Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm

http://www.ebook.edu.vn

Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm

Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 1

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ …………………………………………………………………………..3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN................................................................... 5 1.1. Nguồn gốc và sự tồn tại chitin - chitosan trong tự nhiên. ................................5 1.2. Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá của chitin...........................................................6

1.2.1. Cấu trúc hoá học của chitin. .....................................................................................6 1.2.2. Tính chất lý hoá của chitin. .......................................................................................8

1.3. Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá sinh và độc tính của chitosan...............8 1.3.1. Cấu trúc hoá học của chitosan. ...............................................................................9 1.3.2. Tính chất lý hoá của chitosan................................................................................10 1.3.3. Tính chất sinh học của chitosan. .........................................................................11 1.3.4. Độc tính của chitosan. ..............................................................................................11

1.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng trong thực tế của chitin và chitosan ở Việt Nam và trên thế giới. ................................................................................12 1.5. Cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa của glucosamin..........................................15 1.6. Cấu trúc hóa học, tính chất vật lý một số muối của glucosamin. ............17

1.6.1. Glucosamin hydroclorua..........................................................................................17 1.6.2. Glucosamin sulfat. .......................................................................................................17 1.6.3. Acetyl glucosamin.........................................................................................................18

1.7. Dược lý và dược động học của glucosamin và muối của nó......................18 1.8. Một số quy trình sản xuất chitin, chitosan trên thế giới và ở tại Việt Nam...........................................................................................................................................................21

1.8.1. Trên thế giới. ....................................................................................................................21 1.8.2. Ở Việt Nam........................................................................................................................23

1.9. Quy trình sản xuất glucosamin hydroclorua (glu.HCl). .................................25 1.9.1. Quy trình sản xuất glu.HCl của Trần Thị Luyến. .....................................25 1.9.2. Quy trình sản xuất glu.HCl của Đỗ Đình Rãng. .......................................26

Chương II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................................................................................................................................27 2.1. Đối tượng nghiên cứu..........................................................................................................27 2.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................................................27




CHƯƠNG III : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ......................................29 3.1.Quy trình điều chế chitin, chitosan và glucosamin hydroclorua. ..............29 3.2. Điều chế chitin từ vỏ tôm. ................................................................................................30 3.3.Điều chế chitosan bằng cách deacetyl chitin. ........................................................31 3.4. Điều chế glucosamin hydroclorua (glu.HCl). ......................................................32

3.4.1.Điều chế glu.HCl từ chitin. .....................................................................................32 3.4.2.Điều chế glu.HCl từ chitosan..................................................................................33 3.4.3. Tinh chế glu.HCl. ..........................................................................................................34

3.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin.........................................................................................................................................................39 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin .........................................................................................................................................................39 3.7. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ axit HCl đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin. ..............................................................................................................................40 CHƯƠNG IV : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..................................................41 4.1. Điều chế chitin từ vỏ tôm. ................................................................................................41

4.1.1.Quá trình khử khoáng..................................................................................................41 4.1.2. Quá trình loại bỏ protein.........................................................................................41

4.1.3. Quá trình tẩy màu (loại bỏ Astaxanthin). ......................................................42 4.2. Điều chế chitosan. ..................................................................................................................43 4.3. Điều chế glucosamin hydroclorua (glu.HCl)........................................................43

4.3.1. Điều chế glu.HCl đi từ chitin. ...............................................................................44 4.3.2. Điều chế glu.HCl từ chitosan. ...............................................................................45

KẾT LUẬN......................................................................................................................................48

TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................49




ĐẶT VẤN ĐỀ

Giáp xác là nguồn nguyên liệu thủy sản dồi dào chiếm 1/3 tổng sản lượng

nguyên liệu thủy sản ở Việt Nam. Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất

khẩu, tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đông lạnh giáp xác chiếm từ 70 - 80% công suất

chế biến. Hàng năm các nhà máy chế biến đã thải bỏ một lượng phế liệu giáp xác

khá lớn khoảng 70.000 tấn/năm [3].

Nguồn phế liệu này là nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp sản xuất

chitin 1, chitosan 2, glucosamin 3 và các sản phẩm có giá trị khác. Do vậy việc

nghiên cứu và phát triển sản xuất các sản phẩm từ vỏ tôm là rất quan trọng, để

nâng cao giá trị sử dụng phế liệu này và làm sạch môi trường.

Sản phẩm chitin - chitosan đã có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng

trong thực tế. Chitin có ứng dụng làm da nhân tạo và là nguyên liệu trung gian

cho các chất quan trọng như chitosan, glucosamin và các chất có giá trị khác.

Chitosan có nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp, nông nghiệp, y dược

và bảo vệ môi trường như: sản xuất glucosamin, chỉ khâu phẫu thuật, thuốc kem,

vải, sơn, chất bảo vệ hoa quả, bảo vệ môi trường…Với khả năng ứng dụng rộng

rãi của chitin – chitosan mà nhiều nước trên thế giới và cả Việt Nam đã nghiên

cứu sản xuất các sản phẩm này.

Glucosamin là một hoạt chất quý được sản xuất từ vỏ tôm thông qua

nguyên liệu trung gian là chitin hoặc chitosan. Glucosamin chủ yếu được sử dụng

trong y học chữa bệnh thoái hoá khớp.

Ở người già, chức năng cũng như cấu tạo của khớp có nhiều thay đổi, các

tế bào của khớp thoái hoá, trở nên kém linh động. Gân và dây chằng phân đoạn,

đóng vôi, khô cằn, trở nên kém bền bỉ, kém co dãn, không chịu được căng lực và

dễ bị tổn thương. Sụn trở nên đục màu, xơ hóa, gai xương, khô nước, rạn nứt với

nhiều tinh thể canxi làm khớp đau. Khớp co duỗi khó khăn vì màng hoạt dịch

mỏng và khô dần [1].

Trước đây, trong điều trị các bệnh thoái hóa khớp người ta thường dùng

các thuốc thuộc nhóm corticoid hoặc nhóm kháng viêm giảm đau không steroid

NSAID (Non - Steroidal Anti - Inflammatory Drugs), nhưng các thuốc thuộc




nhóm này chỉ điều trị triệu chứng và có nhiều tác dụng phụ. Với các thuốc thuộc

nhóm corticoid thường gây nên các tác dụng phụ: loãng xương, viêm loét dạ dày,

giảm miễn dịch…. Đối với các NSAID thì gây viêm loét dạ dày…[12]. Từ thập

kỷ 90 người ta đã phát hiện ra glucosamin phục hồi được các sụn khớp, tức là

chữa được căn nguyên của bệnh viêm, thoái hoá khớp [2].

Đã có nhiều công trình nghiên cứu với nhiều thử nghiệm lâm sàng đã

chứng minh tác dụng điều trị tận gốc bệnh thoái hoá khớp của glucosamin, nhất

là dạng phối hợp với dược liệu thiên nhiên. Trên thực tế glucosamin thường được

sử dụng ở các dạng: glucosamin hydroclorua 4, glucosamin sulfat 5, N - Acetyl

glucosamin 6. Hiện nay thuốc chứa glucosamin đã được lưu hành trên 70 quốc

gia.

Tại Việt Nam, glucosamin và các thành phẩm đi từ glucosamin vẫn chủ

yếu là nhập khẩu và xu thế sử dụng ngày càng nhiều. Trong khi đó nguồn nguyên

liệu (vỏ giáp xác) chủ yếu để điều chế ra glucosamin thì dồi dào. Để tận dụng

nguồn nguyên liệu phế thải, tạo nguồn nguyên liệu cho việc sản xuất thuốc chữa

bệnh thoái hoá khớp và là nguyên liệu cho việc nghiên cứu các ứng dụng khác

của glucosamin chúng tôi đặt vấn đề tiến hành đề tài “Nghiên cứu điều chế

glucosamin từ vỏ tôm”.

Mục tiêu của đề tài nhằm giải quyết các vấn đề sau :

1. Phân lập chitin – chitosan từ vỏ tôm phế thải.

2. Điều chế glucosamin hydroclorua từ chitin và chitosan..




Chương I: TỔNG QUAN

1.1. Nguồn gốc và sự tồn tại chitin - chitosan trong tự nhiên

Chitin - chitosan là một polysacharit tồn tại trong tự nhiên với sản lượng

rất lớn (đứng thứ hai sau xellulose). Trong tự nhiên chitin tồn tại trong cả động

vật và thực vật .

Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ

một số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun

tròn. Trong động vật bậc cao monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong

mô da nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da. Trong thực vật

chitin có ở thành tế bào nấm họ zygenmyctes, các sinh khối nấm mốc, một số

loại tảo... [13].

Chitin - chitosan là polysacharit có đạm không độc, có khối lượng phân tử

lớn. Cấu trúc của chitin là tập hợp các monosacharit (N-acetyl-β-D-glucosamine)

liên kết với nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi có tổ

chức. Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và hầu như luôn luôn nối

bởi các cầu nối đẳng trị (coralente) với các protein, CaCO3 và các hợp chất hữu

cơ khác.

Hình 1 : Chitin và vỏ tôm




Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng

chitin - chitosan chiếm khá cao đao động từ 14 - 35% so với trọng lượng khô [5].

Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin - chitosan.

Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1821,

trong cặn dịch chiết từ một loại nấm. Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để

ghi nhớ nguồn gốc của nó. Năm 1823 Odier phân lập được một chất từ bọ cánh

cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng

ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó. Cuối cùng cả Odier và

Braconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống với xellulose.

O

NHCOCH3

OH

CH2OH

O OO

NHCOCH3

OH

CH2OH

O

O

NH2

OH

CH2OH

O OO

NH2

OH

CH2OH

O

O

OH

OH

CH2OH

O OO

OH

OH

CH2OH

O

2)

3)

1)

H×nh 2 :1) Chitin; 2) Chitosan; 3) Xellulose

1.2. Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá của chitin

1.2.1. Cấu trúc hoá học của chitin

Chitin 1 có cấu trúc tinh thể rất chặt chẽ và đều đặn. Bằng phương pháp

nhiễu xạ tia X. Người ta đã chứng minh được chitin tồn tại ở ba dạng cấu hình :α,

β, γ - chitin [15].

Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi

mắt xích (N-acetyl-D-glucosamin) trong mạch.




Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu của mũi

tên chỉ nhóm –CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH3, thì các cấu trúc α, β, γ-

chitin được mô tả như sau:

α - chitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn,

nên ngoài liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữa

các lớp do các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững. Do các mắt xích sắp

xếp đảo chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt không gian và năng lượng. Đây cũng là

dạng phổ biến trong tự nhiên.

β, γ - chitin do mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β - chitin) và

hai song song một ngược chiều (γ - chitin), giữa các lớp không có loại liên kết

hydro. Dạng β - chitin cũng có thể chuyển sang dạng α - chitin nhờ quá trình

axetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn.

Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzym hay axit HCl đậm đặc

thì người ta thấy rằng chitin có cấu trúc là một polyme được tạo thành từ các đơn

vị N-Acetyl-β-D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β-(1-4) glucozit.

Công thức cấu tạo của chitin:

OO

HO

NHCCH3

O

OH

OH

NHCH2CH3

HO OO

HO

NHCH2CH3

O

OH

O

O

O

1 Tên gọi : Poly(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucose; Poly(1-4)-2-

acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranose.

α - Chitin β - Chitin γ - Chitin




Công thức phân tử: [C8H13O5N]n

Phân tử lượng : Mchitin = (203,09)n

1.2.2. Tính chất lý hoá của chitin [3]

Chitin có màu trắng hay màu trắng phớt hồng, dạng vảy hoặc dạng bột,

không mùi, không vị, không tan trong nước, trong môi trường kiềm, axit loãng và

các dung môi hữu cơ như ete, rượu …Nhưng tan trong dung dịch đặc nóng của

muối thioxianat liti (LiSCN) và thioxianat canxi (Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch

keo, tan được trong hệ dimetylacetamid - LiCl 8% [4], tan trong hexafluoro-

isopropyl alcohol (CF3CHOHCF3) và hexafluoracetone sesquihydrate

(CF3COCF3.H2O) [16]. Chitin có khả năng hấp thu tia hồng ngoại có bước sóng

884 - 890cm-1.

Chitin ổn định với các chất oxy hoá mạnh như thuốc tím (KMnO4); oxy

già (H2O2); nước javen (NaOCl - NaCl)…, lợi dụng tính chất này mà người ta sử

dụng các chất oxy hoá trên để khử màu cho chitin.

Khi đun nóng trong dung dịch NaOH đậm đặc (40 - 50%), ở nhiệt độ cao

thì chitin sẽ bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan:

ChitnCH2OHOHNHCOCH3

ChitosanCH2OHOHNH2

NaOH 40-50%

T0cao

Khi đun nóng trong axit HCl đậm đặc, ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị cắt

mạch thu được glucosamin:

CH2OHOHNHCOCH3

CH2OHOHNH2

GlucosaminHCl 36%

ChitnT0cao

Phản ứng este hóa :

- Chitin tác dụng với HNO3 đậm đặc cho sản phẩm chitin nitrat.

- Chitin tác dụng với anhydrit sunfuric trong pyridin, dioxan và

N,N-dimetylanilin cho sản phẩm chitin sunfonat.

1.3. Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá sinh và độc tính của chitosan




1.3.1. Cấu trúc hoá học của chitosan [3]

Trong số các dẫn xuất của chitin thì chitosan 2 là một trong những dẫn

xuất quan trọng vì nó có hoạt tính sinh học cao và có nhiều ứng dụng trong thực

tế.

Việc sản xuất chitosan tương đối đơn giản, không cần dung môi, hóa chất

độc hại, đắt tiền. Chitosan thu được bằng phản ứng deacetyl hóa chitin, biến đổi

nhóm N-acetyl thành nhóm amin ở vị trí C2.

Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta qui ước nếu

độ deacetyl hóa (degree of deacetylation) DD > 50% thì gọi là chitosan, nếu DD

< 50% gọi là chitin [13].

Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị 2-amino-2-deoxy-β-D-

glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-(1-4) glucozit.

Công thức cấu tạo của chitosan:

OO

HO

NH2

O

OH

OH

NH2

HO OO

HO

NH2

O

OH

2 Tên gọi khoa học: Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glucose; poly(1-4)-2-

amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose.

Công thức phân tử: [C6H11O4N]n

Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n

Qua cấu trúc của chitin - chitosan ta thấy chitin chỉ có một nhóm chức

hoạt động là -OH (H ở nhóm hydroxyl bậc 1 linh động hơn H ở nhóm hydroxyl

bậc 2 trong vòng 6 cạnh) còn chitosan có 2 nhóm chức hoạt động là -OH, -NH2,

do đó chitosan dễ dàng tham gia phản ứng hóa học hơn chitin. Trong thực tế các

mạch chitin - chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời, việc

tách và phân tích chúng rất phức tạp.




1.3.2. Tính chất lý hoá của chitosan [3]

Chitosan có màu trắng ngà hoặc màu vàng nhạt, tồn tại dạng bột hoặc dạng

vảy, không mùi, không vị, nhiệt độ nóng chảy 309 - 3110C.

Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, trong kiềm nhưng hoà

tan được trong dung dịch axit hữu cơ loãng như: axit acetic, axit fomic, axit

lactic…, tạo thành dung dịch keo nhớt trong suốt. Chitosan hoà tan trong dung

dịch axit acetic 1 - 1.5%. Độ nhớt của chitosan trong dung dịch axit loãng liên

quan đến kích thước và khối lượng phân tử trung bình của chitosan (đây cũng là

tính chất chung của tất cả các dung dịch polyme) [6]. Chitosan kết hợp với

aldehit trong điều kiện thích hợp để hình thành gel, đây là cơ sở để bẫy tế bào,

enzym. Chitosan phản ứng với axit đậm đặc, tạo muối khó tan. Chitosan tác dụng

với iod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím.

Một số dẫn xuất chitosan [26]:

OOHO HN

O

OHOO

HO NHO

OHOO

HO NH3+

O

OH

OOHO NH3

+O

OCH2CH2SO3-

OOHO NHCH2COOH

O

OCH2COOH

OOHO NHAc

O

OCH2CH2CN

OOHO NHAc

O

OCS2-Na+

OOHO N=CHR

O

OH

OOHO NHR

O

OH

OOHO NHCH2COOH

O

OH

OOHO NHAc

O

OCH2CHOHR

OOHO NH2

O

OH

OO-O NHAc

O

O-Na+

OORH2CO NHAc

O

OCH2ROO

HO NHAcO

OCH2COOH

OOHO NHAc

O

OH

Na+

Chitosan

Chitin

Crosslinked ChitosanChitosan salts

Sulfoethylchitosan

N,O-carboxymethylchitosan

Cyanoethylchitin

Chitin xanthogenate

Alkalichitin Alkylchitin

Carboxmethylchitin

Hydroxyalkylchitin

N-carboxymethylchitosan

N-alkylchitosan

Schiff base

Hình 3 : Sơ đồ các dẫn xuất đi từ chitin, chitosan.




1.3.3. Tính chất sinh học của chitosan [5]

Chitosan không độc, dùng an toàn cho người [18]. Chúng có tính hoà hợp

sinh học cao với cơ thể [19], có khả năng tự phân huỷ sinh học [20].

Chitosan có nhiều tác dụng sinh học đa dạng như: tính kháng nấm, tính

kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh

của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, tác

dụng cầm máu, chống sưng u [21].

Ngoài ra, chitosan còn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid máu, hạ

huyết áp [22], điều trị thận mãn tính, chống rối loạn nội tiết [23].

Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các peptit - insulin, kích thích việc

tiết ra insulin ở tuyến tụy nên chitosan đã được dùng để điều trị bệnh tiểu đường.

Nhiều công trình đã công bố khả năng kháng đột biến, kích thích làm tăng cường

hệ thống miễn dịch cơ thể, khôi phục bạch cầu, hạn chế sự phát triển các tế bào u,

ung thư, HIV/AIDS, chống tia tử ngoại, chống ngứa… của chitosan [24].

1.3.4. Độc tính của chitosan [5]

Vào năm 1968, K. Arai và cộng sự đã xác định chitosan hầu như không

độc, chỉ số LD50 = 16g/kg cân nặng cơ thể, không gây độc trên súc vật thực

nghiệm và người, không gây độc tính trường diễn [25].

Nghiên cứu tiêm chitosan theo đường tĩnh mạch trên thỏ, các tác giả đã kết

luận: chitosan là vật liệu hoà hợp sinh học cao, nó là chất mang lý tưởng trong hệ

thống vận tải thuốc, không những sử dụng cho đường uống, tiêm tĩnh mạch, tiêm

bắp, tiêm dưới da, mà còn sử dụng an toàn trong ghép mô [25].

Dùng chitosan loại trọng lượng phân tử trung bình thấp để tiêm tĩnh mạch,

không thấy có tích luỹ ở gan. Loại chitosan có DD ≈ 50%, có khả năng phân huỷ

sinh học cao, sau khi tiêm vào ổ bụng chuột, nó được thải trừ dễ dàng, nhanh

chóng qua thận và nước tiểu, chitosan không phân bố tới gan và lá lách.

Nhiều tác giả đã chỉ rõ những lợi điểm của chitosan: tính chất cơ học tốt,

không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân hủy sinh học, hòa hợp sinh học không

những đối với động vật mà còn đối với các mô thực vật, là vật liệu y sinh tốt làm

mau liền vết thương [27].




1.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng trong thực tế của

chitin và chitosan ở Việt Nam và trên Thế giới [3]

Trước đây người ta đã thử chiết tách chitin từ thực vật biển nhưng nguồn

nguyên liệu không đủ để đáp ứng nhu cầu sản xuất. Trữ lượng chitin phần lớn có

nguồn gốc từ vỏ tôm, cua. Trong một thời gian, các chất phế thải này không được

thu hồi mà lại thải ra ngoài gây ô nhiễm môi trường. Năm 1977 Viện kỹ thuật

Masachusetts (Mỹ), khi tiến hành xác định giá trị của chitin và protein trong vỏ

tôm, cua đã cho thấy việc thu hồi các chất này có lợi nếu sử dụng trong công

nghiệp. Phần protein thu được sẽ dùng để chế biến thức ăn gia súc, còn phần

chitin sẽ được dùng như một chất khởi đầu để điều chế các dẫn xuất có nhiều ứng

dụng trong lĩnh vực công nghiệp [16].

Việc nghiên cứu sản xuất chitin - chitosan và các ứng dụng của chúng

trong sản xuất phuc vụ đời sống là một hướng nghiên cứu tương đối mới mẻ ở

nước ta. Vào những năm 1978 đến 1980 Trường đại học Thuỷ sản Nha Trang đã

công bố quy trình sản xuất chitin - chitosan của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, nhưng

chưa có ứng dụng cụ thể trong sản xuất. Gần đây trước yêu cầu xử lý phế liệu

thuỷ sản đông lạnh đang ngày càng cấp bách, trước những thông tin kỹ thuật mới

về chitin - chitosan cũng như tiềm năng thị trường của chúng đã thúc đẩy các nhà

khoa học của chúng ta bắt tay vào nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitin

- chitosan ở bước cao hơn, đồng thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng trong

các lĩnh vực sản xuất công nghiệp.

Hiện nay ở Việt Nam có nhiều cơ sở khoa học đang nghiên cứu sản xuất

chitin - chitosan như: Trường Đại Học Nông Lâm - thành phố Hồ Chí Minh;

Trung tâm nghiên cứu polyme - Viện Khoa Học Việt Nam; Viện Hoá thuộc phân

Viện Khoa Học Việt Nam tại thành phố Hồ Chí Minh; Trung tâm công nghệ và

sinh học Thuỷ sản - Viện nghiên cứu nuôi trồng Thuỷ sản 2.

Ở miền Bắc, Viện Khoa Học Việt Nam đã kết hợp với Xí nghiệp thuỷ sản

Hà Nội sản xuất chitosan và ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp ở đồng lúa

Thái Bình và đã thu được một số kết quả đáng khích lệ.

Ở miền Nam, Trung tâm công nghệ và sinh học thuỷ sản phối hợp với một

số cơ quan khác: Đại Học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, phân Viện Khoa Học




Việt Nam, Viện Khoa Học nông nghiệp miền nam,… đang nghiên cứu sản xuất

và ứng dụng chitin - chitosan trong lĩnh vực: nông nghiệp, y dược và mỹ phẩm.

Trong nông nghiệp, chitosan được sử dụng để bảo vệ các hạt giống nhằm

mục đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng

cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt [7].

Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên tố vi lượng lên một

số chỉ tiêu sinh hoá của mạ lúa ở nhiệt độ thấp thì kết quả nghiên cứu cho thấy

chitosan vi lượng làm tăng hàm lượng diệp lục và hàm lượng nitơ; đồng thời hàm

lượng các enzym như amylaza, catalaza hay peroxidaza cũng tăng lên.

Ngày nay chitosan còn được dùng làm nguyên liệu bổ xung vào thức ăn

cho tôm, cá, cua để kích thích sinh trưởng.

Những ứng dụng của chitin - chitosan và những dẫn xuất của chúng ngày

càng phát triển. Một số đã đưa vào ứng dụng như là: chỉ khâu tự huỷ, da nhân tạo

[4], thấu kính chiết xuất, và một số ứng dụng khác còn đang nghiên cứu như: tác

động kích thích miễn dịch, chống sự phát triển của khối u, đặc tính làm giảm

cholesterol máu [10], trị bỏng nhiệt [11]…

Da nhân tạo có nguồn gốc từ chitin, nó giống như một tấm vải và được bọc

ốp lên vết thương chỉ một lần đến khi khỏi. Da nhân tạo bị phân huỷ sinh học từ

từ cho đến lúc hình thành lớp biểu bì mới. Nó có tác dụng giảm đau, giúp cho các

vết sẹo bỏng phục hồi biểu bì nhanh chóng. Trường Đại Học Dược Hà Nội, Đại

Học Y Hà Nội, Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ Quốc gia cũng đã chế

tạo thành công loại da nhân tạo này và bước đầu ứng dụng có hiệu quả.

Chitin - chitosan và các oligome của nó có đặc tính miễn dịch do nó kích

thích các tế bào giữ nhiệm vụ bảo vệ miễn dịch với các tế bào khối u và các tác

nhân gây bệnh.

Những nghiên cứu gần đây hướng vào các oligome, N-acetyl-glucosamin

và glucosamin, các chất này có một số tính chất của các polyme tương ứng

nhưng lại có ưu thế là tan tốt trong nước do đó dễ dàng được hấp thụ.

Hiện nay trên thế giới đã thành công việc sử dụng chitosan làm chất mang

để cố định enzym và tế bào. Enzym cố định đã cho phép mở ra việc sử dụng rộng

rãi enzym trong công nghiệp, y học và khoa học phân tích. Enzym cố định được




sử dụng lâu dài, không cần thay đổi chất xúc tác. Nhất là trong công nghệ làm

sạch nước, làm trong nước hoa quả, sử dụng enzym cố định rất thuận lợi và đạt

hiệu quả cao. Chitosan thoả mãn yêu cầu đối với một chất mang có phân tử lượng

lớn, bền vững không tan và ổn định với các yếu tố hoá học.

Do có cấu trúc tương tự như xellulose nên chitosan được nghiên cứu bổ

sung vào làm nguyên liệu sản xuất giấy. Chitosan làm tăng độ bền dai của giấy,

đồng thời việc in trên giấy cũng tốt hơn. Trong sản xuất giấy qua nghiên cứu

người ta thấy nếu bổ sung 1% chitosan thì độ bền của giấy tăng lên khi bị ướt hay

tăng độ nét khi in [5].

Có thể thay hồ tinh bột bằng chitosan để hồ vải, nó có tác dụng làm tơ sợi

bền, mịn, bóng đẹp, cố định hình in, chịu được axit và kiềm nhẹ.

Chitosan kết hợp với một số thành phần khác để sản xuất vải chịu nhiệt,

vải chống thấm, sản xuất vải col…

Chitosan được sử dụng để sản xuất kem chống khô da do tính chất của

chitosan là có thể cố định dễ dàng trên biểu bì của da nhờ các nhóm –NH+4. Các

nhóm này liên kết với các tế bào sừng hóa của da, nhờ vậy mà các nhà khoa học

đã nghiên cứu sử dụng chitosan làm các loại kem dưỡng da chống nắng.

Nhờ khả năng làm đông tụ các thể rắn lơ lửng giàu protein và nhờ khả

năng kết dính tốt các ion kim loại như Pb, Hg… do đó chitin được sử dụng để tẩy

lọc nguồn nước thải công nghiệp từ các nhà máy chế biến thực phẩm.

Chitosan sử dụng để chống hiện tượng mất nước trong quá trình làm lạnh,

làm đông thực phẩm.

Do chitosan có tính chất diệt khuẩn, do đó nó được tạo thành màng mỏng

để bao gói thực phẩm chống ẩm mốc, chống mất nước.

Đặc tính diệt khuẩn của chitosan được thể hiện trên các mặt sau :

• Khi tiếp xúc với thực phẩm chitin - chitosan sẽ lấy đi từ các vi sinh

vật này các ion thiết yếu, ví dụ như ion Cu2+. Như vậy vi sinh vật sẽ

bị chết do sự mất cân bằng liên quan đến các ion thiết yếu.

• Ngăn chặn phá hoại chức năng màng tế bào.

• Gây ra sự rò rỉ các phần bên trong tế bào.




Như vậy việc dùng chất chitosan bao bọc quanh bề mặt thực phẩm có thể

kéo dài thời gian bảo quản, giảm sự hư hỏng do khả năng kháng nấm, kháng

khuẩn của nó.

1.5. Cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa của glucosamin

Khi thủy phân chitin trong môi trường axit HCl đậm đặc, các mối nối amid

và osid đều bị phá hủy do đó thu được glucosamin 3 (là monome của chitosan).

Yếu tố nồng độ axit và nhiệt độ thủy phân rất quan trọng, nếu nồng độ của axit

không thích hợp thì quá trình deacetyl hóa và deosid chỉ dừng lại giới hạn nhất

định, nếu nhiệt độ không thích hợp thì sản phẩm cuối cùng là glucosamin có thể

bị giáng hóa thành những phân tử đơn giản hơn.

Công thúc cấu tạo của glucosamin:

CCCCCCH2OH

O

O

OH

OH

NH2

OH

CH2OHH OHNH2HHHOOHH

H

OHO

HO

NH2

OH

OH

3

OHC OH

NH2

OH

OH

OH

Tên UIPAC: (3R,4R,5S,6R)-3-amino-6-(hydroxymethyl)oxane-2,4,5-triol

Tên gọi khác: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose; 2-amino-2-deoxy-β-D-

glucopyranose; chitosamine; D-glucosamine; D-(+)- glucosamine.

Công thức phân tử: C6H13O5N

Phân tử lượng: Mglucosamin = 179,17




Hình 4 : Cấu trúc không gian của glucosamin

Glucosamin là chất rắn dạng tinh thể, không màu, không mùi, điểm nóng

chảy 880C, điểm phân hủy 1100C, tan được trong nước và trong methanol sôi, hơi

tan trong methanol hoặc ethanol, không tan trong ether và chloroform.

Một số phản ứng của glucosamin [14]:

• Phản ứng tráng bạc:

Giống như glucose, glucosamin cho phản ứng tráng bạc khá rõ ràng:

C5H12O4NCHO + 2[Ag(NH3)]OHC5H12O4NCOONH4 + 2Ag + 3NH3 + H2O

500C

• Phản ứng với Cu(OH)2.

Sản phẩm có màu xanh nhạt.

CHO

CHNH2

CHOH

CHOH

CHOH

CH2OH

+ Cu(OH)22

CHO

CHNH2

CHO

CHO

CHOH

CH2OH

CHO

CHNH2

CHOH

CH2OH

Cu

HOHC

OHCH+ 2 H2O

• Phản ứng với C6H5CH=O.

Phản ứng xác nhận có mặt của NH2. Bazơ Shiff tạo ra dưới dạng keo

sánh màu nâu:




CHO

CHNH2

CHOH

CHOH

CHOH

CH2OH

CHO

CHN

CHOH

CHOH

CHOH

CH2OH

+

CHO HC

H2SO4d

500C+ H2O

1.6. Cấu trúc hóa học và tính chất vật lý một số muối của glucosamin

Trong thực tế, một số dẫn xuất của glucosamin được sử dụng làm nguyên

liệu làm thuốc.

1.6.1. Glucosamin hydroclorua.

Công thức cấu tạo:

OHC OH

NH2

OH

OH

OH

HCl

4 Tên gọi khoa học: 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose hydrochloride;

Chitosamine hydrochloride; D-glucosamine hydrochloride; D-(+)-glucosamine

hydrochloride.

Công thức phân tử: C6H13O5N.HCl

Phân tử lượng: Mglucosamin.HCl = 215.63

Glucosamin hydroclorua là chất rắn dạng tinh thể màu trắng, không mùi.

Điểm nóng chảy 190-1940C hoặc 3000C

Tan được trong nước 0,1g/ml

1.6.2. Glucosamin sulfat


OHC OH

NH2

OH

OH

OH

H2SO4

5




Tên gọi khoa học: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose sulfate; D-glucosamine

sulfate.

Công thức phân tử: C6H13O5N.H2SO4

Phân tử lượng: Mglucosamin.H2SO4 = 277,24

1.6.3. Acetyl glucosamin


OHC OH

NHAc

OH

OH

OH

6 Tên gọi khoa học: 2-Acetoamido-2-deoxy-D-glucopyranose; N-acetyl-D-

(+)-glucosamine; N-acetyl-β-D-glucosaminide; N-acetylchitosamine.

Công thức phân tử: C8H15O6N

Phân tử lượng: Macetylglucosamin = 221,21

Điểm nóng chảy: 201 - 2100C

Tan được trong nước, 0,1g/ml

1.7. Dược lý và dược động học của glucosamin và muối của nó [9]

Glucosamine là một aminomonosacharit được

thấy trong tự nhiên, nguyên liệu để tổng hợp

proteoglycan. Glucosamin kích thích tế bào sụn khớp

tăng tổng hợp và trùng hợp nên cấu trúc proteoglycan

bình thường. Kết quả của quá trình trùng hợp là tạo ra

mucopolysaccharit, thành phần cơ bản tạo nên sụn khớp.

Bình thường sụn khớp được cấu tạo chủ yếu bởi nước,

collagen và proteoplycan.

Glucosamin đồng thời ức chế các enzym phá

hủy sụn khớp như collagenase, phospholipase A2

và giảm các gốc tự do superoxid phá hủy các tế bào

sụn. Glucosamin còn có tác dụng kích thích sinh sản

Hình 5 : Đau xương cột sống

Hình 6 : Khớp nối




mô liên kết của xương, giảm quá trình mất canxi của xương [ 9].

Khi thiếu glucosamin thì sụn đặc biệt là sụn khớp háng, đầu gối bị hỏng,

cứng, tạo gai xương gây biến dạng khớp làm hạn chế vận động, dẫn đến bệnh

viêm xương khớp phát triển.

Do glucosamin làm tăng sản xuất chất nhầy

dịch khớp nên tăng độ nhớt, khả năng bôi trơn của

dịch khớp, vì thế không những làm giảm triệu

chứng của thoái hóa khớp (đau, khó vận động) mà

còn ngăn chặn quá trình thoái hóa khớp, ngăn chặn

bệnh tiến triển [9].

Thuốc tác động vào cơ chế sinh bệnh của

thoái hóa khớp, điều trị các bệnh thoái hóa xương

khớp cả cấp và mãn tính, cải thiện chức năng khớp

và ngăn chặn bệnh tiến triển, phục hồi cấu trúc sụn

khớp.

Từ tuổi 45 - 50 trở lên, bệnh có chiều hướng tăng (27% ở tuổi 60 - 70%,

45% ở tuổi 80). Đối tượng nguy cơ dễ mắc bệnh khớp nhất là người già, người

béo phì, người bị chấn thương khớp, có dị tật bẩm sinh, bệnh về chuyển hoá, di

truyền hoặc bị xáo trộn về kích tố [1].

Các muối của glucosamin có khả năng giải phóng và sản sinh

mucopolysacharit khuếch tán tốt vào dịch khớp, phát huy tốt tác dụng chống

viêm khớp.

Các dẫn xuất glucosamin thông dụng được dùng phổ biến ngày nay là:

• Glucosamin hydroclorua.

• Glucosamin sulfat.

• Acetyl glucosamin.

Trong thực nghiệm trên thỏ con, người ta thấy glucosamin chỉ làm tăng

thành phần các proteoglycan trong các vị trí mô sụn hư cần phải sửa chữa mà

không có tác dụng tương tự trên phần sụn khớp bình thường.

Những năm gần đây, glucosamin được dùng rộng rãi trong điều trị viêm

khớp, thoái hóa khớp. Tuy nhiên, theo một nghiên cứu mới của tiến sĩ Ronald

Hình 7 :Các vị trí

khớp nối




Tallarida thuộc trường Đại Học Y khoa Temple, Philadelphia (Mỹ) cho thấy nếu

sử dụng glucosamin đơn độc sẽ không có hiệu quả chống đau. Nhưng nếu kết

hợp với một loại thuốc nhóm kháng viêm không steroid (NSAID) thì tác dụng

chống đau, chống viêm tăng lên rất nhiều.

Thực tế lâm sàng cho thấy nó mang lại nhiều ưu điểm trong điều trị hơn

hẳn các thuốc NSAID. Nhược điểm của thuốc

NSAID là có nhiều tác dụng phụ, còn khi sử

dụng glucosamin thì lại rất ít tác dụng phụ. Một

vài dị ứng không đáng kể đối với người có cơ

địa quá mẫn cảm với thuốc.

Trước đây glucosamin được xếp vào

nhóm thuốc bảo vệ sụn (gồm có glucosamin,

chondroitin và diacerin) hay thuốc tác dụng

chậm với các bệnh viêm khớp. Hiện nay cơ

quan Dược phẩm Châu Âu (EMEA) chấp nhận

xếp glucosamin vào danh mục thuốc giúp cải

thiện cấu trúc trong bệnh viêm khớp. Các loại

khác chưa được chấp nhận vì không đáp ứng

được các yếu cầu trên lâm sàng.

Ở Việt Nam hiện nay cũng đang sử dụng

một số loại thuốc có chứa glucosamin như :

Lubrex, Lubrex-F, Glucosamin, Glusivac,…[9].

Nhưng các thuốc này chủ yếu vẫn nhập khẩu từ

nước ngoài.

Đã có rất nhiều nghiên cứu thử nghiệm so

sánh glucosamin với các loại thuốc NSAID, cho

kết quả như sau [8]:

1. Cải thiện triệu chứng viêm khớp tương

đương với NSAID trong thời gian ngắn

và vượt trội hơn hẳn nếu uống thuốc thời

gian dài.

Hình 8 : Một số thuốc

glucosamin hiện đang lưu bày trên thị trường Việt

Nam




2. Tính an toàn hơn hẳn với các loại đi từ NSAID.

3. Người ta dùng phối hợp glucosamine và NSAID cho kết quả tốt hơn khi

dùng đơn độc NSAID trong thời gian ngắn. Sau đó ngưng sử dụng

NSAID, tiếp tục sử dụng glucosamin thì tình trạng cải thiện vẫn tiếp tục

được duy trì theo kiểu tuyến tính.

4. Người ta thấy nếu dùng NSAID, những ích lợi giảm triệu chứng cho bệnh

nhân sẽ nhanh chóng mất đi ngay sau khi ngưng thuốc. Ngược lại, ngưng

uống glucosamin tác dụng vẫn tiếp tục kéo dài trong nhiều tháng sau đó.

5. Với những bệnh nhân tuân thủ phác đồ điều trị dùng glucosamin càng dài

thì lợi ích kinh tế càng lớn vì tính an toàn và hiệu quả của nó càng được

phát huy.

Theo các nhà nghiên cứu khi bị hấp thu vào dạ dày, muối glucosamin

sulfat bị ion hóa hoàn toàn do nồng độ tương đối lớn axit HCl (pH = 1 - 3) sẵn có

trong dạ dày. Như một tất yếu, các ion glucosamin và các ion sulfate bị trộn lẫn

với một lượng lớn ion Cl- và ion H+. Nếu khảo sát hỗn hợp này và tách loại muối

glucosamin ra thì lại nhận được 99% muối glucosamin hydroclorua do muối dạng

sulfate đã bị mất đáng kể do nồng độ rất thấp so với nồng độ rất lớn axit HCl có

mặt trong dạ dày.

1.8. Một số quy trình sản xuất chitin, chitosan trên thế giới và tại Việt

Nam

1.8.1. Trên thế giới

1.8.1.1. Quy trình thủy nhiệt Yamasaki và Nacamichi (Nhật bản) [3]

Nguyên liệu là vỏ cua đã khô, sạch được đem khử khoáng bằng HCl 2N

trong thời gian là 1 giờ (tác giả cho rằng hiệu quả khử khoáng có thể đạt được

100%).

Sau đó đem rửa sạch và đem làm khô. Tiếp theo là tiến hành kết hợp hai

công đoạn khử protein và deacetyl đồng thời trong dung dịch NaOH 15N ở nhiệt

độ 1500C trong 1 giờ, kết quả cho thấy protein được tách ra triệt để và độ

deacetyl đạt trên 70%. Sau thời gian 1 giờ đem rửa sạch và làm khô sẽ thu được

chitosan thành phẩm.




Phương pháp này có ưu điểm là quy trình đơn giản công đoạn, rút ngắn

đáng kể thời gian sản xuất so với các quy trình khác. Hóa chất sử dụng ít (HCl và

NaOH), chitosan thu được có độ tinh khiết cao. Tuy nhiên cũng có nhược điểm là

sản phẩm chitosan thu được có độ nhớt thấp, tiêu tốn nhiều năng lượng cho các

khâu sản xuất.

1.8.1.2. Quy trình sản xuất chitin của Hackman [3]

Vỏ tôm hùm được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 1000C; tiếp theo được

khử khoáng bằng HCl 2N với tỷ lệ w/v=1/10 ở nhiệt độ phòng, sau thời gian 5

giờ đem rửa trung tính và sấy khô ở 1000C, và đem xay nhỏ.

Ngâm tiếp trong dung dịch HCl 2N với tỷ lệ w/v=1/2,5 ở nhiệt độ phòng.

Sau 48 giờ đem ly tâm thu phần bã và đem rửa trung tính. Ngâm bã bột đã rửa

trong dung dịch NaOH 1N với tỷ lệ w/v= 1/2,5 ở nhiệt độ 1000C, sau 42 giờ đem

ly tâm thu phần bã. Sau đó lại tiếp tục ngâm trong NaOH 1N với tỷ lệ và nhiệt độ

trên, sau 12 giờ đem ly tâm thu phần bã. Tiếp theo đó rửa trung tính và đem làm

sạch bằng cách ly tâm với các chất theo thứ tự: nước, etanol và ete. Sau đó làm

khô ta được sản phẩm dạng bột màu kem.

Với quy trình này thì có nhiều công đoạn tăng khả năng khử khoáng, khử

protein song do cồng kềnh, chỉ thích hợp cho đối tượng là vỏ tôm hùm, tôm mũ

ni và vỏ cua, thời gian thực các công đoạn kéo dài, do đó quy trình Hackman chỉ

mang tính nghiên cứu thí nghiệm, không có tính khả thi nếu sản xuất đại trà, quy

trình mới chỉ dừng lại đến sản phẩm là chitin.

1.8.1.3. Quy trình sản xuất chitosan của Pháp [3]

Nguyên liệu (vỏ tôm) sạch được đem đi hấp chín, phơi khô, ta đem đi xay

nhỏ. Khử proteinn bằng NaOH 3,5% với tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ 650C, sau 2

giờ vớt ra rửa trung tính, tiếp đó ngâm trong HCl 1N với tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt

độ phòng sau 2 giờ vớt ra tiến hành tẩy các chất màu hữu cơ bằng aceton với tỷ lệ

w/v=1/5, ở nhiệt độ phòng sau 30 phút vớt ra rửa sạch và tẩy màu lại bằng nước

javen (NaOCl + NaCl) 0,135%, tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ phòng sau 6 phút với

ra rửa trung tính, thu được chitin sạch đẹp. Sau đó tiến hành deacetyl chitin bằng

NaOH 40% với tỷ lệ w/v=1/4, ở nhiệt độ 850C sau thời gian 4 giờ đem rửa trung

tính, thu được chitosan.




Quy trình có ưu điểm là thời gian sản xuất ngắn, sản phẩm có màu sắc đẹp,

sạch do có hai bước khử sắc tố. Tuy nhiên NaOCl là một chất oxy hóa mạnh, ảnh

hưởng đến mạch polyme, do đó độ nhớt sản phẩm giảm rõ rệt. Mặt khác aceton

có giá trị đắt tiền, tổn thất nhiều, giá thành sản phẩm sẽ cao. Chưa kể các yếu tố

trong an toàn sản xuất, công nghệ này khó áp dụng trong điều kiện sản xuất ở

nước ta hiện nay.

1.8.1.4. Phương pháp điều chế chitin của Capozza [17]

Cân 149g nguyên liệu vỏ tôm sạch cho vào bình khuấy với một máy

khuấy, thêm từ từ 825ml axit HCl 2N vào bình, thực hiện phản ứng ở 40C trong

thời gian 48 giờ. Sản phẩm sau quá trình khử khoáng được rửa sạch bằng nước

đến pH = 7. Xác định hàm lượng tro 0,4 - 0,5%. Sau đó sản phẩm được khuấy ở

nhiệt độ phòng với 1500ml axit fomic HCOOH 90%, để qua đêm. Hỗn hợp được

lọc ly tâm lấy phần bã và rửa lại với nước nhiều lần cho đến khi pH = 7. Sản

phẩm sạch sau đó được ngâm ngập trong 2 lít dung dịch NaOH 10% và đun nóng

ở 90 - 1000C trong 2,5 giờ. Dung dịch được lọc và rửa sạch với nước đến pH = 7,

sau đó sản phẩm được tráng rửa lại trong ethanol 960 và ether. Sấy khô ở 400C

dưới áp suất giảm. Khối lượng chitin khô sạch thu được là 66g. Hiệu suất 44,3%.

1.8.2. Tại Việt Nam

1.8.2.1. Quy trình sản xuất chitosan của Đỗ Minh Phụng [3]

Nguyên liệu là vỏ tôm khô được khử khoáng bằng HCl 6N với tỷ lệ

w/v=1/2,5, ở nhiệt độ phòng, sau 48 giờ đem rửa trung tính, tiếp theo đun trong

NaOH 8% với tỷ lệ w/v=1/1,5, ở nhiệt độ 1000C, sau 2 giờ khử protein rồi đem

rửa trung tính.

Tiến hành tẩy màu bằng KMnO4 1% trong môi trường H2SO4 10%, sau 1

giờ đem rửa sạch và khử màu phụ bằng Na2S2O3 1,5% trong 15 phút, vớt ra rửa

sạch thu được chitin.

Deacetyl chitin bằng NaOH 40% với tỷ lệ w/v=1/1, ở nhiệt độ 800C sau 24

giờ đem rửa sạch và cuối cùng thu được chitosan.

Sản phẩm có chất lượng khá tốt, chitin có màu trắng đẹp. Song thời gian

còn dài, sử dụng nhiều chất oxy hóa dễ làm ảnh hưởng tới độ nhớt của sản phẩm.




1.8.2.2. Quy trình sản xuất chitosan ở Trung tâm cao phân tử Viện Khoa

Học Việt Nam [3]

Nguyên liệu là vỏ ghẹ hay vỏ tôm sạch được khử khoáng lần 1 bằng HCl

4% ở nhiệt độ phòng, sau thời gian 24 giờ đem rửa trung tính để làm giảm lượng

NaOH tiêu hao ở công đoạn sau.

Nấu trong NaOH 3% ở nhiệt độ 90 - 950C, sau 3 giờ đem rửa trung tính,

tiếp tục khử khoáng lần 2 bằng HCl ở nhiệt độ phòng, sau 24 giờ đem di rửa

trung tính và đem nấu lần 2 trong NaOH ở nhiệt độ 90 - 950C, sau 3 giờ đem rửa

trung tính. Cuối cùng nấu trong NaOH 40%, rửa trung tính và sấy khô thu được

chitosan.

Sản phẩm chitosan sản xuất theo quy trình này có màu sắc không đẹp bằng

sản phẩm theo quy trình của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, thời gian thực hiện quy trình

kéo dài, nhiều công đoạn.

1.8.2.3. Quy trình sản xuất chitin của Xí nghiệp thủy sản Hà Nội [3]

Nguyên liệu là vỏ tôm khô hoặc tươi được loại bỏ hết tạp chất, xử lý tách

khoáng lần 1 trong HCl 4%, tỷ lệ w/v=1/2, ở nhiệt độ phòng sau 24giờ vớt ra rửa

trung tính. Sau đó dùng NaOH 2% để tách protein lần 1 với tỷ lệ w/v=1/2,8 ở

nhiệt độ 90=950C, sau 3 giờ rửa và tiến hành khử khoáng lần 2 cũng dùng HCl

4%, tỷ lệ w/v=1/2, ở nhiệt độ phòng sau 24 giờ đem rửa trung tính. Để tách

protein lần 2 cũng dùng NaOH 2%, w/v=1/2,8, ở nhiệt độ 90=950C, sau 3 giờ rửa

trung tính và tiến hành khử khoáng lần 3 cũng giống như lần khử khoáng trên.

Sản phẩm đem làm khô thu được chitin.

Chitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công đoạn tẩy màu.

Nhưng nhược điểm là thời gian sản xuất của quy trình kéo dài, nồng độ hóa chất

xử lý cao kết hợp với thời gian xử lý dài (công đoạn khử khoáng) làm cắt mạch

polyme trong môi trường axit dẫn đến độ nhớt giảm.

1.8.2.4. Quy trình sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học kết hợp

hóa học [3]

Việc sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học kết hợp hóa học cũng

thực hiện theo các bước : khử khoáng, khử protein và deacetyl.




Công đoạn khử khoáng hiệu quả nhất và duy nhất chỉ thực hiện bằng

phương pháp hóa học.

Công đoạn khử protein và deacetyl có thể thay thế bằng phương pháp sinh

học, đó là khử protein bằng proteaza và deacetyl bằng enzym deacetylaza.

Vỏ tôm được ngâm trong HCl 10% tỷ lệ w/v = 1/10, để ở nhiệt độ phòng

trong thời gian 5giờ. Rửa sạch đến pH= 7. Sau đó khử protein bằng papain 13%,

tỷ lệ w/v = 1/5, pH = 5 - 5,5, ở nhiệt độ 70 - 800C trong thời gian 4 giờ. Rửa sạch,

tẩy màu và sấy khô ở 600C thu được chitin khô, trắng. Deacetyl chitin bằng

NaOH 35%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở 900C trong thời gian 5,5 giờ. Rửa sạch và sấy

khô thu được chitosan sạch.

Chitosan thu được có màu sắc trắng, đẹp, trong và mềm mại. Quy trình

papain cho sản phẩm có độ nhớt cao hơn các quy trình khác. Tuy nhiên điều kiện

khó khăn do việc tìm mua hoặc sản xuất enzym deacetylaza nên công đoạn

deacetyl được thực hiện bằng việc nấu NaOH đậm đặc.

1.9. Quy trình sản xuất glucosamin hydroclorua (glu.HCl)

1.9.1. Quy trình sản xuất glu.HCl của Trần Thị Luyến [3]

Để khử khoáng, vỏ tôm được ngâm trong HCl 10%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở

nhiệt độ phòng trong thời gian 5 giờ, sau đó vớt ra rửa sạch đến pH=7. Sau đó

khử protein kết hợp deacetyl hóa trong NaOH 40%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở nhiệt độ

95 - 1000C trong thời gian 6,5 giờ. Tẩy màu rửa sạch, sấy khô. Chitosan được

đun trong HCl 35%, tỷ lệ w/v = 1/4, ở nhiệt độ 95 - 1000C trong thời gian 4 giờ.

Sau đó lọc bỏ cặn, làm lạnh 0 - 20C trong thời gian 2 giờ khi đó kết tinh sẽ xuất

hiện. Lọc tách kết tinh, hòa tan trong nước cất, khử màu qua than hoạt tính, cô

cạn và lại thực hiện kết tinh. Sau khi kết tinh lần cuối (khoảng 3 lần), tinh thể

trắng, lọc lấy tinh thể đem rửa lại bằng cồn, sau đó sấy khô ở 50 - 600C.

1.9.2. Quy trình sản xuất glu.HCl của Đỗ Đình Rãng [14]

Vỏ tôm khô, sạch, nghiền thành bột, sau đó đun sôi nguyên liệu với nước

trong 2 giờ và gạn bỏ protein, sấy khô. Nguyên liêu khô đun trong HCl 5% tách

khoáng, rửa sạch đến pH=7 và sấy khô. Khử hoàn toàn protein trong NaOH 5%,

đun sôi. Sản phẩm rửa sạch đến pH=7, sấy khô. Chitin thu được có màu trắng




phớt hồng. Từ chitin để chuyển hóa thành glucosamin bằng cách thủy phân trong

dung dịch axit HCl đậm đặc 36%, ở nhiệt độ 1000C, tẩy màu băng than hoạt tính,

để kết tinh và lọc. Sấy khô, thu được tinh thể glucosamin hydroclorua trắng. Hiệu

suất quá trình 51,4%.




Chương II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

*Vật liệu:

Vỏ tôm

*Hóa chất:

Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết như axit hydroclorua (HCl), natri

hydroxit (NaOH), kali permanganat (KMnO4), axit oxalic (C2H2O4), oxi già

(H2O2), axit acetic CH3COOH, ngoài ra còn có các dung môi khác như nước cất,

methanol, ethanol…

*Dụng cụ thí nghiệm:

Bình tam giác, bình cầu cổ nhám, cốc thủy tinh, cân phân tích, nhiệt kế,

thiết bị đo điểm nóng chảy, tủ sấy, bình hút ẩm, thiết bị gia nhiệt, khuấy từ, sinh

hàn hồi lưu, dụng cụ lọc…

2.2. Phương pháp nghiên cứu

1. Sử dụng các phương pháp chiết tách hóa học để tách chiết vỏ tôm thu

được chitin và deacetyl hóa chitin trong dung dịch NaOH đậm đặc thu

được chitosan.

2. Tổng hợp glucosamin hydroclorua từ chitin và chitosan.

3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng tới phản ứng như: thời gian phản ứng,

nhiệt độ phản ứng và nồng độ tác nhân tác nhân phản ứng.

4. Kiểm tra cấu trúc của sản phẩm điều ra thông qua các loại phổ như : IR, 1H-NMR, 13C-NMR tại Viện Hóa Học – Viện Khoa Học Việt Nam. So

sánh với các số liệu phổ đã công bố để xác định cấu trúc sản phẩm.

- Đo phổ IR trên máy FTR – IMPACT 410 của hãng

Nicolet.

- Đo phổ 1H – NMR và 13C – NMR trên máy Bruker AC-

500MHz trong dung môi D2O.




5. Kiểm tra, đo một số thông số như nhiệt độ nóng chảy trên máy Boetius –

MK (Đức).

6. Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi.

7. Phưong pháp xác định hàm lượng chất không tan.

a) Nguyên lý: Chitosan tan được trong axit acetic loãng, còn chitin và các

tạp chất khác thi không tan.

b) Tiến hành : Cân chính xác a gam chitosan hoà tan trong dung dịch axit

acetic 1%, khuấy đảo 60 phút cho chitosan tan hết rồi lọc, rửa cặn bằng axit

acetic loãng, sau đó rửa lại bằng nước cất và đem sấy khô đến khối lượng không

đổi.

Hàm lượng chất không tan được tính theo công thức:

(%)100*(%)a

BAX −=

Trong đó:

A : khối lượng phễu lọc + giấy + tạp chất sau khi sấy (g).

B : khối lượng phễu lọc + giấy lọc trước khi sấy (g).

a : khối lượng chitosan sử dụng (g).

X : Hàm lượng chất không tan (%).

8. Phương pháp xác định hiệu suất quá trình bằng phương pháp trọng lượng.




Chương III : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1.Quy trình điều chế chitin, chitosan và glucosamin hydroclorua

(glu.HCl)

Sơ đồ 3.1: Quy trình điều chế chitin, chitosan và glu.HCl từ vỏ tôm

Vỏ tôm sạch

Ngâm trong HCl 10%, Ts = 12 giờ, T0 = t0 phòng

Rửa trung tính

Đun trong NaOH 3%, Ts = 3,5 - 4 giờ, T0 = 90 - 950C

Rửa trung tính

1.Ngâm trong hỗn hợp KMnO4 + C2H2O4. Hoặc 2.Ngâm trong H2O2 1%.

Chitin trắng sạch

Loại Khoáng

Loại Protein

Rửa sạch, sấy khô ở T0 = 600C

Đun trong NaOH 50%, Ts = 4 giờ, T0=110 - 1200C

Chitosan Đun trong HCl 36%, Ts= 4 giờ,

T0 = 90-95%

Glucosamin hydroclorua

Rửa trung tính, sấy khô

Tẩy màu, lọc, sấy khô




3.2. Điều chế chitin từ vỏ tôm

Cân 40g vỏ tôm khô cho vào cốc 1lít, sau đó cho từ từ 200ml HCl 10%

vào và để ngập toàn bộ vỏ tôm, nhận thấy có hiện tượng sủi bọt mạnh chứng tỏ

có phản ứng xẩy ra, kiểm tra pH=1 - 2 là được, ngâm trong khoảng 12 giờ (để

qua đêm) và để ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lại khuấy để cho phản ứng xảy ra

nhanh hơn (đến khi không thấy bọt, khí thoát ra, thử pH vẫn còn axit).

Sau 12 giờ, vớt vỏ tôm ra và rửa lại bằng nước thường đến pH=7, sau đó

rửa bằng nước cất. Lúc này vỏ tôm có màu hồng nhạt và mềm do đã được loại

hết các tạp chất vô cơ.

Vỏ tôm thu được để ráo bớt nước sau đó cho vào bình cầu 500ml, đồng

thời cho NaOH 3% vào cho đến khi ngập hoàn toàn vỏ tôm và kiểm tra pH= 11-

12 là đạt yêu cầu. Đun ở nhiệt độ 90 - 950C trong khoảng 3,5 - 4 giờ, lúc đun có

lắp sinh hàn để tránh hiện tượng trào bọt ra ngoài và mùi khó chịu. Sau khi phản

ứng kết thúc đem sản phẩm đi rửa bằng nước thường đến pH=7, sau đó tráng lại

bằng nước cất. Sản phẩm thu được có màu trắng phớt hồng.

Chất màu (astaxanthin) có trong chitin được loại bỏ theo 2 phương pháp:

1. Cho 10ml dung dịch KMnO4 1% vào trong bình đựng chitin ở trên,

sau đó trộn đều với nhau, để trong thời gian 1 giờ ở nhiệt độ phòng.

Sau 1 giờ, rửa sạch sản phẩm, nhận thấy sản phẩm có màu tím đen

chứng tỏ vẫn còn nhiều KMnO4 chưa được rửa sạch. Để loại hết

KMnO4 ta dùng 50ml axit Oxalic HOOC-COOH 1%, nhận thấy nếu

để ở nhiệt độ phòng thì khó loại hết màu tím, ta đem đun nóng ở

nhiệt độ 50 - 600C thì màu mất hoàn toàn, rửa sạch thu được sản

phẩm có màu trắng đẹp.

2. Ngâm ngập chitin bằng 60ml H2O2 1%, để qua đêm ở nhiệt độ

phòng. Sản phẩm sau khi ngâm tuy màu đã bớt nhiều nhưng vẫn

còn thấy hơi phớt hồng, rửa sạch bằng nước, tráng lại bằng nước

cất.

Sấy khô sản phẩm ở nhiệt độ 600C, thu được chitin trắng sạch.

Hiệu suất quá trình điều chế chitin được tính theo công thức sau:




21

1

(%) *100%mHm

=

Trong đó :

m1: số gam của vỏ tôm ban đầu (g).

m2: số gam chitin thu được (g).

H1(%) : hiệu suất của quá trình (%).

Kết quả thu được như bảng 3.1:

Bảng 3.1. Hàm lượng chitin trong vỏ tôm

STT Vỏ tôm (g) Chitin (g) Hiệu suất (%)

1 40 10,87 27,18

2 40 13,67 32,73

3 40 12,27 30,68

4 40 14,33 35,83

5 40 13,09 34,65

3.3.Điều chế chitosan bằng cách deacetyl chitin

Từ chitin điều chế trên, cân lượng chính xác 10g chitin cho vào bình cầu

500ml, sau đó cho 350ml dung dịch NaOH 50% cho đến ngập hoàn toàn chitin.

Đun ở nhiệt độ 110 - 1200C, có hồi lưu tránh bay hơi dung môi, bay mùi khó

chịu, thỉnh thoảng có khuấy cho phản ứng xảy ra nhanh, thời gian đun là 4 giờ.

Sản phẩm sau phản ứng được rửa sạch đến pH=7, rửa lại bằng nước cất, sấy khô.

Sản phẩm thu được là chitosan có màu trắng.

Hiệu suất quá trình điều chế chitosan được tính theo công thức:

42

3

(%) *100%mHm

=

Trong đó:

m3: khối lượng chitin tham gia phản ứng (g).

m4 : khối lượng sản phẩm chitosan thu được(g).

H2(%) : hiệu suất của quá trình (%).

Kết quả thu được ở bảng 3.2:




Bảng 3.2. Hiệu suất điều chế chitosan từ chitin

STT Chitin (g) Chitosan (g) Hiệu suất (%)

1 10 6,33 63,3

2 10 6,56 65,6

3 10 7,23 72,3

4 10 7,0 70,0

5 10 7,47 74,7

Tinh chế chitosan

Cân 5g chitosan cho vào cốc thủy tinh 1lít, sau đó cho 300ml axit acetic

CH3COOH 1%, khuấy ở nhiệt độ thường trong thời gian 30 phút thu được dung

dịch trong suốt. Dung dịch được đem đi lọc bỏ cặn bẩn.

Sau đó cho 30 ml NaOH 10% vào, khuấy đều trong 10 phút thu được dung

dịch keo. Lọc lấy kết tủa keo và rửa 3 lần bằng methanol (5ml/lần).

Cho kết tủa keo bào bình cầu 250ml, thêm 140ml CH3OH và đun ở nhiệt

độ 60 - 650C trong thời gian 5 giờ. Lọc và rửa bằng aceton 2 lần, sau đó sấy khô

ở 400C. Thu được 4,2g chitosan tinh khiết. Hiệu suất 84%.

3.4.Điều chế glu.HCl

3.4.1.Điều chế glu.HCl từ chitin

Cân 5g chitin khô (đã cắt nhỏ) cho vào bình cầu 250ml, sau đó thêm 40ml

HCl 36%. Đun cách thủy có lắp sinh hàn hồi lưu, khuấy đều và duy trì ở nhiệt độ

khoảng 90 - 950C. Khi nhiệt độ hỗn hợp trong bình phản ứng đạt 65 - 700C thì

chitin bắt đầu tan rất nhanh tạo thành dung dịch màu nâu đen. Đun trong thời

gian 4giờ.

Kết thúc thời gian phản ứng, sản phẩm được lọc nóng để loại bỏ cặn bẩn,

sau đó dịch lọc được tẩy màu bằng 1g than hoạt tính, giai đoạn này được hỗn hợp

được đun nóng đến 900C, sau đó duy trì ở nhiệt độ 50 - 600C trong thời gian 30

phút.




Lọc bỏ than hoạt tính thu được dung dịch có màu xanh nhạt trong suốt, để

nguội thu được dung dịch có màu vàng rơm. Dung dịch để nguội lạnh ở nhiệt độ

0 - 40C, thời gian để kết tinh là 12 giờ (để qua đêm).

Tinh thể glu.HCl được tách ra bằng phương pháp lọc, sau đó rửa lại sản

phẩm thu được bằng cồn 960. Sản phẩm được sấy khô ở nhiệt độ 600C thì thu

được tinh thể glu.HCl khô trắng đẹp.

Dịch lọc còn lại sau khi lọc kết tinh được cô bớt dung môi bằng cất chân

không ở nhiệt độ 60 - 650C, đến khi thể tích bằng 1/3 thể tích đem cô ban đầu, để

kết tinh và lọc lấy kết tinh, rửa bằng cồn 960, sấy khô.

Hiệu suất của quá trình điều chế glu.HCl từ chitin được tính theo công

thức sau:

6 73

5

(%) *100%m mHm+

=

Trong đó :

m5: khối lượng chitin ban đầu (g).

m6 : khối lượng glu.HCl kết tinh lần thứ nhất (g).

m7: khối lượng glu.HCl kết tinh lần thứ hai (g).

H3(%): hiệu suất của quá trình (%).


Bảng 3.3. Hiệu suất điều chế glucosamin hydroclorua từ chitin

STT Chitin (g) Glu.HCl (g) Hiệu suất (%)

1 5 3,12 62,4

2 5 3,14 62,8

3 5 3,10 62,0

3.4.2.Điều chế glu.HCl từ chitosan

Cân 5 gam chitosan cho vào bình cầu 250ml, thêm từ từ 40ml axit HCl

36% vào bình, sau đó thực hiện các thao tác tương tự như phần 3.4.1 trên.

Tính thời gian phản ứng khi chitosan bắt đầu tan vào dung dịch. Đun được

1 giờ thì nhận thấy dung dịch có độ nhớt cao, đun tiếp đến 3 giờ thì thu được

dung dịch đặc quánh. Kết thúc thời gian phản ứng, cho thêm 20ml nước cất vào




để pha loãng dung dịch rồi đem lọc lấy dung dịch nước cái. Dung dịch có màu

nâu đen được tẩy màu bằng than hoạt tính. Do có pha loãng dung dịch, lượng

nước đưa vào tương đối nhiều nên để có kết tinh cần phải cô bớt dung môi đến

thể tích 1/5 thể tích dung dịch ban đầu. Sau khi cô, dung dịch được để nguội lạnh

ở nhiệt độ 0 - 40C qua đêm. Nhận thấy có rất ít tinh thể glu.HCl được tạo thành,

hầu như là không đáng kể. Lọc lấy kết tinh, rửa lại bằng cồn, sấy khô.

Hiệu suất của quá trình điều chế glu.HCl từ chitin được tính theo công

thức sau:

%100*(%)8

94 m

mH =

Trong đó :

m8 : khối lượng chitosan ban đầu (g).

m9 : khối lượng glucosamin thu được (g).

H4(%) : Hiệu suất quá trình (%).


Bảng 3.4. Hiệu suất điều chế glucosamin hydroclorua từ chitosan

STT Chitosan (g) Glu.HCl (g) Hiệu suất (%)

1 5 0,5 10,0

2 5 0.35 7,0

3 5 0.6 12,0

3.4.3. Tinh chế glu.HCl

Cân 2g glu.HCl cho vào bình cầu 100ml, thêm dần 25ml cồn 960, đun sôi,

có khuấy ở nhiệt độ 75 - 800C.

Sau khi hỗn hợp sôi, cho từ từ nước cất tối thiểu vào, cho đến khi glu.HCl

tan hết (vẫn duy trì ở nhiệt độ sôi), lượng nước cất tối thiểu là 5,5 - 6ml cho 2g

glu.HCl. Đun tiếp 60 phút, lọc nóng. Để kết tinh lại ở nhiệt độ 0 - 40C trong thời

gian 4 giờ.

Tinh thể được lọc và rửa bằng cồn 960 (2 lần x 3ml), sấy khô ở nhiệt độ

600C thu được glu.HCl tinh khiết. Dung dịch nước cái đem cô bớt dung môi và




kết tinh lại để thu thêm glu.HCl. Sản phẩm thu được có nhiệt độ nóng chảy 192 -

1940C.

Cấu trúc của glu.HCl điều chế ra đã được đo các loại phổ IR, 1H-NMR, 13C-NMR.

Phổ IR có các vạch đặc trưng sau: ν(OH…O) 3354,44(cm-1); ν(N-H)

3289.88(cm-1); ν(C-H) 2852,33-2945,58(cm-1); δ(OH phẳng) 1422,37(cm-1); δ(OH không

phẳng) 1248,95(cm-1); ν(C-O) 1185,36(cm-1); ν(C-N) 1029,28(cm-1).

• α-D-glucosamin hydroclorua

OHO

HONH2.HCl

OH

OH

12

3

4 56

Phổ 1H-NMR (500MHz, D2O, δ : ppm)

5,42 (d, J = 3,5Hz, 1H, H1); 3,3 (dd, J = 3,5Hz; 10,5Hz, 1H, H2);

3,5 – 3,9 (m, 4H, H3, H4, H5, H6).

Phổ 13C-NMR (125MHz, D2O, δ : ppm)

89,6 (C1); 54,7 (C2); 70,0 (C3); 70,2 (C4); 72,0 (C5); 60,8 (C6).

• β-D-glucosamin hydroclorua

OHO

HONH2.HCl

OH

OH

12

3

4 56

Phổ 1H-NMR (500MHz, D2O, δ : ppm)

4,93 (d, J = 8,5Hz, 1H, H1); 2,98 (dd, J = 8,5Hz; 10,5Hz,1H, H2);

3,2 – 3,9 (m, 4H, H3, H4, H5, H6).

Phổ 13C-NMR (125MHz, D2O, δ : ppm)

93,1 (C1); 57,2 (C2); 72,5 (C3); 76,6 (C4); 70,2 (C5); 60,9 (C6).




Hình 9: Phổ IR – glucosamin hydroclorua




Hình 10 : Phổ 1H-NMR – glucosamin hydroclorua




Hình 11 : Phổ 13C-NMR – glucosamin hydroclorua




3.6. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất điều chế glu.HCl

từ chitin

Tiến hành phản ứng như mục 3.4.1 làm trong bình cầu 250ml (5 lần) với

mỗi lần 5g chitin, 40ml HCl 36%, nhiệt độ phản ứng 90 - 950C nhưng thực hiện

với điều kiện thời gian khác nhau:

• Lần 1: thời gian phản ứng 1giờ.

• Lần 2: thời gian phản ứng 2 giờ.




Kết quả thu được được trình bày trong bảng 3.5:

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất của phản ứng:

Ts (h) 1 2 3 4 5

Chitin(g) 5 5 5 5 5

Glu.HCl(g) 2,93 2,97 3,05 3,14 3,11

H(%) 58,6 59,4 61,0 62,8 62,2

3.7. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất điều chế glu.HCl

từ chitin


mỗi lần 5g chitin, 40ml HCl 36%, thời gian phản ứng 4 giờ nhưng thực hiện với

điều kiện ở những khoảng nhiệt độ khác nhau.

• Lần 1: khoảng nhiệt độ 25 - 300C (nhiệt độ phòng).

• Lần 2: khoảng nhiệt độ 55 - 600C.

• Lần 3: khoảng nhiệt độ 90 - 950C.

Kết quả thu được được trình bày trong bảng 3.6:




Bảng 3.6 : Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng:

T0 (0C) 25 - 30 55 - 60 90 - 95

Chitin(g) 5 5 5

Glu.HCl(g) - 1,83 3,14

Hiệu suất (%) - 36,6 62,8

- : không xác định.

3.8. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ axit HCl đến hiệu suất điều chế

glu.HCl từ chitin


lần 5g chitin, thời gian phản ứng 4giờ, nhiệt độ phản ứng 90 - 950C nhưng thực

hiện trong điều kiện nồng độ axit hydrocloric khác nhau:

• Lần 1: Nồng độ axit HCl 10%.

• Lần 2: Nồng độ axit HCl 20%.

• Lần 3: Nồng độ axit HCl 36%. Kết quả thu được được trình bày trong bảng 3.7:

Bảng 3.7.Ảnh hưởng của nồng độ axit HCl đến hiệu suất phản ứng.

HCl (%) 10 20 36

Chitin (g) 5 5 5

Glu.HCl (g) - - 3,14

Hiệu suất (%) - - 62,8

- : không xác định.




Chương IV : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

4.1. Điều chế chitin từ vỏ tôm

4.1.1. Quá trình khử khoáng

Trong vỏ tôm, thành phần khoáng chủ yếu là muối CaCO3, MgCO3 và rất

ít Ca3(PO4)2. Nên người ta thường dùng các loại axit như HCl, H2SO4… để khử

khoáng. Khi khử khoáng, nếu dùng HCl thì cho hiệu quả cao hơn. Nếu dùng

H2SO4 sẽ tạo muối khó tan nên ít sử dụng. Phản ứng của HCl để khử khoáng như

sau:

MgCO3 + 2HCl = MgCl2 + CO2 + H2O.

CaCO3 + 2HCl = CaCl2 + CO2 + H2O.

Ca3(PO4)2 + 6HCl = 3CaCl2 + 2H3PO4.

Trong quá trình rửa thì muối Cl- tạo thành được rửa trôi, nồng độ axit HCl

có ảnh hưởng lớn đến chất lượng của chitosan thành phẩm, đồng thời nó ảnh

hưởng lớn tới thời gian và hiệu quả khử khoáng. Nếu nồng độ HCl cao sẽ rút

ngắn được thời gian khử khoáng nhưng sẽ làm cắt mạch do có hiện tượng thủy

phân các liên kết β-(1-4) glucozit để tạo ra các polyme có trọng lượng phân tử

trung bình thấp, có khi bị thủy phân triệt để đến glucosamin. Ngược lại nếu nồng

độ HCl quá thấp thì quá trình khử khoáng sẽ không triệt để và thời gian xử lý kéo

dài ảnh hưởng tới chất lượng của sản phẩm.

Tỷ lệ nguyên liệu và dung dịch axit HCl cũng ảnh hưởng tới hiệu quả khử

khoáng. Vì vậy, ở đây chúng tôi chọn dung dịch HCl 10% với tỷ lệ chitin/HCl là

w/v = 1/5 và thời gian khử khoáng là 12 giờ (qua đêm) để đảm bảo quá trình khử

khoáng xảy ra hoàn toàn.

Sau khi khử khoáng chúng tôi tiến hành rửa trung tính, công đoạn này có

tác dụng rửa trôi hết các muối, axit dư tan trong nước. Quá trình rửa kết thúc khi

dịch rửa cho pH=7.

4.1.2. Quá trình loại bỏ protein

Sau khi có vỏ tôm đã loại khoáng, chúng tôi tiến hành loại bỏ hoàn toàn

protein bằng dung dịch NaOH 3%, protein bị kiềm thủy phân thành các amin tự




do tan và được loại ra theo quy trình rửa trôi. Lượng NaOH 3% cho vào đến khi

ngập toàn bộ vỏ tôm và kiểm tra pH = 11 - 12 là được để đảm bảo việc loại bỏ

protein được hoàn toàn. Đun ở nhiệt độ 90 - 950C trong khoảng 3,5 - 4 giờ (trong

quá trình đun lưu ý vấn đề trào dung môi do tạo bọt nhiều và mùi bay ra khó

chịu). Sản phẩm sau khi đun được rửa sạch bằng nước thường và nước cất đến

pH = 7.

Tiếp đó chúng tôi tiến hành rửa trung tính, nhằm mục đích rửa trôi hết các

muối natri, các amin tự do và NaOH dư. Sấy khô ở 600C, thu được chitin thô.

4.1.3. Quá trình tẩy màu (loại bỏ astaxanthin)

Chitin thô thu được có màu hồng nhạt do còn sắc tố astaxanthin. Do chitin

ổn định với các chất oxy hoá như thuốc tím (KMnO4), oxy già (H2O2), nước

javen (NaOCl+NaCl), Na2S2O3, CH3COCH3,…lợi dụng tính chất này chúng tôi

đã sử dụng KMnO4, H2O2 để khử màu cho chitin.

• Cách 1:

Dùng hỗn hợp KMnO4 1% + C2H2O4 1% để tẩy màu. Trước tiên chúng tôi

cho chitin thô (phân lập từ 40g vỏ tôm) vào cốc thuỷ tinh, sau đó cho dung dịch

KMnO4 1% (10ml) vào, khuấy đảo sao cho toàn bộ chitin đều ngấm dung dịch

KMnO4 1%, để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 1 giờ. Hỗn hợp được rửa sạch,

sản phẩm chitin lúc này có màu tím của KMnO4. Để loại màu tím chúng tôi sử

dụng 50ml axit oxalic 1% ((COOH)2), để tăng nhanh khả năng tẩy màu chúng tôi

đun nóng hỗn hợp dung dịch ở nhiệt độ 50 - 600C đến khi chitin có màu trắng

hoàn toàn.

Theo cách này một số tác giả rằng sản phẩm của phản ứng có tạo ra Mn2+,

mà trong chitin - chitosan có nhóm –NHCOCH3 và nhóm –NH2, do đó các nhóm

này có thể tạo phức với Mn2+ gây ra hiện tượng khâu mạch làm ảnh hưởng đến

phản ứng chuyển hoá tiếp theo.

• Cách 2:

Dùng H2O2 1% để tẩy màu. Chitin thô (phân lập từ 40g vỏ tôm) cho vào

cốc thuỷ tinh, sau đó cho 60ml dung dịch H2O2 1% vào ngập toàn bộ chitin, để

qua đêm ở nhiệt độ phòng. Chitin thu được có màu trắng phớt hồng. Chúng tôi

dùng H2O2 với nồng độ <1,5% để tránh hiện tượng oxy hoá phá mạch phân tử




chitin - chitosan. Với phương pháp này chitin thu được vẫn còn màu phớt hồng,

nếu đem đun nóng nhẹ lên khoảng 50 - 600C thì thu được chitin trắng hơn.

Chitin sau quá trình tẩy màu được rửa sạch bằng nước thường và được rửa

lại với nước cất. Sấy khô ở nhiệt độ 600C, thu được chitin khô sạch có màu trắng.

Lượng chitin thu được dao động từ 10,87g – 14,33g (27 – 36%).

4.2. Điều chế chitosan

Phương trình phản ứng điều chế chitosan từ chitin :

O

NHCOCH3

OH

CH2OH

*

O*

n

nNaOH 50%

110-1200C

O

NH2

OH

CH2OH

*

O*

n

+ nCH3COONa

Quá trình điều chế chitosan từ chitin thực chất là quá trình deacetyl hoá

(deacetylation) chitin, chuyển hoá nhóm –NHCOCH3 thành nhóm –NH2 và loại

bỏ nhóm acetyl -CH3CO, chuyển hoá thành muối natri (CH3COONa). Để thực

hiện được quá trình deacetyl hoá hoàn toàn, chúng tôi sử dụng NaOH đậm đặc

50%, thời gian là 4 giờ với nhiệt độ ở 110 - 1200C. Ở đây dựa vào tính chất

chitosan tan được trong dung dịch axit loãng tạo thành dung dịch keo trong suốt,

trong khi đó chitin không tan do đó chúng tôi sơ bộ kiểm tra mức độ chuyển hóa

chitin thành chitosan bằng cách lấy một ít sản phẩm cho vào CH3COOH 1%, nếu

sản phẩm tan tạo thành dung dịch keo trong suốt là được. Sau đó rửa trung tính

và sấy khô, chitosan thu được có màu trắng sáng. Quá trình điều chế chitosan từ

chitin cho hiệu suất tương đối cao (63,3 – 74,7%).

4.3. Điều chế glucosamin hydroclorua (glu.HCl)

Glucosamin là đơn vị cấu thành lên chitosan, các phân tử glucosamin liên

kết với nhau bằng liên kết glucozit tạo nên phân tử chitosan, mặt khác chitosan

lại là sản phẩm của quá trình deacetyl chitin, do đó để điều chế glu.HCl ta có thể

đi theo hai con đường :




1. Từ chitin dùng axit HCl đặc 36%, ở nhiệt độ cao thực hiện thủy

phân cắt mạch thu được glucosamin.

2. Thủy phân cắt mạch chitosan bằng axit HCl đặc (36%) ở nhiệt độ

cao để thu được glucosamin.

4.3.1. Điều chế glu.HCl đi từ chitin

Phương trình thuỷ phân chitin bằng axit HCl:

Chitin acetyl glucosamin glu.HCl + CH3COOHHCl 36%

H2O, T0caoHCl 36%

H2O, T0cao

O

NHCOCH3

OH

CH2OH

O OO

NHCOCH3

OH

CH2OH

O

HCl 36%

O

OH

OH

NHCOCH3

OH

CH2OHHCl 36%

H2O, T0cao

O

OH

OH

NH3Cl

OH

CH2OH

+ CH3COOH

H2O, T0cao

Phản ứng thủy phân cắt mạch chitin để thu glucosamin phụ thuộc rất nhiều

yếu tố. Qua tham khảo tài liệu chúng tôi đã khảo sát thời gian tối ưu cho phản

ứng và kết quả cho thấy thời gian phản ứng 4 giờ là tốt nhất (hiệu suất 62,8%).

Nếu kéo dài thêm thì hiệu suất phản ứng cũng không tăng lên. Điều này phù hợp

với các kết quả đã công bố. Do đó chúng tôi chọn thời gian để khảo sát ảnh

hưởng của các yếu tố tiếp theo là 4 giờ.

Qua thực nghiệm chúng tôi thấy rằng khi cho HCl đặc vào trong bình cầu

với chitin nếu khuấy ở nhiệt độ phòng thì chitin có tan nhưng thời gian tan kéo

dài rất lâu (2 giờ) và tạo hỗn hợp có độ nhớt cao. Nếu tăng dần nhiệt độ lên thì

đến 70oC chitin tan rất nhanh. Do đó chúng tôi đã khảo sát phản ứng này ở các

nhiệt độ khác nhau và kết quả cho thấy:




- Ở nhiệt độ phòng sau khi chitin tan hết chúng tôi tiếp tục khuấy trong

khoảng thời gian 4giờ. Lúc này thu đươc dịch keo không màu, rất khó khăn trong

vấn đề lọc, chúng tôi tiến hành pha loãng với methanol rồi lọc, dịch lọc được tẩy

màu bằng than hoạt tính ở nhiệt độ 55 - 60oC, cô dịch lọc để đuổi methanol và

loại bớt nước, để kết tinh qua đêm nhưng không thấy glucosamin kết tinh ra.

- Ở nhiệt độ 55 - 60oC kết quả cho thấy là thời gian để chitin tan nhanh

hơn nhiều (40 - 50 phút), dịch thu được có màu vàng rồi chuyển sang nâu đen,

dịch thu được vẫn có độ nhớt lớn, vẫn phải pha loãng với methanol để thuận lợi

cho quá trình lọc, tẩy màu, cô dịch lọc như trên, để kết tinh qua đêm và hiệu suất

glu.HCl thu được tương đối thấp (36,6%).

- Nếu tăng nhiệt độ lên đến 70oC chitin tan rất nhanh (2 – 3 phút) , dịch

thu được có độ nhớt vừa phải, có thể lọc được luôn mà không cần pha loãng với

methanol. Tẩy màu bằng than hoạt tính, cô dịch lọc, để kết tinh qua đêm. Hiệu

suất glu.HCl thu được tương đối cao (62,8%).

Trong tất cả các trường hợp chúng tôi đều cô đuổi bớt dung môi là

methanol và nước vì glu.HCl tan rất tốt trong nước (độ tan 01g/ml).

Sau khi chọn được thời gian và nhiệt độ tối ưu, chúng tôi cũng đã tiến

hành khảo sát nồng độ HCl tới hiệu suất phản ứng. Thực nghiệm được tiến hành

trên các dung dịch HCl có nồng độ lần lượt là 10%, 20% và HCl đặc (35 - 37%)

với tổng lượng mol HCl đưa vào là như nhau. Kết quả cho thấy ở các nồng độ

HCl 10% và 20% gần như không thu được glu.HCl. Do đó với phản ứng này yêu

cầu phải dùng HCl đặc (36 - 37%).

Qua đó chúng tôi đưa ra yêu cầu để thu được glu.HCl với hiệu suất tương

đối cao thì điều kiện của phản ứng là dùng HCl đặc (35 - 37%), nhiệt độ phản

ứng là 90 - 95oC, thời gian phản ứng là 4 giờ.

4.3.2. Điều chế glu.HCl từ chitosan

Phương trình phản ứng:

Chitosan HCl 36%H2O, T0cao

glu.HCl




O

NH2

OH

CH2OH

O OO

NH2

OH

CH2OH

OO

OH

OH

NH3Cl

OH

CH2OHHCl 36%

H2O, T0cao

Phương pháp tiến hành thí nghiệm và điều kiện như đã làm với chitin,

nhưng chất tham gia là chitosan. Chọn điều kiện tối ưu của chitin để tiến hành thí

nghiệm. Kết quả cho thấy thời gian để tan hết lượng chitosan tương đối dài (từ

1h15 phút - 1h30 phút). Dung dịch đặc quánh làm cho việc khuấy từ rất khó

khăn. Kết thúc thời gian phản ứng, chúng tôi lọc nóng nhằm loại bỏ các chất

không tan, kết quả là trên phễu lọc chúng tôi thu nhận được một lượng lớn chất

không tan dạng keo nhớt đặc. Dịch lọc được tẩy màu bằng than hoạt tính, lọc, cô

để loại bớt dung môi, để kết tinh qua đêm. Thấy có rất ít tinh thể glu.HCl được

kết tinh. Sản phẩm keo đã được hút kiệt nước được kiểm tra sơ bộ bằng cách cho

lượng mẫu keo vào hai cốc thuỷ tinh, cốc 1 chứa nước cất, cốc 2 chứa dung dịch

axit acetic 1% và khuấy trong 20 phút thì nhận được kết quả :

+) Cốc 1: Chất keo không tan tạo thành dung dịch huyền phù.

+) Cốc 2: Chất keo tan tạo thành dung dịch trong suốt.

Từ hai kết quả trên, chúng tôi cho rằng phản ứng chuyển hoá chitosan

thành glu.HCl ở điều kiện HCl 36%, T0 = 90 - 950C, Ts = 4 giờ là khó thực hiện,

tuy có sản phẩm glu.HCl tạo ra nhưng hiệu suất rất thấp (12%). Theo chúng tôi

có thể lý giải như sau: Khi cho HCl đặc vào dung dịch sau đó đun đến nhiệt độ

phản ứng, axit HCl sẽ kết hợp trước với nhóm –NH2 của chitosan tạo ra sản

phẩm chitosan hydroclorua (-NH2.HCl), sản phẩm này tồn tại dạng keo bền

không tan trong nước gây cản trở quá trình thuỷ phân cắt mạch liên kết glucozit,

do đó mà sản phẩm glu.HCl được tạo ra rất ít.

Nếu nhìn công thức cấu tạo của chitin và chitosan thì dường như việc tạo

ra glu.HCl từ chitosan sẽ dễ dàng và cho hiệu suất cao hơn so với là đi từ chitin,

nhưng thực tế thì ngược lại. Điều này có thể lý giải là do chitosan bị cắt mạch để

tạo thành các polyme đơn giản hơn như oligome – phần không tan nằm lại trên

phễu lọc. Chỉ có một phần rất nhỏ được thủy phân triệt để để tạo thành glu.HCl

dẫn đến là hiệu suất thu được từ chitosan rất thấp.




Phản ứng xảy ra như sau:

O

NH2

OH

CH2OH

O OO

NH2

OH

CH2OH

O

O

OH

OH

NH2HCl

OH

CH2OH

O

NH2

OH

CH2OH

OO

NH2

OH

CH2OH

O

O

NH2.HCl

OH

CH2OH

O OO

NH2HCl

OH

CH2OH

OO

NH2

OH

CH2OH

OO

NH2HCl

OH

CH2OH

O

HCl 36%H2O T0cao

HCl 36%H2O T0cao




KẾT LUẬN

Qua thời gian nghiên cứu các khía cạnh khác nhau của đề tài trên cơ sở các

mục tiêu đề ra. Chúng tôi đã đạt được một số kết quả như sau:

1. Điều chế ra chitin, chitosan từ vỏ tôm phế thải. Với hàm lượng chitin

thu được 27,18 – 35,83%, chitosan thu được 63,3÷74,7%.

2. Điều chế ra glucosamin hydroclorua đi theo con đường từ chitin. Với

hàm lượng glu.HCl thu được tương đối cao (62,8%).

3. Sơ bộ khảo sát tìm được điều kiện tối ưu hóa cho quá trình điều chế

glucosamin hydroclorua từ chitin. Với điều kiện axit HCl đặc 36%;

nhiệt độ phản ứng 90 – 950C; thời gian phản ứng là 4 giờ.

Một số kiến nghị và đề xuất: Do điều kiện thời gian và kinh phí có hạn nên một số thực nghiệm chưa có

điều kiện thực hiện. Vì vậy, nếu sau này có điều kiện xin được tiếp tục các

nghiên cứu sau:

1. Hoàn thiện quy trình sản xuất chitin, chitosan từ vỏ tôm phế thải từ các

nhà máy chế biến thủy sản, đông lạnh,… sao cho điều kiện là tối ưu

hóa và áp dụng được trên quy mô sản xuất công nghiệp.

2. Điều chế glucosamin dạng tự do từ chitin, chitosan làm nguyên liệu

sạch cho các nghiên cứu tổng hợp các hợp chất quan trọng khác có

ứng dụng lớn tới đời sống con người.




TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Nguyễn Đức Ý (Texas-Hoa Kỳ) “Dinh dưỡng với viêm khớp”. Tạp chí

sức khỏe đời sống, N0 344, tr 9-10, 2006.

2. Bách khoa toàn thư bệnh học. NXB từ điển BKHN, tập 2, tr 68-70.

2000.

3. Trần Thị Luyến, Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và một số cộng sự. “Hoàn

thiện quy trình sản xuất Chitin-Chitosan và chế biến một số sản phẩm

công nghiệp từ phế liệu vỏ tôm, cua”. Báo cáo khoa học, Đề tài cấp bộ.

Nha Trang.2000.

4. Phạm Lê Dũng, Trịnh Bình, Lại Thu Hiền và cùng các cộng sự . “Vật

liệu sinh học từ chitin”. Viện hóa học - Viện công nghệ sinh học, Trung

tâm khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia. Hà Nội.1997.

5. Đào Tố Quyên, Nguyễn Thị Lâm, Hà Thị Anh Đào & cộng sự. “Nghiên

cứu thử nghiệm PDP (chitosan) làm chất phụ gia trong sản xuất giò

lụa, bánh cuốn”. Viện dinh dưỡng. Trung tâm kỹ thuật an toàn vệ sinh

thực phẩm Việt Nam.

6. Nguyễn Thị Huệ, Bùi Thị Huyền. “Nghiên cứu thủy phân chitosan bằng

axít hữu cơ” và “Nghiên cứu phản ứng chitosan bằng axít Fomic và axít

Acetic”. Hội nghị khoa học và công nghệ hóa hữu cơ toàn quốc lần thứ

III, tr 210-221. 2005.

7. Nguyễn Thị Đông, Đỗ Trường Thiện, Nguyễn Văn Hoan. “Ứng dụng

chitosan khối lượng phân tử thấp để kích thích sinh trưởng đối với cây

lúa”. Tuyển tập các công trình hội nghị khoa học và công nghệ hóa hữu

cơ toàn quốc lần thứ 3, tr 445-449.2005

8. BS.Huỳnh Bá Lĩnh. “Glucosamine, thuốc mới điều trị bệnh viêm khớp”.

Bệnh Viện Việt Đức Hà Nội. Tài liệu truy cập mạng internet, theo địa

chỉ : vietduchospital.edu.vn.




9. Ts. Nguyễn Vĩnh Ngọc. “Thuốc điều trị thoái hóa khớp” Khoa xương

khớp Bệnh Viện Bạch Mai Hà Nội. Tạp chí Sức khỏe & đời sống ra

ngày 30/5/2006, số 964.

10. Lưu Vǎn Chính, Châu Vǎn Minh, Phạm Hữu Điển, Vũ Mạnh Hùng,

Ngô Thị Thuận. “Tổng hợp và nghiên cứu tác dụng hạ Cholesterol máu

của N,N,N-trimethyl chitosan (TMC)”. Tạp chí Dược học số 9, mục 5,

năm 2000.

11. Vũ Thị Ngọc Thanh, Đoàn Trọng Phụ, Nguyễn Thị Ty. “Nghiên cứu tác

dụng tăng sinh collagen của chitosan trong điều trị bỏng nhiệt thực

nghiệm”. Tạp chí Dược học số 9, mục 9, năm 2000.

12. Nguyễn Xuân Hoài, Hoàng Kim Huyền “Đánh giá tác dụng phụ của

thuốc chống viêm không steroid (NSAID) trong điều trị các bệnh xương

khớp tại một bệnh viện tuyến trung ương”. Tạp chí Dược học số 9, mục

10, năm 2000.

13. Đặng Văn Luyến, “Chitin/Chitosan”. Các bài giảng và báo cáo chuyên

đề, tập 2, tr 27-35, 1995.

14. Đỗ Đình Rãng, Phạm Đình Cường, “Xác định hàm lượng chitin của một

số loài thủy sản ở Việt Nam và chuyển hóa thành glucosamin”. Tạp chí

khoa học, N0 4, tr 66- 71, 1990.

TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI.

15. Sydney London. “Encyclopedia ò polymer Sciene and Technology”. Vol

3, p 605-704. 1965.

16. Kim. S. S., Kim. S. H. and Lee.Y. M. (1996). “Preparation,

characterization and properties of β-Chitin and N-Acetylated β-Chitin”,

J.Polymer Sci., Part B: Polymer physics. Vol 34, p.2367-2374.

17. Richard Carl Capozza, US. Pat. N0 4074713.

18. Singh Dinesh.K., Ray Alok.R., Macromol.J. “Biomedical Applications

of Chitin, Chitosan and their derivatives”.Sci., Res. Macromol. Chem.

Phys.2000, C40 (1), p. 69-83.




19. Richrdson, Simon.C.W., Kolbe Hanno.V.J., Duncan Ruth., “Chitosan

copolymers for intranasal Delivery of Insulin”. et al. C.A, Vol. 130, N0

25, 1999, p. 1141(342,853u), England.

20. Onishi Hiraku, Machida Yoshiharu et al. “Biodegradation and

distribution of weter – soluble PDP in mice”. C.A, Vol. 130, N0 2,

1999, p.1158(286,935h), Japan.

21. Mosbay.M., Deral.T. Pat. N0 EP 0356060. A2 900228, 1998, England.

22. Schuzczyk Henryk, Pomoell Harri, Wulff Marketta, Saynatjok Elina et

al. “Chitosan – based pharmaceuticals for reduction of cholesterol and

lipid contents”. C.A, Vol 132, N0 23, 2000, p.1170(313724P, Finland).

23. Jing. S. B., L. Li, D. Ji. Y. Takiguchi, T. Yamaguchi 1997 : “Effect of

chitosan on renal function in patients with chronic renal failure”, J.

Pharm. Pharmacol. Jun; 49 (7), p.721-723.

24. Yao Kangde, Yin Yuji, Cheng Guoxian, Zhou Jun. “Biomedical

developments in Chitosan – based polymers”. C.A, Vol 130, N0 13,

1999, p. 1052(172813, China).

25. Shigehiro Hirano, Haruyoshi Seino, Yasutoshi Akiyama and Isao

Nonaka. “Progress in Biomedical Polymers”. New York, 1990, p. 283-

290.

26. http://www.mpikg-golm.mpg.de/kc/scripts/Polysaccharide.pdf.

“Supramolecular Biopolymers II – Polysaccharides”. 07 – Jun - 2006

10:40AM, p. 24 - 39.

27. Inui Hiroshi Appl. Biol. Sci., 1997; Vol 2, N0 2, p 55 - 65.

Documents

Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm