RNA diagnostika neurofibromatózy typu 1

Kratochvílová A., Kadlecová J., Ravčuková B.,Valášková I. a Gaillyová R.

laboratoř molekulární diagnostiky, OLG, FN Brno, Černopolní 9

Neurofibromatóza typu 1 (NF1)

Neurofibromatóza typu 1 patří do skupiny

neurokožních syndromů primárně

postihujících tkáně odvozené od nervových

kmenových buněk.

Je to autozomálně dominantní choroba

s četností 1:3500, je způsobena mutacemi

v genu NF1, kódujícím protein neurofibromin.

Klinické projevy:

1. Lish noduly v oční duhovce

2. skvrny „bílé kávy“ na kůži

3. kožní a podkožní neurofibromy

4. abnormality skeletu

5. malignity centrálního a periferního

nervového systému

6. vzácně mentální retardace atd.

Diagnostická kritéria neurofibromatózy typu 1

Struktura NF1 genu

- lokalizován na chromozomu 17q11.2

- 350 kb

- 60 exonů

- 11 - 13 kb mRNA

- alternativní sestřih: exon 9br

23a

48a

Neurofibromin

Translačním produktem genu NF1 je protein

neurofibromin, skládající se z 2818 aminokyselin

s odhadovanou molekulární hmotností 327 kDa. Jedinou

oblastí na molekule neurofibrominu s jasně popsanou

biologickou funkcí je centrální doména o 360

aminokyselinách (exony 21 - 27), (s vysokým stupněm

homologie k Ras - specifickým GTPázy aktivujícím

proteinům) - “GAP-related domain” (NF1-GRD). Touto

doménou neurofibromin urychluje konverzi Ras z aktivní

(GTP-vázané) do inaktivní (GDP-vázané) formy.

Inaktivace Ras vede k regulaci buněčného růstu, při ztrátě této funkce neurofibrominu v tumorech (na obou alelách) dochází ke zvýšenému buněčnému růstu, neurofibromin ve své funkční podobě tedy působí jako tumor supresor.

Exprese neurofibrominu v lidských tkáních

NF1 expression in normal human tissues based on proprietary W.I.S DNA array results

Mutace v genu NF1

- jedna z nejvyšších mutačních

rychlostí u lidské choroby

(1x10-4/gametu/generaci)

- 50% případů de novo

- široké spektrum mutací:

od bodových mutací až

po komplexní přestavby

- žádné významnější

“hot spot” oblasti

(ex. 10 a ex. 37?),

mutace rozloženy

po celém genu.

Komplikace při molekulární diagnostice NF1

- nesnadné stanovení klinické diagnózy NF1

- až 50 % případů de novo - vysoká mutační rychlost genu NF1 - velikost genu (350 kb, 60 exonů)

- absence hot spot oblastí - nutnost vyhledávání mutací v celém genu

- nejasná korelace mezi typem mutace a formou postižení

- neurofibromin - známa funkce pouze jeho centrální domény

- různé klinické projevy i u pacientů nesoucích stejnou mutaci

Strategie molekulárně - genetického testování NF1 pacientů

DNA / RNA pacienta

Prenatální diagnostika

intragenový DNA polymorfismusIVS27AAAT2.1, IVS27AC28.4

IVS38GT53.0 - i 38

Vazebná DNA analýza

DNA/RNA vyhledávací metodyDGGE, SSCPcDNA / SSCP

Mutační analýza Přímé sekvenování

RNA diagnostika genu NF1

- dříve používána pouze DNA diagnostika: u pacientů skrínováno 8 exonů ze 60

- pomocí RNA diagnostiky prohledávána celá kódující oblast genu (využití přepisu RNA do bezintronové cDNA ): rozdělení cDNA do deseti úseků o délce okolo 1000bp.

- možnost zachycení mutací ovlivňujících sestřih (u NF1 časté)

RNA diagnostika genu NF1

- založena na detekci mutací v cDNA,

umožňuje vyhledávat mutace v celé kódující

oblasti genu NF1.:

1. Izolace RNA z krve nebo tkáně.

2. Přepis RNA zpětnou transkriptázou (RT)

do cDNA.

3. Amplifikace vnitřní kódující oblasti cDNA

s deseti páry specifických primerů - vznik

deseti částečně se překrývajících

segmentů P1 - P10 pokrývajících celou kódující oblast genu NF1.

4. Mutační analýza segmentů P1 - P10 pomocí cDNA-SSCP.

5. Sekvenace vzorků s odlišnou

elektroforetickou mobilitou.

6. Určení typu a polohy mutace.

cDNA

NF1 cDNA ( 60 exonů)

P1 P3 P5 P7 P9

RT

PCR

P2 P4 P6 P8 P10

cDNA-SSCP (~ 1000 - 1200bp)

Sekvenační analýza

celková RNA

Metoda jednořetězcového konformačního polymorfismu (SSCP)

- technika založená na elektroforetické mobilitě

jednořetězců DNA.

Cílový produkt amplifikace DNA je tepelně

denaturován na jednořetězce a je podroben

elektroforetické separaci. Za nedenaturujících

podmínek zaujímá ssDNA sekundární strukturu

podmíněnou sekvencí nukleotidů. Přítomnost mutace

tuto strukturu mění, tím je ovlivněna i rychlost

migrace DNA a na gelu můžeme detekovat nadbytečný proužek.

podmínky elektroforetické separace : 12% PAGE (60:1) / 150V / 16 hod. / r.t.

P7

mt C5242T

wt C62

cDNA/SSCP analýza genu NF1

Úspěšné zavedení SSCP analýzy (používané

většinou pro úseky DNA do 300bp) pro úseky genu

NF1 o délce okolo 1 kbp.

- PCR produkt ředit ve formamidu

- 10 % PAG (40:1)

- elektroforéza: 600 V

15°C

4,5 h

Sekvenace úseku P7 genu NF1 ( exony 28 - 33)

standardní DNA

mutantní DNA C 5242 T ( R 1748 X) Arg > Stop

5’ 3’

5’ 3’

C > T

Další kroky v diagnostice neurofibromatóz

- zavedení funkční analýzy proteinového produktu genu NF1,

(rozlišení neutrálního polymorfismu od mutaci způsobující změny)

- objasnění souvislosti konkrétní mutace a formy postižení

- genová terapie, cílená terapie(viz obr.):

a) blokování enzymů zapojených do farnesylace ras

b - d) blokování dalších cílů aktivovaných proteinem ras

pro amplifikaci mitogenního signálu

- zavedení diagnostiky neurofibromatózy typu 2 na našem pracovišti

a

b c d

V souboru 30 pacientů vyšetřovaných RNA diagnostikou (cDNA/SSCP) byla nalezena změna v mobilitě některého z fragmentů P1 - P10 cDNA u 17 pacientů. U 6 z nich byla mutace na úrovni cDNA přesně charakterizována (jedná se o tři delece celých exonů, jednu deleci čtyř nukleotidů a dvě nukleotidové substituce). U ostatních je třeba sekvenací dořešit, zda je změna v mobilitě úseku cDNA způsobena skutečně mutací a tuto případnou mutaci přesně charakterizovat.

Pro potvrzení patologického vlivu nalezených mutací na funkci proteinu by bylo vhodné zavést funkční analýzu neurofibrominu v kvasinkách (FASAY).

Závěr