nghiên cứu một số đặc trưng của chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------------

Ngô Thị Huyền Trang

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TRƯNG CỦA CHẾ

PHẨM ARABINOXYLAN TẠO RA TỪ CÁM GẠO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------------


NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TRƯNG CỦA CHẾ

PHẨM ARABINOXYLAN TẠO RA TỪ CÁM GẠO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. PHAN TUẤN NGHĨA

Hà Nội - 2012

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.

Phan Tuấn Nghĩa và TS. Nguyễn Thị Vân Anh đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn,

giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận

văn.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô giáo thuộc Khoa Sinh học, Trường

Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy, cô giáo thuộc Bộ môn Sinh lý thực

vật và Hóa sinh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian

học tập và thực tập.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bộ, học viên, sinh viên

thuộc Phòng Protein tái tổ hợp và Phòng Sinh học nano và ứng dụng thuộc Phòng

Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, những người đã giúp đỡ tôi

rất nhiều để tôi có thể hoàn thành luận văn này.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã tạo cho

tôi điều kiện tốt nhất để hoàn thành luận văn này.

Luận văn được thực hiện với kinh phí của đề tài “Nghiên cứu ứng dụng endo-

xylanase để sản xuất arabinoxylan từ cám gạo làm thực phẩm chức năng”, mã

số 02/HĐ-ĐT.02.11/CNSHCB.

Hà Nội, ngày 02 tháng 12 năm 2012

Học viên


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 2

1.1. Arabinoxylan và nguồn nguyên liệu cám gạo ............................................... 2

1.1.1. Giới thiệu chung về arabinoxylan ....................................................... 2

1.1.2. Cấu tạo của arabinoxylan .................................................................... 4

1.1.3. Chức năng sinh học của arabinoxylan ................................................ 7

1.1.4. Nguyên liệu cám gạo chứa arabinoxylan ............................................ 7

1.2. Enzyme endoxylanase và các phương pháp tách chiết arabinoxylan ............ 8

1.2.1. Giới thiệu chung về enzyme endoxylanase ......................................... 8

1.2.2. Các phương pháp tách chiết arabinoxylan ........................................ 10

1.3. Các nghiên cứu định tính và định lượng arabinoxylan ............................... 12

1.3.1.Thủy phân arabinoxylan thành các monosaccharide .......................... 13

1.3.2. Phân tích định tính arabinoxylan ....................................................... 14

1.3.3. Phân tích định lượng arabinoxylan .................................................... 14

1.4. Các nghiên cứu tinh sạch và xác định khối lượng phân tử của arabinoxylan .... 18

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 20

2.1. Nguyên liệu .................................................................................................. 20

2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 20

2.2.1. Thủy phân arabinoxylan thành các monosaccharide ......................... 20

2.2.2. Phân tích định lượng arabinoxylan bằng kit D-xylose và kit Arabinan ... 21

2.2.2.1. Xác định hàm lượng D-xylose có trong arabinoxylan sau khi

đươc thủy phân bằng D-xylose kit [60]. ............................................................ 21

2.2.2.2. Xác định hàm lượng L-arabinose có trong arabinoxylan sau

khi đươc thủy phân bằng Arabinan kit [59] ...................................................... 23

2.2.3. Phân tích định tính arabinoxylan bằng phương pháp sắc ký bản mỏng ... 25

2.2.4. Tinh sạch và cô đặc mẫu bằng màng lọc có kích thước lỗ xác định .. 26

2.2.5. Đánh giá tỷ lệ và kích thước của arabinoxylan bằng phương pháp sắc ký lọc gel . 26

2.2.6. Xác định độ ẩm .................................................................................. 28

2.2.7. Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl [2] ... 29

2.2.8. Xác định hàm lượng asen ................................................................... 29

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 30

3.1. Xây dựng quy trình định tính và định lượng arabinoxylan ......................... 30

3.1.1. Thủy phân arabinoxylan bằng acid và định tính, định lượng arabinoxylan30

3.1.2. Thủy phân arabinoxylan bằng enzyme xylanase và định tính, định

lượng arabinoxylan ............................................................................................. 35

3.2. Phân tích một số tính chất của chế phẩm arabinoxylan được tạo ra từ cám gạo ..... 40

3.2.1. Xác định khối lượng phân tử của chế phẩm arabinoxylan ................ 40

3.2.2. Xác định độ ẩm của chế phẩm arabinoxylan được tạo ra từ cám gạo 45

3.2.3. Xác định hàm lượng protein tổng số của chế phẩm arabinoxylan ..... 46

3.2.4. Xác định hàm lượng asen của chế phẩm arabinoxylan ...................... 46

KẾT LUẬN ............................................................................................................... 47

KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 48

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

AX Arabinoxylan

A340 Độ hấp thu ở bước sóng 340 nm

EtOH Ethanol

kDa Kilodalton

HPSEC Sắc ký chọn lọc theo kích thước phân tử hiệu năng cao

(High Performance Size Exclusion Chromatography)

KLPT Khối lượng phân tử

β-D-Xylp β-D-xylopyranosyl

α -L-Araf α-L-arabinofuranosyl

XOS Xylan-oligosaccharide

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần các hợp chất trong thành tế bào một số hạt ngũ cốc……….4

Bảng 1.2: Thành phần dinh dưỡng của một số ngũ cốc…………………………….8

Bảng 2.1: Thành phần của phản ứng định lượng D-xylose bằng D-XYLOSE KIT22

Bảng 2.2: Thành phần của phản ứng định lượng L-arabinose bằng

ARABINAN KIT………………………………………………………………….24

Bảng 3.1: Kết quả định lượng D-xylose và L-arabinose sau khi thủy phân

arabinoxylan thương mại bằng axit………………………………………………...31

Bảng 3.2: Kết quả định lượng D-xylose sau khi thủy phân mẫu chứa arabinoxylan

bằng axit…………………………………………………………………………...32

Bảng 3.3: Kết quả định lượng L-arabinose sau khi thủy phân mẫu chứa

arabinoxylan bằng axit…………………..…………………………………………32

Bảng 3.4: Hàm lượng arabinoxylan có mặt trong chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ

cám gạo được thủy phân bằng axit………………………………………………..33

Bảng 3.5: Kết quả định lượng D-xylose và L-arabinose sau khi thủy phân

arabinoxylan thương mại bằng enzyme xylanase…………………...……………..35

Bảng 3.6: Kết quả định lượng D-xylose sau khi thủy phân chế phẩm arabinoxylan

tạo ra từ cám gạo bằng enzyme xylanase…………………………………………..36

Bảng 3.7: Kết quả định lượng L-arabinose sau khi thủy phân chế phẩm

arabinoxylan tạo ra từ cám gạo bằng enzyme xylanase….……………………… 36

Bảng 3.8: Hàm lượng arabinoxylan trong chế phẩm tạo ra từ cám gạo được thủy

phân bằng enzyme…………………………………………………………………37

Bảng 3.9: Khối lượng phân tử của arabinoxylan tách ra bằng sắc ký lọc gel

Sephadex G-100………………………………………………………………...…43

Bảng 3.10: Khối lượng của hộp mẫu sau khi được sấy đến khối lượng không

đổi…………………………………………………………………………………45

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc các đơn vị của arabinoxylan……………………………………5

Hình 1.2: Cấu trúc của arabinoxylan ngũ cốc……………………………………….6

Hình 1.3: Cấu trúc phân tử arabinoxylan…………………………………………..6

Hình 1.4: Cấu trúc của họ endoxylanase 10 và 11………………………………….9

Hình 1.5: Sự phân loại arabinoxylan theo khả năng hòa tan……………………...11

Hình 1.6: Vị trí cắt hoạt động endoxylanase………………………………………12

Hình 1.7: Vị trí hoạt động của endo-1,4-β -ᴅ-xylanase trên phân tử arabinoxylan13

Hình 3.1: Kết quả sắc ký bản mỏng chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo sau

khi được thủy phân bằng axit………………………………………………………34

Hình 3.2: Kết quả sắc ký bản mỏng chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo sau

khi được thủy phân bằng enzyme xylanase……………………………………….38

Hình 3.3: Tóm tắt quy trình phân tích định tính, định lượng

arabinoxylan……………….………………………………………………………39

Hình 3.4: Đồ thị tương quan giữa khối lượng phân tử và thể tích rửa chiết của các

chất chuẩn qua sắc ký lọc gel Sephadex G-100………………………………..…41

Hình 3.5: Đồ thị minh họa giá trị A340 của các phân đoạn rửa chiết từ 1 đến 70 qua

sắc ký lọc gel Sephadex G-100…………………………………………………..42

Hình 3.6: Kết quả sắc ký bản mỏng sau khi thủy phân các phân đoạn rửa chiết

arabinoxylan………………………………………………………………………44

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang

Khóa 2010 - 2012 1

MỞ ĐẦU

Arabinoxylan (AX) là polysaccharide được cấu tạo từ hai đường arabinose

và xylose có kích thước phân tử lớn có thể lên đến hàng trăm, hàng nghìn kDa và

thường được sử dụng làm thực phẩm chức năng tương đối phổ biến trên thế giới.

AX thể hiện được hoạt tính miễn dịch, phòng chống ung thư, có ưu thế vượt trội so

với các hoạt chất gây kích thích miễn dịch khác do có nguồn gốc tự nhiên và đã

được sử dụng với chức năng tăng cường miễn dịch cho bệnh nhân nhiễm HIV, viêm

gan và ung thư.

Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu và sản xuất thực

phẩm chức năng chứa AX nhưng thực tế cho thấy các chế phẩm này được bán với

giá khá cao, hơn nữa, thành phần cụ thể cũng như hàm lượng AX trong các chế

phẩm đều không được các nhà sản xuất cung cấp một cách rõ ràng. Trong khi đó

AX lại có thể được tách chiết từ các phụ phẩm nông nghiệp rẻ tiền như ngũ cốc,

mày ngô, hay phổ biến hơn cả là từ cám gạo, những nguyên liệu rất sẵn có ở một

nước nông nghiệp như Việt Nam. Một số nhóm nghiên cứu trong nước đã bắt đầu

nghiên cứu tạo chế phẩm AX từ các nguồn nguyên liệu sẵn có trong nông nghiệp

như cám gạo và mở ra cơ hội cho người tiêu dùng được sử dụng AX với giá cả hợp

lý hơn. Vì vậy, việc thiết kế quy trình định tính, định lượng AX trong các chế phẩm

một cách hiệu quả và nghiên cứu một số đặc trưng của chế phẩm là rất cần thiết cho

các nghiên cứu sản xuất thực phẩm chức năng chứa AX.

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “ Nghiên cứu một số

đặc trưng của chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo”.


Khóa 2010 - 2012 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Arabinoxylan và nguồn nguyên liệu cám gạo

1.1.1. Giới thiệu chung về arabinoxylan

Ở thực vật, các polysaccharide chủ yếu tồn tại ở hai dạng: tinh bột và phi

tinh bột, hàm lượng của chúng thay đổi tùy theo loài, loại tế bào và giai đoạn sinh

trưởng [15].

Nhóm polysaccharide phi tinh bột bao gồm cellulose, hemicellulose, pectic

polysaccharide và được phân loại chủ yếu dựa vào phương pháp được sử dụng để

tách chiết polysaccharide đó như khả năng hòa tan của chúng khi được chiết bằng

kiềm. Cellulose là polymer được cấu tạo bởi các đơn vị đường glucose, nối với

nhau bởi liên kết β-(1→4) glycoside, gồm các chất không hòa tan được trong kiềm

và là nhóm hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong tự nhiên. Nhóm hemicellulose bao

gồm các hợp chất như xylan, arabinoxylan, β-glucan, galactan, xyloglucan… có khả

năng hòa tan trong kiềm. Các pectin bao gồm các gốc acid polygalacturonic có thể

là thành phần cấu tạo của arabinan, galactan và arabinogalactan [15]. Cả cellulose

và hemicellulose đều có vai trò như các vật liệu để cấu trúc nên thành tế bào thực

vật, trong khi thành phần cellulose tạo độ cứng rắn thì hemicellose tạo nên sự dẻo

dai cho cấu trúc thành tế bào nhờ các liên kết dọc với các vi sợi cellulose [10]. Các

monosaccharide thường có trong thành tế bào ngũ cốc bao gồm các hexose như D-

glucose, D-galactose, D-mannose; các đường pentose như L-arabinose, D-xylose và

các đường acid như acid D-galacturonic, acid D-glucuronic và các dạng eter 4-O-

methyl của chúng [15].

Các xylan là những hemicellulose phổ biến nhất trong tự nhiên và là

polysaccharide phi tinh bột có nhiều thứ hai trong cơ thể thực vật chỉ sau cellulose.

Các xylan có thể được phân chia thành 3 nhóm [41]:


Khóa 2010 - 2012 3

Nhóm Glucurono - arabinoxylan có mặt ở các phần gỗ mềm, mô đang

hóa gỗ của các cây thân thảo và cây hàng năm.

Nhóm Arabinoxylan ở hạt các cây ngũ cốc.

Nhóm Glucuronoxylan ở các phần gỗ cứng.

Trong đó, các hợp chất AX ở các cây ngũ cốc thường được tách chiết, tinh

sạch và phân tích thử nghiệm hoạt tính sinh học với mục tiêu sản xuất thực phẩm

chức năng dùng cho con người.

Các cây ngũ cốc là các cây thân thảo thuộc họ Hòa thảo (Poaceae) thường

được trồng lấy hạt làm thức ăn cho người và gia súc. Các cây ngũ cốc chính như

ngô (Zea mays L.), lúa gạo (Oryza sativa), lúa mì (Triticum spp), đại mạch

(Hordeum vulgare)… được trồng rộng rãi khắp thế giới. Trong đó ngô, lúa mì và

lúa gạo chiếm 87% sản lượng các loại hạt được gieo trồng và chiếm 43% lượng

thức ăn năm 2003 [68].

Hàm lượng của AX trong hạt ngũ cốc tương đối nhỏ, chiếm từ 1,2% tổng

chất khô ở lúa gạo (Oryza sativa) đến khoảng 8,5% ở lúa mạch đen (Secale

cereale). Tuy nhiên nhóm hợp chất này lại chiếm một tỷ lệ đáng kể ở thành tế bào

của nội nhũ hạt. Cụ thể hàm lượng AX trong thành tế bào hạt thay đổi từ khoảng

20% ở đại mạch (Hordeum vulgare) đến 70% ở lúa mì (Triticum aestivum) (Bảng

1.1)


Khóa 2010 - 2012 4

Bảng 1.1: Thành phần các hợp chất trong thành tế bào một số hạt ngũ cốc

Hạt Loại thành

tế bào

Thành phần các hợp chất (%)

Tài liệu

tham

khảo Arabinoxylan Cellulose β-Glucan Hợp chất

khác

Lúa mì

(Triticum

aestivum)

Vỏ nội nhũ 65 2 29 4

[3]

Nội nhũ

hạt 70 4 20 6

Đại mạch

(Hordeum

vulgare)

Vỏ nội nhũ 71 2 26 1

Nội nhũ

hạt

20

2

75

3

Lúa gạo

(Oryza

sativa)

Nội nhũ

hạt

27

28

20

25

[51]

Ngô

(Zea mays)

Nội nhũ

hạt 50 20 17 13 [19]

1.1.2. Cấu tạo của arabinoxylan

Chuỗi chính của arabinoxylan trong ngũ cốc được tạo thành từ hai loại

đường 5 cacbon là arabinose và xylose, bao gồm mạch chính chứa các liên kết β-

(1→4) liên kết các phân tử β-D-Xylp. Mạch xylan liên kết với α-L-Araf thông qua

liên kết 1-2 hoặc 1-3 ở nguyên tử O2 và O3 của phân tử xylosyl [13-15].

Nhóm phụ này thường liên kết 1-3 với β-D-Xylp ở tất cả các loại ngũ cốc, trong khi

đó β-D-Xylp liên kết 1-2 với nhóm α-L-Araf thường thấy trong AX tan trong kiềm

được chiết từ bột lúa mạch và trong các ngũ cốc khác với một lượng nhỏ.

Các phân tử thường liên kết vào mạch chính của AX là arabinose, có thể là

các đường hexose, acid hexuronic. Các chuỗi bên của AX thường là các hợp chất


Khóa 2010 - 2012 5

phenol (phenolic) và các protein. Đặc điểm đặc trưng trong cấu trúc AX ở hầu hết

các loài ngũ cốc đó là tỷ lệ liên kết của các phân tử ở cả hai nguyên tử O2 và O3.

Hầu hết các AX trong hạt ngũ cốc đều không tan trong nước do chúng bị neo giữ ở

thành tế bào bằng các liên kết chéo giống như liên kết ester không bền vững trong

kiềm. Các AX không liên kết với thành tế bào có thể tạo thành dạng dung dịch rất

nhớt và vì thế tăng khả năng hấp thụ vào nước cao hơn đến 10 lần. Khi có mặt các

tác nhân oxi hóa như H2O2/peroxide, AX có thể nhanh chóng hình thành mạng lưới

gel do có sự tái lập các liên kết chéo. Ngoài ra, khối lượng phân tử của AX rất đa

dạng, phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu và phương pháp tách chiết [15].

Ngoài α-L-Araf, mạch chính β-D-Xylp cũng có thể mang thêm acid α-D-

glucopyranosyluronic (α-D-GlcA) hoặc dạng 4-O-methyl của nó (4-O-Me-α-D-

GlcA) và thay thế nhóm acetyl. Acid ferulic và p-coumaric có thể tạo liên kết ester

tại vị trí O-5 ở một vài đơn vị α-L-Araf. Các nhóm acetyl, acid ferulic và p-

coumaric dễ dàng được giải phóng khi chiết bằng kiềm [14, 15, 65]. Các đơn vị cấu

trúc chính của AX được minh họa như hình 1.1, và cấu trúc minh họa cho AX được

thể hiện ở hình 1.2 và 1.3.

H nh 1.1: Cấu trúc các đơn vị của arabinoxylan


Khóa 2010 - 2012 6

Hình 1.2: Cấu trúc của arabinoxylan ngũ cốc

H nh 1.3: Cấu trúc phân tử arabinoxylan [65]

Tỷ lệ arabinose/xylose trong AX của nội nhũ lúa mì thay đổi từ 0,5-0,71, ở

cám mì là từ 1,02-1,07, ở nội nhũ của lúa mạch đen là 0,48-0,55, AX ở nội nhũ lúa

gạo khi được chiết bằng kiềm có tỷ lệ AX/xylan khoảng 0,8, còn ở cám gạo là 0,93.

Ở gạo và cao lương mạch xylan phân nhánh nhiều hơn so với ở lúa mỳ, lúa mạch

đen và đại mạch, hơn nữa trong cấu trúc AX ở gạo có thể chứa galactose, acid

glucuronic [31].


Khóa 2010 - 2012 7

1.1.3. Chức năng sinh học của arabinoxylan

Arabinoxylan là hợp chất có thể kích thích hệ thống miễn dịch mạnh hơn và

an toàn hơn bất kỳ hợp chất tự nhiên hoặc tổng hợp khác. Nó làm tăng sản xuất các

cytokine tự nhiên của cơ thể - yếu tố hoại tử khối u (TNF) và interferon nội sinh

(IFN), điều này không chỉ giúp tiêu diệt một cách trực tiếp các tế bào gây hại và

virus mà còn hoạt hóa hệ thống miễn dịch bằng cách làm tăng hoạt động của tế bào

lympho - B và T và các tế bào đặc biệt - tế bào giết tự nhiên (tế bào NK) [34]. Các

tế bào B tập trung sản xuất các kháng thể, trong khi các tế bào T và NK đi trong cơ

thể trực tiếp phá hủy các tế bào bị nhiễm virus hoặc do vi khuẩn, và các tế bào ung

thư. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng AX được tạo ra từ ngũ cốc có khả năng gây

đáp ứng miễn dịch chống các khối u [49]. Ngoài ra, sử dụng AX trong điều trị có

thể làm tăng sinh đại thực bào, tế bào NK và hoạt động đại thực bào, điều này

chứng tỏ rằng AX đã thúc đẩy cả đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu đối

với khối u. Đặc biệt, các AX có khối lượng phân tử khoảng 5-300 kDa thể hiện hoạt

tính miễn dịch mạnh nhất, được sử dụng khá phổ biến trên thế giới ở dạng thực

phẩm chức năng và được khuyến cáo sử dụng cho bệnh nhân nhiễm HIV, viêm gan

và ung thư [36, 37].

1.1.4. Nguyên liệu cám gạo chứa arabinoxylan

Cám gạo là phụ phẩm chính thu được từ lúa sau khi xay xát và thường chiếm

khoảng 10% chất khô của lúa. Cám gạo được hình thành từ lớp vỏ nội nhũ, mầm

phôi của hạt, cũng như một phần từ tấm. Cám gạo có màu sáng và mùi thơm đặc

trưng. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của cám gạo biến động rất lớn, phụ

thuộc nhiều vào kỹ thuật xay xát gạo. Tỷ lệ vỏ trấu sau khi xay xát ảnh hưởng nhiều

tới hàm lượng protein, chất béo và chất xơ của cám gạo thành phẩm. Tỷ lệ protein

trong cám gạo mịn có thể đạt 12-14%. Lượng protein thô ở cám gạo cao hơn so với

ở bắp hạt (chỉ đạt 8,3%). Hàm lượng chất béo, chất xơ khoảng 13-14% và 7-8%

[65], giàu các polysaccharide hemicellulose trong đó AX là thành phần chủ yếu có


Khóa 2010 - 2012 8

trong cấu thành chất xơ của cám gạo, chúng chiếm khoảng 60% tổng số các

polysaccharide không phải tinh bột [50, 65].

Ở Việt Nam, cám gạo là một nguyên liệu phổ biến, rẻ tiền, chứa hàm lượng

AX cao, vì thế đã trở thành sự lựa chọn tối ưu cho nguyên liệu tách chiết AX trên

quy mô lớn.

ảng 1.2: Thành phần dinh dưỡng của một số ngũ cốc [65]

Chỉ tiêu Bắp Cám gạo

nguyên dầu

Cám gạo

trích dầu Lúa mì

Cám

lúa mì Bột mì

Protein (%) 8 13 15 12 16 16

Năng lượng tiêu

hóa (Kcal/kg) 3,5 3,1 2,3 3,4 2,5 3,0

Xơ thô (%) 2,2 8 11 2,5 11 9

Xơ tổng số (%) 9,5 19 27 10,5 44 27

NSP tổng số (%) 9 15 21 9,5 38,2 23,5

Cellulose (%) 2,0 5 7 2,5 11 8

Lignin (%) 0,5 4 6 1 5,8 3,5

Arabinoxylan (%) 3,7 9 11 5,5 21 15

(% không hoà tan) 94 96 97 77 99 97

1.2. Enzyme endoxylanase và các phương pháp tách chiết arabinoxylan

1.2.1. Giới thiệu chung về enzyme endoxylanase

Enzyme endoxylanase thủy phân khung đường xylan của AX một cách ngẫu

nhiên, làm giảm mức độ polymer hóa của cơ chất và giải phóng các oligomer,

đường xylose, xylobiose.


Khóa 2010 - 2012 9

Hiện nay, endoxylanase được phân loại chủ yếu dựa trên thông tin gen mã

hóa và phân tích cấu trúc. Phân tích mức độ tương đồng về trình tự gen mã hóa và

nhóm kỵ nước có thể phân chia endoxylanase thành 2 họ: họ 10 và họ 11, đều là họ

enzyme thủy phân liên kết glycoside [32].

Họ endoxylanase 10 có khối lượng phân tử tương đối cao và cấu trúc phức

tạp hơn so với họ endoxylanase 11 [32]. Các enzyme này có xu hướng hình thành

dạng oligo với mức độ polymer hóa thấp hơn [9] (Hình 1.4A).

Họ endoxylanase 11 có khối lượng phân tử thấp hơn so với họ endoxylanase

10, có xu hướng đặc hiệu hơn với cơ chất xylan và tạo ra các đoạn oligo dài hơn

(Hình 1.4B).

Hình 1.4: Cấu trúc của họ endoxylanase 10 (hình A) và 11 (hình B) [55]

Ngoài ra, endoxylanase thủy phân cơ chất xylan (hay endo-β-(1→4)-D-

xylanase [β-(1→4)-D-xylan xylano hydrolase]) còn được phân chia thành bốn loại,

bao gồm:

- Các endoxylanase thủy phân không giải phóng arabinose (I): các enzyme này

không phân cắt ở các điểm nhánh L-arabinosyl bắt đầu liên kết β-(1→4), vì thế sản

phẩm thủy phân chỉ tạo ra phần lớn là xylobiose và xylose. Chúng cũng có thể thủy

phân một lượng nhỏ xylo-oligosaccharide cũng như xylobiose.

- Các endoxylanase thủy phân không giải phóng arabinose (II): các enzyme

này không phân cắt các điểm nhánh α-(1→2) và α-(1→3) và vì thế sản phẩn thủy

A B


Khóa 2010 - 2012 10

phân chủ yếu gồm các xylo-oligosaccharide có kích thước lớn hơn xylobiose. Các

enzyme này không thủy phân xylotriose và xylobiose.

- Các endoxylanase thủy phân xylan có tạo thành arabinose (III): Các enzyme

này phân cắt mạch xylan ở các điểm nhánh và tạo ra sản phẩm chủ yếu là xylobiose,

xylose và arabinose.

- Các endoxylanase thủy phân xylan có tạo thành arabinose (IV): Các enzyme

này thủy phân xylan ở các điểm nhánh, tạo ra arabinose và các sản phẩm xylo-

oligosaccharide có kích thước trung gian [4].

Endoxylanase ở một số ngũ cốc như lúa mì, lúa mạch, lúa mạch đen và trong

những mô khác nhau của lúa mì thường có hoạt tính yếu [12, 46]. Sau khi nảy mầm,

các enzyme nội sinh endoxylanase thủy phân các tế bào nội nhũ vỏ, làm cho các

thành phần dự trữ tinh bột và các protein gluten có thể tiếp cận tới amylase và

protease.

Endoxylanase cũng được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm, côn trùng, ốc, động vật

giáp xác, tảo biển. Một số sinh vật này đã được ứng dụng trong sản xuất

endoxylanase công nghiệp, nghiên cứu, nhân bản các gen mã hóa cho endoxylanase.

Các tiêu chí quan trọng để lựa chọn endoxylanase bao gồm tính đặc hiệu cơ chất, độ

bền và phạm vi nhiệt độ và pH hoạt động của enzyme. Ví dụ, endoxylanase của

nấm thường hoạt động tốt nhất ở điều kiện acid (pH 3,5-5,5) và bền trong một phạm

vi pH rộng (pH 3,0-10,0), trong khi đó endoxylanase của vi khuẩn có pH tối ưu cao

hơn (pH 6,0-7,0) và có dải pH hoạt động hẹp hơn (pH 5,0-7,3). Endoxylanase của vi

khuẩn thông thường có nhiệt độ hoạt động tối ưu khoảng 40 - 50oC và thường được

tiết vào môi trường ngoại bào [16].

1.2.2. Các phương pháp tách chiết arabinoxylan

Arabinoxylan được phân chia thành 2 dạng: dạng có thể tan trong nước và

dạng không thể tan trong nước. Dựa vào tính tan của cấu trúc AX có 3 phương pháp

chính thường được sử dụng để tách chiết AX gồm: tách chiết bằng nước, tách chiết

bằng kiềm và tách chiết bằng enzyme.


Khóa 2010 - 2012 11

H nh 1.5: Sự phân loại arabinoxylan theo khả năng hòa tan [49]

Phương pháp tách chiết bằng nước dựa trên nguyên tắc: do các AX liên kết

với thành tế bào khá lỏng lẻo, dễ dàng bị phá vỡ vì thế có thể dùng nước để chiết

AX ra khỏi nguyên liệu [39]. Phương pháp có ưu điểm là tương đối đơn giản, dễ

dàng áp dụng để sản xuất AX ở quy mô nhỏ, không bị lẫn protein. Tuy nhiên nhược

điểm là hiệu suất thu hồi kém, không đem lại hiệu quả kinh tế cao khi sản xuất ở

quy mô công nghiệp.

Phương pháp chiết bằng kiềm: Phương pháp này thường được sử dụng để

chiết các AX không thể chiết được bằng nước, do chúng có liên kết chặt chẽ với

thành tế bào, có các tương tác liên kết cộng hóa trị và không cộng hóa trị với các

AX khác hoặc liên kết với các thành phần khác của tế bào như protein, lignin hoặc

cellulose [38]. Rất nhiều các liên kết trong số đó không bền với kiềm, do đó AX có

thể được tách chiết bằng phương pháp sử dụng kiềm như Ba(OH)2, KOH, NaOH,

trong đó Ba(OH)2 được sử dụng phổ biến nhất vì sau khi tách chiết không bị lẫn β-

glucan như hai loại kiềm còn lại [27, 29]. Phương pháp có ưu điểm là hiệu quả tách

chiết AX cao, tuy nhiên sản phẩm AX sau tách chiết tồn tại trong môi trường kiềm,


Khóa 2010 - 2012 12

cần có bước loại bỏ kiềm, nếu loại bỏ không hết có thể gây ảnh hưởng tới hoạt tính

của sản phẩm.

Phương pháp tách chiết bằng enzyme: Ngoài phương pháp tách chiết bằng

kiềm, các AX không thể chiết được bằng nước còn có thể được chiết bằng cách sử

dụng enzyme cắt nhỏ mạch AX, làm giảm khối lượng phân tử AX, tăng khả năng

hòa tan của AX trong nước. Trong các nghiên cứu tìm phương pháp tách chiết AX

bằng enzyme, enzyme 1,4-endoxylanase được sử dụng rất phổ biến. Enzyme này sẽ

cắt ngẫu nhiên liên kết β-1,4-xylan trong các cấu trúc AX mạch dài, giải phóng ra

những phân tử AX tan được trong nước (Hình 1.6) [27, 28].

Hình 1.6: Vị trí hoạt động của endoxylanase [65]

Phương pháp tách chiết bằng enzyme có ưu điểm cho hiệu quả tách chiết

cao, thu hồi được những dạng cấu trúc không chiết được trong nước, sản phẩm thu

hồi an toàn, không gây tác dụng phụ. Tuy vậy, phương pháp này có nhược điểm về

thời gian tách chiết kéo dài, thời gian ủ enzyme có thể lên tới 24 giờ.

1.3. Các nghiên cứu định tính và định lượng arabinoxylan

Do AX có kích thước và những khác nhau nhất định trong cấu trúc, nên cho

đến nay chưa có nghiên cứu nào chỉ ra được phương pháp định tính và định lượng

AX trực tiếp không thông qua quá trình thủy phân AX thành các đường đơn. Có

nhiều phương pháp thủy phân AX khác nhau như thủy phân bằng acid HCl,

H2SO4… thủy phân bằng enzyme xylanase. Dựa trên sự định tính và định lượng các


Khóa 2010 - 2012 13

sản phẩm sau khi thủy phân AX có thể suy ra hàm lượng và khẳng định sự có mặt

của AX có trong mẫu nghiên cứu.

1.3.1. Thủy phân arabinoxylan thành các monosaccharide

Thủy phân arabinoxylan bằng enzyme xylanase: Khung đường xylan của

arabinoxylan có thể được thủy phân bởi nhóm các enzyme có khả năng cắt các liên

kết β-(1→4) glycoside giữa các β-D-Xylp. Điển hình là endo-1,4-β-D-xylanase (EC

3.2.1.8), enzyme này có khả năng cắt ngẫu nhiên giữa khung đường tạo thành hỗn

hợp các oligosaccharide và đường đơn. Sản phẩm oligosaccharide ngắn nhất thu

được sau phản ứng là α-L-Araf-(13)-β-D-Xylp-(14)-D-Xylp (A3X) [7].

Bên cạnh các enzyme endo-1,4-β-D-xylanase còn có các enzyme có khả

năng thủy phân khung đường xylan từ các đầu tận cùng hay còn được gọi là các

exo-1,4-β-D-xylosidase (EC 3.2.1.37). Chúng có tác dụng giải phóng các đơn phân

xylose từ các đầu không khử của XOS, nhưng hiệu quả phản ứng giảm dần theo độ

dài chuỗi XOS và hoạt động của chúng bị ức chế bởi các chuỗi bên α- L-Araf [6].

Hình 1.7: Vị trí hoạt động của endo-1,4-β -D-xylanase trên phân tử arabinoxylan

Thủy phân arabinoxylan bằng các phương pháp khác

Arabinoxylan có thể được thủy phân bằng HCl ở 100oC trong 4 giờ, thủy

hoặc phân bằng acid formic ở 100oC trong 30 phút, kết hợp với thủy phân bằng acid

sulfuric trong 2-4 giờ [18, 35, 57].


Khóa 2010 - 2012 14

1.3.2. Phân tích định tính arabinoxylan

Các nghiên cứu về định tính arabinoxylan thường gián tiếp định tính các

đường đơn arabinose và xylose sau khi thủy phân hoàn toàn arabinoxylan.

Kubuta và tập thể [33] đã sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) để

khẳng định sự có mặt của xylose và các oligoxylose và hiệu quả của các phản ứng

thủy phân xylan bằng các enzyme xylanase được tách từ vi khuẩn Aeromonas

caviae, sử dụng hệ dung môi n-butanol : acid axetic : H2O với tỷ lệ 2:1:1, hiện màu

ở 100oC bằng dung dịch acid sulfuric có 99,5% ethanol với tỷ lệ 1:1. Đây là một

phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và cho các kết quả trực quan, dễ quan sát. Hiện

nay, phương pháp này vẫn được sử dụng trong các nghiên cứu định tính xylan và

arbinoxylan như trong các nghiên cứu của Rantanen và tập thể [45], Pastell và tập

thể [42], Garófalo và tập thể [26] đã thủy phân AX trong bột mì thành các

monosaccharide và được chạy sắc ký bản mỏng với hệ dung môi MeOH : CHCl3 :

C3H6O : NH4OH với tỷ lệ 42:17:25:17 và hiện màu bằng dung dịch orcinol 0,2% và

EtOH : H2SO4 tỷ lệ 90:10 ở 110oC trong 2 phút. Tỷ lệ arabinose/xylose được xác

định bằng phương pháp sắc ký khí sau khi AX được thủy thân và được chuyển

thành alditol acetate.

Một số tác giả khác đã và đang nghiên cứu nhằm tạo ra kháng thể đa dòng

nhận biết liên kết β (1→4) xylan và kháng thể đơn dòng nhận biết các vị trí khác

trên mạch xylan được thay thế bởi phân tử arabinose [40].

1.3.3. Phân tích định lượng arabinoxylan

Hiện nay có một số phương pháp khác nhau để định lượng AX, chủ yếu

gồm phương pháp so màu, phương pháp sắc ký và một vài phương pháp khác.

Hàm lượng pentosan trong bột mì được định lượng bằng các phương pháp so

màu sử dụng orcinol-HCl [26] hoặc phloroglucinol [20, 48]. Mẫu được thủy phân

với HCl ở 100oC, sau đó được trung hòa bằng natri carbonate, sau cùng là xử lý với

nấm men để loại bỏ các đường có thể lên men. Dịch nổi được trộn với sắt chlorua


Khóa 2010 - 2012 15

và orcinol, sau đó được ủ trong bể nước sôi, được xử lý và đo độ hấp thụ ở bước

sóng 670 nm [56] hoặc được phân tích bằng phương pháp orcinol-HCl [26].

Phương pháp của Douglas [20] cho phép định lượng tương đối tỷ lệ phần

trăm về khối lượng của các đường pentosan trong một mẫu phân tích. Phương pháp

được tiến hành dựa trên nguyên tắc: các đường pentosan được chiết ra khỏi mẫu

phân tích bằng các acid như HCl sau đó được nhuộm màu bằng phloroglucinol. Tỷ

lệ phần trăm của pentosan được xác định bằng hiệu độ hấp thụ của mẫu ở bước

sóng 552 nm và độ hấp thụ ở bước sóng 510 nm sau khi được thủy phân và đối

chiếu với giá trị đo được đối với đường chuẩn D-xylose. Đây là phương pháp được

sử dụng tương đối phổ biến với ưu điểm đơn giản, tiết kiệm thời gian và chi phí.

Hiện nay một số hệ thống bán tự động đã được phát triển dựa trên phương pháp này

với ưu điểm có thể điều khiển tự động các thành phần của phản ứng và phân tích kết

quả trên máy tính điện tử [48]. Ngoài ra các đường pentose có thể được nhuộm màu

bằng orcinol 1% pha trong cồn tuyệt đối thay thế cho phloroglucinol. Kết quả được

xác định bằng hiệu chỉ số hấp thụ ở bước sóng 670 nm và độ hấp thụ ở bước sóng

580 nm rồi so sánh với giá trị đo được đối với đường chuẩn xylose [21, 26, 43]. Cải

tiến phương pháp của Douglas để có thể định lượng được cả AX tổng số và AX

không hòa tan, Finnie và tập thể [23] đã hòa tan mẫu vào nước, mẫu sau đó được

vortex, dịch nổi được sử dụng để định lượng AX tổng số, phần mẫu còn lại được

chiết nhiều lần để thu AX không tan. Các mẫu sau đó sẽ được định lượng theo

phương pháp của Douglas.

Phương pháp sắc ký khí dựa trên sự thủy phân và khử nước của các đường

pentosan tạo thành furfurl và được chiết với dibutylether [25]. Các đường pentose

đã thủy phân có thể được chuyển hóa thành alditol acetate [22] hoặc được chuyển

thành trimethylsilyl ester [8] và sau đó được định lượng nhờ bộ phận phát hiện của

máy [56]. Revanappa và tập thể đã thủy phân AX, sau đó xử lý với acid

trifluoroacetic 2N [58] hoặc bằng methanolysis [54] và được cho qua cột sắc ký khí

HP-5 (Agilent Technologies) trong điều kiện thay đổi nhiệt độ theo chu trình

150oC-5 phút; 260

oC-2 phút trong 60 phút. Sắc ký khí có thể dùng để định tính và


Khóa 2010 - 2012 16

định lượng các đường bằng cách so sánh thời gian lưu giữ của các mẫu với các

đường chuẩn được pha với nồng độ nhất định.

Phương pháp sắc ký trao đổi ion kết hợp với sự phát hiện các ion trong dung

dịch xung đẩy (IEC-PAD: Ion Exchange Chromatography – Pulsed Amperometric

Detection): trong phương pháp này, các polysaccharide được thủy phân hoàn toàn

thành xylose, arabinose, galactose, sau đó được phân tích bằng sắc ký trao đổi ion

sử dụng cột Carbopac 1 (Dionex Corp.) với pha động là NaOH 1 mM và bộ phận

phát hiện xung đẩy. Sự ảnh hưởng của glucose được loại bỏ bằng cách chuyển

glucose thành acid gluconic nhờ enzyme glucose oxidase. Tuy vậy, để loại bỏ acid

gluconic, cột sắc ký phải được rửa kỹ với NaOH 500 mM trước khi được cân bằng

với NaOH 1 mM. Để duy trì sự phát hiện với độ nhạy cao, dòng chảy qua cột cần

được trộn với NaOH 250 mM trước khi cho qua bộ phận phát hiện hóa điện tử. Các

tác giả đã thực hiện một số cải tiến so với phương pháp của Houben: pha động sử

dụng NaOH 15 mM có thể nâng cao độ nhạy của detector, cho phép định lượng

chính xác mà không cần bổ sung thêm NaOH; xylose và galactose có khả năng hòa

tan tốt khi glucose ở nồng độ cao mà không cần loại bỏ enzyme glucose oxidase,

hơn nữa có thể tránh được giai đoạn rửa cột với gradient nồng độ NaOH 500 mM

[56].

Các phương pháp định lượng trên có một số nhược điểm, do trong cấu trúc tự

nhiên của các pentosan không có chứa các nhóm mang màu, vì thế rất khó để phát

hiện và định lượng được ở nồng độ thấp nếu sử dụng các hệ thống phát hiện bình

thường. Hầu hết các cột HPLC pha đảo đều không lưu giữ và phân tích pentose một

cách đầy đủ, vì thế để duy trì sự phân tích giữa glucose, xylose và giữa glucose,

galactose, cần phải điều chỉnh nồng độ NaOH thích hợp. Tuy vậy, sử dụng phương

pháp IEC-PAD rất lý tưởng để định lượng các pentosan trong bột mì do có ưu điểm

là độ nhạy cao, không cần phải chuyển hóa chất phân tích thành các chất khác, kết

quả phân tích thành phần cụ thể, rõ ràng. Trong khi với phương pháp so màu, kết

quả dễ bị ảnh hưởng bởi các chất như glucose, không cho được kết quả cụ thể thành


Khóa 2010 - 2012 17

phần các đường đơn, còn phương pháp sắc ký khí lại có độ nhạy không cao, cần

thiết phải chuyển hóa chất phân tích thành chất trung gian khác [56].

Ngoài ra, để phân tích các đường mono, oligo là sản phẩm của các phản ứng

thủy phân AX có thể sử dụng các phương pháp sắc ký khác như sắc ký lỏng cao áp.

Trong nghiên cứu của Bataillon và tập thể [5], đường đơn xylose, arabinose và

glucose trong mẫu AX sau khi được thủy phân được chạy qua cột sắc ký Biorad

Aminex column HPX-87H, rửa chiết bằng acid sulfuric 5 mM. Zheng và tập thể

[58] đã định tính và định lượng các monosaccharide cấu tạo nên AX bằng pháp sắc

ký trao đổi ion cao áp (HPAEC), hàm lượng đường không phải cellulose được xác

định bằng tổng hàm lượng các monosaccharide đo được với hệ số nghịch đảo của

pentose (0,88) hoặc hexose (0,9) so với hàm lượng polymer. Khi đó hàm lượng AX

được tính theo công thức 0,88 x (% arabinose + % xylose). Khối lượng phân tử của

AX được xác định bằng sắc ký lọc rây phân tử cao áp (HPSEC). Cerning và tập thể

[11] đã định lượng pentosan tổng số trong ngũ cốc và các sản phẩm ngũ cốc.

Pentosan được chuyển thành furfural bằng cách sử dụng HCl 4,15 N và được phân

tách bằng chưng cất hơi nước. Phương pháp này có ưu điểm: thủy phân hoàn toàn

pentosan thành pentose và sau đó được chuyển thành furfural, sự chưng cất diễn ra

không cần sử dụng trực tiếp nhiệt của môi trường phản ứng. Phản ứng định lượng

furfural được thực hiện dựa trên phản ứng màu của aniline acetate và được đo ở

bước sóng 530 nm. Nhược điểm của phương pháp là tính kém bền của phức màu

aniline furfural nếu không sử dung dung dịch đệm thích hợp để làm bền màu của

phản ứng. Ngoài ra furfural có thể được định lượng khi có mặt lượng lớn hydroxy

methyl furfural (HMF). Acid uronic và glucuronic không ảnh hưởng đến 10% nồng

độ pentosan tổng số. Englyst và Cummings [21] đã thủy phân polysaccharide bằng

acid sulfuric 2N ở 100oC trong 2 giờ. Các đường đơn sau đó được chuyển thành

aldidol acetate và được phân tích bằng phương pháp sắc ký khí lỏng. Hàm lượng

AX được tính bằng tổng arabinose và xylose, trong đó arabinose được thủy phân từ

arabinogalactan được ước lượng từ hàm lượng galactose với tỷ lệ


Khóa 2010 - 2012 18

arabinose/galactose là 0,7. AX sau đó được phân tích bằng sắc ký HPSEC sử dụng

hai cột Shodex OH-pak SB HQ 804 và 805 [18, 35].

1.4. Các nghiên cứu tinh sạch và xác định khối lượng phân tử của

arabinoxylan

Arabinoxylan được tạo ra từ ngũ cốc có khối lượng phân tử thay đổi phụ

thuộc vào phương pháp xác định khối lượng phân tử. Các nghiên cứu đã cho thấy

AX của lúa mì được chiết bằng nước có khối lượng phân tử khoảng 65-66 kDa khi

được phân tích bằng phương pháp lắng kết tủa, trong khi đó nếu phân tích bằng

phương pháp sắc ký lọc gel, khối lượng phân tử lớn hơn nhiều từ 800-5.000 kDa,

70-1.000 kDa. AX của lúa mạch đen có khối lượng phân tử khoảng 519-770 kDa

khi phân tích bằng phương pháp sắc ký lọc gel cao áp [31]. Vì thế để xác định chính

xác khối lượng phân tử của AX là điều không dễ dàng. Phương pháp phổ biến nhất

được sử dụng trong các nghiên cứu trên thế giới là phương pháp HPSEC [18, 53,

57].

Dervilly và tập thể [18] đã tinh sạch AX hòa tan trong nước từ dịch chiết thô

bằng cách xử lý với enzyme bền nhiệt α-amylase và protease để loại bỏ tinh bột và

protein và được tủa hai lần với ethanol 80% rồi xử lý với ethanol 100% và acetone

trước khi được sấy khô. AX sau đó được phân đoạn theo các nồng độ ethanol khác

nhau từ 20 đến 70%, và được xử lý với enzyme lichenase, β-glucosidase và

amyloglucosidase để loại bỏ các β-glucan và tinh bột còn sót lại. Các phân đoạn tủa

cồn được xử lý và rửa chiết qua cột Sephacryl S500 HR. Shiiba và tập thể [52] đã

sử dụng cột sắc ký DEAE-Sepharose CL-6B để tinh sạch hemicellulose hòa tan

trong nước, mẫu qua cột được thẩm tích trong đệm Tris-HCl 100 mM trước khi

được sắc ký qua cột Sephacryl S-200. Khối lượng phân tử của AX cám mì được xác

định bằng hệ thống SE-HPLC với cột Waters Ultrahydrogel 1000 và hệ các chất

chuẩn của Shodex có khối lượng phân tử khác nhau. Rao và tập thể [53] đã tinh

sạch polysaccharide qua cột Sepharose CL-4B, sau đó mẫu được cho qua cột E-

1000, và xác định khối lượng phân tử bằng phương pháp HPSEC.


Khóa 2010 - 2012 19

Watanabe và tập thể [57] đã nghiên cứu AX được tách từ vỏ trấu của lúa gạo,

AX được tinh sạch qua cột lọc gel Sepharose CL-6B và rửa chiết với đệm NaOH

0,5 M, sau đó AX được kiểm tra độ sạch và sự đồng nhất bằng phương pháp siêu li

tâm và điện di vùng. Kết quả thu được AX có kích thước khoảng 15 kDa. Kích

thước của các oligosaccharide sau khi được thủy phân bằng endoxylanase được

kiểm tra bằng phương pháp sắc ký lọc gel sử dụng cột Bio-Gel P-2. Các phân đoạn

rửa chiết được làm khô và sau đó được kiểm tra bằng sắc ký giấy. Dervilly và tập

thể [43] đã dùng 2 cột sắc ký Shodex OH-pax SB HQ 804 và Shodex OH-pax SB

HQ 805, rửa chiết bằng dung dịch NaNO3 50 mM, NaN3 0,02 % [18] hoặc sử dụng

các cột OH-pax 806 M, OH-pax SB-6 để xác định khối lượng phân tử của mẫu bằng

phương pháp HPSEC.


Khóa 2010 - 2012 20

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu

2.1.1. Chế phẩm arabinoxylan

Chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo dùng cho các thí nghiệm được

cung cấp bởi nhóm nghiên cứu thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ

Enzym và Protein (là sản phẩm của đề tài ĐT.02.11/CNSHCB, Bộ Công thương do

TS. Nguyễn Thị Vân Anh chủ trì).

2.1.2. Hoá chất

Arabinoxylan từ bột mỳ, D-Xylose Kit và Arabinan Kit được mua từ hãng

Megazyme. Bản mỏng sắc ký bọc silica được mua từ hãng Merck. Gel Sephadex

được mua từ hãng Sigma. Các enzyme Ultraflo M, Ultraflo L và Porzyme được mua

từ hãng Novozymes. Các hoá chất còn lại đều đạt độ tinh khiết dùng cho nghiên

cứu.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Thủy phân arabinoxylan thành các monosaccharide

Thủy phân arabinoxylan bằng acid

Khi được xử lý với HCl hoặc H2SO4, arabinnoxylan được thủy phân hoàn

toàn thành dạng đường đơn:

Arabinoxylan → arabinose + xylose

Hàm lượng D-xylose và L-arabinose có trong mẫu sau khi được thủy phân

được xác định theo kit D-xylose và kit Arabinan của hãng Megazyme.

Quy trình:

HCl đặc hoặc H2SO4 2 M được bổ sung vào 100 μl mẫu dạng dịch lỏng để

đạt đến nồng độ HCl là 1,3 M hoặc 0,5 M đối với thủy phân bằng H2SO4. Sau đó

dịch mẫu được thủy phân ở 100oC trong 3 giờ và để nguội đến nhiệt độ phòng. Dịch

mẫu được trung hòa về pH 7,0 bằng cách bổ sung theo thứ tự NaOH 1,3 M hoặc


Khóa 2010 - 2012 21

NaOH 0,5 M, sau đó ly tâm 5.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, dịch

trên tủa được hút nhẹ nhàng và chuyển sang ống eppendorf mới để dung cho phân

tích đường tạo thành.

Thủy phân arabinoxylan bằng enzyme xylanase

Sử dụng cùng số đơn vị hoạt độ (khoảng 0,2 U cho 1mg mẫu AX) của mỗi

một chế phẩm xylanase để thủy phân arabinoxylan trong 24 giờ, trong đệm

CH3COONa 50 mM, pH 5. Dịch mẫu sau khi thủy phân được bất hoạt enzyme ở

100oC trong 10 phuts, sau đó xác định lượng xylose và arabinose tạo thành bằng kit

của Megazyme

2.2.2. Phân tích định lượng arabinoxylan bằng kit D-xylose và kit Arabinan

Nguyên tắc:

Dựa vào phương pháp đo quang phổ để định lượng xylose và arabinose tổng

số có trong mẫu trước và sau khi được xử lý với HCl hoặc H2SO4, từ đó xác định

được hàm lượng AX trong các mẫu.

2.2.2.1. Xác định hàm lượng D-xylose có trong arabinoxylan sau khi đươc thủy

phân bằng D-xylose kit [60].

Nguyên tắc:

- Sự chuyển đổi qua lại các cấu hình dạng α- và β của D-xylose được xúc tác bởi

enzyme xylose mutarotase (XMR)

α-D-Xylose → β-D-xylose

- β-D-xylose bị oxi hóa bởi NAD+

thành acid D-xylonic khi có sự hiện diện của

β-xylose dehydrogenase (β-XDH) tại pH 7,5

β-D-Xylose + NAD+ → acid D-xylonic + NADH + H

+

Hàm lượng NADH tạo thành tỷ lệ với hàm lượng xylose tổng số có trong

mẫu. Trong đó, hàm lượng NADH tạo thành được đo bằng sự tăng hấp thụ ở bước

sóng 340 nm, từ đó tính toán được hàm lượng xylose tương ứng có trong mẫu tham

gia phản ứng.


Khóa 2010 - 2012 22

Quy trình:

Thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 2.1:

Bảng 2.1: Thành phần của phản ứng định lượng D-xylose bằng

D-XYLOSE KIT

Thể tích hút Dung dịch Blank Dung dịch mẫu

Nước cất(ở 25°C)

Mẫu

Dung dịch I ( đệm TE)

Dung dịch II (NAD+/ATP)

Dung dịch III (hexokinase)

400 µl

20 µl nước cất

80 µl

80 µl

4 µl

400 µl

20 µl

80 µl

80 µl

4 µl

Trộn đều, đo A340 của dung dich (A1) sau ít nhất 5 phút và bắt đầu phản ứng

khi thêm:

Dung dịch IV (XDH/XMR) 10 µl 10 µl

Trộn đều, đo giá trị A340 của dung dịch (A2) khi kết thúc phản ứng (6 phút)

Sản phẩm phản ứng được đo ở bước sóng 340 nm. Thể tích phản ứng cuối

cùng: 594 µl, đối chứng dương là D- xylose có nồng độ 0,25 mg/ml, thể tích mẫu và

nước có thể thay đổi nhiều hơn hoặc ít hơn tùy thuộc vào nồng độ của mẫu cần phân

tích

Hàm lượng D-xylose được tính toán như sau:

C = x ΔAxylose (g/L )

Trong đó

V = thể tích cuối cùng (ml)

MW = khối lượng phân tử của D-xylose (g/mol)

ε = Hệ số hấp thụ quang của NADH tại 340 nm


Khóa 2010 - 2012 23

= 6300 (l x mol-1

x cm-1

)

d = Độ dày cuvet (cm)

v = thể tích mẫu (mL)

Do đó, với thể tích mẫu là 20 µl:

Cxylose = x ΔAxylose = 0,7076 x ΔAD-xylose

Ta có:

ΔA xylose của Arabinoxylan = ΔAxylose tổng – ΔAxylose tự do

= ΔAxylose của D2 – ΔAxylose = ΔAD*

Cxylose của arabinoxylan (g/L) = 0,7076× ΔAD* x hệ số pha loãng (nếu có)

C D-xylose của arabinoxylan (g/100g) = Cxylose của arabinoxylan (g/L)x100/trọng lượng mẫu (g/L)

2.2.2.2. Xác định hàm lượng L-arabinose có trong arabinoxylan sau khi đươc

thủy phân bằng Arabinan kit [59]

Nguyên tắc:

- Sự chuyển đổi qua lại các cấu hình dạng α- và β của L- arabinose được xúc tác

bởi enzyme galactose mutarotase (GalMR)

α -L-Arabinose → β -L-arabinose

- β-L-arabinose bị oxi hóa bởi NAD+

thành acid D-arabinonic khi có sự hiện diện

của enzyme β -galactose dehydrogenase (β- GalDH).

β -L-Arabinose + NAD+ → acid L-arabinonic + NADH + H

+

Hàm lượng NADH tạo thành tỷ lệ với hàm lượng arabinose tổng số có trong

mẫu và được xác định thông qua giá trị A340.

Quy trình:

Thành phần phản ứng đo hàm lượng arabinose được trình bày ở bảng 2.2:


Khóa 2010 - 2012 24

Bảng 2.2: Thành phần của phản ứng định lượng L-arabinose bằng

ARABINAN KIT

Thể tích hút Dung dịch Blank Dung dịch mẫu

Nước cất (ở 25°C)

Mẫu

Đệm B (đệm acetate, pH 4.0)

Dung dịch 1 (Đệm Tris-HCl)

Dung dịch 2 (NAD+)

404 µl

20 µl nước cất

20 µl

40 µl

20 µl

404 µl

20 µl

20 µl

40 µl

20 µl

Trộn đều, đo A340 của dung dich (A1) sau ít nhất 3 phút và bắt đầu phản ứng

khi thêm:

Dung dịch 4 (β-GalDH + Gal-MR) 4 µl 4 µl

Trộn đều, ủ 40°C trong 10 phút. Đo A340 của dung dịch (A2) khi kết thúc phản

ứng.

Sản phẩm phản ứng được đo ở bước sóng: 340 nm. Thể tích phản ứng cuối

cùng là 508 µl, đối chứng dương là arabinose có nồng độ 0,5 mg/ml, thể tích mẫu

và thể tích nước có thể thay đổi nhiều hơn hoặc ít hơn tùy thuộc vào nồng độ của

mẫu cần phân tích.

Hàm lượng L-arabinose được tính toán như sau:

C = x ΔAarabinose (g/L )

Trong đó

V = thể tích cuối cùng (ml)

MW = khối lượng phân tử của L-arabinose (g/mol)

ε = Hệ số hấp thụ quang của NADH tại 340 nm

= 6300 (l x mol-1

x cm-1

)

d = Độ dày cuvet (cm)

v = Thể tích mẫu (mL)


Khóa 2010 - 2012 25

ΔA arabinose của Arabinoxylan = ΔAarabinose tổng số – ΔAarabinose tự do = ΔA*

Do đó, với thể tích mẫu là 20 μl, ta có:

Carabinose = (0,508 x 150,1 x ΔA arabinose) / (6300 x 1 x 0,02) (g/L)

= 0,6052 x ΔA (g/L) và nhân với hệ số pha loãng (nếu có)

2.2.3. Phân tích định tính arabinoxylan bằng phương pháp sắc ký bản mỏng

Nguyên tắc :

Sắc ký bản mỏng bao gồm lớp gel mỏng tráng trên bề mặt kính hoặc nhôm,

là pha cố định và hệ thống dung môi hay pha chuyển động được lựa chọn để tạo ra

sự phân tách các chất chấm trên bản gel. Do các chất di chuyển với tốc độ nhanh

chậm khác nhau nên chúng dần dần được tách ra khỏi nhau dưới dạng các vết trên

bản mỏng. Để đánh giá khả năng phân tách của từng chất trên bản sắc ký người ta

quan tâm đến giá trị Rf đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất trong hệ thống

sắc ký, được tính bằng tỉ số giữa khoảng cách mà chất đó di chuyển được khỏi vệt

xuất phát trên khoảng cách mà dung môi di chuyển được.

Rf =

Trong đó:

a: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử

b: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến vạch mức cuối cùng mà dung môi chạy đến

Kết quả phân tách các chất trên bản sắc ký có thể được hiển thị bằng các

phản ứng màu đặc trưng kèm theo việc so sánh với chất chuẩn. Khi việc phân tách

các chất trong hỗn hợp không rõ ràng, người ta có thể thay đổi thành phần và/ hoặc

tỷ lệ của các dung môi trong hỗn hợp dung môi sắc ký. Việc bổ sung các chất không

phân cực cũng như tăng tỷ lệ của chúng sẽ tạo điều kiện cho các chất ít phân cực

chạy nhanh hơn khỏi vạch xuất phát và ngược lại [1].

Quy trình:

Dùng pipet loại nhỏ hoặc dùng ống chấm sắc ký có chia vạch thể tích (5-10

μl) để hút mẫu và chấm lên các vị trí đã được đánh dấu trên bản gel. Bản gel sau khi


Khóa 2010 - 2012 26

chấm mẫu được đặt vào hệ thống bình sắc ký có nắp đậy, trong đó có chứa dung

môi hữu cơ. Mức dung môi luôn được giữ thấp hơn vạch xuất phát của mẫu. Dung

môi sẽ theo lớp gel để chạy ngược lên và mang theo các chất cần phân tích. Khi

vạch dung môi chạy đến gần mép trên của bản gel sắc ký thì phải làm ngừng quá

trình sắc ký. Bản gel được lấy ra, làm khô dung môi và sau đó có thể cho chạy lại

một vài lần tương tự, tùy thuộc vào sự tách bạch giữa các mẫu quan tâm [1]. Kết

quả phân tách các chất trên bản sắc ký được hiển thị bằng phản ứng màu đặc trưng

kèm theo việc so sánh với chất chuẩn là D-xylose và L-arabinose được mua từ hãng

Megazyme.

2.2.4. Tinh sạch và cô đặc mẫu bằng màng lọc có kích thước lỗ xác định

Nguyên tắc:

Màng lọc được cấu tạo dựa trên mạng lưới các polymer được liên kết chéo

tạo thành các lỗ. Các chất hòa tan có kích thước nhỏ sẽ di chuyển một chiều qua các

lỗ trên màng từ dung dịch có nồng độ cao đến dung dịch có nồng độ thấp cho đến

khi nồng độ cân bằng ở hai dung dịch. Vì thế sử dụng màng lọc có thể phân tách các

chất hòa tan trong dung dịch dựa trên kích thước hoặc khối lượng phân tử [62].

Quy trình:

Arabinoxylan dạng dịch lỏng được cho vào túi thẩm tích với màng lọc có

kích thước lỗ xác định, túi mẫu sau đó được cho vào cốc chứa nước cất đã được khử

trùng, được đặt lên máy khuấy từ và thẩm tích trong 1 ngày ở 4oC để loại muối và

các chất phân tử nhỏ khác. Mẫu trong túi sau đó được cô đặc bằng cách cho bay hơi

nước ở 4oC trong 1 ngày và thu lấy mẫu trong túi bảo quản ở -20

oC .

2.2.5. Đánh giá tỷ lệ và kích thước của arabinoxylan bằng phương pháp sắc ký

lọc gel

Nguyên tắc:

Sắc ký lọc gel bao gồm pha cố định là một loại gel có cấu tạo dạng mạng

lưới hay lỗ và kích thước của các lỗ rây này khác nhau tùy theo loại gel được sử


Khóa 2010 - 2012 27

dụng, còn pha chuyển động là một loại dung dịch đệm hay dung môi thích hợp. Các

chất khi đi qua hệ thống lọc gel sẽ được phân tách theo nguyên tắc, trong đó chất có

kích thước lớn ra trước, tiếp đến là chất có kích thước vừa và cuối cùng là chất có

kích thước nhỏ, là do chất có kích thước lớn không thể chui vào các hệ thống lỗ gel,

do đó khi đi qua phần kẽ hở giữa các hạt gel và ra nhanh hơn, các chất có kích

thước vừa sẽ có cơ hội chui vào các lỗ gel và do đó mất nhiều thời gian để chui ra.

Các chất có kích thước nhỏ dễ dàng chui vào lỗ gel và cơ hội chui vào các lỗ gel

cao nhất và thời gian đi qua hệ thống lọc gel lâu nhất nên được đẩy ra khỏi hệ thống

gel muộn nhất [1].

Dựa vào sắc ký lọc gel có thể đánh giá khối lượng phân tử tương đối của chất

với nguyên tắc: Logarit KLPT (logMw) của các chất tỷ lệ nghịch với hệ số Ve/Vo,

trong đó Ve là thể tích rửa chiết của chất sắc ký, Vo là thể tích trống của cột. Khi có

được một loạt các chất chuẩn với KLPT đã biết, người ta cho sắc ký qua cột để tính

ra giá trị Ve/Vo và lập đồ thị tương quan giữa logMw và Ve/Vo, từ đó với một chất

chưa biết KLPT nhưng biết được Ve khi đi qua cột thì có thể tính được KLPT của

chất đó [1] một cách tương đối.

Quy trình:

Gel đã trương nở được nhồi vào cột 1x 60 cm. Cột gel được cân bằng với

nước cất với thể tích tổi thiểu bằng 2 lần thể tích cột gel để tạo môi trường gel sắc

ký đồng nhất trong toàn bộ cột gel. Dextran xanh (2.000 kDa) được dùng để tính thể

tích trống Vo của cột. Sau khi cột gel được rửa sạch, từng dịch protein chuẩn được

nạp vào cột từ từ, đảm bảo bề mặt gel ổn định. Sau đó cho đệm chảy qua liên tục,

tốc độ dòng chảy đươc duy trì khoảng 20 ml/giờ, thu các phân đoạn vào các ống

riêng. Xác định hàm lượng protein mỗi phân đoạn để tính Ve của từng protein chuẩn

với cách tinh giống như tính Vo. Tính toán các giá trị logMw và Ve/Vo của các chất

chuẩn. Sau đó lập đồ thị tương quan giữa logMw và Ve/Vo với trục tung là giá trị

logMw và trục hoành là tỷ lệ Ve/Vo.


Khóa 2010 - 2012 28

Mẫu đã cô đặc được nạp vào cột với thể tích khoảng 1 ml với cách thức tiến

hành tương tự như đối với protein chuẩn. Khi bắt đầu cho mẫu lên cột thì cũng bắt

đầu tính thể tích mẫu chảy qua cột bằng cách tiến hành thu các phân đoạn vào từng

ống riêng. Các phân đoạn rửa chiết sau đó được xác định hàm lượng arabinoxylan

thông qua hàm lượng xylose và arabinose như quy trình được trình bày ở mục 2.2.2.

Biểu đồ của quá trình phân tách qua sắc ký lọc gel được thiết lập với trục tung là giá

trị độ hấp thụ ở 340 nm và trục hoành là các phân đoạn/thể tích rửa chiết.

Dựa trên giá trị Ve của các đỉnh sắc ký qua cột lọc gel của chế phẩm

arabinoxylan sau khi qua cột, tỷ lệ Ve/Vo của từng phân đoạn đỉnh sắc ký được tính

và giá trị Ve/Vo được đối chiếu này với đồ thị tương quan của các chất chuẩn sẽ suy

ra được giá trị logMw của AX ở phân đoạn đấy, từ đó có được giá trị KLPT tương

ứng một cách tương đối.

2.2.6. Xác định độ ẩm

Nguyên tắc:

Độ ẩm được xác định theo phương pháp sấy khô mẫu ở 105oC để làm bay

hơi hết hơi nước trong mẫu đến khối lượng không đổi. Mẫu được cân khối lượng

trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong mẫu.

Quy trình:

Hộp nhôm dùng để đựng mẫu được sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 105oC đến

khối lượng không đổi, dùng cân phân tích cân xác định trọng lượng của hộp cân mo

(g). Sau đó cho mẫu vào hộp nhôm, đem cân phân tích, ghi nhận khối lượng hộp và

mẫu là m1 (g). Hộp mẫu được đặt vào tủ sấy đang ở nhiệt độ 105oC, sau 1 ngày thì

lấy hộp mẫu ra để nguội, cân và sau đó để hộp vào tủ sấy tiếp, cứ sau 1 ngày thì hộp

được cân lại lần nữa cho đến khi khối lượng hộp mẫu giữa các lần sấy khác nhau

không quá 0,01%, khối lượng m2 (g) được ghi lại.

Công thức tính độ ẩm theo phần trăm:

W = (m1 – m2).100 / (m1 – mo) (%)


Khóa 2010 - 2012 29

Trong đó:

mo: Khối lượng hộp sau khi được sấy đến khối lượng không đổi.

m1: Khối lượng hộp và mẫu trước khi sấy.

m2: khối lượng hộp và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi.

2.2.7. Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl [2]

Nguyên tắc:

Phương pháp này dựa trên cơ sở định lượng nitơ protein, từ đó tính ra lượng

protein bằng cách nhân với hệ số 6,25 (dựa trên nguyên tắc trong protein nitơ chiếm

16%). Dưới tác dụng của H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất hữu cơ có chứa

nito (N) bị phân hủy và bị oxy hóa đến CO2 và nước, còn nitơ chuyển thành

ammoniac và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối ammonium sulfate.

Quá trình được tiến hành theo các bước sau:

Vô cơ hóa nguyên liệu:

R-CHNH2-COOH + H2SO4 CO2 + H2O + (NH4)2SO4

Cất đạm

(NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2NH3 ↑ +2 H2O

Phản ứng xảy ra trong bình hứng:

NH3+ H2SO4 (NH4)2SO4 + H2SO4 dư (ở bình hứng)

Chuẩn độ H2SO4 dư ở bình hứng bằng NaOH có nồng độ 0,1 N, từ đó tính

được hàm lượng đạm có trong mẫu nghiên cứu.

2.2.8. Xác định hàm lượng asen

Nguyên tắc:

Hàm lượng asen có thể được xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau

như phương pháp so màu với thuốc thử bạc dietyldithiocarbanate (TCVN 5780-

1994), phương pháp dựa trên nguyên tắc cất asin (AsH3) ra khỏi hỗn hợp rồi phản

ứng với thuốc thử bạc dietyldithiocacbanat trong pyridine cho sản phẩm có màu đỏ

nâu và được so màu ở bước sóng 520 nm [63]; hoặc sử dụng phương pháp đo phổ

hấp thụ nguyên tử giải phóng hydro (TCVN 7770-2007) [64].


Khóa 2010 - 2012 30

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Xây dựng quy tr nh định tính và định lượng arabinoxylan

Để xây dựng quy trình phân tích định tính và định lượng arabinoxylan,

chúng tôi đã sử dụng arabinoxylan thương mại có nguồn gốc từ bột mì được mua từ

hãng Megazyme làm mẫu chuẩn để tối ưu các bước của quy trình định lượng. Sau

đó, chúng tôi thử nghiệm quy trình này đối với chế phẩm AX được tạo ra từ cám

gạo.

3.1.1. Thủy phân arabinoxylan bằng acid và định tính, định lượng

arabinoxylan

Đối với chế phẩm arabinoxylan cám gạo ở dạng bột: 1 g mẫu được thủy phân

bằng acid HCl 1,3 M hoặc acid H2SO4 0,5 M ở 100oC trong thời gian 180 phút, sản

phẩm sau khi thủy phân được làm nguội về nhiệt độ phòng và được trung hòa về pH

7,0 bằng NaOH có nồng độ tương đương với nồng độ acid đã sử dụng. Dung dịch

sau khi trung hòa được ly tâm loại muối ở 5.000 vòng/phút trong 10 phút trước khi

được định lượng D-xylose và L-arabinose bằng kit của Megazyme (mục 2.2.2).

Đối với chế phẩm arabinoxylan ở dạng dịch lỏng: bổ sung HCl đặc (hoặc

HCl ở nồng độ cao hơn 1,3 M) hoặc H2SO4 nồng độ 2 M vào 100 μl mẫu để đạt

nồng độ cuối cùng của HCl là 1,3 M và H2SO4 là 0,5 M. Dung dịch sau đó cũng

được thủy phân ở 100oC trong 180 phút và trung hòa bằng NaOH giống như quy

trình định lượng với mẫu dạng bột. Hàm lượng arabinoxylan được tính bằng tổng

hàm lượng xylose và arabinose nhân với hệ số 0,88 [17].


Khóa 2010 - 2012 31

ảng 3.1: Kết quả định lượng D-xylose và L-arabinose sau khi thủy phân

arabinoxylan thương mại bằng acid

Acid ∆A340

*

D-xylose

Nồng độ

xylose

(mg/ml)

Tỷ lệ xylose

trong AX

(%)

∆A340 *

L-arabinose

Nồng độ

arabinose

(mg/ml)

Tỷ lệ

arabinose

trong AX (%)

HCl 0,52 0,60 60 0,59 0,360 36,0

H2SO4 0,49 0,56 56 0,49 0,296 29,6

*) Mẫu được đo 3 lần và tính toán giá trị ∆A340 trung bình

Kết quả định lượng D-xylose và L-arabinose sau khi thủy phân arabinoxylan

thương mại bằng acid ở bảng 3.1 cho thấy, arabinoxylan (thương mại) sau khi được

thủy phân bằng acid HCl có chứa 60% xylose, 36% arabinose, còn thủy phân bằng

H2SO4 thì chứa 56% xylose và 29,6% arabinose. Tỷ lệ xylose và arabinose thu được

phù hợp với một số đặc trưng của AX của bột mì (có thành phần khoảng 62% là

đường xylose, còn lại là đường arabinose [59, 60]). Như vậy, hàm lượng AX được

xác định bằng cách thủy phân thành các đường đơn xylose và arabinose bằng acid

HCl và H2SO4 là 96% và 85,6%, chứng tỏ HCl cho hiệu suất thủy phân tốt hơn

H2SO4. Vì thế, chúng tôi đã sử dụng quy trình này để định lượng AX có trong chế

phẩm tạo ra từ cám gạo.


Khóa 2010 - 2012 32

ảng 3.2: Kết quả định lượng D-xylose sau khi thủy phân chế phẩm

arabinoxylan tạo ra từ cám gạo bằng acid

Phương pháp thủy phân ∆A340 *

Nồng độ xylose

(mg/ml)

Hàm lượng xylose

(mg/g mẫu)

HCl 0,52 1,68 8,40

H2SO4 0,29 1,64 8,21


ảng 3.3: Kết quả định lượng L-arabinose sau khi thủy phân chế phẩm

arabinoxylan tạo ra từ cám gạo bằng acid

Phương pháp thủy

phân

∆A 340* Nồng độ arabinose

(mg/ml)

Hàm lượng arabinose

(mg/g mẫu)

HCl 0,63 1,73 8,65

H2SO4 0,29 1,40 7,02


Kết quả định lượng D-xylose và L-arabinose trong chế phẩm AX tạo ra từ

cám gạo (bảng 3.2 và 3.3) cho thấy hàm lượng xylose và arabinose trong 1g chế

phẩm AX được thủy phân bằng HCl cao hơn so với được thủy phân bằng H2SO4.

Do mỗi đơn phân xylose, arabinose có khối lượng phân tử là 152 Da, khi liên

kết với nhau hình thành cấu trúc AX thì bị loại đi một phân tử nước (18 Da), vì vậy

để xác định hàm lượng AX khi đã biết hàm lượng của các đường đơn xylose và

arabinose, chúng tôi sử dụng hệ số 0,88 (134/152 = 0,88). Kết quả chúng tôi thu

được hàm lượng của AX theo phương pháp thủy phân bằng HCl và H2SO4 tương

ứng là 15 mg/g mẫu và 13,4 mg/g mẫu (bảng 3.4).


Khóa 2010 - 2012 33

Bảng 3.4: Hàm lượng arabinoxylan có mặt trong chế phẩm arabinoxylan

tạo ra từ cám gạo

Phương pháp

thủy phân


(mg/g mẫu)


(mg/g mẫu)

Hàm lượng AX

(mg/g mẫu)*

HCl 8,40 8,65 15,0

H2SO4 8,21 7,02 13,4

(*): Hàm lượng arabinoxylan được tính bằng tổng lượng xylose và arabinose nhân với hệ số 0,88

Như vậy, hàm lượng AX được xác định theo phương pháp thủy phân bằng

acid HCl cao hơn so với thủy phân bằng H2SO4, như vậy, chứng tỏ hiệu suất thủy

phân AX bằng HCl là tốt hơn.

Để khẳng định thêm sự có mặt của D-xylose và L-arabinose trong chế phẩm

AX sau khi được thủy phân bằng acid, chúng tôi tiến hành phân tích các sản phẩm

sau khi thủy phân bằng phương pháp sắc ký bản mỏng trên gel silica.

Các mẫu sau khi được thủy phân bằng acid được trung hòa về pH 7,0 bằng

dung dịch NaOH 1,3M hoặc NaOH 0,5 M (tùy thuộc vào acid sử dụng để thủy phân

AX là HCl 1,3 M hay H2SO4 0,5 M), sau đó được làm khô và hòa tan trở lại trong

methanol 100%, và được chấm lên bản sắc ký (thể tích mỗi mẫu chấm 10-20 µl), sử

dụng hệ dung môi n-butanol : acid axetic : H2O (tỷ lệ 3:1:1). Bản sắc ký sau đó

được làm khô và được chạy thêm một lần nữa trước khi được nhuộm màu bằng

dung dịch aniline phthalate, hiện màu ở 100oC trong 10 phút và quan sát kết quả.


Khóa 2010 - 2012 34

1 2 3 4 5

Hình 3.1: Kết quả sắc ký bản mỏng chế phẩm chứa arabinoxylan từ cám gạo

sau khi được thủy phân bằng acid

Đường chạy 1: Đường chuẩn D-xylose

Đường chạy 2: Đường chuẩn L-arabinose

Đường chạy 3: Chế phẩm được thủy phân bằng acid HCl

Đường chạy 4: Chế phẩm được thủy phân bằng acid H2SO4

Đường chạy 5: Chế phẩm chưa thủy phân

Kết quả sắc ký bản mỏng sản phẩm thủy phân AX (hình 3.1) cho thấy chế

phẩm arabinoxylan được thủy phân bằng acid HCl và H2SO4 đều chứa D-xylose và

L-arabinose (Hình 3.1, đường chạy 3, 4). Tuy vậy cả hai mẫu đều vẫn còn lẫn sản

phẩm chưa thủy phân hoàn toàn, trong đó mẫu được thủy phân bằng H2SO4 có ít các

băng phụ hơn và phân tách các băng rõ nét hơn so với mẫu được thủy phân bằng

HCl. Chúng tôi đã thử nghiệm tăng thời gian thủy phân cũng như tăng nồng độ acid

tuy vậy hàm lượng D - xylose và L - arabinose tạo thành không tăng lên và sự phân

tách các băng trong sắc ký đồ cũng không được cải thiện hơn đáng kể. Kết quả này


Khóa 2010 - 2012 35

có thể được giải thích là do chế phẩm AX được tạo ra từ cám gạo còn bị lẫn một số

hợp chất khác.

3.1.2. Thủy phân arabinoxylan bằng enzyme xylanase và định tính, định lượng

arabinoxylan

Chúng tôi sử dụng chế phẩm enzyme xylanase thương mại là Ultraflo M,

Ultraflo L, Porzyme với cùng số đơn vị hoạt độ (khoảng 0,2 U/1 mg AX) để thủy

phân AX, cùng số đơn vị hoạt độ enzyme xylanase (khoảng 0,2 U/1 mg AX) để

thủy phân AX trong đệm CH3COONa, ở 50oC trong 24 giờ, sau đó xác định hàm

lượng xylose và arabinose tạo thành.

ảng 3.5: Kết quả định lượng D-xylose và L-arabinose sau khi thủy phân

arabinoxylan thương mại bằng enzyme xylanase

Enzyme ∆A340 *

D-

xylose

Nồng độ

xylose

(mg/ml)

Tỷ lệ xylose

trong AX

(%)

∆A340 *

L-

arabinose

Nồng độ

arabinose

(mg/ml)

Tỷ lệ

arabinose

trong AX (%)

Ultraflo M 0,40 0,570 57,0 0,30 0,182 18,2

Ultraflo L 0,44 0,622 62,2 0,46 0,278 27,8

Porzyme 0,42 0,594 59,4 0,49 0,300 30,0


Kết quả định lượng D-xylose và L-arabinose sau khi thủy phân arabinoxylan

thương mại bằng enzyme xylanase (bảng 3.5) cho thấy, trong ba enzyme xylanase đã

được sử dụng để thủy phân chế phẩm AX thương mại, Porzyme cho hiệu quả thủy

phân tốt nhất, thu được 59,4% AX thương mại là xylose, 30% là arabinose. Tỷ lệ

xylose và arabinose thu được tương đối phù hợp với một số đặc trưng của AX của

bột mì (có thành phần khoảng 62% là đường xylose, còn lại là đường arabinose [59,


Khóa 2010 - 2012 36

60]). Vì thế, chúng tôi đã lựa chọn enzyme này để xây dựng quy trinh định lượng

arabinoxylan tạo ra từ cám gạo.

Bảng 3.6: Kết quả định lượng D-xylose sau khi thủy phân chế phẩm

arabinoxylan tạo ra từ cám gạo bằng enzyme xylanase

Tên enzyme ∆A340 *

Nồng độ xylose

(mg/ml)


(mg/g mẫu)

Ultraflo M 0,21 1,49 7,45

Ultraflo L 0,24 1,70 8,50

Porzyme 0,23 1,63 8,15


Bảng 3.7: Kết quả định lượng L-arabinose sau khi thủy phân chế phẩm

arabinoxylan tạo ra từ cám gạo bằng enzyme xylanase

Tên enzyme ∆A 340*

Nồng độ arabinose

(mg/ml)


(mg/g mẫu)

Ultraflo M 0,19 1,15 5,75

Ultraflo L 0,25 1,51 7,55

Porzyme 0,27 1,63 8,15


Kết quả định lượng D-xylose và L-arabinose sau khi thủy phân chế phẩm

arabinoxylan tạo ra từ cám gạo (bảng 3.6, 3.7 và 3.8) cho thấy khi dùng chế phẩm

Ultraflo L và Porzyme để thủy phân AX, chúng tôi thu được hàm lượng AX tương

đương nhau (tương ứng 14,12 mg/g mẫu và 14,34 mg/g mẫu), trong khi đó sử dụng

chế phẩm Ultraflo M cho hàm lượng AX thấp hơn đáng kể (chỉ đạt 11,62 mg/g

mẫu).


Khóa 2010 - 2012 37

Bảng 3.8: Hàm lượng arabinoxylan trong chế phẩm tạo ra từ cám gạo được

thủy phân bằng enzyme

Tên enzyme Hàm lượng xylose

(mg/g mẫu)


(mg/g mẫu)

Hàm lượng AX

(mg/g mẫu)

Ultraflo M 7,45 5,75 11,62

Ultraflo L 8,50 7,55 14,12

Porzyme 8,15 8,15 14,34

So sánh kết quả định lượng AX khi dùng các enzyme xylanase thủy phân

(bảng 3.8) với kết quả định lượng AX khi được thủy phân bằng acid (bảng 3.4), cho

thấy hàm lượng AX khi dung phương pháp thủy phân bằng acid là cao hơn so với

thủy phân bằng các chế phẩm enzyme công nghiệp. Nguyên nhân của sự sai khác

này có thể do tính đặc hiệu cơ chất của các enzyme xylanase mà chúng đã không

thể thủy phân hoàn toàn được AX thành các đường đơn xylose và arabinose [15,

40]. Thông thường các enzyme xylanase chỉ thủy phân được các liên kết trên mạch

xylan trong cấu trúc AX tạo ra xylose, xylobiose hoặc các xylo-oligosaccharide.

Một số xylanase có khả năng phân cắt liên kết trong AX để tạo ra arabinose nhưng

lại không tạo ra được xylose mà giải phóng các xylo-oligosaccharide có kích thước

trung gian khác nhau [4].

Để khẳng định chắc chắn hơn về sự có mặt của xylose và arabinose sau khi

thủy phân AX bằng enzyme xylanase, chúng tôi đã sử dụng phương pháp sắc ký

bản mỏng trên gel silica tương tự như đã được thực hiện đối với mẫu được thủy

phân bằng acid.

Kết quả sắc ký bản mỏng các sản phẩm thủy phân AX với ba enzyme

xylanase khác nhau ở hình 3.2 cho thấy AX sau khi thủy phân bằng Porzyme cho

kết quả phân tách tốt nhất với sự xuất hiện rõ nét của các đường xylose và arabinose


Khóa 2010 - 2012 38

(hình 3.2, đường chạy 3). Các mẫu được thủy phân bằng Ultraflo M và Ultraflo L

(hình 3.2, đường chạy 4 và 5) còn nhiều cơ chất được thủy phân ở mức độ không

hoàn toàn (hình 3.2, đường chạy 4 và 5). Kết quả này một lần nữa khẳng định hiệu

suất thủy phân AX cao của Porzyme như đã trình bày ở trên.

1 2 3 4 5 6

Hình 3.2: Kết quả sắc ký bản mỏng chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo

sau khi được thủy phân bằng enzyme xylanase

Đường chạy 1: Đường chuẩn D - xylose

Đường chạy 2: Đường chuẩn L - arabinose

Đường chạy 3: Chế phẩm thủy phân bằng Porzyme

Đường chạy 4: Chế phẩm thủy phân bằng Ultraflo L

Đường chạy 5: Chế phẩm thủy phân bằng Ultraflo M

Đường chạy 6: Chế phẩm chưa thủy phân

Từ những kết quả thu được ở trên cho thấy có thể sử dụng phương pháp sắc

ký bản mỏng để phát hiện sự có mặt của xylose và arabinose, cũng như đánh giá bổ

sung kết quả thủy phân AX.


Khóa 2010 - 2012 39

Như vậy, có thể tóm tắt quy trình phân tích định tính và định lượng

arabinoxylan như sơ đồ ở hình 3.3, với các bước: i) thủy phân AX bằng acid (HCl

hoặc H2SO4) hoặc xylanase, ii) định lượng đường xylose và arabinose tạo thành

bằng kit Megazyme và phân tích định tính sản phẩm thủy phân bằng sắc ký bản

mỏng trên silicagel.

Hình 3.3. Tóm tắt quy tr nh phân tích định tính, định lượng arabinoxylan.

Thủy phân thành đường đơn bằng acid

HCl (1,3 M) và H2SO4 (0,5 M)

ở 100oC trong 3 giờ

Thủy phân thành đường đơn bằng enzyme

xylanase porzyme trong đệm CH3COONa

50 mM, pH 5 trong 24 giờ ở 50oC

Arabinoxylan ở dạng bột (1 g) hoặc

arabinoxylan ở dạng dịch (100 µl)

Định lượng xylose và arabinose bằng kit D-

xylose của Megazyme, nhân hàm lượng đường

tổng số với hệ số 0,88

Mẫu được làm khô và hòa vào methanol, được định

tính bằng sắc ký bản mỏng trên gel silica, sử dụng

hệ dung môi n-butanol : acid axetic : H2O với tỷ lệ

3:1:1, hiện màu bằng dung dịch aniline phthalate ở

100oC trong 10 phút.


Khóa 2010 - 2012 40

3.2. Phân tích một số tính chất của chế phẩm arabinoxylan được tạo ra từ cám

gạo

3.2.1. Xác định khối lượng phân tử của chế phẩm arabinoxylan

Trước khi được cho qua cột sắc ký lọc gel, chế phẩm arabinoxylan được định

lượng theo quy trình xác lập ở phần trên. Các mẫu có nồng độ AX thấp (dưới 10

mg/ml) được cô đặc bằng màng lọc có kích thước lỗ 10 kDa. Sử dụng màng lọc này

cũng có thể tinh sạch AX bằng cách loại bỏ các chất có khối lượng phân tử nhỏ hơn

30 kDa và các đường đơn xylose, arabinose, glucose… hay các muối có trong chế

phẩm sau khi chiết từ cám gạo. Mẫu sau khi được cô đặc được định lượng AX để

đảm bảo mẫu trước khi lên cột lọc gel có nồng độ khoảng 10 mg/ml và được cho

lên cột lọc gel Sephadex G-100.

Gel Sephadex G-100 được nhồi vào cột có kích thước 1x60cm. Dung dịch

dextran (nồng độ 2 mg/ml) xanh có KLPT 2000 kDa được sử dụng để xác định tính

thể tích trống của cột V0 (ml) của cột. Hàm lượng dextran xanh sau khi rửa chiết ra

khỏi cột được đo độ hấp thụ ở bước sóng 620 nm (A620), từ đó tính được giá trị V0,

khoảng 14,7 ml, là thể tích rửa chiết được tính từ lúc dextran xanh được cho lên cột

cho đến khi thu được giá trị A620 cực đại.

Các chất chuẩn (protein) có nồng độ 2 mg/ml và KLPT đã biết được lần lượt

cho qua cột, rửa chiết và thu riêng từng phân đoạn với thể tích mỗi phân đoạn

khoảng 0,5 ml. Các phân đoạn rửa chiết protein chuẩn được đo độ hấp thụ của

protein ở bước sóng 280 nm để xác định phân đoạn nào chứa nhiều protein nhất, từ

đó tính thể tích rửa chiết từ lúc bắt đầu nạp mẫu cho đến khi thu được phân đoạn

protein chuẩn cực đại, sau đó lập đồ thị tương quan giữa logMw và Ve/Vo của các

protein chuẩn.


Khóa 2010 - 2012 41

Hình 3.4: Đồ thị sự tương quan giữa khối lượng phân tử và thể tích rửa

chiết của các chất chuẩn qua sắc ký lọc gel

Các protein chuẩn bao gồm: Ovalbumin (45 kDa), Chymotrypsinogen A (25

kDa), chất ức chế trypsin hay chất ức chế Kunitz từ đậu tương (21 kDa), cytochrom

c (12,4 kDa).

Kết quả (hình 3.4) nói lên tương quan giữa giữa logMw và Ve/Vo của các

protein chuẩn khi được sắc ký lọc gel qua cột Sephadex G-100 trong nghiên cứu

của chúng tôi.

Sau khi cột gel được rửa sạch, 1 ml chế phẩm arabinoxylan có nồng độ

khoảng 10 mg/ml được cho lên cột gel, rửa chiết và thu các phân đoạn vào từng ống

riêng. Kết quả chúng tôi đã thu tổng số 70 phân đoạn, mỗi phân đoạn có thể tích

khoảng 0,5 ml. Các phân đoạn rửa chiết được định lượng hàm lượng xylose và

arabinose, sau đó vẽ đồ thi minh họa giá trị A340 của các phân đoạn rửa chiết


Khóa 2010 - 2012 42

Hình 3.5: Đồ thị minh họa giá trị A340 của các phân đoạn rửa chiết từ 1 đến 70

qua sắc ký lọc gel Sephadex G-100

Kết quả biểu diễn hàm lượng arabinoxylan của các phân đoạn ở hình 3.5 cho

thấy, chúng tôi đã thu được ba đỉnh sắc ký khác nhau, đỉnh I (các phân đoạn 35-42),

đỉnh II (các phân đoạn 43-48), đỉnh III (các phân đoạn 50-54) . Trên cơ sở giá trị Ve

của các đỉnh này và dựa vào đồ thị chuẩn đã được thiết lập (hình 3.4) chúng tôi đã

tính ra KLPT hay kích thước của các arabinoxylan này tương ứng là 41 kDa, 35

kDa và 28,2 kDa (bảng 3.9).


Khóa 2010 - 2012 43

ảng 3.9: Khối lượng phân tử của arabinoxylan tách ra bằng sắc ký lọc gel

Sephadex G-100

Đỉnh sắc ký Thể tích rửa

chiết (ml)

Hàm lượng

arabinoxylan (mg)

Ve/V0 Mw (kDa)

Đỉnh I 20,10 2,883 1,37 41,0

Đỉnh II 23,82 2,352 1,62 35,0

Đỉnh III 28,12 2,387 1,91 28,2

Tổng hàm lượng arabinoxylan trong các phân đoạn từ 35 đến 54: 7,622 mg

chiếm 80,57% hàm lượng AX tổng số trước khi qua cột. Hay nói cách khác, hiệu

suất thu hồi của chế phẩm sau khi sắc ký là 80,57%.

Để khẳng định thêm về sự có mặt của xylose và arabinose sau khi đã thủy

phân các phân đoạn rửa chiết qua cột, chúng tôi đã sử dụng phương pháp sắc ký bản

mỏng trên silica gel (Các phân đoạn rửa chiết được thủy phân thành xylose và

arabinose bằng enzyme Porzyme)


Khóa 2010 - 2012 44

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Hình 3.6: Kết quả sắc ký bản mỏng sau khi thủy phân các phân đoạn rửa chiết AX

Đường chạy 1: Đường chuẩn D-xylose

Đường chạy 2: Đường chuẩn L-arabinose

Đường chạy 3: Các phân đoạn thuộc đỉnh sắc ký III đã được thủy phân

Đường chạy 4: Các phân đoạn thuộc đỉnh sắc ký II đã được thủy phân

Đường chạy 5: Các phân đoạn thuộc đỉnh sắc ký I đã được thủy phân

Đường chạy 6: Các phân đoạn thuộc đỉnh sắc ký III chưa thủy phân

Đường chạy 7: Các phân đoạn thuộc đỉnh sắc ký II chưa thủy phân

Đường chạy 8: Các phân đoạn thuộc đỉnh sắc ký I chưa thủy phân

Đường chạy 9: Phân đoạn rửa chiết từ 1-30 chưa thủy phân

Đường chạy 10: AX trước khi qua cột Sephadex G-100

Kết quả sắc ký bản mỏng cho thấy các phân đoạn rửa chiết qua cột (hình 3.6,

đường chạy 3, 4, 5) sau khi được thủy phân bằng Porzyme cho hai băng rõ nét có vị

trí tương tự như vị trí của đường xylose và arabinose (hình 3.6, đường chạy 1 và 2),

chứng tỏ các phân đoạn rửa chiết này có chứa AX. Hơn nữa, khi chưa được thủy

phân các phân đoạn rửa chiết qua cột tạo những vệt sắc ký dài, không phân tách


Khóa 2010 - 2012 45

thành các băng riêng rẽ, chứng tỏ trong các phân đoạn này không chứa các đường

xylose và arabinose tự do. Kết quả sắc trên silica gel còn cho thấy, sử dụng sắc ký

lọc gel Sephadex G-100 đã cho phép loại bỏ một số sản phẩm (mà acid hay

xylanase không thể thủy phân được) có lẫn trong chế phẩm arabinoxylan.

3.2.2. Xác định độ ẩm của chế phẩm arabinoxylan được tạo ra từ cám gạo

Arabinoxylan tạo ra từ cám gạo ở dạng bột được xác định độ ẩm theo quy

trình được trình bày ở mục 2.2.6. Khối lượng của hộp: m và các giá trị mo-mn là

tương ứng khối lượng của hộp có chứa mẫu sau khi sấy n ngày.

Bảng 3.10: Khối lượng của hộp mẫu sau khi được sấy đến

khối lượng không đổi

STT mo (g) m1 (g) m2 (g) m3 (g) m4 (g) m5 (g)

Độ ẩm

tương đối

(%)

1 25,21566 25,73341 25,68721 25,67841 25,67618 25,67614 11,06

2 25,98038 26,35956 26,32681 26,32036 26,31890 26,31891 10,72

3 25,21910 26,79677 26,63364 26,62958 26,63074 26,62746 10,73

4 23,84970 25,21241 25,15166 25,14922 25,14657 25,14655 11,31

5 25,98659 28,21436 28,11465 28,10267 28,10092 27,97245 10,86

Độ ẩm tương đối trung bình sau 5 lần đo (%) 10,94

Kết quả xác định độ ẩm thu được ở bảng 3.10 cho thấy, sau 5 ngày sấy mẫu

ở 105oC, các mẫu có khối lượng ổn định và trên cơ sở khối lượng mẫu ban đầu và

lượng mẫu còn lại, chúng tôi đã tính ra độ ẩm của chế phẩm arabinoxylan từ cám

gạo là 10,94%.


Khóa 2010 - 2012 46

3.2.3. Xác định hàm lượng protein tổng số của chế phẩm arabinoxylan

Chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo ở dạng bột được gửi đến Phòng

Kiểm nghiệm hóa, Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội để xác định hàm lượng protein

tổng số. Kết quả xác định 3 mẫu khác nhau và lấy trung bình cho thấy hàm lượng

protein tổng số trong chế phẩm arabinoxylan là 12,49 g% ± 0,43%. Trong khi đó,

chế phẩm BioBran thương mại được sản xuất bởi Công ty Daiwa Pharmaceutical có

hàm lượng protein trong khoảng 8-15%.

3.2.4. Xác định hàm lượng asen của chế phẩm arabinoxylan

Tương tự như việc phân tích hàm lượng nitơ tổng số, chế phẩm arabinoxylan

tạo ra từ cám gạo ở dạng bột được gửi đến Phòng Kiểm nghiệm hóa, Trung tâm Y

tế dự phòng Hà Nội để xác định hàm lượng asen, phương pháp thử theo TCVN

7770-2007. Kết quả thu được là chế phẩm arabinoxylan từ cám gạo chứa 0,31 mg

asen/kg chế phẩm (0,31 ppm), thấp hơn khoảng 10 lần so với chế phẩm BioBran

thương mại được sản xuất bởi Công ty Daiwa Pharmaceutical có hàm lượng asen

khoảng 3 ppm [66].

Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia QCVN 8-2:2011/BYT đối với giới hạn ô

nhiễm kim loại nặng trong thực phẩm không quy định mức giới hạn cho phép đối

với hàm lượng asen trong thực phẩm chức năng, tuy nhiên so với các thực phẩm

khác thì hàm lượng asen cho phép trong khoảng 0,1-5 mg/kg tùy thuộc vào nhóm

thực phẩm [67]. Như vậy, chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo có hàm lượng

asen trong mức giới hạn cho phép.


Khóa 2010 - 2012 47

KẾT LUẬN

Từ các kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi rút ra một số

kết luận sau:

1. Chế phẩm arabinoxylan từ cám gạo được tạo ra từ đề tài ĐT.02.11/CNSHCB,

Bộ Công thương có chứa khoảng 80% arabinoxylan với khối lượng phân tử nằm

trong khoảng 30-50 kDa, độ ẩm khoảng 10,94%, hàm lượng protein tổng số là

12,49 g% và hàm lượng asen là 0,31 mg/kg mẫu.

2. Bước đầu đã xây dựng được quy trình phân tích định tính và định lượng

arabinoxylan, bao gồm các bước: arabinoxylan được thủy phân bằng acid hoặc

enzyme xylanase, sau đó xylose và arabinose tạo thành được phân tích bằng phản

ứng sử dụng enzyme đặc hiệu và phân tích định tính các đường tạo thành bằng sắc

ký bản mỏng, hàm lượng arabinoxylan được tính ra trên cơ sở nhân hàm lượng

đường đơn tổng số xylose và arabinose tạo thành với hệ số 0,88.

KIẾN NGHỊ

Tiếp tục nghiên cứu một số tính chất kích thích miễn dịch của chế phẩm

arabinoxylan từ cám gạo để có thể dùng làm thực phẩm chức năng.


Khóa 2010 - 2012 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt:

1. Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình Hóa sinh học thực nghiệm, Nhà xuất bản

giáo dục VIệt Nam, Hà Nội, tr. 63-90.

2. Nguyễn Quang Vinh, Bùi Phương Thuận, Phan Tuấn Nghĩa (2007), Thực tập hóa

sinh học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội, tr. 25-30.

Tài liệu tiếng Anh:

3. Bacic, A., Stone, B. A. (1981), “Chemistry and organization of aleurone cell

wall components from wheat and barley”, Aust. J. Plant Physiol., 8, pp. 475-

495.

4. Bastawde, K. B. (1992), “Xylan structure, microbial xylanases, and their mode

of action”, World J. Microbiol. Biotechnol., 8, pp. 353 -368.

5. Bataillon, M., Mathaly, P., Nunes Cardinali, A. P., Duchiron, F. (1998),

“Extraction and purification of arabinoxylan from destarched wheat bran in a

pilot scale”, Indust. Crops Prod., 8, pp. 37-43.

6. Biely, P. (1985), “Microbial xylanolytic systems”, Trends Biotechnol., 3, pp.

286-290.

7. Biely, P., Vršanská, M., Tenkanen, M., Kluepfel, D. (1997), “Endo-β-1,4-

xylanase families: differences in catalytic properties”, J. Biotechnol., 57, pp.

151-166.

8. Bradbury, A. G. W., Halliday, D. J., Medcalf, D. G., (1981), "Saparation of

monosaccharides as trimethylsilylated alditols on fusedsilica capillary

columns", J. Chromatogr., 213, pp:146–150.

9. Cao, L., Liu, X., Qian, T., Sun, G., Guo, Y., Chang, F., Zhou, S., Sun, X.

(2011), “Antitumor and immunomodulatory activity of arabinoxylans: a major

constituent of wheat bran”, Int. J. Biol. Macromol., 48, pp. 160-164.


Khóa 2010 - 2012 49

10. Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. (1993), “Structural models of primary cell walls

in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical

properties of the walls during growth”, Plant J., 3, pp. 1-30.

11. Cerning, J., Guilbot, A. (1973), “A specific method for the determination of

pentosans in cereals and cereal products”, Cereal Chem., 50, pp. 176-184.

12. Cleemput, G., Bleukx, W., Van Oort, M., Hessing, M., Delcour, J. A. (1995),

“Evidence for the presence of arabinoxylan hydrolyzing enzymes in European

wheat flours”, Cereal Sci., 22, pp. 1-7.

13. Cleemput, G., Hessing, M., Van Oort, M., Deconynck, M., Delcour, J. A.

(1997), “Purification and characterization of a beta-D-xylosidase and an endo-

xylanase from wheat flour”, Plant Physiol., 113, pp. 377-386.

14. Courtin, C. M., Delcour, J. A. (2000), “Relative activity of endoxylanases

towards water-extractable and water-unextractable arabinoxylan”, J. Cereal

Sci., 33, pp. 301-312.

15. Choct, M. (1997), “Feed non-starch polysaccharides: Chemical structures and

nutritional significance”, Feed Mill. Intern., June Issue, pp. 13-26.

16. Dekker, R. F., Richards, G. N. (1976), “Hemicellulases: their occurrence,

purification, properties, and mode of action”, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem.,

32, pp. 277–352.

17. Delcour, J. A., Van Win, H., Grobet, P. J. (1999), “Distribution and structural

variation of arabinoxylans in common wheat mill streams”, J. Agric. Food

Chem., 47, pp. 271-275.

18. Dervilly, G., Saulnier, L., Roger, P., Thibault, J. (2000), “Isolation of

homogenous fractions from wheat water-soluble arabinoxylans. influence of the

structure on their macromolecular characteristics”, J. Agric. Food Chem., 48,

pp. 270-278.

19. Doner, L. W. B., Johnston, D., Singh, V. (2001), “Analysis and properties of

arabinoxylans from discrete corn wet-milling fiber fractions”, J. Agric. Food

Chem., 49, pp. 1266-1269.


Khóa 2010 - 2012 50

20. Douglas, S. G. (1980), “A rapid method for the determination of pentosan in

wheat flour”, J. Agric. Food Chem., 7, pp. 139-145.

21. Englyst, H. N., Cummings, J. H. (1988), "Improved method of measurement of

dietary fiber as non starch polysaccharides in plant foods", J. Assoc. Off. Anal.

Chem., 71, pp. 808-814.

22. Englyst, H. N., Quigley, M. E., Hudson, G. J., Cummings, J. H. (1992),

"Determination of dietary fiber as non-starch polysaccharides by gas-liquid

chromatography". Analyst, 117, pp. 1707–1714.

23. Finnie, S., Bettge, A., Morris, C. (2006), “Influence of Cultivar and

Environment on Water-Soluble and Water-Insoluble Arabinoxylans in Soft

Wheat”, Cereal Chem., 83, pp. 617-623.

24. Fleury, M. D., Edney, M. J., Campbell, L. D., Crow, G. H. (1997), “Total

water-soluble and acid-soluble arabinoxylans in western Canadian barleys”,

Can. J. Plant Sci., 77, pp. 191-196.

25. Folkes, D. J. (1980), "A gas chromatographic method for the determination of

pentosans", J. Sci. Food Agric., 31, pp. 1011–1016.

26. Garófalo, L., Vazquez, D., Ferraira, F., Soule, S. (2011), “Wheat flour non-

starch polysaccharides and their effect on dough rheological properties”, Ind.

Crop. Prod., 34, pp. 1327-1331.

27. Gebruers, K., Debyser, W., Goesaert, H., Proost, P.,Van Damme, J., Delcour, J.

A. (2001), “Triticum aestivum L. endo-xylanase inhibitor consists of two

inhibitors, TAXI I and TAXI II, with different specificities”, Biochem. J., 353,

pp. 239-244.

28. Ghoneum, M. (1998), “Anti-HIV activity in vitro of MGN-3, an activated

arabinoxylan from rice bran”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 243, pp. 25-

29.

29. Grupen, H., Hamer, R. J, Voragen, A. G. J. (1991), “Water-unextractable cell

wall material from wheat flour. 1. Extraction of polymers with alkali”, J. Cereal

Sci., 16, pp. 41-51.


Khóa 2010 - 2012 51

30. Hashimoto, S., Shogren, M. D., Pomeranz, Y. (1987), “Cereal pentosans: their

estimation and significancee. I. Pentosans in wheat and milled wheat products”,

Cereal Chem., 64, pp. 3034.

31. Izydorczyk, M. S., Biliaderis, C. G. (1995), “Cereal arabinoxylans: advances in

structure and physicochemical properties”, Carbohyd. Polym., 28, pp. 33-48.

32. Jeffries, T. W. (1996), “Biochemistry and genetics of microbial xylanases”,

Curr. Opin. Biotechnol., 7, pp. 337.

33. Kubuta, B. K., Suzuki, T., Horitsu, H., Kawai, K., Takamizawa, K. (1994),

“Purification and Characterization of Aeromonas caviae ME-1 Xylanase V,

which produces exclusively xylobiose from xylan”, Appl. Environ. Microbiol.,

60, pp. 531-535.

34. Lissoni, P., Messina, G., Brivio, F., Fumagalli, L., Vigore, L., Rovelli, F.,

Maruelli, L., Miceli, M., Marchiori, P., Porro, G., Held, M., Di Fede, G.,

Uchiyamada, T. (2008), “Modulation of the anticancer immpaunity by natural

agents: inhibition of T regulatory lymphocyte generation by arabinoxylan in

patients with locally limited or metastatic solid tumors”, Cancer Therapy, 6, pp.

1011-1016.

35. Lu, J., Li, Y., Gu, G., Mao, Z. (2005), “Effects of molecular weight and

concentration of arabinoxylans on the membrane plugging”, J. Agric. Food

Chem., 53, pp. 4996-5002.

36. Maes, C., Vangeneugden, B., Delcour, J. A (2004), “Relative activity of two

endo-xylanase towards water-unextractable arabinoxylans in wheat bran”, J.

Cereal Sci., 39, pp. 181-186.

37. Mares, D.J., Stone, B. A. (1973), “Studies on wheat endosperm. I. Chemical

composition and ultrastructure of the cell walls”, Aust. J. Biol. Sci., 26, pp. 793-

812.

38. Mclauchlan, W.R., Flatman, R. H., Sancho, A. I., Kakuta, J., Faulds, C. B.,

Elliot, G. O., Kroon, P. A., Furniss, C. S., Juge, N., Ravestein, P. And

Williamson, G. (2000), “Xylanase inhibitors from cereals: Implications for


Khóa 2010 - 2012 52

baking, brewing and plant technology”, The Second European Symposium on

Enzymes in Grain Processing, VTT Technical Research Centre of Finland, pp.

55-61.

39. Nishath, K.G., Turner, M. A (2008), “A simplified method for extracting water-

extractable arabinoxylans from wheat flour”, J. Sci. Food Agri., 88, pp. 1905-

1910.

40. Ordaz-Ortiz, J.J., Guillon, F., Tranquet, O., Dervilly-Pinel, G., Tran, V.,

Saulnier, L. (2004), “Specificity of monoclonal antibodies generated against

arabinoxylans of cereal grains”, Carbohyd. Polym., 57, pp. 425-433.

41. Pastell, H. (2010), Preparation, structural analysis and prebiotic potential of

arabinoxylo-oligosaccharides, Academic doctoral dissertation, Faculty of

Agriculture and Forestry, University of Helsinki, pp. 18-28.

42. Pastell, H., Tuomainen, P., Virkki, L., Tenkanen, M. (2008), “Step-wise

enzymatic preparation and structural characterization of singly and doubly

substituted arabinoxylo-oligosaccharides with non-reducing end terminal

branches”, Carbohydr. Res. , 343, pp. 3049-3057.

43. Pitkänen, L., Tenkanen, M., Toumainen. P. (2011), “Behavior of

polysaccharide assemblies in field-flow fractionation and size-exclusion

chromatography”, Anal. Bioanal. Chem., 399, pp. 1467-1472.

44. Preece, I. A., Mcdougall, M. (1958), “Enzymic degradation of cereal

hemicelluloses. II. Pattern of pentosan degration”, J. Inst. Brew., 64, pp. 489-

500.

45. Rantanen, H., Virkki, L., Tuomainen, P., Kabel, M., Schols, H., Tenkanen, M.

(2007), “Preparation of arabinoxylobiose from rye xylan using family 10

Aspergillus aculeatus endo-1,4-β-D-xylanase”, Carbohydr. Polymers, 68, pp.

350-359.

46. Reilly, P. J. (1981), “Xylanases: structure and function. In: Trends in the

biology of fermentation for fuels and chemicals”, Basic Life Sci., Plenum Press,

New York, pp. 111-129


Khóa 2010 - 2012 53

47. Rose, D. J., Inglett, G. E. (2011), “A method for the determination of soluble

arabinoxylan released from insoluble substrates by xylanases”, Food Anal.

Methods, 4, pp. 66-72.

48. Rouau, X., Surget, A. (1994), “A rapid semi-automated method for the

determination of total and water-extractable pentosans in wheat flours”,

Carbohyd. Polym., 24, pp. 123 -132.

49. Samuelsen, A. B., Rieder, A., Grimmer, S., Michaelsen, T. E., Knutsen, S. H.

(2011), “Immunomodulatory activity of dietary fiber: Arabinoxylan and mixed-

linked beta-glucan isolated from barley show modest activities in vitro”, Int. J.

Mol. Sci., 12, pp. 570-587.

50. Shibuya, N., Iwasaki, T. (1985), “Structural features of rice bran

hemicelluloses”, Phytochem., 24, pp. 285-289.

51. Shibuya, N., Nakane, R., Yasui, A., Tanaka, K., Iwasaki, T. (1985),

“Comparative studies on cell wall preparations from rice bran, germ, and

endosperm”, J. Cereal Sci., 62, pp. 252-258.

52. Shiiba, K., Yamada, H., Hara, H., Okada, K., Nagao, S. (1993), “Purification

and characterization of two arabinoxylan from wheat bran”, Cereal Chem., 70,

pp. 209-214.

53. Subba Rao, M.V.S.S.T., Muralikrishna, G. (2006), “Hemicellulose of Ragi

(Finger Millet, Eleusine coracana, Indaf-15): Isolation and purification of an

alkali-extractable arbinoxylan from native and malted hemicelluloses B”, J.

Agric. Food Chem., 54, pp. 2342-2349.

54. Sundberg, A., Sundberg, K., Lillandt, C., Holmbom, B. (1996), “Determination

of hemicelluloses and pectins in wood and pulp fibers by acid methanolysis and

gas chromatography”, Nord. Pulp Pap. Res. J., 11, pp. 216- 226.

55. Törrönen, A., Rouvinen, J. (1997), “Structural and functional properties of low

molecular weight endo-1,4-beta-xylanases”, J. Biotechnol., 57, pp. 137-149.


Khóa 2010 - 2012 54

56. Vinjamoori, D.V., Byrum, J. R., Hayes, T., Das, P. K. (2004), “Challenges and

opportunities in the analysis of raffinose oligosaccharides, pentosans, phytate,

and glucosinolates”, J. Anim. Sci., 82, pp. 319-328.

57. Watanabe, T., Shida, M., Furuyama, Y., Tsukamoto, K., Nakajima. T.,

Matsuda, K. (1983), “Structure of the arabinoxylan of rice hull”, Carbohydr.

Res., 123, pp. 83-95.

58. Zheng, X., Li, L., Wang, X. (2011), “Molecular characterization of

arabinoxylans from hull-less barley milling fractions”, Molecules, 16, pp. 2743-

2753.

59. www.megazyme.com/downloads/en/data/K-ARAB.pdf

60. www.megazyme.com/downloads/en/data/K-XYLOSE.pdf

61. http://www.jafra.gr.jp/eng/biobran.html

62. http://www.spectrumlabs.com/dialysis/Fund.html

63. http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/tcvn-5780-1994.274386.html

64. http://tieuchuan.vn/vi/tin-tuc/593-tieu-chuan-quoc-gia-viet-nam-tcvn-cong-bo-

nam-2007.html

65. http://web.idrc.ca/openebooks/278-3/

66. http://www.daiwa-pharm.com/eng/bio-5.html

67. http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/qcvn-8-2-2011-byt.1286436.html

68. www.wikipedia.org

http://www.megazyme.com/downloads/en/data/K-ARAB.pdf

http://www.megazyme.com/downloads/en/data/K-XYLOSE.pdf

http://www.jafra.gr.jp/eng/biobran.html

http://www.spectrumlabs.com/dialysis/Fund.html

http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/tcvn-5780-1994.274386.html

http://tieuchuan.vn/vi/tin-tuc/593-tieu-chuan-quoc-gia-viet-nam-tcvn-cong-bo-nam-2007.html

http://tieuchuan.vn/vi/tin-tuc/593-tieu-chuan-quoc-gia-viet-nam-tcvn-cong-bo-nam-2007.html

http://web.idrc.ca/openebooks/278-3/

http://www.daiwa-pharm.com/eng/bio-5.html

http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/qcvn-8-2-2011-byt.1286436.html

Documents

nghiên cứu một số đặc trưng của chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ