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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS
Carolina Pontes Soares
Efeitos da retirada de colesterol membranar sobre
cardiomiócitos crescidos in vitro
Dissertação apresentada a Pós-Graduação em Ciências
Morfológicas do Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos
requisitos para obtenção do Título de Mestre
Orientadora: Cláudia dos Santos Mermelstein
Março / 2009
Livros Grátis
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ii
Efeitos da retirada de colesterol membranar sobre
cardiomiócitos crescidos in vitro
CAROLINA PONTES SOARES
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Morfológicas do Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos
necessários à obtenção do Grau de Mestre em Ciências.
Banca Examinadora composta pelos professores:
___________________________ Profa. Tecia M. Ulisses de Carvalho - IBCCF / UFRJ
___________________________ Profa. Maria Isabel Doria Rossi - ICB / UFRJ
___________________________ Profa. Silvana Allodi - ICB / UFRJ
___________________________ Profa. Ana Maria B. Martinez - ICB / UFRJ - revisora
___________________________ Prof. Marcelo E. Lamas - IBCCF / UFRJ - suplente
iii
Ficha Catalográfica
SOARES, Carolina Pontes Efeitos da retirada de colesterol membranar sobre cardiomiócitos crescidos in vitro / Carolina Pontes Soares. Rio de Janeiro, UFRJ, Pós Graduação em Ciências Morfológicas, 2009. 65 pp, xv Tese (Mestrado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, PCM, 2009. 1. Cardiomiócitos. 2. Colesterol. 3. Membrana plasmática. 4. Tecido cardíaco. 5. Caderina – Tese. I. Tese (Mestrado) – Pós Graduação em Ciências Morfológicas. II. Título
iv
O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Diferenciação
Muscular e Citoesqueleto do Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob orientação da Profa. Cláudia
dos Santos Mermelstein e na vigência de auxílios concedidos pelo
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ),
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e
Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ).
v
“Tudo vale a pena quando a alma não é pequena”
Fernando Pessoa
vi
Agradecimentos
• Aos professores Cláudia Mermelstein e Manoel Costa pela grandiosa orientação,
por toda dedicação, exemplo de profissional e pessoa, apoio e principalmente
pelo incentivo, os quais foram indispensáveis para a realização deste trabalho.
• A minha querida amiga Débora, minha “Sub-orientadora” que mesmo passando
um tempo longe (Boston), esteve sempre presente dando conselhos e palavras
doces de incentivo.
• As minhas amiga e companheiras laboratório Danielle, Eliane, Laise e Eliana
que sempre compartilhavam as alegrias e as tristezas, vividas neste período de
mestrado, sempre com muita alegria.
• A minha querida amiga de laboratório Juliana pela amizade e pelos bons
momentos nesses últimos anos.
• Aos alunos de iniciação cientifica Cacau, Renata, Natalia e Joseph pelos
momentos de descontração e alegria vividos no laboratório, obrigada pela
amizade e pelo carinho.
• A professora Ana Martinez por ter me proporcionado a participação em seu
artigo e pela minuciosa revisão feita em minha tese.
• Ao Professor Vivaldo pelo apoio e incentivo dado neste período de mestrado.
• A Tânia e Alrizete por toda atenção e carinho.
• Aos meus pais Raimundo e Marize por todo amor, carinho e incentivo ao
ingresso no curso de mestrado. Sem o amor de vocês não teria alcançado este
sonho.
• As minhas amadas irmãs Celita e Laura, minha vida, por todo carinho, amizade
e incentivo.
• Aos meus avôs maternos Dona Maria (in memorium) e Sebastião e paternos
Narciso (in memorium) e Celita (in memorium) pelo exemplo de vida, amor,
carinho e principalmente por acreditarem no meu sonho.
• Aos meus tios queridos Acrinaldo, Delci e Maria Antônia, meus
“patrocionadores”, por todo carinho, amor e principalmente por acreditarem no
meu sonho.
vii
• A toda família Pontes e Soares; tios, tias, primos e primas, que são muitos, por
torcerem sempre por mim mesmo longe.
• A minha querida amiga Dra. Carla Lessa pelo incentivo dado na graduação e por
ter me indicado a fazer estágio no laboratório da Profa. Cláudia Mermelstein.
• Aos meus queridos amigos do Acre, da graduação em especial Adriana, Gabriel,
Hugo, Luciana e Magda pela força e pela amizade, sempre com uma palavra de
conforto e incentivo no período de mestrado.
• Aos meus bichinhos de estimação Neneca, Mila, Becky (Gatas) e Lisinha
(cachorrinha) pelos momentos de descontração proporcionados em minha vida.
viii
Dedicatória
A minha família, minha base, minha vida.
Aos meus amados pais, Raimundo Viana Soares e Marize Pontes Soares, pelo exemplo
de dignidade, caráter e por todo amor, carinho e incentivo que me deram ao longo da
minha vida.
As minhas queridas irmãs Celita e Laura, por todo amor, carinho, alegria, amizade e
pelas palavras doces de incentivo.
Aos tios, tias e primos que sempre, mesmo de longe, me apoiaram nesta caminhada.
Com amor, dedico este trabalho
ix
Abreviações
APS – Persulfato de amônio
ATP - Adenosina trifosfato
BSS - Solução salina balanceada
CMF - Solução salina balanceada sem cálcio e sem magnésio
CAMs - Moléculas de adesão celular
DABCO - 1,4-diazabiciclo-2-(2.2.2) octano
DAPI – 4,6-diamidino-2-fenilindole
DNA - Ácido desoxirribonucleico
DTT - Ditioetreitol
ECL - “Excelent chemiluminescent labeling”- marcador quimioluminescente
Fz - Proteína frizzled
FITC - Isotiocianato de fluoresceína
GATA - Fator da família de "zinc finger”
GFAP - Proteína ácida fibrilar glial
GPI – Glicosil-fosfatidil-inositol
GSK -3ββββ - Cinase sintase glicogênio-3β
GTP - Guanosina trifosfato
IgG - Imunoglobulina G
LDL - Lipoproteína de baixa densidade
LRP-5/6 - Proteína relacionada ao receptor de LDL tipo 5/6
MCD ou MββββCD – Metil-β-ciclodextrina
MEF-2 - Fator estimulatório miocítico tipo 2
MEM - Meio essencial mínimo
Nkx2.5 - Fator de transcrição da família homeobox
PBS - Tampão fosfato com salina
PVDF - Membrana difluoridro polivinilideno hidrofóbica
SFB - Soro fetal bovino
SDS - Dodecil sulfato de sódio
TBS-Tween - Tampão tris com salina e monolaurato de polioxietilenosorbitano
TCF/LEF – Fator de célula T / fator linfóide
TEMED – N,N,N,N-tetrametil-etilenodiamina
x
TRIS - Tris-hidroximetil-aminometano
TRITC - Isotiocianato de tetraetilrodamina
Triton X-100 – t-octilfenoxipolietoxietanol
Wnt - Família de genes de vertebrados homólogos ao fator de crescimento Wingless de
Drosophila
xi
Sumário
Página
1. INTRODUÇÃO...............................................................................1
Os tecidos musculares.........................................................................................................................1 O músculo cardíaco.............................................................................................................................2 As adesões entre cardiomiócitos.........................................................................................................7 O citoesqueleto..................................................................................................................................10 Microfilamentos e microtúbulos.......................................................................................................12 Filamentos intermediários.................................................................................................................13 Membrana plasmática.......................................................................................................................14 Relevância do presente estudo..........................................................................................................18
2. OBJETIVOS...................................................................................19 2.1 Objetivo geral..........................................................................................................................19 2.2 Objetivos específicos..............................................................................................................19
3. MATERIAIS E MÉTODOS..........................................................20
3.1 Culturas primárias de cardiomiócitos........................................................................................20 3.2 Tratamento das culturas primárias de cardiomiócitos com metil-beta-ciclodextrina
(MCD)........................................................................................................................................21 3.3 Imunofluorescência de células em cultura.................................................................................22 3.4 Aquisição e processamento de imagens.....................................................................................23 3.5 Eletroforese em gel de poliacrilamida.......................................................................................26 3.6 Immunoblotting...........................................................................................................................26 3.7 Desligamento de anticorpo (strip) em immunoblotting..............................................................27
4. RESULTADOS ..............................................................................29
5. DISCUSSÃO....................................................................................43 6. SUMÁRIO DOS RESULTADOS E CONCLUSÕES..................51 7. BIBLIOGRAFIA............................................................................53 8. ANEXOS..........................................................................................65
xii
Lista de Ilustrações
Página
Figura 1 - A estrutura histológica do músculo estriado cardíaco.....................................4
Figura 2 - O sarcomêro dos cardiomiócitos.....................................................................4
Figura 3 - A estrutura dos discos intercalares..................................................................6
Figura 4 - Adesão célula-célula via caderina...................................................................8
Figura 5 - Estrutura e composição de micro-domínios de membrana............................15
Figura 6 - Organização da cavéola.................................................................................17
Figura 7 - Microscopia de fase de agregados de células cardíacas............................... 33
Figura 8 - Agregados de cardiomiócitos contraem espontaneamente em cultura..........34
Figura 9 - Cardiomiócitos expressam desmina e tropomiosina......................................35
Figura 10 - A expressão da caveolina-3 é reduzida logo após a depleção do colesterol
em agregados cardíacos............................................................................................36
Figura 11 - A caveolina-3 colocaliza-se com a desmina nos cardiomiócitos.................37
Figura 12 - Caderina se distribui em linhas contínuas ao longo da região de adesão
intercelular de cardiomiócitos...................................................................................38
Figura 13 - β-catenina se distribui em linhas descontínuas ao longo da região de adesão
intercelular de cardiomiócitos...................................................................................39
Figura 14 - A depleção de colesterol aumenta a expressão de caderina em agregados
cardíacos................................................................................................................... 40
Figura 15 - A depleção de colesterol aumenta a expressão de tropomiosina sarcomérica
em agregados cardíacos............................................................................................41
xiii
Figura 16 - A depleção de colesterol aumenta a expressão de Nkx2.5 em agregados
cardíacos....................................................................................................................42
Figura 17 - Esquema dos resultados obtidos na tese......................................................50
Tabela 1 - Anticorpos primários.....................................................................................24
Tabela 2 - Anticorpos secundários e sondas...................................................................25
xiv
Resumo
O colesterol é um lipideo que tem uma série de funções na membrana plasmática. Ele
está envolvido na manutenção da fluidez e da permeabilidade da membrana, além de
estruturar os micro-domínios de membrana. Apesar de sua importância, nenhum estudo
ainda foi feito sobre as conseqüências da retirada de colesterol da membrana sobre a
adesão intercelular cardíaca. Nós decidimos então investigar os mecanismos celulares e
moleculares associados com a retirada de colesterol durante a diferenciação do músculo
cardíaco. Nós utilizamos a substância metil-beta-ciclodextrina (MCD) em culturas
primárias de células cardíacas de embriões de galinha, para retirar o colesterol da
membrana e investigar seu papel na diferenciação cardíaca através da expressão de
vários marcadores cardíacos, tais como o fator de transcrição Nkx2.5, a proteína
miofibrilar tropomiosina, a proteína dos filamentos intermediários desmina, a proteína
caveolar caveolina-3 e o complexo de adesão caderina/beta-catenina. Nossos resultados
mostram que a retirada de colesterol pela MCD leva a uma concentração tanto de
caderina, como de sua proteína associada beta-catenina, nas regiões de adesão
intercelular em cardiomiócitos. Além disso, o tratamento com MCD aumenta a
expressão de caderina, de tropomiosina e de Nkx2.5. É possível se concluir que o
colesterol membranar tem aumenta a diferenciação de cardiomiócitos, e que as adesões
intercelulares mediadas por caderina estão envolvidas nestes eventos.
xv
Abstract
Cholesterol is a sterol lipid that plays pleiotropic roles in plasma membrane function; it
is involved in maintaining membrane fluidity and impermeability and the structure of
lipid microdomains. Despite its importance, no report was made on the consequences of
membrane cholesterol depletion in cardiac intercellular adhesion. Thus, we decided to
investigate the cellular and molecular mechanisms associated with cholesterol depletion
during cardiac muscle differentiation. We used the chemical methyl-β-cyclodextrin
(MCD) in primary cultured chick cardiac cells, to deplete membrane cholesterol and
investigate its role in cardiac differentiation by following the expression of several
markers, such as the transcriptional factor Nkx2.5, the myofibrillar protein tropomyosin,
the cytoskeletal intermediate filament protein desmin, the caveolar protein caveolin-3
and the cadherin/β-catenin adhesion complex. Our results show that cholesterol
depletion by MCD leads to a concentration of both cadherin and its partner β-catenin in
cell-cell adhesion sites in cardiomyocytes. Further, treatment with MCD increases the
expression of cadherin, tropomyosin and Nkx2.5. It is possible to conclude that
membrane cholesterol enhances cardiomyocyte differentiation, and that the cadherin-
based intercellular adhesions are involved in these events.
1
1 – Introdução
Os tecidos musculares
Os tecidos musculares dos vertebrados podem ser subdivididos, com base em
diferenças funcionais e morfológicas, em três tipos: músculo liso, músculo estriado
esquelético e músculo estriado cardíaco. Os três tecidos musculares citados são
constituídos por células contráteis (Huddart, 1975).
O músculo liso é formado por células fusiformes e mononucleadas, que não
possuem estriações. A contração destas células é lenta e involuntária. Esta contração é
possivel graças ao deslizamento de filamentos de actina e miosina ancorados a
estruturas chamadas de corpos densos, que são compostos pelas proteínas desmina e
alfa-actinina. O tecido muscular liso está presente nos vasos sanguíneos e em órgãos
ocos ou tubulares, como o intestino.
O músculo estriado esquelético é formado por feixes de células cilíndricas longas e
multinucleadas, que apresentam estriações transversais. Estas células têm contração
rápida e estão sujeitas ao controle voluntário. O tecido muscular esquelético recebe este
nome porque suas contrações geralmente movem alguma parte do esqueleto.
O músculo estriado cardíaco é formado por células alongadas que são geralmente
mononucleadas ou binucleadas, e que se unem às células vizinhas através de junções
celulares (Figura 1). Estas células, os cardiomiócitos, apresentam estriações. A
contração destas células é rápida, rítmica e involuntária.
Tanto as células do tecido cardíaco como as do esquelético possuem estruturas
periódicas que proporcionam suas contrações. Estas estruturas são chamadas de
sarcômeros e são compostas de proteínas do citoesqueleto.
2
O músculo cardíaco
O músculo cardíaco desenvolve-se a partir do mesoderma esplâncnico, através dos
dois primórdios cardíacos laterais que migram para a linha média e que se fundem
iniciando a formação do tubo cardíaco que inicialmente é simétrico. O tubo cardíaco
alonga-se e começa a realizar o movimento de formação de alças (looping) que é o
primeiro sinal de assimetria esquerda-direita do coração. Os mioblastos cardíacos
diferenciam-se apartir do miocárdio primitivo e desenvolvem-se apartir de genes
cardíacos específicos (Moore, 2004). Os fatores de transcrição tem-se mostrado
fundamentais no controle da cardiomiogênese (Zheng et al., 2003). Embora alguns dos
fatores da cardiomiogênese tenham sido determinados, todo o estudo da regulação da
cascata ainda tem que ser melhor caracterizada (Mably e Liew, 1996). O
desenvolvimento cardíaco depende da regulação da atividade de fatores de transcrição
como as famílias T-Box e Homeodomínio (Cripps e Olson, 2002; Harvey, 2002).
Existem diversas famílias de fatores de transcrição envolvidas na cardiomiogênese,
dentre as quais estão as famílias GATA, MEF2 e Nkx2.5. Os fatores GATA são uma
família de reguladores transcricionais que são expressos de uma maneira específica. A
família MEF2 pertence à família de reguladores transcricionais MADS-box, e apresenta
uma função central na morfogênese e miogênese de celulas musculares esqueléticas,
cardíacas e lisas (Zheng, 2003).
O Nkx2.5 é o marcador mais precoce do desenvolvimento do coração, precedendo
outros genes cardíacos específicos. Este interage com os fatores de transcrição e
membros das famílias T-Box e GATA (Lyons et al., 1995; Tanaka et al, 1999; Harvey,
2002), colaborando na regulação de promotores (Chen e Schwartz, 1996; Durocher et
al.,1997; Bruneau et al., 2000; Hiroi et al., 2001; von Both et al., 2004). Sua expressão
também é detectada em mioblastos, no mesoderma visceral da extremidade distal do
3
estômago e no tecido mesentérico próximo ao estômago (Lints et al., 1993). A sua
expressão em células progenitoras embrionárias cardíacas e em coração adulto sugere
um papel na diferenciação da linhagem do miocárdio e na manutenção do fenótipo
cardíaco (Mably e Liew, 1996).
O músculo estriado cardíaco mostra muitas características estruturais e funcionais
intermediárias entre os tecidos musculares esquelético e liso. Suas contrações são fortes
e utilizam uma grande quantidade de mitocôndria como no músculo estriado
esquelético, e, como o músculo liso, suas contrações são contínuas e iniciadas por
mecanismos involuntários (Young et al., 2007). As mitocôndrias encontram-se
enfileiradas entre as miofibrilas (Lullmann-Rauch, 2006).
O músculo estriado cardíaco, o qual constitui o miocárdio, é formado por células
longas e cilíndricas denominadas cardiomiócitos (Figura 1). A contração destas células
é rápida, rítmica e involuntária. Os cardiomiócitos são cilíndricos com
aproximadamente 85 a 100 µm de comprimento e de 15 a 20 µm de diâmetro. As
células musculares cardíacas dos átrios são menores do que as do ventrículos (Gartner e
Hiatt, 2007; Young et al., 2007). Estes podem ser mononucleados ou binucleados, onde
seu núcleo apresenta uma forma grande e oval. Os núcleos localizam-se centralmente se
diferenciando das células musculares esqueléticas maduras (miotubos), as quais
possuem núcleos periféricos (Lullmann-Rauch, 2006).
O estudo das miofibrilas ao microscópio eletrônico revela que são formadas por
unidades que se repetem: os sarcômeros. O sarcômero é a unidade morfofuncional da
miofibrila (Figura 2). Cada sarcômero é limitado por duas linhas Z e mede cerca de 2 a
3µm de comprimento quando relaxado. O sarcômero é formado por uma banda A e
metades de bandas I que são cortadas ao meio pela linha Z, e entre as linhas Z existe
ainda a linha M (Huxley e Niedergerke, 1954).
4
Figura 1 - A estrutura histológica do músculo estriado cardíaco. Note a presença de
estriações, núcleos (em roxo) e discos intercalares (seta) em corte longitudinal de tecido
cardiaco corado com hematoxilina-eosina (http://cytochemistry.net/cell-
biology/medical/pratice practical muscle.htm).
Figura 2 - O sarcômero dos cardiomiócitos
(www.kcl.ac.uk/schools/medicine/cardio/pi/gautel- m.html).
5
Os principais componentes dos sarcômeros (Figura 2) são os filamentos grossos
(15 nm de diâmetro e 1,5 µm de comprimento), constituídos de miosina do tipo II, e os
filamentos finos (6 nm de diâmetro e 1 µm de comprimento), constituídos de actina,
tropomiosina e as troponinas C, T e I (Complexo Troponina). Estes filamentos estão
organizados num padrão longitudinal e regular na direção do movimento do sarcômero.
Os filamentos de miosina ocupam a região central do sarcômero, a banda A. As linhas Z
participam da transmissão da tensão mecânica para os outros sarcômeros interligados e
são constituídas por desmina e α-actinina (Wang et al., 2000; Costa et al., 2004), essa
última relacionada com a organização dos filamentos de actina. A linha M é composta
pelas proteínas miomesina e proteína C e sua função é interligar os filamentos de actina
e miosina. As proteínas titina e nebulina também auxiliam nessa associação (Gregorio et
al., 1999). O citoesqueleto existe em todos os tipos de células eucarióticas e os
sarcômeros das células musculares são descritos como uma adaptação do citoesqueleto
para uma alta eficiência contrátil.
Os cardiomiócitos apresentam estriações transversais por toda miofibrila, o que se
assemelha com o aparelho contrátil do músculo esquelético (Kierszenbaum, 2008).
Entretanto apresentam algumas diferenças, como os túbulos T que são encontrados na
região do disco Z e são mais largos que os de músculos esqueléticos encontrados na
região de junção de banda A-I, o retículo sarcoplasmático não é tão longo quanto o do
músculo esquelético, a presença de díades (interação entre o túbulo T com uma cisterna
do retículo sarcoplasmático) ao invés de tríades que são típicas de músculo esquelético e
maior quantidade de mitocôndrias em comparação com o músculo esquelético. Outra
característica importante é a presença de discos intercalares que ligam as células
cardíacas funcionando como regiões juncionais especializadas entre estas células e onde
6
suas extremidades se unem (coincidindo sempre com a linha Z). Os discos intercalares
são responsáveis por transmitir a força de contração e oferecem áreas de baixa
resistência elétrica para a rápida disseminação da excitação através do miocárdio. Os
discos intercalares são regiões de membrana plasmática interdigitante (Figura 3) e
apresentam três tipos de junções intercelulares: nas regiões transversais dos discos
intercalares, onde o tipo de junção predominante são as faixas de adesão ou faixas
adherens, os demossomas e as junções comunicantes (também chamadas de junções do
tipo gap).
Figura 3 – A estrutura dos discos intercalares. Este esquema mostra duas células do
tecido cardíaco unidas por discos intercalares, que são estruturas presentes em regiões
próximas à membrana plasmática das células vizinhas. Notar que os filamentos de
actina dos sarcômeros terminam nestas regiões (modificada a partir de Alberts et al.,
2004).
7
As adesões entre cardiomiócitos
As faixas de adesão ou faixas adherens possuem uma importância para a
citoarquitetura cardíaca. Os filamentos de actina nas extremidades dos sarcômeros
terminais se inserem nas faixas de adesão, transmitindo dessa forma as forças contráteis
de célula para célula. As faixas de adesão são compostas de complexos de proteínas
transmembrana, especificamente as caderinas (Figura 4), um conjunto de cateninas (α,
β e γ) e proteínas que se ligam a estas como a vinculina e a α-actinina, que ligam o
citoesqueleto de actina à membrana (Hirschy et al., 2006).
Em vertebrados, duas classes distintas de moléculas de adesão célula-célula atuam
em vias dependentes ou independentes de Ca2+. As moléculas envolvidas na adesão
célula-célula em um mecanismo independente de Ca2+ são as CAMs (cellular adhesion
molecules). As caderinas (Figura 4) constituem o grupo de proteínas de adesão celular
relacionadas com a adesão célula-célula dependente de Ca2+ e esta atividade é regulada
por interações citoplasmáticas entre caderinas, cateninas e o citoesqueleto de actina
(Hazan et al., 1997). Os membros da superfamília de caderinas (100-130 kDa) são
divididos em tipo clássico e tipo protocaderina (Suzuki, 1996). Estudos recentes têm
mostrado importante papel das caderinas clássicas na adesão celular, morfogênese e
outros processos biológicos que ocorrem durante a vida embrionária de vertebrados.
A adesão entre as células cardíacas é mediada principalmente pela adesão das
moléculas de caderina dependentes de Ca2+ (Takeichi, 1990; Geiger e Ayalon, 1992;
Hertig et al., 1996). A proteína caderina está localizada na junção aderente nos discos
intercalares no miocárdio, onde o seu domínio N-teminal homofilíco extracelular
medeia as interações entre as células vizinhas. As caderinas atuam como proteínas de
adesão transmembrana que ligam de forma indireta o citoesqueleto de actina de células
vizinhas. As caudas citoplasmáticas das caderinas são altamente conservadas e
8
interagem com os filamentos de actina por meio de um grupo de proteínas de
ancoramento intracelular denominadas cateninas (Kemler, 1993). Esta interação é
essencial para a eficiência da adesão célula-célula, já que as caderinas sozinhas não
conseguem manter as células fortemente unidas (Alberts et al., 2004).
Figura 4 - Adesão célula-célula via caderina (modificada a partir de Cooper, 2000).
Diferentes tipos celulares expressam subtipos específicos de caderinas, tais
como a N- e a M-caderina (Knudsen et al., 1995; Zeschnigk et al., 1995; Wernig et al.,
2004). A N-caderina é expressa por células neuronais, células musculares esqueléticas e
cardíacas em desenvolvimento ou maduras. A M-caderina é encontrada em células
musculares esqueléticas e está relacionada com a miogênese (adesão e fusão de
9
miócitos), sendo também considerada um marcador de células satélites (células
comprometidas com a linhagem muscular).
A α-catenina é fundamental para a fixação transmembranar de caderinas e
mutações nesta proteína impedem a adesão. A α-catenina se liga à β-catenina, e esta se
liga à γ-catenina que por sua vez se associa à actina. A interação do complexo
caderina/catenina com a actina não está bem elucidada, já que alguns trabalhos mostram
que esta interação se dá ainda via α-actinina (Knudsen et al., 1995) enquanto outros
indicam que a ligação com o citoesqueleto de actina ocorre via vinculina (Hazan et al.,
1997).
O complexo caderina/catenina pode promover o crescimento das miofibrilas em
direção à periferia da célula (Goncharova et al., 1992). Além disso, demonstrou-se que
a N-caderina associa-se com microdomínios de membrana ricos em colesterol que
permitem a formação de um complexo de adesão funcional (Causeret et al., 2005).
Outro tipo de junção intercelular é o desmossoma, são que ocorre nas regiões
transversais dos discos intercalares e é menos frequente que as faixas de adesão. Eles
fornecem ancoragem para os filamentos intermediários do citoesqueleto. Possuem uma
estrutura relativamente semelhante a junções aderentes com um conjunto de caderinas
transmembranares desmossomais (desmogleínas e desmocolinas) que ligam os
filamentos intermediários na membrana através da interação de várias proteínas, como a
desmoplaquina, placoglobulina e placofilina (Garrod e Chidgey, 2008).
As junções aderentes (as faixas de adesão) e os desmossomas desempenham
principalmente um papel mecânico, dando uma direção longitudinal aos cardiomiócitos
Alterações nas moléculas que constituem as estruturas desses dois tipos de adesões
estão associadas a doenças cardíacas (Clark et al., 2002; Saffitz e Kleber, 2004; Hirschy
et al., 2006).
10
As junções comunicantes ou junções do tipo gap estão presentes principalmente
nas porções longitudinais dos discos intercalares e são locais de baixa resistência
elétrica, através dos quais ocorre excitação de célula para célula. Elas possuem um
papel importante na excitação do miocárdio bem como na mediação da propagação do
impulso, coordenando a contração cardíaca (Simon e Goodenough, 1998). No coração
adulto os canais das junções comunicantes são essenciais para a propagação do
potencial de ação a partir do nodo sinoatrial para a integridade mecânica do miocárdio.
As junções comunicantes possuem conexons que são canais intercelulares responsáveis
pela troca de íons, metabólitos, e pequenas moléculas entre cardiomiócitos vizinhos. Os
conexons tem um papel importante tanto no início do desenvolvimento cardíaco como
na diferenciação e na proliferação de cardiomiócitos (White e Paul, 1999; Gros et al.,
2004; Sohl e Willecke, 2004). Estes conexons são compostos por proteínas
denominadas conexinas, que possuem mais de 20 genes identificados em mamíferos.
Estes genes codificados são nomeados de acordo com seus respectivos pesos
moleculares (Delorme et al., 1997; Alberts et al., 2004). Dentre as conexinas expressas
no coração podemos citar as conexina 37, 40, 43 e 45. Em cardiomiócitos ventriculares
as isoformas embrionárias são as conexinas 40 e 45. Sabe-se que ambas as isoformas
são substituídas durante o desenvolvimento pela conexina 43 em células ventriculares
do miocárdio (Fromaget et al., 1992; Delorme et al., 1997; Alcolea et al., 1999).
O citoesqueleto
O citoplasma das células eucarióticas é espacialmente organizado por uma
complexa rede de filamentos protéicos chamada de citoesqueleto. Essa estrutura é
altamente dinâmica e se reorganiza continuamente, à medida que a célula muda de
forma, divide-se e responde ao seu meio ambiente. É responsável pela adesão das
11
células ao substrato, pela contração muscular e pelas inúmeras mudanças de forma que
ocorrem nas células de um embrião de vertebrado em desenvolvimento. Também
fornece a maquinaria necessária aos movimentos intracelulares, como o transporte de
vesículas, organelas e a segregação dos cromossomos na mitose. Além de manter a
compartimentalização das funções celulares de forma altamente organizada, participa
das vias de comunicação entre as células e destas com o meio extracelular.
O citoesqueleto das células cardíacas possui uma estrutura altamente organizada
que é responsável pela eficiência da contração muscular. Em cardiomiócitos o
citoesqueleto é um fator intrínsico determinante na eficácia da função destas células, já
que qualquer dano ao citoesqueleto poderá levar à insuficiência cardíaca (Heling et al.,
2000). Um conjunto de proteínas do citoesqueleto compõe as miofibrilas e as suas
interações com a membrana plasmática e com a matriz extracelular (Ganote e
Armstrong, 1993).
O citoesqueleto das células eucarióticas é basicamente formado por três tipos de
filamentos protéicos, classificados segundo a sua espessura aproximada:
microfilamentos (4 a 6 nm), microtúbulos (22 a 25 nm) e filamentos intermediários (7 a
11 nm). Cada um desses filamentos é formado por um tipo diferente de subunidade
protéica: os microfilamentos são formados por unidades globulares de actina, os
microtúbulos formados por treze protofilamentos compostos de tubulina α e β, e os
filamentos intermediários formados por uma família de proteínas fibrosas que variam de
acordo com o tipo celular (Mermelstein et al., 2000; Herrmann et al., 2000; Amos e
Schlieper, 2005; Revenu et al., 2005). Os filamentos intermediários, por serem
constituídos por unidades fibrosas, são menos dinâmicos que a maioria dos polímeros
de actina e tubulina (Lazarides, 1980).
12
Microfilamentos e microtúbulos
Os microfilamentos e os microtúbulos são formados por subunidades protéicas
globulares que podem se associar e dissociar rapidamente, no interior da célula. O
processo de polimerização e despolimerização dos microfilamentos e dos microtúbulos
é regulado, respectivamente, por ATP e GTP, e ainda, por íons bivalentes de cálcio e
magnésio e proteínas acessórias (Fujiwara e Pollard, 1976).
Os microtúbulos, estruturalmente, são polímeros de subunidades de α e β-
tubulinas que contribuem substancialmente para a estabilidade da célula por ancorar
organelas, tais como as mitocôndrias, complexo de Golgi, núcleos, e miofibrilas,
podendo inclusive modular respostas β-adrenérgicas em cardiomiócitos (Palmer et al.,
1998).
Os microfilamentos são compostos de actina, onde o monômero globular é
chamado de actina-G e a sua forma polimérica filamentosa é chamada de actina-F.
Existem duas isoformas de actina nos músculos estriados, a esquelética e a cardíaca, que
são diferentes das isoformas de células de músculo liso e de células não musculares,
sendo cada uma destas 4 variantes de actina codificada por um gene diferente
(Schiaffino e Reggiani, 1996). Os microfilamentos são especialmente importantes nas
adesões célula-célula (via caderinas) e nas adesões célula-matriz extracelular (via
integrinas). Além disso, os microfilamentos têm um papel fundamental na constituição
das miofibrilas das células musculares, sendo estes os filamentos finos presentes nas
bandas-I dos sarcômeros.
Os filamentos de actina se ligam a uma grande variedade de proteínas acessórias
que permitem aos mesmos participarem de diferentes funções. Algumas dessas
proteínas acessórias ligam os filamentos de um mesmo tipo entre si, a outro tipo de
filamento e, ainda, a componentes celulares. Existem também proteínas motoras, que
13
hidrolisam ATP, produzindo força e movimento direcionado ao longo desses filamentos
(Voet e Voet, 1990; Darnell et al., 2000; Mermelstein et al., 2000; Alberts et al., 2004).
Estas proteínas associadas à actina são essenciais para o correto funcionamento dos
sarcômeros das células musculares cardíacas, podendo citar como exemplos a
tropomiosina, as troponinas (I, C e T) e a miosina do tipo II.
Filamentos intermediários
Os filamentos intermediários estão presentes na maioria das células eucarióticas
e seus constituintes protéicos possuem distribuição celular específica. As principais
proteínas dos filamentos intermediários são: a queratina (específica de células
epiteliais), a vimentina (presente em células de origem mesenquimal), os
neurofilamentos (específica de células neuronais), a GFAP (específica de células gliais),
a periferina (presente em células do sistema nervoso periférico), a nestina (presente em
células precursoras dos sistemas nervoso e muscular), as laminas (presentes no núcleo
de células eucarióticas) e a desmina (específica de células musculares). A desmina está
presente em todas as células de músculo liso, esquelético e cardíaco. Nas células de
músulo liso ela se encontra nos corpos densos, que são as regiões de ancoramento de
filamentos de actina à membrana. Nas células de músculos estriados a desmina se
localiza na região das linhas Z, onde os filamentos de actina se ancoram. Foi descrito
que as proteínas nebulina e nebulete participam da interação dos filamentos de desmina
com as linhas Z (Moncman e Wang, 1995). A localização da desmina na linha Z é
descrita como tendo um papel na manutenção da integridade do sarcômero no momento
da contração cardíaca (Fusch e Cleveland, 1998).
Além de sua localização na linha Z, a desmina também se encontra associada à
membrana externa do envelope nuclear (Mermelstein et al., 2006). Foi mostrado que
14
filamentos de desmina se encontram funcionalmente ancorados às laminas nucleares nas
fibras cardíacas (Lockard e Blomm, 1993), possivelmente através da ligação à proteína
anquirina (Capetanaki et al., 1997).
O aumento de desmina em cardiomiócitos foi descrito na hipertrofia cardíaca
(Hein et al., 1994; Collins et al., 1996). E, por sua vez, a deficiência dos filamentos
intermediários de desmina na insuficiência cardíaca está relacionada com a redução da
função cardíaca (Di Somma et al., 2004).
Membrana plasmática
A membrana plasmática tem inúmeras funções vitais para a célula, dentre as
quais podemos citar a separação dos meios intra- e extra-celulares, o transporte de íons
e nutrientes entre estes dois compartimentos, a recepção de moléculas sinalizadoras e a
adesão entre células adjacentes e com a matriz extracelular. A membrana plasmática é
formada por uma bicamada lipídica, com espessura de 8 a 10 nm, que funciona como
um mosaico fluido bidimensional onde proteínas e lipídios se encontram imersos
(Singer e Nicolson, 1972). As proteínas presentes na membrana plasmática podem ser
integrais (ou transmembranares) que atravessam toda a membrana, ou, periféricas
voltadas para o citoplasma ou para a matriz extracelular. E, ainda, podem estar
associadas a glicídeos, na face extracelular, sendo chamadas de glicoproteínas. As
funções das proteínas de membrana são variadas, podendo ser estruturais ao conferirem
sustentação ao citoesqueleto, ou de transporte de íons, ou de recepção e transdução de
sinais. Já os lipídeos de membrana podem ser classificados em 3 tipos principais: os
fosfolipideos, os glicolipídeos e o colesterol. Os fosfolipídeos constituem a base
estrutural das membranas. Já os glicolipídeos, são moléculas de lipídeos associadas a
glicídeos que são encontrados na face extracelular da membrana e desempenham papel
15
importante nas interações da célula com o ambiente exterior. O colesterol é um dos
responsáveis pela fluidez da membrana e pela formação de regiões especializadas
chamadas de micro-domínios lipídicos (ou rafts), uma vez que ele é um dos principais
constituintes destas regiões. Graças a esta recente descoberta, a membrana plasmática é
hoje vista como um mosaico de diferentes compartimentos ou domínios (Figura 5).
Figura 5 - Estrutura e composição de micro-domínios de membrana
(retirado de Alberts et al., 2004).
Além de colesterol, os micro-domínios lipídicos são enriquecidos também em
glicoesfingolipídeos e por proteínas ancoradas por GPI. As rafts são regiões mais
espessas da membrana, e as proteínas integrais ali presentes têm um longo domínio
transmembranar. Os micro-domínios funcionam como plataformas que concentram
moléculas específicas para certas funções celulares, tais como tráfego de vesículas,
transdução de sinais (Galbiati et al., 2001b) e ainda como local de entrada de
microorganismos patogênicos (Fivaz et al., 1999).
Devido à alta concentração de colesterol e lipídeos com longas caudas saturadas,
dentro da bicamada fosfolipídica, estes domínios estão fortemente empacotados e
inseridos em um estado líquido organizado. Estes micro-domínios coexistem com a fase
16
líquida desorganizada que possui menos colesterol (London e Brown, 2000; Simons,
2004). Dessa forma, a membrana plasmática apresenta diferentes fases (organizada e
desorganizada) em seu estado líquido (Ipsen et al., 1987, 1989).
Os micro-domínios lipídicos podem, então, fixar proteínas como: proteínas
transmembranares longas e ancoradas a GPI. Além dessas proteínas, os micro-domínios
podem ser enriquecidos com caveolina, componente protéico estrutural (integral na
membrana) que provoca alterações na morfologia e na função do micro-domínio
lipídico (Razani et al., 2002). A presença da proteína caveolina causa a formação de
invaginações nos micro-domínios, chamadas de cavéolas (Figura 6). Estas
invaginações podem levar à formação de vesículas que serão endocitadas. Foram
descritas tres diferentes caveolinas: 1, 2 e 3. Enquanto as caveolinas-1 e 2 estão
presentes em todas as células eucarióticas, a caveolina-3 é específica de células dos
músculos liso, esquelético e cardíaco. A presença de caveolina-1, a primeira caveolina
descoberta, determina a formação de cavéolas (Smart et al., 1999).
Estudos recentes mostram que existe a presença das três isoformas de caveolina
em cardiomiócitos adultos, onde estariam associadas a proteção cardíaca em isquemias
(Hagiwara et al., 2002; Krajewska e Maslowska, 2004; Head et al., 2006; Siracusano et
al., 2006). Horikawa e colaboradores (2008) mostraram que as cavéolas e a expressão
de caveolina-3 são requeridas para proteção cardíaca em casos de hipóxia e isquemia.
Exitem muitos métodos utilizados no estudo de micro-domínios de membrana
(Ostrom e Liu, 2007; Kim et al., 2008). Dentre eles podemos citar o isolamento
bioquímico destas regiões de membrana por ultracentrifugação e com o uso de
detergentes e baixa temperatura. Também são bastante empregados os métodos de
alteração dos níveis de colesterol através do uso de substância com afinidade por
colesterol. Dentre estas substâncias, a metil-β-ciclodextrina (MCD) tem sido utilizada
17
em diversos modelos biológicos por ter uma alta afinidade pelo colesterol e poder assim
retirá-lo momentaneamente da membrana, levando à desorganização dos micro-
domínios. Nosso laboratório utilizou a MCD para desorganizar micro-domínios da
membrana plasmática de células de músculo esquelético de embriões de galinha
crescidas in vitro. Nossos resultados mostram que a retirada de colesterol aumenta a
taxa de fusão de mioblastos e sua posterior diferenciação em miotubos (Mermelstein et
al., 2005, 2007b; Portilho et al., 2007).
Figura 6 - Organização da cavéola (retirado de Razani et al., 2002).
18
Relevância do presente estudo
O colesterol é um componente lipídico abundante da membrana plasmática,
sendo o principal regulador da sua fluidez. Além disso, possui um papel crucial na
formação e na estabilização de regiões especializadas, os chamados micro-domínios de
membrana. Já foi mostrado que os micro-domínios de membrana ricos em colesterol
têm um papel crucial na regulação de canais de potássio e na sinalização dependente de
AMPc em cardiomiócitos (Abi-Char et al., 2007; Calaghan et al., 2008). No entanto,
nenhum estudo mostrou, até o presente momento, as consequências da retirada de
colesterol membranar na organização do aparato contrátil de células cardíacas, assim
como na adesão intercelular em cardiomiócitos. Alguns pesquisadores já estudaram os
efeitos da retirada de colesterol pela MCD em cardiomiócitos, mas nenhum com esta
abordagem. Um destes trabalhos mostra que cardiomiócitos obtidos de ratos recém
nascidos e tratados com MCD apresentaram uma inibição da interação da proteína
caveolina 3 com a enzima óxido nítrico sintase endotelial e assim apresentam uma
inibição da produção de AMPc e da atividade da adenil ciclase (Ostrom et al., 2004).
Outro estudo mostra que a cavéola tem papel importante no processo de contração e
excitação de cardiomiócitos ventriculares de rato adulto e que a utilização da MCD leva
a uma diminuição do fluxo de Ca2+ e desta forma uma inibição da contração (Calaghan
e White, 2006).
No presente trabalho, foi utilizada a substância metil-beta-ciclodextrina (MCD),
que por ter uma alta afinidade por moléculas de colesterol consegue retirá-lo
seletivamente das membranas celulares (Christian et al. 1997). A MCD foi utilizada
com o objetivo de alterar a composição e a estrutura da membrana, e assim poder
investigar os mecanismos celulares e moleculares dependentes do colesterol durante a
diferenciação de células cardíacas crescidas in vitro.
19
2 - Objetivos
2.1 - Objetivo Geral
Estudar os efeitos da retirada de colesterol membranar sobre cardiomiócitos crescidos
em cultura de células
2.2 - Objetivos Específicos
Obter culturas primárias de cardiomiócitos a partir de coração de embrião de galinha;
Estudar os possíveis efeitos da substância metil-beta-ciclodextrina (MCD) em culturas
primárias de cardiomiócitos em tempos curtos e longos após o tratamento;
Analisar a distribuição de proteínas sarcoméricas, do citoesqueleto e de membrana em
cardiomiócitos controle e tratados com MCD;
Analisar a expressão de fatores de transcrição e de proteínas sarcoméricas, do
citoesqueleto e de membrana em cardiomiócitos controle e tratados com MCD.
20
3 - Materiais e Métodos
3.1 - Culturas primárias de cardiomiócitos
Ovos provenientes da Granja Tolomei (Rio de Janeiro, RJ), contendo embriões
de galinha com 11 dias de desenvolvimento, eram quebrados sobre uma placa de petri
de 100 mm. A cabeça e os restos de membranas que envolvem os embriões eram
retirados e descartados, enquanto o corpo do embrião era transferido para uma placa de
petri de 60 mm contendo Solução de Sais Balanceada (BSS).
A pele e o músculo peitoral eram cortados através de uma incisão, com o uso de
duas pinças. Feita a incisão ao longo do esterno, era exposto o coração. Este, por sua
vez, era retirado no sentido crânio-caudal e transferido para uma placa de petri de 35
mm contendo BSS. Após a transferência, eram removidos os grandes vasos e retirado o
sangue aprisionado nas câmaras cardíacas (átrios e ventrículos), sendo transferido
novamente para outra placa de petri de 35 mm contendo 2 mL de Solução de Sais
Balanceada sem cálcio e sem magnésio (CMF) para ser feita a separação mecânica das
células do tecido cardíaco com o uso de duas facas de micro-cirurgia sobre o tecido.
Após, o material era colocado em um tubo de 15 mL e centrifugado por 10 minutos em
centrifuga clínica.
Em seguida era aplicada uma solução de tripsina a 0,2% (Gibco) com o objetivo
de retirar as células mais externas dos fragmentos cardíacos. Os fragmentos eram
colocados em estufa de células a 370C com a atmosfera de 5% de gás carbônico durante
5 minutos. Cinco ciclos de incubação (como o descrito) foram feitos. A primeira
incubação era descartada e as próximas eram acrescentadas ao seguinte meio gelado:
Meio Essencial Mínimo (MEM) contendo soro fetal bovino (SFB) a 10%. O SFB era
utilizado nesta etapa para inibir a ação da tripsina. Os fragmentos de tecido cardíaco
eram centrifugados e, posteriormente, tinham seu sobrenadante descartado. O pellet era
21
suspenso com 4 mL de meio de plaqueamento (MEM contendo 5% SFB, 1% penicilina
/ estreptomicina, 1% L-Glutamina). Em seguida eram colocados 2 mL da suspensão de
células em cada placa de cultura de 35 mm. As placas continham no seu interior um
quadrado de 22 mm x 22 mm de plástico do tipo Aclar recoberto com solução de
colagéno isolado a partir de rabo de rato (preparada em nosso laboratório).
Todos os procedimentos acima foram feitos em fluxo laminar, com material
descartável estéril ou material de vidro ou plástico autoclavados.
As células cardíacas eram colocadas em uma incubadora de células a 370C com
atmosfera de 5% de gás carbônico. Eram observadas diariamente ao microscópio óptico
por contraste de fase e o meio era trocado após 24 horas de plaqueamento pelo meio de
crescimento (MEM contendo 5% SFB, 1% penicilina / estreptomicina e sem L-
glutamina).
Em tempos determinados as células eram submetidas ao tratamento com metil-
beta-ciclodextrina (MCD), e posterior fixação para imunofluorescência ou preparação
para eletroforese.
Algumas culturas de agregados de cardiomiócitos foram filmadas utilizando-se
um microscópio óptico invertido Axiovert 100 (Carl Zeiss, Alemanha) e uma câmera de
vídeo CCD modelo DP71 (Olympus, Japão).
3. 2 - Tratamento das culturas primárias de cardiomiócitos com metil-beta-
ciclodextrina (MCD)
As culturas primárias de cardiomiócitos com 24 horas de crescimento eram
tratadas com 2 mM de MCD (concentração final) adicionados no meio de crescimento.
Após 1 hora, o meio de cultura era trocado por um meio fresco sem a MCD e as células
22
eram deixadas na estufa por mais 3 ou 24 horas. Após estes tempos, as células eram
submetidas à fixação para imunofluorescência ou preparadas para eletroforese.
3.3 - Imunofluorescência de células em cultura
As células eram lavadas com tampão fosfato com salina (PBS) por 5 minutos, e
depois fixadas com 2mL de paraformaldeído a 4% (em PBS) durante 10 minutos. O
paraformaldeído era retirado e em seguida eram realizadas 3 lavagens de 10 minutos
com PBS contendo Triton X-100 à 0,5% (o detergente Triton X-100 permeabiliza a
membrana plasmática para a entrada dos anticorpos). Os anticorpos primários eram
diluidos em PBS/Triton X-100 a 0,5% (ver Tabela 1) e colocados em contato com as
células em uma câmara úmida. Após 1 hora, as células eram lavadas 3 vezes (de 10
minutos cada) e incubadas em câmara úmida com os respectivos anticorpos secundários
(ver Tabela 2). Após 1 hora, as células eram lavadas 3 vezes (de 10 minutos cada) com
PBS/Triton X-100 a 0,5% e em seguida lavadas com NaCl 0,9% por 5 minutos. Depois
era realizada a incubação com a sonda fluorescente DAPI a 0,1 µg/ml (em NaCl a 0,9%)
por 3 minutos para marcação dos núcleos celulares. Para retirar o excesso de DAPI,
fazia-se uma nova lavagem com NaCl 0,9% por 5 minutos. As células eram então
montadas em lamínulas de vidro de 24 x 60 mm, usando-se uma solução de montagem
contendo N-Propil-Galato a 5% e DABCO a 25% em glicerol a 60% (pH 7,5).
Como controle dos experimentos de imunofluorescência, algumas culturas de
agregados cardíacos eram fixadas e permeabilizadas (conforme descrito acima) e em
seguida eram incubadas com os anticorpos secundários fluorescentes. A etapa de
incubação com anticorpos primários era omitida de forma a se analisar possível
marcação fluorescente resultante apenas da incubação com anticorpos secundários.
Nestes experimentos não foram observadas marcações fluorescentes nas lâminas.
23
3.4 - Aquisição e processamento de imagens
As células eram observadas em um microscópio óptico invertido Axiovert 100
(Carl Zeiss, Alemanha), com filtros seletivos apropriados para os canais de fluoresceína,
rodamina e DAPI (ultra-violeta). As imagens das células eram adquiridas com uma
câmera CCD C24001 integrada ao processador de imagens Argus 20, ambos da
Hamamatsu Photonics (Japão), transferidas para um computador Dell OptiplexGI 575
(Dell Computadores, EUA), onde as pranchas finais foram montadas com uso do
programa Photoshop (Adobe System, EUA). Algumas lâminas foram observadas e
analisadas também em um microscópio óptico confocal Fluoview da Olympus (Japão).
24
Tabela 1 - anticorpos primários
IB = immunoblotting IF = imunofluorescência
Anticorpos
Primários
Tipo
Feito em
Diluição
Utilizada
Peso
Molecular
Fabricante
anti-caveolina-3
de rato
monoclonal
(clone 26)
camundongo
1:3000 IB
1:50 IF
24kDa
Transduction
anti-
tropomiosina
sarcomérica
monoclonal
(clone CH1)
camundongo
1:3000 IB
1:50 IF
37kDa
Sigma
anti-desmina
de galinha
policlonal
coelho
1:20000 IB
1:100 IF
52kDa
Sigma
anti-Nkx2.5
humano
policlonal
coelho
1:1000 IB
1:50 IF
40 KDa
Santa Cruz
anti-β-catenina monoclonal
(clone 349)
camundongo
1:3000 IB
1:50 IF
68kDa
Transduction
anti-pan
caderina de
coelho
policlonal
coelho
1:3000 IB
1:50 IF
337kDa
Sigma
anti-α-
tubulina de
galinha
monoclonal
(clone DM
1A)
camundongo
1:3000 IB
55kDa
Sigma
25
Tabela 2 - anticorpos secundários e sondas
Anticorpos Secundários e Sondas Feito em Diluição Origem
anti-IgG de camundongo-peroxidase cabra 1:15000 Amersham
anti-IgG de coelho-peroxidase cabra 1:20000 Amersham
anti-IgG de coelho- TRITC cabra 1:50 Sigma
anti-IgG de camundongo-FITC cabra 1:50 Sigma
DAPI sonda p/ DNA 1:2000 Molecular Probes
26
3.5 – Eletroforese em gel de poliacrilamida
Para preparar as amostras de culturas primárias de cardiomiócitos para eletroforese,
o meio de crescimento era descartado e em seguida as células eram lavadas 3 vezes com
PBS. Após, aplicava-se 100 µl de tampão de amostras (SDS 4%, Tris-HCl 125 mM pH
6,8, glicerol 20%, DTT 0,2 M) sobre as células e estas eram então raspadas das placas e
transferidas para tubos do tipo eppendorf.
Géis de corrida com acrilamida a 10% (Laemmli, 1970) e géis de empilhamento
com acrilamida a 6% eram preparados e quantidades iguais de amostras eram aplicadas
nos poços dos géis. As eletroforeses eram realizadas com corrente constante (cerca de
30 mA) em tampão de corrida 2 vezes concentrado (Tris 50 mM, glicina 384 mM e SDS
0,2%). Em seguida, os géis de corrida eram corados com solução corante (azul de
Coomassie 0,01%, álcool isopropílico 25% e ácido acético 10%) para serem analisados
ou submetidos a transferência para folha de PVDF (ver descrição a seguir).
3.6 – Immunoblotting (Reveleção imunológica da transferência eletroforética de
proteínas em gel desnaturante de poliacrilamida para folha de PVDF)
Ao final da eletroforese, o gel era colocado no tampão de transferência (Tris 25
mM, glicina 191 mM e metanol 20%) por 20 minutos. A folha de PVDF era lavada por
10 segundos em metanol 100%, colocada em água destilada por 5 minutos (sob
agitação) e depois por 10 minutos em tampão de transferência. A seguir as proteínas
eram transferidas eletroforeticamente do gel para a folha de PVDF, durante a noite, a 30
mV (85 mA) e a 4 0C. A seguir a folha de PVDF era saturada com 10 mL de solução de
saturação (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 0,2%, 5% leite desnatado em pó
Molico, em água destilada) por 1 hora. Depois a folha era lavada 3 vezes (de 5 minutos
cada) com tampão TBS-Tween (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 0,2%) e
27
incubada com o anticorpo primário devidamente diluido (ver Tabela 1) neste mesmo
tampão por 12 horas, à temperatura ambiente e sob agitação. Após a incubação, a PVDF
era lavada 3 vezes (de 10 minutos cada) com o mesmo tampão. A seguir era incubada
por 1 hora, à temperatura ambiente e sob agitação, com o anticorpo secundário
conjugado à peroxidase (ver Tabela 2) devidamente diluido no tampão TBS-Tween.
Após 4 lavagens de 10 minutos com este mesmo tampão, a PVDF era submetida à
revelação pelo kit ECL (da Amersham), e o procedimento era feito segundo protocolo
da Amersham Biosciences.
Todos os experimentos de immunoblotting eram realizados em triplicatas e um
destes resultados para cada uma das proteínas estudadas (caderina, tropomiosina,
caveolina-3 e Nkx2.5) foi mostrado nesta tese.
3.7 - Desligamento de anticorpo (strip) em immunoblotting
Em alguns immunoblots, após a revelação era feito o desligamento (strip) dos
anticorpos para permitir a marcação de outras proteínas na mesma folha de PVDF.
Desta forma, a folha de PVDF era lavada com tampão TBS-Tween por 3 minutos e, em
seguida, incubada com tampão de strip (2-mercaptoetanol 110 mM, SDS 2%, Tris-HCl
62,5 mM, pH 6,7) por 30 minutos a 600C sob agitação. Depois, eram feitas 5 lavagens
de 3 minutos cada com tampão TBS-Tween e a folha de PVDF podia, então, ser
incubada com solução de saturação (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 0,2%, 5%
leite desnatado em pó Molico, em água destilada) e o immunoblotting era novamente
realizado.
Esse procedimento de strip era realizado para normalizar os dados dos Western
Blots, através da proteína α-tubulina, por esta ser uma proteína constitutiva das células
eucarióticas. As bandas de α-tubulina provenientes das culturas controle e tratadas com
28
MCD, com o mesmo valor de área (medidas pelo programa Adobe Photoshop 7.0,
Adobe Systems Incorporated, CA, EUA), eram escolhidas, para análise da expressão
das proteínas caveolina-3, caderina, tropomiosina e Nkx2.5. Isso permitiu as semi-
quantificações (razão entre α-tubulina e a proteína em questão), que podem ser
visualizadas pelos gráficos das densidades ópticas, realizados pelo programa Microsoft
Excel 6.0 (Microsoft Corporation, Brasil).
29
4 - Resultados
A técnica de cultura de cardiomiócitos isolados tem a vantagem de ser mais
acessível a estudos sobre a distribuição de proteínas em compartimentos celulares
específicos, quando comparada a cultura de agregados de cardiomiócitos aderidos entre
si. Por outro lado, o tecido cardíaco não é composto de células isoladas e os
cardiomiócitos são encontrados em estreito contacto uns com os outros no coração,
onde funcionam de uma maneira altamente coordenada. Por este motivo, o sistema de
cultura que escolhemos neste presente estudo foi constituído de agregados celulares que
são pequenos fragmentos de tecido cardíaco obtidos a partir de embriões de galinha com
11 dias de desenvolvimento, e que são similares aos cardiomiócitos in vivo.
Inicialmente analisamos a morfologia dos agregados cardíacos (Figura 7A), por
miscroscopia óptica de contraste de fase. Na Figura 7B podemos observar em um
maior aumento algumas células cardíacas saindo do agregado e migrando em uma
direção oposta. Esses agregados (com 72 horas de cultura) tinham cerca de 300 µm de
diâmetro e apresentavam contrações espontâneas que duravam 0,5 segundos e com
intervalos de 1,7 segundos entre as contrações (Figura 8).
Para confirmarmos se as células presentes na cultura de agregados de
cardiomiócitos eram realmente células cardíacas realizamos uma imunofluorescência
com dupla marcação para as proteínas desmina e tropomiosina. Tanto a desmina como a
tropomiosina sarcomérica foram utilizadas por serem específicas de células musculares
estriadas e não serem expressas em fibroblastos. Na Figura 9A podemos observar um
cardiomiócito crescido por 24 horas e observado por microscopia óptica de contraste
interferencial (DIC), que permite a obtenção de imagens que mostram toda a célula.
Esta célula foi marcada com anticorpos anti-desmina (Figura 9B) e anti-tropomiosina
sarcomérica (Figura 9C). A marcação de tropomiosina sarcomérica obtida foi na forma
30
de estriações ao longo de toda miofibrila enquanto a de desmina ocupa todo o
citoplasma e a região perinuclear.
Após a confirmação que nossas culturas continham cardiomiócitos (além de
fibroblastos, que são comuns em culturas primárias de tecido cardíaco), decidimos
realizar o tratamento com a substância metil-β-ciclodextrina (MCD), para investigarmos
os mecanismos celulares e moleculares associados com a depleção do colesterol em
cardiomiócitos. Para tal tratamos as culturas de agregados com uma concentração de 2
mM de MCD por 1 hora, retiramos a droga e depois deixavamos que as células
permanecessem em meio fresco por mais 3 horas. Utilizamos esta concentração de 2
mM da MCD devido a trabalhos anteriores de nosso laboratório com culturas de células
musculares esqueléticas (Mermelstein et al., 2005; Portilho et al., 2007).
Já que a MCD retira moléculas de colesterol e desorganiza micro-domínios de
membrana (as rafts), decidimos iniciar nossos testes com a análise da expressão da
proteína caveolina-3, já que ela é um marcador de rafts caveolares de células
musculares. Analisamos a expressão de caveolina-3 através de immunoblottings de
extratos protéicos de agregados de cardiomiócitos crescidos em cultura e tratados com
MCD (Figura 10A). A quantificação dos immunoblots revelou uma diminuição de
cerca de 30% nos níveis de expressão da proteína caveolina-3 após 3 horas de
tratamento com a MCD em comparação às culturas não tratadas. Os níveis de caveolina-
3 aumentam em relação a culturas controle quando as células são analisadas após 24
horas de tratamento com MCD (Figura 10B).
Partimos então para o estudo da distribuição da proteína caveolina-3 através de
microscopia óptica de imunofluorescência. Analisamos também a distribuição da
proteína desmina, por ser um marcador de células musculares (Figura 11). Tanto os
cardiomiócitos controle como os tratados com a MCD apresentaram co-localização das
31
distribuições das proteínas caveolina-3 (Figura 11A) e desmina (Figura 11B) em
estruturas filamentosas presentes na região subsarcolemal (abaixo da membrana
plasmática) e na região perinuclear das células cardíacas.
Culturas de agregados de cardiomiócitos crescidas in vitro exibem, assim como o
músculo cardíaco exibe in vivo, muitas regiões de adesão célula-célula mediadas pela
proteína caderina. Desta forma nosso próximo passo foi investigar se as adesões
intercelulares haviam sofrido alguma alteração após a retirada do colesterol membranar.
Analisamos através de microscopia de imunofluorescência (Figuras 12 e 13) a
distribuição da caderina e de sua proteína associada β-catenina em células cardíacas
controle (dados não mostrados) e após 24 horas de tratamento com a MCD. Em ambas
as condições, a proteína caderina foi encontrada em linhas contínuas presentes ao longo
das regiões de contato célula-célula (Figura 12B), enquanto que a proteína β-catenina
foi encontrada distribuída em linhas descontínuas nas mesmas áreas de adesão
intercelular (Figura 13B). É importante chamar a atenção para o fato de não termos
achado diferenças significativas em relação à distribuição das proteínas caderina e β-
catenina antes e depois do tratamento com MCD. O que observamos foi um nítido
aumento de intensidade de fluorescência (tanto para caderina como para β-catenina) nas
regiões de adesão célula-célula nas culturas tratadas com MCD em relação às culturas
controle (dados do controle não mostrados).
Para examinarmos com maior acurácia este possível aumento na expressão destas
proteínas de adesão, partimos para a análise através de immunobloting da expressão da
proteína caderina em culturas de agregados de cardiomiócitos tratadas ou não com
MCD (Figura 14). A quantificação dos immunoblots revelou um aumento superior a
2,5 vezes nos níveis de expressão de caderina nas células tratadas com MCD quando
comparadas às células controle.
32
Junto com as marcações para caderina e β-catenina fizemos também marcações
para a proteína tropomiosina, para estudarmos o grau de estriação dos cardiomiócitos
antes e após o tratamento com a MCD (Figuras 12 e 13). Tropomiosina foi encontrada
distribuida sob a forma de estriações nas bandas I dos sarcômeros em ambas as
situações, controle (dados não mostrados) e tratada com MCD. No entanto, observamos
um aumento na intensidade de fluorescência nas culturas tratadas com MCD em relação
as culturas controle (dados do controle não mostrados).
Resolvemos então quantificar através de immunoblotting a expressão da proteína
tropomiosina sarcomérica antes e após a depleção de colesterol em culturas de
agregados de cardiomiócitos (Figura 15). A quantificação dos immunoblots revelou um
aumento superior a 2,5 vezes nos níveis de expressão da proteína tropomiosina
sarcomérica em células tratadas com a MCD quando comparados às células controle.
Decidimos por fim verificar se a depleção de colesterol estava afetando a expressão
do fator de transcrição Nkx2.5, uma vez que ele é um marcador de diferenciação
cardíaca (Figura 16). Analisamos então através de immunoblots a expressão de Nkx2.5
em culturas de agregados de cardiomiócitos tratados ou não com MCD. A quantificação
dos immunoblots revelou um aumento superior a 5 vezes nos níveis de expressão do
fator de transcrição Nkx2.5 em células tratadas com a MCD quando comparados às
células controle.
Em resumo, nossos resultados mostram que a depleção de colesterol através da
metil-beta-ciclodextrina leva a um aumento da expressão de diversos marcadores do
músculo cardíaco, como o fator de transcrição Nkx2.5, a proteína sarcomérica
tropomiosina e as proteínas de adesão caderina e β-catenina.
33
Figura 7 – Microscopia de fase de agregados de células cardíacas. Microscopia
óptica de contraste de fase mostrando um agregado de células cardíacas que foi isolado
a partir de embriões de galinha e crescido in vitro por 72 horas (A). Em um maior
aumento (B), podemos observar muitas células se espalhando (seta) a partir do centro do
agregado. Barras de 20 µm.
34
Figura 8 – Agregados de cardiomiócitos contraem espontaneamente em cultura.
Sequência de imagens de microscopia de contraste de fase de um agregado de
cardiomiócitos. As imagens mostradas tem intervalos de 0,03 segundos entre elas. Notar
que a área marcada em vermelho no centro da imagem A é maior que a da imagem I, o
que caracteriza a contração do agregado. A imagem J mostra um perfil temporal das
imagens A-I e as setas apontam momentos de contração do agregado. Barra em G de 40
µm.
35
Figura 9 – Cardiomiócitos expressam desmina e tropomiosina. Microscopia óptica
confocal mostrando dupla-marcação para desmina (verde, B) e para tropomiosina
sarcomérica (vermelho, C) em cardiomiócito. A marcação de desmina foi observada ao
redor do núcleo (seta em B) e em todo citoplasma e a de tropomiosina ficou concentrada
nas estriações sarcoméricas. Em A a mesma célula é vista por microscopia óptica de
contraste interferencial (DIC). Barra de 10 µm.
36
Figura 10 - A expressão da caveolina-3 é reduzida logo após a depleção do
colesterol em agregados cardíacos. Em A, células controle (Co) foram cultivadas por
27 ou 48 horas. Outras células foram cultivadas por 24 horas, tratadas com MCD por 1
hora e após 3 ou 24 horas foram analisadas em Western blot utilizando anticorpos anti-
caveolina-3 e anti-α-tubulina. Em B, a quantificação dos immunoblots revelou uma
diminuição de 30% nos níveis de expressão caveolina-3 após 3 horas de tratamento com
MCD e um aumento de 60% após 24 horas de tratamento.
37
Figura 11 - A caveolina-3 colocaliza-se com a desmina nos cardiomiócitos. Culturas
de agregados de cardiomiócitos de embrião de galinha foram cultivadas por 24 horas,
tratadas com MCD por 1 hora e fixadas após 24 horas. As células foram triplamente
marcadas com anticorpos anti-desmina (A, vermelho), anti-caveolina-3 (B, verde), e a
sonda DAPI para visualização do núcleo (C, azul). Em uma sobreposição das 3 imagens
(em D), é possível ver a co-localização da caveolina-3 com a desmina e a concentração
de ambas as proteínas na região perinuclear (seta em D). A barra de escala representa 10
µm.
38
Figura 12 - Caderina se distribui em linhas contínuas ao longo da região de adesão
intercelular de cardiomiócitos. Culturas de agregados de cardiomiócitos de embrião
de galinha foram cultivadas por 24 horas, tratadas com MCD por 1 hora e fixadas após
24 horas. As células foram triplamente marcadas com anticorpos anti-tropomiosina
sarcomérica (A, verde), anti-caderina (B, vermelho) e a sonda DAPI para visualização
do núcleo (C, azul). Notar a distribuição da tropomiosina em sarcômeros (A) e da
caderina em regiões de adesão célula-célula (seta em B). A imagem mostrada em D
corresponde a sobreposição das 3 imagens anteriores (A-C). A barra de escala
representa 10 µm.
39
Figura 13 - ββββ-catenina se distribui em linhas descontínuas ao longo da região de
adesão intercelular de cardiomiócitos. Culturas de agregados de cardiomiócitos de
embrião de galinha foram cultivadas por 24 horas, tratadas com MCD por 1 hora e
fixadas após 24 horas. As células foram triplamente marcadas com anticorpos anti-
tropomiosina sarcomérica (A, verde), anti-βcatenina (B, vermelho) e a sonda DAPI para
visualização do núcleo (C, azul). Notar a distribuição da tropomiosina em sarcômeros
(A) e da β-catenina em regiões de adesão célula-célula (seta em B). A imagem mostrada
em D corresponde a sobreposição das 3 imagens anteriores (A-C). A barra de escala
representa 10 µm.
40
Figura 14 - A depleção de colesterol aumenta a expressão de caderina em
agregados cardíacos. Em A, células controle (Co) foram cultivadas por 24 horas; e
outras células foram cultivadas por 24 horas e depois tratadas com MCD durante 1 hora.
Após 3 horas foram analisadas por Western blot utilizando anticorpos anti-pan-caderina
e anti-α-tubulina. Em B, a quantificação dos immunoblots revelou um aumento superior
a 2 vezes nos níveis de expressão da caderina quando comparados às células controle.
41
Figura 15 - A depleção de colesterol aumenta a expressão de tropomiosina
sarcomérica em agregados cardíacos. Em A, células controle (Co) foram cultivadas
por 24 horas; e outras células foram cultivadas por 24 horas e depois tratadas com MCD
durante 1 hora após 3 horas foram analisadas por Western blot utilizando anticorpos
anti-tropomiosina sarcomérica e anti-α-tubulina. Em B, a quantificação dos
immunoblots revelou um aumento de mais de 2 vezes nos níveis de expressão da
tropomiosina sarcomérica quando comparada às células controle.
42
Figura 16 - A depleção de colesterol aumenta a expressão de Nkx2.5 em agregados
cardíacos. Em A, células controle (Co) foram cultivadas por 24 horas; outras células
foram cultivadas por 24 horas e depois tratadas com MCD durante 1 hora após 3 horas
foram analisadas por Western blot utilizando anticorpos anti-Nkx2.5 e anti-α-tubulina.
Em B, a quantificação dos immunoblots revelou um aumento de mais de 5 vezes nos
níveis da expressão Nkx2.5 quando comparado às células controle.
43
5 - Discussão
Recentemente o modelo de estrutura da membrana plasmática foi revisto com
base na descoberta de regiões especializadas de membrana enriquecidas em colesterol,
os chamados micro-domínios de membrana ou “rafts” (balsas, plataformas). Estes
microdomínios (Galbiati et al., 2001b) são regiões enriquecidas em colesterol e
esfingolipídeos que fazem com que sejam menos fluidas do que o resto da membrana.
Acredita-se que estas balsas, que podem se mover na membrana, servem para organizá-
la em uma série de micro-domínios discretos, que podem participar de várias funções
celulares, tais como tráfego intracelular de vesículas e transdução de sinais (Simon e
Ikonen, 1997). Diferentes proteínas podem ser seletivamente incluídas ou excluídas
destes micro-domínios. Várias proteínas têm sido descritas tendo associações com
micro-domínios de membrana, e mais ainda, dependendo de colesterol ou de
esfingolipídeos para sua atividade (Klein et al., 1995; Mutoh et al., 1995). Colesterol
influencia a interação entre lipídeos e proteínas através do aumento da espessura da
membrana nos micro-domínios.
Experimentalmente, existe uma substância chamada de metil-beta-ciclodextrina
(MCD) que se liga especificamente a moléculas de colesterol e desta forma as retira
seletivamente da membrana plasmática (Christian et al., 1997), alterando a composição
e a estrutura da membrana. Uma vez que micro-domínios são enriquecidos em
colesterol, esta substância tem sido utilizada para desorganizar as “rafts”, e desta forma
testar as relações entre as “rafts” e eventos celulares específicos.
Utilizamos esta substância nesta tese com o objetivo de estudar os possíveis
efeitos da retirada seletiva de colesterol na diferenciação de cardiomiócitos crescidos in
vitro.
44
Os micro-domínios de membrana são divididos em 2 sub-tipos: os caveolares e
os não-caveolares. O que diferencia estes dois sub-tipos é a presença ou não da proteína
chamada de caveolina. A presença de caveolina leva o micro-domínio a formar uma
invaginação na membrana plasmática e esta invaginação recebe o nome de cavéola. A
cavéola é então um subconjunto específico de micro-domínio de membrana que é
caracterizada pela presença das proteínas caveolinas, além de colesterol e
esfingolipídeos. A família das proteínas caveolinas é constituída de caveolinas 1, 2 e 3
(Parton, 1996, Scherer et al., 1996; Tange et al., 1996; Okamoto et al., 1998). A
proteína caveolina-1 é o principal componente da cavéola na maioria dos tipos
celulares, sendo necessária para a formação da cavéola (Fra et al., 1995; Razani e
Lisanti, 2001). A proteína caveolina-2 colocaliza com caveolina-1 e compartilha a
distribuição semelhante nos tecidos. Já a proteína caveolina-3 tem uma distribuição
seletiva nos tecidos e é predominantemente expressa em células musculares cardíacas,
lisas e esqueléticas (Song et al., 1996). Uma vez que este trabalho de tese se concentrou
no estudo de células musculares cardíacas, decidimos analisar a distribuição e a
expressão da proteína caveolina-3.
Em nossos resultados tanto as culturas de cardiomiócitos controle quanto as
tratadas com a MCD apresentaram colocalizações entre as proteínas especificas de
músculo caveolina-3 e desmina, com uma distribuição contínua das estruturas
filamentosas na região subsarcolemal dos cardiomiócitos. Relatos anteriores de nosso
grupo e de outros pesquisadores confirmam que caveolina-3 se distribui em forma de
filamentos longitudinais que se localizam no citoplasma logo abaixo da membrana
plasmática em células musculares humanas, de camundongo, de rato e de galinha
(Parton et al., 1997; Voldstedlund et al., 2001; Draeger et al., 2003; Mermelstein et al.,
2007a). Além disso, nosso grupo mostrou resultados similares de colocalização de
45
caveolina-3 e desmina em células de músculo esquelético (Mermelstein et al., 2007a). É
possível que a desmina tenha um papel de ligação do citoesqueleto com a membrana
plasmática, através de sua ligação com caveolina-3.
Desmina é um filamento intermediário do citoesqueleto e sua distribuição no
citoplasma também é sob a forma filamentosa (Costa et al., 2004). Além desta
distribuição no citoplasma, os resultados desta tese mostraram também uma marcação
da desmina em torno do núcleo dos cardiomiócitos crescidos in vitro. A marcação
perinuclear da desmina está de acordo com achados anteriores de nosso laboratório que
mostram a associação de desmina com a membrana nuclear externa em células
musculares esqueléticas de embriões de galinha (Mermelstein et al., 2006). Desmina
teria portanto um papel de ancoragem e sustentação do núcleo tanto em células
musculares esqueléticas quanto cardíacas.
Nossos resultados mostraram uma diminuição da expressão de caveolina-3 nas
culturas de agregados cardíacos após 3 horas de tratamento com a metil-beta-
ciclodextrina (MCD) em relação ao controle. Pelo menos duas possibilidades podem ser
pensadas para explicar estes dados: ou a caveolina estaria sendo degradada por
proteassomas após o tratamento com MCD, ou a caveolina estaria sendo liberada da
membrana para o meio de cultura após a saída do colesterol membranar. É importante
lembrarmos que a caveolina é uma proteína transmembranar e portanto acessível tanto
do meio extra como do intracelular.
A plena funcionabilidade do tecido cardíaco depende da contração sincronizada de
suas células musculares, assim como da elasticidade e resistênca mecânica das mesmas.
As miofibrilas, o sistema citoesquelético e as suas ligações com a membrana plasmática
proveem estas propriedades funcionais. Discos intercalares e desmossomas são os dois
principais sistemas de ancoragem do aparato miofibrilar e do citoesqueleto das células
46
musculares cardíacas (Zuppinger et al., 2000). A adesão entre cardiomiócitos é mediada
principalmente pela caderina, uma proteína dependente de cálcio (Takeichi, 1990;
Geiger e Ayalon 1992; Hertig et al., 1996). Caderina se localiza nas junções aderentes
nos discos intercalares do miocárdio, onde seu domínio extracelular N-terminal medeia
interações homotípicas entre células vizinhas. Já o domínio C-terminal da caderina se
liga às cateninas, proteinas citoplasmáticas que interagem com o citoesqueleto de actina
(Kemler, 1993). A molécula de caderina tem ainda um domínio transmembranar que
permite que a proteína tenha sua inserção na bicamada lipídica e onde ela pode interagir
com outras proteínas e lipídeos, como fosfolipídeos e colesterol. Desta forma, fica clara
a importância das caderinas na manutenção das adesões célula-célula no tecido
cardíaco. Por este motivo decidimos estudar a distribuição e a expressão desta proteína
nos cardiomiócitos crescidos in vitro e tratados ou não com a metil-beta-ciclodextrina.
Além da caderina, estudamos também a distribuição da proteína β-catenina. β-
catenina é uma proteína multifuncional, pois participa tanto da adesão intercelular
mediada por caderinas, como pode participar da sinalização da via de Wnt. Esta
sinalização é iniciada pela ligação de glicoproteínas chamadas de Wnt a duas moléculas
receptoras, a proteína transmembranar Frizzled (Fz) e a proteína co-receptora LRP-5/6
(proteína relacionada ao receptor de LDL) (Nelson e Nusse, 2004). Em resposta ao sinal
Wnt, os receptores frizzled ativam a fosfoproteína dishevelled. Apesar do mecanismo
ainda não ser completamente conhecido, sabe-se que a fosfoproteína dishevelled inibe a
função de GSK-3β (glicogênio sintase quinase-3β), cuja inibição leva ao acúmulo da
proteina β-catenina hipofosforilada no citoplasma e a sua translocação para o núcleo
(Barth et al., 1997), onde ela está envolvida na ativação transcricional de genes alvo em
complexo com TCF/LEF. Na ausência de sinalização Wnt, os níveis de β-catenina são
mantidos baixos pela fosforilação dela pela GSK-3β, o que sinaliza para a degradação
47
de β-catenina. Esta fosforilação pela GSK-3β é catalizada por um grande complexo
molecular que inclui a proteína axina, o supressor tumoral APC (adenomatous polyposis
coli) e várias outras proteínas. A competição entre diferentes parceiros citoplasmáticos e
nucleares da β-catenina por um pool limitado de β-catenina pode determinar se sua
função será na adesão celular ou na transativação (Ben-Ze’ev et al., 2000).
Nossos resultados mostram a β-catenina apenas nas regiões de adesão na
membrana, não tendo sido encontrada no núcleo em nenhuma das 2 situações estudadas
(tratadas ou não com MCD). Isso sugere que a via de Wnt/β-catenina não está sendo
ativada nos cardiomiócitos nestas situações. A via de Wnt pode estar sendo ativada
antes do momento que as nossas células são fixadas, e portanto estaríamos perdendo
esta marcação nuclear da β-catenina. Estes dados deverão ser aprofundados pelo nosso
grupo no futuro, uma vez que trabalhos de outros grupos mostram o papel da via de Wnt
na ativação da diferenciação cardíaca (Liu et al., 2009).
Recentemente, nosso grupo mostrou que a depleção de colesterol pela substância
metil-beta-ciclodextrina (MCD) induz a proliferação e a diferenciação de células
musculares esqueléticas crescidas em cultura (Mermelstein et al., 2005). Além disso,
mostramos que a ativação da via Wnt/β-catenina está envolvida nestes eventos
(Mermelstein et al., 2007b). Uma possível explicação para os resultados obtidos nesta
tese é que um mecanismo semelhante ao descrito por nosso grupo para o modelo de
células musculares esqueléticas esteja ocorrendo nas culturas de cardiomiócitos. Ou
seja, a depleção do colesterol membranar poderia estar liberando para o meio de cultura
proteínas ancoradas em rafts lipídicas e desta forma estas moléculas poderiam ativar
vias de sinalização em células vizinhas. Uma destas moléculas é o Wnt-3a, que
mostramos recentemente que é de fato solubilizada e liberada da membrana plasmática
para o meio de cultura de células musculares esqueléticas tratadas com MCD (Portilho
48
et al., 2007). Esta hipótese precisa ser testada e para tal seguiremos a mesma abordagem
metodológica utilizada no nosso trabalho anterior feito com células musculares
esqueléticas. Esta abordagem inclui imunoprecitação e immunoblotting com anticorpo
anti-Wnt3a do meio condicionado das culturas tratadas com MCD.
Neste trabalho também analisamos a expressão do fator de transcrição Nkx2.5.
Nkx2.5 é um elemento fundamental da cardiomiogênese, uma vez que ele controla a
expressão de vários genes cardíacos específicos. Ele é expresso por células progenitoras
desde o inicio da cardiomiogênese até a vida adulta do músculo cardíaco (Lints et al.,
1993). Desta forma, se tornou importante analisar a sua expressão nos agregados de
cardiomiócitos tratados ou não com a metil-beta-ciclodextrina (MCD). Nossos
resultados mostram um aumento de mais de 5 vezes na expressão de Nkx2.5 nos
extratos protéicos das culturas tratadas com MCD em relação às culturas controle. Este
aumento tão expressivo nos surpreendeu. Dados da literatura mostram que o Nkx2.5
tem sua expressão induzida pela ativação da via de Wnt (Liu et al., 2009). Como já
discutido anteriormente nesta tese, é possível que a via de Wnt esteja envolvida nos
efeitos por nós observados nos cardiomiócitos após a depleção de colesterol.
É importante também chamarmos a atenção para o fato de termos estabelecido
durante este trabalho de tese um sistema de cultura de agregados de células cardíacas.
Estes agregados são pequenos fragmentos de tecido cardíaco obtidos a partir de
embriões de galinha com 11 dias de desenvolvimento, e que são similares aos
cardiomiócitos in vivo. Mostramos que estas células são funcionais, pois contraem
espontaneamente, e expressam vários marcadores de diferenciação cardíaca (como o
Nkx2.5). Este modelo poderá servir para futuros estudos para se entender melhor as
bases celulares e moleculares dos mecanismos que governam a diferenciação cardíaca.
49
Exemplos destes estudos seriam análises dos efeitos de fármacos e transfecções de
genes para análise de super-expressão ou desligamento de genes específicos.
Em resumo, os resultados desta tese mostram que a depleção de colesterol
membranar de cardiomiócitos pela substância metal-beta-ciclodextrina leva a um
aumento na expressão de vários marcadores de diferenciação cardíaca, tais como o fator
de transcrição Nkx2.5, a proteína sarcomérica tropomiosina, a proteína de adesão
caderina e a proteína caveolar caveolina-3 (Figura 17). Além disso, mostramos que a
retirada de colesterol leva a uma concentração de caderina e de sua associada β-catenina
em regiões de adesão entre cardiomiócitos vizinhos. Desta forma sugerimos que o
colesterol presente na membrana plasmática desempenha um papel importante na
diferenciação cardíaca, em especial na regulação da adesão intercelular.
50
Figura 17 – Esquema dos resultados obtidos na tese. Em (A) vemos um agregado de
cardiomiócitos de embrião de galinha cultivado por 24 horas e analisado depois de mais
3 ou 24 horas de crescimento. Em (B) vemos um agregado de cardiomiócitos de
embrião de galinha cultivado por 24 horas, tratado com metil-beta-ciclodextrina
(MβCD, que retira o colesterol membranar) e analisado depois de 3 e 24 horas de
crescimento. Após a depleção de colesterol, foi observado um aumento na expressão das
proteínas β-catenina, caderina, caveolina-3, desmina, tropomiosina e Nkx2.5. Uma das
hipóteses levantadas para explicar este fenômeno seria a liberação de fatores solúveis
para o meio de cultura após o tratamento com a MCD.
51
6 – Sumário dos Resultados e Conclusões
• Neste trabalho foi possível estabelecermos a técnica de cultivo de agregados de
cardiomiócitos isolados de corações de embriões de galinha;
• Os cardiomiócitos de embrião de galinha migram para fora dos agregados em
várias direções;
• Os cardiomiócitos de embrião de galinha expressam a proteína dos filamentos
intermediários desmina e seus filamentos se distribuem por todo citoplasma, se
concentrando na região próxima do núcleo celular;
• Os cardiomiócitos de embrião de galinha expressam a proteína tropomiosina e
esta se localiza nas bandas I dos sarcômeros das miofibrilas;
• Os cardiomiócitos de embrião de galinha expressam a proteína caveolar
caveolina-3 e esta se localiza sob a forma de filamentos que se distribuem por
todo citoplasma das células e na região perinuclear;
• As proteínas desmina e caveolina-3 se co-localizam sob a forma filamentosa por
todo o citoplasma e na região perinuclear de cardiomiócitos de embrião de
galinha;
• Os cardiomiócitos de embrião de galinha expressam as proteínas de adesão
intercelular caderina e β-catenina;
• Os cardiomiócitos de embrião de galinha expressam o fator de transcrição
Nkx2.5;
• O tratamento de cardiomiócitos de embrião de galinha por 3 horas com a
substância metil-beta-ciclodextrina (MCD) leva a redução da expressão da
caveolina-3, e que após 24 horas aumenta em 60%;
52
• O tratamento de cardiomiócitos com a MCD leva a um aumento das proteínas
caderina e β-catenina em regiões de adesão intercelular de cardiomiócitos;
• O tratamento de cardiomiócitos com a MCD leva a um aumento de mais de 2
vezes da expressão de tropomiosina sarcomérica e de caderina quando
comparados às células controle;
• O tratamento de cardiomiócitos com a MCD leva a um aumento de mais de 5
vezes da expressão do fator de transcrição Nkx2.5 quando comparado às células
controle;
• O colesterol membranar tem um papel significante na regulação da diferenciação
de cardiomiócitos e em especial nas adesões intercelulares mediadas por
caderina envolvidas nestes eventos.
53
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