NETOSE ET CHOC SEPTIQUE - est.cnerea.fr · Définition de la CIVD ? JAAM-DIC (2016) AT . LPS/TLR4 Cellule endothéliale Cellule musculaire lisse vasculaire ... Un traitement anticoagulant

NETOSE ET CHOC SEPTIQUE

Julie Boisramé-Helms INSERM UMR S949 EFS- FMTS

Réanimation Médicale - NHC, CHU Strasbourg

Les Hôpitaux

Universitaires de STRASBOURG

Sepsis et choc septique

D’après Singer et al., JAMA 2016

Vasopresseurs

Lactate ≥ 2 mmol/L

CHOC SEPTIQUE

SEPSIS

Dysfonction d’organes INFECTION

Sepsis et choc septique

• Mortalité : 42 % à J28

• Une réponse de l’hôte inadaptée

• SIRS

• Activation cellulaire vasculaire

• Dette en O2

• Défaillance d’organes

Bactérie

Hôte

Sepsis et activation coagulation

CIVD

• 30 % des chocs septiques

• Saignement/Thrombose

• Facteur de mauvais pronostic : mortalité

Paramètres biologiques Score ISTH Score JAAM 2006

SIRS [0] < 3 [1] ≥ 3

Plaquettes (G/L) [0] > 100 [1] 50-99 [2] < 50

[0] > 120 [1] 80-119 ou -30% [3] <80 ou -50%

TP (%) [0] > 64 [1] 35-64 [2] <35

[0] > 64 [1] < 64

Fibrinogène (g/L) [0] > 1,0 [1] < 1,0

D-dimères (μg/mL) [0] < 0,5 [2] 0,5-4,0 [3] > 4,0

[0] < 5,0 [1] 5,0-15,0 [3] > 15,0

Diagnostic de CIVD Score ≥ 5/8 Score ≥ 4/8

Définition de la CIVD ?

Paramètres biologiques Score ISTH Score JAAM 2006

SIRS [0] < 3 [1] ≥ 3

Plaquettes (G/L) [0] > 100 [1] 50-99 [2] < 50

[0] > 120 [1] 80-119 ou -30% [3] <80 ou -50%

TP (%) [0] > 64 [1] 35-64 [2] <35

[0] > 64 [1] < 64

Fibrinogène (g/L) [0] > 1,0 [1] < 1,0

D-dimères (μg/mL) [0] < 0,5 [2] 0,5-4,0 [3] > 4,0

[0] < 5,0 [1] 5,0-15,0 [3] > 15,0

Diagnostic de CIVD Score ≥ 5/8 Score ≥ 4/8

Définition de la CIVD ?

JAAM-DIC (2016)

AT

LPS/TLR4

Cellule endothéliale

Cellule musculaire lisse vasculaire

IMMUNITÉ INNÉE

MD2

TRIF/TRAM/IRF IFN-β

MyD88 NF- B

BGN

Reconnaissance de l’agent pathogène

Mise en jeu de l’immunité innée

Macrophage

Kumar, Int Rev Immun 2013 ; Athman, Curr Opin Microbiol 2004

LPS/TLR4

BGN

Etat hyper-inflammatoire : SIRS INFLAMMATION SIRS

Cytokines, interleukines

Macrophage

Parrillo, N Engl J Med 1993 ; Bone, Crit Care Med 1996 ; Annane, Lancet 2005 ; Angus, N Engl J Med 2013

LPS/TLR4

BGN

Etat hyper-oxydant


Production excessive d’ERO/ERN

STRESS OXYDANT

↘ ATP

Acidose Hypoxie Lactate

Canal Ca2+

RELAXATION

Parrillo, N Engl J Med 1993 ; Taylor, J Crit Care 1995 ; Annane, Lancet 2005 ; Angus, N Engl J Med 2013

NO NO O2

-

O2-

ONOO-

H2O2-

NO PGl2

PGl2

COX-2

iNOS

iNOS

NOx XO

NOx XO

COX-2

LPS/TLR4

BGN

Activation cellulaire aiguë



↘ ATP


Canal Ca2+

ACTIVATION LEUCOCYTAIRE & PLAQUETTAIRE Leucocytes et plaquettes activés

Verbist, Semin Immunol 2012 ; Yaguchi, J Thromb Haemost 2004

NO NO O2

-

O2-

ONOO-

H2O2-

NO PGl2

PGl2

COX-2

iNOS

iNOS

NOx XO

NOx XO

COX-2

LPS/TLR4

BGN

Mise en jeu de l’immunité adaptative



↘ ATP


Canal Ca2+

Activation cellules immunitaires

Lymphocytes T : helper Th1 et Th2 mémoire

IMMUNITÉ ADAPTATIVE

Verbist, Sem Immunol 2012 ; Aziz, J Leukocyte Biol 2013

NO NO O2

-

O2-

ONOO-

H2O2-

NO PGl2

PGl2

COX-2

iNOS

iNOS

NOx XO

NOx XO

COX-2

LPS/TLR4

BGN

INFLAMMATION SIRS



↘ ATP


Canal Ca2+

Activation C5a C5aR C5L2 ACTIVATION DU

COMPLÉMENT

INFLAMMATION SIRS

Ward, Crit Care Res and Practice 2012

NO NO O2

-

O2-

ONOO-

H2O2-

NO PGl2

PGl2

COX-2

iNOS

iNOS

NOx XO

NOx XO

COX-2

Mise en jeu de l’immunité adaptative

LPS/TLR4

BGN

Etat procoagulant



↘ ATP


Canal Ca2+

Activation C5a C5aR C5L2

FT

FVIIa FX FII

FXa FIIa FXIa

MP Activation endothéliale et expression du FT

MPs PROINFLAMMATOIRES et PROCOAGULANTES

VÉSICULATION MEMBRANAIRE

Meziani, Crit Care 2010 ; Delabranche, Crit Care 2013 ; Boisramé-Helms, Thromb Haemost 2014

NO NO O2

-

O2-

ONOO-

H2O2-

NO PGl2

PGl2

COX-2

iNOS

iNOS

NOx XO

NOx XO

COX-2

CD

CD Composants

cytoplasmiques Molécules de

signalisation

CMH

Cytoadhésines

Facteur tissulaire

Phosphatidylsérine

0.05 - 1 µm

Lipides bioactifs

Sélectines

Matériel génétique

Stimulus

- pro-inflammatoire

- pro-apoptotique

Marqueurs d’activation cellulaire

et bioeffecteurs

Les microparticules

Wolf, Br J Haematol 1967 ; Zwaal, Blood 1999 ; Combes, J Clin Invest 1999 ; Taraboletti, Am J Pathol 2002 ; Bakouboula, Front Biosci 2011

Les microparticules, marqueurs de CIVD

CD105-MPs CD11a-MPs

Pas de CIVD CIVD Pas de CIVD CIVD

Delabranche et al, ICM 2013.

Les microparticules, marqueurs de CIVD

CD105-MPs CD11a-MPs

Pas de CIVD CIVD Pas de CIVD CIVD

Delabranche et al, ICM 2013.

PNN

MD2

CD14 TLR4

LPS

IL-8

IFNα⁄γ + C5a

GM-CSF + C5a

Dégranulation

Diapédèse au niveau des tissus infectés

NADPH NADP + H+

+02 +2 O2 => H202

ACTIVATION LEUCOCYTAIRE

Amulic, Ann Rev Immunol 2012 ; Brinkmann, The J Cell Biol 2012

Libération de MPs leucocytaires

PNN : immunité / coagulation

PNN

MD2

CD14 TLR4

LPS

IL-8

IFNα⁄γ + C5a

GM-CSF + C5a

Dégranulation

Diapédèse au niveau des tissus infectés

Mort cellulaire « NETosis »

Formation de NETs

Peptides antimicrobiens, histones, élastase

Destruction du pathogène

Lésions d’organes

Citrullination des histones, déroulement de la chromatine, perméabilisation des membranes

Thromboses

Filaments d’ADN

NADPH NADP + H+

+02 +2 O2 => H202

ACTIVATION LEUCOCYTAIRE

Amulic, Ann Rev Immunol 2012 ; Brinkmann, The J Cell Biol 2012

Libération de MPs leucocytaires

PNN : immunité / coagulation

Fragment d’ADN

Bactérie

Enzymes et Histones

• Fragments d’ADN – Histones

– Enzymes (MPO, NE)

• Formation d’un filet – Microorganismes

• Bactéries

• Filamenteux (+++)

– Plaquettes

Neutrophil Extracellular Traps (NETs)

Brinkmann, J Cell Biol 2012 ; Brinkmann et al., Science 2004; Fuchs et al. J Cell Biol 2007

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3432757/figure/fig2/

Les NETs : physiopathologie

Auto-immunité

Infections

Cancer

Thromboses

Toshiyuki et al., Blood 2012

Immunothrombose

Engelmann & Massberg, Nat Rev Immunol. 2013

NETOSE AU COURS DE LA CIVD DU CHOC SEPTIQUE ?

Activation du PNN au cours de la CIVD

No DIC D1 DIC D10.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Pas de CIVD CIVD

MP

s-C

D66b

/Neu

tro

ph

iles

(nM

eq

. P

htd

Ser/

G)

p<0,01

p<0,05 p<0,05

D.

CIVD Pas de CIVD

No DIC D1 DIC D10.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Pas de CIVD CIVD

MP

s-C

D66b

/Neu

tro

ph

iles

(nM

eq

. P

htd

Ser/

G)

Pas de CIVD CIVD

Choc septique à point de départ pulmonaire chez un patient. Formule sanguine: PNN= 1,62G/L

Vésicules sous membranaire

Noyau rond

Dégranulation

Décondensation chromatinienne

Cytologie des neutrophiles

Modification morphologique des PNN dans la CIVD

NORMAL

J2 J3

J4 J7

J1

Modification morphologique des PNN dans la CIVD

1 point

(Variant anormal si l’ensemble des

paramètres est modifié)

Augmentée

Lobulation du

noyau

2 lobules ou 1 gros noyau rond

Condensation

chromatinienne

Chromatine décondensée

Granules

Diminués en nombres ou avec

répartition polaire

Vésicules Vésicules sous membranaires

nombreuses

0

5

10

15

2020

40

60

80

100

Sco

re N

ET

ose

J1 J1J3 J7 J3 J7

p<0,05

CIVD Pas de CIVD

Sco

re d

’an

om

. cyt

olo

giq

ue

s

La NETose est associée à la CIVD

0

1

2

3

4

Nu

cle

oso

mes (

UA

)

J1 J1J3 J7 J3 J7

p<0,05

CIVD Pas de CIVD

NETose et fluorescence des PNN ?

100 patients en choc septique, 35 CIVD

ADN décompacté marqueur de NETose

THROMBOMODULINE ET IMMUNOTHROMBOSE AU COURS DU CHOC SEPTIQUE

Ikezoe, J Crit Care, 2015

Thrombomoduline

Ikezoe, J Crit Care, 2015

Les questions

• rhTM et coagulopathie ?

• NETose ?

• Interaction NETose / coagulation ?

• Interaction NETose / MPs

Protocole expérimental

H0

- Rats Sham - Rats LCP

H18

Sédation, ventilation et monitorage Traitement : - rhTM IVL ou NaCl 0,9% - Remplissage - Noradrénaline

H22

- Recueil MPs - Isolement PNN et induction NETose ex vivo

Chirurgie

rhTM et coagulopathie

Diminution de la consommation plaquettaire


0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

SHAM-NaCl SHAM-TM LCP-NaCl LCP-TM

nMEqPhtdSer

MPsAnnexineVDiminution de la production de microparticules procoagulantes


0

20

40

60

80

100

120

SHAMNaCl SHAMTM LCPNaCl LCPTM

PPL(Sec)

Plus c’est court, plus c’est procoagulant

Diminution du potentiel procoagulant du plasma

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0


nMEqPhtdSer

MPsAnnexineV


0

20

40

60

80

100

120

SHAMNaCl SHAMTM LCPNaCl LCPTM

PPL(Sec)

40

50

60

70

80

90

100

ShamNaCl ShamTM CLPNaCl CLPTM

AT III (%)

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0


nMEqPhtdSer

MPsAnnexineV

Augmentation anticoagulant circulant

Dosage de la PCa microparticulaire

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50


Dosage de la PCa microparticulaire

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50


Activité anticogulante médiée par la protéine C activée

Activité fibrinolytique des MPs

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

45,00

50,00


Fibrinolyse / MPs totales

Mise en jeu retardée de la fibrinolyse

Activité fibrinolytique des MPs

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

45,00

50,00


Fibrinolyse / MPs totales

Fibrinolyse / MPs leucocytaires

Activité fibrinolytique portée par les leucocytes…


Un traitement anticoagulant par rhTM permet de diminuer la coagulopathie du choc septique dans un modèle de CLP chez le rat.

rhTM et activation cellulaire ? (nM Eq PhtdSer/10^9 cellules)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5


CD45/leuco

MPsPNN/PNN

CD61/plaq

Phénotypage des microparticules

NETose (DO/10^9 PNN)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1


Nucléosomes/PNN

NETose (DO/10^9 PNN)

0,0000

0,0500

0,1000

0,1500

0,2000

0,2500

0,3000


H3c/PNN

NE/PNN

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1


Nucléosomes/PNN

(Nucléosomes +) histones H3 citrullinés + neutrophil elastase = NETs

NETose et coagulopathie ?

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

shamNaCl shamTM CLP-NaCl CLP-TM

SFL/PNN

ADN décompacté marqueur de NETose corrélé à la coagulopathie (CIVD)

NETose

Un traitement anticoagulant par rhTM permet de diminuer la NETose au cours du choc septique dans un modèle de CLP chez le rat.

La NETose est associée à la coagulopathie au cours du choc septique dans un modèle de CLP chez le rat.

NETose et défaillance multiviscérale ?

Sham NaCl

Poumon: score lésionnel histologique Critères : - Œdème alvéolaire - Hémorragie alvéolaire - Infiltrat leucocytaire - Épaississement des septa

CLP NaCl

CLP NaCl CLP TM

Sham NaCl

Poumon: score lésionnel histologique Critères : - Œdème alvéolaire - Hémorragie alvéolaire - Infiltrat leucocytaire - Épaississement des septa

Marquages HE poumon (score composite – de 0 à 16 points)

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

œdème hémorragiealvéolaire

infiltratleucocytaire

épaississementseptal

total

shamNaCl

shamTM

CLPNaCl

CLPTM

Marquages HE poumon (score composite – de 0 à 16 points)

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

œdème hémorragiealvéolaire

infiltratleucocytaire

épaississementseptal

total

shamNaCl

shamTM

CLPNaCl

CLPTM

Le traitement par rhTM diminue les lésions histologiques pulmonaires, via une régression de l’infiltrat leucocytaire => NETs ??

CLP NaCl

CLP TM

Sham NaCl

Poumon : Vert : NE Rouge : H3c Bleu : PNN

Marquages du poumon : NE et H3c R

aw

IntD

en

Sha

m N

aCl

Sha

m T

M

Sep

sis NaC

l

Sep

sis TM

0

200000

400000

600000

800000

Ra

wIn

tDe

n

Sham

NaC

l

Sham

TM

Sepsis NaC

l

Sep

sis TM

0

200000

400000

600000

La rhTM diminue la NETose systémique

NETose

Un traitement anticoagulant par rhTM permet de diminuer la NETose et les lésions histologiques pulmonaires, au cours du choc septique dans un modèle de CLP chez le rat.

Au total…

• rhTM :

– effet cytoprotecteur et anti-inflammatoire

– diminue coagulopathie

– diminue activation PNN

– moins de NETs

– moins de lésions d’organes

=> diminue dérégulation immunothrombose.

CONCLUSIONS

DYSFONCTION VASCULAIRE DU CHOC

SEPTIQUE

CIVD

MPs CD105 MPs CD11a/leuco

Score prédictif, 265 patients BREVET 1

MPs marqueurs


SEPTIQUE

CIVD



Dysfonction endothéliale et coagulopathie

Thrombinoformation/ fibrinolyse


SEPTIQUE

Immunothrombose et CIVD

MPs CD105 MPs CD11a/leuco NEUT-SFL Score de NETose


100 patients BREVET 2

20 patients


MPs CD66/PNN



SEPTIQUE



Immuno-monitoring du

sepsis



20 patients

200 patients



MPs CD66/PNN


SEPTIQUE




sepsis



20 patients

200 patients

Plaquettes et immunothrombose

200 patients



MPs CD66/PNN


SEPTIQUE




NEUT-SFL Score de NETose


sepsis




PCa et cytoprotection

Inhibiteurs et cytoprotection

20 patients

200 patients


200 patients

MPs CD66/PNN


SEPTIQUE






sepsis






rhTM et immunothrombose

20 patients

200 patients


200 patients

RCT mondial : ART-123

MPs CD66/PNN


SEPTIQUE






sepsis







PZ/ZPI : anticoagulant et anti-inflammatoire

20 patients

200 patients


200 patients


MPs CD66/PNN


SEPTIQUE






sepsis







PZ/ZPI : anticoagulant et anti-inflammatoire

20 patients

200 patients


200 patients


MPs CD66/PNN

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