Adriana Sáenz Aponte

Juan Carlos López Núñez Luz Angela Galindo

Glosario G losario de Morfología de Nematodos

Adanal: situado en la proximidad del ano. Adcloacal: sitiado en la proximidad de la cloaca. Anfidios: órganos sensoriales pares localizados en el extremo anterior. Generalmente están situados cerca de los labios. Su tamaño y forma son variables. Anillo nervioso: Anillo de fibras nervio-sas situadas alrededor de la boca, esófago, etc. El anillo nervioso representa la conexión ventral y dorsal de los ganglios laterales. Alas caudales: ver bursa. Anfidelfico: referente a úteros opuestos. Posición y dirección de los úteros, no de los ovarios. Anfimixis: relativo a la unión de 2 game-tos en la reproducción sexual. Opuesto a automixis. Ano: Abertura posterior del tacto digesti-vo. Automixis: autofecundación; ovulo y esperma provenientes del mismo indivi-duo. B Bursa: expansiones cuticulares laterales a modo de alas generalmente situadas en el extremo posterior. C Cálamo: mango o cuello de la espícula. Cefálico: referente al extremo anterior.

Cloaca: en los machos, recinto recubierto por cutícula que recibe los productos del intestino y del tracto reproductor. Conducto excretor: tubo o canal a través del cual son eliminados los productos del sistema excretor. Corpus: extremo anterior del esófago, generalmente de forma cilíndrica pero puede estar dilatado. En algunos grupos el corpus está dividido en procorpus, mesocorpus y metacorpus. Crura: segmentos cuticularizados longitudinales que refuerzan la lamina del gubernáculo. Cuerdas longitudinales: engrosamientos longitudinales de la hipodermis. D Dauer: termino de origen alemán que se refiere al estado de quiescencia que ciertos juveniles adquieren cuando están protegidos por la cutícula del estadio precedente. Denticulo: expansiones dentiformes pequeñas. Ducto espermático: vas deferens. E Epiptigma: expansiones cuticulares situadas en la abertura de la vulva. Esófago: tubo que conecta el estoma o estilete con el intestino. Espermateca: porción agrandada del sistema reproductor femenino que sirve de

Glosario G losario de Morfología de Nematodos

reservorio almacenando esperma del macho. Espículas: órgano intromitente masculi-no que se extruye a través de la cloaca y transfiere el esperma a la hembra durante la Copula. Esticocito: célula del esticosoma.

Esticosoma: series longitudinales de células (esticocitos) que forman las Glándulas esofágicas posteriores. Estilete: estructura hueca delgada y filiforme que cumple función. Estoma: abertura bucal, segmento del tracto digestivo situado entre la abertura oral y el esófago. Estrías longitudinales: a nivel de la cutícula se refiere a los surcos que reco-rren longitudinalmente el cuerpo del nemato-do. F Fasmidios: órganos sensoriales pares de posición postanal. Filiforme: con aspecto o forma de hilo. Fosoria: dientes móviles del queilostoma. G Gametogénico: referente a la reproduc-ción sexual. Glándulas esofágicas: glándulas elonga-das

o simplemente túbulos ramificados localizados en la región esofágica con secreciones de naturaleza enzimática. Gubernáculo: estructura acanalada cuticularizada que se halla presente en los machos y sirve de guía de las espículas. H Hemizonido: comisura nerviosa proveniente del anillo nervioso, que es retráctil cuando se une con el cordón nervioso ventral y cerca del poro excretor. I Infectivo: estadio capaz de penetrar en el hospedero y causar enfermedad en el mismo. Istmo: segmento del esófago que conecta el corpus con el bulbo basal. J Juvenil: estadio inmaduro no adulto. Se aconseja usar este término en lugar de “larva”, para evitar confusión con los estadios inmaduros en insectos. L Lamina: Cuerpo de la espícula, porción principal. Leptodera: Tipo de bursa en la que las alas caudales se encuentran por delante del extremo de la cola del macho. M Manubrio: porción anterior (“cefálica”) y expandida de la espícula. Mesorabdiones: paredes del mesostoma

Glosario G losario de Morfología de Nematodos

Mesostoma: Una de la subdivisiones del prostoma, localizado entre el prostoma y el metastoma. Metacorpus: bulbo medio. Subdivisión posterior del corpus. Metarabdion: paredes del metacorpus. Metastoma: subdivisión posterior del prostoma. Monorquico: que tiene un único testis. Monoxénico: referente a la cría o cultivo de un organismo con la presencia de una úni-ca especie de organismo asociado al mismo.

Mucron: terminación en forma de ma-melon o espina en el extremo caudal. O Ovario: gónada femenina involucrada en la producción de huevos. Oviducto: tubo de pasaje de huevos que conecta el ovario con el útero. Ovíparo: hembra que expulsa huevos que eclosionan al ser eliminados en el exterior. Ovovivíparo: hembra que produce hue-vos que son retenidos e incubados en el útero. Los huevos eclosionan dentro del útero. P Papila: órgano sensorial. Es una expan-sión o

proyección cuticular en forma de pápula o granular. Partenogenético: desarrollo de un individuo proveniente de un huevo no fecundado. Pelodera: tipo de bursa en la que las alas caudales se fusionan por detrás de la cola. Poro excretor: orificio localizado en el lado ventral a través del cual son eliminados los productos del sistema excretor. Postcorpus: subdivisión anterior del esófago, donde se localizan las glándulas esofágicas. Procorpus: subdivisión anterior del cor-pus generalmente de aspecto cilíndrico. Prodelfico: útero paralelo y anteriormen-te dirigido. Prorabdion: pared del prostoma. Prostoma: en nematodos rhabditoides, se refiere a la porción media del estoma, delimitada anteriormente por el queilostoma y posteriormente por el telostoma. Pseudocel: cavidad corporal no limitada por mesodermo. Pseudopelodera: tipo de bursa en la que las alas caudales no se reúnen un poco an-tes

Glosario G losario de Morfología de Nematodos

del extremo caudal. Q Queilorabdion: paredes cuticularizada del queilostoma. Queilostoma: cavidad labial del estoma delimitada anteriormente por la abertura oral y posteriormente por el prostoma. R Rabdion: pared del estoma. Rostro/um: proyección distal de la espí-cula. S Septicemia: condición mórbida que ocu-rre en la cavidad corporal del hospedero que es causada por bacterias patógenas y sus toxinas. Seta: expansión de la cutícula a modo del filamento fino. T Testis: gónada masculina que produce espermatozoos. Telostoma: segmento corto que conecta a modo de válvula la estoma con el esófago.

Trofosoma: modificación intestinal en la cual las paredes y el lumen desaparecen, resultando en un sincicio. U Útero: región del oviducto modificada que

sirve para el desarrollo de los huevos. V Vagina: porción terminal del tracto reproductor femenino que se abre al exterior. Vector: organismo que transmite o disemina organismos patógenos o de otro tipo. Velo: expansión membranosa delicada localizada en la cara interna de la espícula Vulva: abertura genital femenina que esta delimitada en sus márgenes por la cutícula

encontraba en su fase inicial en colaboración con científicos de países desarrollados (Kaya et al 2006). A su vez, la búsqueda a nivel mundial de nuevas especies y aislamientos adaptados a diferentes

condiciones climáticas y hospederos se incrementó significativamente. Como resultado, miles de nuevos aislamientos y muchas nuevas especies se recuperaron y otras en proceso de caracterización e identificación. Condiciones necesarias para ampliar el conocimiento de la biodiversidad y distribución geográfica de tan importantes microorganismos (Stock, 2002).

Actualmente, se cuenta con cerca de 54 especies de NEPs identificados en todo el mundo y muchos otros en proceso de ser descritos, de los cuales nueve están disponibles comercialmente en Estados Unidos, Europa, Australia y Asia. Se conoce que diferentes especies y cepas de nematodos muestran diferencias en la supervivencia, infectividad y reproducción, lo cual los hace más o menos favorables para determinadas

Estatus de la Biodiversidad de Nematodos Entomopatógenos en América Latina

Introducción

Ana Milena Caicedo, Arturo Carabalí, Gerardo A. Torres , Jaime Eduardo Muñoz, Paola Andrea Zuluaga y Mabell Orobio, Miguel Uribe

A comienzos de la década de 1970 se evidenció el interés tanto en investigación como en desarrollo comercial de los nematodos entomopatógenos (Steinernematidae y Heterorhabditidae) y sus bacterias asociadas (Xenorhabdus y Photorhabdus). Este gran interés se generó principalmente por la necesidad de disponer de herramientas efectivas y ambientalmente adecuadas para el control de especies-plaga del suelo (Klein, 1990) y por la facilidad de producir estos microorganismos en forma comercial (Ehlers, 2001). Adicionalmente, el hallazgo de que las bacterias asociadas producían antibióticos y toxinas y que podían servir como modelos para entender las asociaciones simbióticas, generó un mayor interés de entender el complejo nematodo/bacteria (Boemare, 2002).

Este interés científico se concentró principalmente en América del Norte y en Europa Oriental. De igual forma, entre 1980 y 1990, los científicos Australianos realizaron importantes contribuciones en la producción masiva y en el conocimiento de la biología de la bacteria. Mientras que en el resto del mundo, la investigación en este campo apenas se

Contenido del Capítulo

Introducción Avance en el conocimiento de la diversidad y distribución geográfica de NEPs en Latinoamérica

Importancia de la caracterización morfológica y molecular de especies de

Importancia del establecimiento de una red latinoamericana de NEPs

Conclusiones Referencias Bibliográficas

Pág ina 2 Caicedo, A . M. et a l .

NEPs debe priorizarse en nuestra región latinoamericana, sobre lo cual es muy poco lo que se conoce comparado con otros países.

Se pretende ilustrar el avance en el conocimiento de la biodiversidad y distribución geográfica de NEPs en los países latinoamericanos y se enfatiza la importancia de establecer una red de investigadores Latinoamericanos para alcanzar un conocimiento general sobre la diversidad y distribución de las principales especies identificadas y su potencial en la producción de frutas de Latinoamérica.

especies de insectos (Stock, 2002). Además, la plasticidad ecológica de los NEPs les ha permitido adaptarse y resistir condiciones adversas, por lo que se encuentran distribuidos en una amplia variedad de hábitats y tipos de suelo (Adams et al. 2006).

La biodiversidad constituye en la actualidad, la mayor riqueza potencial de los países en vías de desarrollo. Las perspectivas de su explotación adecuada y racional están relacionadas con el conocimiento sobre su uso, lo que es a su vez otra riqueza potencial que debe ser conservada por las culturas locales. Es así como el conocimiento de la biodiversidad y la distribución geográfica de los

Avance en el conocimiento de la diversidad y distribución geográfica de NEPs en Latinoamérica

Diversas especies y numerosas cepas nativas se han descubierto de muchos países, los cuales en su mayor proporción se han recuperado del suelo. Estudios extensivos han utilizado el método del insecto-trampa desarrollado por Bedding & Akhurst (1975), con lo cual se ha demostrado la amplia distribución en todos los continentes a excepción de la Antártida (Hominick et al 1996).

El interés actual de estudiar los Neps no es sólo por su potencial de control biológico sino también para responder preguntas en los campos de la ecología, biodiversidad, evolución, bioquímica, simbiosis y genética molecular (Burnell and Stock, 2000).

Entre las especies que presentan una amplia distribución se tiene a S. carpocapsae y S.feltiae en regiones templadas y H. bacteriophora en regiones continentales y clima mediterráneo, H. indica se encuentra en el trópico y subtrópico. Otras especies

como S. rarum, S. kushidai, S. ritteri y H. argentinensis parecen tener una distribución mucho más restringida, pero a medida que se incrementan los muestreos es posible que se amplíe su distribución (Hazir et al 2003). Asimismo, H. indica se ha encontrado en la región tropical de la India, Sri Lanka, Japón, Norte de Australia, Cuba y el Caribe. Mientras que H. bacteriophora presenta una distribución más amplia en el Sur de Europa, Norte y Sur América, Australia y China. Esta variación en la presencia de NEPs en Europa ha sido documentada por diversos autores, donde los Steinernematidos predominan sobre los Heterorhabditidos (Adams et al. 2006; Kaya et al. 2006).

En Latinoamericana el mayor interés de investigación en NEPs es en el uso de estos como controladores biológicos de importantes especies-plaga. Además, las exploraciones de aislamientos nativos promisorios en esta región por la gran

Pág ina 3 Esta tus de la B iod ivers idad de Nematodos

diversidad en los diferentes países. La mayor parte de Sur América permanece

aún sin explorar para NEPs. De acuerdo a Poinar (1990), el primer reporte sobre el cual una especie podía pertenecer al género Heterorhabditis fue descrita hace mas de 65 años como Rhabditis hambletoni Pereira. Posteriormente, S. glaseri, una especie descrita de Norte América fue recuperada de los huevos de Migdolus fryanus (Westwood) colectada en campo en el estado de São Paulo, Brasil. Nuevas especies descritas de Sur América incluye S. rarum (Doucet, 1986) y S. ritteri Doucet y Doucet (1990), en Argentina y S. scapterisci aislado del grillo Scapteriscus vicinus Scudder colectado en Uruguay (Nguyen y Smart, 1990). La especie H. argentinensis Stock (1993) aislada de Graphognatus sp. en Santa Fé, Argentina.

Actualmente en los 12 países Suramericanos se ha adelantado algún tipo de investigación relacionada con NEPs, entre los que se destaca México, Costa Rica, Honduras, Venezuela, Surinam, Colombia, Ecuador, Brasil, Perú, Bolivia, Argentina y Chile. La cual comprende estudios morfológicos, taxonómicos, biología y ecología, evaluación en laboratorio de cepas nativas y exóticas, recuperación de suelos y estudios preliminares de producción masiva.

A continuación se resume las investigaciones más relevantes desarrolladas en cada uno de los países Latinoamericanos:

En México, a mediados de la década de los 90, los investigadores mostraron gran interés por el desarrollo de los NEPs como controladores biológicos, por lo cual en el año de 1997 promovieron un simposio internacional para promover el uso y aplicación de nematodos entomopatógenos, a través de los avances de investigación, desarrollo

de tecnología y regulación existentes a nivel nacional e internacional con la colaboración de investigadores de tres universidades de Estados Unidos, California, Texas y Florida.

El reconocimiento de NEPs en diferentes estados Mexicanos han permitido la recuperación de aislamientos de las dos familias. Un ejemplo de ello es el aislamiento de S. carpocapsae en Chihuahua México (Poinar, 1990) y H. indica aislado de la región subtropical de la La Sierra, Tabasco, México (Cortez-Madrigal et al., 2003). Heterorhabditis sp. y Steinernema sp. fueron colectados de áreas semidesérticas a una altitud mayor de 2000 m en Zacatecas (Cortez-Madrigal et al., 2003). Heterorhabditis sp. y Steinernema sp. también fueron aislados de 10.9% de suelos de 64 sitios muestreados de maíz, sorgo y pastos en seis estados Mexicanos (Molina–Ochoa et al., 2003), y en Jalisco, México, un Hete-rorhabditis sp. fue aislado de muestras de suelo (Diaz-Mederos et al., 2002). Ruiz-Vega et al. (2003) colectaron S. feltiae y una especie sin identificar de Heterorhabditis de Oaxaca, Mexico.

Salas et al (2001) reportaron la existencia de nematodos entomopatógenos (Steinernematidae y Heterorhabditidae) en agrosistemas del cañon de Juchipila en el estado de Zacatecas. 18 NEPs del género Steinernema y 12 del género Heterorhabditis, inspección que demuestra la gran distribución y diversidad existente en México. En el año 2002, Díaz reporta la presencia de un aislamiento del género Heterorhabditis asociado a larvas del género Phyllophaga en el estado de Jalisco.

En el 2004, Nguyen et al. (2004) describen la nueva especie Mexicana, Heterorhabditis mexicana Nguyen, Shapiro-Ilan, Stuart,McCoy.

En cuanto a la evaluación del potencial de control biológico se destacan los trabajos realizados

Pág ina 4 Caicedo, A . M. et a l .

desarrolladas hasta el momento, se presentan trabajos desarrollados en torno a la caracterización molecular de los aislamientos de NEPs en diferentes regiones de México y es así como Orozco et al (2008) adelantan la caracterización molecular de NEPs mediante la obtención de secuencias de DNAr ITS y LSU para la Identificación de un aislado de NEPs, encontrando que con la región ITS se obtiene un 97% de similaridad con la especie S. carpocapsae y con la región LSU el mayor porcentaje de similaridad es con la especie S. websteri.

En cuanto a la producción in vitro, los investigadores Mexicanos son los que van a la

vanguardia en la evaluación y estandarización de medios para su producción, es así como Vergara et al (2010) presentan los resultados obtenidos del cultivo monoxénico sumergido de l nema todo entomopatógeno, Steinernema carpocapsae CABA01 aislado del estado de Hidalgo, en biorreactor airlift con recirculación interna y utilizando un medio de

cultivo complejo que contiene 10% (volumen/volumen, v/v) aguamiel de agave (Agave spp.), 2% v/v aceite de maíz, 1% (peso/volumen, p/v) yema de huevo deshidratada, 0.5% p/v NaCl y 1% p/v extracto de levadura. Los experimentos comenzaron con aproximadamente 1,000 nematodos en fase infectiva juvenil (IJ) por mililitro (ml) de medio, alcanzando el día 16, 126,882 en fase IJ en fermentación 1, lo cual indica unas condiciones específicas hidrodinámicas y de presencia oxígeno.

Espino et al (2004), evaluaron el uso de lactosuero ácido para la producción en cultivo sumergido de S. feltiae en el estado de Hidalgo, donde se dispone de gran cantidad de este medio,

en laboratorio para diferentes especies-plaga como los trabajos desarrollados por Solano et al 2004, evaluando nueve aislamientos introducidos de NEPs (ocho especies de Steinernema y una de Heterorhabditis) para el control de la mosca del cuerno Haematobia irritans, en condiciones de laboratorio con tres sustratos diferentes, los resultados mostraron que en suelo y estiércol, ocho de los nueve aislamientos causaron mortalidades entre el 22 y 100% sobre las larvas.

Toledo et al (2005) evaluó la susceptibilidad de larvas de Anastrepha obliqua Macquart (Diptera: Tephritidae) a Heterorhabditis bacteriophora (poinar) (rhabditida: heterorhabditidae) en condiciones de laboratorio, los resultados obtenidos permitieron determinar al tercer estadío inicial como más susceptible, pero la infección estuvo muy dependiente del nivel de humedad, a menor humedad menor mortalidad.

Igualmente, evaluaron la patogenicidad de cuatro especies de Steinernema, tres introducidas y la especie S. mexicana y dos especies de Heterorhabditis una introducida y una nativa, sobre larvas de A. ludens. Las especies H. indica, S. mexicana y S. carpocapsae All presentaron los porcentajes de mortalidad entre 75 y 52%.

Aquino et al (2006), evaluaron hongos y nematodos entomopatógenos para el control biológico del picudo negro Scyphophorus interstitialis Gyllenhal importante en el cultivo de agave en el estado de Oaxaca. Los adultos mostraron una mortalidad del 100% con una concentración de S. feltiae y H.bacteriophora de 9000 por ml después de 50 días.

En concordancia con las investigaciones

Durante los años 2007 y 2008 se tomaron muestras en todo el campus de la escuela

agrícola Zamorano en búsqueda de NEPs nativos con

el apoyo financiero de la Cuenta del Milenio,

encontrándose un solo aislamiento del género Heterohabditis spp.

Pág ina 5 Esta tus de la B iod ivers idad de Nematodos

el cual resultó ser mucho más económico que otros medios evaluados y con una producción de NEPs comparable con los mismos.

En Costa Rica se presenta el ejemplo de la colaboración de investigadores internacionales en el desarrollo de la investigación de NEPs en Latinoamérica. Se estableció un programa de investigación con la asesoría internacional de la Dra. Patricia Stock, realizando un reconocimiento sistemático de NEPs durante los años 2003-2004 (Uribe-Lorio et al. 2005), recuperando dos aislamientos de Steinernema y uno de H. indica de muestras de suelo.

Posteriormente se identificaron dos nuevas especies, S. costarricense y S. putavense mediante morfología y caracterización molecular con la región 28S del ADN ribosomal (Uribe-Lorio et al 2007).

En el año de 2009, Powers et al (2009) realizaron un estudio para determinar la diversidad y estratificación vertical de los nematodos en bosques húmedos tropicales de Costa Rica, dentro del cual aislaron seis especies de NEPs, identificadas tres en el género Steinernema, S. puntauvense, S. feltiae y S. websteri y tres especies de Heterorhabditis, H. indica, H. bacteriophora y una especie sin describir Heterorhabditis sp.

Rodríguez et al (2009), también realizaron reconocimiento de NEPs en diferentes zonas y sistemas agrícolas de Costa Rica y evaluaron la patogenicidad de seis aislamientos obtenidos sobre larvas de Phyllophaga elegans (L2 y L3), pero sólo una causó el 60% de mortalidad sobre larvas L2 de P. elegans, aislamiento que fue identificado solamente a nivel de género, Heterorhabdithis sp. de los aislamientos restantes no se especifica a que género pertenecen.

Ferrer et al (2004), evaluaron las posibilidades del uso de NEPs de los géneros Steinernema y Heterorhabditis para el control de Aeneolamia varia en caña de azúcar con mortalidades de 71,35 y 75,4%, en dosis de 50 a 100 millones de nematodos por hectárea, es importante destacar que no se especifica la especie de los nematodos utilizados.

En Honduras el inicio de los trabajos de

recuperación de NEPs es relativamente reciente, Trejo y Funez (2004) evaluaron NEPs

nativos de los dos géneros Steinernema y Heterorhabditis sobre diferentes especies-plaga en condiciones de laboratorio, Phyllophaga spp, Spodoptera sunia, Manduca sexta, Leptophobia aripa e Hypothenemus hampei con la colaboración de los investigadores de Inglaterra y Colombia para manejo y cría. No obstante no se suministró mayor información de la procedencia de las especies nativas ya que la información no se encuentra publicada en revistas indexadas.

Como un primer intento de reconocimiento de NEPs está documentado igualmente en una página de internet de la organización La cuenta del Milenio, es así como mencionan que durante los años 2007 y 2008 se tomaron muestras en todo el campus de la escuela agrícola Zamorano en búsqueda de NEPs nativos con el apoyo financiero de la Cuenta del Milenio, encontrándose un solo aislamiento del género Heterohabditis spp.

Con el desarrollo del proyecto del establecimiento de un laboratorio de control biológico, se inició el programa de producción masiva de diferentes controladores biológicos como Phytoseiulus persimilis (Acari: Phytoseidae), Orius insidiosus (Hemiptera: Anthocoridae), Eretmocerus eremicus (Hymenoptera: Encirtidae) y el NEPs nativo Heterorhabditis sp. (Rhabditida: Heterorhabditidae) entre otros, lo cual

Pág ina 6 Caicedo, A . M. et a l .

un reconocimiento de NEPs durante tres años en 9 provincias y 20 localidades. El resultado fue el hallazgo de siete aislamientos de NEPs de 251 muestras de suelo y 27 cultivos (Rodríguez et al 2011).

Estudios realizados por Pozo et al. (2003) en la Estación Experimental de la Universidad Central, en cultivos de I. batatas, Oriza sativa L., Musa sp. y Sorghum bicolor (L.) Moench, encontraron solo dos muestras positivas en sorgo, perteneciente al género Heterorhabditis, los cuales fueron denominados como CIAP-DEY-6 y CIAP-DEY-7 e igualmente no se conoce la especie.

Es así que de los aislamientos de NEPs encontrados en Cuba sólo se cuenta con la identificación de dos especies, Steinernema cubana (cubanum) (Mracek, Hernández y Boemare), y H. indica (Poinar, Karunakar y David), cepa P2M, reflejándose una vez más el desconocimiento real de la biodiversidad de este importante grupo de microorganismos a pesar de los esfuerzos por su recuperación (Rodríguez et al 2011).

Actualmente, es un reto para los investigadores Cubanos, teniendo en cuenta la aceptación por parte de los productores, el desarrollo del cultivo líquido (por fermentación) de NEPs aprovechando la capacidad instalada y experiencia acumulada en la producción de otros entomopatógenos (Rodríguez et al 2011).

En Colombia, se han realizado reconocimiento sistemáticos de NEPs, actualmente se cuenta con cinco, de los cuales tres de ellos se encuentran bien documentados y publicados en revistas nacionales e internacionales indexadas. Los cuales se realizaron asociados a tres especies de insectos-plaga en diferentes cultivos: Cyrtomenus bergi Froeschner en

constituye un proyecto que pretende contribuir al mejoramiento de la calidad de vida de los agricultores de Honduras (cuenta del milenio-Honduras).

Cuba es uno de los países que mayor trayectoria tiene tanto en producción masiva in vivo como en aplicaciones para el control de especies-plaga. Los NEPs representan eficientes agentes de control biológico de una amplia gama de insectos y su uso está extendido, por su producción y uso, a zonas agrícolas en todo el territorio nacional. Se destaca el hecho de que instituciones cubanas han abordado investigaciones básicas y aplicadas en todas las fases para el desarrollo de un producto a base de NEPs el cual es producido en forma artesanal en los Centro de Reproducción de Entomófagos y Entomopatógenos (CREE) del país, aplicándose en más de 50 municipios. Una de las especies-plaga que se controla efectivamente con las aplicaciones de NEPs es Plutella xylostella en cultivos de Brassica oleracea (Rodriguez et al 2006).

Rodríguez et al (2006), menciona que el conocimiento de la biodiversidad de estos microorganismos en Cuba se inició desde el hallazgo de Montes en el año 1978, de la especie Neoplectana sp. identificada así por Plumas & Hernández sobre larvas del picudo verde azul de los cítricos Pachnaeus litus Germar en la Habana, la cual posteriormente fue identificada como H. heliothidis (Khan, Brook y Hirschmann) por Artega y Mrácek y finalmente identificada como H. indica Poinar, Karunakar y David. Posteriormente, Chang (1988) hace mención de la presencia de nematodos del género Heterorhabditis en larvas de Cylas formicarius Fab. en Ipomoea batatas Lam. en la Habana, pero no se especifica la especie.

En 1994, investigadores del CENSA realizaron

Pág ina 7 Esta tus de la B iod ivers idad de Nematodos

yuca y cebolla (CIAT) (Caicedo & Bellotti 1996) , Hypothenemus hampei en café (López 2001; López 2007) y Tecia solanivora en papa (Univ. Nacional de Colombia Bogotá) (Saenz 1999).

En 2007, López-Núñez y colaboradores, realizaron un reconocimiento en la región cen-tral Andina de Colombia, de las cuales el 92% correspondieron a Steinernema y sólo 7,2% a Heterorhabditis. La caracterización morfológica y molecular permitió establecer que de los cinco aislamientos de Steinernema spp., uno correspondía a la especie S. websteri y cuatro especies aún permanecen sin describir. Posteriormente en el 2008, se reporta la primer nueva especie para Colombia S. colombiense (López et al 2008). Los Heterorhabditis fueron identificados como dos especies sin describir de Heterorhabditis spp. Estos resultados aunque muy limitados a una sola región geográfica sugiere que la biodiversidad de NEPs en Colombia es bastante amplia como en los demás países Latinoamericanos.

A partir del año 2009, se realizó una búsqueda de NEPs asociados a cultivos de chontaduro, Bactris gasipaes en tres veredas del municipio de Buenaventura-Valle del Cauca, los cual permitió la recuperación tanto de cuatro aislamientos de Steinernematidos (Olaya 2008). En el año 2010, se inició la búsqueda de NEPs asociados a guaduales, Guadua angustifolia en el Valle del Cauca y el Quindío, del cual se aisló tres Steinernematidos y un Heterorhabditido, los cuales se encuentran en proceso de caracterización morfológica y molecular. Además, se han evaluado en el manejo de larvas del picudo de los cítricos, Compsus sp.

López (2005) menciona las diferentes investigaciones

realizadas en Colombia como potencial biológico de NEPs, las cuales son las que mayor desarrollo y continuidad presentan en el manejo integrado de la broca del café, las cuales incluyen: búsqueda y selección de aislamientos nativos patogénicos a broca, estudio del comportamiento y estrategias de búsqueda de hospedante realizado por Molina y López durante los años de 2002 y 2003, ciclo de vida de nematodos nativos, evaluación de sistemas de aplicación por Lara y López en el año de 2005 y evaluaciones bajo condiciones de invernadero y de campo en pequeña escala por Giraldo en el 2003 y Lara y colaboradores en 2004. Molina y Lopez (2003) evaluaron el efecto de tween y glicerina en

el aumento de la capacidad de S. feltiae y H. bacteriophora para el control de la broca del café, Hypot-henemus hampei. De igual forma Saenz (1999) y Saenz y Luque (2000a y 2000b) y Saenz (2003) han desarrollado diferentes estudios básicos y aplicados para evaluar el potencial de los aislamientos nativos para el control

de diversas especias-plaga de importancia agrícola en el país.

En Brasil, el primer muestreo sistemático documentado, lo realizó Fowler durante el año de 1987, lo cual permitió la recuperación de 18 aislamientos of S. carpocapsae y 13 aislamientos de Heterorhabditis (Fowler, 1988). Steinernema feltiae también fue recuperada de insectos muertos por NEPs del estado de São Paulo (Fowler y García, 1988).

Posteriormente, Dolinski et al (2008) muestrearon el bosque lluvioso de Monte Negro Rondonia en Brasil, recupendo 19 aislamientos, los

En Brasil, el primer muestreo sistemático documentado, lo realizó Fowler durante el año de 1987, lo cual permitió la

recuperación de 18 aislamientos of S. carpocapsae y 13

aislamientos de Heterorhabditis (Fowler, 1988).

Pág ina 8 Caicedo, A . M. et a l .

H. bacteriophora y H. argentinensis Stock (Stock, 1992, 1993, 1995).

En Perú, una especie de Heterorhabditids adaptada al frio se aisló del picudo de la papa en los andes y mostró un potencial para el control de este insecto (Parsa 2009,). Otro nematodo del género Heterorhabditis se aisló de la región costera. Evidencias moleculares sugieren que ambos Heterorhabditis parecen ser nuevas especies (Kaya et al 2006).

En Ecuador, Hernández et al (2008) realizaron un trabajo de prospección de NEPs en tres provincias productoras de papa y evaluaron la patogenici-dad de los aislamientos, como una alternativa de control biológico de la plaga. De un total de 357 muestras de suelo se encontraron 28 aislamientos de NEPs. de los cuales se evaluaron 11 aislamientos, cuatro aislamientos del género Heterorhabditis y siete

cuales todos resultaron del género Heterorhabditis. Cuatro cepas fueron estudiadas morfológica y molecularmente, las cuales se identificaron como Heterorhabditis indica y Heterorhabditis baujardi.

Recientemente, Barbosa-Negrisoli et al (2010), realizaron un reconocimiento de NEPs en el estado Rio Grande del Sur, quienes procesaron 121 muestras de suelo, de las cuales el 10% resultaron positivas para Steinernematidos y el 6% a Heterorhabditidos. Las especies Steinernema feltiae, S. rarum y S. riobrave fueron aislados por primera vez en Brasil, lo cual muestra la amplia diversidad de NEPs localmente. Steinernema rarum y Heterorhabditis bacteriophora fueron las especies más comúnmente aisladas.

En Argentina, un reconocimiento exhaustivo fue realizado en la región de la Pampa liderando el aislamiento de S. feltiae, S. carpocapsae, S. scapterisci,

Importancia de la caracterización morfológica y molecular de especies de NEPs

Adams et al (2006) resumen la secuencia de la evolución de la taxonomía mediante caracteres morfológicos y moleculares de NEPs a partir de procesos de concertación y estandarización de métodos y técnicas para su desarrollo. A pesar que más de la mitad de las especies actualmente identificadas se describieron desde el año de 1995, fue en la primera conferencia Internacional de EPN en Asilomar, California en 1990, que consideraron que por la confusión y frustración con los cambios en la nomenclatura y la variabilidad se considera la taxonomía de nematodos entomopatógenos como en estado de flujo.

Cinco años después, en la segunda conferencia

internacional en Honolulu, Hawái, con el adveni-miento de las técnicas moleculares y la fertilización cruzada se empezó a incorporar en la descripción de especies, y en ese momento la taxonomía se consideró en un estado de transición. Posteriormente, casi una década después, numerosos eventos lideraron el mejoramiento taxonómico, como la estandarización de criterios para la identificación (Adams y Nguyen, 2002;) y la interpretación de las relaciones filogenéticas en el phylum Nematoda basado en la evidencia molecular (Blaxter et al., 1998); la generación de conceptos teóricos y aplicados de especies (Adams, 2006); y la actualización de la clasificación del phylum Nematoda (De Ley and

Pág ina 9 Esta tus de la B iod ivers idad de Nematodos

Blaxter, 2002). Lo cual conllevó a la sistemática de los EPNs en una fase de estabilidad y crecimiento.

Quizás la contribución más grande a la estabilidad sistemática surgió de la inclusión de las hipótesis en la consideraciones taxonómicas como la de Blaxter et al. (1998) citado por Adams (2006), en el marco de la filogenética molecular para Nematoda quienes consideraron que la familia Heterorhabditidae estaba más relacionada con los Strongylida, un grupo de parásitos vertebrados que comparten el ancestro mas reciente con Pellioditis, un bacterívoro de vida libre. Asímismo, la hipótesis para la familia Steinernematidae como más relacionada con Panagrolaimoidea (nematodos de vida libre y asociados a insectos) y Strongyloididae (parásitos de vertebrados), y como miembro de un grupo grande que incluye de vida libre, fungívoros y parásitos de plantas. Este estudio filogenético soporta la tesis de Poinar (1993) la cual establecía que los heterorhabditidos probablemente provenían de un ancestro de vida libre bacterívoro, mientras que los steinernematidos, de una reconstrucción del hábitat trófico de los ancestros (Blaxter et al., 1998).

Con el incremento del número de especies descritas, las metodologías tradicionales como la morfología comparativa se volvió una herramienta limitada para la identificación o diagnóstico de NEPs. Entre las limitaciones morfológicas se tiene la poca variabilidad morfológica y en especial para grupos que presenten una divergencia reciente o estén muy relacionados como las especies de Heterorhabditis y la mayoría de caracteres utilizados para la identificación de especies son sólo útiles para diagnóstico pero no para análisis filogenéticos, ya que presentan estados plesiomórficos o altamente homoplásicos (Stock, 2002; Stock and Reid, 2003).

La aplicación del concepto biológico de

especies mediante el método de reproducción cruzada con las especies del género Steinernema, el cual está muy cuestionado por lo dispendioso y porque los resultados pueden tener poco significado evolutivo (Adams, 1998). Adicionalmente, el descubrimiento de especies de steinernematidos hermafroditas por Griffin et al. (2001) por lo que se debe tener precaución en considerar la hibridación como un ensayo válido para especies en este grupo.

Por lo tanto, una serie de métodos moleculares se han investigado como potenciales sustitutos o complementos a los métodos tradicionales morfológicos. Técnicas como electroforesis de proteínas son consideradas adecuadas especialmente en la identificación de especies hermanas, pero con poco uso a nivel de género o la separación de organismos a nivel de subespecie (Akhurst, 1987).

El método de polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción (RFLPs) son considerados como una herramienta diagnóstica para la discriminación de especies de Steinernema desde comienzos de la década del 90 y desde entonces han sido utilizados ampliamente para complementar descripciones morfológicas de especies sin caracterizar de Steinernema spp. y también estimar relaciones filogenéticas entre especies de este género como lo documentan diferentes autores (Hominick et al., 1996; Stock et al.,1998).

Amplificaciones polimórficas al azar de ADN (RAPD) también se han utilizado en el diagnóstico y evaluación de relaciones filogenéticas de NEPs. Además, se han utilizado para medir la viariabilidad genética entre aislamientos y especies de Heterorhabditis and Steinernema. Sin embargo su uso no es muy amplio por la baja reproducibilidad del método, el cual se puede afectar por diversos

Pág ina 10 Caicedo, A . M. et a l .

información sobre la sistemática de los NEPs, también es posible generar una cantidad de datos sin ningún valor si no son obtenidos y analizados apropiadamente.

Según Stock y Reid, (2002), es un error pensar en reemplazar la morfología tradicional solo por los métodos moleculares. Programas de investigación han mostrado convincentemente la consideración que las dos herramientas, morfológica y molecular poseen grandes ventajas para el diagnóstico, las cuales continuarán ofreciendo una mejor comprensión de la evolución de los NEPs y un mejor soporte de las descripciones taxonómicas.

factores como la calidad y concentración de ADN y las condiciones de la PCR (Gardner et al., 1994; Liu and Berry, 1996).

Actualmente, el análisis de secuencias es el que ha mostrado ser una herramienta adecuada no solo para el diagnóstico a diferentes niveles taxonómicos sino también para los estudios filogenéticos (Nguyen et al., 2004; Stock et al., 2001). Grenier et al., (1997) mencionan que las secuencias de microsatelites de ADN, también han sido propuestas como herramienta para la identificación de especies de Heterorhabditis y Steinernema a nivel de poblaciones, pero no se han empleado exitosamente.

Es importante anotar que aunque las técni-cas moleculares han generado una cantidad de

Importancia del establecimiento de una red latinoamericana de NEPs De acuerdo al panorama actual de la investigación

y desarrollo de los NEPs en Latinoamérica y con todo el potencial de biodiversidad y uso que se refleja en los trabajos de investigación desarrollados hasta el momento por los diferentes grupos de investigación, se considera necesario establecer una red de investigadores Latinoamericanos especialistas en NEPs para aunar esfuerzos que contribuyan en la superación de las diferentes barreras de conocimiento que se presentan en la temática, especialmente lo que concierne a la identificación morfológica y molecular de especies donde se observa la mayor falencia para conocer el mapa real de biodiversidad de la región y la producción masiva en medio líquido, lo cual contribuirá a la aplicación en campo de una forma sistemática para el manejo de las diferentes especies-plaga evaluadas en laboratorio e invernadero.

La conformación de una red permitirá

obtener beneficios a la región, promoviendo el conocimiento de la biodiversidad y el uso de NEPs en sistemas agrícolas sostenibles y ambientalmente más saludables. La promoción mediante talleres, congresos, entrenamiento tanto de los científicos como de los estudiantes en centros de investigación y universidades permitirá reducir la brecha que nos separa de los países desarrollados.

Además, es importante iniciar un trabajo de promo-ción del estudio de los nematodos entomopatógenos en las universidades a nivel nacional, promover los proyectos colaborativos internacionales en los cuales siempre se involucre el personal científico nacional y se establezcan acuerdos que contribu-yan al intercambio de información, experiencias y material biológico para uso exclusivo en investigación y que se respeten las leyes de la conservación de la biodiversidad tanto a nivel nacional como internacional. De igual manera con

Pág ina 1 1 Esta tus de la B iod ivers idad de Nematodos

esta red se puede iniciar un proceso de visibilización de la información de los países Latinoamericanos como un bloque y no individualmente.

De igual manera, es importante establecer el compromiso de publicar toda la investigación en

revistas indexadas que permitan un mayor impacto del desarrollo en el tema a nivel mundial, puesto que es una de las grandes falencias que se tiene, la información no está disponible en revistas de fácil acceso al público.

Conclusiones El mapa de la biodiversidad de NEPs en

Latinoamérica aún se encuentra en sus fases iniciales, a pesar del incremento de la investigación durante los últimos 15 años, el desconocimiento del tema es considerable.

La falta de políticas que incentiven el desarrollo del tema y el déficit de investigadores y es-pecialistas en el área, como por ejemplo: taxónomos, ha conllevado que la mayor parte de los aislamientos

recuperados se encuentren actualmente identificados sólo a nivel de género.

La escasa colaboración a nivel nacional e internacional y transferencia de tecnología no ha permitido el desarrollo y divulgación de los avances en obtenidos de una forma generalizada, de igual forma la falta de divulgación en revistas nacionales e internacionales de fácil acceso.

Referencias Bibliográficas Adams B. y Nguyen K. 2002. Taxonomy and

Systematics of entomopathogenic nematodes. En: Entomopathogenic nematology. Editado por: Randy Gaugler CAB Publisher. 1-34p.

Adams, B. J., Fodor, A., Klein, M. G. Smith, H. L., Stackenbrandt, E. and Stock, S. P. 2006. Biodiversity and Systematics of Nematode- Bacte-rium Entomopathogens. Biological Control. 37: 32-49.

Adams, B.J., 1998. Species concepts and the evolutionary paradigm in modern nematology. J. Nematol. 30, 1–21.

Akhurst, R.J., 1987. Use of starch gel electro-phoresis in the taxonomy of the genus Heterorhabdi-tis (Nematoda: Heterorhabditidae). Nematologica 33, 1–9.

Aquino B., Ruiz J., Iparraguirre M. 2006. Control biológico del picudo negro (Scyphophorus

interstitialis Gyllenhal) con nemátodos y hongos en-tomopatógenos en agave en Oaxaca, México. UDO Agrícola 6 (1): 92-101.

Artega E, Montes M, Broche R, Chang B. Utilización de Heterorhabditis heliothidis (Heterorhabditidae) contra Pachnaeu litus (Coleoptera, Curculionidae) en Cuba. Cienc. Téc. Agric. Citricos y otros frutales. 1984; 7(2): 79-85.

Barbosa-Negrisoli1 C., Garcia M., Dolinski C., Negrisoli A. Jr., Bernardi D. y dos Santos F. 2010. Survey of Entomopathogenic Nematodes (Rhabditida: Heterorhabditidae, Steinernematidae) in Rio Grande do Sul State, Brazil Artigo Vol. 34(4) 187-196.

Bedding, R.A & Akhurst, R.J. 1975. A simple technique for the detection of insect parasitic rhabditid nematodes in soil. Nematologica. 21:109-110.

Blaxter ML., De Ley P., Garey JR., Liu LX., Scheldeman P., Vierstrete A., Vanflenteren J.R.,

Pág ina 12 Caicedo, A . M. et a l .

vantes-Rios, J., Ibarra-Frias, N. (Eds.), Memorias del XXVI Congreso Nacional de Control Biológi-co. Sociedad Mexicana de Control Biológico, Tex-coco, México, pp. 68–70.

Cuenta del Milenio. 2008. Nematodos Ento-mopátogenos nativos especies encontradas en Za-morano, gracias al Proyecto Control Biológico. Honduras. http://mca.zamorano.edu/noticiasCB/mca-noticias1.pdf Nov. 16 de 2011.

De Ley, P. y Blaxter, M.L. 2002. Systematic position and phylogeny. In: D.L. Lee (Ed.) The Biology of Nematodes. London, Taylor and Fran-cis, pp. 1-30.

Díaz P. 2002. Abundancia y distribución de gallina ciega, hongos y nematodos entomopatóge-nos en los altos de Jalisco México. Tesis MSc. Uni-versidad de Colima 179p.

Díaz P., Najera M.B., Lezama, R., Rebolledo O., Flores H.E., 2002. Hongos (Hyphomycetes) y nematodos (Nematoda: Heterorhabditidae) ento-mopatógenos de gallinas ciegas (Coleoptera: Melo-lonthidae), en los altos de Jalisco, Mexico. In: Baez-Sañudo, R., Juvera-Bracamontes, J.J. (Eds.), Me-morias del XXV Congreso Nacional de Control Biológico. Sociedad Mexicana de Control Biológi-co, Texcoco, Mexico, pp. 236–238.

Dolinski C., Kamitani F., Machado I. y Win-ter C. 2008. Molecular and morphological charac-terization of heterorhabditid entomopathogenic nematodes from the tropical rainforest in Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 103(2): 150-159

Doucet, M.M.A., 1986. A new species of Neoaplectana Steiner, 1929 (Nematoda: Steinerne-matidae) from Cordoba. Argentina Rev. Nematol. 9, 317–323.

Doucet, M.M.A., Doucet, M.E., 1990. Stein-

Mackey LY., Dorris M., Frisse LM., Vida JT. y Thomas WK. 1998. A molecular evolutionary framework for the phylum nematode. Nature 392, 71-75.

Boemare, N., 2002. Biology, taxonomy and systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus. In: Gaugler, R. (Ed.), Entomopathogenic Nematology. CABI Publishing, Wallingford, UK, pp. 35–56.

Burnell, A.M., Stock, S.P., 2000. Heterorhabdi-tis, Steinernema and their bacterial symbionts—lethal pathogens of insects. Nematology 2, 31–42.

Caicedo A.M., Orobio M., Muñoz JE, Torres GA. 2011. Caracterización Morfológica de aisla-mientos nativos de Steinernema spp. de dos localida-des del valle del cauca. Resúmenes Congreso Soco-len 43 Manizales, Colombia. 112p.

Caicedo, A.M., Trujillo, H., Quintero, M.P., Calatayud, P.A. y Bellotti, A.C. 2004. Reconoci-miento de nematodos entomopatógenos asociados a Cyrtomenus bergi en tres localidades de Colom-bia. Abstracts of the XXXI Congreso Sociedad Colombiana de Entomología. Bogotá D:C.

Caicedo, A.M; Bellotti, A.C.1996. Recono-cimiento de nematodos entomopatógenos nativos asociados con Cyrtomenus bergi Froeschner (Hemiptera: Cydnidae) en ocho localidades de Co-lombia. Rev. Colom. Entomología. 22 (1): 19-24.

Chang B. 1988. Reporte de un nematodo del género Heterorhabditis como enemigo natural del Tetuán del boniato Cylas formicarius elegantulus (Coleoptera, Cuculionidae). Cienc. Téc. Agric. Pro-teccion de Plantas. 5(2): 121-122.

Cortez-Madrigal, H., Morales-Salvador, P., Adams, B., 2003. Primer registro en México del nematodo Heterorhabditis indicus Poinar. In: Vazquez- Garcia, M., Perez Dominguez, J.F., Ibarra-Cortes, K., Balpuesta- Leon, C., Vazquez-Reyes, R., Cer-

Pág ina 13 Esta tus de la B iod ivers idad de Nematodos

ernema ritteri n. sp. (Nematoda: Steinernematidae) with a key to the species of the genus. Nematologi-ca36, 257–265

Ehlers, R.-U., 2001. Mass production of en-tomopathogenic nematodes for plant protection. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56, 623–633.

Espino JJ., Rodríguez A. y Chavarría N. 2004.Cinética de producción del nematodo ento-mopatógeno Steinernema felitiae en medio com-plejo formulado con lactosuero ácido. http://www.smbb.com.mx/congresossmbb/puertovallarta03/TRABAJOS/AREA_II/CARTEL/CII-27.pdf nov 16 de 2011.

Fan X., Maggiorani A. y Gudino S. 2000. Uso de nemátodos entomopatógenos como una alternativa en el control de polilla (Tecia solanivora), importante plaga de la papa (Solanum tuberosum). Ponencia en Congreso de Entomología-Mérida-Venezuela. p.115-118

Fan, X.J., Maggiorani, A., Gudino, S., 2000. Uso de nematodos entomopatogenos como una alternativa en el control de polilla (Tecia solanivora), importante plaga de la papa (Solanum tuberosum). Revista Forestal Venezolana 34, 115–118.

Ferrer F., Arias M., Trelles A., Palencia G., Navarro JM. y Colmenarez R. 2004. Posibilidades del uso de nematodos entomopatógenos para el control de Aeneolamia varia en caña de azúcar. Ma-nejo Integrado de Plagas y Agroecología. No. 72 p.39-43.

Fowler, H.G., 1988. Occurrence and infectiv-ity of entomogenous nematodes in mole crickets in Brazil. Int. Rice Res. Newsletter 13 (3), 34–35.

Fowler, H.G., Garcia, C.R., 1988. Nematodes (Rhabditida: Steinernema feltiae) as natural control agents of mole crickets (Orthoptera: Gryllotalpi-dae): Weld and laboratory studies. Revista Bra-

sileira Biol. 48,789–795. Gardner, S.L., Stock, S.P., Kaya, H.K., 1994.

A new species of Heterorhabditis from the Hawaiian islands. J. Parasitol. 80, 100–106.

Grenier, E., Castagnone-Sereno, P., Abad, P., 1997. Satellite DNA sequences as taxonomic markers in nematodes of agronomic interest. Para-sitol. Today 13, 398–401.

Griffin, C.T., O’ Callaghan, K.M., Dix, I., 2001. A self-fertile species of Steinernemafrom In-donesia: further evidence of convergent evolution amongst entomopathogenic nematodes? Parasitol-ogy 122, 181–186.

Griffin, C.T., O’ Callaghan, K.M., Dix, I., 2001. A self-fertile species of Steinernema from In-donesia: further evidence of convergent evolution amongst entomopathogenic nematodes? Parasitol-ogy 122, 181–186.

Hazir, S., Keskin, N., Stock, S.P., Kaya, H.K., Özcan, S., 2003. Diversity and distribution of ento-mopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinerne-matidae and Heterorhabditidae) in Turkey. Biodi-versity Conserv. 12, 375–386.

Hernández P., Alcázar J., Garcés S. y Galle-gos P. 2008. Prospección de nematodos entomo-patógenos para el control de gusano blanco (premnotrypes vorax hustache) (coleoptera: curcullio-nidae) en Ecuador. www.cip.org.ecu. 16 nov. 2011.

Hominick, W.M., Reid, A.P., Bohan, D.A., Briscoe, B.R., 1996. Entomopathogenic nema-todes: biodiversity, geographical distribution, and convention on biological diversity. Biocontrol Sci. Technol. 6, 317–331.

Kaya H., Aguillera M., Alumai A., Choo H., de la Torre M., Fodor A., Ganguly S., HazÂr S., Lakatos T., Pye A., Wilson M., Yamanaka S., Yang

Pág ina 14 Caicedo, A . M. et a l .

ra el control de Hypothenemus hampei Ferrari (Coleoptera: Scotylidae) en frutos de café. Boletin de Sanidad Vegetal de España. Plagas 29, 523–533.

Montes M. 1978. Informe sobre un nemato-do del género Neoaplectana como enemigo natural de las larvas del picudo verde azul Pachnaeus litus (Coleoptera, Curculionidae). Cienc. Téc. Agric. Cítricos y otros frutales. 3 (1): 43-45.

Nguyen, K.B., Shapiro-Ilan, D.I., Stuart, R.J., McCoy, C.W., James, R.R., Adams, B.J., 2004. Het-erorhabditis mexicana n. sp (Rhabditida: Heterorhab-ditidae) from Tamaulipas, Mexico, and morpho-logical studies of the bursa of Heterorhabditis spp. Nematology 6, 231–244.

Nguyen, K.B., Smart Jr., G.C., 1990. Stein-ernema scapterisci n. sp. (Steinernematidae: Nema-toda) and a key to species of the genus Steinernema. J. Nematol. 22, 187–199.

Orozco M., Hueso E., Fallad J., Aquino T., Vargas G., Villalobos A., 2008. Obtención de Se-cuencias de DNAr ITS y LSU para la Identifica-ción de un Aislado de Nematodo Entomopatóge-no Nativo (Rhabditida: Steinernematidae). Avances en la investigación científica en el CUCBA. 155-160p.

Parsa S, Alcazar J, Salazar J y, Kaya H. 2009. An indigenous Peruvian entomopathoge nematode for suppression of the Andean potato weevilnic" . Biological Control v.39 fasc.2 p.171- 178.

Poinar Jr., G.O., 1990. Taxonomy and biol-ogy of Steinernematidae and Heterorhabditidae. In: Gaugler, R., Kaya, H.K. (Eds.), Entomopatho-genic Nematodes in Biological Control. CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 23–60.

Poinar, GO. 1993. Origins and phylogenetic

H., Ehlers R-U. 2006. Status of entomopathogenic nematodes and their symbiotic bacteria from se-lected countries or regions of the world. Biological Control 38 134–155 p.

Klein, M.G., 1990. Efficacy against soil-inhabiting insect pests. In: Gaugler, R., Kaya, H.K. (Eds.), Entomopathogenic Nematodes in Biologi-cal Control. CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 195–214.

Liu, J., Berry, R.E., 1996c. Phylogenetic analysis of the genus Steinernema by morphological characters and randomly ampliWed polymorphic DNA fragments. Fundam. Appl. Nematol. 19, 463–469.

López J.C. 2005. ¿Es posible el uso de ento-monematodos en programas MIP en Colombia?: Avances con la broca del café en Colombia. Even-to: Sociedad Colombiana de Entomología, Memo-rias Socolen 32, Ibagué p.33 - 39.

López N, J.C. 1999. Movilidad y búsqueda de hospedero: Ventajas de un entomopatógeno. Me-morias Seminario Nemátodos Entomopatógenos. Santa Fé de Bogotá. Universidad Nacional. pp. 26-29.

López-Núñez J.C., Plichta, K., Góngora, C. y Stock, S.P. 2008. A new entomopathogenic nema-tode, Steinernema colombiense n. sp. (Nematoda: Stei-nernematidae) from Colombia. Nematology 10: 561-574.

Lopez-Núñez J.C., Cano L. Góngora C.E. y Stock, S.P. 2007. Diversity and evolutionary rela-tionships of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) from the central Andean region of Colombia. Nematology 9: 333-341.

Molina J.P., Lopez, J.C., 2003. Supervivencia y parasitismo de nematodos entomopatógenos pa-

Pág ina 15 Esta tus de la B iod ivers idad de Nematodos

relationships of the entomophilic rhabditis, Het-erorhabditis and Steinernema. Fundamental and Ap-plied Nematology 16 (4): 333-338p.

Powers, T.O., Neher, D.A., Mullin, P. Esquivel, A., Giblin-Davis, R.M., Kanzaki, N., Stock, S. P., Mora, M. M. and Uribe-Lorio, L. 2009. Tropical nematode diversity: vertical stratifi-cation of nematode communities in a Costa Rican humid lowland rainforest. Molecular Ecology 18: 985-996.

Powers, T.O., Neher, D.A., Mullin, P. Esquivel, A., Giblin-Davis, R.M., Kanzaki, N., Stock, S. P., Mora, M. M. and Uribe-Lorio, L. 2009. Tropical nematode diversity: vertical stratifi-cation of nematode communities in a Costa Rican humid lowland rainforest. Molecular Ecology 18: 985-996.

Pozo E, López D, Martínez Y. 2003. Nuevos aislados de nematodos entomopatógenos en la re-gión central de Cuba. Centro Agrícola. No. 4 (30): 94-95.

Reyes M.A. 2003. Patogenicidad de nemato-dos entomopatógenos (Steinernematidae y Hetero-habaditidae) sobre larvas y pupas de mosca de la fruta Anastrepha ludens (Dipera:Tephritidae).Tesis Universidad de Colima México. Pp 129.

Rodríguez D. Torre M. Uribe L. Flores L. 2009. Susceptibilidad de los estadios l2 y l3 de phy-llophaga elenans a una cepa nativa de Heterorhabditis sp. en condiciones de invernadero. Agronomía Costarricense 33(2): 171-182.

Rodríguez M., Gómez L. 2011. Nematodos entomopatógenos: desarrollo histórico y retos para su eficiente explotación como agentes de control biológico en Cuba. Revista protección vegetal vol. 16 en prensa.

Rodríguez M., Sánchez L. García, M. Gómez L. Rodríguez Y., Borrero Y., Martínez M.A. 2006. Desarrollo y uso de nematodos entomopatógenos del género Heterorhabditis para el manejo de plagas en Cuba. En: IV Congreso Internacional de Control Bio-lógico. Mayo 31 a Junio2. Palmira, Colombia. CD Memoria. Pp. 20.

Rosales, A.L.C., Suarez, H.Z., 1998. Nemato-dos entomopatogenos como posibles agentes de control del gorgojo negro del platano Cosmopolites sordidus (Germar, 1824) Coleoptera: Curculioni-dae). Boletin Entomol. Venezolana, Série Mono-graWas 13, 123–140.

Ruiz-Vega, J., Aquino-Bolanos, T, Kaya, H. K. and Stock, S. P. 2003. Colecta y evaluacion de nematodos entomopatogenos para el control de gallinas ciegas, Phyllophaga vetula (Horn) en Oaxaca, Mexico. Folia Entomologica Mexicana 42: 169-175.

Ruiz-Vega, J., Aquino-Bolaños, T., Kaya, H.K.P., Stock, P., 2003. Colecta y evaluación de nemátodos entomopathágenos para el control de gallinas ciegas Phyllophaga vetula (Horn) en Oaxaca, México. Folia Entomol. Mexicana 42, 169–175.

Saenz, A., 1999. Evaluación de procedimien-tos para el aislamiento y almacenamiento del ento-monematodo nativo Steinernema feltiae (Rhabditida: Steinernematidae). Revista Colombiana Entomol. 25 (3–4), 209–215.

Saenz, A., 2003. Efcacia de invasion de Tecia solanivora y Clavipalpus ursinus por el nematodo Stei-nernema feltiae. Manejo Integrado de Plagas y Agroe-cologia 67, 35–43.

Saenz, A., Luque, J.E., 2000a. Ciclo de vida del entomonematodo nativo Steinernema feltiae Filip-jev. Agronomia Colombiana 17 (1–3) 11–16.

Saenz, A., Luque, J.E., 2000b. Cultivo in vivo y método de almacenamiento para juveniles infec-

Pág ina 16 Caicedo, A . M. et a l .

In: Monduzzi (ed.) Proceedings of the International Con-ference on Parasitology, Vancouver, Canada. Pp.1-8

Stock, S.P., 1992. Presence of Steinernema scap-terisci Nguyen et Smart parasitizing the mole cricket Scapteriscus borellii in Argentina. Nematol. Mediter-ranea 20, 163–165.

Stock, S.P., 1993. A new species of the genus Heterorhabditis Poinar, 1975 (Nematoda: Heteror-habditidae) parasitizing Graphognatus sp. larvae (Coleoptera: Curculionidae) from Argentina. Res. Rev. Parasitol. 53, 103–107.

Stock, S.P., 1995. Natural populations of en-tomopathogenic nematodes in the Pampean region of Argentina. Nematropica 25, 143–148.

Stock, S.P., Campbell, J.F., Nadler, S.A., 2001. Phylogeny of Steinernema Travassos, 1927 (Cephalobina: Steinernematidae) inferred from ri-bosomal DNA sequences and morphological char-acters. J. Parasitol. 87, 877–889.

Toledo J., Pérez C., Liedo P. & Ibarra JE. 2005. Susceptibilidad de larvas de Anastrepha obli-qua Macquart (Diptera: Tephritidae) a Heterorhabdi-tis bacteriophora (poinar) (Rhabditida: Heterorhabdi-tidae) en condiciones de laboratorio. Vedalia 12 (1): 11-22

Trejo A y Funez R. 2004. Manual Técnico: Manejo Integrado de la broca del café en Hondu-ras. Tomado de: http://pdf-esma-nual.com/books/25959/nematodos_entomopatogenos.html Nov. 16 de 2011.

Uribe-Lorio, L., Mora, M. and Stock, S. P.

2007. Steinernema costaricense n. sp. and Steinernema puntauvense n.sp. (Rhabditida, Steinernematidae), two new entomopathogenic nematodes from Costa Rica. Systematic Parasitology. 68: 167-172.

tivos de Steinernema feltiae Filipjev (Rhabditida: Stei-nernematidae). Agronomía Colombiana 17 (1–3) 37–42.

Salas M.A. Mejía, JJ., Lara A., Vega HR, Manzanares E. 2001. Nematodos entomopatóge-nos (Rhabditida: Steinernematidae y Heterorhabdi-tidae) en el sur de Zacatecas. Revista de Investiga-ción Científica 1 Vol. 2 (1) 18p.

Salas M.A., González M., Lezama R., Rebo-lledo O y Molina J. 2001. Existencia de nemátodos entomopatógenos (Steinernematidae y Heteror-habditidae) en agrosistemas del cañon de Juchipila Zacatecas, México. 5as Jornadas de Investigación Universidad Autónoma de Zacatecas 25 al 29 de Junio del 2001

Solano R., Almazán C., Armendáriz I. 2004. Estudios preliminares con nematodos entomo-patógenos para el control de la mosca de los cuer-nos Haematobia irritans (Diptera: Muscidae). Vete-rinaria-México 35 (004) UNAM México pp. 339-350.

Stock SP and Reid AP. 2002. Biosystematics of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae): current status and future directions. Nematology. In: Cook R and Hunt DJ. eds. Proceedings of the Fourth International Congress of Nematology, 8-13 June 2002, Tenerife, Spain. Nematology Monographs and Perspectives 2, 435-446, 2003.

Stock SP. 2002. New trends in entomopatho-genic nematode systematics: impact of molecular biology and phylogenetic reconstruction. In: Mon-duzzi. ed. Proceedings of the International Confer-ence on Parasitology. Vancouver, Canada; Pp.1-8.

Stock, S. P. 2002. New Trends in Entomopa-thogenic Nematode Systematics: Impact of Mo-lecular Biology and Phylogenetic Reconstruction.

Pág ina 17 Esta tus de la B iod ivers idad de Nematodos

Uribe-Lorio, L., Mora, M. Stock, S. P. 2005. First Record of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) in Costa Rica. J. Invert. Pathol. 88, 226-231.

Valdés Y. y Mercedes Escobar M. 2006. Sus-ceptibilidad de Hypothenemus hampei Ferrari a las es-pecies de nematodos entomopatógenos Steinernema cubanum, Heterorhabditis indica y Heterorhabditis bacte-riophora. Fitosanidad vol. 10 (3) 25-31.

Vázquez L., Caballero S, Carr A., Gil J., Ar-mas J., Rodríguez A., Becerra M., Rodríguez L., Granda R., Corona T., Fumero M., Peña M., Essen I., Leyva L., Concepción E., Ramos T. y Corbea O. 2010. Diagnóstico de la utilización de entomófagos y entomopatógenos para el control biológico de insectos por los agricultores en cuba. Fitosanidad vol. 14 ( 3), pp. 159-169.

Vergara G., Rodríguez A., Hernández N. 2010. Cultivo Monoxénico Sumergido del Nema-todo Entomopatógeno, Steinernema carpocapsae CA-BA01, en Biorreactor airlift con Recirculación In-terna. BioTecnología, Vol. 14 No. 1 11-24.

Profesor Asistente. M.Sc. Unidad de

Ecología y Sistemática UNESIS.

Departamento de Biología. Pontificia

Universidad Javeriana. Cra 7a No 43-82

Ed 54 (Jesús Emilio Ramirez), Of. 200.

adriana.saenz@javeriana.edu.co.

Heterorhabditis sp. SL0708 como una alternativa para el control de plagas

Introducción

Adriana Saenz Aponte

La incorporación de agentes biológicos para la regulación de insectos

y otros organismos plaga, se hace cada día más urgente como una

respuesta a las restricciones cada vez más estrictas para el uso de

agroquímicos y a las exigencias de calidad en los productos de origen

agrícola, para mercados internacionales y aún para los nacionales. No

menos importantes son las exigencias en lo que tiene que ver con la

protección del medio ambiente y la biodiversidad dentro de la moderna

concepción del desarrollo sostenible.

El uso de hongos, bacterias y virus entomopatógenos ha cobrado

especial vigencia durante las dos últimas décadas y el estudio de los

nematodos entomopatógenos, aunque no alcanza aún igual nivel de uso,

algunos autores como Kaya y Gaugler (1993); Kaya y Stock (1997);

Blaxter et.al (1998); Burnell y Stock (2000); Boemare (2002), lo consideran

prioritario por ser una de las alternativas promisorias de los próximos

años en el control de plagas agrícolas, pecuarias y aún aquellas que afectan

instalaciones industriales.

Los nematodos entomopatógenos que han mostrado más importantes

en el control biológico de plagas corresponden a las familias Steinernematidae y

Heterorhabditidae, cuyos miembros están mutualísticamente asociados

Contenido del Capítulo

Introducción Heterorhabditis sp. SL0708.

Biologia del complejo nematodo/bacteria

Rango de hospederos Interaccion Heterorhabditis sp. sl07087-Photorhabdus sp-hospedero

Comportamiento de heterorhabditis sp sl0708

Aplicación de Heterorhabditis sp SL0708

Consideraciones Finales Referencias Bibliográficas

con bacterias de los géneros Xenorhabdus y Photorhabdus que ocasionan septicemia y otros tipos de afecciones letales en sus

hospederos. Entre las características que hacen de éste un grupo promisorio de controladores biológicos

pueden destacarse las siguientes: Alta virulencia y rápida acción al matar al hospedero, el tercer estado o

juvenil infectivo no se alimenta, está morfológica y fisiológicamente adaptado para sobrevivir por largos

períodos en el suelo en ausencia de su hospedero, tienen un alto potencial reproductivo y muestran

respuesta numérica con respecto al hospedero, pueden criarse masivamente en laboratorio, tienen un

amplio rango de acción, aunque algunos son muy poco específicos, alta resistencia a productos químicos y

a condiciones ambientales adversas, tanto los nematodos entomopatógenos como sus bacterias, son

inocuos para humanos y animales domésticos, no causan ningún daño a las plantas por ser específicos para

á

Heterorhabditis sp. SL0708.

observados, este rango amplio de hospederos puede

incluir algunos insectos benéficos); limitada

tolerancia a condiciones ambientales (por ejemplo,

requerimientos de humedad); tiempo corto de

almacenamiento; pobre persistencia en campo y

altos costos en comparación a los pesticidas químicos

(Kaya. 1993).

insectos, algunas especies se pueden reproducir

sin la presencia del macho, están exentos de

registro para su comercialización en Europa y

Estados Unidos (Klein. 1990; Kaya. 1993; Kaya y

Gaugler. 1993; Georgia y Manweiler. 1994).

Dentro de los atributos negativos está incluido

su amplio rango de hospederos (aunque efectos

negativos en hospederos no blanco no han sido

Heterorhabditis sp. SL0708, es un nematodo

aislado con la técnica de insecto trampa de suelo

de guadua de Alcalá, Valle del Cauca. Heterorhabditis

sp. SL0708 pertenece a la familia Heterorhabditidae,

es un agente importante para el control biológico

de plagas. Vive en el suelo y es capaz de infectar

insectos de los órdenes Díptera, Lepidóptera,

Hemíptera y Coleóptera (Sáenz y López 2011).

Heterorhabditis sp. SL0708 tiene un complejo ciclo

de vida que incluye generaciones hermafroditas y

amfimícticas que ocurren dentro del hospedero

parasitado muchas veces y superponiéndose. Una

característica particular es que guarda una relación

mutualista con un simbionte bacteriano del género

Photorhabdus (Enterobacteriaceae) que alojan en su

intestino. Esta relación le da una ventaja competitiva

al parásito pues mata a su hospedero durante las

primeras 24 a 48 horas después de infección

(Sáenz y López 2011).

El estado infectivo de Heterorhabditis sp.

SL0708 no se alimenta, está morfológica y

fisiológicamente adaptado para la dispersión,

sobrevivir largos periodos en el suelo, buscar e

infectar su hospedero. Este estado es conocido

como juvenil infectivo (JI). Los JI responden al

insecto hospedero en el suelo por quimiotaxis. Los

JI ingresan al insecto a través de aberturas naturales

(boca, ano, espiráculos) o penetran las membranas

intersegmentales del hospedero mediante un diente

en la parte anterior. Una vez en el hemocele del

insecto, los JI liberan sus bacterias simbiontes, las

cuales se multiplican rápidamente secretando toxinas

y enzimas líticas. Estas secreciones son letales para

los insectos que mueren dentro de las 48 horas

(Forst et al. 1997). Las células bacterianas y tejidos

del hospedero proporcionan un medio rico para el

crecimiento y reproducción de Heterorhabditis sp.

SL0708. Los nematodos pueden desarrollar una

generación en Collaria scenica Stal (Hemíptera: Miridae),

Delia platura (Meigen) (Diptera: Anthomyiidae) o

dos generaciones en Galleria mellonella L

(Lepidoptera: Piralydae) y emerger al suelo en dos

semanas.

Biologia del complejo nematodo/bacteria Heterorhabditis sp. SL0708, es un patógeno

obligado en la naturaleza; tiene un estado de vida

libre que no se alimenta, conocido como juvenil

infectivo, juvenil dauer o JI, que infecta los

á

insectos hospederos en el suelo. El

juvenil infectivo es el único estado que se

encuentra fuera del insecto hospedero y

conserva la cutícula del segundo estado

para protección en el ambiente y la

pierden justo antes o después de la

infección del hospedero. Además, la

asociación nematodo-bacteria es

específica. En los juveniles infectivos,

las células bacterianas son llevadas en

el tracto intestinal.

El ciclo de vida de Heterorhabditis sp.

SL0708 dura 19 días a 20oC o 15 días a

25oC. Está compuesto de un ciclo largo

con dos generaciones y ciclo corto con

una generación pero esto depende del

número de JI que inicialmente invade el

hospedero y la disponibilidad de nutrientes

para los estados de desarrollo. Este

nematodo nativo presenta ocho estados

de desarrollo: huevo, cuatro estados

juveniles (J1, J2, J3-JI, J4), separados por

mudas y adultos hermafroditas, machos y

hembras. Todos los estados son

morfológicamente distintos. (Figura 1 y

2).

La sintomatología exhibida por los hospederos

de Heterorhabditis sp. SL0708 es cuerpo flácido y no

putrefacto, coloración roja o vinotinto, característica

presente en infecciones por especies de la familia

Heterorhabditidae (Figura 3). La coloración del

hospedero con Heterorhabditis sp. SL0708 cambia a

medida que pasa el tiempo en aproximadamente 24

horas, algunos pueden permanecer por cuatro a

cinco días con coloraciones anaranjadas y terminar

con coloraciones vinotinto como se observa en la

Figura 1. Estados de desarrollo de la primera generación de

Heterorhabditis sp.SL0708. A. Adulto hermafrodita. B. Desprendimiento

anterior en el proceso de muda de un J4. C. Hermafrodita juvenil

sin desarrollo de la vulva. D. Hermafrodita madura con vulva

desarrollada. (Barras de escala A, C, D=100µm; B=40µm).

El juvenil infectivo ingresa al hospedero a

través de aberturas naturales (boca, espiráculos,

ano) o áreas delgadas de la cutícula del hospedero y

penetra dentro del hemocele del hospedero. Los

juveniles infectivos liberan la bacteria por la boca.

La bacteria mutualista se propaga y produce

sustancias que rápidamente matan el hospedero y

protegen el cadáver de la colonización de otros

microorganismos. Los nematodos inician su

desarrollo, se alimentan de las células bacterianas y

los tejidos del hospedero son metabolizados por la

bacteria. Como los recursos

de alimento en el cadáver del

hospedero son agotados, una

nueva generación de juveniles

infectivos es producida y

emerge desde el cadáver del

hospedero en el suelo para

buscar un nuevo hospedero.

En cuanto a la producción

acumulada de JI, se inicia

después de los 15 días de

infección, recuperando en

promedio 10.414 JI (10.414-

17.784) y con producción

total de 150.000 a 280.000 JI/

larva de G. mellonella hasta el

agotamiento del hospedero,

siendo el quinto y sexto día,

los de mayor recuperación de

á

Figura 2. Estados de desarrollo

de Heterorhabditis sp. SL0708.

A. Desplazamiento del huevo

dentro del útero de hembra no

grávida. B. Huevos maduros

cerca a la abertura de la vulva.

C. Huevos con desarrollo del

J1. D. J1. E. J2. F. J3. G.

Juvenil infectivo conservando

la cutícula del J2. H. Hembra.

I. Macho con bursa expuesta.

(Barras de escala en A=100

µm (figura izquierda), 25µm

(f igura derecha); B-C-

D=40µm; E=10µ; F-G-

H=33µm; I-J=100µm).

á

Las especies de nematodos están asociadas

con una especie específica de bacteria simbiótica, pe-

ro las especies bacterianas pueden estar asociadas

con más de una especie de nematodo. Akhurst y

Boemare (1990) establecen que la mejor reproducción

de nematodos se presenta con su simbionte

natural, pero en algunos casos, los nematodos

pueden desarrollarse con otras especies bacteriales.

La relación entre los nematodos y la bacteria es

mutualista, porque los nematodos son dependientes

de la bacteria, dado que matan rápidamente su

insecto hospedero; crean un ambiente favorable

para su desarrollo por producir antibióticos que

suprimen la competencia de otros microorganismos;

transforman los tejidos del hospedero en una fuente

de alimento y sirve como recurso alimenticio. La

bacteria necesita del nematodo para protegerse del

ambiente externo; penetrar el hemocele del hospedero

e inhibir las proteínas antibacteriales del hospedero.

Photorhabdus sp es una bacteria perteneciente

a la familia Enterobacteriaceae, gran negativa,

facultativa, no forma esporas y son anaeróbicas

(Fischer et al 1999; Burnell y Stock. 2000; Boemare.

2002;; Hazir et. al 2005). Se caracteriza por la

luminiscencia, produce células diferentes conocidas

como forma primaria (fase I) y forma secundaria

(fase II) (Forst y Clarke. 2002). La forma primaria

está asociada naturalmente con los juveniles

infectivos, mientras la forma secundaria surge

espontáneamente cuando los cultivos bacteriales

están en estado estacionario de no crecimiento en

cultivos in vitro. No se ha establecido para Photorhabdus

sp, cambiar de la forma secundaria a primaria.

Las dos formas bacteriales presentan diferencias,

por ejemplo, la forma primaria produce antibióticos,

absorbe ciertos colorantes y desarrolla grandes

inclusiones intracelulares compuestas de cristales

de proteínas; mientras la forma secundaria produce

semanalmente antibióticos o no produce, no

absorbe colorantes y produce ineficientemente

inclusiones intracelulares. La forma primaria es la

que tiene la capacidad de soportar la propagación

de nematodos in vitro (Lysenko y Weiser 1974;

Ehlers et. al. 1990; Aguillera et. al. 1993; Aguillera y

Smart. 1993; Jackson et. al. 1995; Babic et.al. 2000;

Vivas y Goodrich-Blair. 2001; Boemare. 2002;

Martens et. al. 2003).

Figura 3. Cambios de coloración en Galleria mellonella afectadas por Heterorhabditis sp. SL0708.

á

Rango de Hospederos En el laboratorio, la mayoría de las

especies de nematodos entomopatógenos

infectan una variedad de insectos cuando

existe un contacto seguro, las condiciones

ambientales son óptimas y no hay barreras

ecológicas o comportamentales para la

presencia de la infección (Hominick.

2002; Hazir et. al. 2003a, b). En el campo,

los nematodos entomopatógenos atacan

un limitado rango de hospederos más que

en laboratorio. No obstante, son seguros

como agentes de control biológico.

Además, están adaptados al ambiente suelo,

dado que los principales hospederos son

insectos del suelo.

En estudios desarrollados en el

laboratorio de control biológico de la

Pontificia Universidad Javeriana, se ha

podido comprobar alta virulencia de

Heterorhabditis sp. SL0708 en la chinche

de los pastos (Collaria scenica (Naranjo et

al. 2010, Díaz 2011, Fig. 4, 5), la mosca

de la semilla (Delia platura (Celeita y

Sáenz 2011), el picudo de la guayaba

(Conotrachelus psidii Fig. 6), polilla dorso

de diamante (Plutella xylostella, Fig. 7) y

la polilla mayor de las colmenas (Galleria

mellonella), (Sáenz y López 2011).

Interaccion Heterorhabditis sp. sl07087-Photorhabdus sp-hospedero.

Figura 4. Collaria scenica afectada por nematodos entomopatógenos.

Figura 5. Juveniles infectivos de Heterorhabditis sp. SL07087

migrando de cadáveres de Collaraia scenica.

especies de insectos y su estado de desarrollo (Eidt

y Thurston. 1995; Simoes y Rosa. 1996). Uno de

los factores que afecta la eficacia de los juveniles

infectivos, es que la mayoría de los insectos habitantes

Así como la mayoría de especies de nematodos

entomopatógenos tienen un amplio rango de

hospederos, su eficacia varía con muchos factores

biológicos, incluyendo especies y cepas de nematodos,

á

la de Dípteros).

Los juveniles infectivos de Heterorhabditis sp

SL0708 pueden penetrar el insecto usando varias

rutas, dependiendo de cuál es más accesible (Sáenz

y López 2011). En algunos insectos, la ruta usual

de entrada puede ser inaccesible, como la boca, al

estar obstruida por filtros orales y/o, ser angosta

(insectos con partes bucales chupadoras como el

caso de la chinche de los pastos o insectos pequeños

con partes bucales masticadoras como el picudo de

la guyaba). El ano, por ser estrecho por la presencia

de fibras musculares u otras estructuras y los

espiráculos cubiertos con setas (larvas de lepidópteros)

o platos filtradores (larvas de escarabajos) o

simplemente ser angostos para la entrada de los

nematodos (algunos dípteros y lepidópteros).

También pueden penetrar a través de la cutícula

(incluyendo las tráqueas) o el intestino para entrar

al hemocele. Para ingresar a través de la cutícula,

del suelo han desarrollado

comportamientos para reducir su

descubrimiento, fijación o penetración

de los juveniles infectivos. Algunos

de los comportamientos incluyen

una alta tasa de defecación que

reduce la infección por el ano

(larvas de escarabajos) (De Bach.

1964); bajo rendimiento de liberación

de CO2 que minimiza la señal

química (pupas de lepidópteros y

larvas de escarabajos) (Tanada y

Kaya. 1993); formación de cocones

impenetrables o celdas de suelo

antes de la pupación que sirven

como barreras físicas (muchos

lepidópteros y escarabajos); comportamiento

evasor que reduce el contacto con los juveniles

(larvas de escarabajos, larvas que se cuelgan como

Figura 6. Conotrachelus psidii afectada por Heteror-

habditis sp. SL07087

Figura 7. Larva y pupa de Plutella xylostella afectada por Heterorhabdi-

tis sp. SL07087.

á

defensas del insecto, tal es el caso de la especie S.

glaseri, la cual inicialmente es encapsulada por lar-

vas del escarabajo japonés Popillia japonica, pero

ésta escapa de la cápsula e infecta con éxito al

hospedero, ya que la superficie de los nematodos

tiene proteínas que suprimen la respuesta inmune

de su hospedero y destruye las células antibacteriales

del insecto (Wang et. al. 1995; Wang y Gaugler.

1998). Sin embargo, la invasión de los nematodos

puede producir factores inmuno-inhibitorios que

destruyen los factores antibacteriales producidos

por el insecto y permite que la bacteria mutualista

produzca toxinas insecticidas que rápidamente

matan al hospedero (Bowen et. al. 1998). Los

nematodos pueden también producir exotoxinas

paralizantes y enzimas extracelulares proteolíticas y

citotóxicas. Las reacciones anter iores son

dependientes en el insecto hospedero, en el

complejo nematodo-bacteria y contribuyen a la

variabilidad en la eficacia de los nematodos

los nematodos emplean la fuerza física, clavando

su cuerpo para romper y atravesar las delgadas

tráqueas, como Heterorhabditis sp SL0708 que usa

su diente anterior para penetrar directamente el

hemocele. Para entrar a través del intestino, usan

fuerzas físicas y/o secreciones proteolíticas, para

digerir tejidos del intestino medio y acceder al

hemocele (Peters y Ehlers. 1994). Además dentro

del hemocele, la bacteria y los juveniles infectivos

resisten la respuesta inmune del hospedero, que

involucra la interacción de factores humorales y

celulares.

Para contrarrestar las células bacteriales, los

insectos pueden usar proteínas antibacteriales,

seguido de la formación de nódulos e inactivar los

nematodos, para el caso de Heterorhabditis sp

SL0708, no se ha observado con los hospederos

expuestos a este nematodo. Los insectos pueden

encapsular el juvenil infectivo. En algunos casos, el

tercer estado del nematodo puede superar las

Comportamiento de Heterorhabditis sp sl0708 bajo la superficie del suelo, tales como las prepupas

de lepidópteros, hormigas o larvas de escarabajos.

Los juveniles infectivos emboscadores (S. carpocap-

sae y S. scapterisci) se caracterizan por la baja movilidad y

una tendencia a permanecer cerca de la superficie

del suelo. Además, no responden a las señales de

contacto del hospedero al menos que presente una

apropiada secuencia y eficiente movilidad de las

especies hospederas t a l e s como mar iposas ,

saltamontes o gusanos cortadores cerca de la

superficie del suelo. Los juveniles infectivos cruceros

se caracterizan por la alta movilidad y están

distribuidos a través del perfil del suelo; los juveniles

se orientan por sustancias volátiles del hospedero y

lo localizan; infectan hospederos sedentarios como

Uno de los factores limitantes del rango de

hospederos de los nematodos entomopatógenos es

el comportamiento de forrajeo de los juveniles

infectivos. Estos nematodos emplean estrategias

para localizar e infectar al hospedero, dentro de

éstos están los emboscadores (esperan a su hospedero)

o cruceros como Heterorhabditis sp SL0708, H.

bacteriophora (buscan activamente a su hospedero).

La mayoría de las especies de nematodos están

situadas dentro de estos dos comportamientos; sin

embargo, algunas tienen comportamientos

intermedios dentro de estas dos, como S. riobrave o

S. feltiae (Campbell y Gaugler. 1997; Campbell y

kaya. 1999a, b). Estas estrategias intermedias están

adaptadas para infectar insectos que permanecen

á

Aplicación de Heterorhabditis sp

parándose en su cola y tomando una postura recta

o alternando períodos sin movimiento y activo

ondeamiento (Campbell y Kaya. 1999a, b). Los

juveniles cruceros de Heterorhabditis sp SL0708

pueden ondear su cuerpo, pero no pueden pararse

en su cola. Los juveniles que pueden pararse en su

cola y ondear su cuerpo, pueden saltar también.

Este comportamiento de salto puede ser utilizado

para atacar al hospedero o como mecanismo de

dispersión.

prepupas y pupas de coleópteros, d ipteros y

lepidópteros.

Otro comportamiento de los juveniles infectivos

es su típico ondeamiento corporal o nictación,

donde del 30 al 95% de su cuerpo es levantado del

sustrato por unos pocos segundos. La mayoría de

especies de nematodos que tienen una estrategia de

forrajeo emboscador o intermedio pueden ondear

su cuerpo y levantarlo en un 95% del sustrato,

Heterorhabditis sp SL0708 se está aplicando

mediante cadáveres de insectos infectados que se

depositan cerca de focos del picudo de la guayaba y

mediante suspensiones acuosas que son aplicadas con

jeringas dosificadoras y sistemas de aspersión para el

control de Delia platura. Dentro de estos sistemas, la

aspersión representa ventajas comparativas frente a

los demás, debido a que es más económico en grandes

extensiones, demanda menor uso de mano de obra y

ofrece una mejor distribución en el campo y mayor

humedad a los juveniles infectivos.

El método de aplicación al suelo es el más

común para la aplicación de nematodos, la principal

condición que se debe tener con este método es la

humedad del suelo, debido a que esta no puede ser

deficiente ya que los juveniles infectivos son muy

susceptibles a la deshidratación, ni excesiva porque

limita su movimiento. Además, los sistemas de aplicación

deben distribuir homogéneamente los juveniles

infectivos dentro de un cultivo, debido a que esto

influye en su capacidad para controlar las plagas.

En general para elegir un equipo de aspersión

para aplicar Heterorhabditis sp SL0708 debe tenerse en

cuenta las características del área y cultivo en el cual

se va a implementar, como la pendiente, la extensión,

la distancia de siembra y la biología de la plaga,

adicionalmente debe considerarse el costo del equipo,

la frecuencia de aplicación y la velocidad requerida

para tratar el área.

Al seleccionar los equipos de aspersión para la

aplicación de Heterorhabditis sp SL0708 deben

preferirse los equipos más usados en la zona de

interés, de esta manera se evitarán costos adicionales

por la compra de equipos al agricultor y no se

presentará la necesidad de capacitar a los operarios,

pues ya están familiarizados con su manejo.

Adicionalmente, se debe tener en cuenta que los equipos

pueden someterlos a condiciones adversas como:

altas presiones, altas temperaturas, déficit de oxígeno

en tanques y mangueras, lo cual puede causarles

daños físicos, mortalidad, inactividad, susceptibilidad

a los rayos UV y a la desecación, reduciendo su

viabilidad y parasitismo. En este sentido para la

aplicación de Heterorhabditis sp SL0708 en Colombia

deben evaluarse los equipos más comunes y de mayor

uso en los cultivos, dentro de los que se encuentran

equipos de palanca, presión previa retenida,

motorizados de espalda y semiestacionarios.

á

Consideraciones Finales físicos y biológicos los cuales se reflejan en pérdidas

de energía, reducciones de virulencia, viabilidad y

persistencia, entre estos factores los principales

son: la temperatura, la humedad, la aireación, el

pH, la radiación, altas presiones, la disponibilidad

de hospedantes, depredadores, patógenos y

Para la implementación de Heterorhabditis sp

SL0708 como controlador biológico, deben

optimizarse aspectos relacionados con su

producción masiva, aplicación y establecimiento en

campo, debido a que durante estos procesos existen

diversos factores que pueden provocarle daños

Aguillera, M.M; Hodge, N.C; Stall, R.E. 1993.

Bacterial symbionts of Steinernema scapterisci. J. In-

vertebr. Pathol. 62: 68-72.

Aguillera, M.M; Smart, G.C. 1993. Develop-

ment, reproduction and pathogenicity of Stein-

ernema scapterisci in monoxenic culture with differ-

ent species of bacteria. J. Invertebr. Pathol. 62: 289

-294.

Akhurst, R.J; Boemare, N.E. 1990. Biology

and taxonomy of Xenorhabdus. In: Gaugler, R;

Kaya, H.K. Eds. Entomopathogenic Nematodes in

Biological Control. CRC Press. Boca Ratón, FL.

Pp 75-90.

Babic, I; Fischer-Le, S.M; Giraud, E. 2000.

Occurrence of natural dixenic associations be-

tween the symbiont Photorhabdus luminescens and

bacteria related to Ochobactrum spp. In tropical en-

tomopathogenic Heterorhabditis.spp. (Nematode:

Rhabditida). Microbiology 146: 709-718.

Blaxter, M.L; De Ley, P; Garey, J.R. 1998. A

molecular evolutionary framework for the phylum

Nematode. Nature 392:71-78.

Boemare, N. 2002. Biology, taxonomy and

systematic of Photorhabdus and Xenorhabdus. In

Gaugler, R. Ed. Entomopathogenic Nematology.

CABI publishing. Wallingford. UK. Pp 35-56.

Bowen, D; Rocheleau, T.A; Blackburn. M.

1998. Insecticidal toxins from the bacterium Photor-

habdus luminescens. Science 80: 2129-2132.

Burnell, A.M; Stock, S.P. 2000. Heterorhabditis,

Steinernema and their bacterial symbionts – lethal

pathogens of insects. Nematology 2: 1-12.

Campbell, J.F; Gaugler, R. 1997. Inter-

specific variation in entomopathogenic nematode

foraging strategy: Dichotomy or variation along a

continuum?. Fundam. Appl. Nematol. 20: 393-398.

Campbell, J.F; Kaya, H.K. 1999a. How and

why a parasitic nematode jumps? Nature 397: 485-

486.

Campbell, J.F; Kaya, H.K. 1999b. Mecha-

nism, kinematics performance and fitness conse-

quences of jumping behavior in entomopathogenic

nematodes (Steinernema sp). Can. J. Zool. 77: 1-9.

DeBach. O. 1964. Biological Control of in-

sect Pests and Weeds. Reinhold Publishing Corp.

New York.

Diaz, S. 2011. Evaluación de nemátodos en-

tomopatógenos como controladores biológicos de

la chinche de los pastos Collaria scenica l.

(Hemíptera: Miridae). Trabajo de grado. Pontificia

Universidad Javeriana. pp 32.

Ehlers, R.U; Stoessel, S; Wyss, U. 1990. The

influence of the phase variants of Xenorhabdus spp.

and Escherichia coli (Enterobacteriaceae) on the

propagation of entomopathogenic nematodes of

the genera Steinernema and Heterorhabditis. Rev.

nematol. 13: 417-424.

Referencias Bibliográficas

á

Kaya, H.K; Gaugler, R. 1993. Entomopat-

hogenic nematodos. Ann. Rev. Entomol. 38: 181-

206.

Kaya, H.K; Stock, S.P. 1997. Techniques in

insect nematology. In Lacey, L. Ed. Manual of

Techniques in Insect Pathology. Academic Press.

San Diego. CA. Pp 281-324.

Klein, M.G. 1990. Efficacy against soli-

inhabiting insect pests. In: Gaugler, R y Kaya,

H.K. Ed. Entomopathogenic Nematodes in Bio-

logical Control, CRC Press. Boca Raton, FL. Pp.

195-214.

Lysenko, O; Weiser, J. 1974. Bacteria associ-

ated with the nematode Neoaplectana carpocapsae and

the patogenicity of this complex for Galleria mel-

lonella larvae. J. invertebr. Pathol. 24: 332-336.

Martens, E.C; Heungens, K; Goodrich, B.H.

2003. Early colonization events in the mutialistic

association between Steinernema carpocapsae nema-

todes and Xenorhabdus nematophila bacteria. J. Bacte-

riol. 185: 3147-3154.

Naranjo, N.; Villamil, D.; Sáenz, A.A.

2010.Evaluación en invernadero de Steinernema sp.

y Heterorhabditis sp. (Rhabditida: Steinernematidae-

Heterorhabditidae) sobre Collaria scenica

(Hemíptera: Miridae). Resúmenes XXXVII Con-

greso Sociedad Colombiana de Entomología SO-

COLEN. pp 114.

Peters, A; Ehlers, R.U. 1994. Susceptibility of

leatherjackets (Tipula paludosa and T. oleracea: Tipuli-

dae: Nematocera) to the entomopathogenic nema-

tode Steinernema feltiae. J. Invertebr. Pathol. 63: 163-

171.

Sáenz, A.; López, J.C. 2011. Ciclo de vida y

patogencidad del aislamiento nativo Heterorhabditis

sp SL0708 (Rhabditida: Heterorhabditidae). Revis-

ta colombiana de entomología 37(1): 43-47.

Simoes, N; Rosa, J.S. 1996. Pathogenicity and

host specificity of entomopathogenic nematodes.

Eidt, D.C; Thurston, G.S. 1995. Physical de-

terrents to infection by entomopathogenic nema-

todes in wire worms (Coleoptera: Elateridae) and

other soil insects. Can. Entomol. 127: 423-429.

Fischer, L.E; Saux, M; Viallard, V; Borne, B.

1999. Polyphasic classification of the genus Photor-

habdus and proposal of new taxa: P. luminescens

subsp, luminescens subsp. nov, P. luminescens subsp.

akhurstii subsp. nov., P. luminescens subsp laumondii

subsp. nov., P. temperata sp. nov., P. temperate subsp

temperate subsp. nov. and P. asymbiotica sp. nov. In-

ternat. J. Syst. Bacteriol. 49: 1645-1656.

Forst, S.; Dowds, B.; Boemare, N.; Stacke-

brandt, E. 1997. Xenorhabdus and Photorhabdus spp.

Bugs that kill bugs. Annual Review of Microbiol-

ogy 51 47-72.

Forst, S; Clarke, D. 2002. Bacteria-nematode

symbiosis. In Gaugler, R. Ed. Entomopathogenic

Nematology. CABI Publishing, Wallingford. UK.

Pp 57-77.

Georgia, R; Manweiler, S.S. 1994. Entomopa-

thogenic Nematodes: a developing biological con-

trol technology. Agri. Zool. Rev. 6:63-94.

Hazir, S; Stackebrandt, E; Lang. E. 2005.

Two new subspecies of Photorhabdus luminescens, iso-

lated from Heterorhabditis bacteriophora (Nematoda:

Heterorhabditidae): Photorhabdus luminescens subsp

kayaii subsp nov. and Photorhabdus luminescens subsp.

thraciaensis subsp. nov. Appl. Syst Microbiol 40: 895

-910.

Jackson, T.J; Wang, H; Nugent, M.T. 1995.

Isolation of insect pathogenic bacteria. Providencia

rettgeri, from Heterorhabditis.spp. J. Appl. Bacteriol.

78: 237-244.

Kaya, H.K. 1993. Entomogenous and ento-

mopathogenic nematodes in biological control. In:

Evans, K, Trudgill, D.L; Wester, J.M, Eds. Plant

Parasitic Nematodes in Temperate Agriculture

CAB International, Wallingford, UK. Pp 565-591.

á

Biocontrol Sci. Technol. 6: 403-411.

Tanada, Y; Kaya, H.K. 1993. Insect Pathol-

ogy. Academic Press. San Diego, CA. Pp 45-68

Vivas, E.L; Goodrich-Blair, H. 2001. Xenor-

habdus nematophilus as a model for host-bacterium

interactions: is necessary for mutualism with nema-

todes. J. Bacteriol. 183: 4687-4693.

Wang, Y; Campbell. J.F; Gaugler, R. 1995.

Infection of entomopathogenic nematodes Stein-

ernema glaseri and Heterorhabditis bacteriophora against

Popillia japonica (Coleoptera: Scarabaeidae) larvae. J.

Invertebr. Pathol. 66: 178-184.

Wang, Y; Gaugler, R. 1998. Steinernema glaseri

surface coat protein supresses the immune re-

sponse of Popillia japonica (Coleoptera: Scarabaei-

dae) larvae. Biol. Control 14: 45-50.

Los nemátodos son organismos morfológica, genética y ecológicamente

diversos, representan cerca del 80% de los animales en la tierra, lo que los

convierte en el grupo animal más abundante en cuanto a número de individuos

(Poinar, 1983; Parkinson et al. 2004; Coghlan, 2005). Su gran abundancia

se debe a su habilidad de adaptación, así como a su tamaño pequeño, cutícula

resistente y a la capacidad de adquirir pequeños cambios en su plano

corporal, permitiéndoles invadir diversos hábitats y parasitar plantas,

vertebrados, insectos e incluso otros nemátodos (Blaxter, 2003; Coghlan,

2005).

Los nemátodos parásitos de insectos o nemátodos entomopatógenos

(NEPs), se conocen desde el siglo XVII. En la década de 1930 se puso

mayor interés en ellos por su capacidad para el control biológico y fue a

principios de los 80 que los NEPs de las familias Steinernematidae y

Heterorhabditidae se consideraron como agentes biocontroladores de

gran importancia (Smart, 1995; Reyes y De la Torre, 2005). Los NEPs

son letales para muchas plagas de plantas con importancia agronómica y

presentan la ventaja de no ser perjudiciales para plantas y vertebrados

(Poinar, 1975; Smart, 1995; Burnell y Stock, 2000). Muchos de estos

nemátodos tienen la particularidad de ser parásitos obligados de insectos

Implementación de técnicas moleculares para la identificación de nematodos entomopatógenos

Introducción

Introducción Uso de técnicas moleculares

El laboratorio de genética

molecular

Protocolos

Resultados esperados

Conclusiones Agradecimientos

Referencias bibliográficas

Contenido del Capítulo

Mitzi Flores-Ponce1 y Rafael Montiel2

(Burnell y Stock, 2000; Shapiro-Ilan y Gaugler, 2002).

Existen varios géneros de nemátodos parásitos de insectos, sin embargo las especies más importantes

para el control biológico se concentran en las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae (Poinar,

1979; Smart, 1995; Burnell y Stock, 2000). Estos nemátodos poseen varias cualidades atractivas, que incluyen:

su persistencia y viabilidad en el suelo debido a una etapa infectiva de resistencia; poseen la habilidad de

buscar activamente a su hospedero; no contaminan, por lo que son seguros para el ambiente y no causan

una mortandad indiscriminada; presentan cierta especificidad hacia insectos, lo que los hace seguros e ino-

cuos para el usuario, otros animales y medio ambiente; tienen un rango extenso de hospederos por lo que

pueden controlar una gran variedad de plagas de importancia agrícola; actúan en un rango amplio de tem-

1y2 Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad, CINVESTAV-IPN. Km. 9.6 Libramiento Norte Carretera Irapuato – León. Irapuato, Guanajuato, México.

E-mail: montiel@langebio.cinvestav.mx

peraturas; son de fácil aplicación y se encuentran

disponibles a nivel comercial, por su habilidad de

crecer en medio artificial, lo que permite su

producción en masa (Smart, 1995; Shapiro-Ilan y

Gaugler, 2002; Rodríguez Solano et al. 2004; Reyes

y De la Torre, 2005).

La familia Heterorhabditidae (Nematoda:

Rhabditida), contiene al género Heterorhabditis.

Mientras que la familia Steinernematidae

(Nematoda: Rhabditida) contiene los géneros

Steinernema y Neosteinernema, este último contiene

sólo a la especie N. longicurvicauda, la cual parasita

termitas (Reticulitermes flavipes) (Smart, 1995). De

acuerdo con un estudio realizado y con la base

de datos Taxonomy del NCBI, se han descrito y

registrado 63 especies del género Steinernema y 18

especies de Heterorhabditis (Smart, 1995; Sayers et al.

2009). Ambos géneros, Steinernema y Heterorhabditis,

á

presentan una relación simbiótica con enterobacterias

gram negativas de los géneros Xenorhabdus y Photorhabdus,

respectivamente (Burnell y Stock, 2000; Gouge y

Snyder, 2006). Ya que la bacteria es incapaz de

entrar en el insecto hospedero por sí sola y el

nemátodo sólo alcanza su crecimiento óptimo

cuando la bacteria está presente, esta relación

simbiótica es forética y mutualista al mismo tiempo

(Georgis y Poinar Jr, 1994; Griffin et al. 2005). Esta

relación simbiótica es altamente específica lo cual

hace que los NEPs constituyan modelos muy

complejos (Shapiro-Ilan y Gaugler, 2002; Carrero y

Planes, 2008). Especies del genero Steinernema se

asocian con una sola especie de Xenorhabdus y

muestran diferencias en rango de hospedero, infectividad,

tolerancia al ambiente y facilidad de producción

para su comercialización (Burnell y Stock, 2000;

Shapiro-Ilan y Gaugler, 2002).

Uso de técnicas moleculares en la identificación Inicialmente, la identificación específica de

los nemátodos entomopatogénicos y desde luego

la identificación de nuevas especies, se basó

primordialmente en el análisis de caracteres

morfológicos. Sin embargo, la fiabilidad de las

determinaciones específicas a nivel morfológico

depende en gran medida de la experiencia de la

persona que realiza el análisis, de tal forma que

solo unos cuantos expertos en el mundo están

plenamente reconocidos para llevar a cabo dichas

identificaciones. Sin embargo, el advenimiento de

las técnicas moleculares ha provisto de nuevas

herramientas en este ámbito, junto con la esperanza

de hacer más asequible la identificación específica

de forma reproducible, de tal suerte que un

estudiante, con la debida formación, pueda llevar a

cabo esta tarea de manera fiable.

Es en este concepto que se basa la ahora

popular técnica del código de barras del DNA

(Hebert et al. 2003), que consiste en la caracterización

de un fragmento específico de DNA mitocondrial

de las especies animales para su posterior uso en la

identificación de especies e incluso para la identificación

de especies nuevas (Hajibabaei et al. 2007). En

general, diversos estudios han demostrado que el

código de barras del DNA puede resolver la

mayoría de las especies, aunque algunos taxones se

han mostrado intratables, debido entre otras

dificultades a la existencia de especies crípticas

(Waugh, 2007). Otro de los principales problemas

puede ser la escasa variación de la secuencia

comúnmente encontrada entre especies cercanas,

además de su completa inutilidad en estudios

poblacionales. Por este y otros motivos, esta técnica

ha recibido severas críticas (p.ej. Rubinoff et al.

2006). Sin embargo, en los últimos años este método

ha sido cada vez más utilizado y las ventajas y

limitaciones se han identificado con claridad a

medida que se ha incrementado el número de

organismos estudiados (Frézal y Leblois, 2008). A

pesar de todo, su uso en la identificación de

nemátodos entomopatogénicos ha sido prácticamente

inexistente, lo que limita su aplicación en esta área.

En cualquier caso, lo importante de la técnica del

código de barras del DNA es que

muestra la eficacia que pueden tener

los métodos moleculares en la

identificación y que en el peor de los

casos serán muy buenos complementos

de los estudios morfológicos. Por

otra parte, también es posible percibir

que los métodos de identificación

molecular serán más potentes en la

medida en la que se cuente con más

información de las especies de interés. Así, en el

caso de los nemátodos entomopatógenos, actualmente

hay información suficiente de una variedad de loci

del DNA que pueden ser útiles para este fin y que

efectivamente están siendo utilizados en la identificación.

Estos loci inicialmente atrajeron interés por su

potencial en la resolución de la filogenia de estas

especies.

Los esfuerzos iniciales incluyeron el análisis

mediante PCR-RFLP de regiones del espaciador

interno transcrito (ITS, por sus siglas en inglés) del

DNA ribosomal (Reid, 1994; Reid et al. 1997).

Otras aproximaciones incluyeron combinaciones

de DNA polimórfico amplificado de manera

áó é

aleatoria (RAPD, por sus siglas en inglés) y datos

morfológicos (Liu y Berry, 1996). Posteriormente y

por primera vez a nivel de secuenciación de DNA,

se utilizó el gene de la subunidad menor ribosomal

(SSU, por sus siglas en inglés; también conocido

como 18S) para resolver la filogenia dentro y entre

los géneros Steinernema y Heterorhabditis (Liu et al.

1997). Más tarde se utilizaron genes nucleares y

mitocondriales (Szalanski et al. 2000) incluyendo la

subunidad mayor del DNA ribosomal (LSU, también

conocido como 28S) (Stock et al. 2001; Adams et al.

2007), el ITS (Adams et al. 1998; Nguyen et al.

2001; Spiridonov et al. 2004), la

subunidad 4 de la NADH

deshidrogenasa mitocondrial

(ND4) (Liu et al. 1999) y el gene de

la citocromo oxidasa I (COI)

(Blouin, 2002).

Algunos de estos genes son evolutivamente

conservados, como los genes

ribosomales (SSU, LSU) y algunos

otros presentan una variación

mayor, como el ITS, pasando por genes que

presentan variaciones intermedias, como los

mitocondriales (NAD4, COI). Esto hace que se

puedan obtener resultados contradictorios en

análisis filogenéticos cuando se comparan las

filogenias resultantes de los distintos genes utilizados

(Blouin, 2002; Nadler et al. 2006a), pero también

representa una oportunidad de contar con

herramientas útiles para distintos fines. Los genes

conservados serían más útiles para la resolución de

conflictos en las zonas basales de las filogenias,

aún siendo útiles para la diferenciación de muchas

especies (p.ej. De Ley et al. 1999; He et al. 2005) y

los menos conservados servirían para estudios de

Los genes conservados serían más útiles para la resolución de conflictos en las zonas

basales de las filogenias, aún siendo útiles para la

diferenciación de muchas especies

variabilidad poblacional (Spiridonov et al. 2004). A

primera vista, para la identificación de nemátodos

serían más útiles los genes conservados, sin embargo

debemos considerar el problema de las especies

crípticas, que presentarán una misma secuencia en

genes conservados a pesar de ser especies distintas

(Waugh, 2007), lo que nos llevaría a una identificación

errónea. El caso contrario lo representa el uso de

genes de secuencia muy variable (o métodos como

RAPD), que resultarían en secuencias distintas (o

patrones de RAPD distintos) entre especímenes de

la misma especie (Adams et al. 1998; Spiridonov et

al. 2004), lo que nos podría llevar a concluir, de

forma equivocada, que estamos en presencia de

dos especies distintas. Bajo esta luz, parece claro

que un análisis multi-locus será siempre más fiable,

sobre todo si los datos moleculares pueden

combinarse con datos morfológicos (Nadler et al.

á

2006b).

Por otra parte, también hay que considerar,

en la elección de los fragmentos de DNA a analizar,

la información existente de las especies bajo estudio.

Como hemos visto, en el caso de los nemátodos

entomopatógenos existe información para un

número de genes, por lo que actualmente podemos

considerar que contamos con buenas herramientas

para la aplicación de las técnicas moleculares en la

identificación de estas especies, adoptando un marco

filogenético robusto para evaluar la fiabilidad de la

identificación. Esto se logra realizando análisis

filogenéticos con la información disponible en las

bases de datos, en los que se incluye las secuencias

que determinemos de los especímenes en cuestión,

lo que nos dará un mejor panorama de dónde se

sitúan nuestros especímenes en la filogenia.

El laboratorio de genética molecular La implementación de un laboratorio de

genética molecular para conducir experimentos de

identificación de nemátodos es una tarea relativamente

sencilla, pero requiere cierta planeación para garantizar

el rigor y calidad de los resultados, así como un

presupuesto adecuado. Actualmente hay una gran

variedad de equipos de distintas capacidades y

precios, por lo que un buen laboratorio no tiene

porque ser necesariamente muy costoso, en

función de los objetivos que se pretendan. La

identificación molecular de nemátodos es un

proceso de relativa baja complejidad y no requiere

equipos con especificaciones muy altas, por lo que

de una forma sencilla se puede montar un buen

laboratorio que garantice los mejores resultados.

Uno de los principales problemas al trabajar

con DNA y específicamente con DNA amplificado

mediante la técnica de PCR, es la contaminación

cruzada, por lo que conviene diseñar el laboratorio

de tal forma que nos permita separar las áreas de

trabajo, idealmente en torno a las siguientes

actividades: 1) extracción de DNA; 2) amplificación

por PCR; 3) electroforesis de DNA y procedimentos

post-PCR (adicionalmente podría ser necesario

secuenciar el DNA, sin embargo, para la secuenciación

lo más recomendable es recurrir a un servicio

especializado, pues actualmente los precios de

secuenciación son muy asequibles y por otra parte,

no es recomendable realizar la inversión en aparatos

de secuenciación a menos que se les vaya a dar un

uso verdaderamente intensivo); y 4) el análisis de

datos. Veamos a continuación las características

esenciales de cada una de estas áreas de trabajo:

1) Extracción de DNA: La extracción de

DNA consiste en separar esta biomolécula del

resto de componentes celulares de los organismos.

Los pasos pueden incluir la destrucción física de

los tejidos, la digestión de proteínas, la separación

del DNA de los restos proteicos y la purificación y

concentración del DNA (Sambrook y Russell,

2001). Se requiere una mesa de trabajo de laboratorio;

una campana de extracción de humos (muchos de

los protocolos requieren trabajo con sustancias

tóxicas) y equipo estándar de biología molecular,

que incluye microcentrífuga (idealmente refrigerada),

baños o placas termostáticas, vórtex, micropipetas

de varios calibres, refrigerador y congelador. En la

sección siguiente (Protocolos) se provee una lista

del equipo, material y reactivos, que puede servir

de guía sobre el equipo mínimo que se requiere en

cada etapa del análisis. Además, será necesario

considerar también el material y equipo para

procesar las muestras antes de la extracción del

DNA, como sonicadores, morteros, molinillos

motorizados, etc.

2) Amplificación del DNA: El PCR es un

método que permite obtener billones de copias de

un fragmento de DNA, a través de un proceso

iterativo de copiado, llamado amplificación, en el

que el número de copias se incrementa

exponencialmente en cada ciclo de replicación

(Figura 1). Es un método específico que hace posible

amplificar un determinado fragmento que

inicialmente puede estar purificado o que puede

ser parte de una mezcla compleja de materiales

biológicos (Mullis y Faloona, 1987). Para su

funcionamiento se vale de los principios básicos de

la termodinámica y de las propiedades químicas de

la molécula del DNA, como su conformación en

doble cadena con apareamiento específico de

bases. Requiere para su funcionamiento, una DNA

áó é

polimerasa termoestable, cebadores o primers para

iniciar el copiado específico, nucleótidos (dTNPs),

cloruro de magnesio y DNA molde o templado (el

DNA que se pretende amplificar) (Saiki et al. 1988).

Uno de los problemas más graves del PCR es

la contaminación cruzada entre las muestras, ya

que puede confundir el análisis e invalidar los

resultados. Esto se debe a que durante el PCR se

producen billones de copias específicas del

fragmento amplificado (estas copias son llamadas

amplicones), de tal forma que una partícula de

aerosol, que pude ser generada al abrir un tubo o al

pipetear, puede contener miles de amplicones. Si

una de estas partículas de aerosol termina en los

reactivos, o en las pipetas que se utilizarán para

extraer el DNA, puede contaminar severamente

los experimentos y producir resultados erróneos.

Para ilustrar el potencial de contaminación que

tienen los amplicones, Kwow y Higuchi (1989) han

hecho notar que una reacción de PCR puede generar

1012 copias de un fragmento de DNA en 100 µl y

si fuese posible diluirlos uniformemente en una

piscina olímpica, una alícuota de 100 µl de líquido

de la piscina contendría 400 moléculas amplificables.

Más aún, la décima parte de un microlitro de una

reacción de PCR, transportada en una punta de

pipeta, podría contener 109 copias de la secuencia

amplificada (Kwok y Higuchi, 1989) y un picolitro

(10-6 µl) podría contener 10,000 moléculas (Walder

et al. 1993). La transferencia de los amplicones

contaminantes de un sitio a otro puede darse

también a través de la piel, el pelo y la ropa de los

investigadores (Kitchin et al. 1990; Rys y Persing,

1993), por lo que también es adecuado tomar

precauciones en este sentido.

á

Figura 1. Representación esquemática de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los fragmentos largos se acumulan siguiendo una producción lineal, en tanto que los fragmentos de tamaño específico son producidos exponencialmente (Tomado de Montiel, 2001).

Las condiciones recomendadas para el manejo

de las muestras son similares a las que usan los

microbiólogos para el manejo y cultivo de

microorganismos (Kwok y Higuchi, 1989; Cimino

et al. 1990) o incluso más extremas (Kitchin et al.

1990), e incluyen:

Separación física de las áreas de preparación

de PCR y de las áreas donde se almacenan y

manipulan los productos, incluyendo la separación

de material, equipo y batas.

Autoclavado de las soluciones y de los

tubos. Esto es útil hasta cierto punto, pues

fragmentos pequeños de DNA pueden permanecer

intactos, sobre todo si se utiliza una temperatura

baja.

Alicuotar los reactivos, lo que reduce el riesgo

de contaminar las soluciones “stock” y permite

eliminar poco material si existe contaminación.

Utilizar guantes, cambiándolos frecuente-

mente, pues podrían facilitar el transporte de

amplicones. Evitar exponer otras superficies de la

piel cuando se prepara una reacción, utilizando

batas y mascarillas quirúrgicas o caretas de plástico

transparente.

Evitar las salpicaduras al abrir los tubos, ya

que pueden escapar aerosoles cargados con una

gran cantidad de copias.

Usar pipetas de desplazamiento positivo o

puntas con filtro capaces de retener aerosoles.

Premezclar los reactivos para minimizar el

número de veces que se requiere abrir los tubos y

el número de veces que se introducen las pipetas

en los reactivos. Esto tiene además la ventaja de

que se reduce el error de pipeteo, que se presenta

con cantidades inferiores a 1 µl.

áó é

El DNA que se quiere amplificar debe

añadirse al final, después de que se han puesto en

el tubo todos los reactivos.

Escoger adecuadamente los controles

positivos y negativos. El DNA para el control

positivo no debe estar muy concentrado. Si se

procesan muchas muestras, es recomendable

incluir más de un control negativo.

También, debe tenerse precaución con los

equipos que se utilizan para el análisis de los

amplicones. Las cubetas de electroforesis, las

superficies de los transiluminadores, las centrífugas

o los baños, pueden representar una fuente muy

importante de contaminación y la mayoría de estos

objetos pueden limpiarse si es necesario con HCl 1

M (Kwok y Higuchi, 1989), aunque lo más

importante es ser consciente de su potencial

contaminante.

Además, algunos autores (Rys y Persing,

1993; Espy et al. 1993) recomiendan el uso de

por lo menos un sistema adicional de esterilización

como la irradiación de los reactivos con luz UV.

El equipo necesario incluye una campana de

flujo laminar, un termociclador, una minicentrífuga,

refrigerador, congelador y un juego de micropipetas,

todo ello en un área de pre-PCR, separada del área

de extracción y del área de electroforesis. Una lista

más detallada de equipo, material y reactivos puede

encontrarse en la sección siguiente.

3) Electroforesis de DNA: La electroforesis

en gel de agarosa es una técnica simple y rápida,

que permite separar, identificar y purificar

fragmentos de DNA (Sambrook y Russell, 2001).

La elección de las medidas del gel depende del

tamaño de los fragmentos de DNA que se quiere

Los siguientes protocolos fueron diseñados

para realizar una práctica de un día en el marco del

Primer Taller Internacional de Nematodos

Entomopatógenos “Retos del Uso de Nematodos

Entomopatógenos en Latinoamérica para la

Sustentabilidad Agroalimentaria en el marco del

Cambio Climático”. Como tal, se han buscado

métodos sencillos y rápidos con la idea fundamental

de ilustrar los procedimientos utilizados en la

identificación molecular de nemátodos entomopatogénicos

y su implementación. No pretenden ser exhausti-

vos y no abarcan todas las posibilidades existentes,

por lo que deben ser considerados como una guía

inicial para el desarrollo de estas estrategias. La

práctica incluye la extracción de DNA y la

amplificación de fragmentos de dos genes

ribosomales comúnmente utilizados en la identificación

de nemátodos, el 18S y el 28S, así como la amplificación

con dos primers de RAPD, que nos ayudarán a

observar los problemas y virtudes de la técnica.

Debido al escaso tiempo disponible para la práctica,

no se realizará la purificación y secuenciación de

los genes ribosomales, como sería necesario para

completar el proceso de identificación; sin embargo,

en caso de interés, estos pasos pueden ser desarrollados

posteriormente. Por otra parte, dentro de la práctica se

separar. En general, los fragmentos pequeños se

separan bien en recorridos cortos (geles pequeños)

en tanto que fragmentos de mayor tamaño, requieren

recorridos más largos (geles grandes). Esta separación

corre generalmente de manera horizontal en un

campo eléctrico de flujo constante y en una dirección

(el DNA tiene carga neta negativa, por lo que

migrará hacia el polo positivo del campo eléctrico).

El trabajo en esta área es el que presenta el mayor

riesgo de contaminar los reactivos de extracción de

DNA y PCR, por lo que debe estar debidamente

separada de las otras áreas de trabajo, ya sea físicamente

o por lo menos logísticamente, con una mesa

dedicada exclusivamente a este tipo de análisis,

incluyendo el material y el equipo necesarios. El

trabajo en esta área y las manipulaciones posteriores

se consideran procedimientos post-PCR, por lo

que deberían ubicarse en un área que podría

etiquetarse con este nombre, zona de post-PCR. Se

requieren cubetas de electroforesis, fuentes de

á

poder para generar el campo eléctrico y un juego

de micropipetas. Una lista más detallada de equipo,

material y reactivos puede encontrarse en la

sección siguiente.

Otros procedimientos post-PCR, útiles en la

identificación molecular de especies, incluyen

digestión de los amplicones con enzimas de

restricción, o bien, la purificación de los productos

de PCR para envío a secuenciación. Para estos

procesos se requieren baños o bloques termostáticos,

microcentrífugas y pipetas.

4) Análisis de datos: Se requiere un espacio

de trabajo adecuado para acomodar por lo menos

una computadora y conexión a internet. Muchos

de los programas que se utilizan actualmente para

el análisis trabajan accediendo a bases de datos en

línea. Existe una amplia gama de programas para el

análisis de secuencias de DNA. Como punto de

inicio se recomiendan los siguientes programas:

BioEdit (Hall, 1999) para manipulación de secuen-

Protocolos

incluye una demostración del análisis bioinformático

de secuencias, para ilustrar esta parte importante

del proceso de identificación.

I. Extracción de DNA de Nemátodos

Objetivo: Extraer DNA de nemátodos para

amplificación por PCR. El protocolo está diseñado

para funcionar desde un nemátodo, útil para analizar

variabilidad poblacional, o variabilidad de especies

en aislados crudos (potencialmente con más de una

especie), hasta 5 nemátodos, cuando se quiere

tener más cantidad de DNA para más reacciones

de PCR y cuando el aislado está purificado

(contiene una sola especie).

Equipo y Material:

- Microcentrifuga para tubos tipo eppendorf 1.5 ml

(idealmente refrigerada)

- Termobloc para tubos tipo eppendorf de 1.5 ml

(se puede substituir por baño termostático, en este

caso se requieren flotadores para tubos eppendorf

de 1.5 ml).

- Micropipetas de: 0.5 -2 µl, 2 - 20 µl y 1 ml

- Puntas para micropipeta blancas, amarillas y

azules (compatibles con marca de micropipetas),

estériles o esterilizadas por autoclave

- Receptáculos para puntas y tubos de desecho

- Microtubos tipo eppendorf de 1.5 ml, estériles o

esterilizados por autoclave

- Tubos Falcon de 15 y 50 ml

- Gradillas para tubos eppendorf de 1.5 ml

- Gradillas para tubos Falcon de 15 y 50 ml

- Sanitas (toallas de papel desechable de laboratorio)

áó é

- Hielo picado y contenedores para incubación

- Picetas para agua y etanol

- Contenedor para baño de hielo seco con etanol

(opcional)

- Guantes quirúrgicos.

Reactivos:

- H2O destilada

- Etanol de 70° o 96° para laboratorio

- H2O Milli-Q, esterilizada por autoclave (ó SIG-

MA W4502-1L)

- Cloro comercial (hipoclorito de sodio 5-10%)

- Sodium chloride – SIGMA S3014-500G (o

equivalente)

- Potasium chloride solution 1M – SIGMA 60142-

100ML-F (o equivalente)

- Trizma® hydrochloride (Tris-HCl) – SIGMA

T5941-100G (o equivalente)

- Magnesium chloride solution 1M – SIGMA

M1028-10X1ML (o equivalente)

- Triton® X-100 – SIGMA T8787-50ML (o

equivalente, puede substituirse por NP-40)

- TWEEN® 20– SIGMA P9416-50ML (o equivalente)

- Proteinase K 800 units/ml – SIGMA P4850-

1ML (o equivalente)

- Hielo seco (opcional).

Soluciones stock:

- Etanol al 70%

- NaCl 0.8%

0.1 M Tris-HCl pH 8.3

Procedimiento

Preparar el tampón de lisis de nemátodos:

Tomar 1 ml de nemátodos

Lavar con cloro 10% por 7 min (en agitación)

Centrifugar a 12000 rpm por 1 min y desechar

sobrenadante

Lavar con NaCl 0.8% una vez

Lavar con H2O destilada una vez

En un tubo eppendorf limpio añadir la proteinasa

nasa K 800 units/ml)

Introducir 1 nemátodo en el tampón de lisis

de tampón de lisis).

Congelar el tubo en un baño de hielo seco con

etanol, o congelar a -80°C por al menos dos horas

(opcional)

Incubar durante una hora a 65 °C

Inactivar la proteinasa K incubando a 95 °C por

15 min

Puede almacenarse el sobrante a -80 °C para uso

posterior.

á

II. Amplificación por PCR

Objetivo: Amplificación de fragmentos de

DNA mediante la técnica de reacción de

polimerización en cadena (PCR).

Equipo y Material:

Campana de flujo laminar

Termociclador, cualquier marca (recomendable

con opción FAST)

Minicentrífuga (para centrifugaciones rápidas).

Bloques termostáticos para tubos eppendorf

(mantenidos a -20°C)

Micropipetas de: 0.5 -2 µl, 2 - 20 µl y 20 – 200 µl

(distintas a las usadas en la extracción)

Puntas para micropipeta blancas y amarillas

(compatibles con marca de micropipetas),

estériles o esterilizadas por autoclave

Receptáculos para puntas y tubos de desecho

Microtubos tipo eppendorf de 1.5 ml, estériles o

esterilizados por autoclave

Microtubos tipo eppendorf de 0.2 ó 0.5 ml

(compatibles con bloque del termociclador),

estériles o esterilizados por autoclave

Gradillas para tubos eppendorf de 0.2 ó 0.5 ml y

de 1.5 ml

Hielo picado y contenedores para incubación

Guantes quirúrgicos.

Reactivos:

Agua Milli-Q estéril (ó agua grado PCR – SIGMA

W1754-1VL)

Taq DNA polimerasa con tampón de reacción

10X y MgCl2 – SIGMA D4545-50UN (o equivalente)

Worm Lysis

Buffer (WLB):

50 mM KCl

10 mM Tris-HCl pH 8.3

2.5 mM MgCl2

0.45% Triton-X-100

Proteinasa K: 20 mg/ml u 800units/ml

Deoxynucleotide Mix, 10 mM – SIGMA D7295-

.2ML (o equivalente)

Primers:

Sc-18S_F44

5'-TGATGAGGAGCTAATCGGAAACG-3'

Sc-18S_R246

5'-CACCATCCACCGAATCAAGAAAG-3'

Sc-28S_F286

5’-GCGTTTCGTCTTTGCTTTTC-3’

Sc-28S_F1135

5' -TAGGGACAGTGGGAATCTCG 3'

PplaRAPD-R

5’-CACGGGCAATAG-3’

OP-H15

5’-AATGGCGCAG-3’

Los primers del 28S de S. carpocapsae se diseñaron

con el software Primer3 (v.0.4.0) en línea (http://

frodo.wi.mit.edu/primer3) (Rozen y Skaletsky,

2000), tomando como templado la secuencia del

gen ribosomal 28S reportada en el GeneBank del

NCBI.

Procedimiento:

1.Preparar en un tubo eppendorf la mezcla de

reacción.

2.Adicionar los siguientes componentes, excepto el

DNA:

*Una vez que se adiciona la Taq polimerasa se

deben mantener los tubos a 4ºC o menos. Es

conveniente utilizar bloques termostáticos para

este fin (o hielo picado).

3.Alicuotar 20 µl de mezcla en microtubos tipo

eppendorf de 0.2 ml (compatibles con termociclador).

4.Agregar 5 μl de DNA a cada tubo.

5.Mezclar y centrifugar brevemente.

áó é

6.Colocar los tubos en el termociclador y correr el

siguiente programa:

Puede ser necesario duplicar el tiempo de extensión

para insertos mayores a 1.5 Kb.

Puede ser necesario determinar la temperatura

óptima dependiendo de los primers

Puede ser necesario determinar las concentraciones

óptimas de MgCl2 y Taq por cada lote de enzima.

7. Verificar la amplificación por electroforesis en

un gel de agarosa al 2%.

III. Electroforesis de DNA

Objetivo: Separar fragmentos de DNA de distinto tamaño en un gel de agarosa.

Equipo y Material

- Microondas para fundir la agarosa (o placa calefactora)

Componente Concentración

Final Vol. para 1 reacción

H20 ajustar a 25µl 13.8 µl

Buffer 10X sin Mg 1X 2.5 µl

50 mM MgCl2 3 mM 1.5 µl

10 mM dNTPs 0.4 mM 1 µl

Primer F 10 µM 0.2 µM 0.5 µl

Primer R10 µM 0.2 µM 0.5 µl

Taq 5 U/µl 1 U 0.2 µl

DNA variable 5 µl

Volumen total 25 µl 25 µl

1

ciclo 35 ciclos

1

ciclo

Tiempo 5:00

min

0:30

min 0:30 min

1:00

min 7:00

T°C 94ºC 94ºC

59-63ºC

dependiendo

de los

primers

72ºC 72ºC 4ºC

- Cámara de electroforesis en gel de agarosa

(pequeña)

- Cubetas y peines para preparación de geles

(compatibles con la cámara)

- Cinta “masking tape”

- Fuente de poder para electroforesis (mínimo

100V)

- Transiluminador UV

- Sistema de fotodocumentación (puede substituirse

por sistema polaroid o cámara digital)

- Agua destilada

- Micropipeta de: 0.5 -10 µl ó 2 - 20 µl (diferentes

de las usadas en los protocolos anteriores)

- Puntas para micropipeta blancas (compatibles

con marca de micropipetas)

- Receptáculos para puntas y tubos de desecho

- Microtubos tipo eppendorf de 1.5 ml

- Gradillas para tubos eppendorf de 1.5 ml

Reactivos

- Tris-Borate-EDTA buffer – SIGMA T7527-1L

(o equivalente)

- Agarose – SIGMA A9539-10G (o equivalente,

uso rutinario)

- Ethidium bromide solution – SIGMA E1510-

10ML (o equivalente)

- PCR 100 bp Low Ladder – SIGMA P1473-1VL

(o equivalente)

- Gel Loading Buffer – SIGMA G2526-5ML (o

equivalente)

- Guantes quirúrgicos

ADVERTENCIA: El bromuro de etidio es en ex-

tremo mutagénico; use guantes al manipularlo y

á

tome precauciones al desecharlo.

Procedimiento

7. Para geles de Agarosa al 2%, pesar 2gr de agarosa

y disolver en 100 ml de TBE.

8. Calentar en horno de microondas hasta que la

agarosa se haya fundido.

9. Es conveniente mezclar varias veces mientras se

está calentando.

10.Dejar enfriar (sin que solidifique) mientras se

prepara la cubeta para el gel.

11.

etidio (concentración final de 0.5 μg/ml).

Otra opción es no adicionar bromuro de

etidio a la agarosa y teñir el gel en 0.5 μg/ml de

bromuro de etidio, durante 15-30 min, una vez que

se ha corrido el gel. Generalmente no es necesario

desteñir, pero si se quiere reducir la fluorescencia

de fondo, el gel puede enjuagarse con H2O

destilada durante 15 min.

5. Para preparar la cubeta se deben tapar los extremos

abiertos. Existen en el mercado gomas especiales

para ello, sin embargo pueden sustituirse sin

problema por cinta adhesiva (tipo “masking-

tape”).

6. Una vez lista la cubeta, verter la agarosa e insertar

los peines.

7. Dejar solidificar de 20 a 30 min y colocar la

cubeta en la cámara de electroforesis.

8. Cubrir el gel con buffer TBE sin que sobrepase

un par de milímetros.

9. Tomar 2 µl de buffer de carga y depositar en un

papel parafilm.

10.Tomar 4 µl de muestra y depositar encima del

buffer de carga.

11.Mezclar perfectamente con la punta de la

micropipeta.

12.Cargar toda la muestra en cada pozo del gel, a

partir del segundo pozo.

13.Cargar 2 µl de marcador de peso molecular en

el primer pozo.

14.Conectar la cámara de electroforesis a la fuente

de poder y correr las muestras en el gel a 100-

110 Volts (~5Volts/cm) durante 40 min.

*Puede correrse más tiempo a criterio personal.

Para esto es necesario observar la migración del

colorante azul de bromofenol.

15.Desconectar la fuente de poder y retirar la cubeta

de la cámara de electroforesis.

16.Colocar el gel en un transiluminador con luz

UV para observar las bandas y tomar fotografías

del gel. Es conveniente utilizar una tapa acrílica

áó é

con el transiluminador u otro medio de protección

de la luz UV.

IV. Demostración de análisis bioinformático:

La demostración incluirá los siguientes procedimientos:

Alineamiento de la secuencia de interés con una

secuencia de referencia, mediante el programa

BioEdit (Hall, 1999).

Colecta de secuencias en las bases de datos y

alineamiento para análisis filogenético.

Determinación del mejor modelo evolutivo para

nuestros datos, mediante el programa MEGA 5

(Tamura et al. 2011).

Reconstrucción filogenética, mediante el programa

MEGA 5 (Tamura et al. 2011).

Interpretación de resultados.

Resultados Esperados Se espera que los participantes en

el curso se familiaricen con la

terminología de los métodos

moleculares y con los distintos

pasos del análisis. Se realizará un

proceso de extracción de DNA

sencillo y rápido que produce

DNA con las características

suficientes para ser usado en la

amplificación por PCR. En la

práctica de PCR se espera obtener

amplificaciones de fragmentos de

tamaños distintos, para familiarizarse

Figura 2. Geles de agarosa al 2%, en ambos casos a la izquierda se

observa el marcador de peso molecular, una escalera de 100 pb. a)

Fragmento correspondiente a los primers 28S (850bp); 1, control

negativo; 2-6 DNA de S. carpocapsae. b) Fragmento correspondiente a

los primers 18S (203bp); 1, control negativo; 2-6, DNA de S. carpocap-

Actualmente la aplicación de técnicas moleculares

para la identificación de nemátodos entomopatógenos

es posible debido a la información que se ha ido

acumulando desde los primeros estudios encaminados

a resolver la filogenia de los dos géneros principales

de este tipo de nemátodos. Aunque todavía existe

el debate sobre si la identificación específica con

estos métodos podrá algún día prescindir de los

análisis morfológicos, por el momento se acepta

que son una herramienta de apoyo de gran importancia

y en algunos casos podrían considerarse suficientes,

por ejemplo, en el caso de la identificación de

especies ya muy bien caracterizadas, siendo todavía

riesgoso la definición de nuevas especies basada

únicamente en la evidencia molecular. En este

documento se presenta información fundamental

para implementar este tipo de técnicas, sin embargo,

se anima a los lectores a profundizar en los distintos

temas abordados, sobre todo en lo referente a las

distintas alternativas existentes de protocolos

experimentales.

con la estimación de tamaño de fragmentos de

DNA en gel de agarosa (Figura 2).

Se realizará también la técnica de

RAPD para que los participantes cuenten

con un punto de referencia de un método

que no requiere secuenciación. Para

valorar la potencialidad y problemática

de la técnica de RAPD se uti l izarán

primers de dos tamaños distintos (10 y 12

pb), que producen resultados distintos

en cuanto a la reproducibilidad del

patrón de bandas obtenido (Figura 3).

Finalmente, la demostración de

análisis bioinformático servirá para que

los participantes puedan integrar los

resultados obtenidos durante el trabajo

práctico con el proceso de identificación

molecular en su conjunto.v

á

Conclusiones

Figura 3. Geles de agarosa al 2%, en ambos casos el marcador

de peso molecular es una escalera de 100 bp. a) RAPD con el

primer OP-H15 de 10 pb; 1-11 DNA de H. bacteriophora, se

observa la falta de reproducibilidad de algunas bandas; 12, con-

trol negativo. b) RAPD con el primer PplaRAPD-R de 12 pb; 1-

9, DNA de H. bacteriophora, se observa mayor reproducibilidad

de las bandas; 10, control negativo.

Agradecimmientos El trabajo sobre nemátodos entomopatógenos en el laboratorio de los autores ha sido financiado por el proyecto Fomix-Hgo-2008-C01-97032 del Fondo

Mixto Conacyt-Gobierno del Estado de Hidalgo, otorgado a RM. MF-P cuenta con una beca de Cona-cyt para estudios de doctorado (Reg. No. 219899).

áó é

Referencias Bibliográficas Adams, B.J., Burnell, A.M., y Powers, T.O. 1998.

A phylogenetic analysis of Heterorhabditis

(Nemata: Rhabditidae) based on internal tran-

scribed spacer 1 DNA sequences data. Journal of

Nematology 30: 22-39.

Adams, B.J., Peat, S.M. y Dillman, A.R. 2007. Phy-

logeny and evolution. In: K.B. Nguyen y D.J.

Hunt, eds. Entomopathogenic nematodes: Systematics,

Phylogeny and Bacterial Symbionts. Brill, Boston. pp.

693-733.

Blaxter, M.L. 2003. Nematoda: Genes, Genomes

and the Evolution of Parasitism. In: D.T.J. Lit-

tlewood, ed. Advances in Parasitology. 54. London:

Elsevier Academic Press. pp.101-195.

Blouin, M.S. 2002. Molecular prospecting for cryp-

tic species of nematodes: mitochondrial DNA

versus internal transcribed spacer. Int J Parasitol.

32: 527-531.

Burnell, A.M. y Stock, P. 2000. Heterorhabditis,

Steinernema and their bacterial symbionts, lethal

pathogens of insects. Nematology 2: 31-42.

Carrero, J.M. y Planes, S. 2008. Plagas del campo.

España: Ediciones Mundi-Prensa.

Cimino, G.D., K.C. Metchette, J.W. Tessman, J.E.

Hearst y S.T. Isaacs. 1990. Post-PCR steriliza-

tion: a method to control carryover contamina-

tion for the polymerase chain reaction. Nucleic

Acids Res. 19 (1): 99-107.

Coghlan, A. 2005. Nematode Genome Evolution.

In: The C. elegans Research Community, eds.

WormBook. http://www.wormbook.org.

De Ley, P., Felix, M.A., Frisse, L.M., Nadler, S.A.,

Sternberg, P.W. y Thomas, W.K. 1999. Molecu-

lar and morphological characterization of two

reproductively isolated species with mirror-

image anatomy (Nematoda: Cephalobidae).

Nematology 1: 591-612.

Espy, M.J., T.F. Smith y D.H. Persing. 1993. De-

pendence of polymerase chain reaction product

inactivation protocols on amplicon length and

sequence composition. Journal of Clinical Microbi-

ology 31 (9): 2361-2365.

Frézal, L. y Leblois, R. 2008. Four years of DNA

barcoding: current advances and prospects. In-

fect Genet Evol. 8: 727-736.

Georgis, R. y Poinar Jr, G.O. 1994. Nematodes as

Bioinsecticides in Turf and Ornamentals. In: A.

R. Leslie, ed. Handbook of Integrated Pest Manage-

ment for Turf and Ornamentals. Boca Raton, Fl:

Lewis Publishers. pp.477-489.

Gouge, D.H. y Snyder, J.L. 2006. Temporal asso-

ciation of entomopathogenic nematodes

(Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhab-

ditidae) and bacteria. Journal of Invertebrate Pathol-

ogy 91: 147-157.

Griffin, C.T., Boemare, N.E. y Lewis, E.E. 2005.

Biology and Behaviour. In: P.S. Grewal, R.U.

Ehlers y D.I. Shapiro-Ilan, eds. Nematodes as Bio-

control Agents. Wallingford, UK: CABI. pp.47-64.

Hajibabaei, M., Singer, G.A., Hebert, P.D., Hickey,

D.A. 2007. DNA barcoding: how it comple-

ments taxonomy, molecular phylogenetics and

population genetics. Trends Genet. 23: 167-172.

Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biologi-

cal sequence alignment editor and analysis pro-

gram for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids.

Symp. Ser. 41: 95-98.

He, Y., Subbotin, S.A., Rubtsova, T.V., Lamberti,

F., Brown, D.J.F. y Moens, M. 2005. A molecu-

lar phylogenetic approach to Longidoridae

(Nematoda: Dorylaimida). Nematology 7: 111-

124.

Hebert, P.D.N., Ratnasingham, S., deWaard, J.R.,

2003. Barcoding animal life: cytochrome c oxi-

dase subunit I divergences among closely re-

lated species. Proc. R. Soc. Lond. B 270: S96-S99.

Kitchin, P.A., Szotyori, Z., Fromholc, C. y Al-

mond, N. 1990. Avoidance of false positives.

Nature 344: 201.

Kwok, S. y Higuchi, R. 1989. Avoiding false posi-

tives with PCR. Nature 339: 237-238.

Liu, J. y Berry, R.E. 1996. Phylogenetic analysis of

the genus Steinernema by morpoholgical charac-

ters and randomly amplified polymorphic DNA

fragments. Fundamental and Applied Nematology

19: 463-469.

Liu, J., Berry, R.E. y Moldenke, A.F. 1997. Phy-

logenetic relationships of entomopathogenic

nematodes (Heterorhabditidae and Steinerne-

matidae) inferred from partial 18S rRNA gene

sequences. J Invertebr Pathol. 69: 246-252.

Liu, J., Berry, R.E. y Blouin, M.S. 1999. Molecular

differentiation and phylogeny of entomopatho-

genic nematodes (Rhabditida: Heterorhabditi-

dae) based on ND4 gene sequences of mito-

chondrial DNA. J Parasitol. 85: 709-715.

Mullis, K.B. y Faloona, F.A. 1987. Specific synthe-

sis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed

chain reaction. Methods Enzymol. 155: 335-350.

Nadler, S.A., De Ley, P., Mundo-Ocampo, M.,

á

Smythe, A.B., Stock, S.P., Bumbarger, D., Ad-

ams, B.J., De Ley, I.T., Holovachov, O. y Bald-

win, J.G. 2006a. Phylogeny of Cephalobina

(Nematoda): molecular evidence for recurrent

evolution of probolae and incongruence with

traditional classifications. Mol Phylogenet Evol. 40:

696-711.

Nadler, S.A., Bolotin, E. y Stock, S.P. 2006b. Phy-

logenetic relationships of Steinernema Travassos,

1927 (Nematoda: Cephalobina: Steinernemati-

dae) based on nuclear, mitochondrial and mor-

phological data. Syst Parasitol. 63: 161-181.

Nguyen, K.B., Maruniak, J. y Adams, B.J. 2001.

Diagnostic and phylogenetic utility of the

rDNA internal transcribed spacer sequences of

Steinernema. Journal of Nematology 33: 73-82.

Parkinson J, Mitreva M, Whitton C, Thomson M,

Daub J, Martin J, Schmid R, Hall N, Barrell B,

Waterston RH, McCarter JP, Blaxter ML. 2004.

A transcriptomic analysis of the phylum Nema-

toda. Nat Genet. 36: 1259-1267.

Poinar, G.O. 1975. Description and biology of a

new insect parasitic rhabditoid, Heterorhabditis

bacteriophora n. gen., n. sp.(Rhabditida; Heteror-

habditidae n. fam.). Nematologica 21: 463-470.

Poinar, G.O. 1979. Nematodes for Biological Con-

trol of Insects. Boca Raton, Florida: CRC Press.

Poinar, G.O. 1983. The Natural History of Nema-

todes. Englewood Cliffs, N.J.: Prentice-Hall.

Reid, A.P. 1994. Molecular Taxonomy of Steiner-

nema. In: A.M. Burnell, R.-U. Ehlers y J.P. Ma-

son, eds. Genetics of entomopathogenic nematode-

bacterium complexes. Proceedings of a symposium and

workshops held at St Parick’s College, Maynooth, Co.

Kildare, Ireland. Luxembourg-Belgium, European

Commission Directorate-General XII, Science,

Research and Development Environment Re-

search Programme, pp. 49-58.

Reid, A.P., Hominick, W.M. y Briscoe, B.R. 1997.

Molecular taxonomy and phylogeny of entomo-

pathogenic nematode species

(Rhabditida:Steinernematidae) by RFLP analysis

of the ITS region of the ribosomal DNA repeat

unit. Systematic Parasitology 37: 187-193.

Reyes, Y. y De la Torre, M. 2005. La Producción

de Nemátodos Entomopatógenos y su Uso Para

el Control Biológico de Plagas. Claridades Agrope-

cuarias 143: 43-46.

Rys, P.N. y Persing, D.H. 1993. Preventing false

positives: quantitative evaluation of three proto-

cols for inactivation of polymerase chain reac-

tion amplification products. Journal of Clinical

Microbiology 31: 2356-2360.

Rodríguez Solano, R., Almazán García, C. y Ar-

mendáriz González, I. 2004. Estudios prelimi-

nares con nemátodos entomopatógenos para el

control biológico de la mosca del cuerno, Hae-

matobia irritans L.(Diptera: Muscidae). Veterinaria

México 35: 339-350.

Rozen, S. y Skaletsky, H. 2000. Primer3 on the

WWW for general users and for biologist pro-

grammers. In: S. Krawetz y S. Misener, eds. Bio-

informatics Methods and Protocols: Methods in Molecu-

lar Biology. 132. Totowa, NJ: Humana Press.

pp.365-386.

Rubinoff, D., Cameron, S. y Will, K. 2006. A ge-

nomic perspective on the shortcomings of mi-

tochondrial DNA for "barcoding" identifica-

tion. J Hered. 97: 581-594.

Saiki, R.K., Chang, C.A., Levenson, C.H., Warren,

áó é

T.C., Boehm, C.D., Kazazian, H.H. Jr, Erlich,

H.A. 1988. Diagnosis of sickle cell anemia and

-thalassemia with enzymatically amplified

DNA and nonradioactive allele-specific oli-

gonucleotide probes. N Engl J Med. 319: 537-

541.

Sambrook, J. y Russell, D.W. 2001. Molecular

cloning: a laboratory manual. Cold Spring Har-

bor Laboratory Press.

Sayers, E.W., Barrett, T., Benson, D.A., Bolton, E.,

Bryant, S.H., et al. 2009. Database resources of

the National Center for Biotechnology Informa-

tion. Nucleic Acids Research 37 (Database issue):

D5-15.

Shapiro-Ilan, D.I. y Gaugler, R. 2002. Production

technology for entomopathogenic nematodes

and their bacterial symbionts. Journal of Industrial

Microbiology and Biotechnology 28: 137-146.

Smart, G.C. 1995. Entomopathogenic nematodes

for the biological control of insects. Journal of

Nematology 27: 529-534.

Spiridonov, S.E., Reid, A.P., Podrucka, K., Subbo-

tin, S.A., y Moens, M. 2004. Phylogenetic rela-

tionships within the genues Steinernema

(Nematoda: Rhabditida) as inferred from analy-

ses of sequences of the ITS-5.8S-ITS2 region of

rDNA and morphological features. Nematology 6:

547-566.

Stock, S.P., Campbell, J.F. y Nadler, S.A. 2001.

Phylogeny of Steinernema travassos, 1927

(Cephalobina: Steinernematidae) inferred from

ribosomal DNA sequences and morphological

characters. J Parasitol. 87: 877-889.

Szalanski, A.L., Taylor, D.B. y Mullin, P.G. 2000.

Assessing nuclear and mitochondrial DNA se-

quence variation within Steinernema (Rhabditida:

Steinernematidae). Journal of Nematology 32: 229-

233.

Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher,

G., Nei, M. y Kumar, S. 2011. MEGA5: Mo-

lecular Evolutionary Genetics Analysis Using

Maximum Likelihood, Evolutionary Distance,

and Maximum Parsimony Methods. Mol Biol

Evol. 28: 2731-2739.

Walder, R.Y., J.R. Hayes y J.A. Walder. 1993. Use

of PCR primers containing a 3'-terminal ribose

residue to prevent cross-contamination of am-

plified sequences. Nucleic Acids Res. 21: 4339-

4343.

Waugh J. 2007. DNA barcoding in animal species:

progress, potential and pitfalls. Bioessays 29: 188-

197.

á

áó é

Investigador Científico I. Federación Nacional

de Cafeteros—Cenicafé. Disciplina

Entomología.

Juancarlos.lopez@cafedecolombia.com

Uso de Nematodos Entomopatógenos en el Manejo Integrado de la Broca del Café: Una Herramienta Para Beneficio de los Caficultores

Generalidades Contenido del Capítulo

Generalidades Nematodos entomopatógenos con potencial en el control de insectos plaga

Uso de nematodos entomo-patógenos en el cultivo del café

Referencias Bibliográficas

Juan Carlos López Núñez

En el ámbito mundial, el cultivo del café cuenta con dos plagas de

importancia económica: el minador de la hoja del café Leucoptera coffeella

(Guer-Meneville) (Lepidoptera: Lyonetiidae) que ataca la hoja del café y la

broca del café Hypothenemus hampei Ferrari (Coleoptera: Curculionidae),

que ataca el fruto (Villacorta, 1998); esta última, se considera como la más

importante (Le Pelley, 1968), al encontrarse distribuida en todos los países

productores de café. Para Colombia, actualmente representa el problema

más severo para la caficultura, ya que su ataque se dirige a la almendra o

endospermo (Decazy, 1990), causando la pérdida parcial o total de los

frutos cosechados, disminuyendo su peso al ser atacados por las larvas y

la caída prematura de frutos menores de tres meses de edad cuando son

atacados, traduciéndose en la disminución del precio de venta y en la calidad del producto final (Bustillo,

1991 y 2006).

Este insecto se introdujo al continente americano desde el África, y desde entonces ha ocasionado

reducción en el rendimiento entre el 5 y 24%, reducciones en el peso de la almendra infestada hasta del 55

%, lo que ha permitido estimar el costo de la broca en pérdidas al menos por 75 millones de dólares anuales

para Colombia (Montoya 1999; Duque y Baker 2003). Globalmente, la importancia de la comercialización

del café como producto agrícola es innegable. En el 2003 supero en más de 14 mil millones de dólares las

exportaciones agrícolas de Estados Unidos; en más de 50 países productores del grano es el sustento de

por lo menos 20 millones de familias cafeteras, y teniendo en cuenta un promedio de cinco personas por

familia, se podría estimar que al menos 100 millones de personas dependen directamente del cultivo del

café (Osorio 2002; Vega et al.,2003)

Dinámica de la broca en el suelo: Con el ánimo de entender la no sencilla dinámica de la broca en

el suelo, se debe considerar principalmente la población del insecto que se resguarda y reproduce en los

frutos remanentes en el suelo, pues este factor es del que depende la infestación a los frutos sanos de las

nuevas cosechas (Peralta, 1995; Bustillo, 2006). Un segundo factor y no menos importante, son los frutos

de café que caen al suelo principalmente después de las cosechas, ya que ofrecen al insecto alimento para

á ó úñ

1972), y hasta algunas condiciones que se presentan

de manera fortuita o esporadica como efecto de

tormentas eléctricas, que afectan secando los troncos,

las ramas y frutos (Leguizamón y Arcila, 1992), o

las emanaciones del volcán Nevado del Ruiz, fenómeno

que causó la caída de frutos entre un 5 a 10%

(Arcila y Valencia, 1985), son factores que favorecen

la presencia de frutos tanto sanos como infestados

por la broca en el suelo, siendo el principal

reservorio de la plaga donde además se proteje de

condiciones ambientales que pudieran afectarla

sobre todo en períodos donde no hay cosecha, y

las condiciones agrestes en las que se presenta la

caficultura colombiana, hacen difícil retirar estos

frutos del suelo, lo que permite

que la broca se mantenga

como el enemigo escondido

haciendo presencia silenciosa y

constante en cualquier lugar

donde el cultivo se mantenga.

Bajo este panorama, y

entendiendo que el control de

la broca del café requiere de

un enfoque integral en el que se consideren que

todos los métodos de control disponibles sean

compatibles, y a la vez disminuyan las poblaciones

del insecto en el campo de manera efectiva y

armoniosa con el ambiente, es que en Colombia la

Federación Nacional de Cafeteros en manos de

Cenicafé ha implementado un manejo integrado de

la broca que incluye componentes químicos,

culturales y biológicos (Bustillo, 2006). Dentro de

este último componente, Cenicafé ha invertido

recursos en la búsqueda de alternativas como el caso de nema-

todos entomopatógenos, que puedan ser incorporadas dentro

de los programas de manejo de la plaga.

su desarrollo y le sirven como medio de dispersión

durante la época de escasez de frutos (Bernal et al.,

1999). Si se tiene en cuenta que lo anterior está

siendo afectado, tanto por condiciones bióticas como

abióticas, esta dinámica del insecto se torna más

compleja; por ejemplo, después de un periodo seco,

se presenta un aumento poblacional de la broca en

dichos frutos y con la llegada de las lluvias, los

adultos emergen y se dispersan por el cafetal,

atacando frutos sanos (Baker et al.,1994; Bustillo,

2002).

Son diferentes razones, por la que hay

presencia en mayor o menor número de frutos en

el suelo en un cultivo de café. Dentro de los mas

relevantes, las enfermedades como

roya (Leguizamón y Arcila, 1991),

mancha de hierro (Leguizamón,

1997), mal rosado (Cadena, 1981),

yaga macana y negra (Castro y

Montoya, 1997), causan en general el

secamiento de ramas y caída de fruto.

Algunos problemas fisiológicos

causados por factores climáticos

como sequías o exceso de lluvia (Valencia y Arcila,

1975), y desequilibrios en la fertilización

(Valencia, 1972), ocasionan en la planta la caída

prematura de frutos. La acción de algunos insectos

sobre las regiones productivas de la planta y las

hojas, causa caída directa de frutos y repercute en

su secamiento y defoliación, como es el caso del

minador, chinche harinoso y arañas (Cárdenas,

1985; Cárdenas y Orozco, 1983; Cárdenas et al.,

1997). Finalmente, la ejecución de labores que se

realizan para incrementar la productividad del

cultivo, como la fertilización, deshierba, zoqueo y

hasta la ocurrencia de cosechas abundantes y el

tránsito de los trabajadores por los lotes (Valencia,

Cenicafé ha implementado un manejo integrado de la broca que incluye componentes químicos, culturales y

biológicos. En este último componente se ha invertido en la búsqueda de alternativas como los

NEPs.

á

Las especies de las familias Steinernematidae

y Heterorhabditidae, son los candidatos con el

mayor potencial en el control de plagas, no

solamente porque además de ser altamente virulentas

sobre mas de 200 especies de insectos considerados

plaga (Tanada y Kaya, 1993; Stock y Hunt, 2005), y

guardar una asociación simbiótica con varias especies

de bacterias de los géneros Xenorhabdus spp. y Photorhabdus

spp., respectivamente, que son las directamente

responsables de la muerte del hospedante durante

las primeras 24 a 48 horas después de infección

(Akhurst y Boemare, 1990; Griffin et al., 2005;

Lengyel et al., 2005; Tailliez et al., 2006), sino por-

que buscan a su presa activamente lo que los hace

altamente eficientes y letales, a diferencia de otros

entomopatógenos (Reed y Wallace, 1965; Ishibashi

y Kondo, 1990; Campbell y Kaya, 1999).

Adicionalmente, los novedosos avances,

durante los últimos 15 años, en los sistemas de

producción masiva aseguran el suministro de estos

agentes de control (Capinera y Epsky, 1992, Ehlers

y Shapiro-Ilan, 2005). Adicionalmente, especies

representantes de estas familias, son las que

actualmente están incluidas en programas exitosos

de manejo en el campo e invernadero como

Heterorhabditis bacteriophora, H. zealandica H. megidis,

Steinernema feltiae, S. carpocapsae, S. riobrave S. kraussei,

S. scarabaei en el control de Cyclocephala borealis,

Popillia japonica, Phyllophaga spp. (Grewal et al.,

2004), Otiorhynchus sulcatus (Lola-Luz et al., 2005),

Bradysia spp. (Jagdale et al., 2004), Liriomyza spp.

(Williams y MacDonald, 1995), Frankliniella occiden-

talis (Ebbsa et al., 2004), Diaprepes abbreviatus

(McCoy et al., 2002), Cosmopolites sordidus (Treverow

Nematodos entomopatógenos con potencial en el control de insectos plaga.

ó

Uso de nematodos entomopatógenos en el cultivo del café La información sobre su uso práctico es escasa.

En Cuba, se tienen registros el uso de de

Heterorhabditis bacteriophora (cepa HC1) y Verticillium

lecanii, integrándolos dentro del manejo de la chinche

harinosa en el cultivo del café (Martínez et al.,

1998). En este registro se menciona que en las

localidades donde se realizaron las aplicaciones

entomopatógenos combinadas con prácticas

agronómicas, se disminuyeron los niveles de

infestación y se obtuvieron mayores rendimientos.

En cuanto a trabajos en que consistentemente se

presenten resultados que permitan considerar a los

nematodos entomopatógenos como una herramienta

de control de plagas en la caficultura, la información

es limitada y Cenicafé ha sido pionero en estas

investigaciones generando espacios en los que por

medio de investigaciones, ha desarrollado esta

herramienta de control biológico, enfocada al

control principalmente de poblaciones de broca

que se resguardan en los frutos del suelo (López,

2005) y que son la principal fuente de infestación

para cosechas posteriores (Bustillo, 2006).

Nematodos y la broca del café

Hasta el momento sólo se tienen dos registros

de nematodos afectando naturalmente la broca del

café; el primero se presentó en India en 1994, donde

á ó úñ

CIBC, 1990; Georgis y Hom, 1992).

El primer trabajo que registra el efecto de

especies de estas familias, se realizó en Inglaterra,

en 1989, cuando en el laboratorio describen el

efecto parasítico de Heterorhabditis bacteriophora,

sobre larvas y adultos de la broca (Allard y Moore,

1989). Posteriormente, otros registros en el laboratorio

presentan el efecto patogénico de Steinernema glaseri,

S. feltiae, S. carpocapsae y Heterorhabditis bacteriophora,

principalmente, sobre adultos (Lubego, 1992; Castillo y

Marbán, 1996). En Cuba se registró la susceptibilidad

de larvas, pupas y adultos de broca a S. cubanum, H.

indica y H. bacteriophora (Valdés y Escobar,

2006). No obstante que actualmente las

especies comercialmente

disponibles ofrecen una

perspectiva muy prometedora

para usarlos como reguladores

de la broca del café, no son

específicas para la broca, y por

lo tanto, se requiere incrementar

esfuerzos en la búsqueda de

especies de estos nematodos

con atributos para controlar biológicamente a la

broca, así como también es necesario desarrollar

los métodos para multiplicarlos (Castillo, 2007).

El uso de nematodos entomopatógenos aislados

de la misma región (nativos), presenta ventajas

como es la fácil adaptación a la zona donde van a

ser empleados a diferencia de aquellos exóticos,

donde las ‖condiciones ambientales extrañas‖ pueden

resultar fallidas al momento de la adaptación.

Además, para evitar el desplazamiento de cepas y/

o especies nativas, que son altamente suscptibles a

desaparecer cuando se realizan aplicaciones inun-

dativas con organismos exóticos, es preferible

Varaprasad y colaboradores en 1994, encontraron

a Panagrolaimus sp. (Panagrolaimidae), típico

nematodo bacterióvoro, afectando adultos de H.

hampei. El segundo registro fue en México, en el

municipio de Cacahoatán en Chiapas, en donde a

partir de hembras de broca extraídas de frutos de

café brocados caídos al suelo se aisló a Sphaerulariopsis

sp. (Thylenchida: Sphaerularioidea), nematodo

parásito de invertebrados (Castillo y Barrera, 1998;

Castillo et al., 2002), que finalmente fue descrito

como nueva especie Methaparasitilenchus hypothenemi

(Allantonematidae) (Poinar et al., 2004). Estos

registros, son evidencia de las diferentes asociaciones

que pueden presentar los nematodos del suelo con

la broca guarecida en el fruto, y de las

condiciones favorables que este hábitat

ofrece para el desarrollo y la

permanencia del patógeno. Esto último

concuerda con observaciones realizadas

en los laboratorios de Cenicafé, en

donde a partir de frutos brocados

recolectados de diferentes regiones

cafeteras colombianas, se ha registrado

diversidad de nematodos con hábitos

omnívoros, algívoros y bacterióvoros, principalmente

de la familia Diplogasteridae (resultados no

publicados).

Las especies de las familias de Steinernematidae

y Heterorhabditidae, tienen gran potencial para el

control de insectos como la broca del café, pues

además de ofrecer ciertas ventajas frente a los

insecticidas químicos por ser seguros al ambiente,

no afectar plantas ni humanos, ser de alta aceptación

comercial y ser activos al buscar el insecto plaga,

son letales a la hora de ser usados como

herramienta de control de insectos (Gaugler, 1981;

En Colombia, Cenicafé ha

enfocado sus esfuerzos,

realizando investigaciones para

usar esta herramienta para

controlar poblaciones de la plaga

en el campo.

á

implementar los programas de manejo con

organismos nativos. De esta manera, los trabajos

realizados en Cenicafé han permitido además de

mostrar la gran diversidad de especies nativas de

steinernematidos y heterorhabditidos de la región

cafetera colombiana (López et al., 2007 y 2008),

evaluar su virulencia frente a los diferentes estados

de broca del café, logrando caracterizarlos con éxito

frente a esta plaga, permitiendo que los caficultores

colombianos cuenten con un pull de organismos

altamente virulentos a la broca del café (Quintero

et al., 2010).

El conocimiento de los detalles de la interacción

nematodo – broca como virulencia de diferentes

especies, estrategia para la búsqueda de hospedante,

ciclo de vida sobre el insecto, vulnerabilidad de los

instares al ataque del patógeno y comportameinto

de este frente a su presa, permite tener argumentos

para la selección del patógeno que cumpla con los

requisitos suficientes para ser seleccionado (Molina

y López 2002, 2003; López 2002). Adicionalmente,

el conocimiento sobre sistemas de aplicación (Lara

y López, 2005), los resultados de control de broca con

aplicaciones en mezcla con hongos entomopatógenos

tanto en invernadero como en el campo, en pequeña

y mediana escala (Giraldo, 2003; Del Castillo,

2004; Lara et al., 2004), al igual que la posibilidad

de obtener nematodos de la mas alta calidad por

medio de la multiplicación in vivo de los nematodos

que permiten pensar en una rápida y efectiva adopción

del sistema de producción por parte de las empresas

de producción de biológicos (Realpe et al, 2007),

permiten considerar a esta herramienta biológica

como promisoria para ser incorporada dentro del

programa de Manejo Integrado de la Broca.

ó

Consideraciones Finales El beneficio intrínseco que se obtiene en el uso

de especies nativas, no sólo para preservar y proteger la

biodiversidad natural de ecosistemas frágiles, sino

también para aprovechar su adaptación natural al

medio ambiente, principalmente al clima y a las

condiciones del suelo, hacen de estos organismos unos

candidatos apropiados para desarrollar e implementar

programas de Manejo Integrado en Colombia,

contribuyendo con la sostenibilidad de la agricultura del

país, como ha sido tenido en cuenta por parte del

programa de Manejo Integrado de la Broca del café en

Colombia.

Es prioritario aunar esfuerzos y tumbar barreras

que puedan existir entre grupos de investigación y

empresas productoras de biológicos en Latinoamérica,

para poder aprovechar los conocimientos generados y

las experiencias adquiridas, sin que se desperdicien

recursos económicos repitiendo trabajos. Tal es el caso

de la producción in vitro, para la que urge el suministro

de material de alta calidad y disponible a los agricultores.

Las capacidades únicas con que cuenta este

biocontrolador, principalmente lo relacionado con la

tolerancia a rangos amplios de pH, temperatura, humedad,

rango amplio de insectos para infección, capacidad de

búsqueda activa de hospedantes, compatibilidad con

agroquímicos, facilidad de aplicación con equipos

convencionales entre otros, los hacen la ―herramienta

idónea de control biológico para el cambio climático‖,

lo que es una oportunidad sin igual para continuar o

iniciar proyectos donde su implementación y su

aplicabilidad en programas MIP en países latinoameri-

canos esté a la orden del día.

á ó úñ

Referencias Bibliográficas ALLARD, G. B.; MOORE, D. 1989. Heteror-

habditis sp., nematodes as control agents for coffee

berry borer Hypothenemus hampei (Scolytidae). Jour-

nal of Invertebrate Pathology, 54 (1): 45-48.

ARCILA P., J.; VALENCIA A., G. 1985.

Daños provocados en cafetales por emanaciones

del volcan nevado del Ruíz. Cenicafé. Diciembre.

Avances técnicos. No.127.

BAKER, P. S.; RIVAS, A.; BALBUENA, R.;

BARRERA, J. F. 1994. Abiotic mortality factors of

the coffee berry borer (Hypothenemus hampei). Ento-

mología Experimentalis et Applicata 71:201-209.

BERNAL U., M.G.; BUSTILLO P., A.E.;

CHAVES C., B.; BENAVIDES M., P. 1999. Efec-

to de Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae sobre

poblaciones de Hypothenemus hampei (Coleoptera:

Scolytidae) que emergen de frutos en el suelo. Re-

vista Colombiana de Entomología 25 (1-2):11-16.

BUSTILLO P, A. E. 1991. Perspectivas de

un manejo integrado de la broca del café, Hypot-

henemus hampei, en Colombia. Agricultura Tropical

(Colombia) 28 (1): 83-93.

BUSTILLO, A. E. 2006. Una revisión sobre

la broca del café Hypothenemus hampei (Coleoptera:

Curculionidae: Scolytinae), en Colombia. Revista

Colombiana de Entomología. 32(2):101-116.

CADENA G., G. 1981. Mal Rosado. In: Ma-

nual de Sanidad Vegetal. Enfermedades 1. 1981.

Chinchiná (Colombia), Cenicafé, 2p.

CAMPBELL, J. F.; KAYA, H. K. 1999. How

and why a parasitic nematode jumps. Nature, 397:

485-486.

CAPINERA, J. L.; EPSKY, N. D. 1992. Po-

tential for biological control of soil insects in the

Caribbean basin using entomopathogenic nema-

todes. Florida Entomologist, 75 (4): 525-532.

CÁRDENAS M., R.; OROZCO C., F. J.

1983. Caracterización histomorfológica del daño

del minador de las hojas del cafeto Leucoptera coffee-

lla G. M. en seis materiales de coffea. Cenicafé

(Colombia). 34 (2): 37 - 43.

CÁRDENAS M., R. 1985. La palomilla de las

ramas del cafeto (Planococcus citri (Risso)

(Homoptera: Pseudococcidae). Cenicafé, Septiem-

bre. Avances técnicos. No.125.

CÁRDENAS M., R.; POSADA F., F. J.;

BUSTILLO P., A, E. Daños causados por arañas

en los cafetales.Cenicafé. Agosto. Avances técni-

cos. No. 242.

CASTILLO, A. 2007. Nematodos parásitos

de la broca del café. In: La broca del café en Amé-

rica Tropical: Hallazgos y enfoques, J. F. Barrera,

A. García, V. Domínguez & C. Luna. Eds. Socie-

dad Mexicana de Entomología y El Colegio de la

Frontera Sur, México, p. 111-120.

CASTILLO, A.; BARRERA, J. F. 1998. Pri-

mer registro de nematodo parasitando a la broca

del café en cafetales de México. In: II Reunión In-

tercontinental sobre broca del café, J. F. Barrera,

A. A. Guerra, J. J. Menn & P. S. Baker, Eds, 29 de

marzo a 2 de abril de 1998. Tapachula, Chiapas

(México). p. 47.

CASTILLO, A.; INFANTE, F.; BARRERA,

J. F.; CARTA, L.; VEGA, F. E. 2002. First field

report of a nematode (Tylenchida: Spherur-

á

larioidea) attacking the coffee berry borer, Hypoth-

enemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Scolytidae) in

the Americas. Journal of Invertebrate Pathology,

79: 199-202.

CASTILLO, A.; MARBÁN, M., N. 1996.

Evaluación en laboratorio de nematodos steinerne-

matidos y heterorhabditidos para el control bio-

lógico de la broca del café, Hypothenemus hampei

(Ferr.). Nematropica, 26 (2):101 – 109.

CASTRO C., B, L.; MONTOYA R., E, C.

1997. El zoqueo de los cafetales y su relación con

la infección por llaga macana. Cenicafé. Junio.

Avances Técnicos. No. 240.

CIBC. COMMONWEALTH INSTITUTE

OF BIOLOGICAL CONTROL. 1990. Control

biológico de la broca de la cereza del cafeto. In:

Manual de Capacitación de Control Biológico.

Chinchiná (Colombia), Cenicafé, p. 140 - 153.

DEL CASTILLO R., J. A. 2004. Evaluación

de mezclas de entomopatógenos para el control de

poblaciones de broca en el suelo. Universidad de

Nariño. Facultad de Ciencias Agrícolas, (Tesis: In-

geniero Agrónomo), San Juan de Pasto, Colombia,

97 p.

DECAZY. B. 1990. Descripción, biología,

ecología y control de la broca del fruto del cafeto

Hypothenemus hampei (Ferr.). In: 50 años de Cenicafé

1938 - 1988. Cenicafé (Chinchiná) pp. 133-139.

DUQUE, H. O.; BAKER, P. S. 2003. De-

vouring Profit: the socioeconomics of coffee berry

borer IPM. CABI Commodities Press. 106p.

EBSA, L.; BORGEMEISTER, C.; POEH-

LING, H. M. 2004. Effectiveness of differente

species strains of entomopatogenic nematodes for

control of western flower thrips (Frankliniella occi-

dentalis), at various concentrations, host densities

and temperatures. Biological Control, 29: 145-154.

EHLERS, R. U.; SHAPIRO-ILAN, D. I.

2005. Mass production. In: Nematodes as biocon-

trol agents. Grewal, P. S.; Ehlers, R. U.; Shapiro-

Ilan, D.I. Eds. Chapter 3. CABI Publishing. Ox-

fordshire. U.K., p. 65 - 78.

GAUGLER, R. 1981. Biological control po-

tential of neoplectanid nematodes. Journal Nema-

tology, 13 (3): 241-249.

GEORGIS, R.; HOM, A. 1992. Introduction

of entomopathogenic nematode products into latin

america and the caribbean. Nematropica, 22 (1): 81

-98.

GIRALDO, D. P. 2003. Comportamiento de

entomonematodos en el control de poblaciones de

broca en árboles de café. Universidad de Caldas.

Facultad de Ciencias Agropecuarias, (Tesis: Inge-

niero Agrónomo). Manizales, Colombia, 83 p.

GREWAL, P. S.; POWER, K. T.; GREWAL,

S. K.; SUGGARS, A.; HAUPRICHT, S. 2004. En-

hanced consistency in biological control of white

grubs (Coleoptera: Scarabaeidae) with new strains

of entomopathogenic nematodes. Biological Con-

trol, 30: 73-82.

ISHIBASHI, N.; KONDO, E. 1990. Behav-

ior of infective juveniles. In: Entomopathogenic

nematodes in biological control. Gaugler R.; Kaya,

H. K., Eds. Boca Raton, CRC Press, p. 139-150.

JAGDALE, G. B.; CASEY, M. L.; GRE-

WAL, P. S.; LINDQUIST, R. K. 2004. Effects of

application rate and timing, potting medium, and

host plant on efficacy of Steinernema feltiae against

ó

á ó úñ

fungus gnat, Bradysia coprophila, in floriculture. Bio-

logical Control, 29: 296-305.

LARA, J. C.; LÓPEZ N., J. C. 2005. Evalua-

ción de diferentes equipos de aspersión para la

aplicación de nematodos entomopatógenos. Revis-

ta Colombiana de Entomología, 31 (1): 1 - 4.

LARA, J. C.; LÓPEZ N., J. C.; BUSTILLO,

A. E. 2004. Efecto de entomonematodos sobre

poblaciones de la broca del café, Hypothenemus ham-

pei (Coleoptera: Scolytidae), en frutos en el suelo.

Revista Colombiana de Entomología, 30 (2): 179 -

185.

LE PELLEY, R. H. 1968. Las plagas del café.

Agricultura Tropical. Editorial Labor, S. A. Cala-

bria, Barcelona, España. 693p.

LEGUIZAMÓN C., J. E.; ARCILA, P. J.

1991. Secamiento de ramas del cafeto y su relación

con la roya. Cenicafé.Avances técnicos. Septiem-

bre. Número 166.

LEGUIZAMÓN C., J. E.; ARCILA, P. J.

1992. Daños en cafetales por descargas eléctricas

Cenicafé, Agosto. Avances técnicos. No. 180.

LEGUIZAMÓN C., J. E. 1997. La mancha

de hierro del cafeto. Cenicafé. Avances Técnicos.

Diciembre. No. 246.

LOLA-LUZ, T.; DOWNES, M.; DUNNE,

R. 2005. Control of black vine weevil larvae Otio-

rhynchus sulcatus (Fabricius)

(Coleoptera:Curculionidae) in grow bags outdoors

with nematodes. Agricultural and Forest Entomol-

ogy, 7: 121–126.

LÓPEZ N., J. C.; 2002. Nematodos parásitos

de insectos y su papel en el control de la broca del

café, Hypothenemus hampei (Ferrari). In: Memorias

Curso Internacional Teórico – Práctico. Sección II.

Parasitoides y otros enemigos de la broca. Ceni-

café, Chinchiná, Colombia, Marzo 18-22, p. 39–70.

LÓPEZ N., J. C.; 2005. ¿Es posible el uso de

entomonematodos en programas MIP en Colom-

bia ?. Avances con la broca del café. In: SOCO-

LEN Sociedad Colombiana de Entomología, Sim-

posio Broca del Café. Socolen, Ibagué, Colombia,

XXXII Congreso. Julio 27 al 29, 2005. Memorias,

p. 33 –39.

LÓPEZ N., J. C.; CANO, L.; GÓNGORA,

C. E.; STOCK, S. P. 2007. Diversity and evolu-

tionary relationships of entomopathogenic nema-

todes (Steinernematidae and Heterorhabditidae)

from the Central Andean region of Colombia.

Nematology, 9 (3): 333 - 341.

LÓPEZ N., J. C.; PLICHTA, K.; GÓNGO-

RA, C.E.; STOCK, P. 2008. A new entomopatho-

genic nematode, Steinernema colombiense n. sp.

(Nematoda: Steinernematidae) from Colombia.

Nematology, 10 (4): 561 – 574.

LUBEGO, S. 1992. The use of four Rhabdi-

tid Nematode species in the control of Cosmopolites

sordidus, Hypothenemus hampei and Cylas puncticollis.,

University of Reading. Department of Agriculture.

(Thesis: M.Sc. in Technology of Crop Protection),

111 p.

MARTÍNEZ, M. A.; SURIS, M.; SÁNCHEZ,

L.; RODRÍGUEZ, M. G.; GONZÁLEZ, E.;

CASTELLANOS, L. 1998. Manejo integrado de

chinches harinosos en el cultivo del cafeto. Resú-

menes del II Congreso Taller Internacional Apor-

tes del Control Biológico en la Agricultura Sosteni-

ble y I Congreso Latinoamericano de la Sección

Regional Neotropical de la Organización Interna-

á

cional de Lucha Biológica. Mayo 18-22, Lima,

Perú, p. 91.

McCOY, C. W.; STUART, R. J.; DUNCAN,

L. W.; NGUYEN, K. 2002. Field efficacy of two

commercial preparatiosn of entomopathogenic

nematodes against larvae of Diaprepes abbreviatus

(Coleoptera: Curculionidae) in alfisol type soi.

Florida Entomologist, 85: 537-544.

MOLINA, J. P.; LÓPEZ N., J. C. 2002. Des-

plazamiento y parasitismo de entomonematodos

hacia frutos infestados con la broca del café, Hypot-

henemus hampei (Coleoptera: Scolytidae). Revista Co-

lombiana de Entomología, 28 (2): 145 – 151.

MOLINA, J. P.; LÓPEZ N., J. C. 2003. Su-

pervivencia y parasitismo de nematodos entomo-

patógenos para el control de Hypothenemus hampei

(Ferrari) (Coleoptera: Scolytidae). Boletín de Sani-

dad Vegetal. Plagas, 29: 523–533.

MONTOYA R., E.C. 1999. Caracterización

de la infestación del café por la broca y efecto del

daño en la calidad de la bebida. Cenicafé 50(4): 245

-258.

OSORIO, N. The global coffee crisis: a threat

to sustainable development. International Coffee

Organization, London. 2002. Disponible online:

http://www.ico.org/documents/globalcrisise.pdf.

QUINTERO V., A.; BENAVIDES M., P.;

LOPEZ N., J.C. 2010. Evaluación en el laborato-

rio de nematodos entomopatógenos nativos para el

control de la broca del café. Cenicafé 61 (2): 119-

131.

PERALTA C., J, H. 1995. Diagnóstico de la

labor de recolección y repase para el manejo de la

broca del café Hypothenemus hampei (Ferrari)/

(Col:Scolytidae) por agricultores. Palmira

(Colombia). Universidad Nacional de Colombia.

Facultad de Ciencias Agropecuarias (Tesis de Inge-

niero Agrónomo). 71p.

POINAR, G. O. Jr.; VEGA, F. E.; CASTI-

LLO, A.; CHAVEZ, I. E.; INFANTE, F. 2004.

Metaparasitylenchus hypothenemi n. sp (Nematoda: Al-

lantonematidae), a parasite of the coffee berry

borer, Hypothenemus hampei (Curculionidae: Sco-

lytinae). Journal of Parasitology, 90 (5): 1106-1110.

REALPE, F. J.; BUSTILLO, A. E.;

LÓPEZ, J. C. 2007. Optimización de la cría de

Galleria mellonella (L.) para la producción de dos

nematodos entomopatógenos parásitos de la

broca del café, Hypothenemus hampei (Ferrari).

En impresión Revista Cenicafé. 58 (2).

REED, E. M.; WALLACE, H. R. 1965.

Leaping locomotion by an insect-parasitic nema-

tode. Nature, 206 (4980): 210-211.

STOCK, S. P.; HUNT, D. J. 2005. Nema-

tode morphology and systematics. In: Grewal, P.

S., Ehlers, R. U.; Shapiro-Ilan, D. I. (Eds). Nema-

todes as biological control agents. Wallingford,

UK, CABI Publishing, p. 3-43.

TAILLIEZ, P.; PATÉS, S.; GINIBRE, N.;

BOEMARE, N. 2006. New insight into diversity

in the genus Xenorhabdus, including the description

of ten novel species. International Journal of Sys-

tematic and Evolutionary Microbiology, 56: 2805-

2818.

TANADA, Y.; KAYA, H. K. 1993. Nema-

todes, nematomorphs, and plathelminthes. In: In-

sect pathology. Chapter 13. San Diego, USA, Aca-

demic Press, 666 p.

TREVERROW, N.; BEEDING, R. A.;

DETTMANN, E. B.; MADOX, C. 1991. Evalua-

ó

á ó úñ

tion of entomopathogenic nematodes for control

of Cosmopolites sordidus (Gemar) (Coleoptera: Curcu-

lionidae), a pest of bananas in Australia. Annals of

Applied Biology, 119: 139-145.

VALDES, V. Y.; ESCOBAR, H. M. 2006.

Susceptibilidad de Hypothenemus hampei Ferrari a las

especies de nematodos entomopatógenos Steinerne-

ma cubanum, Heterorhabditis indica y Heterorhabditis

bacteriophora. Fitosanidad, 10 (3): 245-246.

VALENCIA A., G. 1972. Granos negros y

caída de frutos de café. Cenicafé, Agosto. Avan-

ces técnicos No.21.

VALENCIA A., G.; ARCILA P., J. 1975.

Secamiento y caída de frutos tiernos de café. Ceni-

cafe. Marzo. Avances técnicos. No.40.

VARAPRASAD, K. S.; BALASUBRAMA-

NIAN, S.; DINAKAR, B. J.; RAO, R. C. V. R.

1994. First report of an entomogenous nematode,

Panagrolaimus sp., from coffee-berry borer, Hypoth-

enemus gampei (Ferrari) from Karnataka, India. Plant

Protection Bulletin Faridabad, 46 (2-3): 34.

VEGA, F.E.; ROSENQUIST, E.;

COLLINS, W. 2003. Global project needed to

tackle coffee crisis. Nature, 425: 343.

VILLACORTA., A. 1998. El control biológi-

co en el control de plagas de importancia económi-

ca de café. In: II Seminario Taller Internacional.

Aportes del Control Biológico en la Agricultura

Sostenible y I Congreso Latinoamericano de la

Sección Regional Neotropical de la Organización

Internacional de Lucha Biológica. Lima - Perú, 18 -

22 Mayo 1998, pp 55 - 58.

WILLIAMS, E. C.; MacDONALD, O.C.

1995. Critical factors required by the nematod

Steinernema feltiae for the control of the leafminers

Liriomyza huidobrensis, Liriomyza bryoniae and Chroma-

tomyia syngenesiae. Annals of Applied Biology.

127:329-341.

Para contrarrestar lo anterior, se ha buscado restaurar este proceso

natural tratando de reintroducir enemigos naturales a los sistemas agrícolas y así recuperar el equilibrio de

las poblaciones de insectos; este es el principal objetivo del Control Biológico al utilizar insectos depredadores, parasitoides,

entomopatógenos (hongos, bacterias y nematodos) para controlar las poblaciones de otros insectos (Dent

2000). El control Biológico puede ser una estrategia eficaz para el control de plagas con hábitos crípticos,

ya que los enemigos naturales pueden buscarlas activamente en los lugares donde estas se ocultan

(Rodríguez et al. 2006).

Teniendo en cuenta lo anterior, el presente trabajo evaluó la susceptibilidad de larvas de tercer instar de

Delia platura a NE de los géneros Steinernema y Heterorhabditis en condiciones de laboratorio, para lo cual se

cuantifica la mortalidad de larvas de Delia platura expuestas a los aislamientos Heterorhabditis sp. SL0708,

1Biólogo. jceleita@javeriana.edu.co 2Profesor Asistente., Unidad de Ecología y Sistemática –UNESIS, Laboratorio de Control Biológico. adriana.saenz@javeriana.edu.co.

Pontificia Universidad Javeriana, Cra 7 N°43-82, Edf 54, Oficina 200. Bogotá, Colombia.

Susceptibilidad de Delia platura (Meigen, 1826)

(Diptera: Anthomyiidae) a Nematodos Entomopatógenos

Introducción

José Joaquín Celeita Bernal 1 y Adriana Saenz Aponte2

La interacción de los insectos y sus enemigos naturales es un proceso

ecológico esencial dado que este mantiene reguladas las poblaciones de

insectos evitando que estas se conviertan en potenciales plagas (Dent 2000).

Estos procesos ecológicos se ven interrumpidos por el establecimiento de

monocultivos y el uso de insecticidas para su mantenimiento dado que

estos no solo destruyen los insectos plaga sino también los enemigos

naturales (insectos benéficos) conllevando a que las poblaciones de los

insectos fitófagos se incrementen generando daños económicos importantes

y convirtiéndose posiblemente en plagas (Dent 2000). Como ejemplo de

estas plagas, están las moscas del género Delia (Anthomyiidae) las cuales

son de hábito fitófago en su etapa larval, pueden convertirse en plagas de

muchos cultivos (Hennig 1976; Griffiths 1990 en Gouinguene & Stadler 2005),

como cebolla (Allium fistulosum L.), atacado por Delia antiqua, semilla del frijol

(Phaseolus vulgaris L.), atacada por Delia platura, el nabo (Brassica rapa L . )

por Delia f lora l i s y l a co l (Brass i ca o l earacea ) atacada por Delia radicum; en general

los daños causados son en raíces de plántulas y semillas en germinación ya

que estas moscas ovipositan en el suelo y en este se desarrollan sus larvas

(Gouinguene y Stadler 2005).

Contenido del Capítulo Generalidades ¿Por qué estudiar los nematodos como posibles controladores biológicos de Delia platura?

Ciclo de vida de Delia Platura

Nematodos entomopatógenos Experiencias con Delia platura y Nematodos entomopatógenos colombianos.

Resultados Conclusiones Recomendaciones Referencias Bibliográficas

á á

¿Por qué estudiar los nematodos como posibles controladores biológicos de Delia platura?

tercer instar larval de Delia platura a cinco dosis del

mejor aislamiento y se evaluó la capacidad de re-

producción en las larvas.

Heterorhabditis bacteriophora HNI0100, Steinernema

colombiense SNI0198 y Steinernema websteri JCL006 y

posteriormente se compara la susceptibilidad del

En Colombia en el municipio de Cota, los

cultivos de espinaca Spinacia oleracea L., presentan

pérdidas por los daños de Delia platura. El daño

consiste en la destrucción del tallo, la raíz de la

plántula y el punto de crecimiento de la planta

cuando esta próxima a la cosecha. Los productores

realizan hasta 6 aplicaciones de plaguicidas en un

ciclo de cultivo de tan solo 60 días (Gil et al. 2007).

La mayoría de los plaguicidas utilizados son de alto

espectro como los organofosforados, organosulfu-

rados y piretroides por lo que eliminan indiscrimi-

nadamente insectos plaga y benéficos; además, el

uso inapropiado y frecuente de estos productos

genera problemas en la salud de los productores,

consumidores, daños ambientales y altos costos de

producción (Gil et al. 2007).

Delia platura se ha reportado también como

plaga de cultivos de remolacha (Beta vulgaris), alca-

chofa (Cynara scolymus), col de Bruselas (Brassica ole-

racea var. gemmifera), repollo (Brassica oleracea var.

viridis), melón (Cucumis melo), zanahoria (Daucus

carota), coliflor (Brassica oleracea var. botrytis), maíz

(Zea mays), pepino (Cucumis sativus), ajo (Allium sati-

vum), lechuga rizada (Lactuca sativa), habas (Vicia

faba), mostaza (Sinapis), cebolla (Allium cepa), arveja

(Pisum sativum), calabaza (Cucurbita), nabo (Brassica

rapa), habichuela (Judiaphaseolus vulgaris), espinacas

(Spinacia oleracea), papa (Solanum tuberosum) y tomate

(Solanum lycopers) (Capinera 2001).

Una de las alternativas para el control de D.

platura, es la implementación del control biológico,

ya que utiliza entre otras alternativas los NE para el

control de insectos plaga (Chen et al. 2003). Las

especies de las familias Steinernematidae y Hete-

rorhabditidae tienen atributos de patógenos por

que tienen quimiorreceptores que les facilita la

búsqueda del huésped (Kaya & Gaugler, 1993 en

Lacey et al. 2001), su asociación con bacterias mu-

tualistas de los géneros Xenorhabdus

( S t e i n e r n e m a t i d a e ) y P h o t o r h a b d u s

(Heterorhabditidae), hace que este complejo nema-

todo-bacteria sea altamente virulento matando a su

huésped en aproximadamente 48 horas (Lacey et al.

2001).

Al aplicar NE para el control de plagas cuyas

etapas larvales se desarrollan en el suelo, se puede

lograr un control efectivo de estas ya que el suelo

es el hábitat natural de los NE (Georgis y Manwei-

ler 1994; Koppenhober 2000 en (Lacey et al. 2001).

Los NE a diferencia de otros controladores bio-

lógicos, se reproducen masivamente, ya que de un

solo hospedero pueden emerger miles de JI y pue-

den persistir por largo tiempo en el suelo, contro-

lando de una forma continua las plagas (Fenton et

al. 2001).

Otras ventajas de utilización de los NE en el

control de plagas es que pueden ser aplicados me-

diante los mismos sistemas utilizados para plaguici-

á

El ciclo completo de Delia platura puede durar

de 15 a 77 días, normalmente en el trópico dura

alrededor de 22 días, el ciclo es más largo en zonas

templadas ya que la larva crece en verano y la pupa

entra en diapausa en invierno, el número de

generaciones por año es incierto ya que esto depende de si la

población entra en diapausa o no y de variables

ambientales (Capinera 2001).

Los huevos son elongados y ovoides de color

perla blanco, miden aproximadamente 0.99mm,

teniendo un rango entre los 0.90-0.95mm de largo

y 0.30mm de ancho,

por lo general los

huevos son puestos

individualmente o

máximo en grupos de

10 en la superficie del

suelo. La ovoposición

se da a temperaturas

entre los 10-27 ºC,

los sitos favoritos de

ovoposición son semillas en germinación o en

descomposición, también en material vegetal en

descomposición y fertilizantes orgánicos; la etapa

de huevo dura dependiendo de la temperatura ya

que entre los 15-28 ºC este eclosiona a los 2 o 3

días, mientras que a temperaturas de 5-7 ºC la

eclosión puede darse entre los 7 a 9 días (Capinera

2001).La larva es blanca y presenta tres instares, inicialmente

mide 0.7mm y 7mm al finalizar el tercer instar (Fig.

1a). Estas larvas se alimentan de forma gregaria, el

primer instar no puede dañar las plantas sanas, tan

sólo ataca las que están recién cortadas o con

heridas, por ejemplo en cortes de semillas de papa,

las larvas se alimentan y crecen mejor si él sustrato

está en proceso de descomposición, la rapidez del

crecimiento de la larva depende de la temperatura,

21-30 ºC es la temperatura óptima. Bajo estas

condiciones el primer instar dura 1-3 días, el

segundo 3-5 días y el tercer instar de 5-16 días

(Capinera 2001).

La pupa es ovalada y rojiza, antes de emerger

el adulto se torna café oscuro, esta puede medir de

4-5mm de largo y 1.5mm de ancho (Fig. 1b), la larva

en prepupa baja al suelo y en este, pasa a pupa, esto

ocurre a menudo en el lugar de alimentación o las

larvas se entierran en el sustrato del cual se están

alimentando y pupan. El periodo de pupa dura

aproximadamente 7-14 días a una temperatura de

18-24 ºC (Capinera 2001).

Ciclo de vida de Delia platura

Figura 1. Estados de desarrollo de Delia platura. a) Larva de tercer instar.

b) Pupa. c) Macho. d) Hembra.

das, por lo que no se generan costos extras por los

sistemas de aplicación (Shapiro-Ilan, et al. 2005).

El uso de los NE contribuye a la disminución en el

manejo con plaguicidas y por ende a la reducción

de la contaminación generada por estos, ya sea

rectamente al ambiente, a los productores y/o a las

personas que consumen residuos (trazas) de estos

en los alimentos que se producen bajo esta

modalidad de agricultura (Chen, et al. 2003).

género de NE se observo una mortalidad del 40%

al 60%, utilizando entre 50 y 250 JI por larva a una

temperatura de 18-20°C (Nielsen 2003).

Igualmente, se han registrado mortalidades de 70%

en experimentos realizados sobre larvas de tercer

instar de Delia radicum utilizando el NE Steinernema

feltiae mientras que con otras especies del mismo

á á

Experiencias con Delia platura y Nematodos entomopatógenos colombianos.

Cría de Delia platura: Se colectaron adultos

de Delia platura en cultivos de espinaca de 15 días

de edad en la Finca Sede Roso, vereda Roso, en el

municipio de Cota Cundinamarca, con el fin de

iniciar una cría de larvas. Para esto se utilizaron 20

botellas de plástico de 1.5 L de ca-

pacidad, con masato de arroz en fermento (3cm3/

botella) como atrayente, las botellas se colocaron

5 por surco, cada 15 metros entre si y dejando 5

surcos de por medio entre cada línea de botellas

(Fig. 3 a). Los adultos capturados se expusieron a

tubérculos de papa criolla (Solanum phureja) cortados

a la mitad, colocando la parte expuesta por el corte

hacia abajo sobre cuadros de icopor de 1cm3, esto

dentro de bandejas medianas plásticas en cuya base

se coloco arena estéril, el montaje se dejo por 8

días para que las hembras ovipositaran y se des-

arrollaran las larvas. La cría se mantuvo a una tem-

peratura de 20 ± 2ºC, humedad relativa de 75 ±

2%, 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad (Fig. 3

b), como lo recomienda Jiménez et al. (2010).

Obtención de ne-

matodos entomo-

patógenos: Heteror-

habditis sp. SL0708

fue suministrado por

el laboratorio de

Control Biológico

de la Pontificia

Universidad Javeria-

na, Heterorhabditis

bacteriophora HNI0100,

Steinernema colombien-

se SNI0198 y Steiner-

n e m a w e b s t e r i k

JCL006, fueron obtenidos por el acuerdo 182 con

cenicafe. Las especies mencionadas fueron aisladas

de diferentes lugres y condiciones ambientales

(Tabla 1).

Figura 3. Obtención de estados de desarrollo de Delia platura (Meigen, 1826) a) Trampas para colecta de adultos. b) cría de larvas.

A

B

Prueba de patogenicidad: 15 larvas del tercer

instar larval de Delia platura fueron individualizadas en

vasos plásticos de 1fl.Oz de capacidad con papel

filtro esterilizado y 5g de papa criolla para que la

larva se alimentara. Luego se aplico una dosis de

2500 JI/larva en cada unidad experimental (Fig. 4

a). Las unidades experimentales se mantuvieron a

20 ± 2ºC, 70% de humedad y en oscuridad (Fig. 4

b). Este ensayo se realizo dos veces para un total

de 30 larvas por tratamiento. Se r ea l i z a ron

observaciones hasta los 8 días después de la

infección (DDI) y se registro el número de larvas

muertas y los síntomas diariamente. Las larvas muertas

se disectaron y observaron en un estereomicroscopio

con el fin de corroborar la presencia de diferentes

estados de desarrollo de NE.

Dosis de nematodos entomopatógenos:

15 Larvas fueron individualizadas en vasos plásticos de

1fl.Oz con papel filtro estéril y 5g de papa criolla

(Fig. 4 a). Las dosis 600, 1200, 2500, 5000 y 7500

JI/larva, se evaluaron de acuerdo al trabajo realizado

por Nielsen (2003) quien utilizo dosis similares

sobre Delia radicum, se aplicaron en las unidades

experimentales y se mantuvieron a la misma

temperatura y humedad relativa que el primer

bioensayo (Fig. 4 b). Este ensayo se realizo dos

veces para un total de 30 larvas por tratamiento. Se

realizaron observaciones hasta los 8 días después

de la infección (DDI) y se registro el número de

larvas muertas. Las larvas muertas se disectaron y

observaron en un estereomicroscopio con el fin de

corroborar la presencia de diferentes estados de

desarrollo de NE.

Diseño experimental y análisis estadístico: Los

bioensayos se organizaron en un diseño completamente

al azar (DCA). Se realizó una ANOVA para cada

bioensayo y posteriormente una prueba de compa-

ración múltiple de Tukey con el programa Statistix

8.0.

á

Especie Cepa Localidad Altura

(m) Tipo de suelo pH Vegetación

Steinernema websteri JCL006

Naranjal

Chinchiná

Caldas

1381

Unid Chinchina (Melanudans) Cenizas volcánicas

3,9-5,2 Bosque

Steinernema colombiense SNI0198

Maracay

Quimbaya

Quindío

1402

Unid Chinchina y Montenegro (Melanudans) Cenizas volcánicas

4,9 Café libre exposición

Heterorhabditis bacteriophora HNI0100

SL0708

Alcalá

Valle del Cauca

Franco arenoso 4,76 Guadual Heterorhabditis sp.

Tabla 1. Especies de nematodos entomopatógenos usados para los ensayos con Delia platura.

á á

Resultados

Figura 4. Evaluación de nematodos entomopatógenos en larvas de Delia platura a) Unidad experimental. b) Unidades experimentales en cámara para mantener las condiciones requeridas por los NE.

A B

Para el primer bioensayo Heterorhabditis bacte-

riophora HNI0100 presentó 46.6 % de mortalidad

sobre Delia platura, seguida de Heterorhabditis sp.

SL0708 con 36,6%, Steinernema websteri JCL006 con

20% y Steinernema colombiense SNI0198 con 16,6%

(Fig. 5). Se presentaron diferencias significativas

entre los tratamientos (F= 6,21; DF= 4; α= 0.05;

P= 0,0001) y el tratamiento con Heterorhabditis bac-

teriophora HNI0100 presento diferencias altamente

significativas. Estos resultados son opuestos a lo

reportado por Willmott et al. (2002), quien utili-

zando la misma especie de NE en dosis altas

(32000 JI/planta) no reportan mortalidad en Delia

radicum, bajo condiciones de campo. Igualmente

Chen et al. (2003), evalúan dosis de 1000JI/larva de

Heterorhabditis bacteriophora sobre Delia radicum, pero

no muestra efecto sobre las larvas, probablemente

debido a que es una dosis muy baja para que este

NE afecte las larvas de esta mosca, no obstante,

con la dosis de 2500JI/larva se alcanzó un porcen-

taje de mortalidad significativo para D. platura.

Por otro lado, las 2 especies del género Stei-

nernema presentaron los más bajos porcentajes de

mortalidad, esto coincide con el trabajo realizado

por Nielsen (2003) quien muestra que no todas las

especies de este género son efectivas en el control

de Delia radicum, ya que de 6 especies evaluadas,

solo Steinernema feltiae obtuvo una alta eficacia.

El tiempo de mortalidad muestra que la ma-

yor cantidad de larvas muertas por Heterorhabditis

bacteriophora HNI0100 fue entre las 24 y 144 horas

después de la infección (HDI), para Heterorhabditi

sp. SL0708 entre las 24 y 196 HDI mientras que

para las larvas infectadas por Steinernema colombiense

SNI0198 fue entre las 72 y 120 HDI y 24 y 192

HDI por Steinernema websteri JCL006 (Fig. 6).

Los síntomas presentados en la coloración

del cadáver son típicos de la infección por NE

(Fig. 7), ya que las bacterias asociadas Xenorhabdus

(Steinernema) y Photorhabdus (Heterorhabditis), presen-

tan diferencias para absorber o no colorantes, lo

que le confiere una coloración distintiva a las larvas

muertas por alguno de los dos géneros de NE

(Sáenz 2005). Además con las disecciones se

observó diferencias en el número de estados de

desarrollo encontrados de acuerdo a la especie,

para Steinernema colombiense SNI0198 y Steinernema

websteri JCL006, el ciclo del NE no se completó,

debido a que sólo ingreso un JI, mientras con Heteror-

habditis bacteriophora HNI0100 y Heterorhabditis sp.

SL0708, el ciclo del NE se completó, encontrando

J4, adultos, J1.

Se observó en el transcurso del tiempo de

evaluación, un cambio de comportamiento de

aproximadamente el 15% de las larvas, ya que estas

se pegaban a las paredes o a la tapa del vaso plástico

y no se alimentaron (Fig 8).

Los resultados del ensayo de dosis presentaron

diferencias significativas entre los tratamientos (F=

5,23; DF= 5; α= 0.05; P= 0,0002) y la mejor dosis

correspondió a 7500 JI/larva de Heterorhabditis

bacteriophora HN0100 con una mortalidad de

62.25%, seguida de 5000 y 2500 JI/larva con 35%,

mientras 1200 y 600 JI/larva solo presentaron el

31% y 34,8% de mortalidad respectivamente (Fig. 9).

Estos resultados coinciden con lo reportado por

Chen, et al (2003) y Steiner 1996 en Willmott et al.

(2002), sin embargo, en el presente trabajo aunque

á

Figura 5. Porcentaje de mortalidad de larvas de tercer instar de Delia platura expuestas a cuatro especies de nematodos entomopatógenos.

las patas son de color negro, las alas no tienen marcas,

pero si una venación oscura (Fig. 1d). Los adultos

pueden medir entre 4-5 mm de longitud (Capinera 2001).

Los adultos son de color pardo grisáceo, el macho

tiende a tener rallas en el tórax y una en la mitad

del dorso (Fig. 1c). Las hembras carecen de rallas,

á á

Nematodos entomopatógenos Los NE son efectivos controladores biológicos

de insectos plaga del suelo, debido a que este es su

hábitat natural (Georgis y Manweiler 1994;

Koppenhober 2000 en Lacey et al. 2001). Teniendo

en cuenta esto, se consideran los géneros Steinernema

y Heterorhabditis de alto potencial en el control

de insectos plaga en la horticultura (Simons

1981; Kakouli-Duarte et al. 1997 en Chen et al.

2003).

Las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae

son buenos controladores de él gorgojo de la raíz

de los cítricos (Diaprepes abbreviatus L, Coleoptera:

curcullionidae), el gorgojo negro de la vid

(Otiorhynchus sulcatus F, Coleoptera: curcullionidae),

el gusano cortador negro (Agrotis ípsilon H,

Lepidoptera: Noctuidae) en viveros y arandanos

(Lacey et al. 2001). Algunas especies de

nematodos son más efectivas contra un

insecto o grupo de insectos en particular, por

ejemplo Steinernema kushidai es eficaz contra

larvas de escarabajos (Coleópteros) y no

muy efectivos contra larvas de mariposas y

polillas (Lepidópteros) (Mamiya 1989 en

Lacey et al. 2001), Steinernema scapterisci es

buen controlador de grillos topo

(Ortópteros), pero no es eficaz contra otros

grupos de insectos (Nguyen y Smart 1991 en

Lacey et al. 2001).

Los NE se encuentran generalmente

hasta los 5cm del suelo, los JI infectan larvas

de vida libre y hábitats crípticos; la infección

se presenta a través de espacios intersegmentales y

entradas naturales (ano, espiráculos y boca),

(Fenton, et al. 2001). Dentro del insecto los JI liberan

sus bacterias asociadas, se reproducen y digieren la

hemolinfa del insecto parasitado, causándole la

muerte en aproximadamente 48 horas, proporcionando

así el alimento para los NE (Fenton et al. 2001),

(Fig. 2). Los NE permanecen dentro del insecto

por dos o tres generaciones, esto depende del

tamaño del huésped y disponibilidad de nutrientes.

Posteriormente, los JI salen del hospedero y regresan a

su ambiente natural para infectar un nuevo huésped

(Fenton et al. 2001). Los NE de los géneros Steiner-

nema y Heterorhabditis tienen alto potencial para el

control de insectos plaga en la horticultura (Simons

Figura 2. Nematodos entomopatógenos en hemolinfa de

una larva de Galleria mellonella L.

Otra característica importante de los NE es

el comportamiento de forrajeo, que puede afectar

su eficacia si no se tiene en cuenta el comportamiento

de la plaga, ya que algunas especies de NE son

emboscadoras por lo que se mantienen inmóviles

en espera de que su huésped pase cerca para

adherirse e infectarlo, como Steinernema carpocapsae y

Steinernema scapterisci (Campbell y Gaugler 1993;

Lewis et al. 1993 en Lacey et al. 2001). Otras especies

como Steinernema glaseri y Heterorhabditis bacteriophora

son cruceros por lo que se mantienen en constante

búsqueda de su huésped por lo que son más

efectivos para el control de insectos con poca

movilidad en el suelo (Lacey et al. 2001). Pero

factores como la humedad del suelo y la textura del

mismo pueden influir en la movilidad de los JI, si la

humedad es baja o por el contrario muy alta, los JI

no se pueden desplazar fácilmente (Koppenhofer

et al 1995. en Koppenhofer y Fuzy 2006).

La eficacia de los NE depende de la especie y

cantidad (dosis) de JI aplicada, así como del estado

de desarrollo de la plaga (Nielsen 2003). El hospedero

también puede reducir la eficacia de los NE, debido

a que ha desarrollado estrategias como el aseo y la

evasión para evitar ser infectados, un ejemplo de

esto es el escarabajo japonés Popillia japónica, a l

rozar su cuerpo contra los sustratos u objetos para

limpiarse los NE (Gaugler et al. 1994. en Ennis et

al. 2010). Esto conlleva a un desgaste energético

por parte del hospedero ya que incluso reduce su

alimentación para evitar ser infectado. O t r o s

estudios con gorgojos del pino Hylobius abietis,

muestran que este responde a las cepas de NE más

virulentas que a las menos virulentas (Girling et al.

2010. en Ennis et al. 2010) Por otra parte, la

mayoría de los dípteros entre ellos los del género

Delia, tienen sus aberturas naturales muy reducidas

y una cabeza que se retrae en el protórax, lo que

puede disminuir la posibilidad de rutas de infección por

parte de los NE (Coaker y Finch 1971 en Willmott et

al. 2002).

Entre las especies de la familia Anthomyiidae,

el gusano de la col (Delia radicum) es en el que más

se han realizado estudios con NE, el nivel de control

obtenido con los NE ha sido variable y no muy

confiable desde el punto de vista comercial en

contraste con la efectividad de los plaguicidas

(Bélair et al. 2005). Las familias Steinernematidae y

Heterorhabditidae en dosis altas garantizan el

contacto de los NE con el huésped, por ejemplo

en una dosis de 40000 JI por planta se controlo

entre un 40% y 50% de las larvas de tercer instar

de Delia radicum, reduciendo significativamente la

cantidad de insectos luego de las aplicaciones

(Chen et al. 2003). Por otra parte la temperatura

adecuada para que los NE sean más efectivos en el

control del último estadio larval de Delia radicum

está entre los 15°C y 20°C (Chen et al. 2003).

Otros estudios sobre la susceptibilidad de

Delia radicum a NE muestran que en campo se

necesitan dosis muy altas (64000 JI/planta) para

obtener un control económicamente efectivo

(Simser 1992; Vanninen et al. 1999 en Willmott et

al. 2002). Un ejemplo de esto es el trabajo de

Welch y Briand (1961) quienes utilizaron dosis de

45000 JI de Steinernema carpocapsae por planta, por

su parte otros trabajos con especies de los géneros

Heterorhabditis y Steinernema en dosis de 30000 JI

por planta no obtuvieron ningún control sobre

Delia radicum, debido al uso de cepas no óptimas y

factores ambientales que pueden dificultar la infección

del hospedero (Steiner 1996 en Willmott et al. 2002).

á

tiene estrategias para limpiarse y de alimenta-

ción para reducir la posibilidad de ser parasita-

do Gaugler et al. (1994) en Ennis et al. (2010).

Otra razón en la diferencia en el tiempo de

muerte de las larvas, se puede atribuir a la morfología

de estas, el NE encuentra pocas rutas de acceso, es

el caso de los dípteros como lo menciona Coaker y

Finch 1971 en Willmott et al. (2002), esto podría

explicar por que Heterorhabditis bacteriophora

HNI0100 fue la especie que produjo más muertes

a las larvas de Delia platura, ya que si la larva no se

alimentaba o tenía sus entradas naturales cerradas

o reducidas evitó ser parasitada, Heterorhabditis

bacteriophora HNI0100 tiene una estrategia de forrajeo

la dosis de JI que produjo la mayor mortalidad es

alta, está a su vez es baja comparada con la aplicada

por Steiner (1996), y produce una mortalidad con-

siderable a las larvas de Delia platura.

El tiempo de mortalidad para las diferentes

dosis de JI de Heterorhabditis bacteriophora HNI0100,

muestra que todas las dosis tuvieron un tiempo

de mortalidad similar entre las 24 y 168 HDI, sin

embargo en este rango de tiempo, murieron más

larvas con la dosis de 7500 JI/larva (Fig. 10).

Fenton et al. (2001) y Sáenz (2005) plantean que

la muerte del hospedero infectado por NE se da

a las 48 HDI, no obstante, esto puede variar

por condiciones ambientales y/o que el hospedero

á á

Figura 6. Tiempo de mortalidad de Delia platura expuestas a cuatro especies de NE en una dosis de 2500 JI/larva.

de crucero para buscar su huésped y la posibilidad

de utilizar un diente para perforar la cutícula de su

huésped e infectarlo, mientras que los Steinerne-

matidos carecen de esta estructura (Sáenz 2005).

En general los resultados obtenidos en el

presente trabajo para Heterorhabditis bacteriophora

HNI0100 son positivos, teniendo en cuenta que

los dípteros no son el huésped por excelencia de

los NE (Bélair et al. 2005) y que la mayoría de

los trabajos realizados sobre dípteros utilizan

Steinernematidos con buenos resultados, como los

trabajos realizados por Harris et al. (1995) Jagdale et

al. (2004) y Simard (2006), entre otros.

á

Figura 7. Coloración en larvas afectadas por NE

a) Larva sana, b) Heterorhabditis bacteriophora

HNI0100, c) Heterorhabditis sp. SL0708, d) Steinerne-

ma colombiense SNI0198, e) Steinernema websteri

JCL006.

Figura 8. Larvas de tercer instar de Delia platura

evitando el contacto con los NE.

á á

Figura 9. Porcentaje de mortalidad de Delia platura expuestas a cinco dosis de JI de Heterorhabdi-tis bacteriophora HNI0100.

Figura 10. Tiempo de mortalidad de larvas de tercer instar de Delia platura expuestas a cinco dosis de JI de Heterorhabditis bacteriophora HNI0100.

á

Conclusiones y Recomendaciones Los NE colombianos de los géneros

Steinernema y Heterorhabditis si pueden infectar y matar las larvas de tercer instar de Delia platura y cumplen su ciclo de vida. Además,

Heterorhabditis bacteriophora HNI0100 fue la que mostro mejores resultados de mortalidad sobre larvas de tercer instar de Delia platura, con la dosis de 7500 JI/larva.

Se recomienda realizar la cría de Delia platura

sobre tubérculos de papa criolla, dada su facilidad

de consecución y palatabilidad para las larvas que

permiten el desarrollo del ciclo de vida completo

de la mosca.

Efectuar más estudios de susceptibilidad de

larvas de Delia platura con otras especies de NE.

Evaluar bioensayos para el control de la plaga

en cultivos de espinaca aplicando la mejor dosis de

Heterorhabditis bacteriophora HNI0100 en invernadero

y campo.

Referencias Bibliográficas Bélair, G; Wright, D. J; Curto, G. 2005.

Vegetable and Tuber Crop Applications, CAB

International Pp. 257-258

Capinera, J. L. 2001. Hand book of vegetable

pests, ACADENIC PRESS U.S.A Pp 218-221

Chen S; Han X; Moens M. 2003. Biological

control of Delia radicum (Diptera: Anthomyiidae)

with entomopathogenic nematodes, Appl. Entomol.

Zool. 38 (4): 441–448.

Chen S; Han X; Moens M. 2003. Effect of

temperature on the pathogenicity of entomopathogenic

nematodes (Steinernema and Heterorhabditis spp.) to

Delia radicum, BioControl 48: 713–724

Dent, D. 2000. Insect pest management, 2nd Edi-

tion, CABI publishing New York USA. Pp 180-185.

Ennis, D. E; Dillon, A. B; Griffin, C. T. 2010.

Pine Weevils modúlate defensive in response to para-

sites of differeng virulence, Animal Behaviour 80:

283-288

Fenton, A; Norman, R; Fairbairn, J. P; Hudson,

P. J. 2001. Evaluating the Efficacy of Entomopathogenic

Nematodes for the Biological Control of Crop

Pests: A Nonequilibrium Approach, The American

naturalist, Vol. 158, No. 4

Gil, C. R; Carrillo, Q. D; Jiménez, G. J. 2007.

Determinación de las principales plagas de la

espinaca (Spinacia oleracea) en Cota, Colombia,

Revista Colombiana de Entomología 33 (2): 124-

128.

Gouinguene, S. P. D; Stadler, E. 2005. Comparison

of the sensitivity of four Delia species to host and non-host

plant compounds, Physiological Entomology 30: 62–74.

Harris, M. A; Oetting, R. D; Gardner, W. A.

my, S. B. 2006. Pathogenicity of three species of

entomopathogenic nematodes to some major

stored-product insect pests, Journal of Stored

Products Research 42 (2006) 241–252

Saenz, A. 2005. Importancia de los nematodos

entomopatógenos para el control biológico de plagas

en palma de aceite, Palmas 26: (2) 41-57

Shapiro-Ilan, D, I; Gouge, D. H; Piggott, S. J;

Fife, J. P. 2005. Application technology and

environmental considerations for use of entomopathogenic

nematodes in biological control, Biological Control

38 (2006) 124–133.

Simard, L; Bélair, G; Gosselin, M-E; Dionne, J.

2006. Virulence of entomopathogenic nematodes

(Rhabditida: Steinernematidae, Heterorhabditidae)

against Tipula paludosa (Diptera: Tipulidae), a

turfgrass pest on golf courses, Biocontrol Science

and Technology, 16(8): 789-801.

1995. Use of entomopathogenic nematodes and a

new monitoring technique for control of fungus

gnats Bradysia coprophila (Diptera: Sciaridae), in

floriculture, Biological control 5: 412-418.

Jagdale, G. B; Casey, M. L; Parwider, C;

Lindquist, R. K. 2004. Application rate and tim-

ing, potting medium, and host plant effects on

the efficacy of Steinernema feltiae against the fungus

gnat, Bradysia coprophila, in floriculture, Biologi-

cal Control 29: 296–305

Jiménez, J; Arias L. A; Fuentes, L. E; Garzón

C. 2010. Recuperación en campo y cría de Delia

platura (Diptera: Anthomyiidae) Resumenes

XXXVII Congreso Nacional de Entomología

SOCOLEN.

Koppenhofer A. M; Fuzy E. M. 2006.

Effect soil type on infectivity and persistence

of the entomophathonic nematodes Steinernema

scarabaei, Steinernema glaseri, Heterorhabditis zealandica

and Heterorhabditis bacteriophora, Journal of inverte-

brate phatology 92: 11-22

Lacey, L. A; Frutos R; Kaya, H. K; Vails, P.

2001. Insect Pathogens as Biological Control

Agents: Do They Have a Future?, Biological Con-

trol 21, 230–248.

Nielsen, O. 2003. Susceptibility of Delia radi-

cum to steinernematid nematodes, BioControl 48:

431–446.

Rodríguez, O. R; Campbell, J. F; Ramaswa-

á á

Control de la mosca de la semilla Delia platura con Steinernema sp3 JCL 027 en un cultivo comercial de espinaca

Introducción Introducción Control Biológico – Nematodos Entomopatógenos

Importancia del cultivo espinaca en Colombia

Cultivo y Manejo de la espinaca

Aspectos de la mosca de la semilla D. platura

Estudios con nematodos entompatógenos en Delia spp

Efecto de Steinernema sp3 sobre D. platura

Tiempo de aplicación de Steinernema sp3

Persistencia Steinernema sp3 Conclusión

Referencias Bibliográficas

Contenido del Capítulo

Carolina María Jaramillo1 y Adriana Sáenz Aponte2

Recientemente se han incorporado al estudio el uso de nemátodos entomopatògenos como una

alternativa para el control de diferentes especies de Delia spp (Nielsen 2003; Leger & Riga 2009; Celeita

2010). Ensayos en laboratorio han demostrado que diferentes dosis de Steinernema sp son eficientes en

un 40 a 60 % en el control de Delia radicum y Delia antiqua (especies hermanas de Delia platura). Sin

embargo, dicho control puede cambiar bajo condiciones de campo debido a que no siempre

se asegura un contacto entre el huésped y el enemigo natural. Bajo condiciones de laboratorio el contacto

entre el huésped y el enemigo natural es seguro debido a que las condiciones ambientales son óptimas y

no hay cambios comportamentales del hospedero que impidan ser parasitados (Nielsen 2003; Sáenz

2005).

1Estudiante. carolina-jaramillo@javeriana.edu.co 2 Profesor Asistente. Unidad de Ecología y Sistemática –UNESIS. Laboratorio de Control Biológico. adriana.saenz@javeriana.edu.co Pontificia Universidad Javeriana, Cra 7 N°43-82, Edificio 54, Oficina 200. Bogotá, Colombia.

El municipio de Cota, Cundinamarca es el mayor productor de

espinaca (Spinacia oleracea L.) del país, produciendo anualmente 18 toneladas

por hectárea, que corresponde a más del 60% de la producción colombiana

(Agronet, 2008). La producción anual del municipio se ve afectada por

la mosca de la semilla, Delia platura, díptero de la familia Anthomyiidae

que afecta a más de 40 tipos de hortalizas (Capinera 2001; Valenciano et

al. 2004). Los principales daños están relacionados con la deformación de

las hojas durante la germinación y emergencia de las plántulas. Las larvas

destruyen el tallo y la raíz de la plántula cuando está próxima a la

cosecha, reduciendo la producción del cultivo entre 5 -30% por año

(Gouinguené & Städler 2006; Gil et al. 2007).

En Colombia aún prevalece el uso de productos químicos combinado

con prácticas orgánicas para el control de plagas y de enfermedades en

la espinaca (Gil et al. 2007; Niño et al. 2009). Diferentes métodos se han

propuesto para el control de Delia platura, los cuales están centrados en

la generación de nuevas variedades de Spinacea oleracea más resistentes,

aplicación de diferentes combinaciones de insecticidas, esterilización de

los adultos de Delia platura entre otros (Kim et al. 2001; Valenciano et al.

2004; Ellis & Scatcherd 2007).

El control biológico es hoy en día uno de

las componentes principales en la protección de

los cultivos en todo el mundo. De acuerdo a Sáenz

(2005) y Estrada (2008) se define como la acción

de los enemigos naturales que mantienen la población

de sus huéspedes a niveles bajos, los cuales se

incrementan en ausencia de los mismos. El

control biológico según Badii et al. (2010) se puede

entender de dos formas: como un fenómeno natural

donde todas las especies cuentan con enemigos

naturales que regulan sus poblaciones y como una

estrategia de control de plagas en la cual se

involucra la intervención del hombre para

incrementar la actividad de enemigos naturales.

Como estrategia de control de plagas los enemigos

naturales pueden entenderse como toda especie

(depredadores, parasitoides, entomopatógenos)

capaz de regular la densidad de población de una

plaga y mantenerla en niveles por debajo del

umbral económico (Sáenz 2005; Badii et al. 2010)

Dentro de los enemigos naturales más

promisorios para el control de plagas debido a su

alta resistencia a los agroquímicos y a las condiciones

ambientales adversas se encuentran los nemátodos

entomopatógenos (Sáenz 2005). Los nemátodos

entomopatógenos de las familias Steinernematidae

y Heterorhabditidae son patógenos obligados,

los cuales presentan relaciones mutualistas con

bacterias de la familia Enterorbacteriaceae del ge-

nero Xenorhabdus y Photorhabdus, transportadas por

vesículas en el intestino o en el tracto intestinal

del juvenil infectivo (Estrada 2008). Los juveniles

infectivos son el estadio libre (fuera del huésped) de

los nematodos, encargados de infectar diferentes

estadios de insectos huéspedes en el suelo. Se

caracterizan por no alimentarse y conserva la cutícula

del segundo estadio para protección del medio

ambiente (Sáenz 2005).

Los juveniles infectivos de los steinernematidos

están asociados a Xenorhabdus, bacterias facultativas

gran negativas, transportadas en una vesícula en la

parte anterior del intestino (Estrada 2008). Los

juveniles infectivos pueden ingresar a través de

cualquier abertura ya sea boca, ano y espiráculos.

Una vez que han ingresado al huésped la bacteria

se propaga produciendo sustancias toxicas, las

cuales causan septicemia y posterior muerte del

individuo (Nielsen 2003; Saenz 2005; Estrada 2008).

Los nematodos se desarrollan al interior del cadáver

alimentándose de los tejidos metabolizados por las

En un cultivo los hospederos desarrollan comportamientos

para reducir su descubrimiento y penetración de

los juveniles infectivos, como alta tasa de defecación

que impide la entrada del nemátodo por el ano,

baja tasa de CO2 minimizando las señales químicas,

reduciendo las posibilidades de contacto entre

hospedero y el enemigo natural (Sáenz 2005). La

información en Colombia sobre el manejo de

á á

enfermedades y plagas en espinaca es limitada.

Buscar nuevas alternativas para el control de Delia

platura es de gran importancia. En estudios de

laboratorio en la Universidad Javeriana se ha

demostrado que Heterorhabditis bacteriophora

HNI0100 genera un control de 68% y Steinernema

sp3 JCL 027 74% de control, haciendo posible su

uso como agentes de control para ser utilizados

Control Biológico – Nematodos Entomopatógenos

bacterias, en el caso de steinernematidos se re-

quiere la entrada de dos juveniles infectivos debi-

do a que su primera generación es sexual. De acuer-

do al recurso alimenticio se pueden desarrollar entre 1 a 3

generaciones de nematodos en un mismo huésped.

á

Una vez agotado el recurso emergen nuevos juve-

niles infectivos capaces de infectar nuevos indivi-

duos (Sáenz 2005; Estrada 2008).

Importancia del cultivo espinaca en Colombia.

En Colombia la

espinaca fue introducía

por lo colonos hace

aproximadamente 30

años, convirtiéndose en

una actividad económi-

ca importante para los

municipios hortícolas

(Jimenez & Gil 2008;

Morelock & Correll

2008). La espinaca es

cultivada en regiones de

clima frío a temperaturas

de 11° a 27°C donde se

destacan como principales

produc tores l o s

departamentos de

Cundinamarca con 9.532

ton anuales, seguido de

pequeñas áreas de siembra

los departamentos de

Antioquia 624 ton, Norte de Santander 303 ton

(Fig 1)(Agronet 2010).

La Sabana de Bogotá se destaca por ser el

mayor abastecedor local y regional de hortalizas

del país, debido a sus excelentes características

edafoclimaticas que permiten el establecimiento

de cultivos de alta calidad (Jimenez & Gil 2008).

Dentro de la producción hortícola de la Sabana,

la espinaca es uno de los cultivos

más importantes con 139.79 ha

sembradas anuales lo que

representa el 8.24% del país. Los

municipios reconocidos en la

región por la vocación hortícola

son Bojacá, Cajicá, Cota. Facatativa,

Funza, Madrid, Mosquera, Sibaté

y Soacha (DANE 2002; Chaverra

& Walteros 2004).

El cultivo de espinaca (Spinacia oleracea L.)

tiene una representación económica y social

importante para la región. En la Sabana el mayor

crecimiento lo presentan los municipios de Cota, se-

guido de Soacha y Chía (Fig 2). En el municipio de

Cota el cultivo de espinaca se ha convertido en su

F i g 1 . P r i n c i p a l e s departamentos productores de espinaca del país. Tomado de Agronet (2010).

Fig 2. Principales municipios productores de espinaca de la Sabana de Bogotá. Tomado de Agronet (20119

principal actividad agropecuaria de la cual

dependen más de 300 familias de productores

medianos y pequeños. Anualmente se siembran

140 ha con un rendimiento de 18ton/ha lo que

á á

corresponde a más del 77.8% de la producción del

país. La demanda al interior del país aumenta

volviéndolo un cultivo promisorio para el futuro

(Jimenez & Gil 2008).

Cultivo y Manejo de la espinaca. En Colombia la espinaca es cultivada en

regiones de clima frío a temperaturas de 11°

a 27°C, donde se destacan como principales

productores los departamentos de Cundinamarca

con 4.029 ton anuales (Jimenez & Gil 2008;

Morelock & Correll 2008). El cultivo de espinaca

(Spinacia oleracea L.) tiene una representación

económica y social importante en la Sabana de

Bogotá destacándose por ser el mayor abastecedor

local y regional de hortalizas del país. En la

Sabana el mayor crecimiento lo presenta el

municipio de Cota con 68%. En Cota, el cultivo

de espinaca se ha convertido en su principal

actividad agropecuaria de la cual dependen más de

300 familias de medianos y pequeños productores.

Anualmente s e s i embran 140 ha con un

rendimiento de 18ton/ha lo que corresponde a

más del 77.8% de la producción del país. La demanda

al interior del país aumenta volviéndolo un cultivo

promisorio para el futuro (Jiménez & Gil 2008).

El cultivo de espinaca se maneja con

métodos convencionales y alta mano de obra

debido a la falta de tecnificación. En Cota la

preparación del suelo se hace mediante arado

en disco y dos rastrillas para obtener terrenos

esponjosos, nivelados, al cual se le incorpora ma-

teria orgánica. Generalmente se aplica estiércol de

gallina (Gallinaza) como fuente orgánica de nitró-

geno, potasio y fosforo en dosis de 1 a 1.5 ton/

hectárea, ya que en climas fríos dichos nutrientes

son deficientes (Gil et al. 2007). Adicionalmente se

aplican fertilizantes foliares con alto contenido

de nitrógeno, favoreciendo en un 90% el porcentaje

foliar de cada planta de espinaca (CCI 2006).

Las semillas se siembra (18 kg/ ha), al

voleo en camas de 1.7m de ancho, separadas

cada una 25m, logrando así una densidad de 32

plantas /m2 es decir aproximadamente 400.000

plantas/ha (CCI 2006). La espinaca hibrida

sembrada en el municipio pertenece a la variedad

quinto, caracterizada por sus hojas lanceolada

grande de ciclo largo, su resistencia a mildeo raza

1-4 y su alto rendimiento en campo del cual se

pueden obtener 18 toneladas por hectárea anuales

(Gil et al. 2007).

En cuanto al control fitosanitario en el

municipio aún prevalece como principal méto-

do de manejo el uso de productos químicos

(79%), siendo los más usados los derivados de

organosulfurados (Tetradifon), Carbamatos

(Carbofuran), órganofosforados (clorpifidos,

Profenofos, metamidofos) y los piretroides

(Deltametrina) (Gil et al. 2007). Mientras que en un

18.55% combinan prácticas químicas /orgánicas

y sólo el 0.67% emplean prácticas orgánicas

(DANE 2002; CCI 2006; Agronet 2008).

Dichos insecticidas se aplican de manera

conjunta más de 6 veces en un cultivo de un ciclo

de 55 días. Al ser el método más utilizado, la

resistencia al insecticida por parte de la plaga ha ido

á

Mosca de la semilla Delia platura. Delia platura es una plaga importante con una

amplia distribución geográfica. Fue reportada por

primera vez en Estados Unidos distribuyéndose así

por todo el Sur –Norte de América y Europa

(Morelock & Correll 2008). La mosca de la

semilla es un díptero pequeño de la familia

Anthomyiidae. Cosmopolita que afecta a más de

40 plantas diferentes entre las cuales se encuentra

una gran variedad de hortalizas como espinaca,

alcachofa, remolacha, coles de brúcelas, repollo,

entre otras (Darvas & Szappanos 2003; Valenciano et

al. 2004). La larva de la mosca ataca durante la

germinación, reduciendo la emergencia de los

cotiledones, causando grandes pérdidas económicas a

los productores (Willmott et al. 2002; Gil et al. 2007).

El ciclo de vida de Delia platura esta

sincronizado con el periodo de siembra y

germinación de las plántulas de espinaca y puede

durar alrededor de 22 días. Las hembras (Fig 3a)

se ven atraídas por la materia orgánica y humedad

del suelo, ovipositando aproximadamente 100

huevos en el suelo cerca de las semillas recién

sembradas (Capinera 2001; Gouinguené & Städler

2006). Dependiendo de la temperatura se puede

demorar la eclosión. A temperaturas entre 5-7°

C la eclosión puede darse entre 7 a 9 días

mientras que a temperaturas de 15-28°C es de 2 a 3

días (Capinera 2001). Los huevos eclosionan y las

larvas penetran la testa cuando ésta se en-

cuentra dividida. A medida que las larvas (Fig

3b) minan, las raíces y tallos de la

planta presentan pudrición, la cual

viene acompañada de enfermedades

causadas por microorganismos del suelo

como hongos. Las plántulas se tornan

amarillas y mueren (Vea et al. 1975).

Mientras más largo sea el periodo

entre la siembra y germinación de las

plantas, mayor será la predisposición a

ataques severos. Ataques masivos in-

hiben por completo la germinación

(Valenciano et al. 2004).

Las larvas de D. platura presenta

tres instares, los cuales se pue-

den diferenciar dependiendo de su

cambiando con el tiempo, desarrollando resistencia al

insecticida. Al ser la plaga resistente a los productos

químicos, los agricultores se han visto en la obligación

de incrementar la dosis de aplicación y realizar

mezclas con más de dos insecticidas para una misma

aplicación (Valenciano et al. 2004; Ellis & Scat-

cherd 2006; Gil et al. 2007).

Fig. 3. Delia platura, Mosca de la semilla. A. Adulto B. Larva tercer

instar. C. Espiráculos caudales. D. pupa. Tomado de Capínera (2007)

longitud, presentando longitudes de 0.44, 0.80 a

1.24 mm respectivamente. Las larvas son blancas

y en la boca presentan ganchos negros (Capinera

2001). Detrás de la cabeza presentan espiráculos

parduscos (Fig 3c), divididos en aproximadamente

12 lóbulos. Las larvas se alimentan externamente e

á á

internamente de las raíces, tallos (1- 2 instar) y

cogollo (3 instar). Su desarrollo generalmente está

condicionado por las condiciones ambientales.

En condiciones de frio y cortos fotoperiodos

las larvas cortan el tiempo pasando a pupa (Fig

3d). En condiciones normales requieren de 18 a 22

Estudios con nematodos entompatógenos en Delia spp. Como una alternativa innovadora se han

incorporado a los estudios el uso de nemátodos

en tomopatógenos pa ra e l con t ro l de

diferentes especies de Delia spp, siendo la

especie más estudiadas D. radicum (plaga de cultivos

de Brassica). La susceptibilidad de Delia

radicum a nemátodos entomopatógenos

se ha estudiado desde 1989. Bracken

(1990) investigó la mortalidad de

larvas de p r imer in s t a r y

encontraron que las larvas son

susceptibles a medida que aumenta

el número de nemátodos pero la mortalidad no

excede del 40% en ninguna de las cepas estudiadas

(Steinernema sp & Heterorhabditis sp) (Nielsen 2003;

Leger & Riga 2009). Experimentos en campo con

larvas de primer instar en las cuales se les permitió

minar plantas de colinabo, la susceptibilidad a

nematodos entomopatógenos disminuyó

significativamente; de esta manera el éxito de los

estudios está dado por las condiciones experimen-

tales (Royer et al. 1996).

Estudios en cultivos de coliflor en el 2002

demostraron una vez más la susceptibilidad de D.

radicum a Steinernema sp y Herterorhabditis sp, sien-

do Steinernema affine la especie que ocasionó una

mortalidad de 46% en las larvas, seguido de S. feltiae,

contrario a las especies de Heterorhabditis sp las cuales

no generan ningún control (Wilmott et al. 2002).

En el 2003 se estudió la susceptibilidad de D.

radicum en todos sus estadios larvales a

especies de nematodos entomopatógenos del

género Steinernema sp del cual se

concluyó que la especie más eficiente

(46%) en el control de la plaga fue

S. feltiae, debido a la capacidad de

búsqueda que tiene el nematodo

(Nielsen 2003). Encontrando que en

el tercer instar larval es donde S.

feltiae ocasiona una mayor mortalidad (60%)

el tercer instar , debido al tamaño de la larva,

facilitando la entrada del nematodo y (Nielsen

2003).

Leger en el 2009, comprobó dichos resultados

en un cultivo de repollo en invernadero

determinando que la concentración óptima es de

invernadero las cuales se ven favorecidas con la

apli300 juveniles infectivos/larva para que se presente

un 30% de mortalidad bajo condiciones de cación de

extractos de caléndula , aumentando la mortalidad

en un 96%. Estudios recientes con D. platura

demostraron que las larvas de tercer instar son

susceptibles a Heterorhabditis bacteriophora HNI0100

en un 63% y a Steinernema sp3 JCL 027 en un 74%

Todos los estadíos larvales de D. radicum son susceptibles a S. feltiae, debido a la capacidad

de búsqueda que tiene el nematodo (Nielsen 2003).

á

Durante los meses de febrero – Abril se

llevó a cabo la aplicación de Steinernema sp3

JCL027, en la finca Alcalá Cota, Cundinamarca. El

lote de estudio de 0.5 ha (Fig 4), ubicado

a una altura de 2578 ± 7 m.s.n.m, se di-

vidió en camas de 1.7m de acho, en

los cuales se sembraron 18kg de

espinaca variedad Quinto por me-

tro cuadrado. Las plantas fueron

inoculadas con 500, 1000, 2000,

4000 y 8000 JIs/planta. Para cada

aplicación se utilizaron juveniles infectivos

de una semana de cosechados, los cuales

se obtuvieron mediante el cultivo in vivo de

Steinernema sp3 JCL027 utilizando la polilla mayor de

las colmenas Galleria mellonella (Fig 5). Así mismo se

tuvo en cuenta dos controles:

un absoluto (agua) y un relativo

(con insecticida usado por el

agricultor, Monitor, insecticida

de amplio espectro usado más

de tres veces en el cultivo). Para

un total de siete tratamientos

con 15 plantas cada uno, organizados

en un diseño de bloques al

azar.

La aplicación de Steinernema sp3

JCL027 durante todo el ciclo del

cultivo disminuye notoriamente

los daños de D. platura en las

plantas superando el control

químico (Fig 6). Los daños más altos

(67%) se encontraron

en el control

químico, el cual

se comporta

Efecto de Steinernema sp3 JCL027 sobre Delia platura

Fig. 4. Lote de estudio en la finca Alcalá, Cota, Cundinamarca.

Fig. 5. Cultivo in vivo

de Steinernema sp3 JCL027.

A. Trampas White modificadas

obtención de JIs B. larvas Galleria

mellonella infectadas con Steinernema sp3 JCL027.

de manera similar que el control con agua, debido

a que no hay un control significativo de la plaga

que reduzca los daños en un 40 a 50%. Willmont

et al. (2002) y Valenciano et al. (2004) atribuyen

este fenómeno probablemente a la resistencia que

ha generado la plaga al uso continuo de químicos

para su control. Al ser la plaga resistente a los

productos químicos, los agricultores se han visto

en la obligación de aumentar la dosis de aplicación e

inclusive utilizar productos de amplio espectro no

específicos para D. platura, con el fin de obtener al

menos un control mínimo (< 30%) de la plaga

(Valenciano et al. 2004; Ellis and Scatcherd 2007).

Contrario a lo que sucede con la aplicación

de nematodos entomopatógenos, Steinernema sp3

JCL027 (Fig 6). A partir de las dosis de 4000 y

8000 JIs /planta durante las tres aplicaciones, se

observa una reducción del 40-50% de los daños

á á

nuevos. Las plantas no presentaron daños en el

cogollo, son más frondosas, grandes y sus raíces

se encuentran completamente sanas. Comparado

con dosis inferiores a 2000JIs/planta donde la

reducción nueva es similar al control químico, las

plantas son pequeñas y presentan una reducción

en las hojas.

Un éxito limitado se ha logrado con los

nematodos entomopatógenos, para el control de pla-

gas en campo, debido a la temperatura del suelo,

actividad del nematodo e invasión del huésped

(Steiner, 1996). Por ello Estudios de susceptibili-

dad en poblaciones de Delia spp, sugieren usar

dosis altas de juveniles infectivos, para encontrar

un grado de éxito (≥30%) en el control de la plaga

(Simser, 1992). Willmont et al. (2002) sugieren con-

centraciones iguales o superiores a 1.6X104 JIs/

planta para lograr un control significativo de la

Fig. 6. Daños ocasionados por D. platura en la espinaca en cada una de los tratamientos durante las

tres etapas fenológicas del cultivo (Error estándar para la diferencia entre tratamientos).

plaga. En estudios recientes con Steinernema

feltiae sugieren concentraciones de 30.000JIs /

planta, reduciendo en 30% la plaga en el cultivo

(Leger y Riga, 2009). Sin embargo, aplicando

4000JIs/planta (=30JIs/cm2) y 8000 JIs/planta

(=60JIs/cm2) de Steinernema sp3 JCL 027, la re-

ducción de los daños es significativa (40 – 50%).

Dicho control puede estar explicado por la alta

patogenicidad, capacidad de búsqueda de los ne-

matodos pero en especial, por su adaptación a

las condiciones del suelo como textura y hume-

dad, relevantes para su supervivencia (Simser,

1992; Chen et al. 2003). Factores como la hume-

dad, se mantuvieron durante todo el ciclo del

cultivo, debido al riego y lluvias periódicas que

facilitaron la adaptación de Steinernema sp3 JCL 027

en el suelo y el éxito de los mismos.

á

Estudios de susceptibilidad en poblacio-

nes de Delia spp llevados a cabo en campo,

no tienen en cuenta las etapas fenológicas para

la aplicación de los nematodos (Simser, 1992; Chen

et al. 2003). Por ello, sugieren llevar a cabo dos

aplicaciones continuas de acuerdo a la detección

de plaga (Choo et al, 1988; Chen et al. 2003), para

encontrar un éxito del 30% (Chen et al. 2003).

Contrario a la mayoría de los estudios, en este

se tuvo en cuenta las etapas fenológicas para la

aplicación del nematodo entomopatógeno, Steinernema

sp3 JCL027. Para

ello se dividió el

cultivo de espina-

ca en tres etapas

siguiendo la escala

BBCH (código unifor-

me de estados de creci-

miento), propuesto

por Gil et al. (2007)

(Fig 7). La pri-

mera, germina-

ción: comprendió

desde la siembra

hasta tres hojas verdaderas (00-13 BBCH). La

segunda, desarrollo: desde la aparición de 4 hojas

verdaderas hasta el desarrollado de la roseta

foliar en un 70% de diámetro esperado (14-37

BBCH). La tercera, cosecha: comprendió desarrollo

de la roseta foliar con 70% de diámetro hasta su

desarrollo completo (38-39 BBCH). En cada una de

las etapas se aplicaron las dosis de los juveniles

infectivos.

Desde la primera aplicación con Steinernema

sp3 JCL027, se logró reducir entre un 40- 50% los

Tiempo de aplicación de Steinernema sp3 JCL027

Fig. 7. Etapas fenológicas del cultivo de espinaca. A. Etapa 1: Germinación (00-13

BBCH). B. Etapa 2: Desarrollo (14-37 BBCH). C. Etapa 3: Cosecha (38-39

daños en las plantas (Fig 8); siendo en la primera

y última etapa donde más se presentó la plaga,

encontrando de 1 a 2 individuos por planta. La

presencia de D. platura durante las tres etapas fue

completamente diferente, presentándose daños

distintivos en cada una de ellas. Durante la etapa

de germinación (Fig 9,10) las plantas presentaron

un tamaño relativamente pequeño en el cual los

individuos de D. platura no se encontraron en la

superficie de la planta (cogollo – hojas) sino en su

interior (raíz – tallo); siendo imposible llevar un

registro del número de individuos por plántulas. Sin embargo

se observaron plantas relativamente pequeñas con

ausencia de brotes (Fig 9d), reducción del número

de hojas verdaderas (Fig 9b) y deterioro en el

cogollo (Fig 9a), presentando un crecimiento lento

(Fig 9d).

á á

En la segunda etapa desarrollo (Fig 11,12) las

plantas presentaban de 1 a 3 adultos/planta. Se

observaron plantas muertas (Fig 11c), plantas con

un número reducido de hojas verdaderas (Fig 11b),

tamaños pequeños, presentando crecimiento lento

(Fig 11a). En la última etapa cosecha (Fig 13), las

plantas ya presentaban el 70% de su roseta fo-

liar desarrollada (Fig 14), encontrándose de 1 a

2 larvas tercer instar (Fig 13e) y pupas en los

cogollos y suelo de las plántulas, ratificando la

presencia de D. platura en campo. Al finalizar se

observaron plantas con el cogollo deteriorado (Fig

13a, b), las raíces de la mayoría de plantas minadas

(1 mina/planta)(Fig 13f), reducción en las hojas

verdaderas y longitud relativamente pequeña. La

reducción en las hojas verdaderas es un daño

característico de D. platura, las cuales al comparar

Fig. 8. Daños ocasionados por D. platura en la espinaca en cada una de los tratamientos durante las

tres etapas fenológicas del cultivo, después de las tres aplicaciones de Steinernema sp3 JCL027 (Error están-

con plántulas sanas (mayor de 20 hojas),

se observó que presentaban menos de

diez hojas verdaderas viables en dosis de

Steinernema sp3 JCL027donde la reducción

en los daños no fue significativa.

La presencia de los daños oca-

sionados por D. platura durante las

tres etapas fenológicas del cultivo fue

completamente diferente. Gil et al. (2007)

atribuye este fenómeno a la estimulación

en la oviposición al tener contacto con la gallinaza.

La oviposición de D. platura está influenciada por

la acción de microorganismos involucra-

dos en procesos de descomposición y se

estimula con la aplicación de fertilizantes

orgánicos (Goldstein and Bassler, 1988;

Gounguené and Ständler, 2006). Al inicio

del cultivo, la incorporación al suelo de

gallinaza en altas cantidades permitió el

establecimiento de la plaga durante la etapa de

germinación. En la segunda etapa (desarrollo), la

remoción del suelo es un proceso característico

durante la deshierba; dicho movimiento genera

un estímulo atractivo en las moscas para la oviposición

de los huevos en el suelo con o sin la presencia de

la planta (Goldstein, 1987), permitiendo la alta

persistencia de la plaga durante la etapa

cosecha.

La etapa fenológica de desarrollo de las hojas

(segunda etapa) es fundamental para la recuperación

de los daños, debido a la mínima presencia de D.

platura. En ataques bajos (un individuo /

planta) de D. platura las plantas pueden

recuperarse por completo del ataque (Capinera,

2001). Funderburk and Pedigo (1983) encontraron

á

Figura 9. Daños presentes en las espinacas durante la etapa de germinación. A. Cogollo deteriorado. B. Ausencia hojas ver-daderas. C. Ausencia brotes. D. no crecimiento de las plántulas

Figura 10. Planta de espinaca con cinco hojas verdaderas, brotes nuevos, cogollo sano

á á

Figura 12. Planta de espinaca con más de 10 hojas verdaderas, brotes nuevos y cogollo sano.

Figura 11. Daños presentes en las espinacas durante la etapa desa-rrollo. A y B. Plantas recuperadas. C. Planta muerta. D. Cogollo deteriorado

Figura 13. Daños en las espinacas durante la etapa de cosecha. a.b.c.d. Daño en el cogollo. e. Larva dañando el cogollo. f. Raíz minada

Figura 14. Planta de espinaca con más de 20 hojas verdaderas, cogollo sano y brotes nuevo.

á

Fig. 15. Proceso de recuperación de las plantas de espinaca. A y B. plantas con daño apical durante la etapa de germinación. C. plantas recuperadas, desarrollo lateral. D. resultado de las plantas durante la etapa de cosecha. E. plantas recuperadas. f. plantas sanas.

que las plantas de frijol se recuperaban a ataques de

D. platura, disminuyendo el número de vainas por

planta e incrementando el número de granos en

las mismas. Las plantas de espinaca se recuperan

del daño, reduciendo el número de brotes e

inhibiendo el crecimiento apical, pero desarrollan

el crecimiento lateral de sus hojas verdaderas

(Goldstein and Hess, 1984; Nielsen and Orcutt

2000). Al desarrollar el crecimiento lateral, el número

de hojas verdaderas se mantiene y su longitud es

relativamente inferior a 30cm debido a que no hay

desarrollo de brotes (Retuerto et al. 2003). Son

á á

plantas que mantienen durante la segunda etapa

hasta la cosecha, el mismo número de hojas y su

tamaño es pequeño a lo que se espera de una planta

sana (Fig 15)

Persistencia Steinernema sp3 JCL 027 en el Cultivo. Muchos factores abióticos pueden afectar

la ocurrencia y la persistencia de los nematodos,

tales como factores naturales y químicos, los cuales

resultan de las actividades humanas (Stuart et al.

2006). Estudios en campo evidencian que la

mayoría de los nematodos recuperados del suelo

se reducen rápidamente en un periodo corto de

aplicación (Griffin et al. 2005). Después de las tres

aplicaciones de Steinernema sp3 JCL027 al cultivo

de espinaca, se logra encontrar el 10 al 20% de

las dosis totales. Encontrando que el número de

juveniles infectivos varía de acuerdo a las dosis

aplicadas. A partir de las dosis de 4000 y 8000

JIs/planta, se recuperan del suelo en promedio

de 800 a 1600 JIs/ planta. En dosis inferiores a

2000 JIs/planta, el número de juveniles infectivos

es menor (50 a 100 JIs/planta).

El hecho no de no encontrar más del 20%

de JI en el sustrato, se debe al ambiente hostil del

sustrato en el cual los juveniles infectivos llegan a

experimentar condiciones de estrés como

deshidratación, depredación, enfermedades entre

otras (Griffin et al. 2005). La textura y la humedad

del suelo juegan un papel importante en la persistencia

de los Juveniles infectivos en el cultivo. Por un

lado, la textura del suelo determina en gran medida

el movimiento del agua, aire y presencia del

organismo (Stuart et al. 2006). En el caso de los

NEPs el movimiento esta limitado por el tamaño

del poro, en suelos con poros restrictivos (suelos

pesados, muy compactos) el movimiento es más

restringido que en suelos con una estructura más

porosa, como la incorporación de materia orgánica

al suelo (Kung et al. 1990; Barbercheck 1992). Sin duda

la humedad es el factor más crítico que afecta a los

nematodos en el suelo. Los NEPs requieren

películas de agua de un espesor suficiente y

continuidad para permitir el movimiento

(Shapiro Ilan et al. 2002). En suelos muy húmedos o

saturados el oxígeno puede limitar el movimiento

y los nematodos se pueden restringir debido a la

falta de tensión superficial, afectando la virulencia de

los nematodos (Shapiro et al. 2000; Shapiro Ilan et

al. 2002; Stuart et al. 2006).

En la agricultura la condición de la superficie

después de la aplicación y la intensidad de labranza,

entendida como la remoción del suelo, son factores

influyentes para la persistencia de los JI en campo

(Gaugler et al. 1997; Susurluk and Ehlers 2008).

La labranza es perjudicial tanto para el medio

ambiente del suelo como para la persistencia de los

NEPs. Bajo labranzas continuas, la superficie del

suelo tiende a tener mayor fluctuación en la

temperatura y humedad (Stinner et al. 1988). Los

nemátodos a menudo son más frecuentes en los

regímenes de menos labranza debido a que las

condiciones del suelo se mantienen estables en

cuanto a humedad y temperatura (Susurluk and

Ehlers 2008). La actividad de labranza más utilizada

en los cultivos de espinaca es el deshierbe durante

la segunda etapa fenológica, en el cual se genera

una gran remoción de tierra lo cual pudo influir

en la persistencia de los nematodos al finalizar el

estudio.

á

Conclusión Con la creciente preocupación ambiental

sobre el uso de agroquímicos, los nematodos

entomopatógenos son agentes de control alternativo.

El uso de Steinernema sp3 JCL 027 es una alternativa

innovadora para control de Delia platura, reduce

los daños en las plantas de espinaca a un nivel aceptable

para los productores de Cota, Cundinamarca.

Además, permitiría diseñar estrategias de manejo

integrado efectivas en campo que posiblemente

disminuirían la aplicación de agroquímicos; igualmente

estimularía a los agricultores a incrementar el

empleo de controladores biológicos y el uso

racional y seguro de productos químicos en los

cultivos de espinaca .

Los retos en el cultivo de espinaca son diversos,

esto incluye estudios más detallados sobre el

control que ejerce Steinernema sp3 JCL027 en campo,

métodos de aplicación del nematodo, probar otras

especies de nematodos que tengan potencial para

el control de la mosca de la semilla y puedan ser

aplicados en mezcla con Steinernema sp3 JCL027,

mejorando así la eficiencia del control, evaluar los

costó de la utilización de nematodos entomopatógenos

en el cultivo. Así mismo, realizar trabajos con los

agricultores de espinaca para incentivar la utilización

de este agente controlador y diseñar un plan de

manejo integrado para el control de D. platura en

Colombia.

Referencias Bibliográficas AGRONET. 2008. Ministerio de Agricultura

y Desarrollo Rural. Anuario estadístico de Frutas y

Hortalizas 2004 - 2008. http:// www.agronet.gov.

docs_agronet/20101715620_AnuarioEstadistico

defrutas yhortalizas2004-2008.pdf. Fecha de última

revisión: [20 de agosto de 2010].

AGRONET. 2010. Análisis estadísticos.

Principales productores de espinaca del país.

http://www.agronet.gov.co/agronetweb/

AnalisisEstadisticas/tabid/73/Default.aspx. Fecha

ultima revisión: [20 agosto de 2010].

BADII.D; CERNA E; LANDEROS J. 2010.

Enemigos Naturales: nociones etológicas. International

Journal of Good Consciense. 5(2): 256-260.

BARBERCHECK, M.E., 1992. Tritrophic

level effects on entomopathogenic nematodes.

Environ. Entomol. 22, 1166–1171.

BRACKEN G.K. 1990. Susceptibility of first

instar cabbage maggot, Delia radicum (Anthomyiidae:

Diptera), to strains of the entomogenous nematodes

Steinernema feltiae, S,bibionis(Bovien), Heterorhabditis

bacteriophora Poinar and H. heliothidis. Canadian

Entomologist, 122: 633-639.

CAPINERA, J. L. Order Diptera, Flies and

maggots. En: John L. Capinera (Ed.). Handbook

of vegetable pests. San Diego. 2001; 197-242.

CELEITA J. Susceptibilidad de Delia platura

(Meigen, 1826) (Diptera: Anthomyiidae) a Steinerne-

ma spp y Heterorhabditis spp. Trabajo de Grado de

Pregrado. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad

Javeriana, 2010, 42P.

CHEN S; HAN X; & MOENS M. 2003.

Biological control of Delia radicum (Dipetera:

Anthomyiidae) with entomopathogenic

nematodes. Appl. Entomology. Zoology. 38(4):

441-448

CORPORACION COLOMBIANA

INTERNACIONAL (CCI). 2006. Espinaca. En:

Plan Horticola Nacional.Corporacion Colombiana

Internacional, Bogotá. 359-372

DARVAS B; SZAPPANOS A. 2003. Male

and female morphology of some central European

Delia (Anthomyiidae) pests. Acta Zoologica

Academiae Scientiarum Hungaricae, 49(2): 87-101.

DEPARTAMENTO ADMINISTRATIVO

NACIONAL DE ESTADÍSTICA DANE.2002.

Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural.

Censo Hortícola. Sabana de Bogotá. http://

www.dane.gov.co/files/investigaciones/

agropecuario/ena/

Censo_Horticola_Bta_2002.pdf.Fecha de última

revisión: 20 agostos de 2010

ELLIS S. A; SCATCHERD J.E. 2007. Bean

seed fly (Delia platura, Delia florilega) and onion fly

(Delia antiqua) incidence in England and an evaluation

of chemical and biological control options. Annals

of Applied Biology, 151(2): 259-267.

ESTRADA I. 2008. Generalidades. En:

Estrada I (Ed). Control Biológico. Universidad de

Antioquia. Medellin. Colombia. 2008; 1-3.

FUNDERBURK, J. E., PEDIGO, L.

P., BERRY, E. C. 1983 Seedcorn Maggot

(Diptera:Anthomyiidae) Emergence in

Conventional and Reduced-Tillage Soybean

Systems in Iowa. Journal of Economic Entomology

76(1):131-134.

GAUGLER R; LEWIS E; STUART J.R.

1997. Ecology in the Service of Biological Control:

The Case of Entomopathogenic Nematodes.

Oecologia 109(4): 483-489.

GIL C. R; CARRILLO Q. D; JIMENEZ G.

á á

J. 2007. Determinación de las principales plagas de

la espinaca (Spinacia oleracea) en cota, Colombia.

Revista Colombiana De Entomología, 33(2): 124-

128.

GOLDSTEIN H.A.J; BASSLER A.M. 1988.

Effects of bacteria on oviposition by seedcorn

maggots (Dipetera: Anthomyiidae). Enviromental

Entomology, 17(1): 7-12.

GOLDSTEIN H.J; HESS K.A. 1984. Seedcorn

maggot (Diptera: Anthomyiidae) infestation levels

and effects on five crops. Enviromental Entomology

13: 962 -965.

GOUINGUENÉ S.P; STÄDLER E. 2006.

Oviposition in Delia platura (Diptera, anthomyiidae):

The role of volatile and contact cues of bean. Journal

of Chemical Ecology, 32(7): 1399-1413.

GRIFFIN, C.T; BOEMARE, N.E; LEWIS,

E.E. Biology and Bahaviour. En: Grewal, P.S;

Ehlers, R.U. Shapiro -Ilan D.I (Eds). Nematodes

as Biocontrol Agents. USA, 2005;47-64.

JIMÉNEZ J; GIL R. 2008 Investigación

Sobre Espinaca, Elemento Integrador CIAA-

Departamento de Ingeneria de Alimentos de la

UJTL. Aliméntica 4, 20-30.

KIM H. S; CHO J. R; KIM J.J; LEE M;

BYUN M.W. 2001. Optimal radiation dose of

Cobalt60 to improve the sterile insect technique

for Delia antiqua and Delia platura . Journal

of Asia-Pacific Entomology, 4(1): 11-16.

KUNG, S.P., GAUGLER, R., KAYA, H.K.,

1990. Soil type and entomopathogenic nematode

persistence. J. Invertebr. Pathol. 55, 401–406.

LEGER C; RIGA E. 2009. Evaluation of

marigolds and entomopathogenic nematodes for

control of the cabbage maggot Delia radicum.

Journal of Sustainable Agriculture, 33(2): 128-141.

MORELOCK T.E; CORRELL C.J. Spinach. En:

J.Progens & F.Nuez (eds), Handbook of Plant

Breeding: Vegetables. Springerlink. España. 2008;

189-218

NIELSEN O. 2003. Susceptibility of Delia

radicum to steinernematid nematodes. Biocontrol,

48(4): 431-446.

NIELSEN T.E; ORCUTT M.D. Chapter 7:

Herbivory and plant stress. En Nielsen T.E;

Orcutt M.D (Eds). The physiology of plant under

stress: soil and biotic factors. Permreq. Canada.

2000; 264-277.

NIÑO N. E; ESPINOSA B.L; GIL R.;

MENZA G; JIMENEZ J. A. 2009. Enfermedades

de la espinaca (Spinacia oleracea L.) en Cota

(Cundinamarca) y manejo del mildeo velloso

(Peronospora farinosa, Byford). Revista Colombiana

de Ciencias Horticolas, 3(2): 161-174.

REALPE A.F.J; BUSTILLO P.A.E; LOPEZ J.C.

2007. Optimización de la cría de Galleria mellonella(L) para

la producción de nematodos entomopatògenos

parasitados de la broca del cafè. Cenicafè 58(2):

142-157.

RETUERTO R; RODRIGUEZ R;

FERNANDEZ S.S; OBESO J.R. 2003. Respuesta

compensatoria de plantas en situaciones de estrés.

Cientifica y Tecnica de Ecologia y Medio

Ambiente 1: 1-7.

ROYER L; BELAIR G; FOURNIER Y.

1996. Attractiveness of cabbage maggot

(Diptera:Anthomyiidae) to entomopathogenic

Steinernematid nematodes. Journal of Economic

Entomology 89: 614-620.

SAENZ, A.A. 2005. Importancia de los

nematodos entomopatógenos para el control

biológico de palma aceite. Palma. 5(26):41-57.

SHAPIRO, D.I., MCCOY, C.W., FARES,

A., OBREZA, T., DOU, H.2000. Effects of soil

type on virulence and persistence of entomopathogenic

nematodes in relation to control of Diaprepes

abbreviatus. Environ. Entomol. 29, 1083–1087.

SHAPIRO-ILAN, D.I., GOUGE, D.H.,

KOPPENHO¨ FER, A.M. 2002. Factors affecting

commercial success: case studies in cotton, turf

and citrus. In: Gaugler, R. (Ed.), Entomopathgenic

Nematology. CABI, Wallingford, UK, pp. 333–

355.

SIMSER D. 1992. Field application of

entomopathogenic nematodes for control of Delia

radicum in Collards. Journal of Nematology 24(3):

374-378.

STEINER ,W.A. 1996. Dispersal and host

finding ability of entomopathogenic nematodes at

low temperatures. Nematologica 42, 243-261.

STINNER, B.R; MCCARTNEY, D.A; VAN

DOREN JR., D.M. 1988. Soil and foliage

arthropod communities in conventional, reduced

and no-tillage corn (maize, Zea mays L.) systems: a

comparison after 20 years of continuous cropping.

Soil Tillage Res. 11, 147–158.

STUART, R.J; BARBECHECK, E.M;

PARWINDER, S.G; TAYLOR, A.L.R; HOY,W.C.

2006. Population biology of entomopathogenic nema-

todes: Concepts, issues and models. Biological

Control 38, 80-102.

SUSURLUK, A; EHLERS R.U. 2008. Field

persistence of the entomopathogenic nematode

Heterorhabditis bacteriophora in different crops.

BioControl 53: 627-641.

VALENCIANO J. B; CASQUERO P. A;

BOTO J. A. 2004. Evaluation of the occurrence

of bean plants (Phaseolus vulgaris L.) affected by

bean seed fly, Delia platura (Meigen), grown under

different sowing techniques and with different forms

of pesticide application. Field Crops Research, 85(2-

3): 103-109.

VEA V.E; WEBB D.R; ECKENRODE C.J.

1975. Seed corn maggot injury. Plant Sciences 8: 1-

3.

WILLMOTT D. M; HART A. J; LONG

S.J; RICHARDSON P. N; CHANDLER D.

2002. Susceptibility of cabbage root fly Delia radicum,

in potted cauliflower (brassica oleracea var. botrytis)

to isolates of entomopathogenic nematodes

(Steinernema and Heterorhabditis spp.) indigenous to

the UK. Nematology, 4(8): 965-970.

á

Control del picudo de la guayaba Conotrachelus psidii Marshall (Coleoptera: Curculionidae) con nematodos entomopatógenos en Colombia.

Introducción

Introducción

El cultivo de guayaba

El Picudo de la Guayaba Conotrachelus psidii Marshall (Coleoptera: Curculionidae)

Control del Picudo de la Guayaba

Referencias Bibliográficas

Contenido del Capítulo

Delgado-Ochica, C. 1 y Adriana Sáenz Aponte2

Entre las investigaciones realizadas sobre el conocimiento del picudo de la guayaba, presentes en los

cultivos en Suramérica se destacan los trabajos de Monrroy e Insuasty (2006) en el que describen su ciclo

de vida en Barbosa-Santander; Boscán y Cásares (1980) quienes evaluaron los daños del picudo en

Venezuela y en 1981, determinaron las épocas del año en que se encuentran las diferentes fases del insecto

en el campo. Brito et al. (2008) probaron la aplicación de aceites vegetales, imidaclopril con Beauveria bassia-

na y Metarhizium anisopliae. Del Valle et al. (2005, 2008) y Dolinski et al. (2007), evaluaron la eficacia de

los nematodos entomopatógenos sobre el picudo bajo laboratorio, invernadero y campo en Brasil,

con porcentajes de mortalidad entre 70-95%. Aunque se ha demostrado la alta eficacia de nematodos entomopatógenos

para el control del cuarto instar larval del picudo por encontrarse en el suelo, este tipo de estudios no se

1Estudiante. 2 Profesor Asistente. Unidad de Ecología y Sistemática –UNESIS. Laboratorio de Control Biológico. adriana.saenz@javeriana.edu.co Pontificia Universidad Javeriana, Cra 7 N°43-82, Edificio 54, Oficina 200. Bogotá, Colombia.

El cultivo del guayabo en Colombia se conoce como cultivo de

potrero, barranco, de camino o de patio casero, en la cual no se ha aplicado

tecnología alguna en el 90% de los casos. En el país hay sembradas 79.423

ha de guayaba entre árboles en sistema disperso, mixto, solo e intercalado

(Mapamir, 2003). La mano de obra ocupada en la recolección y empaque

de la guayaba en Colombia se estima en 1’140.000 jornales/año, donde

participan más de 9.000 familias y generan una producción cuyo valor

anual se puede estimar entre U$14 a U$20 millones (Anónimo 2006).

El picudo de la guayaba Conotrachelus psidii Marshall (Coleoptera:

Curculionidae) es la principal plaga del cultivo en la región de Santander,

el cual ha venido ocasionando pérdidas de hasta el 80% de la producción

desde el 2007 (Com. Personal. Hernández y Pinzón, 2011). El daño lo

ocasionan las larvas al alimentarse de las semillas y la pulpa produciendo

un ennegrecimiento y endurecimiento de la parte afectada. Las excretas de

la larva en el interior de la guayaba ocasionan petrificación del fruto,

maduración prematura y caída del mismo (Insuasty et al. 2007). El daño

hace al fruto inservible para cualquier forma de consumo ó utilización.

Actualmente esta plaga parece estar fuera de control en el área guayabera

Santandereana.

han realizado en el país, ni se han evaluado las

especies o cepas de nematodos entomopatógenos

disponibles en Colombia para el control de ésta

plaga.

El control biológico es una herramienta que

está siendo utilizada para el control de organismos

plagas como una opción de bajo impacto ambiental

(Alomar y Albajes 2005, Nichols-Estrada 2008, Grewal

et al. 2005). En el grupo de entomopatógenos, los

nematodos han sido de gran interés por reproducirse

en el insecto-plaga produciendo nuevas generaciones

que van a infectar nuevos individuos huésped,

matan rápidamente a su hospedero, tienen un

tercer estadío ó Juvenil Infectivo (JI) que no se

alimenta, está adaptado a sobrevivir en el suelo

dependiendo de sus reservas hasta encontrar a su

huésped, además tienen la capacidad para buscar

activamente a su hospedero. Por otra parte, tienen

desventajas como amplio rango de hospederos,

limitada ,tiempo corto de almacenamiento, pobre

persistencia en campo y altos costos en comparación

con los pesticidas químicos (Grewal et al. 2005, Kaya

y Gaugler 1993, Merino y France 2009).

á á

La atención de los investigadores se ha

centrado especialmente en los nematodos de las

familias Steinernematidae y Heterorhabditidae

(Grewal et al. 2005), donde cada especie es específica

ó puede infectar un pequeño número de especies

(no se han registrado efectos negativos en huéspedes

no blanco). En el presente estudio se realizará la

aplicación de NEP mediante la técnica de cadáveres,

la cual ha demostrado una mayor dispersión en el

suelo e infectividad y supervivencia en comparación

con la suspensión acuosa (Shapiro- Ilan et al. 2003).

Teniendo en cuenta la importancia del

cultivo, los problemas para el control del picudo

de la guayaba y las características de los nematodos

entomopatógenos, se platea evaluar la virulencia de

especies ó cepas de nematodos entomopatógenos

sobre larvas de cuarto instar del picudo de la

guayaba bajo condiciones de laboratorio, invernadero y

campo, y su persistencia en el suelo; para generar

una propuesta de control biológico para el manejo

con del picudo de la guayaba.

El cultivo de Guayaba Psidium guajava Linneo (1753) (Rosales: Myrtaceae)

conocida como guayaba, es nativa de los trópicos

de América, pero hoy se encuentra en todas las

regiones tropicales y subtropicales del mundo

dentro de los 35° latitud norte y 35° latitud sur

(Raga et al. 2006, Tong et al. 1991). La guayaba es

una fruta de aroma fuerte inconfundible, sabor

cautivador, considerada la reina de las frutas

además por su contenido de minerales, vitaminas,

principalmente vitamina C (10 veces más que la

naranja), también contiene aminoácidos como lisina

y triptófano tan importantes en la alimentación de

los niños en los primeros cinco años de vida para

el desarrollo normal del cerebro (Lozano et al.

2002, Perales et al. 2005).

En general, el guayabo muestra mucha

diversidad en tamaño de la fruta, forma, cantidad

de semilla, tamaño y dureza de la misma, sabor de

la pulpa, textura, color, aroma, contenido de

ácido ascórbico, acidez; susceptibilidad a plagas

y enfermedades, a cuarteamiento del fruto;

rendimiento, hábito de crecimiento, vigor, tiempo

de floración entre cosecha y vida de estante del

fruto (Lozano et al. 2002).

En Colombia se puede encontrar

silvestre, cultivada sin ningún cuidado y

en cultivos a gran escala. La principal

región agroindustrial de la guayaba y

de bocadillo en el país es la provincia

de Vélez (Santander), allí los guayabales

son principalmente silvestres o se

encuentran asociados a sistemas

silvopastoriles (Figura 1); bajo estas

condiciones naturales, la guayaba

inicia brotes al principio del periodo

lluvioso y las hojas maduras son

sustituidas por brotes nuevos, por lo

cual la producción y cosecha es

periódica (Morales y Melgarejo 2010).

En la provincia de Vélez se

presentan dos cosechas en el año, una

en la primera mitad del año llamada “cosecha

de mitaca” ó pequeña producción. La segunda

producción al final del año conocida como cosecha

principal. Sin embargo, se han registrado alteraciones

en el ciclo de producción debido posiblemente a

factores climáticas como altas precipitaciones

(ausencia de veranillo) (Lozano et al. 2002).

Mercadeo y oportunidades: P. guajava es un

cultivo importante en una gran cantidad de países

de las zonas tropicales. Entre los principales países

productores están India, Pakistan, México y

Hawaii; Venezuela y Brasil en su mayoría la

industrializan y derivan sub-productos para la

exportación (Cordero et al. 2003, Anónimo 2007).

En Colombia la guayaba se encuentra en sistema sil-

vopastoril- grama natural ó rumiante, esta situación

es propicia ahora cuando el mundo moderno quiere

y demanda productos limpios y libres de

á

agroquímicos principalmente (Lozano et al. 2002).

La mayor producción de guayaba en Colombia

se encuentra en el departamento de Santander con

49.800 toneladas (34%) de 145.665 toneladas a

nivel nacional, seguido por Boyacá (20%), y Tolima

(12.3%). Los productores a nivel regional son una

población rural en un 99% de economía campesina,

con un sistema de explotación agropastoril

(Anónimo 2006).

La principal agroindustria rural derivada de

esta fruta en Colombia se concentra en la provincia

de Vélez (Santander), donde se desarrolla en más

de 130 fábricas de Bocadillo, cuya producción

anual se valora en US$24 millones. A pesar de su

importancia socioeconómica, el cultivo y la agroindustria

de la guayaba presentan aun un marcado retraso

tecnológico que afecta su competitividad en los

Figura1. Cultivo de guayaba común (Psidium guajava) asociado a

un sistema silvopastoril en la provincia de Vélez, Municipio Puente

Nacional – Santander (Colombia).

mercados y se refleja en bajos rendimientos del

cultivo, altos costos de producción, deficiencias de

calidad y en la inestabilidad de la oferta, los precios

de la fruta y sus productos procesados (Anónimo

2007).

En relación con el comercio exterior, la

guayaba procesada como bocadillo, jalea, mermelada,

compota, pulpa, néctar y jugo tiene una proyección

amplia y creciente por las características o propiedades

ya anotadas. Teniendo que desarrollar tecnologías

que mejoren la productividad y competitividad con

los mercados internacionales (Perales et al. 2005).

Para el consumo de frutos se prefieren frutos

entre 200 y 400 gramos, en cambio para la industria,

el tamaño de la fruta no es importante. Aquí lo

importante es que en ambos casos la fruta esté

entera o completa y sin daños aparentes que la

hagan rechazable por los consumidores o los

industriales. Contrario a lo que se cree, el tamaño

no tiene que ver con la calidad; y que la industria

recibe cualquier calidad, pero en realidad no es así,

la industria prefiere fruta excelente no excedentes

(Cordero et al. 2003, Lozano et al. 2002).

Aspectos agroecológicos: El guayabo se

adapta con facilidad a distintas condiciones climáticas

pese a su origen tropical. El mejor clima para el

guayabo es el templado, en sitios con temperatura

promedio entre los 15 y 30°C, desde secos a húmedos,

con un suplemento anual de agua de 1000-

2000m3/ha por año y se encuentra en una amplia

variedad de climas (Chacón y Cuenca 1998, Mata y

Rodríguez 1990, Salazar et al. 2006).

Desde el punto de vista fitosanitario este

cultivo afronta una serie de problemas asociados

con el ataque de plagas y enfermedades en donde

se destacan: ataques de la mosca de la fruta del

á á

género Anastrepha (Diptera: Tephritidae), el picudo

de la guayaba C. psidii (Coleoptera: Curculionidae)

y la enfermedad de la costra o clavo de la guayaba

(Pestalotia versicolor Speg.), este hongo es favorecido

por condiciones de alta humedad relativa y

especialmente por exceso de follaje en la planta.

En la región de Santander sobresale el picudo de la

guayaba por el alto impacto económico que genera,

ya que su daño no permite el uso de la fruta en la

preparación de subproductos y ha llegado a afectar

hasta el 80% de la producción (Anónimo 2010,

Insuasty et al. 2007, Perales et al.2005).

Tanto la fruta como sus productos procesados,

son la principal fuente de ingresos para la población

de la provincia de Vélez, por lo que el problema

con el picudo, genera pérdidas en los ingresos de

las familias de la región y elevados costos en la

producción de bocadillo al tener que importar la

fruta desde otras regiones para suplir los requerimientos de

las fábricas (Com. personal Hernández y Pinzón

2011).

Por el sistema de cultivo de guayabales silvestres,

no se realizan aplicaciones de agroquímicos, ni

embolse del fruto para el control de plagas y

enfermedades del fruto de guayaba. Específicamente

para el picudo de la guayaba no se han desarrollado

atrayentes ni feromonas eficaces para su

implementación en manejo integrado de ésta plaga;

tampoco se han realizado estudios de cultivares

que sean resistentes o poco susceptibles (Insuasty

et al. 2007). Prácticas culturales como recolección y

eliminación de frutas afectadas es poco aplicada en

la región por la extensión de los cultivos y por el

aumento en la mano de obra; en los sistemas

silvopastoriles esta labor es realizada en gran medida

por el ganado, sin embargo, la fruta afectada por el

El picudo de la guayaba es una de las principales

plagas de la guayaba en Colombia, afectando tanto

la producción como la calidad de los frutos,

generando grandes pérdidas económicas. Llega a

petrificar hasta el 100% del fruto y si no se le

controla, ocasiona pérdidas del 60 al 100% de la

producción (Insuasty et al. 2007). En la provincia

de Vélez se ha incrementado significativamente las

pérdidas causadas por el picudo, donde se estima

que la producción de la guayaba ha bajado un 80%

(Com. personal Hernández y Pinzón, 2010).

El picudo de la guayaba (C.psidii) es un

escarabajo Curculionidae (Coleoptera) de

á

aproximadamente 6 mm de largo y 4 mm de

ancho. Las hembras generalmente ovipositan un

huevo por fruto de 30 a 90 días de edad; los

huevos son blanquecinos y con longitud promedio

de 1 mm. La larva es ápoda de color amarillo con

cabeza café, con longitudes entre 1,2 y 1,5 mm en

las primeras semanas y entre 10 y 12 mm en la sexta

semana. La pupa es de tipo exarata, amarilla clara y

de 7,5 mm de longitud. El adulto es café oscuro

con piezas bucales cilíndricas y alargadas. Después

de la eclosión del huevo, la larva penetra en el fruto

donde se alimenta de la pulpa y de las semillas. Las

larvas se desarrollan dentro del fruto pasando por

cuatro instares. Los frutos se madura, caen y las

larvas de cuarto instar del picudo migran al suelo,

donde se transforman en pupa, después surgen los

adultos, abandonan el suelo iniciando un nuevo

ciclo. El ciclo total dura 199 días distribuido así:

huevo, 4 a 7 días; larva en el fruto, 42 a 56 días;

larva en suelo, 90 días; pupa en el suelo, 30 a 60

días. Los adultos emergen entre a los 20 y 30 días y

lo hacen durante la época seca, en la cual se pueden

colectar adultos asociados a hojas y flores

(Anónimo 2010, Boscán y

Cásares 1981, Monrroy e

Insuasty 2006).

En la provincia de Vélez

los adultos emergen con la

aparición de las primeras lluvias

de marzo, incrementando

significativamente su población

en el mes de mayo. En

cuanto a la infestación en

los frutos por parte de las

larvas, se ha observado el

valor más alto durante la

cosecha, que va desde

El Picudo de la Guayaba Conotrachelus psidii Marshall (Coleoptera: Curculionidae)

Figura 2. Fruto de gua-

yaba (P. guajava) de 40 días.

A. daño externo generado

por la hembra del picudo de

la guayaba (C. psidii) al ovi-

positar, malformación y

maduración prematura. B.

Daño interno (petrificación)

generado por larvas.

A

B

inicios de septiembre hasta diciembre (Anónimo

2010, Boscán y Cásares 1980, 1981).

El daño ocasionado por el picudo es provocado

por la larva al alimentarse de la pulpa y la semilla,

produciendo un ennegrecimiento, endurecimiento

de la parte afectada, maduración prematura y caída

del fruto. En la medida en que la larva se desarrolla

en el interior del fruto, éste adquiere una forma

á á

arriñonada y el agujero de oviposición se torna más

grande y de color oscuro, a las cuatro semanas de

la oviposición los frutos se petrifican y su interior

toma una apariencia totalmente oscura (Figura 2)

(Insuasty el al. 2010). Un fruto en éstas condiciones

es inservible y no se puede consumir en fresco ni

utilizar en la fabricación de pulpas o jaleas.

Control del Picudo de la Guayaba Dentro de las estrategias de manejo se

encuentra el embolsado de frutos, red de golpe,

eliminación de frutos infestados, selección de árboles

trampa, desfase de cosecha. Sin embargo, estas

prácticas requieren que los árboles sean manejados

técnicamente, para evitar dificultades desde el punto

de vista operativo y altos costos (Monroy e Insuasty

2006). El control se complementa con la colecta y

quema de los frutos dañados en el árbol antes de

que la larva abandone el fruto (Anónimo 2007,

Perales et al. 2005).

La plaga en su estadío larval es difícil de

controlar con métodos químico debido a su

localización dentro del fruto en su estadío de larva1-

4 y su posterior localización en el suelo en su

estadío 4; aunado a ésto se encuentra la carencia de

productos químicos específicos para el control del

picudo. El picudo es capaz de causar daños del 60-

100% de los frutos y hasta del 100% de la producción

total de guayaba si no se controla a tiempo (Boscán

y Cásares 1980).

Éstas medidas de control han resultado

ineficientes por las dificultades que acarrea el sistema

silvestre haciendo que las pérdidas de producción

de la guayaba continúen empeorando. Es por ello

que se hace necesario una estrategia de control que

sea autosostenible y que presente mejores resultados

para el control del picudo. Una alternativa es la

aplicación de estrategias de control biológico

para mantener un equilibrio en los ecosistemas,

no obstante, falta estudiarse con mayor detalle para

su implementación (Insuasty et al. 2007, Perales et

al. 2005).

El control biológico inició en 1889 definido

por de Bach (1964) como la acción de parásitos,

predadores o patógenos que mantienen una

población hospedera a niveles más bajos de los que

se encontraría en ausencia de ese enemigo natural

(Altieri et al. 1997). Está dividido en control

biológico natural en el que los enemigos naturales

nativos o coevolucionados controlan artrópodos

nativos y el control biológico aplicado en el que el

hombre interviene para mejorar la acción de los

enemigos naturales presentes (Hazir et al. 2004).

A través de los tiempos, organismos como

bacterias, virus, hongos y nematodos han sido

utilizados como controladores de insectos plaga en

proporciones muy pequeñas comparado con el uso

abundante de plaguicidas químicos. Poco a poco la

necesidad de implementar técnicas que no causen

daño al medio ambiente y que cumplan con las

normas de sanidad vegetal han llevado al progresivo

aumento del uso de controladores biológicos, la

búsqueda de otras opciones como parasitoides o

depredadores y el estudio sobre las aplicaciones de

los controladores (Carballo et al. 2004, Hazir et al.

2004) como lo son los nematodos entomopatógenos

(Grewal et al. 2005).

Nematodos entomopatógenos: Los

nematodos entomopatógenos son parásitos obligados

de insectos; son invertebrados diversos y abundantes

en diferentes sistemas en donde la humedad y la

disponibilidad de alimento son factores importantes,

por ello se desarrollan en ambientes crípticos

como el suelo (Leguízamo y Parada 2008). Los

estudios con nematodos entomopatógenos se han

incrementado en las últimas dos décadas haciendo

énfasis en el potencial infectivo de diferentes

hospederos (Grewal et al. 2005).

Los nematodos entomopatógenos pertenecen

al orden Rhabditida (Nematoda), los nematodos

entomopatógenos que han mostrado mejores

resultados en el control biológico de plagas pertenecen

a las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae

(Sáenz 2005). Están asociadas a bacterias mutualistas

del género Xenorhabdus para Steinernematidae y

Photorhabdus para Heterorhabditidae, (Burnell y

Stock 2000, Gaugler 2002, Morton y Garcia-del-

Pino 2010) y que les son útiles cuando ingresan al

hospedero. La bacteria mata al insecto por septicemia,

facilitando la degradación de los tejidos para que el

nematodo se pueda alimentar junto con su descendencia.

La asociación nematodo-bacteria es la que permite

la efectividad y selectividad de estos controladores,

razón por la cual se realizan gran variedad de

ensayos en laboratorio para establecer la patogenicidad

á

de cada especie ante una determinada plaga (Hazir

et al. 2004, Sáenz 2005).

Las estrategias de los JIs para encontrar a su

hospedero es variable entre las distintas especies de

nematodos entomopatógenos, se puede clasificar co-

mo “emboscadores” y “cruceros”. Los nematodos

entomopatógenos “emboscadores” esperan a su

hospedero para saltar en dirección a su hospedero

cuando éste se aproxima. Los nematodos

entomopatógenos con estrategia “crucero” buscan

activamente sus hospederos moviéndose en el suelo,

probablemente atraídos por el dióxido de carbono

ú otras sustancias liberadas por los hospederos.

Los nematodos entomopatógenos con estrategia

de “crucero” son más efectivos para insectos con

poca movilidad en la capa del suelo, mientras que

los “emboscadores” son más efectivos para

hospederos móviles; existen adicionalmente,

algunas especies con comportamientos intermedios,

donde por un periodo son “emboscadores” y

después son buscadores activos (Gaugler 2002,

Hazir et al. 2004, Klein 1990, Kaya y Gaugler

1993).

La eficacia del control de insectos plagas

con nematodos entomopatógenos depende de la

temperatura ambiental en la cual ellos son liberados

al suelo. La temperatura influye en muchos procesos

y en la producción de reservas alimenticias como

lípidos, proteínas y carbohidratos, que son utilizados

por los nematodos para su movilidad, sobrevivencia,

infectividad y reproducción. En general, la actividad

insecticida de los nematodos entomopatógenos

son más efectivos entre las temperaturas de 18-

28°C, con excepción de algunas especies que son

más efectivas en temperaturas extremas (Hazir et

al. 2004, Kaya y Gaugler 1993).

Control del picudo con nematodos

entomopatógenos: En Colombia no se han

reportado estudios con nematodos entomopatógenos

para el control del picudo de la guayaba, la información

existente y cercana ha sido desarrollada en Brasil,

donde se ha demostrado en laboratorio e invernadero

la eficacia de nematodos entomopatógenos para el

control del picudo de la guayaba (Dolinski et al.

2006, Del valle et al. 2005, 2008, Shapiro et al.

2008).

Nematodos entomopatógenos de los generos

Heterorhabditis y Steinernema (Rhabditida) pueden ser

usados como agentes de control biológico contra

los estados del picudo de la guayaba que viven en

el suelo (cuarto estadío larval, prepupa y pupa).

Estudios realizados por Del Valle et al. (2005,

2008) y Dolinski et al. (2006) demostraron la alta

susceptibilidad del cuarto instar larval del picudo

de la guayaba por parte de Heterorhabditis baujardii

LPP7 (patogenicidad 80%) y Heterorhabditis indica

Hom1 (patogenicidad 85%) en experimentos de

laboratorio e invernadero a una concentración de

100 nemátodos por larva del gorgojo de la guayaba

(Dolinski et al. 2006; Del valle et al. 2005, 2008).

Cuando fueron evaluados en columnas de arena,

estos nematodos se mostraron eficientes en encontrar

las larvas del gorgojo, causando mortalidad del

70% bajo una dosis de 500 nematodos por larva;

se realizaron algunas pruebas con nematodos en

campo, demostrándose la eficacia y la persistencia

de los nematodos en campo (Del Valle et al. 2008;

Dolinski 2009).

En campo un método alternativo para la

aplicación de los nematodos entomopatógenos, es

el uso de cadáveres. La técnica del cadáver, consiste

en infectar larvas de último instar de Galeria mellonella

á á

con nematodos entomopatógenos, dejar que los

nematodos se desarrollen dentro del huésped y

posteriormente (entre los cinco y los siete días-

dependiendo de la especie de nematodo), aplicar

los cadáveres infectados (Figura 3); una vez entra

en contacto con el sustrato, los nematodos

entomopatógenos emergen de la larva aplicada en

busca de un nuevo huésped. La técnica del

cadáver es un método que ha mostrado mejores

resultados que la aplicación de JI en suspensión en

cuanto a características como dispersión, infectividad

y sobrevivencia (Shapiro y Glazer 1996, Shapiro y

Lewis 1999).

Ésta forma de aplicación de cadáveres-

infectados es más sencilla y demanda menos tecnología

tanto de almacenamiento, mantenimiento como de

aplicación. Las larvas de G. melonella pueden ser

Figura 3. Larvas de último instar de Galeria mellonella

después de seis días de infección con nematodos

entomopatógenos de la familia Heterorhabditidae,

para ser aplicados como cadáver.

Shapiro y Lewis 1999).

La técnica de aplicación de cadáveres infecta-

dos no se ha implementado en el país para el con-

trol de plagas. Esta técnica se va a evaluar en

condiciones de campo para el control del picudo

de la guayaba teniendo en cuenta su factibilidad en

la aplicación por parte de los agricultores, por el

tipo de manejo que se le da a los guayabales, con lo

cual se espera disminuir las poblaciones del picudo

de guayaba y a su vez, generar nuevos nematodos

entomopatógenos (Del Valle et al. 2008)

Las especies de nematodos entomopatógenos

a evaluar para el control del picudo de la guayaba en

Colombia, pertenecen a las familias Steinernematidae

y Heterorhabditidae, las especies obtenidas por

criadas, infectadas y aplicadas por los productores

gracias a su fácil y agradable producción y manejo.

Los cadáveres infectados de G. melonella se ponen a

unos dos centímetros de la superficie del suelo, los

JI del cadáver migran a la lámina de suelo a los 3-5

días después de la aplicación y se desplazan en

suelo en búsqueda de su hospedero (plaga objeti-

vo) para completar su ciclo de vida y generar

nuevos JI. La distancia del desplazamiento, la

profundidad y la persistencia que puedan alcanzar

los nematodos va a depender de las condiciones

ambientales como temperatura y humedad; de las

condiciones bióticas como depredadores y de las

características de cada especie como lo es su

estrategia de forrajeo, tolerancia a las condiciones

ambientales, entre otras (Shapiro y Glazer 1996,

á

No. Género Especie Cepa Mpio/Depto. Unidad de Paisaje

1 Steinernema websteri JCL006 Chinchiná-Caldas Bosque

2 Steinernema sp 1 JCL024 Buenavista-Quindio Cafetal

3 Steinernema sp 2 JCL007 Chinchiná-Caldas Cafetal

4 Steinernema sp 3 JCL027 Sasaima-Cundinam. Plátano

5 Steinernema colombiense SNI0198 Quimbaya-Quindio Cafetal

6 Heterorhabditis bacteriophora HNI0100 Fresno-Tolima

7 Heterorhabditis sp1 SL0708 Alcalá-Valle del Cauca Guadual

Tabla 1: Especies de nematodos entomopatógenos a evaluar para el control del picudo de la guayaba C.

psidii. De la 1ª a la 6ª especies entregadas a la Pontificia Universidad Javeriana por Cenicafé con el conve-

nio No. 182 de 2009. La 7 obtenida por la universidad.

Cenicafé (acuerdo 181) y un aislamiento de la

Pontificia Universidad Javeriana

(Heterorhabditis sp. SL0708), (Tabla 1). Para la

producción de JI, se multiplicaron sobre larvas de

último instar de G. mellonella siguiendo las

recomendaciones de López (2001), Acevedo y

López (2001), Sáenz y Olivares (2008) y Del Valle

et al. (2008).

á á

Se encontró que el picudo de la guayaba es

susceptible a las siete especies de nematodos

entomopatógenos evaluadas en las primeras 48

horas. Las larvas de cuarto instar del picudo de la

guayaba infectados desarrollaron diferentes síntomas

(Figura 4), producciones de JI/ larva y porcentajes

de mortalidad. Este método de control biológico

no genera resultados a corto plazo, sino que es una

alternativa viable que pretende reducir a mediano

Figura 4. Larvas de cuarto instar del picudo de la guayaba C. psidii A. Larva viva. B. infectada con nematodos entomopatógenos de la familia Steinernematidae. C-D larvas infectadas con Heterorhabditidae. E. Larva disetada para corroborar la muerte por nematodos entomopatógenos.

Referencias Bibliográficas ACEVEDO, J.P., LÓPEZ, J.C. 2001.

Producción in vivo de tres entomonemátodos con

dos sistemas de infección en dos hospedantes.

Revista Colombiana de Entomología. 27 (1-2): 73-

78.

ALOMAR, O. y ALBAJES, R, 2005, Control

Biológico de Plagas, Biodiversidad Funcional y

gestión del Agrosistema, Barcelona-España,

biojournal.net, Nº 1. Pp. 10.

ANÓNIMO. 2006. Asociación Colombiana

de Horticultores y Fruticultores de Colombia. Se-

cretarias de Agricultura Departamentales - UR-

PAS´s, UMATA´s. ASOHOFRUCOL. Ministerio

de Agricultura y Desarrollo Rural. En: http://

www.frutasyhortalizas.com.co/ portal/Business/

product_view.php

ANÓNIMO. 2007. Respuesta integral en ge-

neración de la competitividad.Cadena Productiva-

de la Guayaba y su Industria de los Departamentos

de Santander y Boyacá. ANÓNIMO. 1-53.

ANÓNIMO. 2010. Manejo fitosanitario del

cultivo de la guayaba (Psidium guajava L.) en Santan-

der. Corpoica- ICA Imprenta nacional de Colom-

bia. Pp. 40.

BOSCÁN DE MARTÍNEZ, N., CÁSARES,

R. 1980. El gorgojo de la guayaba Conotrachelus psi-

dii 1. Evaluación de daños. Agronomía tropical. 30

(1-6): 77-83.

BOSCÁN DE MARTÍNEZ, N., CÁSARES,

R. 1981. Distribución en el tiempo de las fases del

gorgojo de la guayaba Conotrachelus psidii en el cam-

po. Agronomía tropical. 31 (1-6): 123-130.

BRITO, E., RODRIGRUEZ DE PAULA,

A., PEREIRA, L., DOLINSKI, C., SAMUELS, R.

2008. Combining vegetable oil and sub-lethal con-

centrations of Imidacloprid with Beauveria bassiana

and Metarhizium anisopliae against adult guava weevil

Conotrachelus psidii (Coleoptera: Curculionidae). Bio-

control Science and Technology. 18 (7): 665-673.

BURNELL, A. M., STOCK, S. P. 2000. Het-

erorhabditis, Steinernema and their bacterial simbionts

lethal pathogens of insects, Nematology. 2 (1): 31-

42

CARBALLO, M., CANO, E., CHAPUT, M.,

FERNÁNDEZ, O., GONZÁLEZ, L., GRUB-

BER, A. K., GUHARAY, F., HIDALGO, E.,

NARVÁEZ, C., LÓPEZ, J. A., RIZO, C., RO-

DRIGUEZ, A., RODRÍGUEZ, C., SALAZAR,

D. 2004. Control Biológico de Plagas Agrícolas. 1ª

á

edición. Managua Nicaragua. Pp. 220.

CHACÓN, A., CUENCA, G. 1998. Efecto

de las micorrizas arbusculares y de la fertilización

con fósforo, sobre el crecimiento de la guayaba en

condiciones de vivero. Agronomía Tropical. 48

(4):425-440.

CORDERO, J., BOSHIER, D., BAR-

RANCE, A., BEER, J., CHARMBERLAIN,J.,

DETLEFSEN, G., FINEGAN, B., GALLOWAY,

G., GÓMEZ, M., GORDON, J., HANDS, M.,

HELLIN, J., HUGHES, C., IBRAHIM, M.,

LEAKEY, R., MESÉN, F., MONTERO, M.,

RIVAS, C., SOMARRIBA, E., STEWART, J.

2003. Árboles de Centroamérica: un manual para

extensionistas. OFI-CATIE. 1080 p.

DEL VALLE, E., DOLINSKI, C., SOUZA,

R., SAMUELS, R. 2005. Performance de Heteror-

habditis baujardi LPP7 (28) (Nematoda: Rhabditida)

seleccionada para tolerancia a elevadas no controle

de Conotrachelus psidii, (Coleoptera: Curculionidae).

Nematología Brasileira. 29: 199-205.

DEL VALLE, E., DOLINSKI, C., BARRE-

TO, E., SOUZA, R., SAMUELS, R. 2008. Efficacy

of Heterorhabditis baujardi LPP7 (Nematoda: Rhab-

ditida) Applied in Galleria mellonella (Lepidoptera:

Pyralidae) Insect Cadavers to Conotrachelus psidii,

(Coleoptera: Curculionidae) Larvae. Biocontro.

Science and Technology. 18: 33-41.

DOLINSKI, C., DEL VALLE, E.E.,

STUART, R.J. 2006. Virulence of entomopatho-

genic nematodes to larvae of guava weevil, Conotra-

chelus psidii (Coleoptera:Curculionidae), in labora-

tory and greenhouse experiments. Biological con-

trol. 38: 422-427.

DOLINSKI, C., LANCELY, L. 2007. Micro-

bial Control of Arthropod Pests of Tropical Tree

Fruits. Neotropical Entomology. 36(2):161-179.

DOLINSKI, C., DEL VALLE, E.E., BUR-

LA, R.S., MACHADO, I.R. 2007. Biological traits

of two native Brazilian entomopathogenic

nematodes (Rhabditida: Heterorhabditidae).

Nematologia Brasileira. 31: 54-59.

GAUGLER, R. 2002. Entomopathogenic

nematology, CABI Publishing Series, Pp. 388.

GREWAL P. S., EHLERS R. U., SHAPIRO

-ILAN D. I. 2005. Nematodes as biocontrol

agents. CABI Publishing Series. Pp. 505.

HAZIR, S., KAYA, H. K., STOCK, P., KE-

SKIN ,N. 2004. Entomopathogenic Nematodes

(Steinernematidae and Heterorhabditidae) for bio-

logical control of soil pests. Turkish Journal of Bi-

ology. 26: 181-202

HERNÁNDEZ, E., PINZÓN, G. 2011.

Productores de guayaba en Puente Nacional- San-

tander. Comunicación Personal.

INSUASTY, O., MONROY, R., DIAZ, A.,

BAUTISTA, J. 2007. Manejo integrado del picudo

de la guayaba Conotrachelus psidii Marshall en San-

tander. Corpoica, Ica, Secretaria de Agricultura y

desarrollo de Santander. Pp 27.

KAYA, H.K., GAUGLER, R. 1993. Ento-

mopathogenic nematodes. Annual Review of En-

tomology. 38 : 181–206.

KLEIN, M.G. 1990. Efficacy against soil-

inhabiting insect pests. In: Gaugler, R., Kaya, H.K.

(Eds.), Entomopathogenic Nematodes in Biologi-

cal Control. CRC Press. Boca Raton FL. pp. 195–

214.

LEGUÍZAMO, M.C., PARADA, J.C., 2008.

Nemátodos del suelo en el sistema maíz-soya y en

hábitats naturales adyacentes de la Altillanura co-

lombiana (Meta), Revista Corpoica. Pp. 20.

LÓPEZ N., J. C. 2001. Uso de entomonema-

todos en el control de insectos plaga: experiencias

con trabajos en broca del café. Pp 58-79.

LOZANO, C., TORO, J., GARCÍA, J., TA-

FUR, R. 2002. Manual sobre el cultivo de la guaya-

ba en Colombia. Fruticultura Colombiana. Lavalle

Ltda. 278 pp.

MAPAMIR. 2003. Guía agroecológica para el

manejo del cultivo de la guayaba (Psidium guajava).

Ministerio De Agricultura Programa De Apoyo a

la Microempresa Rural. Sagi comunicación Ltda.

á á

Bucaramanga Santander. Pp. 37.

MATA, I., RODRÍGUEZ, A. 1990. Cultivo

y producción del guayabo. Editorial Trillas SA.

México. Pp160.

MERINO L., FRANCE A. 2009. Nemato-

dos Entomopatógenos: Control Biológico de In-

sectos Plaga de Importancia Económica, Revista

Tierra Adentro, INIA, Chile. 84: 24 – 25.

MONROY, E., INSUASTY, O. 2006. As-

pectos biológicos y duración de los estadios del

picudo de la guyaba Conotrachelus psidii. Revista

Corpoica: Ciencia y Tecnología Agropecuaria. 7

(2): 73-79.

MORTON, A., GARCIA-del-PINO, F.

2010. Ecological characterization of entomopatho-

genic nematodos isolated in stone fruit orchard

soils of Mediterranean areas, Journal of Inverte-

brate Pathology. 28 (1): 185-207.

NICHOLS-ESTRADA, C.I. 2008. Control

Biológico de Insectos: Un enfoque agroecológico,

Medellín Colombia, Editorial Universidad de An-

tioquia. Pp. 282.

RAGA, A., SOUZA, M., PRESTES, D.,

AZEVEDO, J., SATO, M. 2006. Susceptibility of

Guava Genotypes to Natural Infestation by An-

astrepha spp. (Diptera: Tephritidae) in the Munici-

pality of Monte Alegre do Sul, State of São Paulo,

Brazil. Neotropical Entomology. 35 (1):121-125.

SÁENZ, A. 2005. Importancia de los nemá-

todos entomopatógenos para el control biológico

de plagas en palma de aceite, Palmas. 26 (2): 41-57.

SÁENZ. A.A., OLIVARES, W. 2008. Capa-

cidad de búsqueda de Steinernema sp SNIO 198

(Rhabditida: Steinernematidae) para el control de

Sagalassa valida Walker (Lepidoptera: Glyphipterygi-

dae). Revista Colombiana de entomología. 34 (1).

51-56.

SHAPIRO, D. I., GLAZER, I. 1996. Com-

parision of entomopathogenic nematode dispersal

from infected host versus aqueous suspension. En-

vironmental Entomology 25: 1455-1461.

SHAPIRO, D, I., LEWIS, E. 1999. Com-

parasions of enthomopathogenic nematode infec-

tivity from infected host versus aqueous suspen-

sion. Environmental entomology. 28: 907-911.

SHAPIRO-ILAN DI, LEWIS EE, TED-

DERS WL. 2003. Superior efficacy observed in

entomopathogenic nematodes applied in infected-

host cadavers compared with application in aque-

ous suspensions. Journal of. Invertebrate Pathol-

ogy. 83: 270-272.

SHAPIRO-ILAN, D,.RUSSELL, F.,

á

MIZELL I,. COTTRELL, T., HORTON, D.

2008. Control of plum curculio, Conotrachelus

nenuphar, with entomopathogenic nematodes: Ef-

fects of application timing, alternate host plant,

and nematode strain. Biological Control. 44: 207–

215.

TONG, F., MEDINA, D., ESPARZA, D.

1991. Variabilidad en poblaciones de guayaba

(Psidium guajava L.) del municipio Mara del estado

Zulia. Revista de Agronomía (LUZ). 8 (1):15-27.

1Instituto Biológico/Apta/CEIB, C.P. 70, Campinas, SP, 13001-970; lgleite@biologico.sp.gov.br

Aplicação de nematóides entomopatogênicos e resultados de programas na américa latina

Os nematóides úteis ao controle de insetos e outros artrópodes tidos

como pragas estão reunidos nas famílias Mermithidae (Mermithida),

Phaenopsitylenchidae (Tylenchida) e, principalmente, em Heterorhabditidae

e Steinernematidae (Rhabditida) (Ferraz et al., 2008). Nestas duas últimas,

incluem-se as espécies dos gêneros Heterorhabditis e Steinernema que

têm sido mais intensivamente pesquisadas com vistas ao emprego comercial,

conhecendo-se bem os aspectos relativos à ecologia, às estratégias de ação

sobre a praga-alvo, à produção em larga escala e às condições de aplicação

para que se tenha alta eficiência no controle. Esses nematóides são também

chamados de entomopatogênicos (NEPs). De outra parte, por

diversas razões, os nematóides mermitídeos e fenopsitilenquídeos vêm

despertando bem menor interesse do ponto de vista de controle de pragas,

embora existam casos isolados de grande sucesso na utilização de tais

formas para o controle de algumas pragas urbanas. Esses são

chamados de entomofílicos.

Na América Latina, de modo geral, o emprego de nematóides

entomopatogênicos (Nemata: Steinernematidae, Heterorhabditidae)

vem crescendo, mas ainda é incipiente. E, paradoxalmente, os dois relatos de

utilização bem sucedida em escala mais ampla referem-se justamente a

espécies filiadas às famílias Mermithidae e Phaenopsitylenchidae .

Introdução

Famílias Heterorhabditidae e Steinernematidae (Rhabditida)

Aplicação

Pesquisas com Steinernematidae e Heterorhabditidae e utilização prática como bioinseticidas na América Latina

Considerações finais

Referências Bibliográficas

Contenido del Capítulo

Luis G. Leite1

Famílias Heterorhabditidae e Steinernematidae (Rhabditida): Aspectos gerais

Dentre os heterorabditídeos, conhecem-se 11

espécies válidas no gênero Heterorhabditis,

enquanto na família Steinernematidae há 44

espécies em Steinernema e uma única em

Neosteinernema (Adams et al., 2006). Os membros

dessas famílias apresentam evidentes semelhanças

na biologia e ciclos de vida. É importante ressaltar,

contudo, que tal semelhança é decorrente de

perdem a cutícula extra e defecam, liberando as

bactérias (Poinar, 1966; Sicard et al., 2004). Estas se

multiplicam rapidamente, sintetizam toxinas e

outros compostos e, após curto período (no geral

inferior a 48 horas), causam septicemia no

hospedeiro (Jarosz et al., 1991; Ffrench-Constant &

Bowen, 1999).

O cadáver torna-se uma verdadeira “sopa

bacteriana”, ou seja, um meio rico em nutrientes

constituído pelas bactérias e por tecidos já

desorganizados do inseto, a partir do qual os

nematóides alimentam-se e desenvolvem-se,

passando para o último estádio juvenil (J4) e

formando os adultos da primeira geração, machos

e fêmeas. Os juvenis originados por

tais adultos ainda possuem à sua

disposição apreciável quantidade de

alimento, conseguindo completar o

ciclo e formar os adultos da segunda

geração dentro do cadáver do inseto.

Tal fato ocorre porque a decomposição

do cadáver é retardada, principalmente pela produção

de antibióticos pela bactéria (Forst & Clarke,

2002). Outras gerações completas do nematóide

podem ocorrer no cadáver do inseto, mas isso é

relativamente raro. A duração do ciclo do nematóide

no hospedeiro depende de vários fatores, dentre

esses: a espécie do inseto-hospedeiro, o tamanho

do JI, a temperatura ambiente, a quantidade de JIs

que penetraram no inseto (Boff et al., 2000).

Os juvenis originados pelos adultos da segunda

geração encontram baixa quantidade disponível de

bactérias e o grau de decomposição do cadáver

avançado. A falta de alimento no cadáver é percebida

pelos juvenis como um sinal para deixar o cadáver

e buscar novos hospedeiros (Prancha Vd). Assim,

desenvolvimentos paralelos convergentes e não de

relacionamento filogenético entre os representantes

de ambos os gêneros. Na verdade, os ancestrais de

ambos os grupos são bem distintos, tendo Steinernema

em ambiente tipicamente terrestre, ao passo que

Heterorhabditis o fez em habitat de costa marinha

(Poinar, 1990; Blaxter et al., 1998).

As espécies de Steinernema e Heterorhabditis estão

associadas de maneira mutualística a bactérias dos gêneros

Xenorhabdus e Photorhabdus, respectivamente. Tais

bactérias não formam esporos e, portanto,

não estágios resistentes, sendo encontradas

em geral nos nematóides infectantes ou nos

cadáveres de insetos infectados. Na associação,

os nematóides contribuem oferecendo

proteção à bactéria fora do cor-

po do artrópode hospedeiro e

atuando como transportadores da

bactéria do cadáver de um inseto ao

hemoceloma de outro vivo. Por

outro lado, as bactérias servem de

alimento aos nematóides, provendo-lhes meio nutriti-

vo adequado ao desenvolvimento e à reprodução,

sendo, portanto, considerados bacteriófagos

(Poinar, 1990; Dowds & Peters, 2002).

O ciclo de vida em Steinernema começa quando

juvenis de terceiro estádio (J3), também chamados

infectantes (JIs), carregando células da bactéria

Xenorhabdus sp. em uma vesícula localizada na

região anterior do intestino, penetram no corpo do

hospedeiro através de suas aberturas naturais

(boca, ânus, espiráculos). Esses juvenis são

morfologicamente adaptados à permanência no

solo, pois retêm a cutícula do segundo estádio, e

possuem o ânus e a boca fechados. Dentro do

hospedeiro, migram para o hemoceloma, onde

á

A falta de alimento no cadáver é percebida pelos juvenis como um sinal para deivar o cadáver e buscar novos hospedeiros

(Prancha Vd).

passam ao terceiro estádio retendo a cutícula do

segundo estádio, apreendem certa quantidade de

células bacterianas e migram para o ambiente

externo. Nesta forma de JIs, conseguem persistir

por meses no solo até a localização e penetração

em novos insetos hospedeiros, fechando o ciclo

(Patel et al., 1997) (Fig. 1).

Em Heterorhabditis, o ciclo biológico é

bastante semelhante ao de Steinernema, com a

diferença básica de que os adultos da primeira

geração reproduzem-se por hermafroditismo e os

da segunda por anfimixia (Poinar, 1990). Outra

diferença entre os dois gêneros está na localização

da bactéria simbionte, que em Heterorhabditis se

encontra espalhada na parte anterior do intestino.

Ao adentrar no hemoceloma, os JIs regurgitam as

células bacterianas ao invés de defecá-las (Ciche &

Ensign, 2003).

A recomendação de uso de algumas espécies

de Steinernema e Heterorhabditis como bioinseticidas

é resultante de uma intensiva fase de avaliação por

meio de estudos experimentais em laboratório,

micro-parcelas e áreas de campo, principalmente

durante as décadas de 1970 e 1980.

Tais pesquisas indicaram

claramente o potencial desses

nematóides no combate a

diferentes espécies de insetos

consideradas pragas de solo, em

especial lepidópteros, coleópteros

e dípteros. Também espécies que

vivem no interior de galerias formadas

em órgãos aéreos das plantas infestadas,

como as chamadas “brocas”, podem

ser eficientemente controladas por

tais nematóides. Entretanto, pragas

filófagas (comedoras de folhas)

como gafanhotos e vários tipos de

lagartas, em geral não são bem

controladas por tal método, devido à

grande susceptibilidade dos JIs à

dessecação (Lello et al., 1996).

Técnicas para a produção em larga escala de

Steinernematidae e Heterorhabditidae in vivo e

principalmente in vitro foram desenvolvidas e

possibilitaram a redução dos custos envolvidos a

níveis compatíveis com a produção comercial

(Ehlers, 2001) (Prancha VIg-m). Vários produtos

formulados à base desses nematóides encontram-se

disponíveis no mercado internacional atualmente

(Tabela 2), constituindo alternativa adicional e

viável ao público na área de bioinseticidas,

particularmente na América do Norte, Japão e

áçã ó ê

Figura 1. Ciclo de vida dos nematóides dos gêneros Heterorhabditis e Steinernema. Ferrraz et al. (2008).

Espécie Produto Comercial Empresa produtora / País

S. carpocapsae

Biosafe Ortho Monsanto/EUA, SDS Biotech /Japão,

Rhone Paulenc/Itália, Thermo Trilogy/EUA

Exhibit Ciba Geigy/EUA-Canadá-Europa

Boden-Nutzlinge Celaflor/Alemanha-Áustria

Sanoplant R. Maag/Suiça

Trigger // Helix Ciba Geigy/Canadá

Vector T&L Lesco UHS/EUA

Interrupt Farman/EUA

Defend Pitman-Moore/EUA

Vector PCO V.W. & Rogers/EUA

BioFlea Halt Farman/EUA

Bio Vector // Vector TL Thermo Trilogy/EUA

(sem nome) Andermatt Biocontrol AG/Suiça

S. feltiae

Nemasys Agric. Genetics Co./Reino Unido,

Magnet Thermo Trilogy/EUA

Stealth Ciba Geigy/Reino Unido

Entonem // Scia-Rid Koppert Biol. Systems B.V./Holanda

X-Gnat Thermo Trilogy/EUA

Traunen Andermatt Biocontrol AG/Suiça

Nema-plus e-nema GmbH/Alemanha

S. glaseri Vector WG Lesco UHS/EUA

S. scapterisci ProAct Biocontrol/EUA

S. riobrave

Devour-MC Thermo Trilogy/EUA

Vector-MC Lesco UHS/EUA e Thermo Trilogy/EUA

Bio Vector 355 Thermo Trilogy/EUA

H. bacteriophora

Otinem // Cruiser1 Ecogen/EUA

Nema-Top // Nemagreen e-nema GmbH/Alemanha

Probione Probioma/Bolivia

H. megidis

Larvanem Koppert Biol. Systems B.V./Holanda

Nemasys-H Agr. Genetics Co./Reino Unido

Dickmaulrüssnematoden Andermatt Biocontrol AG/Suiça

Heterorhabditis e

Steinernema spp.

Scanmask // Ecomask //

Heteromask BioLogic Company/EUA

Tabela 2. Produtos à base de Steinernema e Heterorhabditis disponibilizados a pesquisadores ou encontrados no mercado durante a década de 1990 e destinados ao controle de insetos em gramados, plantas ornamentais, horticultura e agricultura em geral.*

* elaborado a partir de Georgis et al. (1995) e www.sipweb.org/directorymcp/nematodes.htm

1. disponível apenas a pesquisadores na formulação WP.

á

Entre as vantagens de tais produtos,

destacam-se: a) juvenis infectantes podem ser

produzidos de maneira barata em insetos

hospedeiros ou em meios artificiais (Bedding,

1981); b) podem ser armazenados (Bedding, 1984);

c) são facilmente aplicados a campo na água de

irrigação ou pulverizados (Cabanillas & Raulston,

1996); d) possuem a habilidade de buscar o

hospedeiro (Lewis et al., 1993); e) são compatíveis

com a maioria dos pesticidas (Forschler et al., 1990;

Rovesti & Deseo, 1990; 1991); f) são seguros a

invertebrados e vertebrados (Akhurst & Smith,

2002); g) reproduzem-se no hospedeiro produzindo

novas gerações (Wouts, 1991); e h) possuem estreito

espectro de hospedeiros, sendo muitas vezes

bastante específicos, não causando portanto

mortalidade indiscriminada (Peters, 1996).

A ausência de riscos ao homem e animais

domésticos tem isentado esses produtos à base de

nematóides entomopatogênicos da obrigatoriedade

do registro junto a Environmental Protection

Agency (EPA) nos Estados Unidos e a órgãos

semelhantes em outros países, proporcionando aos

fabricantes apreciável economia em termos de

investimento e tempo para o lançamento no

mercado (Jansson, 1993; Elhers, 1996). No Brasil,

nova regulamentação sobre o registro desses

nematóides nativos e exóticos para o controle de

pragas foi recentemente publicada e comentada

(Dolinski & Moino Jr., 2007).

Aplicação Os nematóides podem ser aplicados por

sistemas convencionais, como os usados para

defensivos químicos e fertilizantes, e por sistemas

de irrigação (Grewal, 2002). No controle de pragas

subterrâneas, a aplicação deve ser realizada logo

após a irrigação ou em períodos chuvosos, quando

o solo apresenta umidade favorável à atuação do

nematóide, sendo recomendada vazão de 750 a

1890 litros/ha, embora a maioria dos pulverizadores

seja projetada para volumes de 200 a 400 litros/ha.

Os pulverizadores de baixo volume também

podem ser utilizados para aplicação de nematóides,

porém a deposição dos agentes no solo deve ser

auxiliada com uma irrigação da área tratada logo

após a pulverização (Georgis et al., 1995; Grewal,

2002).

Para a aplicação dos nematóides, devem ser

removidos os filtros e telas dos pulverizadores,

pois podem dificultar e até impedir a passagem

deles, particularmente nos casos das espécies

maiores, como S. glaseri, cujos juvenis ficam retidos

até mesmo em telas de malha 100. Esses nematóides

toleram altas pressões durante a pulverização,

porém a pressão não deve exceder 300 psi (2070

kPa). Também deve ser evitada a reciclagem excessiva do

nematóide de volta para o sistema de bombeamento

dos pulverizadores (Grewal, 2002).

A sobrevivência e a eficácia na atuação dos

nematóides após a aplicação podem ser afetadas

pelo tipo, umidade e temperatura do solo. Em

geral, os nematóides são mais ativos e persistem

por mais tempo em solos arenosos do que em

solos argilosos (Kaya, 1990). Necessitam de umidade

no solo para movimentação e sobrevivência, mas

são inviabilizados em solos encharcados. A faixa

de temperatura do solo favorável à atuação dos

áçã ó ê

nematóides entomopatogênicos é a de 12 a 28◦C,

sendo que as temperaturas muito elevadas

reduzem sensivelmente as chances de sobrevivência e

as excessivamente baixas limitam tanto a atividade

como a infectividade.

Os juvenis infectivos são compatíveis com a

maioria dos defensivos químicos quando expostos a

eles por curtos períodos (Ishibashi, 1993),

o que possibilita o emprego dos nematóides

entomopatogênicos em misturas com herbicidas,

fungicidas, acaricidas e inseticidas. No entanto,

alguns defensivos podem reduzir a infectividade e

sobrevivência dos nematóides (Grewal et al., 1998),

sendo os heterorrabditídeos geralmente mais afetados

que os esteinernematídeos (Grewal, 2002). Algunos

inseticidas atuam sinergìsticamente com nematóides

entomopatogênicos, aumentando a eficácia desses

organismos em aplicações inundativas

(Koppenhofer & Kaya, 1998; Nishimatsu & Jackson,

1998). Os nematóides entomopatogênicos são

também compatíveis com a maioria dos

fertilizantes inorgânicos em misturas de tanque,

mas populações naturais são negativamente

afetadas por eles (Bednarek & Gaugler, 1997).

Pesquisas com Steinernematidae e Heterorhabditidae e utilização prática como bioinseticidas na América Latina

Estudos básicos relativos a Steinernema e

Heterorhabditis na América Latina, tratando

especialmente da descrição de espécies, caracterização

de isolados, levantamentos de ocorrência,

multiplicação em larga escala e avaliação da ação

patogênica têm sido desenvolvidos na Argentina,

Brasil, Colômbia, Cuba, México e Venezuela

(Stock, 2002).

Descrição de espécies e caracterização de

isolados: Entre as espécies descritas da Argentina,

destacam-se S. rarum de Doucet, 1986, S. ritteri de

Doucet & Doucet, 1990 e H. argentiniensis Stock,

1993, além de populações locais com características

especiais, ou isolados, como de S. carpocapsae, S.

feltiae, S. scapterisci e H. bacteriophora (Stock, 2002).

Em relação a Cuba, tem-se a descrição de S.

cubanum e a caracterização de isolados locais de

H. bacteriophora e H. indica (Mracek et al., 1994). A

espécie S. scapterisci, embora descrita nos Estados

Unidos, foi originalmente obtida durante levantamento

de nematóides entomopatogênicos realizado no

Uruguai, sabendo-se hoje ocorrer também na

Argentina (Stock, 1992).

Mais recentemente, pelo menos mais 4 novas

espécies de nematóides entomopatogênicos foram

descritos em toda America latina: Heterorhabditis

mexicana (Nguyen et al.2004) encontrado na região

de Tamaulipas, Mexico, S. costaricense e S. puntauvense

(Uribe-Lorío et al. 2007) encontrados em Costa

Rica, e Steinernema colombiense (Lópes-Núñes et al.,

2008) descrito na Colombia.

No Brasil, foram feitas as descrições de duas

novas espécies: Heterorhabditis amazonensis (Andaló

et al. 2006) encontrado na região Amazônica, e

Steinernema brazilense (Nguyen et al. 2010) isolado de

solo coletado no estado do Mato Grosso do Sul.

á

Levantamentos de ocorrência: Levantamento de

ocorrência de nematóides entomopatogênicos em

solos da região dos Pampas na Argentina revelou

grande diversidade em termos de composição

da nematofauna e confirmou o potencial desses

organismos no controle natural de certas pragas,

particularmente as de solo. Espécies de Steinernema

(S. carpocapsae, S. feltiae e S. scapterisci) e

Heterorhabditis (H. bacteriophora e H. argentiniensis)

foram encontradas com freqüência, sendo observadas

parasitando larvas de diferentes coleópteros e ninfas

da paquinha, Scapteriscus borelli, entre outros

insetos daninhos à agricultura. Estudos semelhantes

realizados em outras regiões do país evidenciaram

que H. bacteriophora tinha grande potencial

como agente biocontrolador de pragas (Stock,

1992).

No Brasil, há registros de encontro em

condições naturais de S. glaseri associado a ovos de

Migdolus fryanus, conhecida praga de solo de

cana-de-açúcar no estado de São Paulo (Pizano et

al., 1985). Além disso, há o relato pioneiro (Pereira,

1937) de associação de um heterorabditídeo, na

época identificado como Rhabditis hambletoni, com a

broca do algodoeiro, Eutinobothrus brasiliensis, o qual

constituiria o primeiro Heterorhabditis encontrado,

contudo não reconhecido (Georgis & Hom, 1992).

Amostragens de solo e isolamentos de

nematóides entomopatogênicos foram realizados

nos estados de Rondônia (Machado & Dolinski,

2004), Amazonas (Andaló et al., 2006), Minas

Gerais (Acevedo et al., 2005), Rio de Janeiro

(C. Dolinski, Uenf, comunicação pessoal, 2007) e

São Paulo (Fowler, 1988; L.G. Leite, Ceib, comunicação

pessoal, 2007), sendo que a maioria dos isolados

obtidos foi identificada como pertencente ao gênero

Heterorhabditis.

Na Colômbia, H. bacteriophora foi encontrado

durante levantamento de campo utilizando larvas

de Galleria mellonella como iscas; o nematóide

apareceu associado mais comumente ao percevejo

de solo Cyrtomenus bergi (Caicedo & Bellotti, 1996).

Em Cuba, mediante a utilização de larvas de

G. mellonella como iscas em solo de pomares cítricos,

foi possível a coleta de população de espécie de

nematóide filiada a Steinernema identificada como

nova para a ciência, posteriormente descrita como

S. cubanum. Dois isolados de H. bacteriophora,

denominados Tetuan e P2M, foram identificados a

partir de amostras de solo parasitando, respectivamente, os

coleópteros Cylas formicarius e Pachnaeus litus. Em

outro levantamento em áreas cultivadas da

província de Havana, verificou-se que,

dentre os nematóides encontrados incluíam-se

pelo menos três populações de H. bacteriophora

(Rodriguez et al., 1996).

No México, levantamento de campo foi

desenvolvido para a identificação dos diferentes

tipos de agentes de biocontrole de Spodoptera frugiperda

que ocorrem em áreas de cultivo de milho e sorgo

nos estados de Jalisco, Colima, Michoacan e

Tamaulipas. Entre os entomopatógenos encontrados,

estavam espécies de Steinernema e Heterorhabditis

obtidas com iscas de G. mellonella em solo de cinco

das dezenove áreas amostradas. Bacillus thuringiensis

e Steinernema spp. foram considerados os

entomopatógenos de solo de mais ampla distribuição

na Costa Oeste do México (Lezama-Gutierrez et

al., 2001).

áçã ó ê

Na Venezuela, diferentes populações de

H. indica e Heterorhabditis spp. foram obtidas de

amostras de solo durante levantamento nos

estados de Aragua e Miranda, possivelmente

ocorrendo em associação com a broca-da-

bananeira, Cosmopolites sordidus (Rosales & Suarez,

1998).

Produção em larga escala: Um dos fatores mais

importantes a ser considerado no desenvolvimento

de um bioinseticida à base de nematóides é a

possibilidade de produzir tais agentes a um custo

aceitável e em quantidade suficiente para permitir a

comercialização do produto (Georgis & Hom, 1992).

Dentro desse contexto, espécies de Steinernema e

Heterorhabditis têm sido multiplicadas in vivo e in

vitro, sendo a primeira forma empregada para

pequena e média escala de produção, visando a

manutenção do nematóide em laboratório ,

realização de bioensaios e aplicação no campo na

forma de cadáveres, e a segunda para escala mais

ampla, onde os JIs são aplicados pelo sistema de

irrigação ou são formulados.

O cultivo in vivo possui uma série de

vantagens dentre elas a simplicidade, o baixo custo

da matéria prima e dos equipamentos empregados,

e a não necessidade de mão-de-obra especializada.

Na prática, o maior gasto nesse sistema está na

criação das larvas, cuja dieta corrobora com a maior

parcela dos custos na criação. Nesse tipo de produção,

em geral utilizam-se larvas de G. mellonella como

inseto-hospedeiro, sendo a mais empregada no

mundo, inclusive como inseto padrão nos testes de

patogenicidade e na descrição taxonômica das

espécies. A dieta para criação desse inseto está em

constante aprimoramento, objetivando-se baratear

o custo. Esta dieta vem sendo modificada com

sucesso, substituindo-se ingredientes mais caros

por mais baratos, tornando a multiplicação dos

nematóides mais viável (C. Dolinski, Uenf,

comunicação pessoal, 2007). A seqüência de criação

das larvas e infecção dos nematóides é ilustrada na

Fig. 2. Além de larvas de G. mellonella, vêm sendo

testados outros hospedeiros como Diatraea saccharalis,

Spodoptera frugiperda, Bombyx mori, Tenebrio molitor e

Cylas formicarius, porém todos os hospedeiros testados

produzem menos JIs do que larvas de G. mellonella

(Folegatti et al., 1988; Jansson, 1996; Molina et al.,

2004).

No Brasil, iniciativas no sentido do

desenvolvimento de um produto comercial à base

de nematóides entomopatogênicos vêm ganhando

destaque nos últimos anos. Leite et al. (2005)

destacam o desenvolvimento de meios para cultivo

in vitro de nematóides e técnicas de produção

massal. Um meio à base de fígado bovino, encharcado

em esponja, proporcionou produção bastante

elevada do nematóide Heterorhabditis sp., com

rendimento de até 180.000 juvenis por mL de

meio. Também foi desenvolvida uma formulação

pó-molhável que permite a preservação do

nematóide por um período de até 2 meses em

prateleira (25oC) e 7 dias a 35oC. O nematóide não

tolerou a temperatura de 5oC, sendo rapidamente

inviabilizado. Essas pesquisas são apoiadas pelo

Programa de Inovação Tecnológica em Pequenas

Empresas (Pipe/Fapesp) e pela empresa

BioControle Métodos de Controle de Pragas Ltda.

Também a produção in vivo tem sido focada,

num projeto em andamento no Programa de

Incentivo à Inovação (PII), desenvolvido na

á

Universidade Federal de Lavras, MG (Ufla),

financiado pela Secretaria Estadual de Ciência e

Tecnologia de Minas Gerais, SEBRAE e Prefeitura

Municipal de Lavras (A. Moino Jr., Ufla, comunicação

pessoal, 2007).

No México, a produção massal “in vitro” pelo

processo fermentativo tem sido o foco das

pesquisas e estudos avançados vem sendo

realizados visando estabelecer as melhores

condições para transferência de oxigênio ao meio

líquido na produção de Steinernema carpocapsae

CABA01 isolado do estado de Hidalgo (Maciel-

Vergara, 2010).

Avaliação da ação patogênica:

Devido ao grande interesse despertado

pelos nematóides dos gêneros

Steinernema e Heterorhabditis

como importantes agentes

biocontroladores de insetos-praga

em todo o mundo, a partir da década

de 1980 intensificaram-se também

na América Latina as pesquisas

objetivando a adequada caracterização

das populações locais e de isolados estrangeiros

quanto à patogenicidade a insetos-praga em

diferentes culturas.

As cigarrinhas são importantes para cana-de-

açúcar e pastagens em países como Argentina,

Brasil, Venezuela, México e vários outros da

América Central. As ninfas atacam as raízes e são

de difícil controle por meio de inseticidas químicos.

Assim, nematóides filiados a Steinernematidae e

Heterorhabditidae aparecem como candidatos

naturais ao combate dessas pragas porque esses

insetos na fase ninfal vivem em ambiente úmido

(quase na superfície do solo, sob a palhada), propício

a sobrevivência e alta atividade dos nematóides; e

vivem próximas umas das outras, comumente

formando colônias, o que pode favorecer a

ocorrência de epizootia. Resultados experimentais

preliminares (Georgis & Hom, 1992) indicaram

que S. carpocapsae Mexicana mostrou alta

patogenicidade a ninfas e adultos de cigarrinhas da

cana, Aeneolamia spp., sobrevivendo bem em areia

por mais de quatro semanas e migrando a mais de

10 cm de distância para alcançar a presa em solo

argiloso relativamente compactado. Ferrer et al.

(2004) avaliaram H. bacteriophora contra A. varia em

campo de cana-de-açúcar na Venezuela e obtiveram

75% de controle na dose de 1 x 108

JI /ha.

Outros estudos têm indicado que

também ninfas da espécie

Mahanarva fimbriolata, de ocorrência

freqüente no Brasil, são bastante

suscetíveis a certas espécies de

Steinernema (S. glaseri, por exemplo)

e Heterorhabditis (Grewal et al., 2001).

Leite et al. (2006) avaliaram H.

indica contra M. fimbriolata em cana-de-açúcar,

obtendo 66-73% de controle nas doses de 6,6 x

107 a 3,3 x 109 JI/ha, resultados semelhantes aos

obtidos por Ferrer et al. (2004).

Segundo Leite et al. (2006), o Instituto

Biológico de São Paulo, em colaboração com o

Centro de Tecnologia Canavieira (CTC) e a

Universidade Federal de São Carlos (UFSCar/

CCA) vem desenvolvendo pesquisas procurando

avaliar nematóides entomopatogênicos para o

controle de Sphenophorus levis na cultura da cana

áçã ó ê

Pesquisadores vem desenvolvendo trabalhos procurando avaliar

nematóides entomopatogênicos para o controle de

Sphenophorus levis na cultura da cana-de-açúcar

(Prancha Ve-f).

-de-açúcar (Prancha Ve-f). Em testes de

laboratório, o nematóide Steinernema sp.

(IBCB-n6) mostrou-se mais eficiente que

Heterorhabdidits indica (IBCB-n5), proporcionando

mortalidade de 70% na concentração de 2,4 JI/cm2

(equivalente a 1x108 JI/ha). Também foi avaliada a

utilização conjunta dos nematóides com inseticidas

químicos em subdosagem, com resultados

interessantes com relação aos insetos adultos, na

associação Steinernema sp. (1x108 JI/ha) +

thiamethoxam 250WG (250 g p.c/ha), com

mortalidade acima de 70%. Em teste de campo, o

uso dos nematóides isoladamente proporcionou

ganhos de 16 e 10 t/ha na produção da cana,

respectivamente para Steinernema sp. e Heterorhabditis

indica, e a mistura de Steinernema sp. com

thiamethoxam na concentração de 500 g p.c./ha

causou incremento na produção de cana de até 28

ton./ha. Em outros dois testes de campo, o

nematóide Steinernema sp. IBCB-n6 proporcionou

ganhos na produção de colmos de até 17 t/ha,

semelhante àquele obtido com o inseticida fipronil

800WG 250 g/ha (21 t/ha). Atualmente, o Instituto

Biológico vem procurando implementar o uso do

nematóide Steinernema sp. na cultura da cana-de-

açúcar visando o controle do S. levis. Para isso, o

nematóide é produzido in vitro pelo processo da

esponja, sendo já fornecido para o tratamento de

50 hectares de cana-de-açúcar do grupo Dedini,

em São João da Boa Vista, SP. A aplicação em área

descoberta de palha vem sendo realizada através de

pulverizações tratorizadas com bicos tipo leque ou

jato, dirigidas para dentro da faixa de 25 cm de cada

lado das linhas da cultura.

Ainda em relação à cana-de-açúcar,

desenvolveram-se testes preliminares de campo no

Brasil visando avaliação da eficiência de dois

isolados norte-americanos de S. carpocapsae no

controle de M. fryanus, espécie de coleóptero tida

como das mais importantes pragas de solo da

cultura (Arrigoni et al., 1986). Aplicações de

suspensão dos nematóides por pulverização ao lado

das linhas de plantio, em concentrações de até

100000 juvenis/m2, foram seguidas de pesada irrigação,

para favorecer a sobrevivência e atividade dos

parasitos no solo. Os níveis de parasitismo de

larvas da praga coletadas após 4, 14 e 18 dias do

tratamento variaram de 1,7 a 9,2%, sendo considerados

muito baixos. A reduzida eficácia da técnica foi

atribuída a diversos fatores, entre os quais: a) seleção

de isolados pouco ou não adaptados ao combate

do coleóptero; b) condições e doses inadequadas

de aplicação do bioinseticida; c) dificuldades devidas

ao hábito da praga de aprofundar-se muito no solo,

freqüentemente escapando ao raio de ação do

parasito. Esse trabalho demonstra a importância de

se conhecer a praga que se pretende controlar e os

nematóides entomopatogênicos, lembrando a

importância de se buscar NEPs nativos já adaptados

às condições locais (Dolinski & Moino Jr., 2007).

Outra praga que vem sendo alvo de estudos

visando o controle por nematóides entomopatogênicos

é a broca-da-bananeira, C. sordidus, problema

tanto em países produtores da América do Sul

como Central e região caribenha. Abrindo galerias

no rizoma da planta, esse coleóptero favorece

infecções secundárias por fungos altamente

fitopatogênicos bem como concorre ao tombamento

pela ação de ventos. Testes em laboratório vêm

demonstrando a atividade larvicida de vários NEPs

contra esta praga. No Brasil, na região produtora

do Vale do Ribeira (Estado de São Paulo),

á

empregando-se os isolados All e UK de

S. carpocapsae, realizaram-se aplicações do

nematóide com pulverizadores manuais, à dose de

5 x 106 espécimes/m2 por 0,4 L de água, dirigidas

ao solo e a iscas preparadas com pseudocaule de

bananeira, atrativas a adultos do inseto. Foram

obtidos índices de mortalidade variáveis de 51% a

70% para adultos coletados após sete dias do

tratamento, e de 22 a 40% para adultos coletados

aos 21 dias do tratamento. Tais dados indicaram a

possibilidade de obter controle de C. sordidus pela

aplicação do nematóide sobre as iscas ou pela

distribuição das iscas sobre solo tratado com o

nematóide (Schmitt et al., 1992).

Figueroa (1990) avaliou S. carpocapsae, S. glaseri

e S. feltiae contra C. sordidus em casa-de-vegetação

em Porto Rico. Os nematóides, nas concentrações

de 400, 4000 e 40.000 JIs/plantas de 4 meses,

reduziram significativamente o número de túneis

feitos pelas larvas. Nas duas concentrações maiores,

100% de mortalidade das larvas foi alcançada.

Treverrow & Bedding (1993) testaram 32 linhagens e

espécies de Steinernema e Heterorhabditis contra larvas

e adultos de C. sordidus e relataram a alta atividade

da linhagem BW de S. carpocapsae contra adultos.

Treverrow et al. (1991) também conseguiram alto

controle de larvas de C. sordidus nos rizomas,

aplicando S. carpocapsae com emulsificante em orifícios

feitos em rizomas para descarte. Kermarrec &

Maulon (1989) demonstraram o sinergismo entre

inseticidas e S. carpocapsae no controle de C. sordidus.

Em Guadalupe e na Martinica, foram feitas

pulverizações de suspensões de nematóides no

solo ao redor do pseudocaule das plantas, com

resultados bem inferiores aos proporcionados pelo

uso de inseticidas. Todavia, a colocação de larvas

de G. mellonella previamente inoculadas com os

isolados e substituídas semanalmente, junto a iscas

com feromônio, tem resultado comparável ou até

superior ao obtido mediante duas aplicações de

inseticidas ao ano (Chabrier et al., 2003).

O percevejo Cyrtomenus bergi inclui-se entre as

pragas mais importantes da cultura da mandioca na

Colômbia; alimentando-se nas raízes da planta,

facilita o acesso de patógenos secundários, que

aceleram o apodrecimento do sistema radicular.

Como típica praga de solo, oferece condições

aparentemente favoráveis ao controle por meio

de nematóides entomopatogênicos. Em vista disso,

desenvolveu-se estudo em laboratório (Barberena

& Bellotti, 1998) para avaliar o potencial de

dois isolados de H. bacteriophora, LFR 92 e SQC

92, como possíveis agentes de biocontrole do percevejo.

Verificou-se que ambos os isolados

proporcionaram alta mortalidade da praga, sendo

o quinto ínstar ninfal considerado o estágio mais

suscetível.

Na cultura da batata, ocorrem pragas de interesse

econômico que poderiam ser controladas com

nematóides. São exemplos Premnotrypes vorax

(“Andean weevil” ou “Gusano blanco de la papa”)

na Colômbia, e Tecia solanivora (“Polilla guatemalteca

de la papa”) na Venezuela. No primeiro caso, avaliou-

se, em laboratório, o potencial de um isolado colombiano

de Steinernema sp., em comparação ao isolado co-

mercial Exhibit® de S. carpocapsae (Tab. 2). Ambos

os isolados causaram a morte de P. vorax, mas o

Exhibit® mostrou-se bem mais agressivo

(Garzon et al., 1996). Em estudo semelhante,

larvas de T. solanivora revelaram-se bastante susce-

tível a um isolado de S. feltiae e a uma população

áçã ó ê

venezuelana de Heterorhabditis sp. (Het 1). As taxas

de mortalidade variaram de 70 a 100% no caso do

isolado Het 1, aumentando com o nível inicial de

inóculo; S. feltiae foi mais virulento, obtendo-se

100% de mortalidade com apenas 53 nematóides

por larva do inseto (Fan et al., 2000).

Em café, uma das principais pragas é a broca

-do-cafeeiro, Hypothenemus hampei, pois causa

sérias perdas devido à destruição e queda dos frutos

infestados. No México, em estudos de laboratório,

uma espécie nativa de Heterorhabditis mostrou-se

capaz de penetrar nos frutos atacados e causar elevada

mortalidade em larvas e adultos do inseto.

Na Colombia, a broca é

considerada a praga mais importante

na cultura do cafeeiro, por atacar

diretamente o fruto, causando perdas

de peso, depreciação do grão e perda

na qualidade da bebida (Bustillo,

1999). Estudos realizados no Centro

Nacional de Investigaciones de Café

(Cenicafé) demonstraram que a broca

permanece nos frutos que caem ao

solo, funcionando como fonte de incre-

mento populacional da broca, com a emergência de

adultos e sua dispersão na lavoura (Baker et al.,

1994).

Assim, nematóides entomopatogênicos têm

sido considerados inimigos naturais da praga (Baker,

1999; Commonwealth Institute of Biological Control,

1990; Georgis & Hom, 1992), e vários estudos têm

sido realizados, avaliando a patogenicidade e

virulência de Steinernematidae e Heterorhabditidae

aplicados em diferentes estágios biológicos da broca

(Allard & Moore, 1989; Georgis & Hom, 1992;

Castillo, 1995), com destaque para Heterorhabditis

bacteriophora e Steinernema feltiae com mortalidades

superiores a 85%.

Pesquisas em laboratório vêm sendo

desenvolvidas com o objetivo de selecionar

isolados de nematóides capazes de causar mortalidade

à cochonilha Dysmicoccus texensis em plantas de

café. Andaló et al. (2004a) selecionaram o nematóide

Steinernema carpocapsae, causando cerca de 78 %

de controle na concentração de 25 nematóides/

cochonilha. Alves (2006) continuou e aprofundou

os estudos com o uso de nematóides entomopatogênicos

para o controle da cochonilha-da-raiz-do-cafeeiro,

verificando que todos os isolados testados foram

patogênicos à praga. Os isolados

pertencentes ao gênero Steinernema

foram menos virulentos do que os

do gênero Heterorhabditis. A

porcentagem máxima de mortalidade

alcançada pelos isolados do gênero

Steinernema foi de 33%. Por

outro lado, os isolados do gênero

Heterorhabditis alcançaram valores

de até 100% de mortalidade. Em

experimentos realizados no campo, a aplicação do

isolado JPM3 de Heterorhabdtitis pelo método de

suspensão aquosa, e do inseticida tiametoxam, usado

como padrão de comparação, apresentaram 65 e

81%, de eficiência de controle, respectivamente.

Esses resultados indicam o isolado JPM3 como um

agente promissor no controle de D. texensis,

entretanto, testes mais detalhados ainda são necessários

para a validação dos dados obtidos em campo,

inclusive com a determinação de dosagens e métodos

de aplicação mais adequados, porém, o indicativo é

positivo.

á

Nove diferentes linhagens de NEPs nativos e evóticos foram testados contra as larvas no quarto instar do Conotrachelus psidii proporcionaram 30% e 58% de mortalidade nas duas

maiores concentrações (Dolinski et al., 2006).

Também na cultura do cafeeiro, estudos

preliminares para avaliação da patogenicidade de

NEPs sobre ninfas da cigarra-do-cafeeiro Quesada

gigas têm sido realizados, sendo selecionados dois

isolados de Heterorhabditis sp. e S. riobrave como os

mais virulentos, e também verificando a eficiência dos

nematóides selecionados no deslocamento vertical

em coluna de solo, visando maior eficácia no

controle das ninfas móveis com aplicações no solo,

o que será alvo de estudos futuros (Silva, 2007).

Em relação aos insetos sociais considerados

pragas, comumente subterrâneos, a exemplo de

cupins, alguns trabalhos foram desenvolvidos. Em

estudo de laboratório no Brasil (Passos et al.,

1995), aplicações da formulação Exhibit® de S.

carpocapsae sobre folhas que serviram de alimento à saúva

-limão, Atta sexdens rubropilosa, proporcionaram taxas

de mortalidade de 27, 90 e 97% para as castas de

jardineiras, operárias e soldados, respectivamente.

Confirmada a patogenicidade, realizaram-se aplicações

do nematóide à razão de 1.000 JIs/cm2 de folha

em dois ninhos artificiais verificando-se que as

operárias não cortaram as folhas inoculadas, mas

contaminaram-se durante sua movimentação,

transportando o parasito para o interior do sauveiro,

inclusive à câmara em que se encontrava a rainha.

Observou-se esforço no sentido de descartar as

formigas doentes e de isolar o fungo contaminado

nas “panelas” de lixo. Houve morte de exemplares

das diferentes castas e redução no volume de fungo usado

como alimento.

O mesmo isolado de S. carpocapsae foi avaliado

em outro estudo preliminar, também em laboratório,

frente ao cupim Heterotermes tenuis (Passos & Alves,

1995; Rosa et al., 2008). Embora altos índices de

mortalidade fossem obtidos para operários e soldados

mediante a aplicação de 75 JIs/cm2 do substrato

usado como isca (papel corrugado), os resultados

não foram conclusivos porque se verificou que a

substância ativadora dos nematóides contida no

produto comercial exerceu certa toxicidade

sobre os cupins. Quando se empregaram

níveis mais elevados, como 1.000 JIs/cm2, os

nematóides foram detectados e mostraram

aparente efeito repelente, sendo evitados pelos

cupins.

Uma importante praga em goiabeira, o gorgulho-

da-goiabeira, Conotrachelus psidii vem sendo alvo de

estudo no Estado do Rio de Janeiro. Essa praga

possui o quarto instar e a pupa no solo, o que favorece

o controle por NEPs. Nove diferentes linhagens

de NEPs nativos e exóticos foram testados contra as

larvas no quarto instar desse inseto em laboratório.

Experimentos em casa-de-vegetação em potes de

20 L com 10 larvas do gorgulho e JIs de H. baujardi

LPP7 nas concentrações de 500, 1000 e 2000 IJs,

proporcionaram 30% e 58% de mortalidade nas

duas maiores concentrações (Dolinski et al., 2006).

Além do gorgulho, outra praga da goiaba que vem

sendo alvo em testes com NEPs é a mosca-do-

mediterrâneo, Ceratitis capitata. Rohde (2007) verificou a

patogenicidade de diversos isolados de nematóides

entomopatogênicos a C. capitata, sendo que S.

carpocapsae e Heterorhabditis sp. (RSC01) causaram

mortalidade superior a 85% para a fase larval e

Heterorhabditis sp. PI, Heterorhabditis sp. JPM4, H.

bacteriophora HP88, S. feltiae e S. glaseri foram os mais

eficientes para a fase de pupa, com a mortalidade variando

entre 35 e 44 %. Segundo Silva et al. (2009), o

nematóide H. indica IBCB n5 aplicado em cultivo

de goiaba, nas doses de 1 e 10 JI / cm², foi mais

áçã ó ê

eficiente contra a mosca-do-Mediterrâneo

(mortalidades de 66 e 93 %) que para o gorgulho

da goiaba (33 e 50 %), ambos os insetos liberados

sobre o solo na fase de pré-pupa.

Nematóides vêm sendo avaliados também

contra a broca das raízes do dendê, Sagalassa valida.

Aponte & Olivares avaliaram o nematóide Steinernema

sp. SNIO198 em coluna de areia e constataram

eficiência de busca do hospedeiro estando os insetos

fora ou dentro das raízes.

Uso comercial: Apesar do grande destaque que os

nematóides entomopatogênicos vem ganhando

como agentes potenciais para o controle de pragas

na America Latina, o uso comercial ainda está

restrito a poucos países, sendo o produto obtido

de importação ou de processo de produção in “in

vivo” usando larvas de Galleria mellonella.

No Chile, o nematóide usado, S. carpocapsae, é

produzido na Espanha e formulado em uma

mistura de juvenis infectivos mais quitosam

(quitina). Esse produto é recomendado contra

diversos insetos de diferentes ordens, apresentando

efeito sinergistico contra Rhincophorus ferruiginea,

importante praga em palmeiras. Para esse inseto, o

produto é recomendado na dose de 5 – 10 milhões

de JI/palmeira + quitossam (10%), apresentando

eficiência quando usado como curativo ou preventivo,

aplicado na coroa da planta. O quitossam protege e

ativa os nematóides além de fortalecer as palmeiras,

bioestimulando os mecanismos de defesa.

Na Bolivia, H. bacteriophora vem sendo produ-

zido comercialmente por um processo “in vivo”

desenvolvendo e divulgando essa nova técnica,

faltam empresas idôneas interessadas em produzi-los e

distribuí-los. O mercado de bioinseticidas formulados

à base de nematóides é quase inexistente. A exceção é

o México, devido à sua proximidade geográfica em

relação aos Estados Unidos, mas existe uma

tendência de maior popularização de tal método de

controle na América Latina, ainda que de forma

lenta e gradativa.

Um ponto importante para o sucesso dos

NEPs é a escolha do nematóide, que deve ser feita

com critério e parcimônia. Nematóides nativos

devem ter prioridade sobre os exóticos, pois estão

adaptados às condições climáticas como também à

entomofauna local. Nematóides entomopatogênicos

devem ser devidamente identificados ao nível de

Apesar dos trabalhos já desenvolvidos e das

condições climáticas favoráveis à implementação

do controle de pragas agrícolas por nematóides

entomopatogênicos das famílias Steinernematidae

e Heterorhabditidae, tal prática ainda não vem sendo

feita comercialmente na América Latina. Há grande

número de pragas economicamente importantes,

típicas das regiões tropical e subtropical, que,

teoricamente, poderiam ser bem controladas por

tais grupos de nematóides (Georgis & Hom, 1992),

porém o método persiste até o momento apenas

como alternativa promissora. Ainda há muito

mercado e espaço para o s n e m a t ó i d e s

entomopatogênicos, pois mais e mais os produtores

estão buscando alternativas aos pesticidas tradicionais.

Pesquisadores vêm fazendo sua parte

Considerações finais

á

espécie e ter a biologia definida antes de serem

usados a campo.

O sistema de multiplicação de nematóides

deve ser escolhido de acordo com a necessidade

e a disponibilidade de espaço e investimento. A pro-

dução in vivo pode ser uma boa alternativa em laborató-

rios, para associações ou pequenas empresas. Este tipo

de produção favorece a formulação em cadáveres. A

desvantagem deste método seria a impossibilidade

de se aumentar a produção (“scale-up”), pois

demanda muito espaço e mão-de-obra. A produção in

vitro em meio sólido, também parece ser uma boa

alternativa para pequenos mercados em franca

expansão. A multiplicação em meio líquido precisa

ser estudada com mais afinco antes de ser implementada,

para que não haja perda da confiabilidade nos

nematóides entomopatogênicos pelo mercado. Por

ser um método mais elaborado, deve-se fazer

uma boa pesquisa de mercado para constatar a

real necessidade de se produzir tão grande quantidade

de juvenis infectantes e aplicar tantos recursos.

Este tipo de produção deve estar associado à

formulação em pó-molhável ou em grânulos, para

que possa atingir grandes mercados. Produtos

biológicos não deveriam chegar ao mercado com

preços mais elevados do que produtos químicos já

estabelecidos. Por isso o custo de produção precisa

ser baixo e o produto de alta qualidade.

Outro ponto que se deve manter em mente é

que uma espécie de NEPs não deve e não pode

ser utilizada para o controle de todas as pragas;

portanto, quando se almeja produzir várias espécies

ao mesmo tempo, deve-se focar no cultivo in vivo

ou in vitro em meio sólido.

De fato, do que foi aqui exposto, verificou-se

o grande potencial dos nematóides entomofílicos e

entomopatogênicos no controle biológico de

pragas agrícolas e urbanas. Mais pesquisas são

necessárias, contudo já se vislumbra um futuro

promissor na utilização desses agentes do controle

biológico no Brasil e na América Latina.

Referências Bibliográficas Acevedo, J.P.M.; Moino Jr., A.; Cavalcanti, R.S.; Dolinski,

C.; Carvalho, F.A. 2005. Amostragem e Avaliação de técni-

cas para isolamento de nematóides entomopatogênicos nati-

vos. Nematologia Brasileira, 29(1): 17-23.

Adams, B.J.; Fodor, A.; Klein, M.G.; Smith, H.L.; Stacke-

brandt, E.; Stock, S.P. 2006. Biodiversity and systematics of

nematode-bacterium entomopathogens. Biological Control, 38:

4-21.

Adams, B.J.; Nguyen, K.B., 2002. Taxonomy and systemat-

ics. In: Entomopathogenic nematology, Gaugler, R. (Ed.), New

York: CABI Publishing, p. 1-28.

Akhurst, R.J.; Smith, K. 2002. Regulation and safety. In:

Entomopathogenic Nematology, Gaugler, R. (Ed.), New York:

CABI Publishing, p. 311-332.

Allard G.B.; Moore, D. 1989. Heterorhabditis sp., nema-

todes as control agents for coffee berry borer Hypothene-

mus hampei (Scolitydae). Journal of Invertebrate Pathology,

54(1): 45-48.

Alves, V.S. 2006. Biologia e controle da cochonilha-da-raiz-do-

cafeeiro Dysmicoccus texensis (Tinsley) (Hemiptera: Pseudococci-

dae) com nematóides entomopatogênicos (Rhabditida: Heterorhabditi-

dae e Steinernematidae). Lavras, MG, Tese de Doutorado, U-

FLA, 118 p.

Andaló, V.; Moino Jr., A.; Santa-Cecília, L.V.C.; Souza, G.C.

2004a. Seleção de isolados de fungos e nematóides entomo-

patogênicos para a cochonilha-da-raiz-do-cafeeiro-do-

cafeeiro Dysmicoccus texensis (Tinsley). Arquivos do Instituto Bio-

lógico, 71 (2): 181-187.

Aponte, A. S.; Olivares, W. 2008. Capacidad de búsqueda

áçã ó ê

del nematodo entomopatógeno Steinernema sp. SNIO 198

(Rhabditida: Steinernematidae). Revista Colombiana de

Entomología 34 (1): 51-56.

Arrigoni, E.B.; Dinardo-Miranda, L.L.; Conde, A.J.; Terán,

F.O. 1986. Aplicação de Neoaplectana carpocapsae em condições

de campo para o controle de Migdolus spp. Nematologia Brasileira,

10: 181-190.

Baker, P.S. 1999. La broca del café en Colombia; informe

final del Proyecto MIB para el café DFID – CENICAFE –

CABI Bioscience. Chinchiná, Colombia: DFID, 154p.

Baker, P.S.; Rivas, A.; Balbuena, R.; Barrera, J.F. 1994.

Abiotic mortality factors of the coffee berry borer

(Hypothenemus hampei). Entomologia Experimentalis et Applicata,

71: 201-209.

Barberena, M.F.; Bellotti, A.C. 1998. Parasitismo de dos

razas del nematodo Heterorhabditis bacteriophora sobre la

chinche Cyrtonemus bergi en laboratorio. Revista Colombiana de

Entomologia, 24 (1-2): 7-11.

Bedding, R.A. 1968. Deladenus vilsoni n.sp. and D. siricidicola

n.sp., entomophagous-mycetophagous nematodes parasitic

in siricid woodwasps. Nematologica, 14: 515-525.

Bedding, R.A. 1984. Large scale production, storage and

transport of the insect parasitic nematodes Neoplectana spp.

and Heterorhabditis spp. Annals of Applied Biology 104: 117-

120.

Bednarek, A.; Gaugler, R. 1997.Compatibility of soil

amendments with entomopathogenic nematodes. Journal of

Nematology, v.29, p.220-227.

Blaxter, M.L.; De Ley, P.; Garey, J.R.; Liu, L.X.; Scheldeman,

P.; Vierstraete, A.; Vanfleteren, J.R.; Mackey, L.Y.; Dorris,

M.; Frisse, L.M.; Vida, J.T.; Thomas, W.K. 1998. A molecu-

lar evoluationary framework for the phylum Nematoda.

Nature, 392: 71-75.

Boff, M.I.C.; Wiegers, G.L.; Gerritsen, L.J.M.; Smits, P.H.

2000. Development of the entomopathogenic nematode

Heterorhabditis megidis strain NLH-E87.3 in Galleria mellonella.

Nematology, 2: 303-308.

Bustillo, A.E.; Bernal, M.G.; Benavides, P.; Chaves, B. 1999.

Dynamics of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae

infecting Hypothenemus hampei (Coleoptera: Scolytidae)

populations emerging from fallen coffee berries. Florida

Entomologist, 82(4): 491-498.

Cabanillas, H.E.; Raulston J.R. 1996. Evaluation of Stein-

ernema riobravis, S. carpocapsae, and irrigation timing for the

control of corn earworm, Helicoverpa zea. Journal of Nematol-

ogy, 28: 75-82.

Caicedo, A.M.; Bellotti, A.C. 1996. Survey of native nema-

todes associated with Cyrtonemus bergi in eight colombian

sites. Revista Colombiana de Entomologia, 22: 19-24.

Castillo. A. 1995. Evaluación de nematodos entomógenos

(Rhabditida: Steinernematidae y Heterorhabditidae), para el

control biológico de la broca del café Hypothenemus ham-

pei Ferr. En Chiapas, Mexico. Turrialba, Dissertação de

Mestrado, CATIE. 72 p.

Chabrier, C.; Mauleon, H.; Quénehervé, P. 2003. Use of

entomopathogenic nematodes for banana black weevil con-

trol in Martinique. In: XXIV Congresso Brasileiro de Nematolo-

gia, Resumos, Brasil, Petrolina, p. 46.

Ciche, T.A.; Ensign, J.C. 2003. For the insect pathogen

Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out?

Applied and Environmental Microbiology, 1890-1897.

Commonwealth Institute Of Biological Control-Cibc. 1990.

Londres. Inglaterra. Control biológico de la broca de la

cereza del cafeto. In: Manual de capacitación de control bio-

lógico. Chinchiná, Cenicafé. p. 140-153.

Dolinski, C.; Moino Jr., A. 2007. Utilização de nematóides

entomopatogênicos nativos ou exóticos: o perigo das intro-

duções. Nematologia Brasileira, 30(2): 139-149.

Dolinski, C.M.; del Valle, E.E.; Stuart, R. 2006. Virulence of

entomopathogenic nematodes to larvae of the guava weevil

Conotrachelus psidii (Coleoptera: Curculionidae) in laboratory

and greenhouse experiments. Biological Control, 38(3):422-

427.

Dowds, B.C.A.; Peters, A. 2002. Virulence Mechanisms. In:

Entomopathogenic Nematology, Gaugler, R. (ed), New York:

CABI Publishing, p. 79-98.

Ehlers, R.U. 2001. Mass production of entomopathogenic

nematodes for plant protection, Appl. Microb. Biotechnol., 56:

623-33.

Fan, J.X.; Maggiorani, A.; Gudino, S. 2000. Uso de nemato-

dos entomopatógenos como una alternativa en el control de

polilla, Tecia solanivora, importante plaga de la papa in Meri-

da, Venezuela. Revista Florestal Venezolana, 34: 44-51.

Ferraz, L.C.C.B. 1998. Nematóides entomopatogênicos. In:

Controle Microbiano de Insetos, S. B. Alves (ed.), Piracicaba:

Fealq, p. 541-570.

á

Ferraz, L.C.C.B.; Leite, L.G.; Lopes, R.B.; Moino Jr., A.;

Dolinski, C.D. 2008. Utilização de nematóides para o con-

trole de pragas agrícolas e urbanas. In: Alves, S.B.; Lopes,

R.B. (Eds.) Controle Microbiano de Pragas na América Lati-

na. Piracicaba, FEALQ, p. 171-202.

Ferraz, L.C.C.B.; Monteiro, A.R. 1987. Sobre a ocorrência

de mermitídeos parasitando insetos no Brasil. Nematologia

Brasileira, 11:29-30.

Ffrench-Constant, R.H.; Bowen, D. 1999. Photorhabdus to-

xins: novel biological insecticids. Current Opinion in Microbio-

logy, 2: 284-288.

Figueroa, W. 1990. Biocontrol of the banana root borer

weevil, Cosmopolites sordidus (Germar), with steinernematid

nematodes. Jornal Agricultura Universidad Puerto Rico, 74: 15-

19.

Folegatti, M.E.G.; Alves, S.B.; Hawai, P.C.; Botelho, P.C.M.

1988. Nova metodologia para produção in vivo de Neoaplecta-

na carpocapsae. Nematologia Brasileira, 12: 76-83

Forschler, B.T.; All, J.N.; Gardner, W.A. 1990. Steinernema

feltiae activity and infectivity in response to herbicide expo-

sure in aqueous and soil environments. Journal of Invertebrate

Pathology, 55: 375-379

Fowler, H.G. 1988. Occurrence and infectivity of ento-

mogenous nematodes in mole crickets in Brazil. Int. Rice Res.

Newsletter, 13: 34.

Garzon, M.Y.; Aza, B.O.; Jimenez, G.J.; Luque, J.E. 1996.

Potencial del nematodo Steinernema sp. para el control biolo-

gico del gusano blanco de la papa. Revista Colombiana de Ento-

mologia, 22 (1): 25-30.

Georgis R.; Hom, A. 1992. Introduction of entomopatho-

genic Nematode Products into Latin america and the carib-

bean. Nematropica, 22(1): 81-98.

Georgis, R.; Dunlop, D.B.; Grewal, P. 1995. The formula-

tion of entomopathogenic nematodes. In: Biorational Pest

Control Agents, California: American Chemical Society, p. 197

-205.

Georgis, R.; Dunlop, D.B.; Grewal, P.S. 1995. Formulation

of entomopathogenic nematodes. In: Hall, F.R.; Barry, J.W.,

eds. Biorational Pest Control Agents: Formulation and De-

livery. Bethesda: American Chemical Society, p.197-205.

Georgis, R.; Hom, A.. 1992. Introduction of entomopatho-

genic nematode products into Latin America and Carib-

bean. Nematropica, 22 (1): 81-98.

Gold, C.S.; Pinese, B.; Peña, J.E. 2002. Pests of banana. In:

Tropical Fruit Pests and Pollinators: biology, economic importance,

natural enemies, and control, Peña, J.E.; Sharp, J.L.; Wysoki, M.

(eds.),. Wallingford, Oxon: CABI Publishing, p. 13-56.

Grewal, P.; De Nardo, E.A.B.; Aguillera, M.M. 2001. Ento-

mopathogenic nematodes: potential for exploration and use

in South America. Neotropical Entomology, 30 (2): 191-205.

Grewal, P.S. 2002. Formulation and application technology.

In: Gaugler, R., ed. Entomopathogenic nematology. New

York: CABI, p.265-287.

Grewal, P.S.; Webber, T.; Batterlay, D.A. 1998. Com-

patibility of Steinernema feltiae with chemicals used in

mushroom production. Mushroom News, 46: 6-10.

Hussaini, S.S.; Singh, S.P.; Parthassarathy, R.; Shakeela, V.

2002. In vitro production of entomopathogenic nematodes

in different artificial media. Indian Journal of Nematology, 32(1):

44-46.

Iede, E.T.; Penteado, S.R.C.; Leite, M.S.P. 1998. Utilização

do nematóide Deladenus siricidicola no controle biológico de

Sirex noctilio, praga de Pinus spp. In: Congresso Latinoamericano

IUFRO, CDRom, Chile, Valdívia.

Iede, E.T.; Penteado, S.R.C.; Reis Filho, W. 2003. Uso do

entomopatógeno Deladenus siricidicola em Pinus, In: XXIV

Congresso Brasileiro de Nematologia, Resumos, Brasil, Petrolina,

47-49.

Ishibashi, N. 1993. Integrated control of insect pests by

Steinernema carpocapsae. In: Bedding, R.A.; Akhurst, R.; Kaya,

H.K., eds. Nematodes and biological control of insects.

East Melbourne: CSIRO, p.105-113.

Jansson, R.K. 1993. Introduction of exotic entomopatho-

genic nematodes (Rhabditida: Heterorhabditidae and Stein-

ernematidae) for biological control of insects: potential and

problems. Florida Entomologist, 76 (1): 82-96.

Jansson, R.K. 1996. Infectivity and reproduction of three

heterorhaditid nematodes (Rhabditida: Heterorhabditidae)

in two insect hosts. Florida Entomologist, 79: 363-373.

Jarozs, J.; Balcerzak, M.; Skrzypek, H. 1991. Involvement of

lavicidal toxin in pathogenicsis of insect parasitism with the

rhabditoid nematodes, Steinernema feltiae and Heterorhab-

ditis bacteriophora. Entomophaga, 36: 361-368.

Kaya, H.K. 1990. Soil ecology. In: Gaugler, R.; Kaya, H.K.,

eds. Entomopathogenic nematodes in biological control.

Boca Raton: CRC Press, p.93-115.

áçã ó ê

Kermarrec, A.; Mauleon, H. 1989. Synergie entre le chlorde-

cone et Neoaplectana carpocapsae Weiser (Nematoda; Steiner-

nematidae) pour le controle de Cosmopolites sordidus

(Coleoptera: Curculionidae). Rev. Nematol. 12: 324-324.

Klasmer, P. 2000. Avances en el control biologico de Sirex

noctilio en la región patagonica de Argentina. IPEF, Série Téc-

nica, 13 (33): 21-30.

Koppenhöfer, A.M.; Kaya, H.K. 1998. Synergism of Imida-

cloprid and entomopathogenic nematodes: a novel ap-

proach to white grub control in turfgrass. Journal of Econo-

mic Entomology, v.91, p.618-623.

Leite, L.G.; Batista Filho A.; Tavares, F.M.; Ginarte, C.M.A.;

Almeida, L.C.; Botelho, P.S.M.. 2006. Alternativa de contro-

le. Revista Cultivar, 83.

Leite, L.G.; Batista Filho, A.; Prada, W.L.A. 1990. Produção

de Neoaplectana glaseri em lagartas vivas e mortas de Galleria

mellonella. Revista de Agricultura, 65 (2): 225-231.

Leite, L.G.; Machado, L.A.; Ginarte, C.M.A.; Goulart, R.M.;

Tavares, F.M.; Rodrigueiro, T.S.C.; Bússola, R.A. 2005. Ne-

matóides entomopatogênicos: Potencial de uso como bioin-

seticidas no Brasil. In: XXV Congresso Brasileiro de Nematologi-

a, Anais, Brasil, Piracicaba, p. 45-48.

Lello, E.R.; Patel, M.N.; Mathew, G.A.; Wright, D.J. 1996.

Application technology for entomopathogenic nematodes

against foliar pests. Crop Protection, 15: 567-574.

Lewis, E.E.; Gaugler, R; Harrison, R. 1993. Response of

cruiser and ambusher entomopathogenic nematodes

(Steinernematidae) to host volatile cues. Canadian Journal of

Zoology. 71: 765-769.

Lezama-Gutierrez, R.; Hamm, J.J.; Ochoa, J.M.; Lopez,

M.E.; Rubio, A.P.; Ramirez, M.G.; Styer, G.L.. 2001. Occur-

rence of entomopathogens of Spodoptera frugiperda in the

Mexican states of Michoacan, Colima, Jalisco and Tamauli-

pas. Florida Entomologist, 84 (1): 23-30.

López-Nunez, J.C.; Plichta, K.; Góngora-Botero, C.E.;

Stock, S.P. 2008. A new entomopathogenic nematode, Stei-

nernema colombiense n. sp. (Nematoda: Steinernematidae),

from Colombia. Nematology, 10(4): 561-574.

Machado, I.R.; Dolinski, C.M. 2004. Isolamento e Identifi-

cação de nematóides entomopatogênicos da Floresta Ama-

zônica em Monte Negro-RO. In: I Simpósio de Entomologia

UFV, Anais, Brasil, Viçosa, 1, p. 161-164.

Maciel-Vergara, G.; Rodríguez-Hernández, A.I.; Chavarría-

Hernández, N. 2010. Cultivo Monoxénico Sumergido del

Nematodo Entomopatógeno, Steinernema carpocapsae

CABA01, en Biorreactor airlift com Recirculación Interna.

BioTecnología, 14 (1): 11-24.

Mendes, C.J. 1997. Utilização prática do controle da vespa

da madeira em sistemas agro-florestais. In: XX Congresso

Brasileiro de Nematologia, Resumos, Brasil, Gramado, RS, p.

44-45.

Mijares, A.S.; Bellini, A.C. 2000. Producción masiva de Ro-

manomermis iyengari y su aplicacción en criaderos de anofeli-

nos en Boa Vista (Roraima), Brasil. Revista Panamericana de

Salud Publica, 7: 155-161.

Mijares, A.S.; Pacheco, R.P. 1997. Reduction of mosquito

densities in natural sites after introduction of Romanomermis

culicivorax in Cuba. Journal of Medical Entomology, 34 (1): 1-4.

Molina, J.P.A.; Moino Jr., A.; Cavalcanti, R.S.. 2004. Produ-

ção in vivo de nematóides entomopatogênicos em diferentes

insetos hospedeiros. Arquivos do Instituto Biológico, 71: 347-

354.

Mracek, Z.; Hernandez, E.A.; Boemare, N.E. 1994. Stein-

ernema cubana sp. n. (Nematoda: Rhabditida: Steinernemati-

dae) and preliminary characterization of its associated bacte-

rium. Journal of Invertebrate Pathology, 64: 123-129.

Neves, P.J.; Alves, S.B.; Aguillera, M.M. 1998. Produção de

nematóides entomopatogênicos. In: Controle Microbiano de

Insetos, S.B. Alves (ed.), Piracicaba: FEALQ, p. 889-905.

Nguyen, K.B. Morphology and taxonomy of entomopatho-

genic nematodes. Florida: University of Florida, Entomo-

logy and Nematology Dept., USA. <http://

www.ifas.ufl.edu/~kbn/kbnstein. htm>. acesso em: 12 fev.

2007.

Nguyen, K.B.; Shapiro-Ilan, D.I.; Stuart. R.J.; McCoy, C.W.;

James, R.R.; Adans, B.J. 2004. Heterorhabditis mexicana n. sp.

(Rhabditida: Heterorhabditidae) from Tamaulipas,Mexico,

and morphological studies of the bursa of Heterorhabditis

spp. Nematology, 6(2): 231-244.

Nishimatsu, T. & Jackson, J.J. 1998. Interaction of insecti-

cides, entomopathogenic nematodes and larvae of the west-

ern corn rootworm. Journal of Economic Entomology,

v.91, p.410-418.

Pacheco, R.P.; Mijares, A.S.; Martinez, S.H.; Ambrosio, G.F.

1998. Susceptibilidad de las larvas de Anopheles pseudopuncti-

pennis al parasitismo del nematodo Romanomermis iyengari, en

el Estado de Oaxaca, Mexico. Revista Cubana de Medicina Tro-

á

pical, 50 (3): 199-202.

Passos Jr., N.C.; Alves, S.B. 1995. Controle de Heterotermes

tenuis, cupim subterrâneo da cana de açúcar, com Steinernema

carpocapsae. In: III Simpósio Iniciação Científica Ciências Agrárias,

Resumos, Brasil, Piracicaba, SP, p. 380.

Passos Jr., N.C.; Alves, S.B.; Silveira Neto, S.. 1995. Patoge-

nicidade de Steinernema carpocapsae, formulação Exhibit, sobre

diferentes castas de saúva-limão, Atta sexdens rubropilosa. In:

XV Congresso Brasileiro de Entomologia, Resumos, Brasil, Ca-

xambú, p. 342

Patel, M.N.; Stolinski, M.; Wright, D.J. 1997. Neutral lipids

and the assessment of infectivity in entomopathogenic

nematodes: observations on four Steinernema species. Parasi-

tology, 114: 489-496.

Penteado, S.R.C.; Oliveira, E.B.; Iede, E.T. 1997. Avaliação

do parasitismo de Deladenus siricidicola em Sirex noctilio. In:

XX Congresso Brasileiro de Nematologia, Resumos, Brasil, Gra-

mado, p.41-43

Pereira, C. 1937. Rhabditis hambletoni n.sp. nema apparente-

mente semiparasito da broca do algodoeiro. Arquivos Instituto

Biológico, 8: 125-135.

Peters, A. 1996. The natural host range of Steinernema and

Heterorhabditis spp. and their impact on insect populations.

Biocontrol Science and Technology, 6: 389-402.

Pizano, M.A.; Aguillera, M.M.; Monteiro, A.R.; Ferraz,

L.C.C.B. 1985. Incidência de Neoaplectana glaseri parasitando

ovo de Migdolus fryanus. Nematologia Brasileira, 9: 9-10

Poinar Jr., G.O. 1990. Biology and taxonomy of Steinerne-

matidae and Heterorhabditidae. In: Entomopathogenic nema-

todes in biological control, Gaugler, R.; Kaya, H.K (eds). Boca

Raton, FL: CRC Press Inc. p. 23-58.

Poinar Jr., G.O.; Thomas, G.M. 1966. Significance of Achro-

mobacter nematophilus Poinar and Thomas

(Achromabacteraceae: Eubacteriales) in the development of

the nematode, DD-136 (Neoplectana sp. Steinernematidae).

Parasitology, 56: 385–390.

Rodriguez, M.G.; Rodríguez, I.; Sanchez, L. 1996. Identifi-

cacion y caracterizacion morfologica de tres cepas de nema-

todes entomopatogenos de Cuba. Revista Protecion Vegetal, 11

(3): 159-163.

Rohde, C. 2007. Avaliação de nematóides entomopatogêni-

cos (Rhabditida) para o controle da mosca-das-frutas Cerati-

tis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae). Lavras, MG,

Dissertação de Mestrado, UFLA, 60 p.

Rosa, J.M.O.; Wilcken, S.R.S., Wilcken, C.F.; Leite, L.G.

2008. Patogenicidade de Steinernema carpocapsae

(Rhabditida: Steinernematidae) ao Cupim de Montículo

Cornitermes cumulans (Isoptera: Termitidae). Nematologia

Brasileira, 32(4): 260-269.

Rosales, L.C.; Suarez, Z. 1998. Nematodos entomopatóge-

nos como posibles agentes de control del gorgojo negro del

plátano Cosmopolites sordidus (Germar). Boletin de Entomologia

Venezolana, 13 (2): 123-140.

Rovesti, L.; Deseo, K.V. 1991. Compatibility of chemical

pesticides with the entomopathogenic nematodes, Hetero-

rhabditis heliothidis. Nematologica, 37: 113-116

Rovesti, L; Deseo, K.V. 1990. Compatibility of chemical

pesticides with the entomopathogenic nematodes, Stein-

ernema carpocapsae Weiser and S. feltiae Filipjev (Nematoda:

Steinernematidae). Nematologica, 36: 237-245.

Schmitt, A.T.; Gowen, S.R.; Hague, N.G.M. 1992 Baiting

techniques for the control of Cosmopolites sordidus by Stein-

ernema carpocapsae. Nematropica, 22:159-163.

Sicard, M.; Ferdy, J.B.; Pagès, S.; Le Brun, N.; Godelle, B.;

Boemare, N.; Moulia, C. 2004. When mutualists are patho-

gens: an experimental study of the symbioses between Stein-

ernema (entomopathogenic nematodes) and Xenorhabdus

(bacteria). Journal of Evolutionary Biology, 17: 985–993.

Silva, M. A. T. 2007. Utilização de nematóides entomopato-

gênicos (Rhabditida: Heterorhabditidae, Steinernematidae)

visando o controle da cigarra-do-cafeeiro (Hemiptera: Cica-

didae). Lavras, MG, Dissertação de Mestrado, UFLA, 47 p.

Smith, D. 1995. Banana weevil borer control in south-

eastern Queensland. Aus. J. Exp. Agric., 35: 1165-1172.

Stock, S.P. 1992. Presence of Steinernema scapterisci Nguyen et

Smart parasitizing the mole cricket Scapteriscus borelli in Ar-

gentina. Nematologia Mediterrânea, 20: 163-165.

Stock, S.P. 2002. Entomopathogenic nematode diversity in

South Amercia: opportunities for exploration. In: XXXV

Annual Meeting of the SIP, Proceedings, Brazil, Foz de

Iguassu, Documentos 184, p. 105-109.

Treverrow, N.; Bedding, R.A. 1993. Development of a sys-

tem for the control of the banana weevil borer, Cosmopolites

sordidus, with entomopathogenic nematodes. In: Nematodes

and the Biological Control of Insect Pests, Bedding, R.A.; Akhurst,

R.; Kaya, H.K. (eds.). Melbourne: CSIRO, p. 41-47.

áçã ó ê

1 Investigador PhD Corpoica C.I Turipaná. Km 13 vía Cereté. Email.

rumano76@hotmail.com

Experiencias con nematodos entomopatógenos en Brasil y en la costa caribe

Introducción

Juan Pablo Molina Acevedo

Los nematodos entomopatógenos (NEPs), son organismos filiformes

no segmentados pertenecientes al género Nematoda. Actualmente son

encontradas más de 30 familias asociadas a insectos, incluyendo aquellos

nematodos que usan plantas como hospederos y animales como vectores,

determinando, así, diferentes asociaciones con insectos, como foréticas

que usan los insectos para transporte y de parasitismo facultativo y

obligatorio, que usan el insecto exclusivamente para multiplicarse, como

es el caso de los denominados NEPs (Kaya y Stock, 1997).

En las últimas décadas los NEPs vienen adquiriendo gran importancia

en programas de control biológico de plagas como agentes microbianos,

evitando parcialmente el uso indiscriminado de insecticidas. Su introducción

junto a otros enemigos naturales constituye una herramienta efectiva en

programas de Manejo Integrado de Plagas (MIP).

De acuerdo con Georgis y Hom (1992) y Ricci et al. (1996), viene

donde realizados estudios a fin de determinar la biología, epidemiología,

producción, formulación y efectividad de liberación en el campo, de las

familias que han presentado cierta potencialidad como agentes de control

biológico, entre las cuales se destacan: Allantonematidae, Mermithidae,

Steinernematidae y Heterorhabditidae.

Contenido del Capítulo

Con base en calidades con alta virulencia, buenas condiciones de producción

y un número importante de hospederos, las familias que presentan mayor

perspectiva para ser incorporadas en programas de MIP, son Steinernematidae y Heterorhabditidae, las

cuales son utilizadas especialmente para plagas del solo (Poinar, 1990).

En cuanto a la producción masiva de nematodos in vivo e in vitro, en los últimos años, fueron

conquistados avances significativos con relación a la producción en escala comercial de estos nematodos

de tal forma que, actualmente, ya son competitivos con los insecticidas en el control de plagas en cultivos

de medio y alto valor (Gaugler y Han, 2002).

Según Gaugler y Han (2002), para producción in vivo convencionalmente son utilizadas larvas de

Galleria mellonella (Fabricius) (Lepidoptera: Pyralidae). Este hospedero ofrece elevada producción de juveniles

Introducción Aislamiento e identificación de

nematodos entomopatógenos nativos - Muestreo de campo y procesamiento de las muestras

Biología y patogenicidad de aislamientos nativos de NEPs en larvas de Galleria mellonella

Identificación preliminar de aislamientos de nematodos

Producción in vivo de nematodos entomopatógenos en diferentes insectos hospederos

Interacción entre dos aislamientos de Metarhizium anisopliae y el nematodo entomopatógeno Heterorhabditis bacteriophora JPM4 durante la infección de

Trabajos preliminares con Nematodos entomopatógenos en ejecución por Corpoica C.I Turipaná.

Conclusiones generales de los trabajos descritos Referencias Bibliográficas

á

aplicados en altas dosis, también fue evidenciado

efecto aditivo en la mortalidad de larvas de Curculio

caryae (Coleoptera: Curculionidae). De la misma

forma Ansari et al. 2004, comprueban la existencia

de interacción entre M. anisopliae aislado CLO53

con los nematodos Heterorhabditis megidis y Steinernema

glaseri, cuando fueron aplicados juntos en altas

concentraciones de inoculo, presentándose una alta

mortalidad aditiva en el tiempo, en larvas de Hoplia

philanthus (Coleoptera: Scarabaeidae).

Por otro lado, las asociaciones de agentes

entomopatógenos, pueden presentar un efecto

antagonista. Shapiro et al, (2004), afirman que

todas las combinaciones entre los nematodos H.

indica, S. carpocapsae con el hongo Paecilomyces

fumosoroseus y la bacteria Serratia marcescens presentaron

antagonismo en la mortalidad de C. caryae. De la

misma forma Lacey et al. (2003) afirman que el uso

simultáneo de los ectoparasitóides Mastrus ridibundus

y Liotryphon caudatus (Hymenoptera: Ichneumonidae)

y Steinernema carpocapsae producen una interacción

antagónica entre los dos grupos, que resulta en la

muerte de las larvas de los parasitoides.

De ese modo, la exploración de nuevos aislados

de NEPs con características deseables (virulentos y

tolerantes al medio ambiente), que potencialmente

existan en Brasil, Colombia y en la región, posibilitarán

el desarrollo de investigaciones referente a la

biología, identificación taxonómica, evaluación de

sistemas de producción y evaluación de diferentes

especies nativas y exóticas, incluso aplicados con

otros microorganismos en insectos plaga de

importancia económica. A continuación se citan

los siguientes trabajos:

infectivos (JIs) (>1 x 105 JIs/larva) y puede ser

usado en la multiplicación de la mayoría de las

especies de NEPs de los géneros Steinernema y

Heterorhabditis. La Promedio de producción, en

ese hospedero, está entre 30.000 a 50.000 JIs por

larva (Poinar 1979), pudiendo llegar hasta 200.000

JIs (Dutky et al. 1964). Otros hospederos alternativos

son conocidos para este fin, entre ellos Spodoptera

frugiperda (Smith), (Lepidoptera: Noctuidae), Amyelios

transitella (Walker) y Tenebrio spp. (Coleoptera:

Tenebrionidae), donde ambos criados fácilmente a

bajo costo (Sirjusingh, 1990; Blinova y Ivanova,

1987 citados por Gaugler y Han, 2002).

Otro problema referente a la producción in

vivo de nematodos es la falta de estandarización en

las técnicas de producción, impidiendo así, que los

NEPs sean incorporados en programas de control

biológico. De esa manera, es necesario buscar

opciones para la producción in vivo, estandarizándolas

y/o mejorando los actuales métodos (Flanders et

al., 1996; Molina y López, 2001).

Por otra parte, trabajos de interacción entre

NEPs y otros organismos como hongos, se han

realizando con relativo efecto controlador en

plagas de importancia económica. Barberchek y

Kaya (1991), evidenciaron que la interacción entre

Heterorhabditis bacteriophora y Beauveria bassiana,

presentó alta mortalidad en larvas de Spodoptera

exigua (Lepidoptera: Noctidae), donde superior a la

presentada por los mismos agentes entomopatógenos

actuando por aislamiento. Shapiro et al, (2004),

afirman que el uso combinado de Heterorhabditis

indica con Metarhizium anisopliae aplicados en bajas

dosis y Steinernema. Carpocapsae con B. bassiana

Aislamiento e identificación de nematodos entomopatógenos nativos - Muestreo de campo y procesamiento de las muestras

Muestras de solo para aislamiento de

nematodos fueron colectadas en el Campus

Universitario de la UFLA y llevadas al laboratorio.

Las muestras fueron sacadas de 11 diferentes áreas

á

de cultivo del Campus de la UFLA como fréjol

(AF), maíz (AM), yuca (Am), frutales (Afr),

forestales (AFl), café (AC), Huerto de Plantas

Medicinales, con diferentes cultivos como coliflor

(AHco), brocolis (AHbr), calabaza (AHbo) y plantas

dañinas (AHpd); y de una área sin cultivo alrededor

de la laguna de la UFLA (ASC).

Cada área muestreada fue de 4m² y fueron

colectadas muestras de suelo entre 15-20 cm de

profundidas, retiradas con pala o cavador. Por área

evaluada fueron sacadas 4 muestras de suelo,

donde cada una de estas compuesta por 4

sub-muestras de 250g, sacadas aleatoriamente de la

área, las cuales fueron mezcladas hasta completar

aproximadamente 1kg de suelo, sumando 44

muestras. En el laboratorio, cada muestra fue

procesada simultáneamente con dos técnicas

diferentes de aislamiento de nematodos: insecto

trampa y embudo de Baermann. La eficiencia de

cada procedimiento también fue evaluada.

- Técnica de insecto trampa: Tomando

como referencia la metodología citada por Kaya y

Stock (1997) y Stock (1998), fueron colocados en

un recipiente plástico (14 x 14 x 7 cm) aproximadamente

200 g de solo, quiénes fueron humectados con

agua destilada esterilizada (ADE) a 15%. Fueron

colocadas 10 larvas de último instar de Galleria mellonella

(Linnaeus) (Lepidoptera: Pyralidae) sobre el suelo

humedecido. Los recipientes fueron incubados a

25 ± 2ºC en fotoperiodo de 24 horas por 3 a 4

días. Las larvas muertas y con síntomas de infección

fueron lavadas con solución de Ringer y colocadas

según la metodología de Molina y López (2001), en

Cámara seca (placa de Petri de 9 cm diámetro con

papel filtro) por más 5 días, en incubadora a 25 ±

2ºC. Despues ese tiempo las larvas fueron colocadas

en trampas de White para que los juveniles infectivos

(JIs) fueran colectados.

- Técnica de embudo de Baermann: Fueron

colocados 100g de solo encima de un embudo con

doble papel filtro. En la parte inferior del embudo,

fue colocada una manguera de 15 cm, cerrada en el

final con una pinza de Mohr. El embudo fue rellenado

con agua hasta saturar la muestra de solo,

permaneciendo así por un período de 24 horas,

cuando fue abierta la pinza de Mohr, colectándose

aproximadamente 10 mL de agua con los nematodos

(Kaya y Stock, 1997). Una alícuota de 2 mL de la

suspensión fue recogida y aplicada en una placa de

Petri de 9 cm de diámetro, conteniendo 5 larvas de

G. mellonella para recobrar JIs y adultos, aplicándose

la misma metodología utilizada en la técnica de

insecto trampa para purificación del inóculo.

Una vez aislados los nematodos, fue estimado

el porcentaje de nematodos aislados por área

(PNEPsAr), por la relación entre el número de muestras

positivas con nematodos entomopatógenos en la

área y el número total de muestras de la área.

PNEPsAr=

Finalmente fue estimado el porcentaje total

de aislamiento (PTNEPsAr), a través la relación

entre el número de muestras positivas con nematodos

en todas las áreas y el número total de muestras

empleadas.

PTNEPsAr =

Resultados: De las 44 muestras de solo

colectadas en once áreas del Campus de la UFLA,

100 área del muestras de totalNº

oaislamient de áreaen NEPscon positivas muestras de Nº

100 muestras de totalNº

áreas las de NEPscon positivas muestras de Nº

á

humedad de las muestras del suelo limita la

supervivencia de los nematodos, como lo que puede

haber ocurrido en la área de cultivo de floresta,

donde fueron encontrados aislados de nematodos

aparentemente entomopatógenos por la morfología

exterior de los especímenes (JPM0, JPM0.1 y

JPM0.2), que no consiguieron sobrevivir quizá por

la baja humedad, coincidiendo con el período seco,

obteniendo poco inóculo vivo para la multiplicación

en el laboratorio. Christopher y Womersley (1990)

y Kung et al. (1990), afirman que suelos con bajo

contenido de humedad, inactivan los JI, estimulando

procesos de quiescencia y anhidrobiosis, donde el

JI reduce su metabolismo llegando incluso a la

muerte, si permanece por un período de tiempo

muy prolongado.

La textura del suelo también puede haber

influenciado en la supervivencia de los NEPs en

las áreas muestreadas. Puede si observar en la

Tabla 1, las áreas pertenecientes al Huerto de

Plantas Medicinales, tienen suelos clasificados

como Oxisol rojo amarillo (L.V), cuya proporción

de arena es mayor que las proporciones de arcilla y

silice, textura que puede haber presentado mejores

condiciones para el desplazamiento de los nematodos

aislados con relación a otros suelos en las otras

áreas de estudio. Por el contrario suelos con alto

contenido de arcilla como los encontrados en las

diferentes áreas como Oxisol (syn. Latosol en Brasil)

púrpura (L.R), Oxisol rojo oscuro (L.E) y Podzólico

rojo amarillo (P.V), por su alta proporción de arcilla

(TABLA 1), pueden ha influenciado el desplazamiento

de los nematodos, ya que las muestras analizadas

no presentaron respuesta positiva para aislamiento

de NEPs (TABLA 1). Estudios hechos por

Barbercheck (1992), Kung et al. (1990) y Portillo et

6,8% del total fueron positivas para NEPs, donde

que todas las muestras positivas estaban localizadas

en el área del Huerto de Plantas Medicinales. Los

aislados recuperados fueron denominados como:

JPM3, JPM3.1 y JPM4 (Tabla 1).

Existen varias condiciones favorables que

pueden haber facilitado la supervivencia de los

NEPs en las áreas positivas de aislamiento, como

el contenido de materia orgánica, la humedad, la

textura del suelo y las cultivos asociadas a las

prácticas agronómicas (fertilización, pesticidas,

etc.). El alto contenido de materia orgánica (M.O)

y el uso de fertilización orgánica pueden haber

contribuido favorablemente para la permanencia

de los nematodos en la mayoría de las áreas del

Huerto de Plantas Medicinales de la UFLA (Tabla

1), lo que demuestra que suelos con alta proporción

de arena y MO y/o fertilización orgánico son

favorables para el establecimiento de poblaciones

de nematodos. En general, en suelos orgánicos, de

texturas arenosas y franco arenosas, la supervivencia

y el desplazamiento son mayores que en suelos

arcillosos (Kaya, 1990; Barbercheck y Kaya, 1991;

Barbercheck 1992; Portillo et al. 2000; Molina y

López, 2002).

Otra característica importante, que posiblemente

fue limitante para el aislamiento de los nematodos,

fue la humedad de las muestras. En la mayoría de

las áreas evaluadas la humedad del suelo era baja,

donde que, en estas áreas, no fue posible aislar

nematodos, coincidiendo con una época seca del

año. Por el contrario, las áreas de aislamiento

positivas, en el Huerto de Plantas Medicinales, por

la constante irrigación, tenían alta humedad en el

perfil del suelo y fue posible el aislamiento de los

NEPs. Según Barbercheck (1992), una baja

á

al. (2000), demuestran que a mayor la proporción

de arcilla, menor es el desplazamiento de diferentes

especies de NEPs, con relación a suelos con texturas

arenosas.

Biología y patogenicidad de aislamientos nativos de NEPs en larvas de Galleria mellonella

Para determinar el ciclo de vida general de los

aislamientos nativos y a fin de confirmar la presencia

de los ciclos corto y largo, 200 larvas de G. mellonella

fueron expuestas a dos concentraciones (40.000 y

500 JIs respectivamente), en 10 placas de Petri (100

X 15 mm) a 25 ± 2°C con papel filtro humectado, cada

placa conteniendo 10 larvas. Las larvas fueron

disecadas diariamente hasta que el ciclo de los

nematodos fuese completado. Larvas infectadas

con alta concentración de inóculo fueron usadas

para establecer el ciclo de vida corto y las larvas

infectadas con a baja concentración de inóculo

fueron usadas para establecer el ciclo de vida largo.

Las larvas fueron disecadas en placas de Petri (60

X 15mm) en solución de Ringer, en mayor aumento

de 400X Leica, con agujas de acero en diferentes

tiempos 6, 12, 24, 36 48 horas y a partir de allí a

cada 24 horas, hasta el nematodo desarrollar todo

el ciclo y agotar completamente el hospedero. Para

cada tiempo, fueron disecadas 10 larvas para

confirmar la presencia de cada fase de desarrollo.

Resultados

- Biología de los aislamientos nativos: A

pesar del complejo ciclo de vida de los cepas, la

formación de las diferentes fases de desarrollo y

estadios fue determinada en horas de acuerdo con

los tiempos fijados en la metodología (Tabla 2).

Una aproximación general en días de cada fase y

estadio, la duración del ciclo corto y largo y el

número de generaciones son presentadas en la

figura 1.

El ciclo de vida de los aislamientos incluye

3 fases de desarrollo: huevo, juvenil y adulto, en

que la fase juvenil posee cuatro estadios

morfológicamente distintos (J1, J2, J3 o JI y J4).

En la fase adulta la primera generación es

compuesta por hembras hermafroditas y la

segunda generación por hembras y machos

anfimicticos. El ciclo de vida puede ser también

largo (2 generaciones definidas con posibilidad de

una tercera) o corto (una generación).

El ciclo fue evaluado hasta un tiempo total

de 456 horas (19 días) desde el inicio de la infección

hasta el agotamiento total del hospedero, determinando

tres generaciones (Figura 1).

Algunos JIs se acumulan en la cápsula cefálica

y en la parte posterior del intestino de la larva.

Estando el JI en el interior de la larva, éste libera

sus células bacterianas, causando septicemia y

llevando el insecto a muerte 48 horas después de la

penetración inicial del JI. En el caso del ciclo de

JPM4, las primeras larvas de G. mellonella muertas

fueron encontradas entre las 24 36 horas después

la inoculación.

Los JIs alcanzan el hemocele del hospedero,

y 48 horas después se inicia el proceso de ecdisis,

con el crecimiento del nematodo y posterior

rompimiento de la cutícula, cuando el nematodo

abandona la cutícula vieja.

á

Tabla 1. Lista de aislamientos de NEPs encontrados en las diferentes áreas de muestreo.

Área No.A T. aislamiento P. NEPs N. Is Textura Fertilización

AF 1-4 Baermann Negativa - LE Químico

PNEPsAr: 0%

AM 1-4 Baermann Negativa - LE Químico

PNEPsAr: 0%

Am 1-4 Baermann Negativa - LE Químico

PNEPsAr: 0%

Afr 1-4 Baermann Negativa - Cd Químico

PNEPsAr: 0%

Afl 1 Baermann Negativa JPM0.1(p) PV M. O. D.

Afl 2 Baermann Negativa JPM0.2(p) PV M. O. D.

Afl 3 Baermann Negativa JPM0 (p) PV M. O. D.

Afl 4 Baermann Negativa - PV M. O. D.

PNEPsAr: 0%

AC 1-4 Baermann Negativa - LE Químico

PNEPsAr: 0%

Ahco 1 Baermann Negativa - LV Orgânico

Ahco 2 Ins.Arm/Baerm Positiva JPM1 (p) LV Orgânico

Ahco 3 Baermann Negativa - LV Orgânico

Ahco 4 Baermann Negativa - LV Orgânico

PNEPsAr: 0%

Ahbr 1 Baermann Negativa - LV Orgânico

Ahbr 2 Ins.Arm/Baerm Positiva JPM2 (p) LV Orgânico

Ahbr 3 Baermann Negativa - LV Orgânico

Ahbr 4 Ins.Arm/Baerm Positiva JPM2.1(p) LV Orgânico

PNEPsAr: 0%

Ahbo 1 Ins.Arm/Baerm Positiva JPM3 ®/(p) LV Orgânico

Ahbo 2 Ins.Arm/Baerm Positiva JPM3.1 ®/(p) LV Orgânico

Ahbo 3 Baermann Negativa - LV Orgânico

Ahbo 4 Baermann Negativa - LV Orgânico

PNEPsAr: 50% (Insecto trampa)

Ahpd 1 Baermann Negativa - LV Orgânico

Ahpd 2 Baermann Negativa - LV Orgânico

Ahpd 3 Ins.Arm/Baerm Positiva JPM4 ®/(p) LV Orgânico

Ahpd 4 Ins.Arm/Baerm Positiva - LV Orgânico

PNEPsAr: 25% (Insecto trampa)

ASC 1-4 Baermann Negativa - LR M. O. D.

PNEPsAr: 0%

PTNEPsAr: 6,8%

No.A= Número de muestra; T = Técnica; P.NEPs = Presencia de NEPs; N.Is = Nomenclatura del aislamiento; PNEPsAr

= Porcentaje de nematodos aislados por área; PTNEPsAr = Porcentaje total de nematodos aislados en todas las áreas. In-

s.Arm=Insecto trampa; Baerm=Baermann ® = aislado recuperado; (p) = aislado perdido; AF = Área frijol; AM= Área maíz;

Am= Área yuca; Afr = Área frutales; Afl = Área forestal; AC = Área café; Ahco = Área coliflor; Ahbr = Área brocolis; Ah-

bo = Área calabaza; Ahpd = Área plantas dañinas; ASC = Área sin cultivo; M. O. D.: Materia orgánica en descomposición.

L.R = .Oxisol Púrpúra; L.E = Oxisol Rojo Oscuro; L.V =.Oxisol Rojo Amarillo; P.V.= Podzólico Rojo Amarillo; C.d*.=

Cambissolo distrófico

á

Entre 48 y 72 horas

después la infección se forman

los primeros J4 “pre-adultos”,

quiénes se vuelven hembras

hermafroditas al final de las 72

horas después de la infección.

Éstas van aumentando de

tamaño dependiendo del

espacio y del alimento

disponible. Los huevos son

fecundatos y eclocionan

internamente, iniciando el

proceso de alimentación de

los J1s; otras hermafroditas

desarrollan tardíamente sus

huevos y este proceso dura

hasta 94 horas.

Noventa y cuatro hasta

120 horas después, algunos J1

se transformaron en J2,

rompiendo la cutícula de la

madre hermafrodita, y cerca de las 144 horas, éstos se vuelven J3. En el ciclo corto, éstos J3s conservan

la cutícula del estadio anterior, el

J2, y dejan el cadáver, yendo para

el solo. En este caso específico son

denominados de juveniles infectivos,

poseen el ano y la boca cerrados y

cargan células de bacteria simbionte

(Figura 1).

En cuanto al ciclo largo, éste es

igual hasta la formación de los

primeros J3, sin embargo éstos no

salen del hospedero, y después un

tiempo de 144 hasta 168 horas se

vuelven J4 o pre adultos (Tabla 2).

La segunda generación de adultos

Figura 1. Ciclo de vida del aislamiento JPM04 presentando los diferentes

estadios: J1 = juvenil de primer estadio; J2 = juvenil de según estadio; J3 =

juvenil de tercer estadio no infectante; JI = juvenil infectante de tercer

estadio; J4 = juvenil de cuarto estadio.

Tabla 2. Duración en horas de cada estadio o fase del desarrollo de

los aislamientos en larvas de último instar de Galleria mellonella.

Fases de desarrollo Generaciones en horas (h)

Primera Segunda Tercera

J4 36-48 168 312

Hermafroditas 72

Hermafroditas +

huevos/J1 94

Hermafroditas + J2 120

J3/JI 144-216

Machos y hembras 192 360

Hembras + hue-

vos/J1 216

Hembras +J2 240-264

J3/JI 288-456

á

De acuerdo con Poinar (1976), el ciclo

descrito para Heterorhabditis bacteriophora presentó

un ciclo corto y un ciclo largo con dos generaciones.

Los aislamientos también presentaron un ciclo de

vida corto y un ciclo de vida largo, posiblemente

con tres generaciones, por la prolongada emergencia

desde JIs hasta un poco más de 21 días y por la

formación de adultos de tamaño menor encontrados

en algunas larvas. Los datos concuerdan con Kaya

y Stock (1997), según quiénes en la obtención de

adultos de primera o segunda generación en

heterorhabditídeos la recuperación es hecha de 3 a

4 días después la infección para la primera

generación, de 6 a 9 días para la segunda

generación y 15 o más días para lograr la tercera

generación.

- Patogenicidad: No

fueron verif icadas

diferencias significativas

(P<0,05) entre las pruebas

de patogenicidad en G.

mellonella de los tres

aislamientos nativos

(JPM3.1, JPM4 y JPM3),

donde que entre 24 y 72 horas, fue verificada la

mortalidad total a eso de 90% todos los aislamientos

(Tabla 3). De esta forma, los aislamientos causaron

mortalidad superior al 89%.

La sintomatología exhibida en larvas de G.

mellonella, para los tres aislamientos fue semejante,

con coloración rojo oscuro que, de acuerdo con las

descripciones del género, es característica para

Heterorhabditis, de acuerdo a la descripción de la

sintomatología descrita por Boemare (2002), según

la cual insectos parasitados por heterorhabditídeos

exhiben, en la cutícula, colores rojizos.

con hembras y machos anfimicticos ocurre a las

192 horas aproximadamente. Estos son menores

que las hembras hermafroditas de la primera

generación. Las hembras anfimicticas, entonces,

desarrollan en su interior los huevos, y a las 216

horas se forman los primeros J1, que alteran a J2 a

las 240 horas, y finalmente se forman los J3 a las

288 horas, quienes conservan la cutícula del J2 y

pueden o no abandonar el cadáver. Los J3 que

continuan el ciclo pasan a J4 a las 312 horas y entre

las 336 y las 360 horas se forman los adultos

anfimicticos de tercera generación (TABLA 8).

Finalmente la emergencia de JIs por la falta de

recursos en el hospedero ocurre en un tiempo final

de 456 horas, concluyendo una tercera generación.

Los ciclos de vida de los aislamientos de

NEPs, dependieron de la cantidad del inóculo

empleado, donde que las larvas tratadas con la

concentración baja (500 JIs/200 larvas) y con la

concentración alta (40.000 JIs/200 larvas)

presentaron ciclo de vida largo y corto, respectivamente,

respuesta posiblemente influenciada por la

concentración de nematodo usada, directamente

proporcional a la cantidad de recurso ofrecido por

el hospedero. Adams y Nguyen (2002) afirman que

el ciclo y el número de generaciones de un nematodo

dependen de la disponibilidad de alimento y del

tamaño del hospedero.

Aislamientos de NEPs PMC*

JPM3.1 100,00 ± 0,00 a

JPM4 94,74 ± 1,87 a

JPM3 89,47 ± 1,13 a

CV (%) 4,397

Tabla 3. Porcentaje de mortalidad corregida de larvas de G. mellonella, infectadas

con los aislamientos nativos de nematodos entomopatógenos.

Promedios seguidas por letras distintas difieren entre sí por la prueba de Tukey

(P<0,05) *M ± EP(M)

á

En el ensayo de patogenicidad las 1:1 fue

observada la misma sintomatología rojiza. Fueron

verificadas diferencias significativas (P<0,05) de

mortalidad entre los aislamientos nativos JPM4 y

JPM3.1 con relación al aislamiento JPM3 (Tabla 4),

donde JPM3 fue menos virulento que los

otros aislamientos. Con relación a los

aislamientos JPM4 y JPM3.1, presentaron

mortalidades superiores a JPM3, sin

embargo el porcentaje de mortalidad fue

relativamente bajo, posiblemente por la

infección realizada por un JI, y diferentes

factores del medio, del nematodo y/o del

hospedero, que pudieron interferir en el

proceso de infección. Las larvas infectadas

con los aislamientos de nematodos fueron disecadas

y a las 120 horas ya fue posible ver hembras

hermafroditas de primera generación en su interior

pero no se observó presencia de adultos anfimicticos.

Tabla 4. Porcentaje de mortalidad corregida de larvas de G. mellonella, infectadas con los aislamientos nativos de nematodo ensayo las 1:1.

Promedios seguidas por letras distintas difieren entre sí por la

prueba de Tukey (P<0,05) *M ± EP(M)

Aislamientos de NEPs PMC*

JPM4 60 4,456 a

JPM3.1 53,33 5,87 a

JPM3 30,33 6,13 b

CV (%) 31,74

Identificación preliminar de aislamientos de nematodos entomo-patógenos nativos.

La identificación fue morfométrica, con

medición de las diferentes estructuras del cuerpo

de los nematodos, las cuales fueron comparadas

Promedionte llaves taxonómicas con otras especies

calidad (Kaya y Stock, 1997; Stock, 1998) y

Nguyen (2004), en que caracteres morfológicos

son observados en JI y adultos anfimicticos de

segunda generación (Poinar, 1990; Stock et al.,

1996). En los JIs las medidas tomadas fueron: L =

Largura total del cuerpo; w = Anchura total del

cuerpo; EP = Distancia de la extremidad anterior

al poro excretor; Es = Largura del esófago; EP =

Distancia de la extremidad anterior al poro excretor;

NR = Distancia de la extremidad anterior al anillo

nervioso y los Índices como: Índice la = (L/W);

Índice b = (L/ES); Índice c = (L/T); Índice D (%)

= (EP/ES); Índice Y (%) = (EP/T), donde que

todas las medidas fueron expresas en micrómetros

(µm). Para la medición de los JI en lámina, fue

utilizado un microscopio de contraste de fase Leica

DM LES (HCL3TP), localizado en el Laboratorio

de la Empresa de Investigación Agropecuaria del

Estado de Minas Gerais (EPAMIG).

De los aislamientos nativos multiplicados y

purificados (JPM3, JPM3.1 y JPM4), se determinó

que todos corresponden posiblemente a cepas

geográficos de la especie Heterohabditis bacteriophora,

del municipio de Lavras, Brasil.

Los aislamientos nativos presentan alta

semejanza morfológica entre sí, utilizando como

calidad de comparación todas las medidas

morfométricas determinadas para JIs citadas por

Nguyen (2004), con especial énfasis en el largo

total del cuerpo y la cola de los juveniles infectivos.

Así, estos aislamientos (JPM3, JPM3.1 y JPM4)

hacen parte posiblemente de una misma especie H.

bacteriophora, por la alta semejanza en todos los

11 caracteres determinados con la especie tipo

á

Género Heterohab-

ditis (Poinar, 1976)

H. bacteriophora

(Poinar, 1976)

Cepas JPM3,

JPM3.1 y JPM4

En cuanto al

diagnóstico por

caracterización

morfológica de los

aislamientos JPM3,

JPM3.1 y JPM4,

para confirmar

concluyentemente

su semejanza, es

necesario hacer

otras mediciones,

principalmente en

machos y adicionalmente pueden ser consideradas

mediciones en hembras hermafroditas y anfimicticas

de segunda generación. La ident i f icac ión

morfométrica puede ser finalmente confirmada,

contrastándola con la identificación mediante el

uso de técnicas moleculares.

identificada por Poinar en 1976 (Tablas 5, 6 y 7).

En cuanto a los JIs de los asilamientos, se

destacan como caracteres morfológicos diagnóstico,

que permitió definir el género, la presencia del

diente quitinoso en la extremidad anterior; y para la

identificación preliminar hasta especie, las medidas

de estructuras realizadas sobre los JI.

Aislamiento JPM3 morfométrica H. bacteriophora (Poinar, 1976)

Medida Promedio Desviación

Estandar Min. - Max.

Promedio Min. - Max.

L (µm) 584 20.63 518-617 588 512-670

w (µm) 23.3 2.47 18-28 23 18-31

EP (µm) 106 2.9 97-108 103 87-110

NR(µm) 85 5.88 71-92 85 72-93

ES (µm) 121 6,92 106-139 125 100-139

T(µm) 96 5.62 88-114 98 83-112

a (µm) 25.0 2.74 20-31 25 17-30

b (µm) 4.82 0.35 3.7-5.9 4.5 4-5.1

c (µm) 6.1 0.41 4.6-6.8 6.2 5.5-7

D (%) 0.88 5.38 74-99 0.84 0.76-0.92

E (%) 1.10 6.34 94-123 1.12 1.03-1.30

Tabla 5. Medidas de juveniles (n=30) del aislamiento denominado JPM3.

Producción in vivo de nematodos entomopatógenos en diferentes insec-tos hospederos

El trabajo fue evaluado en el Laboratorio

de Patología de Insectos del Departamento de

Entomología de la Universidad Federal de Lavras.

Material biológico

-Nematodos entomopatógenos: Fueron utilizadas

tres especies de nematodos del género Steinernema:

Steinernema carpocapsae Weiser (1955), Steinernema

glaseri Steiner (1929) Steinernema anomali Kozodor

(1982),

-Insectos hospederos: Para la producción y

mantenimiento de estas especies de nematodos

fueron utilizadas cuatro especies de insectos logradas

de la creación en el laboratorio de Biología de

Insectos del Departamento de Entomología-

UFLA: larvas de último ínstar de Galleria mellonella

(Fabricius) (Lepidoptera: Pyralidae), Tenebrio molitor

á

(Linnaeus) (Coleoptera:

Tenebrionidae), Spodopte-

ra frugiperda (Smith)

(Lepidoptera: Noctuidae)

y Bombyx mori (Linnaeus)

(Lepidoptera: Bombyci-

dae).

Sistemas de infección

En la infección fueron

utilizados tres sistemas:

Topical compuesta

(ToC): Cada especie de

nematodo fue aplicada

en la concentración de

100 ± 10 JIs diluida en

0,5 mL de ADE;

enseguida, se transfirie-

ron 5 larvas de cada hospedero para las placas de

Petri conteniendo papel filtro Whatman # 1

humectado con 1 mL de ADE y el inóculo.

Topical simple: (ToS): Cada especie de

nematodo fue aplicada en la concentración de 20 ±

5 JIs diluida en 0,5 mL de ADE, en placas de Petri

de 5 cm con papel filtro Whatman # 1, donde

enseguida fueron colocadas

las larvas de cada hospedero

individualizadas.

- Inyección (Iny):

Utilizando una jeringa de

insulina de 1 mL fue

inyectada una concentración

de 20 ± 5 JIs diluida en

20 µl de ADE, aplicados

por hospedero, en los

últimos segmentos de la

región posterior ventral

de las larvas (FIGURA

2D). Todas las larvas,

una vez infectadas, fue-

Tabla 6. Medidas de juveniles (n=30) aislamiento JPM3.1).

Aislamiento JPM3.1 morfométrica H. bacteriophora (Poinar, 1976)

Medida Promedio Desviación

Estándar Min. - Max.

Promedio Min. - Max.

L (µm) 591 20,6 570-620 588 512-670

w (µm) 25 5,31 21-30 23 18-31

EP (µm) 107 2,9 92-105 103 87-110

NR(µm) 87 3,78 76-95 85 72-93

ES (µm) 124 6,75 103-138 125 100-139

T(µm) 97 5,8 91-108 98 83-112

a (µm) 23,64 3,14 17-31 25 17-30

b (µm) 4,77 0,36 3.5-6.1 4.5 4-5.1

c (µm) 6,09 0,49 4.2-7 6.2 5.5-7

D (%) 0,86 7,4 0.8-0.96 0.84 0.76-0.92

E (%) 1,1 0,36 1.01-1.29 1.12 1.03-1.30

Tabla 7. Medidas em micrômetros de juveniles (n=30) aislamiento JPM4.

Aislamiento JPM4 morfométrica H. bacteriophora (Poinar, 1976)

Medida Promedio Desviación

Estándar Min. - Max. Promedio Min. - Max.

L (µm) 587 26,27 560-630 588 512-670

w (µm) 23.33 2,69 20-27 23 18-31

EP (µm) 108.2 6,13 97-106 103 87-110

NR(µm) 85 8,49 73-94 85 72-93

ES (µm) 124 5,56 102-141 125 100-139

T(µm) 95 8,29 91-113 98 83-112

a (µm) 25,15 3,03 19-29 25 17-30

b (µm) 4,73 0,32 3.5-6.4 4.5 4-5.1

c (µm) 6,17 0,57 4.3-7.1 6.2 5.5-7

D (%) 0,87 5,84 0.81-0.94 0.84 0.76-0.92

E (%) 1,14 4,21 1.06-1.25 1.12 1.03-1.30

á

pasó principalmente con el sistema de infección

topical simple en G. mellonella, destacándose las

producciones logradas para S. carpocapsae con

302.124 JIs (nuevo registro) para S. glaseri, 132.025

JIs; y para S. anomali, con 149.212 JIs. Como

hospederos alternativos, pueden ser empleados B.

mori con el sistema de infección topical simple para

multiplicar S. carpocapsae con una producción de

128.923 JIs, y T. molitor con el sistema topical

compuesta, con 103.059 JIs.

Estos resultados registran producciones

aproximadas a las encontradas por Dutky et al.

(1964), con 160.000 JIs para S. carpocapsae Mexican

strain en larvas de G. mellonella, y con las registradas

por Molina y López (2001), para S. carpocapsae, con

149.258 JIs/larva. En cuanto a las altas producciones

acumuladas, solamente estaban registradas para

heterorhabditídeos en G. mellonella, como es

presentado en diversos trabajos como Jansson

(1996) que logró para Heterorhabditis Bacardis y

FL2122, una producción de 137.229 y 238.692 JIs/

larva en G. mellonella respectivamente, y Ozer y

Unlu (2003), que lograron, para H. bacteriophora,

141.562 hasta 271.593 JIs, incluso llegando a alcanzar

la producción de 350.000 JIs para esta especie en

G. mellonella (Woodring y Kaya, 1988).

También es importante resaltar, que el tamaño

del hospedero no fue determinante en la producción

lograda por G. mellonella, donde un hospedero

menor (1/9) con relación a B. mori, logró las

mayores producciones del experimento. Por el

contrario, Adams y Nguyen (2002) y Ozer y Unlu

(2003), afirman que la producción es dependiente

del tamaño del cuerpo del hospedero; así, a mayor

tamaño de la larva producen un mayor número de

JIs y vice-versa.

ron mantenidas a 25 ± 2°C y oscuridad constante

durante 48 horas, de acuerdo con metodología de

Taylor y Shields (1990). Se evaluó en todos los

sistemas de infección la producción acumulada de

JIs.

Resultados

Producción acumulada de nematodos entomopatógenos:

Para la especie S. carpocapsae, el sistema de

infección topical simple presentó diferencias (Scott

-Knott P<0,05) con relación a los otros sistemas

empleados, en la mayoría de los hospederos, aparte

S. frugiperda, que no presentó diferencias. En

cuanto al hospedero, principalmente en el sistema

topical simple, G. mellonella fue diferente (Scott-

Knott P<0,05) de los otros hospederos, presentando

la mayor producción del experimento con 302.124

JIs en B. mori (Tabla 8).

Para la especie S. glaseri solo hubo producción

con infección topical simple y compuesta en G.

mellonella, con 132.025 y 125.672 JIs (Tabla 9).

Finalmente, para S. anomali el sistema de

infección topical simple presentó diferencias (Scott

-Knott P<0,05) con relación a los otros sistemas

empleados, con excepción de T. molitor el cual

presentó diferencias a favor del sistema topical

compuesta. En cuanto al hospedero G. mellonella,

hubo diferencias en producción con el sistema

topical simple con 149.212 JIs y T. molitor fue

diferente (Scott-Knott P<0,05) en producción con

el sistema topical compuesta con 103.059 JIs

(Tabla 10).

Por otro lado, las mayores producciones

acumuladas de las especies de nematodos evaluadas

estuvieron determinadas significativamente por la

interacción sistema de infección y hospedero, qué

á

Tabla 8. Producción Promedio diaria para S. carpocapsae.

(Desdoblamiento de la interacción Hospedero x Infección).

Hospedero Sistema de iinfección

Iny ToC ToS

B. mori 0 a A 86.012 c B 128.923 c C

G. mellonella 0 a A 79.607 c B 302.124 d C

S. frugiperda 0 a A 3.418 a A 4.231 a A

T. molitor 0 a A 48.134 b B 33.471 b B

Promedios seguidos de misma letra minúscula en la columna

e mayúscula en la línea no difieren entre si por Scott-Knott

(p0,05)

Tabla 9. Producción Promedio diaria para S. glaseri.

(Interacción Hospedero x infección).

Hospedero Sistema de infección

Iny ToC ToS

B. mori 0 a A 0 a A 0 a A

G. mellonella 0 a A 126.672 b B 132.025 b B

S. frugiperda 0 a A 0 a A 0 a A

T. molitor 0 a A 0 a A 0 a A

Promedios seguidas de misma letra minúscula en la columna e

mayúscula en la línea no difieren entre si por Scott-Knott

Tabla 10. Producción Promedio diaria para S. anomali.

(Interacción Hospedero x infección).

Hospedero Sistema de Infección

Iny ToC ToS

B. mori 0 a A 35.281 b B 53.265 b C

G. mellonella 1.076 a A 51.624 c B 149.212 d C

S. frugiperda 0 a A 0 a A 0 a A

T. molitor 0 a A 103.059 d B 81.460 c C

Promedios seguidas de misma letra minúscula en la columna e

mayúscula en la línea no difieren entre si por Scott-Knott

(p0,05)

De esta forma, puede si concluir que

los sistemas de infección más efectivos

para la multiplicación de todas las especies

de nematodos en orden de importancia

fueron topical simple y compuesta, donde

los mejores sistemas para continuar trabajos

en producción in vivo de otros nematodos.

G. mellonella es el hospedero más efectivo

para producción in vivo para todas las

especies, pero los hospederos B. mori para

la especie S. carpocapsae y T. molitor para la

especie S. anomali presentan óptimas

posibilidades como hospederos alternativos.

Las colectas de NEPs pueden ser hechas

en los cuatro primeros días, ya que del

cuarto día hasta el décimo la producción

decrece, con el riesgo de lograr JIs con

baja virulencia.

á

Interacción entre dos aislamientos de Metarhizium anisopliae y el nematodo entomopatógeno Heterorhabditis bacteriophora JPM4 durante la infección de larvas de la broca de la carrizo Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Pyralidae).

aplicado en el mismo tiempo, las larvas fueron

infectadas por inmersión con hongos, donde

colocadas en placas de Petri con arena estéril con

la concentración del nematodo. Cuando el hongo

fue aplicado 48 horas antes del nematodo, las

larvas fueron inmersas en la suspensión del hongo

y posteriormente transferidas en las placas de Petri

con arena; después de 24 horas en la arena de las

placas de Petri fue inoculado el nematodo. Cuando

el nematodo fue aplicado 48 horas antes del hongo,

fueron inoculados los JIs en las placas de Petri con

arena, 24 horas después de fueron sacadas las larvas

para ser infectadas por inmersión en los ependorfs

con las suspensiones de los hongos.

Diseño experimental y variables evaluadas:

Como unidad experimental (U.E), fue una

placa de Petri estéril (Diámetro=4.5cm) con 20 g

de arena estéril, 2 mL de ADE y una larva de D.

saccharalis. Fue usado un diseño completamente

aleatorio, con análisis de variancia (P<0,05). En

total fueron constituidos diez tratamientos, cada

uno de los cuales contó con 10 repeticiones. Los

tratamientos fueron: T1=Testigo (aplicación de

100 uL de ADE en la UE); T2=Fmv; T3=Fav;

T4=NEP; T5= Fmv+NEP; T6=Fav+NEP;

T7=Fav+48h NEP; T8=NEP+48h Fav;

T9=Fmv+48h NEP; T10=NEP+48hFmv.

Nota: Las convenciones usadas fueron:

T=Tratamiento; Fmv=Hongo de media virulencia;

Este trabajo tuvo como objetivo evaluar la

acción individual y conjunta de dos tipos de agentes

entomopatógenos: el nematodo H. bacteriophora

aislamiento JPM4 (Rhabditida Heterorhabditidae) y

dos aislamientos de M. anisopliae LPP45 y LPP39,

de alta y Promedio virulencia respectivamente, en

la mortalidad de larvas de D. saccharalis (Fabr.)

(Lepidoptera: Pyralidae).

El experimento fue realizado en el Laboratorio

de Protección de Plantas, Universidad Estadual del

Norte Fluminense (UENF), Campos,Rio de Janeiro,

Brasil. .

- Hospedero: Como insecto modelo, fueron usadas

larvas del cuarto ínstar de D. saccharalis (Fabr.)

(Lepidoptera: Pyralidae) con peso medio de 0,19 ±

0,03g,

- Nematodos entomopatógenos: Fueron utilizados

juveniles infectivos (JIs) de Heterorhabditis bacteriophora

JPM4 (Rhabditida:Heterorhabditidae), aislamiento

nativo de Lavras MG (Molina, 2004)..

- Hongos entomopatógenos: Fueron usados dos

aislamientos nativos del hongo entomopatógeno

Metarhizium anisopliae aislamientos LPP45 y LPP39

(Deuteromycotina: Hypomycetes), procedentes de

Montenegro – Rondônia Brasil.

Los tratamientos combinados hongo/

nematodo y vice-versa en los diferentes tiempos de

inoculación, fueron evaluados en las siguientes

condiciones: Cuando hongo y nematodo fueron

á

Fav=Hongo de alta virulencia; +48h=agente

entomopatógeno aplicado 48 horas después. Las

variables evaluadas fueron:

- Mortalidad de larvas: Las larvas fueron

observadas cada 24 horas apos infección hasta

confirmar mortalidad. El tiempo final de evaluación

fue hasta cuando todas las larvas murieron. Para

esta variable fue hecho un análisis Probit,

estimando el Tiempo Letal 50 95 (TL50 y TL95).

- Producción de JIs: Variable evaluada para los

tratamientos donde fueron aplicados nematodos.

Así, será contabilizada la producción acumulada de

JIs en trampas de White (1927) hasta el agotamiento

total del hospedero en la multiplicación del NEP.

- Producción de esporas: Variable evaluada para

los tratamientos donde se aplicó el hongo,

determinándose el número total de esporas producidas

por larva. Para esto, después de la esporulación

inicial, las larvas fueron colocadas individualmente

en placas de Petri (D=4,5cm) con papel filtro estéril

por dos semanas, tiempo en el cual se estimó la

máxima esporulación. Posteriormente cada larva

fue colocada en un ependorf con 1mL con ADE,

agitado en vórtex por 30 segundos a 2000 RPM.

Así fue sacada una alícuota de 15ml, donde realizada

la conteo de las esporas en las cámaras de Neubauer.

Para las variables, producción de JIs y de esporas,

fue hecha una prueba de comparación de Promedios

aplicando la prueba de Tukey (P<0,05).

Resultados

-Mortalidad de larvas: Para los agentes entomopatógenos

evaluados en forma individual, se presentaron diferencias

en mortalidad. El hongo de alta virulencia M.

anisopliae LPP45 presentó una mortalidad del 100%

en cinco días, en comparación con el de media

virulencia M. anisopliae LPP39, el cual alcanzó una

mortalidad del 60% en nueve días (Figura 2A). El

nematodo H. bacteriophora JPM4, logró una mortalidad

del 100% en larvas de D. saccharalis, en menor

tiempo con relación a los hongos evaluados. En el

caso del hongo M. anisopliae LPP39 aplicado

simultáneamente con el nematodo, resultó en un

100% mortalidad en D. saccharalis solo en cuatro

días, superior a los agentes entomopatógenos

aplicados, determinando una acción aditiva en la

mortalidad (Figura 2A).

En el caso del hongo de alta virulencia (M.

anisopliae LPP45) aplicado junto con el nematodo

en el mismo tiempo, se presentó una reducción

favorable en el tiempo de mortalidad de D. saccharalis

cuando comparado a la acción individual del hongo,

obteniendo 100% de mortalidad en seis días

(Figura 2A).

Cuando fue aplicado el hongo de media

virulencia 48 horas antes que el nematodo, resultó

un incremento del 30% en la mortalidad de D.

saccharalis con relación a lo hongo aplicado

individualmente, pero esta alta mortalidad del 90%

fue lograda en un mayor tiempo (nueve días) con

relación a la mortalidad presentada por la

aplicación individual del nematodo (5 días) (Figura

2B).

Por lo contrario cuando fue aplicado el

nematodo 48 horas antes del hongo de Promedio

virulencia, la mortalidad alcanzó 100% en los

primeros 6 días, aconteciendo un incremento en la

mortalidad con relación a lo hongo aplicado solo,

sin superar la alta mortalidad acontecida por los

tratamientos hongo y nematodo y nematodo solo

(Figura 2B). Asimismo, cuando fue aplicado el

nematodo 48 horas antes del hongo de alta virulencia,

á

asociación, por el cual no existió evidencia de

efecto aditivo. En el caso del hongo de media

virulencia aplicado 48 horas antes del nematodo,

presentó TL50 y TL95 de 5,2 11,5, reduciendo el

tiempo de mortalidad con relación a lo hongo

aplicado solo. La respuesta lograda en el TL50 y

TL95 por el efecto combinado del nematodo H.

fue alcanzado un 100% de mortalidad en D. sacharalis

en el octavo día, donde más lenta ésta acción

conjunta, que del hongo y nematodo cuando

fueron aplicados individualmente (Figura 2B).

De acuerdo con el análisis Probit, en cuanto

a la estimación del TL50 y TL95, fueron

confirmadas diferencias en la respuesta en mortalidad

de los agentes entomopatógenos

en el tiempo, donde fue evidente

el efecto aditivo por la acción

combinada de los agentes entomopatógenos

(Tabla 11). Cuando fueron

aplicados el hongo de media

virulencia con el nematodo

simultáneamente, fueron logrados

promedios de TL50 y TL95 de

1,8 y 2,8 respectivamente,

confirmando el efecto aditivo de la

asociación de estos agentes

entomopatógenos. De la misma

forma la asociación del hongo de

alta virulencia con H. bacteriophora

JPM4, presentaron bajos valores

de TL50 y TL95 con 2,4 4,4 días

respectivamente, indicando de la

misma forma que esta asociación

propició una reducción en el tiempo

de mortalidad, donde superior al

efecto presentado por el hongo

aplicado individualmente. En los

tratamientos donde fueron aplicados

los hongos 48 horas antes que el

nematodo, los promedios de TL50

y TL95 con 4,8 8,6 respectivamente,

fueron superiores a las encontradas

con relación al mismo hongo sin

Figura 2. A. B. Mortalidad evaluada en días de los tratamientos

individuas hongos y nematodo y los tratamientos combinados hongo

con nematodo. Convenciones usadas: Fmv=Hongo de medía viru-

lencia; Fav=Hongo de alta virulencia; NEP=Nematodo entomopató-

á

bacteriophora JPM4 aplicado 48 horas antes con los

dos hongos, fueron los tratamientos que presenta-

ron menor tiempo de mortalidad con relación a la

TL50 y TL95 presentada por los hongos cuan-

do fueron aplicados individualmente.

-Producción de JIs: En cuanto a la pro-

ducción de H. bacteriophora JPM4, solamente se

confirmó emergencia de JIs en cuatro trata-

mientos, presentándose diferencias significati-

vas (P<0,05). La mayor producción de nema-

todos se presentó en los tratamientos donde

fue el nematodo fue aplicado individualmente y

junto con el hongo de Promedio virulencia,

con producciones de 71383 ± 8.155 y 59455 ±

6243 JIs/larva respectivamente, donde diferentes

con relación a los tratamientos hongo de Promedio

virulencia aplicado 48 horas antes

del nematodo y nematodo aplicado

48 horas después del hongo de alta

virulencia, con 28403±2407JIs y

8592±291 respectivamente (Tabla

12).

Producción de esporas: Fueron

observadas diferencias significativas

(P<0,05) entre los diferentes

tratamientos donde resultó a

esporulación. El tratamiento que

presentó la mayor esporulación, fue

del hongo de alta virulencia con

1,46 x 108±1,2 5x107 esporas/ml, donde estadísticamente

diferente a la presentado con el hongo de Promedio

virulencia y el hongo de alta virulencia con el

nematodo. En este último caso, junto con todos

los tratamientos que tuvo el nematodo, a esporulación

estuvo inhibida por la alta virulencia del

nematodo adentro del insecto, donde una vez

más se confirma que la concurrencia entre éstos

dos agentes entomopatógenos limita la tasa

reproductiva de los mismos (Tabla 13).

Discusión

Éste es el primer estudio donde es evaluado

Tabla 12. Promedio de producción acumulada de JI.

Tratamiento Prod. Acum. ± E.E

NEP 71383 ± 8155 A

NEP+48h Fmv 59455 ± 6243 AB

Fmv+48h NEP 28403 ± 2407 C

NEP+48h Fav 8592 ± 291 D

Promedios seguidos por letras diferentes, son diferen-

tes significativamente, Tukey (p0,05)

Tabla 13. Promedio de número de esporas por larva.

Tratamiento Prod. Acum. ± E.E

Fav 1,46 x 108±1,25x 107 A

Fmv 3,23 x 107± 3,56 x 106 B

Fav+48h NEP 2,14 x 107± 2,23 x 106 B

Promedios seguidas por letras diferentes, são diferen-

tes significativamente, Tukey (p0,05)

Tabla 11. TL50 e TL95 de los tratamientos evaluados.

Tratamientos TL50 TL95

Días LI LS Días LI LS

Fmv 7,44 6,27 9,28 - - -

Fav 4,02 3,41 4,61 6,40 5,62 7,89

NEP 2,15 1,31 2,73 4,38 3,62 6,24

Fmv e JPM4 1,85 1,35 2,24 2,85 2,41 4,05

Fav e JPM4 2,43 1,74 2,97 4,44 3,75 5,94

Fav + 48h NEP 4,81 3,01 6,22 8,60 6,97 13,37

NEP + 48h Fav 3,22 2,25 3,97 6,89 5,85 8,91

Fmv + 48h NEP 5,26 4,10 6,35 11,54 9,59 15,79

NEP + 48h Fmv 3,17 2,46 3,79 5,80 4,94 7,55

á

nematodo, ya que por sintomatología y desarrollo

adentro del insecto, es el agente entomopatógeno

que consigue colonizar y finalmente si reproducir.

Ansari et al.2004, sugieren que el hongo

M.anisopliae posiblemente tuvo un papel estresante

en H. philanthus reduciendo la capacidad de

consumo alimenticio del insecto, teniendo como

consecuencia una homeostasis interna totalmente

alterada, quedándose el hospedero debilitado y

quisquilloso a la infección de los nematodos.

Un aspecto importante en la interacción H.

bacteriophora JPM4 y los hongos evaluados, fue la

capacidad reproductiva de los agentes

entomopatógenos. Cuando fueron combinados el

hongo de Promedio virulencia con el nematodo

aplicado simultáneamente y 48 horas después,

resultó una total inhibición en la producción de

esporas pero no en la multiplicación del nematodo,

obteniendo altas producciones de 59455 28403

JIs/larva, próximas a la producción lograda en el

tratamiento individual con H. bacteriophora JPM4.

Resultados semejantes fueron registrados por

Ansari et al. (2004), quiénes afirman que en la

interacción entre S. glaseri con M. anisopliae se logró

una producción de 30000 a 40000 JIs/larva a cual

no fue diferente con producción individual del

nematodo. De acuerdo con Molina y López (2001),

el promedio de producción de JIs de Steinernematidos

y Heterorhabditidos está en el rango de 30000 a

50000 JIs/larva, por el cual las producciones

logradas en este experimento producto de la

interacción entre los agentes entomopatógenos

está en el rango de multiplicación estandar de los

NEPs.

Ansari et al.(2004), encontraron al aplicar la mayor

concentración de M. anisopliae (1x108 conidias/g), con H.

el efecto combinado de aislamientos de hongos de

diferente virulencia con un nematodo entomopatógeno.

Todos los agentes entomopatógenos utilizados en

este experimento, fueron aislamientos nativos

teniendo como objetivo su posterior uso en el

control biológico de D. saccharalis y otras plagas de

importancia económica de la región. Existen algunos

trabajos de interacción de nematodos con agentes

entomopatógenos como hongos y bacterias

(Barberchek y kaya, 1990; Barberchek y kaya, 1991;

Koppenhofer y Kaya, 1997; Koppenhofer et al.

1999; Ansari et al., 2004; Shapiro et al, 2004).

Estos resultados mostraron un efecto aditivo

en la mortalidad en D. saccharalis cuando específicamente

el hongo de media virulencia (Metarhizium anisopliae

LPP39) fue combinado simultáneamente con H.

bacteriophora JPM4 presentando la mayor mortalidad y

un tiempo letal de infección menor con relación a

los agentes entomopatógenos por aislamiento,

donde el mejor tratamiento del experimento.

Barberchek y Kaya (1991) encontraron que

Heterorhabditis bacteriophora y B. bassiana, presentaron

alta mortalidad en larvas de Spodoptera exigua

(Lepidoptera: Noctidae), con efecto aditivo con

relación a los agentes entomopatógenos separadamente.

Shapiro et al. (2004), encontraron que la mayoría

de las interacciones entre patógenos en la mortalidad

de Curculio caryae (Coleoptera: Curculionidae

ocurrió antagonismo y pocas interacciones

presentaron algún efecto de sinergismo.

Una posible explicación de la eficiencia en

mortalidad y en la reducción del tiempo letal de

infección de la combinación simultánea y anticipada

del hongo de Promedio virulencia con el nematodo,

es el papel supresor que desempeña el hongo colocando

más vulnerable el insecto a la infección del

á

Actualmente se está trabajando con dos aislamientos

nativos de NEP aisladas por Corpoica, la cual se

encontró parasitando naturalmente a Compsus n sp

(Coleoptera: Curculionidae), se purificó el

aislamiento y fue reinoculado en pruebas de

patogenicidad, en larvas y adultos de Compsus, con

100% de mortalidad, donde solo en los adultos se

multiplicaron en bajo volumen. Para confirmar la

patogenicidad por nematodos entomopatógenos,

se utilizó como hospedero alternativo, larvas de

Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae).

Fueron obtenidas dos cepas, pertenecientes al

género Steinernema, denominadas Steinernema sp.

CLS2 y Steinernema sp. CLS1, con mortalidades del

95,4 y 89,7% en S. frugiperda y con multiplicación

de 63.784±5.863 y 46.357±9.843 juveniles/larva

respectivamente. Así se confirmó el aislamiento de

dos cepas nativas de Steinernema, de alta multiplicación,

para ser utilizados en trabajos para el control de

Compsus n.sp.. Recientemente, se realizó un convenio

interinstitucional entre Cenicafé y Corpoica C.I

Turipaná, donde especies nativas de estos nematodos

entomopatógenos, caracterizadas en un estudio de

reconocimiento de su diversidad en la región Andina

(López et al., 2007), se evaluaran como potencial

herramienta de control de plagas de importancia

económica en Colombia como, S frugiperda y Aeno-

lamia reducta (Hemiptera: Cercopidae).

megidis, el número de nematodos producidos por

larva decreció significativamente. En cuanto la

producción de esporas por los hongos en los

tratamientos combinados con Heterorhabditis bacteriophora

JPM4, la esporulación siempre estuvo restricta

por la alta virulencia del nematodo dentro del

insecto, donde una vez más se confirma que la

competencia entre éstos dos agentes entomopatógenos,

limita la tasa reproductiva de los hongos. Con

relación a lo efecto antibiótico de los nematodos

entomopatógenos, la bacteria simbiótica puede

estar suprimiendo la acción antibiótica del hongo

para su total desarrollo en D. saccharalis.

Hu y Webster (2000), afirman que durante

las primeras 24 horas del inicio de la infección, la

población de Photorhabdus luminescens C9, bacteria

simbiótica del nematodo H. megidis, aumenta

totalmente produciendo antibióticos aproximadamente

durante 21 días, con la hipótesis que éstos minimizan

la competición de otros microorganismos que

intentan invadir el mismo hospedero. Isaacson y

Webster (2002), afirman que la bacteria simbiótica

Xenorhabdus sp. del nematodo Steinernema riobrave

presenta actividad antibiótica y antimicótica

siguiendo una calidad semejante al de la curva de

crecimiento de la fase estacionaria de la bacteria,

donde que la actividad antimicótica estaba

compuesta de exo y endoquitinasas, proteinasas y

un poco de combinaciones moleculares.

Trabajos preliminares con Nematodos entomopatógenos en ejecución por Corpoica C.I Turipaná.

á

Conclusiones generales de los trabajos descritos En el muestreo de nematodos entomopatógenos

nativos, fueron logrados 6,8% de recuperación de

aislamientos positivos con nematodos

entomopatógenos principalmente la localizada en

el área de plantas dañinas de las 11 áreas evaluadas,

por presentar las mejores condiciones para la

supervivencia y el aislamiento de nematodos, como

poca disturbación del suelo, buena humedad y

poca aplicación de agroquímicos.

La mejor técnica de aislamiento de nematodos

entomopatógenos nativos fue de insecto trampa,

técnica por la cual fueron separadas 100% de las

muestras recobradas con nematodos, con una

eficiencia del 50%. La técnica del embudo de Baermann

no presentó eficiencia, donde poco selectiva para

el aislamiento de nematodos entomopatógenos.

Por identificación morfométrica, los tres

aislamientos fueron considerados cepas de Heteror-

habditis bacteriophora Poinar, (1976). JPM3, 3.1 y 4.

Dichas cepas presentan un ciclo de vida corto

completado en 9 días y largo con tres generaciones

completado en 19 días.

Los sistemas de infección más efectivos para

la multiplicación de todas las especies de nematodos

en orden de importancia fueron topical simple y

compuesta, donde los mejores sistemas para continuar

trabajos en producción in vivo de otros nematodos.

G. mellonella es el hospedero más efectivo

para producción in vivo para todas las especies,

pero los hospederos B. mori para la especie S. carpocapsae

y T. molitor para la especie S. anomali presentan

óptimas posibilidades como hospederos alternativos.

La combinación entre el nematodo H.

bacteriophora JPM4 y hongo de media virulencia M.

anisopliae LPP39, presenta un efecto aditivo en la

mortalidad de larvas de D. saccharalis e se incrementa

la eficiencia de los dos agentes entomopatógenos.

En los trabajos ha ser realizados en el caribe

Colombiano, debe caracterizar inicialmente NEPs

nativos con alta virulencia, resistencia a altas

temperaturas y alta multiplicación, en las plagas de

importancia económica para la región. Aun

los trabajos están en fase exploratoria.

Referencias Bibliográficas ADAMS, B. J.; NGUYEN, K. B. Taxonomy and

systopicaltics. In: GAUGLER, R. (Ed.). Entomo-

pathogenic nematology. New Jersey: Rutgers Uni-

versity, 2002. p. 1-28.

ANSARI, M.A.; TIRRY L.; MOENS M. 2004. In-

teraction between Metarhizium anisopliae and ento-

mopathogenic nematodes for the control of Hoplia

philanthus. Biological control 31, 172–180.

BARBERCHECK, M. E. 1992. Effect of soil

physical factors on biological control agents of soil

insect pests. The Florida Entomologist, Gaines-

ville, v. 75, n. 4, p. 539-548.

á

BARBERCHECK, M. E.;KAYA, H.K. 1991.

Competitive interactions between entomopatho-

genic nematodes and Beauveria bassiana

(Deuteromycotina: Hypomycetes) in soilborne lar-

vae of Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae).

Environmental entomology 20: 2, 707-712.

BARBERCHECK, M. E.; KAYA, H. K. 1991. Ef-

fect of host condition and soil texture on host

finding by the entomogenous nematodes Heteror-

habditis bacteriophora (Rhabditida: Heterorhabditi-

dae) and Steinernema carpocapsae (Rhabditida: Stein-

ernematidae). Environmental Entomology,

Lanham, v. 20, n. 2, p. 582-589.

BARBERCHECK, M. E.;KAYA, H.K. 1990. In-

teractions between Beauveria bassiana and the ento-

mogenous nematodes, Steinernema feltiae and Het-

erorhabditis heliothidis. Journal of invertebrate pathol-

ogy 55, 225-234.

BOEMARE, N. Biology, taxonomy and sistematic

of Photorhabdus and Xenorhabdus. In: GAUGLER,

R. (Ed.). Entomopathogenic nematology. New Jer-

sey: Rutgers University, 2002. p. 35-56.

CHRISTOPHER, Z.; WOMERSLEY, C. Z. 1990.

Dehydration survival and anhydrobiotic potential.

In: GAUGLER, R.; KAYA, H. K (Ed.). Entomo-

pathogenic nematodes in biological control.. Boca

Raton: CRC Press, p. 117-135.

DUTKY, S. R.; THOMPSON, J. V.;

CANTWELL, G. W. 1964. A technique for the

propagation of the DD-136 nematode. Journal of

Insect Pathology, San Diego, v. 6, n. 4, p. 417-422.

GAUGLER, R.; HAN, R. Production tecnology.

In: GAUGLER, R. (Ed.). Entomopathogenic

nematology. New Jersey: Rutgers University, 2002.

p. 289-310.

GEORGIS, R.; HOM, A. Introduction of ento-

mopathogenic Nematode Products into Latin

America and the Caribbean. Nematropica, Au-

burn, v. 22, n. 1, p. 81-98, June 1992.

HU, K.; WEBSTER, J. M. 2000. Antibiotic pro-

duction in relation to bacterial growth and nema-

tode development in Photorhabdus Heterorhabditis

infected Galleria mellonella larvae. Microbiology let-

ters 189, 219-223.

ISAACSON, P. J.; WEBSTER J. M. 2002. Antim-

icrobial activity of Xenorhabdus sp. RIO

(Enterobacteriaceae), symbiont of the entomopa-

thogenic nematode, Steinernema riobrave (Rhabditida:

Steinernematidae). Journal of Invertebrate Pathol-

ogy 79, 146–153

JANSSON, K. R. 1996. Infectivity and reproduc-

tion of three Heterorhabditid nematodes

(Rhabditida: Heterorhabditidae) in two insect host.

The Florida Entomologist, Gainesville, v. 79, n. 3,

p. 363-368.

KAYA H. K.; STOCK S. P. 1997. Techniques in

insect nematology. In: Manual of Techniques in

Insect Pathology. Academic press. N.T. 281-324.

KAYA, H. K. 1990. Soil ecology: In: GAUGLER

R.; KAYA, H. K. (Ed.). Entomopathogenic nema-

todes in biological control. Boca Raton: CRC

Press, p. 93-115.

á

KOPPENHOFER, A. M.; H. K. KAYA 1997.

Additive and synergistic interaction between Ento-

mopathogenic Nematodes and Bacillus thuringien-

sis for scarab grub control. Biological control 8,

131–137.

KOPPENHOFER A. M.; CHOO H, Y.; KAYA

H. K.; LEE, D. W.; GELERNTER W. D. 1999.

Increased field and greenhouse efficacy against

scarab grubs with a combination of an entomopa-

thogenic nematode and Bacillus thuringiensis. Bio-

logical control 14, 37–44.

LACEY L, A.; UNRUH T, R.; HEATHER L. H.

2003. Interactions of two idiobiont parasitoids

(Hymenoptera: Ichneumonidae) of codling moth

(Lepidoptera: Tortricidae) with the entomopatho-

genic nematode Steinernema carpocapsae (Rhabditida:

Steinernematidae). Journal of invertebrate pathol-

ogy 83, 230–239.

LÓPEZ-NÚÑEZ J.C.; CANO L.; GÓNGORA

C.E.; STOCK, S.P. 2007. Diversity and evolution-

ary relationships of entomopathogenic nematodes

(Steinernematidae and Heterorhabditidae) from

the central Andean region of Colombia. Nematol-

ogy 9: 333-341.

MOLINA, A. J. P. 2004. Aislamiento, identifica-

ção, biologia e Producción in vivo de nematodos

entomopatógenos (Rhabditida) provenientes de

Lavras, MG. Universidade Federal de Lavras, MG-

Brasil. 96p. (Tese M. Sc em Entomologia)

MOLINA, A. J. P.; LÓPEZ, N. J. C. 2002. Des-

plazamiento y parasitismo de los entomonemato-

dos Steinernema feltiae (Rhabdiida: Steinernematidae)

y Heterorhabditis bacteriophora (Rhabditida: Heteror-

habditidae) hacia frutos infestados con la broca del

café Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Sco-

lytidae). Revista Colombiana de Entomología, San-

tafe de Bogota, v. 28, n. 2, p. 145-151,

MOLINA, A. J. P.; LÓPEZ, N. J. C. 2001. Pro-

ducción in vivo de tres entomonematodos con dos

sistemas de infección en dos hospedantes. Revista

Colombiana de Entomología, 27:1-2, 73-78.

NGUYEN, K. B. 2004. Morphology and taxon-

omy of entomopathogenic nematodes. Florida: U-

niversity of Florida. Entomology and Nematology

Department. Estados Unidos. Disponível em:

<http://www.ifas.ufl.edu/~kbn/kbnstein. htm>.

OZER, N.; UNLU, I. O. 2003. Evaluation of the

reproductive potential and competition between

two entomopathogenic nematodes, Steinernema

feltiae Filipjev, 1934 (Rhabditida: Steinernematidae)

and Heterorhabditis bacteriophora, Poinar 1976

(Rhabditida: Heterorhabditidae). Turkey Journal

Biology, Ankara, v. 27, p. 149-155.

POINAR, G. O. 1990. Biology and taxonomy of

Steinernematidae and Heterorhabditidae. In:

GAUGLER, R.; KAYA, H. K. (Ed.). Entomopa-

thogenic nematodes in biological control. Boca

Raton: CRC Press, p. 23-58.

POINAR, G. O. 1976. Description and biologyof

a new insect parasitic rhabditoid. Heterorhabditis bac-

teriophora n. gen. n sp. (Thabditida: heterorhabditi-

dae n. fam). Nematologica, Leiden, v. 21, n. 4, p.

463-470,

á

PORTILLO, A. C.; VILLANI, G. M.; TAUBER,

J. M.; TAUBER, A. C.; NYROP, P. J. 2000. Ento-

mopathogenic nematode (Rhabditida: Heterorhab-

ditidae and Steinernematidae) response to soil tex-

ture and bulk density. Environmental Entomology,

Lanham, v. 28, n. 6, p. 1021-1035.

RICCI, M.; GLAZER, I.; CAMPBELL, J. F.;

GAUGLER, R. Comparison of biossays to meas-

ure virulence of different entomopathogenic

nematodes. Biocontrol Science and Technology,

Abingdon, v. 6, n. 2, p. 235-245, June 1996.

SHAPIRO D. I.; JACKSON, M.; REILLY C. C.;

HOTCHKISS M. W. 2004. Efects of combining

an entomopathogenic fungi or bacterium with en-

tomopathogenic nematodes on mortality of Curcu-

lio caryae (Coleoptera: Curculionidae). Biological

Control 30, 119–126.

STOCK, S. P. 1998. Sistemática y biología de ne-

matodos parásitos y asociados a insectos de impor-

tancia económica. Santa Fe, Argentina: Universi-

dad Nacional del Litoral Esperanza, 88 p.

STOCK, S. P.; KAYA, H. K. 1996. A multivariate

analysis of morphopmetric characters of Heteror-

habditis spscies (Nemata: Heterorhabditidae) and

the role of morphometrics in the taxonomy of spe-

cies of the genus. Journal of Parasitology, Law-

rence, v. 82, n. 5, p. 806-813.

TAYLOR, P. S.; SHIELDS, E. J. 1990. A Micro-

computer-controlled system of environmental

chambers suitable for the study of thermoperiodic

effects. Environmental Entomology, Lanham, v.

19, n. 4, p. 866-873.

WOODRING, J. L.; KAYA H. K. 1988. Sterne-

matidae and Heterorhabditidae nematodes: A

handbook of techniquess soulhern cooperative.

Arkansas Agricultivol Experimen Station Fallete-

ville, (Series Bulletin 331).

1Instituto

Biológico/Apta/CEIB, C.P. 70,

Campinas, SP, 13001-970;

lgleite@biologico.sp.gov.br

No Brasil, com a expansão de áreas cultivadas e uma exploração

agrícola cada vez mais intensa e menos diversificada, tem sido notado ao

longo dos anos um aumento significativo no número de pragas de solo,

deixando os agricultores na dependência muitas vezes do controle químico.

Tal prática, ao longo do tempo, pode trazer conseqüências indesejáveis

ao meio ambiente e à saúde humana, além de que nem sempre tem

proporcionado resultados de controle plenamente satisfatórios. Em nível

mundial, o panorama pouco diverge e, em razão disso, o controle biológico

de pragas de solo, que já tem sido bastante estudado há mais de 60 anos,

buscou tornar-se alternativa viável aos produtores rurais; nessa linha, o

emprego mais intensivo de nematóides entomopatogênicos constitui

técnica de adoção relativamente recente e ainda em fase de expansão em

muitos países, inclusive no Brasil.

Introdução

Ciclo de vida

Histórico no Brasil

Pesquisas realizadas pelo Instituto Biológico

Considerações Finais

Referências Bibliográficas

O juvenil de terceiro estágio (infectivos)

(Figura 1) dos nematóides esteinernematídeos e

heterorhabditideos não se alimenta e carrega suas

bactérias mutualisticas específicas no intestino

(Leite et al. 2006). Os juvenis infectivos (JI)

entram em seus insetos hospedeiros através das

aberturas naturais (boca, ânus e espiráculos) e

penetram no hemocele. No caso específico do

gênero Heterorhabditis, os juvenis infectivos podem

penetrar também diretamente pelo tegumento.

Dentro do hemocele, os juvenis liberam células

da bactéria que se propaga e mata o hospedeiro em

48 horas. Os nematóides se alimentam da bactéria e tecido hospedeiro, se reproduzem por 2 a 3 gerações

e emergem dos cadáveres como juvenis infectivos para a procura de novos hospedeiros (Figura 2).

Figura 1. Juvenis infectivos do nematóide

Steinernema sp.

No Brasil, Lauro Travassos foi o grande pioneiro

no campo da Helmintologia e várias de suas

publicações, principalmente a partir da década de

1920, contribuíram decisivamente ao conhecimento

dos nematóides das famílias Oxyuridae e Thelastomatidae,

parasitos de miriápodos e insetos. Ressalta-se o

trabalho de 1927, em que transferiu a espécie Aplectana

kraussei para um novo gênero por ele denominado

Steinernema, hoje um dos mais importantes, senão o

principal, no âmbito da Nematologia de Insetos

(Wouts et al., 1982). Outro registro histórico significativo

foi o relato, também no Brasil, por C. Pereira em

1937, de um nematóide encontrado associado a

Eutinobothrus brasiliensis, a broca do algodoeiro, por

ele nomeado Rhabditis hambletoni. Quase 40 anos

depois, com a criação do gênero Heterorhabditis,

essa espécie foi transferida para ele, resultando o

novo nome Heterorhabditis hambletoni (Poinar, 1979).

á

Figura 2 – Ciclo biológico dos nematóides dos gêneros Steinernema e Heterorhabditis (Leite et al. 2006).

Essa foi, portanto, ao que tudo indica, a primeira

espécie conhecida do gênero Heterorhabditis, embora

muitos a considerem ainda hoje como species

inquirenda.

Os trabalhos nacionais tratando de associações

entre nematóides e insetos resumiram-se por muito

tempo aos estudos pioneiros, já citados no item 2,

realizados por L. Travassos na primeira metade do

século passado, além do relato também significativo,

mas isolado, de R. Pereira, datado de 1937. Em

termos práticos, somente são retomados a partir da dé-

cada de 1980, quando Pizano et al. (1985) relataram o

parasitismo de S. glaseri sobre ovos de Migdolus

fryanus, um coleóptero-praga da cana-de-açúcar

no interior paulista, e com Arrigoni et al. (1986),

que realizaram estudo de campo com população

importada de S. carpocapsae visando a avaliar a sua

eficiência no controle de larvas dessa mesma praga,

mas com resultados inconclusivos.

Nessa ocasião, dentro de publicação mais ampla

que tratava do controle microbiano de pragas no País,

Ferraz (1986), teve a oportunidade de incluir um

primeiro capítulo abordando, de forma geral, o

tema „Nematóides Entomopatogênicos‟, buscando

assim divulgar melhor o assunto bem como alertar os

pesquisadores nacionais sobre a sua importância.

Ferraz & Monteiro (1987) relataram o parasitis-

mo de diferentes insetos considerados pragas de

interesse no Brasil por nematóides mermitídeos do

gênero Hexamermis. Nos anos seguintes, Follegati

et al. (1988) estudaram a produção in vivo de S.

carpocapsae usando larvas de Diatraea sacharalis, a

broca da cana-de-açúcar, e Leite et al. (1990)

verificaram que a produção de S. glaseri sobre lagartas

de G. mellonella, mortas por aquecimento ou

á

congelamento, pode ser três ou quatro vezes mais

elevada do que sobre lagartas vivas. Schmitt et al.

(1992) conduziram ensaios de campo com dois

isolados de S. carpocapsae, aplicados sobre pseudocaules

partidos, para o controle de adultos do coleóptero

Cosmopolites sordidus o “moleque” ou broca da

bananeira, com resultados bastante satisfatórios

e superiores aos obtidos mediante liberação dos

nematóides no solo ao redor das plantas. Aguillera

& Smart (1993) estudaram o desenvolvimento,

a reprodução e a patogenicidade de S. scap-

terisci , parasito de paquinhas , em cul turas

monoxênicas com diferentes espécies de bactérias;

o nematóide desenvolveu-se bem e multiplicou-se

sobre Xenorhabdus nematophilus e X. bovienii, entre

outras bactérias, situando-se as dosagens letais para os

insetos testados entre 1000 e 4000 juvenis infectivos.

Passos Jr. et al. (1995) e Passos Jr. & Alves (1995)

avaliaram o potencial de S. carpocapsae, isolado

Exhibit, para o controle da saúva-limão, Atta

sexdens rubropilosa, e do cupim Heterotermis tenuis sob

condição de laboratório. O nematóide, aplicado à

dose de 1000 juvenis infectivos/cm2 de superfície

foliar, acabou contaminando formigas operárias

durante a movimentação destas, embora elas

aparentemente não cortassem as folhas tratadas;

com isso, o nematóide acabou sendo introduzido

no sauveiro, inclusive na câmara em que estava a

rainha, tendo causado mortalidade de exemplares

do inseto de diferentes castas (27,3; 90,7; e 96,4% para

jardineiras, operárias e soldados, respectivamente) e

reduzido o volume do fungo utilizado pela colônia

como alimento. No caso dos cupins, os resultados,

embora promissores, foram inconclusivos porque

o composto químico utilizado com o propósito

de simples reativação dos nematóides infectivos

mostrou-se também tóxico ao inseto-teste. Alves et

al. (1998), Ferraz (1998) e Neves et al. (1998), em um

mesmo livro-texto, publicaram novos capítulos

enfocando diferentes aspectos relacionados ao uso

dos nematóides entomopatogênicos.

Embora não envolvendo uma espécie tipicamente

classificada como nematóide entomopatogênico, há de se

lembrar o bem sucedido programa de controle da

vespa da madeira dos pinheiros nos estados do Sul

pelo neotilenquídeo Beddingia siricidicola, implementado

pela EMBRAPA/CNPF a partir da década de

1990 até o presente.

A partir do ano 2000, esse campo de estudo

começou a ganhar destaque no País, com a realização

de um primeiro Workshop sobre o assunto em

Araras (SP), do qual resultou um artigo relevante

(Grewal et al., 2001) em que se ressaltava o potencial

de uso dos nematóides entomopatogênicos no

Brasil e na América Latina; em 2001

e 2003, outros importantes eventos,

que contaram com a participação

de vários especialistas estrangeiros,

foram promovidos em Campos do

Goytacazes (RJ). A partir daí, grupos

de pesquisas foram estabelecidos

principalmente em Lavras (UFLA-MG), em

Campos dos Goytacazes (UENF-RJ) e em Campinas

(Instituto Biológico-SP), além de vários outros,

emergentes ou já pré-existentes, em Araras, Botucatu,

Jaboticabal, Piracicaba e São Paulo.

No Estado de São Paulo, nematóides estão

sendo avaliados para o controle da mosca dos

fungos (fungus gnat), Bradysia sp. (Diptera: Sciaridae),

em viveiros de mudas e em cultivos de cogumelo;

bicudo da cana-de-açúcar, Sphenophorus levis

(Coleoptera: Curculionidae); cigarrinha da raiz da

cana-de-açúcar, Mahanarva fimbriolata (Hemiptera:

Cercopidae); broca do rizoma da cana-de-açúcar,

Migdolus fryanus; larvas de escarabeídeos também

em cultivos de cana-de-açúcar; traça Opogona sachari,

em cultivos de cogumelo shiitake; besouro

“cascudinho”, Alphitobius diaperinus, em aviários;

“bicho furão” do citros, Echiditolopha aurantiana; e

mosca das frutas, Ceratitis capitata. Testes avançados

de campo já evidenciaram a eficácia e viabilidade

de uso de nematóides para o controle de S. levis, da

mosca dos fungos e da traça O. sachari, esta em

cultivo do cogumelo shiitake (Leite et al., 2005).

Ainda em São Paulo, em condições de laboratório,

altas taxas de mortalidade foram obtidas mediante

inoculações de adultos e ninfas do percevejo castanho

(Scaptocoris castanea) e de operárias e soldados do

cupim de montículo Cornitermes cumulans com S.

carpocapsae à razão de 1000 juvenis/

inseto; no caso dos cupins, S. glaseri

também foi testado, mas mostrou-se

menos eficaz (Rosa et al., 2003 a,b).

No Estado do Rio de Janeiro, numa

primeira fase, estudos básicos sobre a

biologia e embriologia de nematóides

entomopatogênicos, bem como sobre a histopatologia

de insetos por eles parasitados, têm sido desenvolvidos.

Além disso, nematóides oriundos de solo amostrado

em diferentes regiões do País têm sido avaliados

quanto à eficiência como agentes do biocontrole

de pragas, principalmente para o controle do

gorgulho da goiaba, Conotrachelus sp., muito

importante nas áreas de produção do Noroeste do

Rio de Janeiro. Os estudos iniciais mostraram que,

dentre nove linhagens testadas, Heterorhabditis indica

„Hom 1‟ e H. baujardi „LPP7‟ apresentaram taxas de

á

Múltiplos aspectos da utilização dos nematóides entomopatogênicos começam a se tornar freqüentes no País, indicando o crescente

interesse de jovens pesquisadores

mortalidade do inseto superiores a 80% em placas

de Petri com areia, no laboratório, à razão de 100

juvenis infectivos/placa; quando testados em

coluna de areia, ambos foram eficientes em

encontrar larvas do besouro, com mortalidade da

ordem de 70% à concentração de 500 juvenis/

coluna. No campo, os ensaios realizados, pelos

quais lagartas mortas de G. mellonella infectadas por H.

baujardi „LPP7‟ criadas pelos próprios agricultores

foram distribuídas no solo ao redor de goiabeiras

atacadas, ofereceram resultados preliminares

alentadores, com diminuição em relação à testemunha

de quase 90% na população de adultos da praga.

Melhoramento dos nematóides visando melhor

adaptação às temperaturas elevadas da região vem

sendo conduzido, tendo já sido obtida a linhagem

LPP728 de H. baujardi, tolerante a até 34C e com

a mesma virulência da linhagem original, mas 50%

menos prolífica (Dolinski, 2005).

Em Minas Gerais, além de pesquisas básicas em

que se busca a seleção de populações autóctones

com bom potencial ao emprego no biocontrole,

novas técnicas de produção massal in vivo e melhorias

nas condições de armazenamento dos nematóides

á

entomopatogênicos já disponíveis para uso, estudos

vêm sendo desenvolvidos visando ao controle da

cochonilha rosada em cultivo de café, de tripes em

cultivos protegidos e de carrapatos de importância

veterinária (Moino Jr. & Furlong, 2005). No Mato

Grosso do Sul, há estudos relativos ao controle do

percevejo castanho (Scaptocoris castanea) e, no

Maranhão, contra a broca gigante da cana-de-

açúcar, Castnia licus (Arruda et al., 2004; Vivan,

2005).

Dissertações de mestrado e teses de doutorado

envolvendo múltiplos aspectos da utilização dos

nematóides entomopatogênicos começam a se

tornar freqüentes no País, indicando o crescente

interesse de jovens pesquisadores pelo assunto.

Tal fato, aliado à realização de estudos e projetos

cooperativos entre diferentes instituições nacionais,

oficiais ou privadas, permitem antever que o uso

comercial dos nematóides entomopatogênicos no

Brasil, como já ocorre em outros países, deverá

tornar-se realidade e estar consolidado em futuro

próximo.

O Instituto Biológico (IB), em parceria com

a empresa Bio Controle Métodos de Controle

de Pragas Ltda, vem estudando nematóides

entomopatogênicos para o controle biológico

de pragas com financiamento da Fundação de

Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo -

Fapesp, dentro do Programa de Inovação Tecno-

lógica em Pequenas Empresas - PIPE (Fase I e II)

(Leite et al. 2006).

O primeiro passo da pesquisa foi estabelecer

uma coleção de nematóides entomopatogênicos

procurando-se explorar a biodiversidade desses

organismos existente no país. O IB vem avaliando

esses agentes para o controle de diversas pragas, e

alguns nematóides, como o H. indica IBCB-n5 e

Steinernema sp. IBCB-n6, tem se mostrado bastante

promissor.

O Instituto Biológico vem estudando a produção

“in vitro” de nematóides entomopatogênicos,

procurando adaptar os processos da esponja e de

fermentação para as condições do Brasil. Até o

momento tem sido estudado apenas o processo da

esponja, sendo já desenvolvido um meio de cultura

a base de fígado

bovino, o qual

permite produções

de até 180.000 JI/

mL para H. indica

IBCB-n5 e até

200.000 JI/mL para

Steinernema sp.

IBCB-n6 (Figura 3).

Uma formulação pó

-molhavel de H.

indica e outra em esponja de Steinernema sp. foram

desenvolvidas, permitindo a preservação desses

nematóides por dois meses nas temperaturas de

15º e 24ºC, e uma semana na temperatura de 35ºC.

Nematóides entomopatogênicos têm sido

avaliados para o controle de diversos insetos pragas,

apresentando-se bastante promissor para o controle

de fungus gnat, Bradysia sp. (Diptera: Sciaridae),

que é praga em viveiros de mudas e cultivos de

cogumelos; e contra o bicudo da cana-de-açúcar,

Sphenophorus levis (Coleoptera: Curculionidae).

Fungus gnat: “Fungus gnats” são moscas

pequenas do gênero Bradysia, consideradas

importantes pragas em cultivos de cogumelos e

viveiros de mudas, atacando citros, fumo,

ornamentais, e diversas outras plantas de importância

econômica. As larvas do inseto se alimentam de

fungos, algas e matéria orgânica em decomposição,

vivendo em ambientes úmidos e escuros. Todavia

quando se estabelecem, as larvas

passam a se alimentar das raízes das plantas,

principalmente as raízes mais finas, com túneis nas

raízes mais grossas, provocando danos de grande

importância, principalmente em mudinhas em fase

de germinação, e a morte das plantas em casos de

infestação pesada. Além disso, esses danos podem

contribuir para a infecção das plantas por fungos

fitopatogênicos dos gêneros Pythium, Botrytis,

Verticillium, Fusarium, Thielaviopsis, Cylindrocladium e

Sclerotinia.

Até 1966, esta mosca não era considerada praga

nos EUA, sendo sua presença apenas inconveniente.

Atualmente é uma praga mundial e no Brasil, nos

últimos anos, tornou-se uma importante praga,

sendo disseminada de Norte a Sul, e desconhecida

pela grande maioria dos viveiristas e produtores

em estufas. Estima-se que existem no país mais de

15.000 estufas com mudas de plantas, as quais po-

dem estar infestadas com a mosca dos fungos.

á

Figura 3. Nematóides Steinerne-

ma sp. (A) e Heterorhabditis indi-

ca (A) cultivados pelo processo

de esponja

A

B

Não existe nenhum inseticida registrado para o

controle desse inseto no Brasil. Nos EUA, Europa

e outros países, um método bastante conhecido e

utilizado com eficiência é o controle biológico por

meio do nematóide Steinernema feltiae. O ambiente

úmido e sombreado predominante em áreas de

propagação de mudas favorece o nematóide que

ataca tanto a larva como a pupa do inseto. O IB

vem avaliando nematóides para o controle da mosca

dos fungos, tendo selecionado em laboratório a

espécie H. indica IBCB-n5 como a mais virulenta,

proporcionando nível de mortalidade do inseto na

dosagem de 10 JI/cm2 (89%) semelhante ao obtido

com a espécie S. feltiae (84%) (Leite et al. 2006).

Cigarrinha da raiz da cana-de-açúcar:

Cigarrinhas representam um dos grupos de insetos

mais importantes para a cana-de-açúcar em vários

países da América Latina, como no Brasil, Argentina,

Venezuela, México, América Central e Trinidad

Tobago. A cigarrinha da raiz da cana-de-açúcar,

Mahanarva. fimbriolata (Stal, 1854), tornou-se uma

das principais pragas da cultura no Estado de São

Paulo com a expansão do sistema de colheita

mecanizada (cana-crua). As ninfas (Figura 4)

atacam a raiz, reduzindo a produção em até 40%.

No manejo integrado da cigarrinha da raiz, o con-

trole biológico tem ocupado posição de destaque

pelo uso do fungo Metarhizium anisopliae, agente

que ocorre naturalmente na população desse inseto.

O fungo tem sido usado em larga escala no controle

desse inseto, podendo ter um grande aliado com a

implementação do uso de nematóides entomopatogênicos

para o controle de pragas de solo em cana-de-

açúcar.

á

Os nematóides entomopatogênicos dos gêneros

Steinernema e Heterorhabditis têm sido citados desde

1981 como agentes potenciais para o controle de

cigarrinhas pragas da cana-de-açúcar. Em teste de

laboratório realizado no Instituto Biológico, avaliando

diferentes nematóides entomopatogênicos contra

ninfas de M. fimbriolata, foi possível selecionar um iso-

lado de Heterorhabditis sp. (CB-n5) proporcionando

100% de mortalidade do inseto.

Esse nematóide tem sido produzido "in vitro" e

avaliado em condições de campo contra a cigarrinha

da raiz além de outras pragas da cana-de-açúcar

(Leite et al. . Em um dos testes, o nematóide foi

aplicado sobre a palhada e sobre o solo (retirando

temporariamente a palhada) nas dosagens de 6,6

x 107, 3,3 x 108, 6,6 x 108 e 3,3 x 109 JI/ha.

Todas as dosagens proporcionaram níveis de

controle semelhantes, independentemente da data

de avaliação, reduzindo a população de ninfas no

12 dia em 56 a 67% para o nematóide aplicado

sobre a palhada, e 66 a 73% quando aplicado no

solo, retirando-se temporariamente a palhada. Esse

estudo mostra que a palhada não afeta a eficiência

Figura 4. Ninfas de Mahanarva fimbriolata

do nematóide, permitindo alcançar o solo e encontrar

o hospedeiro.

O nematóide aplicado nessa dosagem manteve

níveis de controle da cigarrinha acima de 50% por

até 82 dias (Figura 5). Ao longo do experimento

foram encontradas algumas ninfas da cigarrinha

mortas pelo nematóide, apresentando o sintoma

característico de coloração avermelhada (Figura 6).

Bicudo da cana-de-açúcar: O bicudo da

cana-de-açúcar, Sphenophorus levis, é uma im-

portante praga dos canaviais no estado de São

á

Figura 6. Ninfa de Mahanarva fimbriolata morta pelo

nematóide Heterorhabditis sp.

Figura 5. Flutuação populacional de ninfas de Mahanarva fimbriolata nas parcelas tratadas com o nematóide

Heterorhabditis sp. na dosagem de 6,6 x 107 JI/ha. Testemunha = ______. Nematóide = ______.

Paulo. As larvas desse inseto destroem rizoma da

planta, causando prejuízos da ordem de 30 toneladas

de cana por hectare, além de reduzir a longevidade

do canavial.

A importância de S. levis como praga da

cana-de-açúcar no Brasil somente foi conhecida a

partir de 1977, sendo que 1989 o inseto foi detectado

em 14 municípios ao redor de Piracicaba causando

a morte de 50-60% dos perfilhos ainda na fase de

cana-planta, com cinco a sete meses de

á

crescimento. Atualmente, S. levis encontra-se

distribuído em mais de 70 municípios, estando portanto

em quase todas as regiões de cultivos de cana-de-açúcar

do estado de São Paulo e em outros estados.

Nos EUA e Japão, algumas espécies de Sphenophorus

são pragas importantes em gramados, sendo

eficientemente controladas pelo uso dos nematóides

H. bacteriophora e S. carpocapsae. Esses nematóides

foram eficientes no controle de S. purvulus e S. vena-

Figura 7. Mortalidade de larvas de Sphenophorus levis tratadas com os nematóides Steinernema sp. (S) e

Heterorhabditis indica (H) nas dosagens de 2,4; 12 e 60 JI/cm2. Dados corrigidos pela formula de Abbott.

tus em testes de campo realizados nos EUA para a

primeira espécie, e no Japão para a segunda. O

nematóide S. carpocapsae na dosagen de 2,5 x 109

JI/ha proporcionou níveis de controle variáveis de

70,4 a 91,2% contra S. purvulus, e de 77,3 a 96,2%

contra S. venatus. Já H. bacteriophora testado na mesma

dosagem, foi pouco menos eficiente contra S.

purvulus, proporcionando níveis de controle variáveis

de 67,0 a 84,1%. Todos os estágios imaturos

desses insetos são susceptíveis a nematóides

entomopatogênicos, sendo que os adultos da espécie

S. venatus são suscetíveis também ao nematóide S.

carpocapsae (Smith 2005).

Inicialmente, foi realizado um teste de laboratório

para avaliar a susceptibilidade de larvas de S. levis

aos nematóides Heterorhabditis indica (isolado IBCB-

n5) e Steinernema sp. (IBCB-n6). Esse estudo

demonstrou que as larvas são susceptíveis a esses

agentes, o que motivou a instalação de um

segundo ensaio, em casa de vegetação, para comparar a

eficiência desses dois nematóides contra larvas de

S. levis alojadas dentro do rizoma da planta,

em condições de ambiente mais próximos

das condições de campo (Tavares et al. 2007). O

nematóide Steinernema sp. apresentou-se mais eficiente

que H. indica, proporcionando mortalidade do inseto de

70% quando avaliado já na menor dosagem de 2,4

JI/cm2, equivalente a 1 x 108 JI/ha (Figura 7).

Todas as larvas mortas do inseto encontravam-se

dentro dos canais construídos no rizoma da planta

(Figura 8), alojadas em distâncias de até 4 cm a

partir da abertura do canal, o que demonstra a

capacidade desses dois nematóides para a localização e

busca do hospedeiro, locomovendo-se inicialmente

pelo solo e, em seguida, pelo canal até alcançar o

inseto.

Em outros ensaios, os nematóides H. indica e

Steinernema sp. foram avaliados em associação

com subdosagens de inseticidas químicos quanto

a mortalidade de larvas e adultos de S. levis em con-

dições de laboratório (Tavares et al. 2009). Nos

testes com larvas, as combinações nematóide-

inseticida não proporcionaram nenhuma contribui-

ção para o incremento na mortalidade do inseto.

Porém, nos testes com adultos, ocorreu um efeito

de sinergismo para várias combinações entre os

nematóide e os inseticidas, principalmente para a

mistura Steinernema sp. (1 x 108 JI/ha) + thiametho-

xam 250 WG (250 g p.c./ha), com níveis de mor-

talidade de adultos acima de 70% (Figura 9). Os

nematóides H. indica e Steinernema sp. se reproduziram

dentro dos adultos de S. levis mortos nas diferentes

combinações nematóides-inseticidas (Figura 10), o

que destaca essa fase do inseto como importante fon-

te de inóculo para a reciclagem desses nematóides no

ambiente, principalmente em áreas tratadas com a

mistura de Steinernema sp. + thiamethoxam.

Figura 8. Larva de Sphenophorus levis infectada pelo

nematóide Heterorhabditis sp., dentro do rizoma da

cana-de-açúcar.

á

Finalmente, foi feito um teste de campo

procurando avaliar a eficiência desses nematóides

contra o bicudo da cana-de-açúcar, e o efeito da

associação desses agentes na dosagem de 1 x 108

JI/ha, com subdosagens do thiamethoxam 250

WG. O experimento foi instalado no início de

fevereiro de 2004, em período chuvoso, quando o

solo apresentava umidade favorável para ação

dos entomopatógenos. Os nematóideSteinernema sp.,

testados isoladamente, proporcionaram ganhos na

produção de 10 e 15 t/ha, s H. indica e respectivamente,

quando comparados a testemunha com rendimento

á

de 101 t/ha (Figura 6). O melhor tratamento foi a mistura do

nematóide Steinernema sp. com o inseticida na subdo-

sagem de 500 g p.c./ha, proporcionando um incre-

mento na produção de cana de até 28 t/ha.

Escarabeídeos: Diversas espécies de insetos da

família Scarabaeidae ocorrem na cultura da cana-

de-açúcar. São considerados de menor importância

que S. levis, no entanto, estão mais distribuídos

nos canaviais paulistas, podendo alcançar níveis de

infestação de até 76 insetos em uma área de 4 m2

por 0,3 m de profundidade.

Figura 9. Mortalidade de adultos de Sphenophorus levis tratados com os nematóides Heterorhabditis indica e

Steinernema sp. nas dosagens de 2,4; 12 e 60 JI/cm2, em diferentes combinações com subdosagens dos in-

seticidas fipronil 800 WG (62,5 g p.c./ha), e thiamethoxam 250 WG (250 g p.c./ha).

No mane-

jo inte-

grado

de besouros

escarabeídeos tem sido recomendado o uso de ne-

matóides entomopatogênicos como alternativa de

controle do inseto. Em teste de laboratório realiza-

do no Instituto Biológico os nematóides S. glaseri

(CCA), Heterorhabditis sp. (CB-n5) e S. carpocapsae

(CCA) foram avaliados contra larvas de escarabeí-

deos, na dosagem de 200 JI/inseto, proporcionan-

do mortalidades do inseto de 80,0%, 63,3% e

16,6%, respectivamente. O nematóide Heterorhabdi-

tis sp. (CB-n5) foi testado em campo de cana-de-

açúcar (cana-planta), proporcionando níveis de

controle das larvas de escarabeídeos de 67 e 89%

nas dosagens de 5 x 107 e 5 x 108 JI/ha, respectiva-

mente, em avaliação feita 52 dias após a aplicação.

Traça Opogona sacchari : A traça Opogona sac-

chari é uma praga de ampla distribuição geográfica

tendo sido constatada em várias culturas no estado

de São Paulo, incluindo cultivos do cogumelo shii-

take.

O cogumelo shiitake Lentinula edodes, é um fungo

aeróbico decompositor da madeira, tradicionalmente

cultivado em toras de carvalho em vários países e

no Brasil é cultivado em toras de Eucaliptus spp., arvo-

re abundante e de baixo custo. Para a produção do

shiitake, a umidade relativa deve ser elevada e as

toras inoculadas irrigadas diariamente, as quais são

geralmente mantidas sob módulos de sombrite.

Esta condição de umidade e penumbra favorece a

presença e proliferação da

Nas toras de eucalipto, as larvas da traça abri-

gam-se embaixo da casca, alimentando-se da mes-

ma e do micélio do fungo previamente inoculado,

comprometendo a produção. O controle químico

deste inseto é dificultado por este comportamento,

devido à barreira imposta pela camada suberina. Além dis-

so, o cogumelo shiitake é um produto comercializado

como orgânico ou de agricultura natural,

inviabilizando o uso de defensivos químicos

tradicionais.

Em contrapartida, nematóides entomopatogênicos

possuem grande potencial para o controle desse

inseto, pois apresentam comportamento de busca

do hospedeiro e locomovem-se facilmente em

ambientes crípticos, sendo bastante favorecidos

pelo ambiente de cultivo do cogumelo, com

sombreamento e alta umidade.

O IB desenvolveu algumas pesquisas nesse

assunto, tendo inicialmente comparado a eficiência

de 3 espécies de nematóides no controle desse

inseto em condições de telado (Leite et al. 2006).

Para isso os nematóides foram aplicados nas toras

de eucalipto, fixando em cada tora 4 larvas de G. mel-

lonella previamente infectadas com os nematóides

á

Figura 10. Juvenis infectivos do nematóide Steiner-

nema sp. emergindo do adulto de Sphenophorus levis

morto pela combinação nematóide-thiamethoxam.

á

Figura 11. Larvas vivas e mortas de Opogona sacchari em toras de eucaliptus tratadas com os nematóide Stei-nernema feltiae, S. glaseri e Heterorhabditis indica.

Figura 12. População de larvas de Opogona sacchari em toras de eucaliptus tratadas com 3 dosagens do nematóide Steinernema feltiae aplicado juntamente com larvas infectadas de Galleria mellonella.

para servirem como fonte de inoculo para a liberação

desses organismo no ambiente infestado com larvas

de O. sacchari. O nematóide S. feltiae foi o mais

eficiente com 74% de controle do inseto 20 dias

após a aplicação, seguido do H. indica com 50,5 %

e do S.glaseri com 32,7% (Figura 11).Em seguida, o

nematóide S. feltiae foi avaliado em diferentes dosagens

em condições de telado, variando-se o número

de larvas infectadas de G. mellonella por tora de

eucalipto. A dosagem de duas larvas infectad-

as/tora apresentou-se como a mais adequada, com

65,6% de controle 30 dias após a aplicação, não

diferenciando significativamente da maior dosagem

(70,5%) mas diferenciando menor (23,3%) (Figura

12).

Finalmente, foi realizado outro teste em telado

comparando-se dois métodos de aplicação de S.

feltiae sobre as toras de eucalipto: fixando 2

larvas de G. mellonella infectadas/tora e pulverizando

uma suspensão aquosa do nematóide em dosagem

equivalente a 2 larvas infectadas/tora (40.000 JI/-

tora). A pulverização apresentou-se como a forma

mais adequada para aplicação do nematóide, com

92,3% de controle já aos 20 dias da aplicação,

diferindo significativamente da fixação de larvas

infectadas com 51,2%. Aos 40 dias, os níveis de

á

Figura 13. População de larvas de Opogona sacchari em toras de eucaliptus tratadas o nematóide Steinernema

feltiae aplicado através de dois métodos diferentes: 1) fixando 2 larvas de Galleria mellonella infectadas /tora;

2) pulverizando o nematóide em dosagem equivalente a 2 larvas infectadas /tora.

infecção aumentaram alcançando 87,2% para a

aplicação com larvas infectadas e 99,4% para a

pulverização, não havendo diferença significativa

entre esses tratamentos (Figura 13).

Outros insetos pragas: Considerada como

praga de importância econômica para a cana-de-

açúcar, a broca-gigante (Castnia licus), vem causando

perdas significativas em canaviais nas regiões Norte e

Nordeste do Brasil. As larvas desse inseto

broqueiam o rizoma da planta, podendo causar a sua

morte. O comportamento desse inseto, atacando as

partes subterrâneas da planta, sugere a possibilidade

de uso de nematóides entomopatogênicos como

alternativa eficaz de controle. Em teste de laboratório

avaliando o nematóide Steinernema sp. (CB-n6) contra

larvas de C. licus, obteve-se 74% de mortalidade do

inseto.

O Instituto Biológico vem ainda colaborando

com a Universidade Federal da Grande Dourados,

Dourados, MT, com a Comissão Executiva do

Plano da Lavoura Cacaueira - CEPLAC, Ouro Preto

do Oeste, RO, e com várias outras instituições para

á

a avaliação de nematóides no controle do gorgulho

da goiaba Conotrachelus psidii, coleóbroca do fruto-do-

cacau, C. humeropictus, broca-da-coroa-foliar, E. cy-

parissiass, em cultivo de dendê, dentre outros inse-

tos.

Outros insetos vêm sendo alvos de estudos para

avaliação de nematóides entomopatogênicos,

apresentando-se, entretanto, pouco suscetíveis ou

vulneráveis para a ação desses agentes. Assim,

estudos vem sendo conduzidos visando avaliar a

patogenicidade de nematóides para a pérola-da-

terra, , importante praga de videira no Brasil, tendo

os resultados evidenciados alta resistência do estágio

de cisto amarelo, considerado como principal alvo

no controle da praga (Soria & Gallotti 1986, Gullan

& Kosztarab 1997, Foldi 1997; Hickel & Schimitt

1997; Schmidt, 2011).

Ainda, estudos realizados para avaliar a virulência

de nematóides entomopatogênicos para a mosca-das-

frutas, Ceratitis capitata, evidenciaram menor ou bai-

xa susceptibilidade da fase de pupa, principal alvo

no solo, comparado a fase de larva e pré-pupa do

O sucesso dos programas com nematóides

entomopatogênicos no Brasil vai depender de se

encontrar os nematóides adequados para cada

inseto alvo, que tenham boa persistência em condições

de campo; sejam virulentos e tenham comportamento

favorável à busca do hospedeiro; e proporcionem

bom rendimento na produção massal, quer seja “in

vivo” ou “in vitro”.

O mercado para uso de nematóides no Brasil é

imenso, existindo uma grande necessidade para

técnicas alternativas aos inseticidas químicos no

controle de pragas de solo. Nematóides entomopatogênicos

possuem grande potencial para o controle de

diversas pragas em diferentes culturas e ambientes,

incluindo cana-de-açúcar. Nessa cultura, nematóides

podem se constituir em uma importante alternativa

considerando o hábito subterrâneo da maioria dos

insetos pragas, e as condições bastante favoráveis e

estáveis oferecidas pela cultura, especialmente em á-

reas de colheita mecanizada, onde o solo permanece

coberto com palhada.

Isso tem motivado a formação de grupos de pesquisas

para atuação nesse campo de estudo no Brasil e,

conseqüentemente, promovido um grande avanço

nas pesquisas com nematóides entomopatogênicos,

principalmente nos últimos 10 anos.

á

Aguillera, M.M.; Smart, Jr. G.C. 1993. Devel-

opment, reproduction, and pathogenicity of Stein-

ernema scapterisci in monoxenic culture with differ-

ent species of bacteria. Journal of Invertebrate

Patholology, v.62, p.289-294.

Alves, S.B.; Ferraz, L.C.C.B.; Castello

Branco, Jr., A. 1998. Chaves para a identificação de

patógenos de insetos. In: ALVES, S.B. Coord.

Controle Microbiano de Insetos. Piracicaba:

FEALQ, p.1039-1074.

Arrigoni, E.B.; Dinardo-Miranda, L.L.; Con-

de, A.J.; Terán, F.O. 1986. Aplicação de Neoaplecta-

na carpocapsae em condições de campo para o con-

trole de Migdolus spp. Nematologia Brasileira, v.10

p.181-190,

Arruda, A.O.; Diniz, M.J.M.; Botelho,

P.S.M.; Leite, L.G. 2004. Patogenicidade do nema-

tóide Steinernema sp. contra larvas da broca gigante,

Castnia licus (Drury, 1773) (Lepidoptera, Castiniida-

e). In: CONGRESSO BRASILEIRO DE ENTO-

MOLOGIA, 20, Gramado/RS. Resumos, Socieda-

de Brasileira de Entomologia, p. 317.

Dolinski, C. 2005.Estudos com nematóides

entomopatogênicos na Universidade Estadual do

Norte Fluminense Darcy Ribeiro. In: CONGRES-

SO BRASILEIRO DE NEMATOLOGIA, 25,

Piracicaba. Anais, Sociedade Brasileira de Nemato-

logia, p.38-41.

Ferraz, L.C.C.B. 1986. Nematóides entomo-

patogênicos. In: Alves, S.B., Coord. Controle Mi-

crobiano de Insetos. São Paulo: Manole, p.210-

221.

Ferraz, L.C.C.B. 1998. Nematóides entomo-

patogênicos. In: Alves, S.B., Coord. Controle Mi-

crobiano de Insetos. Piracicaba: FEALQ, p.541-

570.

Ferraz, L.C.C.B.; Monteiro, A.R. 1987. Sobre

a ocorrência de mermitídeos parasitando insetos

no Brasil. Nematologia Brasileira, v.11, p.29-30.

Foldi, I. 1997. Defense strategies in scale in-

sects: Phylogenetic Inference and Evolutionary

Scenarios (Hemiptera, Coccoidea). In: Grandcolas,

P. (ed), The Origin of Biodiversity in Insects: Phy-

logenetic Tests of Evolutionary Scenarios. Mém.

Mus. Natn. Hist. Nat. 173, 203-230.

Folegatti, M.E.G.; Alves, S.B.; Kawai, P.C.;

Botelho, P.C.M. 1988. Nova metodologia para

produção in vivo de Neoaplectana carpocapsae. Nema-

tologia Brasileira, v.12, p.76-83.

Grewal, P.S.; de Nardo, E.A.B.; Aguillera,

M.M. 2001. Entomopathogenic nematodes: poten-

tial for exploration and use in South America.

Neotropical Entomology, v.30, n.2, p.191-205.

Gullan, P. J. & Kosztarab, M. 1997. Adapta-

tions in scale insects. Annu. Rev. Entomol. 42, 23-

50.

Haji, F. N. P., Lima, M. P. L., Alencar, J. A.,

Barbosa, F. R., Ferreira, R. C. F. & Mattos, M. A.

A. 2004. Cochonilha Pérola-da-Terra: Praga Emer-

gente na Cultura da Uva, no Submédio do Vale do

São Francisco. Circular Técnica – Embrapa Semi-

Árido. 78, 8.

Hickel, E. R. & Schimitt, A. T. 1997. Pros-

pecção do controle de pérola-da-terra, Eurhizococcus

brasiliensis (Hempel), com nematódeos entomopa-

togênicos, Steinernema carpocapsae Allp. 103-105. In

Reunião Sul- Brasileira sobre pragas de solo, 6. A-

nals and Ata. Santa Maria, UFSM.

Leite, L.G. 2006. Nematóides entomopatogê-

nicos. In: Batista Filho (Coord.), Controle Biológi-

co de Insetos e Ácaros. São Paulo, Instituto Bioló-

gico, p. 42-51 (Boletin Técnico n.15).

Leite, L.G.; Machado, L.A.; Ambrós, C.M.;

Tavares, F.M. 2006. O uso de nematóides entomo-

patogênicos no controle de pragas da cana-de-

açúcar. In: Pinto, A.S. (Org.), Controle de Pragas

da Cana-de-Açúcar. Sertãozinho, Biocontrol, p.53-

58 (Boletin Técnico, n.1).

Leite, L.G.; Machado, L.A.; Ginarte, C.M.A.;

Goulart, R.M.; Tavares, F.M.; Rodrigueiro, T.S.C.;

Bussola, R.A. 2005. Nematóides entomopatogêni-

cos: potencial de uso como bioinseticidas no Bra-

sil. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE NEMA-

TOLOGIA, 25, Piracicaba. Anais, Sociedade

Brasileira de Nematologia, p.45-48.

Leite, L.G.; Machado, L.A.; Goulart, R.M.;

Tavares, F.M.; Batista Filho, A. 2005. Screening of

entomopathogenic nematodes (Nemata: Rhabdi-

tida) and the efficiency of Heterorhabditis sp. against

the sugarcane root spittlebug Mahanarva fimbriolata

(Fabr.) (Hemiptera: Cercopidae). Neotropical En-

tomology, v.34, n.5, p.785-790.

Leite, L.G.; Tavares, F.M.; Ginarte, C.M.A.;

Carregari, L.C.; Batista Filho, A. 2006. Nematóides

entomopatogênicos no controle de pragas. In: Pin-

to, A.S.; Nava, D.E.; Rossi, M.M.; Malerbo-Souza,

D.T. (Orgs.), Controle Biológico de Pragas na Prá-

tica. Piracicaba, CP2, p.45-53.

Moino, Jr., A.; Furlong, J. 2005. Pesquisas

com nematóides entomopatogênicos no âmbito do

Estado de Minas Gerais: o estado da arte. In: CON-

GRESSO BRASILEIRO DE NEMATOLOGIA, 25,

Piracicaba. Anais, Sociedade Brasileira de Nemato-

logia, p.42-44.

á

Neves, P.J.; Alves, S.B.; Aguillera, M.M. 1998.

Produção de nematóides entomopatogênicos. In:

Alves, S.B., Coord. Controle Microbiano de Inse-

tos. Piracicaba: FEALQ, p.889-905.

Passos Jr., N.C.; Alves, S.B.; Silveira Neto, S.

1995. Patogenicidade de Steinernema carpocapsae, for-

mulação Exhibit, sobre diferentes castas de saúva-

limão, Atta sexdens rubropilosa. In: CONGRESSO

BRASILEIRO DE ENTOMOLOGIA, 15, Ca-

xambu. Resumos, Sociedade Brasileira de Entomo-

logia, p.342.

Passos, Jr., N.C.; Alves, S.B. 1995. Controle

de Heterotermes tenuis, cupim subterrâneo da cana de

açúcar, com Steinernema carpocapsae. In: SIMPÓSIO

INICIAÇÃO CIENTÍFICA CIÊNCIAS AGRÁ-

RIAS, 3, Piracicaba. Resumos, Universidade de São

Paulo, p.380.

Pizano, M.A.; Aguillera, M.M.; Monteiro, A-

.R.; Ferraz, L.C.C.B. 1985. Incidência de Neoaplecta-

na glaseri parasitando ovo de Migdolus fryanus. Ne-

matologia Brasileira, v.9 p.9-10.

Poinar, Jr., G.O. 1979. Nematodes for bio-

logical control of insects. Boca Raton: CRC Press,

277p.

Rohde, C.; Moino Jr., A.; Silva, M. A. T.; Car-

valho, F. D.; Ferreira, C. S. 2010. Influence of soil

temperature and moisture on the infectivity of en-

tomopathogenic nematodes (Rhabditida: Heteror-

habditidae, Steinernematidae) against larvae of

Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephriti-

dae). Neotropical Entomology, 39: 1-4.

Rosa, J.M.O.; Aguillera, M.M.; Wilcken,

S.R.S. 2003a Eficiência de Steinernema carpocapsae no

controle do percevejo castanho da raiz, Scaptocoris

castanea. Nematologia Brasileira, v.27, n.2, p.239

(resumo).

Rosa, J.M.O.; Aguillera, M.M.; Wilcken,

S.R.S. 2003b Suscetibilidade de Cornitermes cumulans

a Steinernema carpocapsae e S. glaseri em condições de

laboratório. Nematologia Brasileira, v.27, n.2,

p.239-240 (resumo).

Schmitt, A.T.; Gowen, S.R.; Hague, N.G.M.

1992. Baiting techniques for the control of Cos-

mopolites sordidus by Steinernema carpocapsae. Nematro-

pica, v.22 n.2 p.159-163.

Silva1, A.C.; Batista Filho1, A.; Leite, L.G.;

Tavares, F.M.; Raga, A.; Schmidt, F.S. 2010. Efeito

de Nematoides Entomopatogênicos na Mortalida-

de da Mosca-do- Mediterrâneo, Ceratitis capitata, e

do Gorgulho-da-goiaba, Conotrachelus psidii. Nema-

tologia Brasileira, 34(1): 31-40.

Soria, S. J. & Gallotti, B. J. 1986. O margaro-

des da videira Eurhizococcus brasiliensis (Homoptera:

Margarodidae): biologia, ecologia e controle no Sul

do Brasil. Circular Técnica – Embrapa CNPUV.

13, 22.

Tavares, F.M.; Batista Filho, A.; Leite, L.G.;

Almeida, L.C.; Goulart, T.M. 2009. Efeitos Sinérgi-

cos de Combinações entre Nematóides Entomo-

patogênicos (Nemata: Rhabditida) e Inseticidas

Químicos na Mortalidade de Sphenophorus levis

(Vaurie) (Coleoptera: Curculionidae). BioAssay,

v.4, p. 1-10.

Tavares, F.M.; Batista Filho, A.; Leite, L.G.;

Almeida, L.C.; Silva, A.C.; Ambrós, C.M.G. 2007.

Efeito de Heterorhabditis indica e Steinernema sp.

(Nemata: Rhabditida) sobre Larvas do Bicudo da

Cana-de-Açúcar, Sphenophorus levis (Coleoptera:

Curculionidae), em Laboratório e Casa-de-

Vegetação. Nematologia Brasileira, v.31, p. 12-19.

Vivan, L.M. 2005. Avaliação de nematóides

entomopatogênicos para o controle de Scaptocoris

castanea Perty (Hemiptera: Cydnidae). In: SIMPÓ-

SIO DE CONTROLE BIOLÓGICO, 9, Recife.

Resumos, Sociedade Brasileira de Entomologia,

p.118.

Wouts, W.M.; Mrácek, S.; Gerdin, S.; Bed-

ding, R.A. 1982. Neoaplectana Steiner, 1929 - a jun-

ior synonim of Steinernema Travassos, 1927. Sys-

tematic Parasitology, 4: 147-154.

á

á

á

á

con compuestos naturales y las civilizaciones griega y romana utilizaban una variedad de fumigantes, acei-

tes y arsénico como insecticidas. Entre los siglos XVI y XVII surgió la era de los compuestos naturales

como la nicotina y el óxido de mercurio, mientras que el éxito de los pesticidas sintéticos tuvo lugar en

1939 cuando Paul Muller descubrió el DDT (difenildiclorotrietano), compuesto usado en sus inicios para

combatir los mosquitos causantes de la propagación de la malaria y posteriormente en los cultivos agríco-

las. A esto siguió la fabricación de compuestos organofosforados y organoclorados con mayor potencial

destructivo, algunos de los cuales se encuentran todavía en uso (Pretty y Hine, 2005).

La finalidad del uso de pesticidas es eliminar plagas interfiriendo con algunos procesos bioquímicos

y fisiológicos vitales. Las diferencias entre los pesticidas son básicamente su persistencia en el ambiente,

toxicidad y sobre todo el espectro que tienen para actuar contra especies sensibles a ellos; sin embargo su

uso causa inevitablemente daños en menor o mayor medida (Bro-Rassmunsen, 1996). Los efectos del uso

Cuerpo Académico de Biotecnología Agroalimentaria. Instituto de Ciencias Agropecuarias. Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo, México. E-mail: norberto@uaeh.edu.mx

Producción de nematodos entomopatógenos por métodos in vitro

Introducción

Norberto Chavarría Hernández, Gabriela Maciel Vergara y Adriana Inés Rodríguez Hernández

Contenido del Capítulo

Introducción Control Biológico Nematodos como agentes de control biológico

Producción masiva de nematodos entomopatógenos

Un Método para producir nematodos entomopatógenos

Referencias Bibliográficas

Desde la antigüedad la agricultura ha sido la base de la humanidad,

pero fue hasta los años 1900‟s que comenzó a constituirse como una acti-

vidad industrial con la introducción de mecanizaciones y nuevas técnicas

en las labores de cultivo. Paralelamente a este hecho, surgió el uso de sus-

tancias químicas en práctica agrícolas, incluyendo específicamente el uso

de pesticidas químicos (Harwood, 1990) “justificándose” esto por razones

como las siguientes: a) los rendimientos en los cultivos eran mayores, b)

la eliminación de plagas era rápida y poco costosa, y c) controlaban agen-

tes que causaban enfermedades infecciosas que posteriormente podían

convertirse en epidemias (Ecobichon, 2001). Estas ventajas hicieron que

su uso se intensificara sin una evaluación de las consecuencias y riesgos a

futuro.

El uso de pesticidas se remonta a tiempos anteriores a la era cristia-

na con los sumerios (2500 A. de C.) quienes utilizaban compuestos sulfu-

rados para el control de insectos, los granjeros chinos trataban las semillas

á

millones de libras (Cuadro 1). Los pesticidas utili-

zados se concentran solamente en algunos cultivos

de frutas y vegetales, arroz, maíz, algodón, trigo,

cebada y soya, siendo los países industrializados los

mayores consumidores, aunque la demanda crece

también en los países en desarrollo, con algunas

desventajas como:

baja tecnificación para la aplicación de quí-

micos, falta de información sobre el uso correcto y

riesgos, y sobre todo el uso ilegal o bien el uso de

productos que actualmente están prohibidos.

De ahí que cada vez son más frecuentes los

reportes sobre trabajadores intoxicados por la ex-

posición a productos químicos en países donde

aún no hay una regulación adecuada para el uso de

de pesticidas quí-

micos no tienen la

misma intensidad

en todos los eco-

sistemas y se pre-

sentan de diversas

formas:

alterando las

cadenas tróficas

debido a la muerte

de uno o más or-

ganismos que son

fuente de alimento

para otros.

generando

daños al ambiente

(i.e. dañando la

capa de ozono,

contaminando los

mantos acuíferos,

la lluvia, el aire y el suelo entre otros) provocando

enfermedades debido a su acumulación en los teji-

dos adiposos de animales.

Este último punto ha sido motivo de estu-

dios recientes por las evidencias encontradas de

efectos secundarios que causa la acumulación, que

varían desde ligeras molestias hasta la muerte por

intoxicación, cáncer o deficiencias en los sistemas y

tejidos. Paradójicamente, la demanda y uso de pes-

ticidas a nivel mundial en los últimos cincuenta

años se incrementó en gran medida con ventas de

hasta 25 mil millones de dólares anuales en lo que

va de este siglo (Pretty y Hine, 2005). De entre

éstos, los herbicidas acumularon 36% de las ven-

tas, mientras que los insecticidas y funguicidas sólo

el 25% y 10% respectivamente de un total de 5,351

Tabla 1. Uso de Pesticidas (ingredientes activos) en EUA y a nivel mundial (Kiely et al., 2004)

Mundial EUA

Tipo

Millones kg

(ingredientes acti-

vos)

%

Millones kg

(ingredientes acti-

vos)

%

Relación de % utilizado en

EUA y % utilizado a nivel

mundial

2010

Herbicidas (1) 883 36% 542 44% 28%

Insecticidas 615 25% 122 10% 9%

Fungicidas 234.264 10% 74 6% 14%

Otros (2) 697 29% 496 40% 32%

Total 2,429 100% 1,234 100% 23%

Año 2001

Herbicidas (1) 849 37% 553 46% 30%

Insecticidas 559 24% 105 9% 9%

Fungicidas 215.65 9% 73 6% 15%

Otros (2) 667 29% 472 39% 32%

Total 2,291 100% 1,203 100% 24%

(1) "Herbicidas" incluye herbicidas y reguladores de crecimiento.

(2) "Otros" incluye nematicidas, fumigantes, rodenticidas, molusquicidas, pesticidas para peces y aves y algu-

nos otros pesticidas convencionales además de químicos como azufre y petróleo, en ocasiones utilizados co-

mo pesticidas.

áó ó

pesticidas químicos (Ecobichon, 2001).

En México, la situación no es muy

distinta a la del resto del mundo, puesto que

según datos de la Asociación Mexicana de la

Industria de Plaguicidas y Fertilizantes

(AMIPFAC), en 1995 el monto de plaguici-

das utilizados fue de 54,678.96 Ton, de las

cuales una parte sustancial correspondió a

insecticidas y herbicidas con 47% y 29%

respectivamente (Figura 1). Los cultivos en que se

utilizaron las cantidades mayores de estos produc-

tos fueron en maíz, hortalizas, caña y algodón

(SNIARN, 2008).

Si bien es cierto que después de 1950 se in-

crementó el uso de pesticidas en el mundo y en

general no había una conciencia sobre los daños

causados por su uso, cabe aclarar que algunos años

antes ya se tenía la idea de desarrollar una “nueva”

agricultura con prácticas que aseguraran cierta esta-

bilidad, lo cual dio lugar al término “agricultura

sustentable” que fue usado por primera vez en la

década de 1980‟s bajo dos principios clave:

La disminución del uso de pesticidas quími-

cos y la concepción de la agricultura como un pro-

ceso biológico y un sistema integral donde el ma-

nejo debería ser responsable.

Debido a que dentro de la idea de sustentabi-

lidad el suelo es considerado como un sistema vi-

vo, se desarrollaron algunas prácticas agrícolas con

enfoque en la dinámica poblacional para el manejo

de la compleja interacción huésped-plaga-predador

evitando la alteración del ecosistema. Así se creó

un nuevo concepto que determinó las prácticas

para el control de plagas basadas en la interacción

ecológica: el manejo integral de plagas (MIP). El

MIP es un conjunto de estrategias que reúne facto-

res económicos, ecológicos, culturales y biológicos

donde los productos químicos solamente son utili-

zados como último recurso, evitando al máximo el

daño al ambiente. Dentro del MIP, además de las

prácticas culturales como la rotación de cultivos y

la planeación de la siembra-cosecha, existen otras

estrategias que resultan eficientes como el llamado

control biológico de plagas (Harwood, 1990).

Control Biológico Una de las definiciones tradicionales del con-

trol biológico es “la manipulación de parásitos,

predadores y patógenos para mantener las pobla-

ciones plaga en niveles donde no haya un daño

económico” (Harwood, 1990), sin embargo los

avances biotecnológicos de los últimos años han

permitido la inclusión de nuevos términos, por lo

cual existen otras definiciones como la de Gnana-

manickam et al (2002): “el uso de organismos natu-

rales o modificados, genes o productos genéticos

para reducir los efectos de organismos indeseables

y favorecer a organismos deseables como insectos

benéficos y algunos microorganismos”. Muy rela-

cionada con la definición anterior, es la dictada por

Figura 1. Volumen de pesticidas usados en México en 1995

(SNIARN, 2008)

á

la Oficina de Asesoría Tecnológica del Congreso

Estadounidense en 1995, la cual hace referencia a

las “tecnologías basadas en la biotecnología para el

control de plagas” (BBT‟s por sus siglas en

inglés), las cuales comprenden el uso de predado-

res, patógenos, feromonas, derivados naturales de

plantas, reguladores del crecimiento en insectos e

insectos estériles como agentes de control biológi-

co (Hagler, 2000). Aunque los inicios del control

biológico datan de varios siglos atrás, la era moder-

na comenzó en 1888 cuando se importaron enemi-

gos naturales del insecto causante del algodoncillo

desde Australia hasta California, en la mayor pérdi-

da económica reportada en la industria de los cítri-

cos causada por una plaga. Desde entonces, el con-

trol biológico ha sido utilizado algunas veces con

éxito y otras veces sin él, en diferentes cultivos y

contra diversas plagas en donde factores como las

condiciones climáticas, la adaptación de los enemi-

gos naturales al ecosistema (si son introducidos), el

estado del cultivo, la afinidad plaga-predador y el

tipo de control biológico aplicado tienen influencia

directa en los resultados que se obtienen. En Méxi-

co, éste comenzó en 1940 y se dio con la introduc-

ción de enemigos naturales para combatir plagas

como la escama algodonosa de los cítricos, la esca-

Tabla 2. Características y ejemplos de los agentes de control biológico según Hagler (2000)

Característica Predador Parasitoide Patógeno Pesticida Quí-

mico (PQ)

Espectro contra plaga Moderado Reducido Reducido Amplio

Disponibilidad comercial Baja Baja Media Alta

Vida de anaquel Corta (días) Corta (días)

Corta / Modera-

da Larga (Años)

Costo Alto Alto Medio Bajo

Aplicación Difícil Difícil Fácil Fácil

Efectividad Baja Baja / moderada Baja / moderada Alta

Compatibilidad con PQ Baja Baja Alta -

Impacto ambiental Bajo Bajo Bajo Muy alto

Resistencia por parte de la

plaga Nula Nula Bajo Alta

Ejemplo

Orden Coleoptera Diptera

DDT

Familia Carabidae Phoridae Enterobacteriaceae

Nombre común/científico

escarabajo de

tierra/

Scarabaeidae sp.

Bt/Bacillus thurin-

giensis

Presa

orugas, hueveci-

llos de insecto e

insectos de

cuerpo suave

hormigas, termitas,

catarinas, moscas,

etc.

larvas de insectos

pertenecientes al

orden Lepidoptera

todo tipo de

insectos e inclu-

so algunas es-

pecies de peces

y aves

áó ó

ma purpúrea, las moscas de la fruta y el pulgón

manchado de la alfalfa, ente otras (Barrera, 2002).

Tipos de Control Biológico

Existen tres tipos de control biológico: con-

servativo, introductivo y aumentativo. El primero

favorece la preservación del ambiente para que los

enemigos naturales presentes puedan actuar como

agentes de control biológico (ACB). Algunas es-

trategias empleadas en este tipo de control son el

establecimiento de cultivos “refugio” (extensiones

pequeñas de cultivo donde no se esparcen pestici-

das químicos), la provisión de alimento y la dismi-

nución del uso de pesticidas químicos de amplio

espectro. El control introductivo se denomina

también “control biológico clásico”, puesto que

se introduce accidental o intencionalmente un

ACB foráneo a un área nueva, donde éste se desa-

rrolla y controla a la plaga existente en el lugar.

Son muchas las desventajas que algunos críticos

encuentran en este tipo de control, puesto que

además de que se altera el ecosistema original,

existe la posibilidad de efectos letales en organis-

mos benéficos y sobre todo la amenaza de que el

organismo introducido pueda convertirse en plaga

por no tener enemigos naturales en el lugar donde

se usa. Todo esto puede suceder si no se estudia

con detalle la dinámica que se utilizará a la hora

de aplicar el control. A pesar de ello, también

existen algunas ventajas que permiten que actual-

mente todavía esté en uso este tipo de estrategia.

El tercer tipo de control es el aumentativo,

que consiste en la “liberación” de ACB estudiados

y producidos masivamente en laboratorio para la

supresión de la plaga. Es equivalente a la utiliza-

ción de productos químicos, pero sin dañar al am-

biente y puede realizarse por inoculación o bien

por inundación. La inoculación se vale solo de

pequeñas cantidades del ACB, que sobreviven y

se mantienen gracias a la presencia del insecto pla-

ga al cual eliminan gradualmente; mientras que en

el método por inundación, se aplican grandes can-

tidades de ACB para asegurar el exterminio casi

inmediato de la plaga, aun cuando el ACB no per-

dure por mucho tiempo en el cultivo (Hagler,

2000).

Agentes de Control Biológico

Existen varias clasificaciones de los enemi-

gos naturales, sin embargo una conveniente es la

propuesta por Hagler (2000) de acuerdo al modo

de acción sobre la plaga y algunas otras caracterís-

ticas en su desempeño como ACB (Cuadro 2).

Los predadores y los parasitoides son agentes ma-

crobiológicos mientras que los patógenos se con-

sideran agentes microbiológicos. Recientemente,

un cuarto grupo ha sido añadido y en él se inclu-

yen los agentes parabiológicos de control como

son las hormonas, los insectos estériles y los regu-

ladores de crecimiento. Entre los patógenos se

encuentran varios agentes de control biológico

que actualmente están disponibles en el mercado,

estos agentes son aplicados con el equipo conven-

cional para la aplicación de pesticidas químicos o

bien en los sistemas de irrigación y su disponibili-

dad comercial se debe en gran parte a la facilidad

de producirlos en laboratorio y a su inocuidad con

relación al ambiente y a otros organismos benéfi-

cos. Las desventajas de estos ACB son: a) su espe-

cificidad para infectar ciertas plagas y la resisten-

cia de éstas después de una aplicación prolongada,

b) corta vida de anaquel y en el campo, y c) sobre

todo las dificultades para su regulación como pro-

ductos pesticidas. Es por ello que las investigacio-

á

Nematodos como agentes de control biológico

para que su uso dentro del manejo integral de pla-

gas sea más intensivo.

nes hoy en día se desarrollan para maximizar el

desempeño general de estos agentes y sobre todo

Existen siete familias de nematodos con po-

tencial biocontrolador: Mermitidae, Tetradonematidae,

Allantonematidae, Phaenopsitylenchidae, Sphaerularidae,

Steinernematidae y Heterorhabditidae; sin embargo, sólo

las dos últimas se han estudiado con más detalle

(Lacey et al., 2001) y se han producido comercial-

mente alcanzando ventas de hasta 10 millones USD

(en 1998) (Samish y Glazer, 2001). Los nemátodos

entomopatógenos (NEP) pertenecientes a los géne-

ros Steinernema y Heterorhabditis poseen receptores

químicos para la búsqueda de insectos huésped y se

encuentran asociados simbióticamente con entero-

bacterias, Xenorhabdus sp. para Steinernema y Photor-

habdus luminiscens para Heterorhabditis. Los NEP son

gusanos redondos no segmentados con sistema res-

piratorio, reproductor y digestivo, además son pató-

genos obligados en la naturaleza y han sido utiliza-

dos para controlar un amplio número de insectos

plaga (Cuadro 3; Figura 2) mediante inundación en

el control aumentativo.

Cabe mencionar que la eficacia de los NEP ha

sido comprobada en plagas cuyo estado larvario se

desarrolla en la tierra (principalmente especies de

los géneros Lepidoptera y Coleoptera), aun cuando

también se han utilizado en plagas cuya ovoposición

y/o estado larvario se desarrollan en troncos o en

las hojas de los árboles (Schroer y Ehlers, 2005). El

usarlos como agentes de control biológico no repre-

senta riesgo para los vertebrados, insectos benéficos

y en general para el medio ambiente; pueden produ-

cirse in vivo e in vitro y son aplicados fácilmente con

equipo convencional, buscan a su presa y la matan

rápidamente (en un lapso entre 24 y 48 h), pueden

Tabla 3. Plagas susceptibles al biocontrol mediante NEP.

Familia Nombre científico Agrocultivo País

Especie

NEP

Referencias

Lepidoptera

Pyralidae Tryporyza incertulas Arroz India Sc Kaya et al., 2006

Noctuidae Spodoptera depravata Césped Japón Sg, Sc Kaya et al., 2006

Glyphipteridae Sagalassa valida Palma Colombia Sc Kaya et al., 2006

Coleoptera

Curculionidae Aristobia testudo Litchi China Sc Kaya et al., 2006

Cosmopolites sordidus Plátano Brasil Sc Kaya et al., 2006

Scarabaeidae Epicometis hirta

Vid y otros

frutos Turquía Hb Hazir et al., 2004

Diptera

Sciaride Lycoriella mali Setas Corea Sc, Hb Kaya et al., 2006

Sc = Steinernema carpocapsae, Sg = Steinernema glaseri, Hb = Heterorhabditis bacteriophora

áó ó

reciclarse en el ambiente y son compatibles

con algunos productos químicos y otros

pesticidas biológicos, además de que están

exentos de registro como pesticidas en algu-

nos países (Shapiro-Ilan y Gaugler, 2002;

Hazir et al., 2004; Shapiro-Ilan et al., 2006).

En contraparte, las razones por las que su

uso todavía no tiene gran impacto son: a) su

reducido rango de acción contra los insec-

tos, b) la poca tolerancia a condiciones es-

tresantes de humedad, radiación y tempera-

tura, c) corta vida de anaquel, y d) la dife-

rencia de su precio con relación a los pro-

ductos químicos.

Ciclo de vida de los NEP

Tanto los steinernemátidos como los

heterorhabdítidos tienen un ciclo de vida que inclu-

ye huevo, cuatro etapas juveniles (J1 a J4) y una fase

adulta. Bajo ciertas condiciones, la fase J3 se con-

vierte en infectivo juvenil (IJ), única fase que sobre-

vive fuera del insecto huésped y puede mantenerse

en búsqueda de un nuevo insecto, al cual penetra a

través de sus aberturas naturales (boca, ano, espirá-

culos) liberando la bacteria simbionte, quien infecta

los tejidos del insecto y éste muere por septicemia

en las siguientes 24 a 48 h. Los IJ se alimentan de

los tejidos del insecto colonizados por la bacteria y

se convierten en adultos de primera generación,

mismos que posterior a la fertilización dan lugar a

huevos que se desarrollan a nematodos J1 y así su-

cesivamente hasta otra generación de adultos. Este

ciclo ocurre hasta que los nutrimentos se agotan,

momento en el que los IJ de nueva

inducción comienzan a emerger del

cadáver para continuar buscando

otros huéspedes (Figura 3) (Neves et

al., 2001; Chavarría-Hernández y de

la Torre, 2001; Serwe-Rodriguez et

al., 2004). Esta sucesión de estadios

también se puede observar en culti-

vos in vitro, ya sea sólidos o líquidos,

donde el ciclo puede comenzar con

la inoculación de IJ en un medio

previamente inoculado e incubado

con la respectiva bacteria simbionte.

Figura 2. Insectos plaga susceptibles al control biológico

usando NEP. A) Hypera postica Gyllenahl, B) Phyllophaga, C)

Icerya purchasi, D) Noctuidae.

Figura 3. Ciclo de vida de Steinernema sp.

á

La diferencia en-

tre steinernemá-

tidos y heteror-

habdítidos es su

modo de repro-

ducción, ya que

mientras los

adultos de los

primeros son

machos y hem-

bras en todas las

generaciones con

capacidad de

producir proge-

nie, los adultos

heterorhabdíti-

dos de la primera

generación son hermafroditas y los adultos de las

generaciones subsecuentes son anfimíticos, pero

incapaces de reproducirse (Ehlers y Shapiro-Ilan,

2005). Con relación a la bacteria simbionte, aun

cuando Xenorhabdus y Photorhabdus tienen diferen-

cias entre sí como su localización dentro del nema-

todo IJ (Figura 4), el mecanismo mediante el cual

son liberadas dentro del insecto huésped y la pro-

piedad de bioluminiscencia, exhiben similitudes en

algunas características ya que ambas pertenecen a

la familia Enterobacteriaceae, son móviles (poseen

flagelos perítricos), Gram-negativas, aerobias facul-

tativas y no forman esporas. Sin embargo, las dos

características más importantes que tienen en

común, son a) la variación fenotípica y b) la pro-

ducción de inclusiones proteínicas cristalinas.

La relación entre los NEP y su bacteria sim-

bionte es esencialmente mutualista y puede ser di-

vidida en tres fases (Ciche et al., 2006):

Forética. Fase en la que tanto la bacteria co-

mo el nematodo se encuentran fuera del huésped;

es decir, el nematodo se encuentra en busca de ali-

mento y al mismo tiempo sirve como vector a la

bacteria y como su protección contra el medio am-

biente. No existen reportes de que la bacteria haya

sido encontrada en forma libre, sino solamente en

el intestino de los IJ y en insectos huésped que han

sido infectados por NEP. El mecanismo de coloni-

zación del intestino de las fases IJ por la bacteria es

aún poco conocido, sin embargo existen dos teor-

ías acerca de ello; la primera es que debido a un

agotamiento en las fuentes de nutrimentos, los J2

disminuyen su función digestiva y por lo tanto en

lugar de digerir a la bacteria, la retienen dentro. La

segunda teoría se basa en la afinidad de los IJ por

su bacteria simbionte y esto sucede porque si la

bacteria presente en el insecto huésped no es la

simbionte especifica del nematodo, éste no la retie-

ne.

Patógena. En esta fase, el complejo nemato-

do-bacteria es directamente responsable de la

muerte del insecto huésped, que es infectado debi-

do a la introducción de la bacteria, llevada a cabo

por los IJ. Una vez dentro, la bacteria invade y

afecta el sistema inmunológico del insecto, que en

condiciones naturales impediría la acción de agen-

tes externos por procesos como melanización o

encapsulación (Hazir et al., 2004), mientras que el

nematodo también contribuye inhibiendo los me-

canismos enzimáticos del insecto plaga para reco-

nocer a sus invasores, de ahí que la relación nema-

todo-bacteria sea mutualista porque ambos orga-

nismos necesitan uno del otro para sobrevivir.

Saprófita. Sucede una vez que el insecto ha

muerto; la bacteria y el nematodo se alimentan de

Figura 4. Localización de la

vesícula bacterial en la parte an-

terior del intestino de Steinerne-

ma spp. (vista lateral). En el ca-

so de Heterorhabditis spp., la bac-

teria se encuentra dispersa en

todo el tracto gastrointestinal

(Ehlers y Shapiro-Ilan, 2005)

áó ó

Actualmente existen tres métodos para la

producción masiva de NEP: in vivo, in vitro sólido e

in vitro líquido los cuales se explican brevemente a

continuación.

Cultivo In vivo

En este método, insectos huésped son inocu-

lados con fases IJ, las cuales se desarrollan y com-

pletan su ciclo de vida durante dos a tres genera-

ciones, después de unos días, cuando los nuevos IJ

comienzan a dejar el cadáver, se procede a las ope-

raciones de cosecha, sanitización, formulación y

almacenamiento de los mismos. La cosecha se rea-

liza en dispositivos denominados “trampa de Whi-

te” que constan de una caja Petri donde existe una

zona elevada (i.e., vidrio de reloj invertido) cubierta

por papel filtro y rodeada por agua (Woodring y

Kaya, 1988; Hazir et al., 2004). Una vez infectadas,

las larvas se colocan en el papel filtro y cuando los

IJ emergen se dirigen hacia el agua donde son co-

sechados fácilmente evitando contaminaciones.

Los IJ así cosechados pueden pasar a una etapa de

concentración para eliminar el agua excedente y

posteriormente ser sanitizados con distintas solu-

ciones comerciales, la concentración puede hacerse

mediante sedimentación y posterior decantación o

bien mediante centrifugación (Shapiro-Ilan y Gau-

gler, 2002). La formulación implica procedimientos

que permiten a los NEP reducir su actividad me-

tabólica y entrar en un estado de deshidratación

(anhidrobiosis parcial) debido a la baja humedad

relativa de los agentes inertes usados como el

carbón activado, vermiculita, alginatos, caolín y

poliacrilamida. Estos agentes propician un menor

costo en el almacenamiento y transporte del pro-

ducto, un mejor manejo y mayor vida de anaquel.

Los NEP también pueden formularse en solucio-

nes acuosas pero esto no es muy conveniente por-

que deben mantenerse en refrigeración y con agita-

ción moderada, además de que hay un mayor ries-

go de contaminación. En la actualidad, se pueden

formular en gránulos dispersables en agua (WDG,

por sus siglas en inglés), método que presenta las

mismas ventajas de los agentes inertes en cuanto a

costo y facilidad de operación y además asegura

una mayor vida de anaquel. Para optimizar el pro-

ceso de producción in vivo de NEP, hace algunos

años se propuso un sistema denominado LOTEK

construido con bandejas y repisas. No obstante

que se requiere de poca experiencia para el método

Producción Masiva de Nematodos Entomopatogenos

los tejidos del hospedero. La bacteria entra en un

estado estacionario de crecimiento y el nematodo

desarrolla su ciclo de vida. Diversos estudios se

han realizado ya que aparentemente la diferencia-

ción sexual y el proceso de fertilización y liberación

de los huevos tienen que ver con la concentración

de bacteria y nutrientes en esta fase de la relación

nematodo-bacteria (por lo menos en Heterorhabdi-

tis). Aquí también ocurre la migración de los IJ fue-

ra del cadáver una vez que se han agotado las fuen-

tes de nutrientes.

Las fases mencionadas anteriormente tam-

bién tienen lugar cuando se cultiva a los NEP en

medios artificiales, donde la recuperación e induc-

ción de los IJ se debe aparentemente a señalizacio-

nes químicas que la bacteria simbionte produce en

el medio (Johnigk y Ehlers., 1999).

á

in vivo, las desventajas son el costo de los hospede-

ros y el equipo, cuya inversión no es fácil de recu-

perar a partir de las ganancias obtenidas, además

la concentración final de IJ en un cultivo in vivo,

depende de factores como el tamaño del insecto

huésped, el tamaño del inóculo de IJ, la forma en

que son inoculados (en suspensión acuosa o in-

cluidos en la comida del insecto huésped) y la afi-

nidad con el huésped, así como condiciones de

humedad y temperatura (Shapiro-Ilan y Gaugler,

2002). Los IJ obtenidos por este método pueden

aplicarse dentro del cadáver del insecto huésped,

colocándolo en los cultivos y protegiendo así a los

NEP del medio ambiente mientras encuentran

un nuevo huésped.

Cultivo Sólido in vitro

Inicialmente el cultivo sólido se desarrolló

axénicamente (i.e., cultivo puro de nematodos) sin

embargo, se encontró que la inclusión de la bacte-

ria simbionte en el cultivo se traducía en mejores

resultados. Los primeros cultivos sólidos se desa-

rrollaron en cajas Petri con medios con sangre de

becerro, alimento para perro y extracto de riñón

porcino entre otros ingredientes. En este sistema

bidimensional se inoculaban fases IJ sanitizadas.

Actualmente este procedimiento sigue utilizándo-

se. En 1960, Bedding diseñó un sistema tridimen-

sional para la producción de NEP que actualmen-

te se utiliza en algunas empresas pequeñas, donde

el medio líquido se esteriliza junto con placas de

espuma de poliuretano como agente inerte en ma-

traces, bolsas de plástico o recipientes de vidrio,

suministrándoles aire mediante bombeo o bien

empleando un dispositivo permeable al aire que

evita la convección forzada de aire. En este méto-

do, también se inocula la bacteria y después de

Tabla 4. Compañías productoras de nematodos entomopatógenos en

Estados Unidos de América y la Comunidad Europea (Kaya et al.,

2006)

Compañía Especie a Formulación Mercado

Andermatt Bio-

control, Grossdiet-

wil, Suiza

Sc, Sf, Hm Barro

Invernadero,

jardinería

doméstica

Asa Jung Labora-

tory, Oakland,

California, EUA

Sc, Sf Barro Variado

BioLogic Willow

Hill, Pennsylvania,

EUA

Suspensión,

gránulos disper-

sables en agua,

esponja

Variado

Bionema, Umea,

Suecia Sc, Sf Polímero

Jardinería

doméstica

Becker Under-

wood Ames, Iowa,

EUA

Sc, Sf,

Sg,Sk, Ss,

Hm

Spray, gránulos

dispersables en

agua

Invernadero,

hongos comesti-

bles

Certis b Columbia,

Maryland, EUA Sc, Sf, Sr

Suspensión,

gránulos dis-

persable en agua

Variado

e-nema GmbH,

Raisdorf, Alemania Sc, Sf, Hb Barro, polímero

Invernadero,

vivero, hongos

comestibles y

jardinería

doméstica Hydrogardens,

Colorado Springs,

Colorado, EUA

Sc, H sp Esponja Invernadero

Integrated Biocon-

trol, Greendale,

Indiana, EUA

Hb, Hi-

,Hmar Pasta, esponja Cítricos, césped

Koppert, Berkel en

Rodenrijs, Sf, Hb Barro

Invernadero,

césped

M & R Durango,

BayWeld, Colora-

do, EUA

Sc, Sf, Hb Esponja Variado

Nematec, San Ra-

mon, California,

EUA

Hb “Wool nematode” N/A c

Owiplant, Owijska,

K/Poznania, Polo-

nia

Barro

Invernadero,

hongos comesti-

bles a Sc, Steinernema carpocapsae; Sf, S. feltiae; Sg, S. glaseri; Sk, S. kraussei; Sr,

S. riobrave; Ss, S. scapterisci; Hb, Heterorhabditis bacteriophora;Hi, H. indica;

Hm, H. megidis; Hmar, H. marelatus; H sp., Heterorhabditis species.

b En 2005, Certis vendió el área productora de nematodos a Becker

Underwood.

c N/A, No disponible

áó ó

algunas horas de incubación se inoculan los IJ. La

recuperación del producto se realiza “lavando” la

espuma de poliuretano hasta que todos los IJ

hayan migrado o bien por centrifugación, la cual, al

igual que en el cultivo in vivo, incrementa el costo

del producto. Las desventajas de este método son

que el escalamiento afecta directamente el desarro-

llo de los cultivos, ya que se dificulta la medición

en línea de parámetros como el pH y el oxígeno

disuelto a la vez que el muestreo no es representa-

tivo debido a la poca uniformidad en la distribu-

ción de los NEP (Ehlers y Shapiro-Ilan, 2005).

Cultivo líquido in vitro

El cultivo en medio líquido ha sido hasta

ahora la forma más conveniente para la produc-

ción de NEP a gran escala, llevada a cabo comer-

cialmente en la actualidad por compañías en Esta-

dos Unidos de América y algunos países de la Co-

munidad Europea, principalmente (Cuadro 4). En

México, existen pocas compañías productoras de

NEP como agentes de control biológico y los

métodos que utilizan para producirlos son confi-

denciales (Cuadro 5).

Al igual que en el cultivo sólido, el cultivo

líquido se desarrolló inicialmente de forma axénica

en matraces y posteriormente de forma monoxéni-

ca, al cultivar ambos organismos juntos. El primer

experimento con biorreactor se patentó en Estados

Unidos de América por Pace et al. (1986) y desde

entonces, diversos trabajos se han desarrollado pa-

ra la mejor adaptación del cultivo líquido de NEP

en biorreactores. Este proceso no resulta tan senci-

llo como lo es el cultivo in vivo, ya que dentro del

biorreactor los NEP se encuentran en un medio

junto con burbujas y partículas, inmersos en un

proceso de mezclado que se relaciona directamente

con su desarrollo, alimentación y cópula, cuya fi-

nalidad es obtener la mayor concentración de fases

IJ. Uno de los factores que afectan el cultivo líqui-

do es la viscosidad del medio, por lo que algunos

de los retos más importantes en este sistema son a)

proveer suficiente oxígeno para ambos microorga-

nismos sin dañarlos, b) evitar al máximo el estrés

hidrodinámico, c) reducir la espuma generada por

la agitación y/o aireación, y d) incrementar la

Tabla 5. Instituciones públicas y privadas productoras de nematodos entomopatógenos para el control

de insectos plaga en México reportadas en 1999 (Taméz-Guerra et al., 2001)

Entidad Fe-

derativa Compañía Especie a

Sinaloa Biosol S.A. de C.V. (Culiacán, Sinaloa) Sf

Agrobiosol de México S.A. de C.V (Culiacán, Sinaloa) Sc

D.F. Koppert de México S.A de C.V (México, DF) Sf

Chiapas Laboratorio de producción de OB, CIICA (Chiapas) Sg, Sf

a Sf= Steinernema feltiae, Sc=Steinernema carpocapsae, Sg= Steinernema glaseri

á

cópula (para el caso específico de Steinernema spp.)

Estos problemas se han minimizado mediante el

diseño y mejora de los biorreactores utilizados,

además de la investigación detallada sobre el ciclo

de vida de los NEP en cultivo líquido (Shapiro-

Ilan y Gaugler, 2002). Durante el cultivo líquido,

que puede durar desde dos hasta cuatro semanas,

es imprescindible mantener condiciones de riguro-

sa asepsia ya que cualquier contaminación puede

ser catastrófica para el proceso. Tanto la composi-

ción del medio como la cantidad de bacteria pre-

sente son factores que influyen en el cultivo líqui-

do. Se han usado diversos medios de producción

que incluyen una fuente de carbono (i.e., glicerol o

glucosa), proteínas animales o vegetales, extracto

de levadura y una fuente de grasas.

Entre los diferentes ingredientes usados para

la formulación de medios se encuentran harina de

soya, yema de huevo, leche en polvo, extracto de

hígado, aceite de maíz, aceite de canola y manteca,

y más recientemente algunos ingredientes no con-

vencionales como lactosuero y aguamiel, entre

otros (Pace et al., 1986; Friedman et al., 1991; Islas-

López et al., 2005; Espino-García, 2005). El tipo y

cantidad de la fuente lipídica utilizada parece ser un

componente clave en el desarrollo y virulencia de

los NEP, por lo que un incremento en la concen-

tración de este componente se relaciona con un

mayor rendimiento, probablemente debido a la ne-

cesidad nutrimental de esteroles en los NEP (Abu-

Hatab y Gaugler, 2001; Yoo y Gaugler, 2000).

Existen reportes de que Steinernema no es capaz de

desarrollarse en medios sin lípidos, mientras que

en el caso de Heterorhabditis, su bacteria simbionte

es capaz de proveerle todos los nutrimentos. En

general se recomienda la adición de lípidos en cual-

quier cultivo de NEP (sea sólido o líquido).

Por otra parte, la cantidad del inóculo tanto

Figura 5. Variables implicadas en el cultivo monoxénico líquido de NEP.

áó ó

bacteriano como de fases IJ puede ser variable. Pa-

ra las especies de Heterorhabditis, el inóculo de ne-

matodos es alto debido a que únicamente los adul-

tos hermafroditas de primera generación son los

que procrean a los individuos que al final del culti-

vo serán IJ, mientras que los adultos unisexuales

no producen progenie, al menos en cultivo líquido.

Entre los parámetros que favorecen al cultivo

líquido de los NEP están el pH, la concentración

de CO2, la temperatura y la agitación/aireación,

aun cuando no se ha logrado la total comprensión

de la interacción de estos parámetros para la ob-

tención de cultivos líquidos exitosos (Figura 5).

El pH inicial del medio varía entre 5.5 y 7

pero algunos autores recomiendan ajustarlo a 8.

Una vez que se inicia el cultivo es perjudicial tratar

de ajustar el pH, puesto que la bacteria es capaz de

mantenerlo superior a 7 hasta que finalice el culti-

vo (un valor de pH inferior a 6.5 puede ser dañino

para los nematodos). El pH puede variar con la

concentración de dióxido de carbono, y aunque

este efecto no se ha reportado porque la medición

de CO2 disuelto no es frecuente durante los culti-

vos, se ha encontrado que a mayores concentracio-

nes de este gas al inicio del cultivo monoxénico, se

incrementa el porcentaje de recuperación de las

fases IJ (Gaugler y Han, 2000). La temperatura de

incubación de la bacteria se hace entre los 28 y 30°

C y el desarrollo del cultivo monoxénico, entre los

22 y 25°C.

Cultivo de NEP en biorreactor

Los biorreactores utilizados para este fin, son

los convencionalmente usados en la industria o

bien con algunas modificaciones o rediseño para

un mejor desarrollo del cultivo, bajo esfuerzo de

corte y sobre todo para un suministro adecuado de

oxígeno; la agitación y aireación son de suma im-

portancia y junto con la geometría del biorreactor

determinan la disponibilidad de los nutrientes y

oxígeno para ambos microorganismos así como las

condiciones para la cópula y desarrollo de los

NEP. En steinernemátidos, la cópula se realiza, si

el macho que es de menor tamaño que la hembra

se enrolla alrededor de ella y este evento determi-

na, junto con otros factores ya mencionados, el

rendimiento final del cultivo. Aunque la agitación

con impulsores de paletas o propelas, provee un

mezclado eficiente para procesos en la industria

química o en cultivos de células bacterias y hongos,

se ha reportado que en el cultivo de NEP las hem-

bras pueden sufrir ruptura mecánica si la velocidad

en la punta del impulsor excede de 1 m s-1 (Pace et

al., 1986). Para la velocidad de aireación, se han

probado diferentes condiciones que van desde 0.05

volúmenes de aire volumen de medio minuto

(vvm) hasta 1 vvm en reactores de diferentes tama-

ños, buscando que al momento de la inoculación

de fases IJ la concentración de oxígeno sea al me-

nos del 20% de saturación. Una aireación excesiva

a menudo provoca gran producción de espuma, lo

cual puede controlarse adicionando antiespuman-

tes convenientes.

Autores como Pace et al. (1986) y Ehlers

(2001) han reportado concentraciones desde

23,000 hasta 95,000 IJ/mL (Cuadro 6) en reactores

agitados mecánicamente, sin embargo debido a los

esfuerzos cortantes imperantes en estos sistemas,

se ha optado por usar reactores con agitación

neumática, principalmente de los llamados Air-lift.

La Figura 6 muestra algunos de los diferentes tipos

de reactores Air-lift utilizados para el cultivo mo-

noxénico de NEP. Las concentraciones logradas

á

este último caso (Ehlers y Shapiro-Ilan, 2005) no

se menciona el tipo de agitación ni la concentra-

ción inicial de nemátodos empleada.

con estos sistemas van desde 40,000 hasta más de

200,000 IJ/mL para Steinernema carpocapsae mientras

que para Heterorhabditis indica se han alcanzado con-

centraciones de 500,000 IJ/mL; sin embargo, en

Algunos Aspectos de Ingeniería Básica

de Reactores Air-Lift

Las columnas de burbujeo o reactores Air-lift,

patentados por Lefrancois, Mariller y Mejane en

1955, son un diseño alternativo a los tanques con

agitación mecánica, los cuales se han usado duran-

te años en diferentes procesos industriales (Znád et

al., 2004). Los Air-lift no incluyen partes móviles y

la alimentación de aire se hace desde la base de una

columna delgada que constituye el “cuerpo” del

tanque, algunas veces se utiliza una sección cónica

en la parte superior de esta columna, que incre-

menta el área de intercambio del gas. En estos re-

actores, los sensores se colocan en a) la tapa, b) en

donde termina la sección cónica, o c) en un anillo

situado en la parte inferior del tanque (Allman,

1999). Los Air-lift involucran cuatro zonas durante

su operación: en la zona de ascenso o “riser”, tiene

lugar la mayor cantidad de transferencia de masa

gas-líquido y es donde el líquido aireado fluye en el

mismo sentido de la inyección del gas. Al término

de esta zona, se encuentra la zona de desacelera-

ción o separador de gas, porque es aquí donde el

gas sube y sale por el venteo del tanque mientras

que el líquido, ya sin burbujas de gas o con baja

concentración de éstas, fluye a contracorriente del

gas por la zona de descenso o “downcomer”, para

ser aireado nuevamente en la zona inferior (Znád et

Figura 6. Distintos diseños de reactores Air-lift utilizados para la producción de NEP a nivel laboratorio.

Los reactores i) a iii) (VL=0.5 L) han sido reportados por Neves et al. (2001), mientras que iv) se trabajó a

VL=4.4 L y probando dos

áó óC

uad

ro 6

. R

end

imie

nto

s de

nem

áto

do

s en

tom

op

ató

gen

os

ob

ten

ido

s en

cult

ivo

s líq

uid

os

en b

iorr

eact

ore

s c

on

dis

tin

to t

ipo

de

agit

ació

n

Co

nc.

fin

al

(CF; IJ

/ m

L)

Dura

ció

n d

el

pro

ceso

(d

ías)

Vo

l. d

e

op

erac

ión

(L

)

Esp

ecie

de

nem

áto

do

usa

da

Co

nc.

in

icia

l

(C0; IJ

/m

L)

Fac

tor

de

rep

roducc

ión

(FR

=C

T/

C0)

Tip

o d

e

Agi

taci

ón

Imp

uls

or

usa

-

do

/ti

po

de

reci

r-

cula

ció

n

Ref

eren

cia

40,0

00

10

8

S. fe

ltia

e 2,0

00

20

Mec

ánic

a P

rop

ela

mar

ina

Pac

e et

al.,

1986

110,0

00

12

16

S. ca

rpoc

apsa

e

- -

Mec

ánic

a -

Fri

edm

an e

t al

., 1991

60,0

00

15

0.5

S. ca

rpoc

apsa

e 500

120

Neu

mát

ica

Rec

ircu

laci

ón

exte

rna

Nev

es e

t al

., 2001

97,5

00

15

-

S. ca

rpoc

apsa

e 500

195

Neu

mát

ica

Rec

ircu

laci

ón

exte

rna*

M

ota

y N

eves

, 2005

193,4

06

20

4

S. ca

rpoc

apsa

e 750

332

Neu

mát

ica

Rec

ircu

laci

ón

inte

rna

San

juan

-Gal

indo

, 2006

- 25

10

H. m

egid

is

3000

- M

ecán

ica

Turb

ina

kap

pla

n^

E

hle

rs e

t al

., 1998

120,0

00

32

20

H. ba

cter

ioph

ora

5000

24

Neu

mát

ica

Co

lum

na

de

bur-

buje

o

Surr

ey y

Dav

ies,

1996

500,0

00

-

H

. ba

cter

ioph

ora

-

-

-

-

Eh

lers

y S

hap

iro

-Ila

n,

2005

* S

e uti

lizó

un

rea

cto

r co

n r

ecir

cula

ció

n e

xter

na

per

o c

on

un

a m

odif

icac

ión

en

el do

wnc

omer

^

Se

uti

lizó

un

cili

nd

ro p

ara

imp

lem

enta

r la

rec

ircu

laci

ón

in

tern

a

-

Dat

os

no

rep

ort

ado

s

á

al. 2004). Estos sistemas se han utilizado en el tra-

tamiento de aguas residuales, en la producción de

biomateriales y en fermentaciones de células sensi-

bles al estrés hidrodinámico. Las ventajas de su uso

son el bajo consumo de energía, facilidad de cons-

trucción, operación y mantenimiento, permiten

conservar condiciones asépticas por largo tiempo y

las características hidrodinámicas imperantes pue-

den modificarse en función de cambios en su geo-

metría (i.e., tipo de recirculación, tipo del draft, ac-

cesorios adicionales, modo de operación, tipo del

difusor, etc.).

Algunos de los parámetros que describen

tanto la hidrodinámica como el funcionamiento de

los reactores tipo Air-lift son el hold-up (i.e., frac-

ción de retención de gas), la velocidad del líquido

en cada zona del reactor y el coeficiente volumétri-

co de transferencia de oxígeno (kLa) (Wen et al.,

2005), los cuales se explican a continuación.

Hold up (fracción de retención de gas). Es el

aumento del volumen en la fase líquida en proceso

a causa de la inyección de gas, introducción de un

sólido o ambas; este parámetro es de suma impor-

tancia para el diseño del reactor ya que determina

la altura del mismo y consecuentemente el máximo

volumen de trabajo, así como el tiempo de residen-

cia del gas en el líquido, que en combinación con el

tamaño de burbuja, determina el área interfacial

gas-líquido disponible para la transferencia de ma-

sa. El valor del hold up, varía en las distintas zonas

del reactor como consecuencia del proceso de

mezclado donde tienen lugar la ruptura y coales-

cencia de las burbujas. El hold up puede determi-

narse por varios métodos (los más comunes son

expansión de volumen y conductancia) y tanto en

la fase sólida como en la líquida o ambas. En la

literatura se han reportado algunas correlaciones

para determinar el hold up total en un reactor Air-

lift, entre ellas la de Molina-Grima et al. (1997):

Donde,

εg = Hold up total

Ar = Área sección transversal del riser

εgr = Hold up en el riser

Ad = Área sección transversal del downcomer

εgd = Hold up en el downcomer

Velocidad del líquido: Determina el tiempo

de mezclado (i.e., lapso de tiempo que transcurre

hasta que las condiciones en el reactor se vuelvan

estables a partir de un cambio en la alimentación),

reflejado en variables de respuesta como son pH,

temperatura, coloración y conductancia. Una vez

medida experimentalmente la velocidad del líquido

y obtenido el valor del hold up, es posible calcular

la velocidad superficial del líquido, la cual a su vez

permite determinar la pérdida de energía por fric-

ción del medio con las paredes mediante la Ecua-

ción 2 (Molina-Grima et al., 1997):

Donde,

Ef = Pérdida de energía por fricción

Cr = factor de fricción

hD = altura de la dispersión

Ar = Área sección transversal del riser

ULr =Velocidad superficial del líquido

Ugr = Velocidad superficial del gas

dr = diámetro del riser

dr

gddgrr

gAA

AA

(1)

)()(2 rLr

r

grLrLr AUd

hDUUCrUEf

(2)

áó ó

El factor de fricción Cr se puede deducir a

partir de la ecuación de Blasius (Ecuación 3 para

downcomer y riser; Ecuación 4, para riser sola-

mente) (Wen et al., 2005; Molina-Grima et al.,

1997):

Donde el número de Reynolds está definido como:

Donde,

i = cada una de las zonas del reactor (i.e. riser,

downcomer)

ρHi,, ρL= densidad promedio del líquido (kg/m3)

VLi, ULr= velocidad del líquido en cada una de las

zonas i del reactor (m/s)

Di, dr= diámetro en cada una de las zonas i del re-

actor (m)

μHi, μL= viscosidad promedio (Pa s)

El número de Reynolds es la relación entre

las fuerzas de inercia y las fuerzas viscosas

(Ecuaciones 6 y 7), por lo que expresa la magnitud

de los factores que favorecen el flujo de un fluido y

de aquellos que se oponen a éste (Mataix, 1982).

Por lo tanto:

Así, valores altos de Re indican que la visco-

sidad no es un factor limitante, mientras que valo-

res pequeños indican lo contrario. Por otra parte,

este parámetro puede utilizarse como criterio para

el escalamiento de procesos donde la viscosidad

juega un papel determinante en las transferencias

de masa, oxígeno y/o momento.

Coeficiente volumétrico de transferencia

de masa (kLa). Es quizá el parámetro más impor-

tante en una fermentación aerobia (sin importar el

tipo de aireación), puesto que determina la capaci-

dad del sistema para transferir oxígeno a los micro-

organismos (Quintero, 1990). La Ecuación 8 des-

cribe el flux de transferencia de oxígeno en proce-

sos de este tipo.

Donde,

Na = Flux de transferencia de O2

kL = Coeficiente de transferencia de O2 en la fase

líquida

a = área interfacial por unidad de volumen

C* = Concentración de saturación de O2

CL = Concentración de O2 en el seno del líquido

El kLa puede variar durante el transcurso de

cada fermentación y puede ser determinado experi-

mentalmente por diferentes métodos: a) método

dinámico, b) oxidación de sulfito, y c) consumo

biológico del oxígeno. Específicamente hablando

del kLa en reactores Air-lift, Znád et al. (2004) pro-

pusieron la Ecuación 9 para calcular el coeficiente

global de transferencia de oxígeno.

25.0Re0791.0

HiCr

Hi

iLiHi

Hi

DV

Re

(3)

(4)

(5)

25.0

))--1(0792.0

Lsrgr

rLrLdU

Cr

LL

idadvis

inercia

cos (6)

(7)

LRe

)( *

LL CCakNa

á

Donde,

PG = Potencia debida a la aeración

VL = Volumen de trabajo del reactor

ρL = densidad del líquido

g = aceleración de la gravedad

Los tres parámetros hidrodinámicos anterior-

mente descritos, están directamente relacionados

con las condiciones de operación, la geometría del

reactor y con las propiedades fisicoquímicas del

medio líquido, de las cuales, la viscosidad es una de

las más importantes. Ésta última es la propiedad

física de los fluidos de “resistirse a fluir” (Bird et

al., 1987) y constituye la constante de proporciona-

lidad µ entre el esfuerzo unitario cortante y la va-

riación de la velocidad de cizalla en las capas de un

fluido (Ecuación 11)

La Ecuación 11 (ecuación de Newton para la

viscosidad) es generalizada y se cumple en los flui-

dos donde el esfuerzo cortante es proporcional al

gradiente de velocidad; sin embargo, existen flui-

dos en donde la relación esfuerzo cortante–

gradiente de velocidad no es proporcional por lo

cual se denominan no Newtonianos (Figura 7).

La mayoría de los fluidos líquidos utilizados

industrialmente son no Newtonianos y los caldos

de fermentación incubados en biorreactores no

son la excepción, además de que la viscosidad de

éstos a menudo es importante y cambia con el

tiempo debido a las complejas reacciones bioquí-

micas que tienen lugar durante estos procesos

(López y López et al., 2000). Por otra parte, la reo-

logía -„„ciencia que estudia el flujo y la

deformación‟‟- se encarga de estudiar a los fluidos

no Newtonianos, entre otros sistemas, de manera

tal que es posible inferir cuál es el comportamiento

de estos fluidos bajo diversas condiciones de pro-

ceso, ajustando los datos obtenidos en pruebas ex-

perimentales a modelos reológicos que relacionen

las variables involucradas (i.e. velocidad de cizalla,

esfuerzo de corte). Uno de los modelos más usa-

dos para describir el comportamiento de los flui-

dos no Newtonianos es el de Ostwald de Waele o

Ley de la Potencia (Ecuación 12) ya que es sencillo

(9) 925.0

41027.1

L

G

LV

Pxak

)/(1 rd

grL

L

G

AA

gU

V

P

(10)

dy

d

(11)

Figura 7. Curvas de flujo típicas de algunos mate-

riales.

. γ

áó ó

días hasta el momento de su utilización. Se estrían

cajas de NBTA con suspensión de NEP para des-

cartar presencia de microorganismos contaminan-

tes.

Bacteria simbionte. La bacteria simbionte se ais-

la fragmentando fases IJ de Steinernema spp. recién

recuperadas de trampa de White, en 10 mL de me-

dio STB (Caldo de soya tripticaseina) previa saniti-

zación superficial con hipoclorito de sodio al 7%.

Esto se hace por duplicado en cajas Petri (D=5

cm) las cuales se incuban a 28°C, y después de 48

h, se estrían cajas de NBTA (Agar Azul de Bromo-

timol - Cloruro de Trifeniltetrazolio) que se incu-

ban a 28°C durante 48 h más. Posteriormente se

selecciona una colonia aislada de color azul que es

Un Método para Producir NEP Mediante Cultivo Sumergido en Biorreactor Air-lift

y se aplica tanto en análisis teóricos como en cálcu-

los de ingeniería aun cuando solamente describe la

zona lineal del comportamiento reológico, motivo

por el cual es necesario manejar con cautela las ex-

trapolaciones que puedan hacerse del ajuste con

este modelo (Barnes et al., 1999).

Donde,

Donde,

η= viscosidad

K=índice de consistencia

n=índice de comportamiento al flujo

= cizalla

1

n

K

Reología en caldos de fermentación para la

producción de NEP

Referente al cultivo de NEP, poco se ha in-

vestigado con respecto a condiciones hidrodinámi-

cas, parámetros reológicos y viscosidad en los cal-

dos de fermentación involucrados. Sin embargo,

algunos autores han evaluado el comportamiento

reológico del cultivo monoxénico en matraz agita-

do y en biorreactor Air-lift (Chavarría-Hernández et

al., 2003; Sanjuan-Galindo, 2006) usando precisa-

mente el modelo de Ostwald de Waele. La deter-

minación de la viscosidad y su evolución en siste-

mas biológicos es muy importante porque afecta

directamente las condiciones hidrodinámicas y de

oxigenación imperantes en el reactor. Por lo tanto,

la viscosidad es un parámetro que debe considerar-

se durante el diseño de procesos y la elección de

las condiciones de operación para lograr producti-

vidades convenientes.

(12)

Materiales y método sugeridos.

Especímenes

NEP. Fases IJ de Steinernema spp. se propa-

gan en cultivo in vivo, usando larvas de Galleria

mellonella o en cultivo in vitro líquido (medio de

producción para NEP, MA-10) a nivel frasco agita-

do orbitalmente. Los IJ obtenidos, se lavan y sani-

tizan con solución 0.2 % v/v Thimerosal para lue-

go enjuagarse 3 veces con agua destilada estéril.

Las fases IJ así sanitizadas se mantienen en suspen-

sión acuosa (200,000 IJ/mL) en botellas para culti-

vo de tejidos (Área=90 cm2, VT=250 mL y VL=30

mL) con tapa permeable al aire a temperatura am-

biente y agitación de 80 rpm durante 2 h cada 8

á

inoculada en 75 mL de medio STB (matraz Erlen-

meyer, VT=0.5 L) que se incuba a 30°C y 150 rpm

en una incubadora con agitación orbital (SEV-

INO 650V, México) durante 30 h. Transcurrido

este tiempo y luego de verificar que el pH del culti-

vo bacteriano es entre 8 y 9, se agrega 25% v/v

glicerol estéril para preparar viales de conservación

(1.5 mL) acondicionados posteriormente a su pre-

paración con 1 h de refrigeración a -4°C, seguida

de 1 h en congelación a -18°C para luego mante-

nerlos en ultracongelación a -80°C, manteniéndo-

los así hasta su uso (previa verificación de que la

bacteria se encuentra en fase I).

Medios de Cultivo

STB (Medio de producción bacteriano)

(Buecher y Propiel, 1989). 3% p/v caldo de

soya tripticasa y 0.5% p/v extracto de levadura.

pH de 7.

Agar NBTA (Medio selectivo y diferencial

para bacteria simbionte) (Akhurst, 1980). 2.3%

p/v agar nutritivo, 0.0375 % p/v azul de bro-

motimol y 0.004 % v/v TTC (cloruro de trife-

nil tetrazolio). pH de 8.5.

MA-10 (Medio de producción para los ne-

matodos). 10% v/v aguamiel estéril, 2% v/v

aceite de maíz, 1% p/v yema de huevo des-

hidratada, 0.5% p/v NaCl, 1% de extracto de

levadura. Incluye 0.3 mL de antiespumante A

[100% base silicón] (SIGMA-Aldrich) por cada

litro de medio. pH de 7.5.

NOTA: Todos los medios se preparan con

agua desionizada, el pH de se ajusta con 40%

p/p hidróxido de sodio y se esterilizan a 15

lbf/in2 durante 15 min en autoclave, con ex-

cepción del medio MA-10 para el cultivo en

biorreactor.

Fermentadores

Se utilizan dos configuraciones de reactor Air

-lift con recirculación interna: un MTB (Modular

Tower Bioreactor 3.4 L - Applikon, The Nether-

lands) acoplado a la consola ADI 1030 y controla-

dor ADI 1031 de la misma marca, y un reactor Air

-lift con tubo draft liso (Sanjuan-Galindo, 2006)

(SEV, México) que se identificarán como Reactor

A y Reactor S, respectivamente. El aspecto, dimen-

siones y geometría de cada reactor se muestran en

la Figura 8 y Cuadro 7. El volumen de trabajo de

ambos biorreactores es el mismo, siendo las dife-

rencias principales, la forma del tanque y la presen-

Figura 8. i) Reactor S (SEV, México); ii) Filtro y humidi-

ficador de aire; iii) sedimentador de acero inoxidable aco-

plado a la tapa del reactor A; iv) Reactor A acoplado a

consola ADI 1031 y controlador ADI 1030 (Applikon,

The Netherlands ).

áó ó

cia de un sedimenta-

dor de acero inoxida-

ble en el reactor A,

que tiene la finalidad

de disminuir la veloci-

dad de flujo en el co-

mienzo de la zona de

descenso (i.e., downco-

mer).

Cultivo monoxénico

en biorreactor con

agitación neumática.

Inóculo bacteriano

Un volumen de

420 mL de medio STB

(Matraz Erlenmeyer

VT=2 L) se inocula con

un vial de conservación

de X. nematophila y se

incuba a 30°C durante

48 h. Se verifica el pH

cercano a 8 y se estrían

muestras en NBTA.

Los electrodos de pH y

temperatura se insertan

en los reactores así como

el puerto para toma de

muestra y electrodo de

oxígeno. Se conectan a

cada reactor, previa este-

rilización (40 min a 15 lbf/in2), un filtro de aire acceso-

rio relleno de algodón (construido con una botella de

vidrio con diámetro y volumen variables) y en la salida

de un filtro PTFE (d=4.5 cm, corte de 0.2 μm) unido a

un humidificador (d=15 cm, VT=3.8 L con 3 L de agua

desionizada), así como una trampa de gases en el venteo

(salida del tanque) (Figura 9). Cada biorreactor se esteri-

liza in situ, suministrando vapor a 13-15 lbf/in2 durante

50 min al tanque completo y 20 min a cada entrada-

salida haciendo las conexiones necesarias (i.e., filtros de

aire -humidificador, botella con MA-10, etc.).

Cuadro 7. Medidas principales de los reactores A y S utilizados para la producción de NEP.

Representación Magnitud

Reactor A Reactor S

Volumen total de trabajo VT 4.2 L 4.2 L

Radio interno mayor del reactor Rcolumna 6.5 cm 5.5 cm

Radio interno menor de reactor rcolumna 3.125 cm 4.75 cm

Longitud axial máxima de operación Hcolumna 54 cm 51 cm

Área transversal máxima del reactor Acolumna 132.73 cm2 95.03 cm2

Área transversal de la corona 1 en la zona

del downcomer

ADWN(1) 109.83 cm2 71.27 cm2

Área transversal de la corona 2 en la zona

del downcomer

aDWN(2) 15.47 cm2 47.12 cm2

Separación del tubo draft con la base del

fermentador

hbottom 2.0 cm 2.0 cm

Radio interno del tubo draft rint draft 2.58 cm 2.5 cm

Radio interno del sedimentador [a] rint [a] 5.0 cm -

Radio interno del sedimentador [b] rint [b] 6.5 cm -

Grosor de pared en tubo draft y sedimen-

tador

epared 0.2 cm 0.25 cm

Área transversal interna del tubo draft

(zona de ascenso, riser)

aint draft 12.56 cm2 19.63 cm2

Área transversal interna del sedimentador

[a] (zona de ascenso, riser)

a int [a] 33.18 cm2 -

Área transversal interna del sedimentador

[b] (zona de ascenso, riser)

a int [b] 19.63 cm2 -

Longitud del tubo draft hdraft 33.3 cm 27.5 cm

Volumen en el interior del tubo draft V int draft 693.53 cm3 579.23 cm3

Diámetro del difusor d difusor 4.0 cm 2.5 cm

Capacidad de suministro de aire del com-

presor

Q 1-10 lpm 1-10 lpm

Sistema de enfriamiento Chaqueta Chaqueta

á

Cultivo monoxénico

Un volumen de 3.8 L de

MA-10 se esteriliza para cada

reactor en botellas de vidrio

(d=20 mm y VT=9.7 L) a 15

lbf/in2 durante 40 min. Una vez

que baja la temperatura de los

reactores, se llena la chaqueta

de enfriamiento y se bombea el

medio de producción MA-10

estéril a cada tanque. Se man-

tienen con una aireación de 2

vvm durante 18 h, tiempo al

cual se bombea el inóculo bac-

teriano (previamente calibrado

el electrodo de O2 disuelto), en

una proporción del 10% del to-

tal de volumen de trabajo. Se

ajusta la temperatura de trabajo

a 30°C, misma que se mantiene durante 48 h con

una aireación de 1.5 vvm en cada fermentación

realizada. Una vez cumplidas las 48 h, se inoculan

fases IJ de NEP a los reactores para alcanzar una

concentración aproximada de 1000 IJ/mL, cam-

biándose la temperatura a 23°C con un régimen de

aireación variable (1 a 1.5 vvm) hasta el término

del proceso.

Muestreo durante el cultivo

El muestreo durante el cultivo se hace cada

2 d involucrándose los siguientes volúmenes de

caldo de fermentación extraídos de los biorreacto-

res:

Purga, 10 mL

Conteo de NEP, 10 mL

Determinaciones reológicas, 30 mL (cada 4 d)

En cada muestreo se estría una placa de

NBTA para revisar el estado de la bacteria y se fo-

tografían los diferentes estadios de desarrollo de

los NEP en un microscopio de campo claro

(Eclipse 80i, Nikkon, Japan) con una cámara digi-

tal. Cuando se hace reometría, NEP se fotografían

antes y después del cizallamiento en el reómetro.

Conteo de NEP viables

De los 10 mL de caldo de fermentación des-

tinados al conteo de NEP, se toman alícuotas de

100 µL y se hacen diluciones hasta 10-3

(dependiendo de la concentración total de NEP en

el reactor) usando agua desionizada de forma que

se puedan contar los NEP bajo el microscopio

usando magnificaciones de 40× a 400×. El recuen-

to se hace por triplicado.

Determinaciones reológicas

Figura 9. Esquema de filtrado y alimentación de aire en los biorreacto-

res Air-lift, así como ubicación del puerto para toma de muestra y elec-

trodos. Clave: C=compresor de aire, FP=filtro PTFE 0.2 µm, F=filtro

de algodón, H=humidificador, Tm (A, S)=toma-muestra en el Reactor

A o S respectivamente, TG=trampa de gases y E= electrodos.

áó ó

Muestras de 30 mL de caldo de fermentación

son cizalladas en un reómetro de esfuerzo contro-

lado (AR-2000; TA Instruments, USA) usando la

geometría de paletas o “vane rotor” en un interva-

lo de velocidad de cizalla de 50 s–1 a 600 s–1 y vice-

versa con una etapa de pre-cizallamiento con la

finalidad de suspender las partículas del medio y

por supuesto, los nematodos, así como descartar

posible dependencia de las propiedades reológicas

con el tiempo. Todas las muestras son cizalladas a

25°C durante 37 min, obteniéndose las curvas de

flujo correspondientes.

Referencias Bibliográficas Abu-Hatab M, Gaugler R. 2001. Diet com-

position and lipids of in vitro-produced Heteror-

habditis bacteriophora. Biol Cont 20: 1-7.

Akurst RJ. 1980. Morphological and func-

tionaldimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria

symbiotically associated with the insect pathogenic

nematodes Neoaplectana and Heterorhabditis. J

Gen Microbiol 121:303-309

Allman JR. 1999. Fermentors: design, opera-

tion and applications. En: Al-Mansi EM, Bryce CF

(editores). Fermentation microbiology and bio-

technology. Reino Unido: Francis & Taylor.

Barnes H, Hutton J, Walters K. 1999. An

introduction to rheology. Elsevier.

Barrera JF. 2002. Introducción, filosofía y

alcance del control biológico. En R.Báez y J.J. Ju-

vera (editores). Memorias del XIII Curso Nacional

de Control Biológico. México.

Bird R, Stewart W, Lightfood E. 1987. Fenó-

menos de transporte. México. Repla Ediciones.

Bro-Rassmunsen F.1996. Contamination by

persistent chemicals in food chain and human

health. Sci Total Environ 188: S45-60.

Buecher E, Propiel I. 1989. Liquid Culture

of the entomogenous nematode Steinernema

feltiae with its bacterial symbiont. J Nematol 21:

500-504

Chavarría-Hernández N, de la Torre M.

2001. Population growth kinetics of the entomopa-

thogenic nematode, Steinernema feltiae, in sub-

merged monoxenic culture. Biotechnol Lett 23:

311-315

Chavarría-Hernández N, Rodríguez-

Hernández AI, Pérez-Guevara , de la Torre M.

2003. Evolution of culture broth rheological prop-

erties during propagation of the entomopathogenic

nematode Steinernema carpocapsae, in submerged

monoxenic culture. Biotechol Prog 19:405-409

Ciche TA, Darby G, Ehlers RU, Forst S,

Goodrich-Blair H. 2006. Dangerous liaisons: The

simbiosis of entomopathogenic nematodes and

bacteria. Biol Control 38: 22-46

Ecobichon D. 2001. Pesticide use in devel-

oping countries. Toxicol 160: 27-33.

Ehlers RU, Lunau S, Krasomil-Oesterfeld K,

Oesterfeld KH. 1998. Liquid culture of the ento-

mopathogenic nematode-bacterium complex Het-

erorhabditis megidis/Photorhabdus luminiscens.

Biocontrol 3:77-86

Ehlers RU, Shapiro-Ilan DS. 2005. Mass

production. En: Parwinder GS, Ehlers RU,

Shapiro Ilan DS (editores) Nematodes as biocon-

trol Agents. Reino Unido. CABI

Ehlers RU, Stoessel S, Wyss U. 1990. The

á

influence of phase variants of Xenorhabdus spp.

and Escherichia coli (Enterobacteriaceae) on the

propagation of entomopathogenic nematodes of

the genera Steinernema and Heterorhabditis. Rev

Nématol 13: 417-424.

Ehlers RU. 2001. Mini- Review: Mass Pro-

duction of entomopathogenic nematodes for plant

protection. Appl Microbiol Biotechnol 56: 623-633

Espino-García J. 2005.Propagación del ento-

mopatógeno Steinernema carpocapsae en cultivo

monoxénico sumergido usando un medio comple-

jo formulado con lactosuero. Tesis de Maestría.

UAEH. México.

Friedman MJ, Langston SE, Pollit S. 1991.

Mass production in liquid culture of insect-killing

nematodes. U.S. Patent 5023183

Gaugler R, Han RC. 2000. Production Tech-

nology. En: Gaugler, R. (editor). Entomopatho-

genic nematology. EUA. CABI

Gnanamanickam SS, Vasudevan P, Reddy

MS, Kloepper JW, Défago G.SS. 2002. Principles

of biological control. En: Gnanamanickam SS

(editor). Biological control of crop diseases. USA,

Marcel Decker Press.

Hagler JR. 2000. Biological control of in-

sects. En: Rechcigl JL, Rechcigl NA (editores).

Biological control of insects. Insect pest manage-

ment: techniques from environmental protection.

EUA.CRC Press

Harwood RR.1990. A history of sustainable

agriculture. En: Edwards CA, Lal R, Madden P,

Miller RH, House G (editores). Sustainable agricul-

tural systems. EUA. St. Lucie Press.

Hazir S, Kaya HK, Stock P, Keskin N, 2004.

Entomopathogenic nematodes (Steinernematidae

and Heterorhabditidae) for biological control of

soil pests. Turk J Biotech 27:181-202

Islas-López MA, Sanjuan-Galindo R, Rodrí-

guez-Hernández AI, Chavarría-Hernandez N.

2005. Monoxenic production of the entomopatho-

genic nematode Steinernema carpocapsae using

culture media containing agave juice (aguamiel)

from Mexican maguey-pulquero (Agave spp.) Ef-

fects of the contents of nitrogen, carbohydrates

and fat on infective juvenile production. Appl Mi-

crobiol Biotech 68: 91-97

Johnigk SA, Ehlers RU. 1999. Endotokia

matricida in hemaphrodites of Heterorhabditis

spp. And the effect of the food supply. Nematol.

1: 717-726.

Kaya HK, Aguilera M, Alumai A, Choo HY,

De la Torre M, Fodor A, Ganguly S, Hazir S,

Lakatos T, Pye A, Wilson M, Yamanaka S, Yanh

H, Ehlers RU. 2006. Status of entomopathogenic

nematodes and their symbiotic bacteria from se-

lected countries or regions of the world. Biol Con-

trol 38:134-155

Kiely T,Donaldson D, Grube A.2004. Pesti-

cide Industry: Sales and Usage, 2000 and 2001

Market Estimates. Enviromental Protection Agen-

ce. EUA

Lacey LA, Frutos R, Kaya HK, Vail P. 2001.

Insect pathogens as biological control agents: Do

they have a future? Biol Control 21: 230-248

López y López EV, Chavarría-Hernández N,

Fernández P, de la Torre M. 2000. Fermentation

processes for bionsecticide production. An over-

view. Recent Res Devel Biotechnol Bioeng 3:1-20

áó ó

Mataix C. 1982. Mecánica de fluidos y

máquinas hidráulicas. México. Harla

Molina-Grima E, Chisti Y, Moo-Young M.

1997. Characterization of shear rates in airlift bio-

reactors for animal cell culture. J Biotechnol 54:

195-210

Mota M, Neves JM. 2005. A low cost tech-

nology for entomopathogenic nematode. En: Mota

M, Tramper E. (editores). Multiphase bioreactor

desing. Reino Unido. Taylor & Francis

Neves JM, Texeira JA, Simoes N, Mota M.

2001. Effect of airflow rate on yields of Stein-

ernema carpocapsae Az 20 in liquid culture in a

external loop-Airlift bioreactor. Biotechnol Bioeng

72: 369-373

Pace GW, Grote W, Pitt DE., Pitt JM. 1986.

International Patent WO 86/01074

Pretty J, Hine R. 2005. Pesticide use and the

environment. En: Pretty J (editor).The pesticide

detox: Towards a more sustainable agriculture. Re-

ino Unido, Earth Scan Press.

Quintero R. 1990. Transferencia de oxígeno

y diseño de fermentadores. En: Quintero R

(editor). Ingeniería bioquímica: teoría y aplicacio-

nes. México, Alhambra.

Samish M, Glazer I. 2001. Entomopa-

thogenic nematodes for the biocotrol of ticks.

Trends Parasitol 17:368-371

Sanjuan-Galindo R. 2006. Producción del

nematodo entomopatógeno Steinernema carpo-

capsae en cultivo monoxénico sumergido en bio-

rreactor Air-lift con recirculación interna. Tesis de

Maestría. UAEH. México.

Schroer S, Ehlers RU. 2005 Foliar application

of the entomopathogenic nematode Steinernema

carpocapsae for biological control of diamondback

moth larvae (Plutella xylostella). Biol Control 33:

81-86

Serwe-Rodriguez J, Sonnenberg K, Apple-

man B, Bornstein-Forst S. 2004. Effects of host

dessication on development, survival, and infectiv-

ity of entomopathogenic nematode Steinernema

carpocapsae. J Inv Pathol 85: 175-81

Shapiro-Ilan DI, Gaugler R. 2002. Produc-

tion technology for entomopathogenic nematodes

and their bacterial symbionts. J Microbiol Biotech

28: 137-146

Shapiro-Ilan DI, Gouge HD, Piggott SJ, Fife

JP. 2006. Application technology and enviromental

considerations for use of entomopathogenic nema-

todes in biological control. Biol Control 38: 124-

133

SNIARN - Sistema Nacional de Información

Ambiental y de Recursos Naturales. Estadísticas

del Medio Ambiente: Informe de la Situación Ge-

neral en materia de Equilibrio Ecológico y Protec-

ción al Ambiente, 1995-1996. http://

www.semarnat.gob.mx/informacionambiental/

Pages/index.aspx

Surrey MR, Davies MJ. 1996. Pilot-scale liq-

uid culture and harvesting of an entomopathogenic

nematode, Heterorhabditis bacteriophora. J Inver

Pathol 67, 92–99

Taméz-Guerra P, Galán-Wong LJ, Medrano-

Roldán H, García-Gutierrez C, Rodríguez-Padilla

C, Gómez-Flores RA, Támez-Guerra RS. 2001.

Bioinsecticidas: Su empleo, producción y comer-

cialización en México. Ciencia UANL 4: 143-152

Wen J, Jia X, Cheng X, Yang P. 2005. Char-

á

acteristics of three-phase internal loop airlift biore-

actors with complete gas recirculation for non-

newtonian fluids. Bioprocess Biosyst Eng 27: 193

-205

Woodring JL, Kaya HK. 1988. Steinerne-

matid and heterorhabditid nematodes: a handbook

of biology and techniques. EUA. Arkansas Agric.

Exp Stn.

Yoo S, Brown I, Gaugler R. 2000. Liquid me-

dia development for Heterorhabditis bacterio-

phora. Appl Microbiol Biotechnol. 54: 759-763

Znád H, Báles V, Kawase Y. 2004. Modeling

and scale up of airlift bioreactors. Comp Chem

Eng 28:2765-2777