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Nextera/Nextera XTサンプル調製キットの使用法と
トラブルシューティング
酒井 名朋子
Sr. Technical Applications Scientist
イルミナ株式会社
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Outline
Nextera/Nextera XT でのサンプル調製のながれ
Libraryのトラブルシューティング
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Nextera/Nextera XTでの
サンプル調製のながれ
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Nexteraキット: Streamlined Library Preparation
~ 2 days 1-5 µg
50 ng/1ng ~ 2 hours
Nextera
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TruSeq DNA？Nextera？Nextera XT？
どのキットを使用するか
DNAの量で決定する
– DNAを1ug準備でき、Covarisをおもちの場合
=> TruSeq DNA キット
– DNAが少量の場合、Covaris等の断片化装置をおもちでない場合
50ngある場合 =>Nextera キット
1ng程度ある場合 =>Nextera XTキット
DNAの由来で決定する
– HumanなどのGenomeサンプルをおもちの場合 =>TruSeq DNAまたはNexteraキット
– PCR Amplicon, 微生物などのGenomeサンプルをおもちの場合 =>Nextera XTキット
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サンプル調製に必要なキット
MiSeqでのRunにはソフトウェアのUpgrade、追加Seq Primerは不要
GA, HiSeqでDual Index Runを行うには
– >SCS2.10 または >HCS1.5
– TruSeq Dual Index Sequencing Primers Single Read Run FC-121-1003
Paired End Run PE-121-1003
Sample prep kit Index Primer kit
Nextera Nextera DNA Sample
Preparation Kit 96 samples/ FC-121-1031
24 samples/ FC-121-1030
Nextera Index Kit 96 Indices/ FC-121-1012
24 Indices/ FC-121-1011
Nextera XT Nextera XT DNA Sample
Preparation Kit 96 samples/ FC-131-1096
24 samples/ FC-131-1024
Nextera XT DNA Sample
Preparation Index Kit 96 Indices/ FC-131-1002
24 Indices/ FC-131-1001
ご準備いただくサンプル調製キットとSeq Primer
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Index for Nextera and Nextera XT
※Index kitのSwapは不可
Nextera FC-121-1011/1012
Nextera XT FC-131-1001/1002
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Nextera とNextera XT ワークフローの違い
Sample Input
Tagmentation Clean
Up PCR AMPure Normalization
Nextera ではZymo filterを使用
Nextera XTではバッファーで中和
Nextera XTのみ
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ご準備いただくサンプル
Nextera
– 50ng の input DNA
Nextera XT
– 1ng の input DNA
– DNA原液を測定後、0.2ng/uLになるように希釈
Best Practice
– Input DNAを正しく定量する
Pico GreenやQbitなど
– Input DNAの260/280=1.8-2.0であること
– Pipet のCalibrationを行う
– 300bp以上の断片であること
両端50bpのCoverageが落ちる
Sample Input
Tagmentation Clean
Up PCR AMPure Normalization
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Nextera とNextera XT 共通
– 55C にて5分間 Incubate
Best Practice
– 反応中のThermocyclerの温度が正しいこと
蓋も加温する
– Tagmentation終了後、10CでHold している間もTamentationは進んでいる
ただちに次のStep に移行
Tagmentation
transposomes gDNA
Sample Input
Tagmentation Clean
Up PCR AMPure Normalization
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Clean Up
Nextera
– Zymo精製キットにてClean Up
– 50uLのTagmentation Reaction
Mixを25uLに溶出
– Best Practice
なるべく新しく調製したEtOH入りZymo Wash Bufferを使用すること（EtOHが古いとTransposomeが残りPCRを阻害する）
BioanalzyerでTagmentation反応による断片サイズを確認する（150-1Kbp）
ろかは必ずx1300gで行う（Yield
が減る場合があります）
Nextera XT
– Buffer にて中和
– 20uLのTagmentation Reaction
mixに5uLのNT bufferを足す
Sample Input
Tagmentation Clean
Up PCR AMPure Normalization
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PCR Amplification
-IndexPrimerkitはNexteraとNexteraXTで異なる
Nextera
– PPC およびIndex Primerの2セットのPrimerを使用する
– PCR反応は5Cycle
Nextera XT
– Index Primerのみ使用するReactionはNexteraと同じ
– PCR反応は12Cycle
Sample
Input Tagmentation
Clean Up
PCR AMPure Normalization
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参考）Index配列の選択
Indexを選択される場合には事前にIEMでサンプルシートを作成し、Indexの組み合わせの確認をお勧めします。
– 1サイクルにG/Tから1チャンネル、A/Cから1チャンネルの最低2種類の塩基が存在する必要がある
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Nextera, NexteraXTに共通
– 精製およびサイズセレクションの役割
– PCR後に生成する68bp程度のPrimer Dimerを除去する
Nextera XT
AMPureビーズを使用したClean Up
Sample Input
Tagmentation Clean
Up PCR AMPure Normalization
Input DNAのサイズを示している
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Nextear XTのみ、NexteraにNormalization Stepは存在しない
ビーズを使用したDNAの量のNormalization（サンプル間での量の均一化）
– MiseqでのRunに適切な量にNormalizeされる
– Normalize後のサンプルはssDNA
Nextera XTサンプルをGA, HiSeqで流す場合：
– NormaraizationのステップをSkipし、qPCRで定量ののちCluster Generationに進む
Normalization
Sample Input
Tagmentation Clean
Up PCR AMPure Normalization
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Nextera とNextera XTの違い
Nextera DNA Nextera XT
サンプルの種類 Whole Genome Small Genome/ Amplicon
Input DNA量 50ng 1ng
Tagmentation 50uL rxn volume 20uL rxn volume
Zymo filterでの精製 Yes No (neutralization)
PCR Yes (5 cycles) Yes (12 cycles)
AMPureでのClean Up Yes (0.6x) Yes (0.6x, 1.8x)
Normalization No Yes
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Libraryのトラブルシューティング 1．Under tagmentation
2．Over tagmentaion
3．Libraryがなくなる
4．60bp程度のLibraryのみ存在する
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できたLibrary のサイズがExampleより大きい
– Input DNAの量が多い場合Tagmentation反応が進まず断片が大きくなる
解決法
– Input DNAの定量が正しいか再確認
– Input DNAを半分以下に減らしてみる
Tagmentation反応時間の延長はお勧めしません
– このままClusteringに進む
Insertサイズは大きくなりますがClusteringは可能です。（~1000bp程度）
1．Tagmentationがうまくいかない（Under Tagmentation)
Sample input = 50ng
Trace of final library
Sample input > 50ng
Trace of final library
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できたLibraryのサイズがExampleより小さい
– Input DNAの量が少ない場合Tagmentationが進みすぎる
解決法
– Input DNAの定量が正しいか再確認
– このままClusteringに進む
2．Tagmentationがうまくいかない（Over Tagmentation)
Sample input = 50ng
Trace of final library
Sample input < 50ng
Trace of final library
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NextearでLibrary調製後、BioanalyzerでLibraryのトレースが存在しない
– 精製ステップで失っている可能性がある
– PCR Primerを正しく使用していない（Index Primer kitを使用していない）
解決法
– どのステップでサンプルが失われたかを確認する
Tagmentation後のZymo Clean Upのステップ (150-1000bp)
AMPureビーズでの精製後
それぞれのステップでBioanlayzerにサンプルを流して存在を確認
– Zymo Clean Upの場合
Zymoプレートは乾燥した場所に保管する
X1300gでSping Downする
RSB添加後のEluteを捨ててしまっていないか確認する
– AMPureビーズの場合
推奨のビーズスタンドを使用する
80%EtOHを用事調製する
– Index Primer kitの使用を確認
3．Libraryがなくなる
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60bp程度のLibraryのみ存在する
– Zymo Clean Upのステップでサンプルが失われ、PCRでPrimer Dimerのみ生成される
– PCR反応がうまく進んでいない
解決法
– 3．で示した方法でZymo Clean Upのステップを確認
– Transposome がZymo Clean Upのステップでのぞききれず、PCR 反応が阻害される
用事調製したWash Bufferを使用
正しいPCR Primerを使用したかどうか確認する
ThermoCyclerの動作を確認
4．60bp程度のLibraryのみ存在する
