enzyme

để trích ly protein đậu nành để quá trình trích ly hiệu quả thì hàm lượng lipid còn sót

không quá 2%. Còn K. Suknark và cộng sự (1991) vẫn tiến hành trích ly protein khi

hàm lượng lipid còn sót đến 11,19%. Do đó hàm lượng lipid sót trong bột đậu phộng

tách béo của chúng tôi là 1,94% là thích hợp cho quá trình trích ly protein.

3.3. Khảo sát quá trình trích ly protein đậu phộng sử dụng chế phẩm

enzyme cellulase hỗ trợ

Protein trong thực vật tồn tại dưới dạng liên kết với các thành phần khác như

polysaccharide, hemicellulose….(Ismal, 1987). Để tách protein từ cấu trúc phức tạp

này cần phải phá vỡ cấu trúc mô thực vật. Trong công nghiệp sản xuất PC và PI, quá

trình trích ly protein được bổ sung các chế phẩm enzyme cellulase, hemicellulase,…

để tăng hiệu quả trích ly.

Quá trình sử dụng enzyme để trích ly protein phụ thuộc vào những điều kiện

khác nhau: loại enzyme, hàm lượng enzyme, nhiệt độ, thời gian phản ứng. Do đó,

trong phần nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát các thông số công nghệ thích hợp (hàm

lượng enzyme và thời gian xử lý) cho chế phẩm enzyme cellulase IndiAge Neutra L

trong việc ứng dụng vào quá trình trích ly protein từ bột đậu phông tách béo.

3.3.1. Khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng chế phẩm enzyme IndiAge

Neutra L sử dụng đến hiệu suất trích ly protein đậu phộng

Dịch trích bột đậu phộng tách béo được xử lý bằng chế phẩm enzyme IndiAge

Neutra L với các hàm lượng 0%, 3%, 4%, 5%, 6% (v/w), thời gian xử lý 90 phút ở

nhiệt độ 500C và pH 7. Từ đó khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng enzyme đến hiệu quả

trích ly protein đậu phộng.

Kết quả hiệu suất trích ly protein thu được ứng với các mẫu xử lý ở các hàm

lượng enzyme khác nhau được trình bày ở bảng 3.3, hình 3.1


Trang 53

Bảng 3. 3: Ảnh hưởng của hàm lượng chế phẩm enzyme sử dụng đến hiệu suất

trích ly protein

Hàm lượng chế phẩm enzyme (% v/w) Hiệu suất trích ly protein (%)

0% 68,80 ± 0,47a

3% 69,76 ± 0,59b

4% 71,68 ± 0,59c

5% 75,70 ± 0,47d

6% 75,89 ± 0,73d

Các giá trị có cùng kí tự (được kí hiệu ở phía trên bên phải mỗi chữ số) trong cùng một cột thì sự khác

nhau giữa chúng không có ý nghĩa (α = 0.05).

Hình 3. 1: Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme sử dụng đến hiệu suất trích ly protein


Trang 54

− Kết quả cho thấy, khi tăng hàm lượng chế phẩm enzyme từ 0% (v/w) lên đến

5% (v/w) thì hiệu suất trích ly tăng 10,03% từ 68,80% đến 75,70%.

− Khi tăng hàm lượng chế phẩm enzyme lên cao hơn nữa (6%), hiệu suất trích ly

protein thu được là 75,89% - không khác nhau có ý nghĩa so với hiệu suất trích ly ở

hàm lượng enzyme 5% (p < 0,05).

Mô thực vật có cấu trúc khá vững chắc. Cellulose của thành tế bào được hình

dung như que thép và phiến mỏng chất pectinic như bê tông (Mudgett và cộng sự,

1978). Protein trong thực vật tồn tại dưới dạng liên kết với các thành phần khác như

polysaccharide, hemicellulose….(Ismal, 1987). Phần lớn protein liên kết với các

polysaccharide. Do đó để tách protein từ cấu trúc phức tạp này cần phải phá vỡ cấu

trúc mô thực vật. Enzyme có thể sử dụng để phá vỡ cấu trúc này như cellulase,

hemicellulase, -glucanase, arabanase, xylanase,…Ở đây, chúng tôi sử dụng chế phẩm

enyme cellulase để thực hiện quá trình thủy phân để phá vỡ cấu trúc thành tế bào đậu

phộng.

Enzyme IndiAge Neutra L có hoạt tính cellulase để phá vỡ cấu trúc thành tế bào

đậu phộng. Chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L có thành phần chính là:

endoglucanase, ngoài ra còn có cellobiohydrolase và -D-glucoside glucohydrolase.

Khi chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L tiếp xúc với cơ chất thì endoglucanase

sẽ tấn công vào giữa mạch cellulose cắt đứt liên kết -1,4 glucoside giải phóng đoạn

đầu và cuối của chuỗi. Tiếp sau đó các cellobiohydrolase tiếp tục phân cắt để tạo sản

phẩm là cellobiose. Cuối cùng là phần tác dụng của enzyme -D-glucoside

glucohydrolase tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose. Sự phân cắt này gây vỡ thành tế

bào, đứt các liên kết trong khung sườn vững chắc, làm lộ các protein và các liên kết

peptide háo nước của phân tử. Đồng thời enzyme này còn thủy phân các

polysaccharide, cắt đứt các liên kết giữa protein với các polysacchride, giải phóng

protein khỏi các liên kết đó làm tăng khả năng hòa tan của protein trong dịch trích.


Trang 55

Hình 3. 2: Cơ chế thủy phân cellulose thành glucose của enzyme cellulase

Nguồn: F.S., P.A. Matson, H.A. Mooney (2002)

Tuy nhiên, hàm lượng cellulose trong tế bào có một giá trị giới hạn, khi cellulose

được phân cắt đến một mức độ nào đó thì việc bổ sung dư lượng chế phẩm enzyme

cũng không làm phá vỡ thêm cấu trúc thành tế bào được nữa thì hiệu suất trích ly

protein cũng không tăng thêm đáng kể. Tương ứng như trong thí nghiệm này khi tăng

hàm lượng chế phẩm enzyme sử dụng lên 6% (v/w) thì hiệu suất trích ly thu được

không khác nhau có ý nghĩa so với khi sử dụng ở hàm lượng 5% (v/w).

Qua thí nghiệm này, ta thấy việc sử dụng chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L

làm tăng hiệu suất trích ly protein đậu phộng. Yếu tố hàm lượng enzyme là một trong

những yếu tố quan trọng trong quá trình xử lý. Ở hàm lượng 5% (v/w) thì hiệu suất

trích ly protein đạt được là cao nhất do đó ta chọn hàm lượng enzyme là 5% (v/w) để

khảo sát những thí nghiệm tiếp theo.


Trang 56

3.3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích

ly protein đậu phộng

Trong thí nghiệm này dịch trích bột đậu phộng tách béo được xử lý bằng chế

phẩm enzyme IndiAge Neutra L ở hàm lượng 5% (v/w); thời gian xử lý từ 0, 30, 60,

90 đến 120 phút tại nhiệt độ 500C và pH 7. Từ đó khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử

lý enzyme đến hiệu quả trích ly protein.

Kết quả hiệu suất trích ly protein thu được ứng với các mẫu xử lý bằng chế phẩm

enzyme ở các thời gian khác nhau được trình bày ở bảng 3.4, hình 3.2.

Bảng 3. 4: Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích ly protein

Thời gian (phút) Hiệu suất trích ly protein (%)

0 68,71 ± 0,43a

30 69,86 ± 0,43b

60 73,02 ± 0,57c

90 75,51 ± 0,51d

120 76,09 ± 0,64d



Hình 3. 3: Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích ly protein


Trang 57

− Khi tăng thời gian xử lý enzyme đến 90 phút, hiệu suất trích ly protein thu

được tăng 8,84% từ 68,71% đến 75,51%.

− Khi tăng thời gian xử lý hơn nữa (120 phút), hiệu suất trích ly protein là

76,09% - thay đổi không có ý nghĩa so với hiệu suất trích ly ở 90 phút (p<0,05).

Khi cho enzyme vào dịch huyền phù bột đậu phộng tách béo, cần có thời gian để

đại phân tử enzyme khuếch tán đi qua các mạng lưới vi sợi cellulose, tiếp xúc với cơ

chất, gắn vào cơ chất và xúc tác phản ứng phân cắt cơ chất. Khi tăng thời gian xử lý

enzyme thì hiệu quả xử lý sẽ càng tăng nhưng thời gian này chỉ tăng đến một giá trị

nhất định.

Ngoài ra, theo nghiên cứu của Hatfield và Ralph (1998) các liên kết ngang

diferulate của polysaccharide làm giảm khả năng tiến đến và làm giảm hoạt tính của

enzyme thủy phân đến polysaccharide cấu trúc trong thành tế bào. Do đó, khả năng

xúc tác của enzyme trong thời gian đầu xử lý không cao. Kết quả là mạng lưới khung

thành tế bào chưa phá hủy triệt để nên vẫn còn gây cản trở quá trình khuếch tán các

chất. Do đó trong khoảng thời gian đầu (30 phút đầu) ta thấy hiệu suất trích ly protein

còn thấp.

Khi thời gian xử lý kéo dài đến 120 phút, các trung tâm hoạt động có thể đã bị

bão hòa hay mạch cellulose đã bị phân cắt đến một chiều dài nhất định thì phản ứng

xúc tác của enzyme sẽ dừng lại. Khi đó có tiếp tục kéo dài thời gian xử lý thì hiệu quả

của quá trình cũng không tăng. Ở thí nghiệm này, 90 phút là giá trị thích hợp cho quá

trình trích ly protein đậu phộng bằng chế phẩm enzyme cellulase IndiAge Neutra L để

hiệu suất thu nhận protein đạt giá trị cao nhất.

3.3.3. Tối ƣu hóa hàm lƣợng enzyme và thời gian xử lý enzyme đến hiệu

suất trích ly protein đậu phộng

Để quá trình sử dụng enzyme hỗ trợ quá trình trích ly protein đạt hiệu quả hơn

nữa, trong phần này chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo phương pháp quy hoạch thực

nghiệm, bậc hai tâm xoay hai yếu tố, với hàm mục tiêu là hiệu suất trích ly protein.

Ở thí nghiệm này hai yếu tố hàm lượng và thời gian xử lý enzyme đồng thời

được thay đổi, từ đó xác định quy luật ảnh hưởng của hai yếu tố này đến hàm mục tiêu

là hiệu suất trích ly protein và thiết lập phương trình hồi quy. Trên cơ sở đó, chọn ra

các thông số tối ưu của thí nghiệm để đạt được hiệu suất trích ly protein cao nhất.

− Số thí nghiệm tối ưu là N = 12 thí nghiệm trong đó có 4 thí nghiệm ở tâm

phương án.

− Hàm mục tiêu cần tối ưu: hiệu suất trích ly protein (%)


Trang 58

− Các giá trị khảo sát của hai yếu tố tối ưu như sau:

Hàm lượng enzyme: X1 [4; 6]; với tâm là X1 = 5% (v/w)

Thời gian xử lý: X2 [60; 120]; với tâm là X2 = 90 (phút).

− Kết quả của thí nghiệm tối ưu hóa được trình bày trong bảng 3.5


thực nghiệm

Số thí

nghiệm

Run

Order X1 X2

X1

(% v/w)

X2

(phút) Y (%)

N1 11 -1 -1 4 60 70,53 ± 0,59

N2 2 +1 -1 6 60 75,7 ± 0,87

N3 10 -1 +1 4 120 75,13 ± 0,94

N4 3 +1 +1 6 120 75,89 ± 0,73

N5 1 - 2 0 3,586 90 70,72 ± 0,63

N6 12 + 2 0 6,414 90 76,47 ± 0,63

N7 8 0 - 2 5 47,58 71,87 ± 0,63

N8 4 0 + 2 5 132,42 76,09 ± 0,47

N9 5 0 0 5 90 75,89 ± 0

N10 7 0 0 5 90 75,51 ± 0,66

N11 9 0 0 5 90 76,28 ± 0,66

N12 6 0 0 5 90 75,7 ± 0,33

Trong đó:

X1 : Hàm lượng chế phẩm enzyme (% v/w)

X2 : Thời gian xử lý enzyme (phút)

Y : Hiệu suất trích ly protein (%)

Theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai tâm xoay, phương trình hồi

quy của mỗi hàm mục tiêu được biểu diễn theo dạng sau:

2112

2

222

2

11122110 XXbXbXbXbXbbY


Trang 59

Giải bài toán quy hoạch thực nghiệm cho hàm mục tiêu bằng phần mềm Modde

5.0, ta nhận được các kết quả như trong bảng 3.6

Bảng 3. 6: Ảnh hưởng của các biến độc lập đến hiệu suất trích ly protein

Giá trị Hệ số Sai số chuẩn Giá trị P Khoảng tin cậy (±)

bo 75,8449 0,2628 1,17E-13 0,642975

b1 1,75783 0,1858 7,94E-05 0,454686

b2 1,34484 0,1858 0,0003532 0,454686

b11 -0,9939 0,2078 0,0030527 0,508424

b22 -0,8013 0,2078 0,0083962 0,508424

b12 -1,1025 0,2628 0,0057128 0,642975

Bảng 3.6 cho thấy các tác động của biến đều có ảnh hưởng đến giá trị của Y do P

< 0,05. Từ các hệ số của bảng 3.6, ta thiết lập được phương trình hồi quy:

Từ phương trình hồi quy, ta có nhận xét sau:

− Cà hai yếu tố hàm lượng enzyme và thời gian xử lý enzyme đều ảnh hưởng

đến hiệu suất trích ly protein theo hàm bậc hai.

− Có sự tương tác giữa hàm lượng enzyme và thời gian xử lý.

− Yếu tố hàm lượng enzyme có ảnh hưởng nhiều hơn so với thời gian xử lý.

Phương trình hồi quy biểu diễn trên ba trục tọa độ không gian ba chiều, được mặt

cong như hình 3.4

21

2

2

2

121 1,1801,0994.0344,1758,1845,75 XXXXXXY


Trang 60

Hình 3. 4: Ảnh hưởng của hàm lượng và thời gian xử lý enzyme lên hiệu suất trích ly

protein

Hình 3. 5: Hình chiếu bề mặt biểu diễn phương trình hồi quy trên mặt phẳng tọa độ


Trang 61

Với phần mềm Modde 5.0, chúng tôi tìm ra được điều kiện tối ưu khi ứng dụng

chế phẩm enzyme IndiAge Neutral L hỗ trợ quá trình trích ly protein đậu phộng như

sau:

− Hàm lượng chế phẩm enzyme: 5,69 % (v/w)

− Thời gian xử lý: 100,89 phút

− Hiệu suất trích ly protein thu được: 76,69 % tăng 11,47% so với mẫu không

xử lý enzyme (hiệu suất 68,8 %)

3.4. Khảo sát ảnh hƣởng của sóng siêu âm đến hoạt tính chế phẩm

enzyme cellulase IndiAge Neutra L

3.4.1. Khảo sát ảnh hƣởng của cƣờng độ siêu âm đến hoạt tính chế phẩm

enzyme cellulase IndiAge Neutra L

Chế phẩm enzyme cellulase IndiAge Neutra L được pha trong dung dịch đệm

với hàm lượng 0,25% (v/v). Sau đó, đem xử lý siêu âm ở các mức năng lượng

1,875W/ml; 3,75 W/ml; 5,625W/ml và 7,5W/ml trong thời gian 60 giây để khảo sát

ảnh hưởng của cường độ siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme.

Hoạt tính enzyme cellulase IndiAge Neutra L ứng với các mẫu xử lý siêu âm ở

các mức năng lượng khác nhau được trình bày bảng 3.7, hình 3.6

Bảng 3. 7: Ảnh hưởng của cường độ siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge

Neutra L

Cường độ siêu âm (W/ml) Hoạt tính chế phẩm enzyme (IU/ml)

0 1083,85 ± 2,41a

1,875 1049,73 ± 8,09 b

3,75 942,61 ± 9,46c

5,625 878,4 ± 1,46d

7,5 838,35 ± 2,42e

Các giá trị có cùng kí tự (được kí hiệu ở phía trên bên phải mỗi chữ số) trong cùng một cột thì

sự khác nhau giữa chúng không có ý nghĩa (α = 0.05).


Trang 62

Hình 3. 6: Ảnh hưởng của cường độ siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge

Neutra L

Khi tăng cường độ siêu âm từ 0 W/ml lên đến 7,5 W/ml thì hoạt tính enzyme

giảm 22,65% (từ 1083,85 IU/ml xuống còn 838,35 IU/ml)

Và khi tăng mức năng lượng cao hơn nữa thì hoạt tính chế phẩm enzyme

cellulase càng giảm nhiều hơn. Ngoài ra khi giảm cường độ siêu âm xuống 1,25 W/ml;

0,75 W/ml thì kết quả là hoạt tính enzyme vẫn giảm có ý nghĩa so với mẫu đối chứng

(kết quả đó không được trình bày ở đây).

So sánh với một số nghiên cứu khác:

Theo các nghiên cứu trước đây, dưới những điều kiện ổn định, sóng siêu âm có

những tác động rất khác nhau đến các chế phẩm enzyme khác nhau. Sóng siêu âm có

thể làm giảm hoạt tính của một số chế phẩm enzyme như β-galactosidase, malate

dehydrogenase, alcohol dehydrogenase (Ozbek và Ulgen, 2000), peroxidase (Gennaro

và cộng sự 1999). Hoặc cũng có thể làm tăng hoạt tính của một số chế phẩm enzyme

khác như invertase (M. Sakakibara và cộng sự, 1996; Vargas và cộng sự, 2004), alpha

amylase (Barton và cộng sự - 1996; M. Yaldagard và cộng sự - 2007), lipase (Babicz

và cộng sự, 2010). Ngoài ra, với enzyme alkaline phosphatase thì hoạt tính lại không

thay đổi dưới tác dụng của sóng siêu âm ở mức năng lượng 7W – 40W, tần số 20 kHz

trong thời gian xử lý siêu âm là 1 phút (Ozbek và Ulgen, 2000).


Trang 63

Ngay cả khi hai chế phẩm enzyme có hoạt tính giống nhau, nhưng được thu nhận

từ các nguồn khác nhau thì sóng siêu âm cũng có những tác động khác nhau. R.

Kadkhodaee và M.J.W. Povey (2006) khi tiến hành nghiên cứu tác động của siêu âm

lên chế phẩm enzyme α-amylase từ Bacillus amyloliquefacients đã cho rằng sóng siêu

âm làm giảm hoạt tính enzyme này. Trong khi theo nghiên cứu của M. Yaldagard và

cộng sự (2007) thì sóng siêu âm lại làm tăng hoạt tính của chế phẩm enzyme α-

amylase từ lúa mạch.

Sóng siêu âm có thể gây ra những tác động khác nhau như vậy đến hoạt tính

enzyme được giải thích là do ảnh hưởng hóa học và vật lý của siêu âm vô hoạt hay

hoạt hóa những enzyme khác nhau phụ thuộc vào trạng thái của enzyme và điều kiện

xử lý (Huihua Huang và cộng sự, 2007). Điều này có thể giải thích những bài trái

ngược về ảnh hưởng của siêu âm lên hoạt độ xúc tác của enzyme. Huihua Huang cũng

cho rằng siêu âm có thể ảnh hưởng lên cấu trúc của enzyme dẫn đến sự thay đổi trung

tâm hoạt động, cũng như thay đổi vị trí tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất .

Kết quả từ thí nghiệm này cho thấy xử lý sóng siêu âm đã làm giảm hoạt tính của

chế phẩm enzyme cellulase IndiAge Neutra L. Mức năng lượng càng cao thì hoạt tính

của chế phẩm enzyme càng giảm. Ngoài bị ảnh hưởng bởi cường độ siêu âm, hoạt tính

enzyme còn bị ảnh hưởng bởi thời gian siêu âm. Ở thí nghiệm kế tiếp chúng tôi sẽ

khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge

Neutra L.

3.4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian siêu âm đến hoạt tính enzyme

cellulase IndiAge Neutra L

Chế phẩm enzyme cellulase IndiAge Neutra L được pha trong dung dịch đệm với

hàm lượng 0,25% (v/v). Sau đó, đem xử lý siêu âm ở các mức năng lượng 3,75 W/ml

với thời gian thay đổi từ 10, 20, 30, 40, 50, 60 giây để khảo sát ảnh hưởng của thời

gian siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme.

Khi xử lý chế phẩm enzyme cellulase IndiAge Neutra L bằng sóng siêu âm thu

được các hoạt tính enzyme ứng với các mẫu xử lý siêu âm ở các thời gian khác nhau

như kết quả ở bảng 3.8, hình 3.7.


Trang 64

Bảng 3. 8: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge

Neutra L

Thời gian siêu âm (giây) Hoạt tính chế phẩm enzyme (IU/ml)

0 1083,85 ± 2,41a

10 1064,16 ± 3,31b

20 1013,94 ± 1,69c

30 982,03 ± 5,25d

40 965,31 ± 4,3e

50 953,81 ± 5,84ef

60 942,61 ± 9,46f



Hình 3. 7: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge

Neutra L


Trang 65

− Khi tăng thời gian siêu âm lên từ 0 giây đến 60 giây thì hoạt tính enzyme giảm

13,03% (từ 1083,85 IU/ml xuống còn 942,61 IU/ml).

− Và khi tăng mức thời gian xử lý hơn nữa (2 phút, 5 phút) thì hoạt tính chế

phẩm enzyme càng giảm nhiều hơn (kết quả đó không được trình bày ở đây).

Như vây xử lý sóng siêu âm đã làm giảm hoạt tính của chế phẩm enzyme

cellulase IndiAge Neutra L. Thời gian càng lâu, hoạt tính chế phẩm enzyme cellulase

càng giảm.

Cả hai thí nghiệm trên đều chứng tỏ việc siêu âm chế phẩm enzyme IndiAge

Neutra L trước khi bổ sung vào cơ chất làm giảm hoạt tính của enzyme và thời gian

siêu âm càng lâu, cũng như cường độ năng lượng siêu âm càng cao hoạt tính enzyme

càng giảm. Nguyên nhân của hiện tượng này có thể được giải thích như sau:

− Các loại enzyme bao gồm cả cellulase thường có cấu trúc bậc 4 và không bền

vững, dễ bị tác động bởi điều kiện xử lý.

− Tác dụng của sóng siêu âm lên chất lỏng có hai ảnh hưởng chính: hiện tượng

sủi bong bóng và gia nhiệt. Trong quá trình xử lý sinh học bằng enzyme, ảnh hưởng

quan trọng hơn là hiện tượng sủi bong bóng. Những hiện tượng này sẽ tập trung năng

lượng âm học tạo ra nhiệt độ khí cao (Noltingk và Neppiras, 1951), sóng va chạm

trong cả khí (Vaughan và Leeman, 1986) và môi trường chất lỏng xung quanh

(Rayleigh, 1917) cùng các gốc tự do (Suslick và cộng sự, 1986). Tất cả những yếu tố

này có thể phá hủy đáng kể hoặc ít nhất vô hoạt cấu trúc phức tạp và nhạy cảm của

enzyme vốn có bản chất là protein. Trong thí nghiệm này, enzyme chỉ được hòa với

dung dịch đệm và đem xử lý siêu âm. Đối với dung dịch đệm, quá trình vỡ bong bóng

tạo ra những chất trung gian có năng lượng lớn như là H , OH , e-(aq), H2O2, HO2 , H2

(Karabago và cộng sự, 2007). Do đó, việc enzyme bị giảm hoạt tính là khó tránh khỏi.

Để kiểm chứng điều giải thích này, chúng tôi đã tiến hành điện di mẫu không xử

lý siêu âm và có xử lý siêu âm để xem sóng siêu âm có phá hủy cấu trúc phân tử

protein hay không ?

Đem xử lý chế phẩm enzyme cellulase IndiAge Neutra L với sóng siêu âm ở 3

mức năng lượng 3,75 W/ml; 5,625W/ml và 7,5W/ml (trong thời gian 1 phút). Và 3

mẩu xử lý ở 3,75 W/ml trong thời gian 20, 40, 60 giây. Sau đó đem 6 mẫu này cùng

với mẫu đối chứng tiến hành điện di. Kết quả điện di thu được như sau:


Trang 66

Kết quả từ trái sang: mẫu đối chứng; mẫu xử lý siêu âm ở cường độ 3,75 W/ml; 5,625W/ml;

7,5W/ml (60 giây); mẫu xử lý siêu âm ở 20 giây, 40 giây, 60 giây (cường độ 3,75W/ml)

Hình 3. 8: Kết quả điện di khi xử lý siêu âm ở các mức năng lượng và thời gian khác

nhau đối với chế phẩm enzyme cellulase IndiAge Neutra L

Kết quả điện di cho thấy khi chúng tôi xử lý sóng siêu âm với các mức năng

lượng thấp và trong thời gian ngắn như trên thì phân tử lượng của đại phân tử enzyme

không thay đổi. Điều này nói lên, sóng siêu âm không làm thay đổi cấu trúc bậc một

chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L. Nhưng rõ ràng hoạt tính enzyme IndiAge Neutra

L giảm khá nhiều khi chúng tôi đem xử lý siêu âm ở những điều kiện trên. Vậy tại sao

hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L lại giảm khi xử lý bằng sóng siêu âm?

Khi xử lý siêu âm với chế phẩm enzyme, có hai khuynh hướng xảy ra:

− Khuynh hướng 1: nhiệt độ tăng làm cắt mạch protein, phá hủy đáng kể hoặc ít

nhất vô hoạt cấu trúc phức tạp và nhạy cảm của enzyme vốn có bản chất là protein của

đại phân tử enzyme từ đó làm giảm hoạt tính và vô hoạt enzyme.

− Khuynh hướng 2: siêu âm ảnh hưởng lên cấu trúc không gian của phân tử

enzyme, dẫn đến sự thay đổi trung tâm hoạt động, cũng như thay đổi vị trí tiếp xúc

giữa enzyme và cơ chất, do đó làm thay đổi hoạt độ xúc tác của enzyme.

Điều này cho thấy tuy sóng siêu âm không làm cắt mạch đại phân tử của chế

phẩm enzyme IndiAge Neutra L nhưng đã làm thay đổi cấu trúc không gian của

enzyme. Đồng thời làm thay đổi trung tâm hoạt động của enzyme theo hướng kìm hãm


Trang 67

trung tâm hoạt động. Theo nghiên cứu của Elpiner (1964) cho biết khi xử lý siêu âm

nhiệt cục bộ tỏa ra bởi hiện tượng sủi bong bóng và những sản phẩm phân hủy của

phân tử nước có tính oxy mạnh được tạo ra có thể làm giảm hoạt tính enzyme. Ở mức

năng lượng siêu âm vừa đủ thấp, sự thay đổi cấu trúc và trao đổi các chất có thể xảy ra

bên trong tế bào mà không cần phá vỡ chúng.

3.5. Khảo sát quá trình trích ly protein khi kết hợp sóng siêu âm và

enzyme

Trong phần này, chúng tôi khảo sát quá trình xử lý chế phẩm enzyme cellulase

IndiAge Neutra L sau khi đã xử lý siêu âm dịch huyền phù bột đậu phộng tách béo

nhằm nâng cao hơn hiệu suất trích ly protein.

Trong thí nghiệm kết hợp sóng siêu âm và chế phẩm enzyme cellulase để hỗ trợ

quá trình trích ly protein đậu phộng, giai đoạn đầu bột đậu phộng tách béo sẽ được

đem xử lý siêu âm với các thông số:

− Tần số 20 kHz - cường độ 30W/g.

− Tỉ lệ bột / nước = 1/20 (w/v).

− pH = 7

− Nhiệt độ siêu âm: 570C.

− Thời gian siêu âm: 17 phút

Sau đó, mới tiến hành đem dịch đã xử lý siêu âm đi xử lý tiếp bằng chế phẩm

enzyme cellulase IndiAge Neutra L để nâng cao hơn nữa hiệu quả trích ly protein đậu.

3.5.1. Khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng chế phẩm enzyme sử dụng đến

hiệu suất trích ly protein từ dịch trích đã xử lý bằng sóng siêu âm

Dịch trích bột đậu phộng tách béo sau khi đã xử lý bằng sóng siêu âm được xử lý

bằng chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L ở các hàm lượng 0%, 1%, 2%, 3%, 4%

(v/w), thời gian xử lý 90 phút ở nhiệt độ 500C và pH 7. Từ đó khảo sát ảnh hưởng của

hàm lượng enzyme đến hiệu quả trích ly protein và so sánh hiệu suất trích ly protein

thu được với mẫu đối chứng.

Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme đến hiệu suất trích ly protein trong dịch trích

của bột đậu phộng tách béo sau khi xử lý bằng sóng siêu âm được trình bày trong

bảng 3.9, hình 3.9.


Trang 68


protein từ dịch trích sau khi xử lý bằng sóng siêu âm

Hàm lượng chế phẩm enzyme (%) Hiệu suất trích ly protein (%)

ĐC 68,61 ± 0,66a

0% 82,41 ± 0,59b

1% 83,18 ± 0,94b

2% 85,86 ± 0,59c

3% 88,16 ± 0,59d

4% 88,35 ± 0,47d



Hình 3. 9: Ảnh hưởng của hàm lượng chế phẩm enzyme sử dụng đến hiệu suất trích ly



Trang 69

Kết quả cho thấy với hàm lượng chế phẩm enzyme 3% (v/w) hiệu quả trích ly

protein được cải thiện:

- Tăng 28,49% so với mẫu đối chứng (từ 68,61% đến 88,16%).

- Tăng 16,46% (từ 75,7% đến 88,16%) so với khi mẫu được xử lý bằng

enzyme (với hàm lượng 5% (v/w)).

- Tăng 5,75% (từ 82,41% đến 88,16%) so với khi mẫu chỉ được xử lý

bằng sóng siêu âm.

Khi tăng hàm lượng chế phẩm enzyme lên hơn nữa 4% (v/w) thì hiệu suất trích

ly thu được là 88,35% - không khác nhau có ý nghĩa so với hiệu suất trích ly ở hàm

lượng chế phẩm enzyme 3% (p < 0,05)

− Giai đoạn đầu của quá trình xử lý, ta xử lý dịch huyền phù bằng sóng siêu âm.

Với tác dụng của sự sủi bong bóng do xử lý siêu âm đã tạo ra một năng lượng làm tăng

truyền khối của các cấu tử cần trích ly. Ngoài tăng tốc độ truyền khối, siêu âm còn có

khả năng phân cắt nhiều liên kết trong thành tế bào, làm phá vỡ cấu trúc tế bào triệt để

hơn giúp cho protein tiếp xúc nhiều hơn với nước tăng khả năng hòa tan vào dịch của

protein.

− Giai đoạn sau của quá trình: dịch huyền phù sau khi đã xử lý bằng siêu âm tiếp

tục đem xử lý bằng chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L. Việc nứt, vỡ thành tế bào ở

giai đoạn đầu giúp cho enzyme dễ dàng khuếch tán vào tế bào chất, tiếp xúc với các cơ

chất, thủy phân các polysaccharide, phá hủy các liên kết của protein với các

polysaccharide còn lại mà sóng siêu âm chưa tác dụng hết, giải phóng thêm một lượng

protein trong dịch trích. Do đó, khi kết hợp xử lý siêu âm và chế phẩm enzyme

IndiAge Neutra L để trích ly protein đậu phộng thì có thể giảm hàm lượng chế phẩm

enzyme sử dụng xuống 3% (v/w) so với khi chỉ xử lý bằng chế phẩm enzyme (khi chỉ

sử dụng chế phẩm enzyme để trích ly protein đậu phộng thì hàm lượng enzyme cần sử

dụng là 5% v/w)

Như vậy, với kết quả khảo sát thu được ta chọn hàm lượng enzyme tối ưu là 3%

(v/w) để sử dụng cho những thí nghiệm tiếp theo.

3.5.2. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích ly

protein từ dịch trích đã xử lý bằng sóng siêu âm

Trong thí nghiệm này dịch trích bột đậu phộng tách béo sau khi được xử lý bằng

sóng siêu âm sẽ được xử lý tiếp bằng chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L với hàm

lượng 3% (v/w), thời gian xử lý từ 30 phút, 60 phút, 90 phút đến 120 phút ở nhiệt độ


Trang 70

500C và pH 7. Từ đó khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu quả

trích ly protein và so sánh hiệu suất trích ly protein thu được với mẫu đối chứng.

Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích ly protein trong dịch

trích của bột đậu phộng tách béo sau khi xử lý bằng sóng siêu âm được trình bày trong

bảng 3.10, hình 3.10

Bảng 3. 10: Ảnh hưởng của thời gian xử lý chế phẩm enzyme đến hiệu suất trích ly


Thời gian (phút) Hiệu suất trích ly protein (%)

ĐC 68,61 ± 0,66a

0 82,03 ± 1,33b

30 84,52 ± 0,63c

60 88,16 ± 0,59d

90 87,97 ± 0,96d



Hình 3. 10: Ảnh hưởng của thời gian xử lý chế phẩm enzyme đến hiệu suất trích ly



Trang 71

Với thời gian xử lý enzyme trong 60 phút hiệu quả trích ly protein được cải

thiện:

- Tăng 28,49% (từ 68,61% đến 88,16%) so với mẫu đối chứng.

- Tăng 16,75% (từ 75,51% đến 88,16%) so với khi mẫu được xử lý bằng

enzyme (với thời gian xử lý là 90 phút).

- Tăng 6,13% (từ 82,03% đến 88,16%) so với khi mẫu chỉ được xử lý bằng sóng

siêu âm.

Khi tăng thời gian xử lý chế phẩm enzyme lên 90 phút thì hiệu suất trích ly

protein thu được là 87,97% - không khác nhau có ý nghĩa so với hiệu suất trích ly ở

thời gian xử lý enzyme trong 60 phút (p < 0,05).

Như đã trình bày ở trên, khi tăng thời gian xử lý enzyme thì hiệu suất trích ly

protein sẽ tăng lên nhưng thời gian này chỉ tăng đến một giá trị nhất định. Nhờ tác

dụng của sóng siêu âm ở giai đoạn đầu, cấu trúc hạt bị phá bung, giúp lộ ra những vị

trí tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất, do đó enzyme nhanh chóng thực hiện được phản

ứng phân cắt cơ chất. Kết quả là có thể rút ngắn thời gian phản ứng từ 90 phút (thí

nghiệm chỉ dùng enzyme để hỗ trợ quá trình trích ly protein) xuống còn 60 phút đồng

thời làm tăng hiệu suất trích ly protein lên.

Khi thời gian xử lý kéo dài từ 60 phút đến 90 phút thì hiệu suất trích ly khác nhau

không có ý nghĩa so với khi xử lý ở thời gian 60 phút.

Ngoài ra ta cũng nhận thấy rằng siêu âm có tác dụng tăng hiệu suất trích ly

protein lớn hơn và thời gian xử lý ngắn hơn nhiều so với khi chỉ sử dụng chế phẩm

enzyme IndiAge Neutra L. Như ở bàng 3.10 nếu chỉ xứ lý bằng siêu âm, hiệu suất

trích ly protein thu được là 82,03 % tăng 19,56% so với mẫu đối chứng (hiệu suất

68,61 %). Còn khi chỉ xử lý bằng chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L thì dù đã tối ưu

hàm lượng và thời gian xử lý enzyme, hiệu suất thu được là 76,69 % chỉ tăng 11,78%

so với mẫu đối chứng (hiệu suất 68,61 %). Điều này có thể được giải thích rằng: chế

phẩm enzyme phân cắt có tính chọn lọc, chỉ phân cắt một số cơ chất nhất định, cắt

những vị trí nhất định, do đó hạn chế sự phá bung triệt để cấu trúc tế bào. Một số

lượng lớn protein vẫn còn kết nối với cấu trúc sợi cellulose và không được trích ly vào

dung dịch. Trong khi đó, siêu âm phân cắt không có tính chọn lọc, thích hợp hơn để

phá vỡ toàn diện tế bào vốn mang cấu trúc phức tạp gồm nhiều đại phân tử khác nhau

như là polysaccharide, protein, …Sự phân cắt này làm cho các hợp chất này cho thể

chuyển vào dung dịch trong quá trình xử lý và kết quả là xử lý bằng siêu âm cho hiệu

suất thu hồi protein cao hơn so với khi chỉ xử lý bằng chế phẩm enzyme. Thêm vào đó,

khi xử lý bằng chế phẩm enzyme cần có thời gian để đại phân tử enzyme khuếch tán

đến vị trí phản ứng trên cơ chất, xúc tác phản ứng, và vận chuyển sản phẩm khỏi trung


Trang 72

tâm phản ứng để quá trình lại được tiếp diễn. Do là hệ tĩnh đồng thời với kích thước

cồng kềnh của đại phân tử enzyme nên thời gian phản ứng kéo dài. Trái với xử lý bằng

chế phẩm enzyme, xử lý bằng siêu âm tạo ra sự khuấy động mạnh mẽ giúp các chất

nhanh chóng di chuyển vào dung dịch và do đó thời gian xử lý ngắn hơn.

Còn khi kết hợp xử lý siêu âm trước, xử lý bằng chế phẩm enzyme sau thì sẽ

càng tăng hiệu quả trích ly protein đồng thời rút ngắn thời gian xử lý bằng enzyme.

3.5.3. Tối ƣu hóa hàm lƣợng enzyme và thời gian xử lý enzyme đến hiệu

suất trích ly protein từ dịch trích đã xử lý bằng sóng siêu âm

Để quá trình sử dụng enzyme hỗ trợ quá trình trích ly protein đạt hiệu quả hơn

nữa, trong phần này chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo phương pháp quy hoạch thực

nghiệm, bậc hai tâm xoay hai yếu tố, với hàm mục tiêu là hiệu suất trích ly protein.

Ở thí nghiệm này hai yếu tố hàm lượng và thời gian xử lý enzyme đồng thời

được thay đổi, từ đó xác định quy luật ảnh hưởng của hai yếu tố này đến hàm mục tiêu

và thiết lập phương trình hồi quy. Trên cơ sở đó, chọn ra các thông số tối ưu của thí

nghiệm để đạt được hiệu suất trích ly protein cao nhất.

− Số thí nghiệm tối ưu là N = 12 thí nghiệm trong đó có 4 thí nghiệm ở tâm

phương án.

− Hàm mục tiêu cần tối ưu: hiệu suất trích ly protein (%)

− Các giá trị khảo sát của hai yếu tố tối ưu như sau:

Hàm lượng enzyme: X1 [2; 4]; với tâm là X1 = 3 % (v/w)

Thời gian xử lý: X2 [30; 90]; với tâm là X2 = 60 (phút).

− Kết quả của thí nghiệm tối ưu hóa được trình bày trong bảng 3.11


Trang 73


thực nghiệm

Số thí nghiệm Run

Order X1 X2

X1

(% v/w)

X2

(phút)

H

(%)

N1 4 -1 -1 2 30 83,75 ± 0,47

N2 11 +1 -1 4 30 86,82 ± 0,63

N3 5 -1 +1 2 90 85,48 ± 0,31

N4 6 +1 +1 4 90 88,35 ± 0,47

N5 2 - 2 0 1,586 60 83,37 ± 0,63

N6 9 + 2 0 4,414 60 88,73 ± 0,47

N7 8 0 - 2 3 17,58 84,14 ± 0,47

N8 10 0 + 2 3 102,42 87,97 ± 0,63

N9 7 0 0 3 60 87,78 ± 0,66

N10 3 0 0 3 60 87,97 ± 0,57

N11 1 0 0 3 60 87,59 ± 0,33

N12 12 0 0 3 60 88,16 ± 0,66

Trong đó:

X1 : Hàm lượng chế phẩm enzyme (% v/w)

X2 : Thời gian xử lý enzyme (phút)

Y : Hiệu suất trích ly protein (%)

Theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai tâm xoay, phương trình hồi

quy của mỗi hàm mục tiêu được biểu diễn theo dạng sau:

2

222

2

111211222110 XbXbXXbXbXbbY

Giải bài toán quy hoạch thực nghiệm cho hàm mục tiêu bằng phần mềm Modde

5.0, ta nhận được các kết quả như trong bảng 3.12


Trang 74

Bảng 3. 12: Ảnh hưởng của các biến độc lập đến hiệu suất trích ly protein

Giá trị Hệ số Sai số chuẩn Giá trị P Khoảng tin cậy (±)

bo 87,875 0,2144 1,42E-14 0,524683

b1 1,6901 0,1516 3,11E-05 0,371035

b2 1,0846 0,1516 0,00037653 0,371035

b11 -0,901 0,1696 0,00180814 0,414886

b22 -0,898 0,1696 0,00183376 0,414886

b12 -0,05 0,2144 0,823358 0,524683

Bảng 3.12 cho thấy các tác động của các biến X1 , X2 , X12, X2

2 ảnh hưởng đến

giá trị của Y (P < 0,05). Từ các hệ số của bảng 3.12, ta thiết lập được phương trình hồi

quy của hiệu suất trích ly protein như sau (bỏ qua ảnh hưởng của X1*X2 do P > 0,05):

2

2

2

121 898,0901.0085,169,1875,87 XXXXY

Từ phương trình hồi quy, ta có nhận xét sau:

− Cà hai yếu tố hàm lượng enzyme và thời gian xử lý enzyme đều ảnh

hưởng đến hiệu suất trích ly protein theo hàm bậc hai.

− Không có sự tương tác giữa hàm lượng enzyme và thời gian xử lý.

− Yếu tố hàm lượng enzyme có ảnh hưởng nhiều hơn so với thời gian xử lý

Phương trình hồi quy biểu diễn trên ba trục tọa độ không gian ba chiều, được mặt

cong như hình 3.11


Trang 75

Hình 3. 11: Ảnh hưởng của hàm lượng và thời gian xử lý chế phẩm enzyme lên hiệu

suất trích ly protein từ dịch trích bột đậu phộng tách béo sau khi đã xử lý siêu âm.

Hình 3. 12: Hình chiếu bề mặt biểu diễn phương trình hồi quy trên mặt phẳng tọa độ


Trang 76

Với phần mềm Modde 5.0, chúng tôi tìm ra được điều kiện tối ưu khi ứng dụng

chế phẩm enzyme IndiAge Neutral L để hỗ trợ quá trình trích ly protein từ dịch trích

bột đậu phộng tách béo sau khi đã xử lý siêu âm như sau:

− Hàm lượng chế phẩm enzyme: 3,92 % v/w


− Hiệu suất trích ly protein thu được: 88,97 % tăng 29,67% so với mẫu đối

chứng (hiệu suất 68,61 %)

Chƣơng 4: Kết luận và kiến nghị

Trang 77

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi có những kết luận sau:

Phương pháp ứng dụng chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L, ứng dụng kết hợp

sóng siêu âm với xử lý bằng chế phẩm enzyme trên mẫu bột đậu phộng đã tách béo đều

làm tăng hiệu suất trích ly protein.

Qua thí nghiệm và tính toán chúng tôi đã thu được các điều kiện xử lý tối ưu để đạt

hiệu suất trích ly protein cao nhất là:

Phương pháp xử lý bằng chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L

− Hàm lượng chế phẩm enzyme: 5,69 %v/w


Khi đó, hiệu suất trích ly protein thu được: 76.69 % tăng 11,78% so với mẫu đối


Phương pháp kết hợp đồng thời siêu âm với xử lý bằng chế phẩm enzyme

IndiAge Neutra L

− Hàm lượng chế phẩm enzyme: 3,92 %v/w


Khi đó, hiệu suất trích ly protein thu được: 88,97 % tăng 29,67% so với mẫu đối


4.2. Kiến nghị

Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên không thể khảo sát hết các yếu tố cũng như

tìm ra một quy trình trích ly protein cho hiệu quả cao nhất. Để phát huy được những ưu

điểm và những nhược điểm trong đề tài này, chúng tôi xin đề xuất một số ý kiến sau:

− Tìm hiểu thêm một số enzyme trích ly khác và thực hiện việc trích ly trên một số

loại enzyme để tìm ra được một loại enzyme cho hiệu suất tối ưu nhất.

Chƣơng 4: Kết luận và kiến nghị

Trang 78

− Sử dụng kết hợp sóng siêu âm và tổ hợp nhiều loại chế phẩm enzyme như

hemicellulase, cellulase, … để xử lý bột đậu phộng tách béo nhằm mục đích làm tăng

hiệu suất trích ly protein.

− Khảo sát việc kết hợp giữa sóng siêu âm và membrane, hay enzyme và

membrane hay sự kết hợp của ba phương pháp đó.

− Sản xuất thử và xác định các tính chất chức năng của PPC/PPI.

− Điều cuối cùng nhưng rất quan trọng ở đây là thiết bị, chúng tôi nghĩ thiết bị nên

được cải tiến, bảo dưỡng và sắp xếp hợp lý.

Tài liệu tham khảo

Trang 79

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Lê Ngọc Tú (chủ biên) (2002), Hóa sinh công nghiệp, NXB khoa học và kỹ

thuật Hà Nội.

[2] Lê Văn Việt Mẫn, Lại Quốc Đạt, Nguyễn Thị Hiền, Tôn Nữ Minh Nguyệt,

Trần Thị Thu Trà (2009), Công nghệ chế biến thực phẩm, Nhà xuất bản Đại học Quốc

gia Thành phố Hồ Chí Minh.

[3] Nguyễn Đức Lượng (chủ biên) (2004), Công nghệ enzyme, NXB Đại học quốc

gia TP. Hồ Chí Minh.

[4] Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, Thí nghiệm Công

nghệ sinh học tập 2, NXB Đại học quốc gia Tp. Hồ Chí Minh.

[5] A. Cavaco-Paulo and G. M. Gübitz (2003), Textile processing with enzymes,

Woodhead Publishing Limited.

[6] A. Rosenthal, D. L. Pyle, and K. Niranjan, Aqueous and enzymatic processes

edible oil extraction for edible oil extraction, Enzyme Microb. Technol., 1996, vol. 19,

403 – 418.

[7] Ahmed, E.M and R.H. Schmidt (1979), Functional properties of peanut and

soy proteins as influenced by processing methods, Peanut Sci., 6, 1 – 6.

[8] Alex Patist, Darren Bates (2008), Ultrasonic innovations in the food industry:

From the laboratory to commercial production, Innovative Food Science and Emerging

Technologies 9, 147 – 154.

[9] Anet Rezek, Vesna Lelas, Timothy J.Mason, Greta Kresic, Marija Badanjak,

Physical properties of ultrasound treated soy proteins, Journal of food engineering 93

(2009), 386 – 393.

[10] Antonio A. Sekul and Robert L. Ory (1977), Rapid Enzymatic Method for

Partial Hydolysis of Oilseed Proteins for Food Uses, Southern Regional Research

Center, 32 – 35.

[11] Aparna Sharma, S.K. Khare, and M.N. Gupta (2002), Enzyme – Assisted

Aqueous Extraction of Peanut Oil, Journal of the American Oil Chemists’ Society, 79

(3), 215 – 218.


Trang 80

[12] B. Adney and J. Baker (2008), Measurement of Cellulase Activities, Technical

Report.

[13] Barton, S., Bullock, C., Weir, D. (1996), The effects of ultrasound on the

activities of some glycosidase enzymes of industrial importance, Enzyme and Microbial

Technology, 18, 190–194.

[14] Bishnu Karki, Buddi P.Lamsal, Stephanie Jung J.(Hans), Van Leeuwen,

Anthony L. PomettoIII, David Grewell, Samir K. Khanal (2009), Enhancing Protein and

Sugar Release From Deffated Soy Flakes Using ultrasound Technology, Journal of food

engineering 96, 270- 278.

[15] Carroll L. Hoffpauir (1953), Peanut Composition, Relation to Processing and

tilization, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 1 (10), 668–671.

[16] Chengzhou Li, Makoto Yoshimoto, Haruki Ogata, Naoki Tsukuda, Kimitoshi

Fukunaga, Katsumi Nakao (2005), Effects of ultrasonic intensity and reactor scale on

kinetics of enzymatic saccharification of various waste papers in continuously irradiated

stirred tanks, Ultrasonics Sonochemistry, 12, 373–384.

[17] Combes, D. and Monsan. P. (1983), Sucrose hydrolysis by invertase:

characterisation of products and substrate inhibition, Curbohydr. Rex, 117, 215-228.

[18] Daussant J, Neucere NJ, Conkerton EJ (Apr 1969), Immunochemical Studies

on Arachis hypogaea Proteins With Particular Reference to the Reserve Proteins. II.

Protein Modification During Germination, Plant Physiol.44(4):480–484.

[19] Dietrich Knorr et.al.(2004), Applications and potential of ultrasonics in food

processing, Trends in Food Science & Technology 15, 261 – 266.

[20] Doktor-Ingenieur (27 June 2002), Effect of Ultrasound, Temperature and

Pressure Treatments on Enzyme Activity and Quality Indicators of Fruit and Vegetable

Juices, Tag der wissenschaftliche Aussprache.

[21] Donald Barnett, B.Sc., Brian A. Baldo, Ph.D. , and Merlin E. H. Howden,

Ph.D (7-1983), Multiplicity of allergens in peanuts, Allergens in peanuts Vol.72, No.1,

961-981.

[22] Dora Dienes, 2006, Effect of cellulase enzyme on secondary fiber properties,

3-10.

[23] Dóra Dienes, Anita Egyházi, Zoltán Sárdi, Kati Réczey (2002), Treatment of

recycled fiber, International Congress & Trade Show Green-Tech..


Trang 81

[24] E.S. Rickard, L.U. Thompson (1997), Interactions and Biological Effects of

Phytic Acid, ACS Symposium , Vol.662, pp 294–312.

[25] Edith J. Conkerton and Robert L. ORY (1976), Peanut Proteins as Food

Supplements: A Compositional Study of Selected Virginia and Spanish Peanuts, Southern

Regional Research Center, 754 – 756.

[26] Entezari, H., Nazary, H., & Khodaparast, H. (2004), The direct effect of

ultrasound on the extraction of date syrup and its micro-organisms, Ultrasonics

Sonochemistry, 11, 379-384.

[27] Flavio E. Mitidieri, Jorge R. Wagner (2002), Coalescence of o/w emulsions

stabilized by whey and isolate soybean proteins. Influence of thermal denaturation, salt

addition and competitive interfacial adsorption, Food Research International 35, 547–

557.

[28] G.S.Ladics, J.H.M.Van Bilsen, H.M.H. Brouwer, L.Vogel, S.Vieths,

L.M.J.Knippels (2008), Assessment of three human FceRI-transfected RBL cell-lines for

identifying IgE induced degranulation utilizing peanut-allergic patient sera and peanut

protein extract , Regulatory Toxicology and Pharmacology 51,1, 288–294.

[29] Ghose TK, (1987). Measurement of cellulase activities, Pure & Appl. Chem.,

Vol. 59, pp. 257—268,

[30] Grabber, J. H., Hatfield, R. D., & Ralph, J. , (1998), Diferulate crosslinks

impede the enzymatic degradation of non-lignified maize walls, Journal of the Science of

Food and Agriculture, 77, 193-200.

[31] Haile Maa, Liurong Huang, Junqiang Jia, Ronghai He, Lin Luo, Wenxue Zhu

(2011), Effect of energy-gathered ultrasound on Alcalase, Ultrasonics Sonochemistry 18,

419 – 424.

[32] Haiwen Wua, Qiang Wang, Tiezheng Maa, Jiajia Ren (2009), Comparative

studies on the functional properties of various protein concentrate preparations of peanut

protein, Food Research International 42, 343–348.

[33] Haizhou Li, Lester Pordesimo, Jochen Weiss (2004), High intensity

ultrasound-assisted extraction of oil from soybeans, Food Research International 37, 731

– 738.


Trang 82

[34] Huihua Huang, Kin-Chor Kwok, Han-Hua Liang (2008), Inhibitory activity

and conformation changes of soybean trypsin inhibitors induced by ultrasound,

Ultrasonics Sonochemistry, 15, 724–730.

[35] Ismail Y. S. Rustom, M. H. Lrpez-Leiva & Baboo M. Nair (1991), A Study of

Factors Affecting Extraction of Peanut (Arachis hypogaea L) Solids With Water, Food

Chemistry 42, 153 – 165.

[36] Ismail Y. S. Rustom, Mervat I. Foda and M. H. Lbpez-Leivaa (1998),

Formation of oligosaccharides from whey UF-permeate by enzymatic hydrolysis –

analysis of factors, Food Chemistry, Vol. 62, No. 2, 141- 147.

[37] Ismail Y. S. Rustom, Miguel H. Lopez-Leiva and Baboo M.Nair (1993),

Extraction of peanut solids with water-effect of the process and enzymatic hydrolysis, 72

– 75.

[38] J H Grabber, R D Hatüeld and J Ralph (1998), Diferulate Cross-Links Impede

the Enzymatic Degradation of Non-Lignified Maize Walls, J Sci Food Agric 77, 193 –

200.

[39] J.T.Lawhon, D.Mulsow, C.M.Cater .F.Mattil (1997), Production of

protein isolate and concentrates from oilseed flour extracts using industrial

ultrafiltration and reverse osmosis systems, Journal of Food Science, 42.

[40] Jianmei Yu, Mohamed Ahmedna, Ipek Goktepe (2007), Peanut protein

concentrate: Production and functional properties as affected by processing, Food

Chemistry 103, 121–129.

[41] Ji-Hyun Jang, Kwang-Deog Moon (2011), Inhibition of polyphenol oxidase

and peroxidase activities on fresh-cut apple by simultaneous treatment of ultrasound and

ascorbic acid, Food Chemistry 124, 444–449.

[42] Jing Wang, Yanping Cao, Baoguo Sun, Chengtao Wang, Yingjie Mo (2011),

Effect of ultrasound on the activity of alliinase from fresh garlic, Ultrasonics

Sonochemistry 18, 534–540.

[43] John P. Cherry (1977), Potential Sources of Peanut Seed Proteins and Oil in

the Genus Arachis, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 25 (1), 186 – 193.

[44] John P. Cherry (1990), Peanut Protein and Product Functionality, Journal of

the American Oil Chemists’ Society, 67 (5), 293 – 301.


Trang 83

[45] K. Suknark, R.D. Phillips and M.S. Chinnan (1991), Physical properties of

directly expanded extrudates formulated from partially defatted peanut flour and

different types of starch, Food Research International, Vol. 30, No. 8, pp. 515-583.

[46] K.J.Moulton and L.C. Wang (1982), A Pilot-Plant Study of Continuous

Ultrasonic Extraction of Soybean Protein, Journal of Food Science, 47.

[47] Kamaljit Vilkhu và cộng sự (2008), Applications and opportunities for

ultrasound assisted extraction in the food industry — A review, Innovative Food Science

and Emerging Technologies 9, 161 – 169.

[48] Kamaljit Vilkhu, Richard Manasseh, Raymond Mawson and Muthupandian

Ashokkumar, Food Engineering Series (2011), Ultrasonic Recovery and Modification of

Food Ingredients, 345-368

[49] Karaboga, C., Korlu, A. E., Duran, K., Bahtiyari, M. (2007), Use of Ultrasonic

Technology in Enzymatic Pretreatment Processes of Cotton Fabrics, Fibres and Textiles

in Eastern Europe, 15, 63.

[50] Kay H. McWatters, John P. Cherry and Mac R. Holmes (1976), Influence of

Suspension Medium and pH on Functional and Protein Properties of Defatted Peanut

Meal, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 24 (30), 517 – 523.

[51] L.J. Manak .W.Lusas (1980), Functioning potential of soy,

cottongseed, peanut protein isolates produced by industrial membrane systems, Journal

of food science, 45.

[52] Latham J. Stack, Patricia A. Carney, Henry B. Malone, Thomas K. Wessels

(2005), Factors influencing the ultrasonic separation of oil-in-water emulsions, 153-160.

[53] Li Chuan Wang (1981), Soybean protein agglomeration: promotion by

ultrasonic treatment, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 29 (1), 177 – 180.

[54] Lihua Jiang, Di Hua, Zhang Wang, Shiying Xu (2010), Aqueous enzymatic

extraction of peanut oil and protein hydrolysates, Food and bioproducts processing 88,

233–238.

[55] M. Aliyu, M.J. Hepher (2000), Effects of ultrasound energy on degradation of

cellulose material, Ultrasonics Sonochemistry 7, 265–268.

[56] M. Sakakibara, D. Wang, R. Takahashi, K. Takahashi and S. Mori (1996),

Influence of ultrasound irradiation on hydrolysis of sucrose catalyzed by invertase,

Enzyme and Microbial Technology 18, 444 – 448.

http://www.springerlink.com/content/?Author=Kamaljit+Vilkhu

http://www.springerlink.com/content/?Author=Richard+Manasseh

http://www.springerlink.com/content/?Author=Raymond+Mawson

http://www.springerlink.com/content/?Author=Muthupandian+Ashokkumar



http://www.springerlink.com/content/1571-0297/


Trang 84

[57] M. Yaldagard, S.A. Mortazavi, F. Tabatabaie (2007), The Effectiveness of

Ultrasound Treatment on the Germination Stimulation of Barley Seed and its Alpha-

Amylase Activity, World Academy of Science Engineering and Technology 34, 154 – 157.

[58] M.K. Bhat (2000), Cellulases and related enzymes in biotechnology,

Biotechnology Advances 18, 355–383.

[59] Mawson, Raymond, Knoerzer, Kai (2007), A brief history of the application of

ultrasonics in food processing, 19th international congress on acoustics madrid.

[60] Mei-Hwa Lee and Chuan-Chuan Lin (2007), Comparison of techniques for

extraction of isoflavones from the root of Radix Puerariae: Ultrasonic and pressurized

solvent extractions, Food Chemistry, Vol. 105, Issue 1, 223-228.

[61] - (2004),

Fuctional properties of Soybean and Lupin protein concentrates produced by

Ultrafiltration- Diafiltration, Journal of the American Oil Chemists’ Society, 81.

[62] Moholkar, V.S., A.B. Pandit and M.M.C.G. Warmoeskerken (1999).

Characterization and optimization aspects of a sonic reactor, Proceedings of the

International Conference and Exhibition on Ultrasonics – 99, 1,17-22.

[63] Muthupandian Ashokkumar và cộng sự (2008), Modification of food

ingredients by ultrasound to improve functionality: A preliminary study on a model

system, Innovative Food Science and Emerging Technologies 9, 155 – 160.

[64] N. J. Neucere and Robert L. ( May 1970), Physicochemical Studies on the

Proteins of the Peanut Cotyledon and Embryonic Axis, Ory Plant Physiol 45(5): 616–

619.

[65] Nelson R. Grosso, Valeria Nepote, and Carlos A. Guzma ´n (2000), Chemical

Composition of Some Wild Peanut Species (Arachis L.) Seeds, Journal of Agricultural

and Food Chemistry, 48, 806 – 809.

[66] Nicolas A. Deak, Lawrence A. Jonhson (2007), Effect of Extraction

Temperature and Preservation Method on Functionality of Soy Protein, 84: 259- 268.

[67] O.N. Donkor and N.P. Shah (2008), Production of β-Glucosidase and

Hydrolysis of Isoflavone Phytoestrogens by Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium

lactis, and Lactobacillus casei in Soymilk, journal of food science, Vol. 73, No. 1, M15 –

M20.

http://www.sciencedirect.com/science/journal/03088146

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=PublicationURL&_tockey=%23TOC%235037%232007%23998949998%23662254%23FLA%23&_cdi=5037&_pubType=J&view=c&_auth=y&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=fba0bd1f16eab4a1167cf7894209ee7b


Trang 85

[68] O¨ zbek, B., U¨ lgen, K.O¨. (2000), The stability of enzymes after sonication,

Process Biochemistry 35, 1037–1043.

[69] Ovsianko, S.L., Chernyavsky, E.A., Minchenya, V.T., Adzerikho, I.E.,

Shkumatov, V.M (2005), Effect of ultrasound on activation of serine protease

precursors, Ultrasonics Sonochemistry, 12, 219–223.

[70] P. Vincent Monteiro and V. Prakash (1994), Functional Properties of

Homogeneous Protein Fractions from Peanut (Arachis hypogaea L.), Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 42, 274 – 278.

[71] R. Y. Yada (2004), Proteins in food processing, Woodhead Publishing

Limited and CRC Press LLC.

[72] R.P. Nascimento, N.A. Junior, N. Pereira Jr, E.P.S. Bon and R.R.R. Coelho

(2009), Brewer’s spent grain and corn steep liquor as substrates for cellulolytic enzymes

production by Streptomyces Malaysiensis, Letters in Applied Microbiology 48, 529–535.

[73] Rassoul Kadkhodaee, Malcolm J.W. Povey (2008), Ultrasonic inactivation of

Bacillus a-amylase. I. effect of gas content and emitting face of probe, Ultrasonics


[74] Renata Torrezan, Whye Pin Tham, Alan E.Bell, Richard A.Frazier, Marcelo

Cristianini (2007), Effect of High Pressure on Functional Properties of Soy Protein, Food

chemistry 104, 140 – 170.

[75] Richard W. Baker (2000), Membrane technology and applications, published

by McGraw-Hill.

[76] Rickey Yoshio Yada, (2004),Proteins in food processing, woodhead

publishing limited.

[77] Riera, Y. Golaùs, A. Blanco, J.A. Gallego, M. Blasco, A. Mulet (2004), Mass

transfer enhancement in supercritical fluids extractionby means of power ultrasound,

Ultrasonics Sonochemistry, 11, 241–244.

[78] Rostagno, M. A., Palma, M., and, Barruso, C. G. (2003). Ultrasoundassisted

extraction of soy isoflavones, J. Chromatogr. A. 1012:119-128.

[79] Rudrapatnam N. Tharanathan, Dharmaraj B. Wankhede and Madhava R.

Raghavendra Rao (1979), Groundnut Carbohydrates – a Review, Journal of the Science

of Food and Agriculture, 30, 1077 – 1084.

[80] S.D. Arntfield, 2004, Proteins from oil-producing plants, Woodhead


Trang 86

Publishing Limited and CRC Press LLC.

[81] S. Jung, B.P. Lamsal, V. Stepien, L.A. Johnson, and P.A. Murphy,

Functionality of Soy Protein Produced by Enzyme-Assisted Extraction, JAOCS, Vol. 83,

no. 1, 2006, 71-78.

[82] Sabine Baumgartner, Claudia Hemetsberger, Elisabeth Drs, Harald Pichler,

Rudolf Krska (September 2003), Purification of peanut proteins for further use in affinity

chromatography and as immunogens, Journal of Separation Science, Vol. 26, 1284 –

1286.

[83] Seo, C.V. Morr (January 1985), Activated Carbon and Ion Exchange

Treatments for Removing Phenolics and Phytate from Peanut Protein Products, Journal

of Food Science, Vol. 50, Issue 1, 262–263.

[84] Sheikh M. Basha and Sunil K. Pancholy (1982), Composition and

Characteristics of Basic Proteins from Peanut (Arachis hypogaea L.) Seed, Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 30, 1176 – 1179.

[85] Stephen Barton, Clive Bullock, and Deborah Weir (15 February 1996), The

effects of ultrasound on the activities of some glycosidase enzymes of industrial

importance, Enzyme and Microbial Technology, vol. 18, 190 – 194.

[86] Stéven Criquet (2002), Measurement and characterization of cellulase activity

in sclerophyllous forest litter, Journal of Microbiological Methods 50 , 165– 173.

[87] T.S. Kholief (1987), Chemical composition and protein properties of peanuts,

Department of Nutrition, University College for Women , Ain Shams University, Cairo

(Arab Republic of Egypt), 56 – 61.

[88] T.V.R. Alicieo , E.S. Mendes, N.C. Pereira and O.C. Motta (10 September

2002), Membrane ultrafiltration of crude soybean oil, Desalination, Vol. 148, Issues 1 –

3, 99 – 102.

[89] T.J. Mason, L. Paniwnyk, J.P. Lorimer (1996), The uses of ultrasound in food

technology, Ultrasonics Sonochemistry 3, 253 – 260.

[90] Tetsuo Yamada, Shigeo Aibara and Yuhei Morita (1980), Accumulation

pattern of arachin and its subunits in maturation of groundnut seeds, Plant & Cell

Physiol. 21(7): 1217-1226.

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jfds.1985.50.issue-1/issuetoc

http://www.sciencedirect.com/science/journal/00119164


Trang 87

[91] Tiezheng Ma, Qiang Wang, Haiwen Wu (2010), Optimization of extraction

conditions for improving solubility of peanut protein concentrates by response surface

methodology, Food Science and Technology 43, 1450 – 1455.

[92] Val G Yachmenev, Noelie R Bertoniere and Eugene J Blanchard, 2002,

Intensification of the bio-processing of cotton textiles by combined enyme/ ultrasound

treatment, Journal Chemical Technology and Biotechnology, 559 – 567.

[93] Xiao, Y., Wu, Q., Cai, Y., Lin, X., (2005) Ultrasound-accelerated enzymatic

synthesis of sugar esters in nonaqueous solvents, Carbohydrate Research, 340 2097–2103.

[94] Yachmenev, Val G., Eugene J. Blanchard, Allan H. Lambert (2004), Use of

ultrasonic energy for intensification of the bio-preparation of greige cotton, Ultrasonics

42, 87–91.

[95] Yachmenev, Val; Condon, Brian; Lambert, Allan. (2007), Technical aspects of

use of ultrasound for intensification of enzymatic bio-processing: new path to ―Green

Chemistry‖, 19th

international congress on acoustics, Marid,.

[96] Yuanyuan Yan, Leiyu Feng, Chaojie Zhang, Hongguang Zhu and Qi Zhou

(22 March 2010), Effect of ultrasonic specific energy on waste activatedsludge

solubilization and enzyme activity, African Journal of Biotechnology Vol. 9 (12), 1776-

1782.

[97] Zaileen Alibhai (2006), Production of soy protein concentrates/isolates:

traditional and membrane technologies, Desalination 191, 351 – 358.

[98] Zhong Min Tian, Ming Xi Wan, Su Pi Wang, Ju Qing Kang (2004), Effects of

ultrasound and aditives on the function and structure of trypsin, Ultrasonics


Phụ lục

Trang 88

PHỤ LỤC

1. Xác định độ ẩm

Cách tiến hành: Sử dụng thiết bị đo độ ẩm hồng ngoại của hãng Scaltec (Đức)

sản xuất. Cân 1 lượng khoảng 2g mẫu vào đĩa sấy, đặt vào máy, xác lập chế độ sấy ở

130 C, sấy đến khối lượng không đổi. Đọc kết quả độ ẩm của mẫu hiển thị trên máy đo

khi kết thúc.

Công thức tính:

Với: mo: khối kượng mẫu ban đầu

m1: khối lượng mẫu lúc sau

2. Xác định độ tro

Cách tiến hành: Nung chén sứ đã rửa sạch ở lò nung (600oC) đến khối lượng

không đổi. Để nguội ở bình hút ẩm và cân. Cho vào chén m (g) mẫu, cân rồi cho vào lò

nung ở 600oC, nung đến tro trắng. Lấy ra cho vào bình hút ẩm và cân chính xác. Tiếp tục

nung 30 phút rồi lấy ra cho vào bình hút ẩm và cân chính xác cho đến khối lượng không

đổi thì ngừng.

Công thức tính:

Độ tro = 2

1

100G

G

G

G

Với G là khối lượng chén.

G1 là khối lượng chén và mẫu.

G2 là khối lượng chén và tro.

3. Xác định hàm lƣợng lipid

Cách tiến hành:

Phụ lục

Trang 89

− Sấy khô nguyên liệu đến khối lượng không đổi (100 – 105oC).

− Cân M (g) nguyên liệu đã nghiền nhỏ cho vào gói giấy.

− Đặt vào trụ chiết. Lắp trụ vào bình cầu và gắn ống sinh hàn. Qua ống sinh hàn

dùng phễu cho dung môi petroleum ether vào trụ chiết sao cho một lượng dung môi đã

chảy xuống bình cầu, một lượng trên phễu vẫn còn ngập mẫu. Dùng bông làm nút đầu

ống sinh hàn. Mở nước lạnh.

− Mở công tắc đèn.

− Trích ly trong 12 giờ.

− Thử xem hết chất béo chưa ở đầu siphon (không còn vết dầu loang khi dung

môi bay hơi).

− Lấy gói giấy, đặt dưới tủ hotte cho bay hơi dung môi.

− Sấy ở 100 – 105oC trong 1,5 giờ

− Để nguội trong bình hút ẩm.

− Cân xác định khối lượng

Công thức tính:

Lượng lipid tổng : 1 2 100M M

XM

Với M1 : khối lượng gói giấy và mẫu ban đầu.

M2 : khối lượng gói giấy và mẫu sau khi trích ly và sấy.

M : khối lượng mẫu ban đầu.

4. Xác định hàm lƣợng protein tổng

Cách tiến hành:

− Vô cơ hóa mẫu: tiến hành trong máy vô cơ hóa mẫu. Cho một lượng mẫu xác

định vào bình chứa mẫu. Thêm từ từ H2SO4 đậm đặc vào bình chứa mẫu. Đưa bình chứa

mẫu vào máy, bật máy và chỉnh nhiệt độ vô cơ mẫu. Sau khi H2SO4 chảy màng trên

thành bình cho tiếp xúc tác H2O2 cho đến khi mẫu trắng ra.

− Cất đạm bằng máy Kjeldahl: mẫu sau khi vô cơ hóa được đưa vào máy Kjeldahl

để cất đạm. Đồng thời, đưa vào một erlen chứa khoảng 10 ml H3BO3 chứa hỗn hợp thuốc

Phụ lục

Trang 90

thử bromcresol green (0,002%) : methyl red (0,2%) = 5:1(w/w) pha trong cồn để thu mẫu.

Mẫu này sau đó đem đi chuẩn độ bằng H2SO4 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng.

Công thức tính:

− Đối với mẫu lỏng:

Hàm lượng nitơ tổng số (Nt) có trong 1l nguyên liệu:

cdvc

tVV

nN

10042,1(mg/ml)

Với n: thể tích H2SO4 0,1N chuẩn độ (ml)

Vvc : thể tích mẫu đem vô cơ (ml).

Vcd : thể tích mẫu vô cơ đem cất đạm (ml).

1,42 số mg nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N

− Đối với mẫu rắn:

cd

tVm

nN

10042,1 (%).

Với m là khối lượng mẫu ban đầu.

Tính hàm lượng protein bằng cách nhân hàm lượng nitơ tổng với hệ số 5,47

Hóa chất sử dụng:

- Thuốc thử methyl bromcresol:hỗn hợp bromcresol green (0.002%) và methyl

red (0.2%) = 5:1(w/w) pha trong cồn tuyệt đối.

- H3BO3 3%

- H2SO4 0,1 N để chuẩn độ

5. Xác định hoạt tính enzyme cellulase

Cách tiến hành (theo IUPAC, 1987):Chuẩn bị các ống nghiệm sau

− Ống chuấn đo mẫu trắng (spectro zero)

- 0.5 ml CMC

- 50oC, 30 phút

- 3 ml DNS

Phụ lục

Trang 91

- 0.5 ml đệm, trộn đều

- To sôi, 5 phút

- 20ml H2O

- Đo ở bước sóng 540nm

− Ống thử enzyme:

- 0.5 ml enzyme 50oC, 5phút

- 0.5 ml CMC

- 50oC, 30 phút

- 3ml DNS

- To sôi, 5 phút

- 20ml H2O


− Ống thử không enzyme đối chứng:

- 0.5 ml CMC

- 50oC, 30 phút

- 3ml DNS

- 0.5 ml enzyme

- To sôi, 5 phút

- 20ml H2O


− 4 ống chuẩn glucose (dựng đƣờng chuẩn)

- 0.5 ml CMC

- 50oC, 30 phút

- 3ml DNS

- 0.5 ml đường chuẩn

- To sôi, 5 phút

- 20ml H2O

Phụ lục

Trang 92

Dung dịch glucose chuẩn được pha với các nồng độ:

- 2 mg/ml (1 mg/0,5ml)

- 1 ml + 0,5 ml đệm = 1:1,5 = 1,33 mg/ml (0,67 mg/0,5l)

- 1 ml + 1 ml đệm = 1:2 = 1mg/ml (0,5 mg/0,5l)

- 1 ml + 3 ml đệm = 1:4 = 0,5 mg/ml (0,25 mg/0,5l)

Phương pháp tính toán:

− Định nghĩa: Một đơn vị hoạt tính IU/ml được định nghĩa là số lượng enzyme cần

thiết để giải phóng ra đường khử (glucose) ở tốc độ µmol/phút dưới các điều kiện thực

nghiệm.

− Xây dựng đường chuẩn glucose y=f(x) với trục tung là mật độ quang, trục hoành

là hàm lượng glucose (mg/0,5ml).

− Dựa vào đường chuẩn, tính nồng độ (mg/0,5ml) glucose trong dung dịch mẫu.

− Chuyển đổi mức độ pha loãng sang nồng độ enzyme:

Nồng độ enzyme = 1/ độ pha loãng

− Tính nồng độ enzyme sao cho phản ứng DNS cho chính xác 0,5 mg glucose (dựa

vào hệ số của phương trình đường chuẩn) trên đồ thị logarith với trục hoàng là hàm

lượng glucose, trục tung là ln( nồng độ enzyme). Độ pha loãng

− Hoạt tính enzyme:

CMC= 0,185/ nồng độ enzyme cho ra 0,5 mg glucose (IU/ml)

Hóa chất sử dụng:

Thốc thử DNS:

- Hòa tan 10g DNS trong nước cất. Khuấy trên máy khuấy từ.

- Hòa tan 300g Natri-Kali tactrate trong nước cất.

- Trộn 2 hỗn hợp trên với nhau

- Hòa tan 16g NaOH vào nước cất

- Cho dung dịch NaOH vào hỗn hợp DNS ở trên, khuấy đều đến khi DNS tan hoàn

toàn. (Sử dụng máy khuấy từ và gia nhiệt không quá 50oC)

- Định mức 1 lít. Lắc đảo đều

Phụ lục

Trang 93

- Dự trữ trong chai thủy tinh có màu tối. Cần phải tránh ánh sáng và CO2.

Đệm citrate 0,05M; pH 4,8:

- Hòa tan 10,5g Acid Citric Monohydrate C6H8O7.H2O trong khoảng 750 ml nước.

- Thêm từ từ 5-6g NaOH trên máy khuấy từ đồng thời chỉnh pH từ từ đến khi được

pH 4,5.

- Định mức 1000ml và kiểm tra pH. Ta được dung dịch đệm citrate 1M; pH 4,8. Cất

trong tủ lạnh.

Dung dịch glucose chuẩn:

- Cân chính xác 0,2g glucose khan, hòa tan trong dung dịch đệm citrate 0,05M.

Định mức lên 100ml. Ta được dung dịch glucose chuẩn 2mg/ml.

Dung dịch cơ chất CMC 2%:

- Khi làm thí nghiệm mới pha dung dịch này trong đệm citrate pH = 4,8

6. Kĩ thuật điện di

Nguyên lý của việc điện di là khi ở trong điện trường, do tích điện âm nên các phân

tử dịch chuyển về phía anode với tốc độ dịch chuyển của chúng khác nhau phụ thuộc vào

khối lượng phân tử. Khối lượng phân tử càng lớn thì dịch chuyển càng chậm. Kết quả là

từ một điểm chung (lỗ hay ―giếng‖ tải mẫu) các phân tử khác nhau dịch chuyển về một

hướng tạo thành một lane, và trên lane đó có các phân tử khác nhau phân bố ở các vị trí –

các band khác nhau tương ứng với độ lớn của chúng.

Các phân tử protein do điện tích bề mặt khác nhau nếu điện di trong gel không gây

biến tính thì dịch chuyển theo các hướng khác nhau với tốc độ khác nhau phụ thuộc cả

khối lượng phân tử lẫn điện tích bề mặt.

Tuy vậy, nếu các protein được xử lý với các chất tẩy ion hóa mạnh như SDS

(sodium dodecyl sulphat) và một hợp chất khử, ví dụ như mercapthoethanol, thì các cấu

trúc bậc 2, và 4 của phân tử protein sẽ bị phá vỡ. Nghĩa là, sau khi xử lý với SDS, protein

trở thành dạng phân tử polymer không có cấu trúc, duỗi mạch hoàn toàn. Đồng thời,

SDS tạo thành lớp vỏ ion và làm phân tử protein trở nên tích điện âm đồng đều hơn.

Mecarptoethanol thì làm giảm các liên kết disulphit hình thành giữa các tiểu phần

cystein. Kết quả là nếu các phân tử protein được gây biến tính bởi SDS và

mecarptoethanol thì sự phân tách của các loại phân tử protein trong điện di chủ yếu là do

Phụ lục

Trang 94

sự khác biệt về trọng lượng và kích thước phân tử. Sau khi điện di, các phân tử protein

được nhuộm với các thuốc nhuộm liên kết protein như Coomassie brilliant blue và quan

sát. Khi không có SDS, điện di vẫn có thể phân tách được các loại protein, nhưng lúc này

còn có các yếu tố khác nhau của các loại protein là trọng lượng phân tử, tổng điện tích và

điểm đẳng điện.

Hình: điện di trên gel polyacrylamide

Documents

nghien cuu su dung song sieu am de trich ly pro tein tu DPF