Neavtorizirani povzetki izbranih predavanj iz biokemije

UN študij Okolje Politehnika Nova Gorica

doc. dr. Marko Dolinar obravnavane teme v študijskem letu 2003/2004: Pretok genetskih informacij (5. poglavje) Raziskovanje genov (6. poglavje) Podvojevanje DNA in popravljanje (27. poglavje) Sinteza RNA in splicing (28. poglavje) Sinteza proteinov (29. poglavje) Kontrola genskega izražanja (31. poglavje) Biosinteza nukleotidov (25. poglavje) Lipidi in celične membrane (12. poglavje) Membranski kanalčki in črpalke (13. poglavje) Prevajanje signalov (15. poglavje) Uvod v metabolizem (14. poglavje) Fotosinteza (19. poglavje) Cikel pentoze-fosfata in Calvinov cikel (20. poglavje) Metabolizem glikogena (21. poglavje) Metabolizem maščobnih kislin (22. poglavje) Presnova proteinov: razgradnja aminokislin in cikel uree (23. poglavje) Imunološke tehnike (33. poglavje: splošna imunologija; tehnike niso obravnavane v učbeniku) Povzetki so namenjeni pomoči pri študiju iz učbenika Berg, J.M., Tymoczko, J.L., Stryer, L.: Biochemistry, 5. izdaja, W.H. Freeman & Co., New York, 2001. oglejte si tudi spletni strani na naslovih: http://bio.ijs.si/marko/png.html (izpitni rezultati in splošna obvestila) http://bio.ijs.si/marko/biokem_povezave.html (seznam strani za pomoč pri študiju nekaterih poglavij iz biokemije)

Pretok genetskih informacij – DNA in RNA DNA in RNA sta dolga linearna polimera, sestavljena iz med seboj povezanih nukleotidov. Nukleotide sestavljajo sladkor (deoksiriboza oziroma riboza), fosfat in organska baza; ogrodje sestavljata fosfat in nanj vezani sladkor, baze pa so v notranjosti strukture in se parijo preko vodikovih vezi v točno določenih kombinacijah: A-T (adenin-timin) in C-G (citozin-gvanin). Ta lastnost omogoča prenašanje genetskih informacij, ki je shranjena v zaporedju specifičnih nukleotidov vzdolž verige DNA. Sparjeni povezani nukleotidi tvorijo dvojnoverižno zgradbo v obliki vijačnice. Pri podvojevanju (replikaciji) se verigi najprej razkleneta, potem pa s pomočjo encima DNA-polimeraza podvojita. Genetska informacija z DNA preide najprej na RNA v procesu prepisovanja (transkripcija), ki predstavlja matrico za sintezo proteinov na ribosomih (prevajanje ali translacija). Obstaja več vrst RNA; kot matrica služi samo mRNA, medtem ko drugi dve obliki sodelujeta v procesu sinteze proteinov kot prenašalka aminokislin (tRNA) oz. kot sestavni del ribosomov (rRNA). Vse tipe RNA sintetizirajo RNA-polimeraze na osnovi zapisa DNA.. Informacija na nivoju nukleinskih kislin je šifrirana s pomočjo genetskega koda, ki definira razmerje med zaporedjem baz in aminokislinskimi ostanki, ki se nizajo v proteinski strukturi. Tri baze – kodon – določajo eno aminokislino. Ribosomi so organeli, sestavljeni iz več tipov rRNA in nad 50 različnih proteinov. Razlika med DNA in RNA je v pentozi; pri RNA gre za ribozo, pri DNA pa za deoksiribozo, ki se od riboze loči samo po tem, da ogljik na mestu 2' nima vezane skupine –OH, pač pa le –H. Razen tega je namesto timina (T) v RNA prisotna baza uracil (U). Sladkorni ostanki so med seboj povezani s fosfodiestrskimi vezmi, ki povezujejo 3'-OH s 5'-OH naslednjega nukleotida. Ti fosfatni mostički so negativno nabiti in dajejo naboj celotni nukleinski kislini. Kombinacija sladkorja in fosfata tvori ogrodje, na katerega so vezane baze. Bazi A in G spadata med purine, C in T (U) pa med pirimidine. Enota nukleinske kisline, ki jo sestavljajo sladkor in baza, vezana z estrsko vezjo na fosfat, se imenuje nukleotid; sama kombinacija baze in sladkorja pa nukleozid (nukleozidna vez). Prostorsko zgradbo molekule DNA sta rešila Watson in Crick leta 1953. Ima obliko dvojne vijačnice, kjer se en zavoj razteza preko 34 Å oziroma 10 baznih parov, širina vijačnice pa je 20 Å.. V središču vijačnice so bazni pari; med A in T sta 2 H-vezi, med C in G pa 3. Molekule DNA so lahko zelo dolge. Celoten genom bakterije Escherichia coli predstavlja ena sama molekula DNA dolžine 4.6 milijonov nukleotidov. Človekov genom ima skupno dolžino 3 milijarde nukleotidov (v 24 molekulah – kromosomih). Nekatere molekule DNA so krožne (npr. mitohondrijska DNA) in so lahko tudi dodatno zvite – gre za način kompaktiranja dolgih verig, ki tako zavzamejo manj prostora in so manj dovzetne za poškodbe. Pri replikaciji DNA prihaja do semikonzervativnega podvajanja: dve verigi DNA se razkleneta, nato pa se na osnovi vsake posamezne sintetizira komplementarna veriga in s tem ponovno pride do tvorbe dvojnoverižne strukture. Dvojno vijačnico lahko razpre encim helikaza, v laboratoriju pa ločbo verig dosežemo s segrevanjem (obstaja temperatura tališča, pri kateri je polovica helikalne strukture razprte), dodatkom baze ali kisline. Pri prehodu v enoverižno obliko se spremenijo tudi spektroskopske lastnosti DNA – absorbanca pri 260 nm se poveča. Ob počasnem ohlajanju 'raztopljene' DNA pride do ponovnega združevanja verig. Zlepljajo se tudi molekule z neidentičnimi, vendar pa podobnimi zaporedji, kar izkoriščamo pri karakterizaciji zaporedij nukleinskih kislin v postopku hibridizacije. Enoverižne nukleinske kisline lahko tvorijo sekundarne strukture, ki segajo od preprostih zgradb steblo-zanka, pa do zapletenih oblik, ki jih zavzemajo dolge molekule mRNA. in pri katerih pride do stika med bazami, ki so v linearnem zaporedju precej oddaljene.

Pri podvajanju DNA v celici sodeluje več kot 20 proteinov, med katerimi imajo ključno vlogo DNA-polimeraze, ki katalizirajo nastanek fosfodiestrske vezi pri postopnem dodajanju deoksiribonukleotidov na rastočo verigo DNA: (DNA)n + dNTP (DNA)n+1 + PPi. Sinteza teče vedno le, če je prisotna prosta komplementarna veriga in nek začetni sparjeni fragment. Nekatere polimeraze imajo tudi nukleazno aktivnost, ki jim pomaga pri odstranjevanju napačno vgrajenih nukleotidov, tako da je dodajanje baz glede na matrico izredno natančno (pogostost napačne vgradnje je 10-8). Vsi celični organizmi imajo gene iz DNA, medtem ko imajo nekateri virusi genetske informacije shranjene v obliki RNA. Pri skupini retrovirusov se RNA ob delovanju reverzne transkriptaze in po vstopu v celico, ki jo virus okuži, postopno pretvori v DNA, ta pa se vključi v genom okuženega osebka. Celice vsebujejo več vrst RNA, med katerimi je po količini kar 80% rRNA, 15% je tRNA, le 5% pa mRNA, ki služi kot informacija za sintezo proteinov. Pri evkariontih najdemo še snRNA, ki sodeluje v procesu izrezovanja intronov. RNA nastaja po matrici DNA s pomočjo RNA-polimeraz. Postopek je podoben kot pri replikaciji DNA in poteka v smeri 5' 3', vendar ne potrebuje začetnega sparjenega fragmenta. Nastane veriga, ki je po zaporedju baz komplementarna matrici DNA.. Prepisovanje se začne na točno določenem odseku DNA, imenovanem promotor, ki ima zaporedje, ki specifično veže RNA-polimerazo. Pri prokariontih so promotorji bolje definirani kot pri evkariontih. Proces se zaključi na mestu terminatorja, ki ima pri E. coli obliko lasnične zanke (na nivoju RNA), ki ji sledi zapredje več uracilnih ostankov. Evkariontska RNA po sintezi doživi več modifikacij, kot so dodajanje poli-A repa na 3'-koncu in kapice na 5'-koncu. Zapis za aminokisline je zvezen, pri čemer po 3 baze (triplet) določajo eno aminokisilno. Isto aminokislino lahko kodira več različnih tripletov (degeneracija genetskega koda), vendar vsak triplet določa vedno samo eno aminokislino. Tudi konec aminokislinske verige je zapisan kot triplet. Od 64 kombinacij, ki so teoretično možne na osnovi 4 baz, 3 kombinacije zapisujejo konec verige (stop-kodon), ostalih 61 pa 20 aminokislin. Genetski kod je univerzalen (vsi organizmi prevedejo isto zaporedje treh baz v isto aminokislino) z redkimi izjemami. Pri višjih evkariontih so kodirajoče regije genov (eksoni) prekinjeni z nekodirajočimi območji (introni). Introni se izrezujejo po prepisovanju z DNA (primarni transkript) in pred nastankom mRNA. Raziskovanje genov Osnovna orodja:

• restrikcijska analiza • tehnike prenosa NA in detekcije • določanje nukleotidnega zaporedja • sinteza NA na trdnih nosilcih • PCR • bioinformatika

Tehnologija rekombinantne DNA

• restikcija – ligacija • plazmidi in fagi kot vektorji • genomska knjižnica • hoja po kromosomu

Manipuliranje z evkariontskimi geni

Priprava cDNA in izražanje Študij nivojev ekspresije (mikromreže) Izražanje v evkariontskih celicah Transgenske živali Tehnologija izbijanja genov Vnos genov v rastline Mestno-specifična mutageneza Podvojevanje DNA in popravljanje DNA obstaja v več helikalnih oblikah (A, B, Z). Je dovolj fleksibilna, da se lahko upogiba, krivi in razvija, hkrati pa zelo stabilna zaradi vodikovih vezi med bazami obeh verig in zaradi efekta nalaganja baz znotraj iste verige. Struktura B ima značilna veliki in mali žleb, ki sta mesti za dostop drugih molekul, ki interagirajo z značilnimi zaporedji baz na DNA. Ob dehidraciji prehaja oblika B v obliko A , kjer so baze glede na os nekoliko zamaknjene, vendar je vijačnica še vedno desna. Oblika Z ima značilnosti leve vijačnice in nastane le v zaporedjih, kjer se izmenjujejo purini in pirimidini. DNA-polimeraze katalizirajo nukleofilni napad 3'-hidroksilne skupine na notranji fosforjev atom v deoksiribonukleotidu. Delujejo lahko le, če je na matrično verigo DNA že vezan segment komplementarne nukleinske kisline s prostim 3'-koncem (začetni oligonukleotid). Encimi iz različnih organizmov so si po zgradbi podobni in potrebujejo za delovanje kovinske ione. Polimeraze z aktivnostjo kontrolnega branja imajo tudi 3' 5' eksonukleazno aktivnost. Preden pride do podvojevanja dvojnoverižne DNA, se morata verigi razkleniti, kar povzročijo helikaze ob hkratni hidrolizi ATP. Dvojnoverižna DNA se lahko ovija okrog same sebe. Vezavno število nam pove, kolikokrat se je veriga zavila. Molekule z različnimi vezavnimi števili so topoizomere, ki lahko prehajajo v druge topoizomere samo po predhodnem rezanju ene ali obeh verig po delovanju topoizomeraz. Pri E. coli se podvajanje DNA začne na mestu oriC in se od tam nadaljuje simetrično v obe smeri. Helikaza razklene verigi in ustvari replikacijske vilice. Obe verigi tu služita kot matrici za sintezo nove DNA. Ker DNA-polimeraze za delovanje potrebujejo začetne nukleotide, najprej primaza (posebna RNA-polimeraza) sintetizira kratka zaporedja RNA, na osnovi katerih se nato nadaljuje sinteza DNA. Z replikacijskih vilic se sinteza po eni matrični verigi nadaljuje neprekinjeno (vodilna eriga), na drugi verigi pa po segmentih (zastajajoča veriga), dolgih ~1 kb (Okazakijevi fragmenti). Encim, ki katalizira podvajanje je pri obeh verigah DNA-polimeraza III, asimetrični dimer z veliko molekulsko maso. Do različnega načina podvajanja ene in druge matrične verige prihaja zaradi enosmernega delovanja polimeraze, ki lahko deluje le v smeri 5' 3', končni efekt na zastajajoči verigi pa je, kot da bi šlo za nastajanje nove verige v smeri 3' 5'. Začetne oligonukleotide RNA razgradi DNA-polimeraza I preko svoje nukleazne aktivnosti, isti encim pa tudi dopolni manjkajoče zaporedje z dNTP. Na koncu se fragmenti DNA med seboj povežejo z DNA-ligazo. Pri evkariontih je podvajanje DNA bolj zapleteno. Kromosomi evkariontov so linearne molekule, zato njihove konce podvaja posebna od RNA odvisna DNA-polimeraza, imenovana telomeraza. Polimeraza III je izredno zmogljiv encim, saj je natančen in hiter (1000 baz/s; polimeraza I samo 10 baz/s), vendar tudi zelo velik (10 polipeptidnih verig s skupno maso 900 kDa; polimeraza I le 1 veriga, ~90 kDa).

Podobna prostorsko ločena nukleotidna zaporedja se lahko med sabo rekombinirajo. Pri tem pomagajo rekombinaze, ki tvorijo in prekinjajo t.i. Hollidayeva križišča, splete 4 nukleotidnih verig. Mehanizem delovanja je podoben kot pri topoizomerazah. Mutacije nastajajo zaradi napak v parjenju baz, kovalentnih modifikacij baz ali pa zaradi insercije ali delecije baz. S tavtomerizacijo vodikovih atomov na bazah (pretvorbo med dvema izomerama) lahko pride do napačnega parjenja. Analogi baz (npr. 5-bromouracil) se lahko vgrajujejo v DNA in s tem povzročajo napake pri podvajanju. Kemični mutageni delujejo na baze in jih modificirajo do te mere, da se z derivati parijo napačne baze, ali pa (v primeru ploskih aromatskih molekul kot so akridini) interkalirajo med bazne pare in s tem pride do insercij. UV-svetloba pa povzroča tvorbo pirimidinskih dimerov, ki niso kompatibilni z dvojno vijačnico. DNA-polimeraza je sposobna popravljati nekatere napake, druge pa popravljajo še nekateri encimi, ki vsi za preverjanje odčitavajo zaporedje baz matrične verige. Pirimidinske dimere, ki nastanejo zaradi delovanja UV-žarkov, popravlja uvrABC-ekscinukleaza, ki odstrani zaporedje 12 baz, vključno z dimerom. Pri ljudeh z okvarami v sistemu popravljanja DNA pride do nastanka različnih bolezni, predvsem različnih rakov. Standardni test mutagenosti je Amesov test, ki ga izvajamo na posebnih sevih bakterij iz rodu Salmonella. Bakterije imajo v genomu točno določene vrste okvar v zapisih za posamezne encime metabolnih poti (biosinteza histidina). Ko bakterije rastejo na gojišču z mutagenim sredstvom, bo prišlo pri nekaterih bakterijah do revertiranja – okvara bo mutirala v divji tip in celice bodo rastle na selektivnem gojišču. V testu uporabimo tudi homogenat sesalskih jeter; encimi v ekstraktu lahko pretvorijo nekatere prekurzorje mutagenih sredstev v prave mutagene. Sinteza RNA pri prokariontih Vse molekule RNA nastajajo na osnovi matrice DNA s pomočjo RNA-polimeraz. Delujejo v smeri 5'-> 3' (tako kot pri sintezi DNA), pri čemer začetni sparjeni segment ni potreben, odsotna pa je tudi aktivnost kontrolnega branja. Gre za polimerizacijo, kjer se zapored dodajajo aktivirani monomeri – ribonukleozid trifosfati. Encim ima več nalog: poišče promotorska mesta in se veže nanja, razvije kratek segment dsDNA, izbere ustrezen NTP in katalizira tvorbo fosfodiestrske vezi, zazna terminacijski signal, interagira z aktivatorji in represorji. Pri E. coli je RNA-polimeraza encim z več podenotami (holoencim: α2ββ'σ) in skupno maso 550 kDa; pri tem osrednji encim zavzemajo podenote α2ββ'. Najprej pride do vezave holoencima preko podenote σ70 na promotorsko regijo, ki jo sestavljata dva segmenta na mestih ~10 in ~35 nukleotidov navzgor od začetka transkripcije. Običajni promotorji imajo zelo ohranjena promotorska zaporedja. V posebnih pogojih rasti (npr. povišana temperatura) pa se izraža drugačna podenota σ32, ki se zato tudi veže na drugačna promotorska zaporedja (heat-shock geni). RNA-polimeraza najprej odvije ~17b dolgo zaporedje v dvojni vijačnici, nakar se začne prepisovanje. Ko se začne elongacija (podaljševanje) in se sintetizira prvih ~10 b, podenota σ disociira iz holoencima, polimerizacija pa se nadaljuje s hitrostjo ~50 b/s (17 nm/s) znotraj takoimenovanega transkripcijskega mehurčka, ki se pomika po matrični DNA. Polimerizacija se konča na določenih mestih. To so lahko posebne lasnične strukture, ki jih ustvari nastala RNA, ali pa signal, ki ga prebere faktor ρ (ro). Pri lasničnih zankah pride do zaustavitve delovanje polimeraze, hkrati pa je nastali hibrid DNA-RNA v tej regiji nestabilen in pride do disociacije RNA z DNA in z encima. Faktor ρ (heksamer z ATPazno aktivnostjo) se veže na 72 b novonastale RNA, nato pa po njej potuje do transkripcijskega mehurčka, kjer deluje na hibrid DNA-RNA kot helikaza in prekine hibrid, kar povzroči prekinitev prepisovanja. Nastala RNA, ki je namenjena za tRNA oz. rRNA se po sintezi še kemično spremeni, medtem ko mRNA ostane nespremenjena in služi kot matrica za sintezo proteinov. Primarni transkript lahko vsebuje RNA, ki po delovanju RNaz razpade na predhodnike tRNA in rRNA. Pri rRNA pride še do modifikacije riboze in

metilacije nekaterih baz. Pri tRNA pride do naknadnega dodajanja zaporedja CCA ter do modifikacije posameznih baz. Nekateri antibiotiki delujejo na nivoju transkripcije. Rifampicin npr. inhibira fazo iniciacije s tem, da se veže v bližino kanalčka, kjer je mesto za hibrid DNA-RNA (na podenoti β). Aktinomicin pa se veže na dsDNA, tako da se ne more razpreti in matrica DNA ne pride v stik s polimerazo. Pri prokariontih potekata prepisovanje in prevajanje v citoplazmi, medtem ko imajo evkarionti celične razdelke in različni procesi tečejo v različnih razdelkih: prepisovanje v jedru, prevajanje pa v citoplazmi na ribosomih. Sinteza in procesiranje RNA pri evkariontih V evkariontskem jedru so 3 različne RNA-polimeraze z različnimi funkcijami. RNA-pol I sintetizira prekurzorje rRNA, RNA-pol II sintetizira mRNA, RNA-pol III pa prekurzorje tRNA. Katalitski mehanizem je enak kot pri prokariontskih RNA-polimerazah (nukleofilni napad 3'-OH na alfa-P vstopajočega NTP brez začetnega oligonukleotida, v smeri 5'->3'). Strup rdeče mušnice vsebuje α-amanitin, ciklični oktapeptid z neobičajnimi aminokislinami. Tesno se veže na RNA-pol II in tako blokira tvorbo prekurzorjev mRNA (fazo elongacije). Promotorji za RNA-pol II so: TATA-škatla (-25), CAAT-škatla in CG-škatla – slednji 2 samo pri pogosto prepisujočih se matricah na mestih med –45 in –110. Inicacija poteče s pomočjo transkripcijskih faktorjev. Za RNA-pol II se najprej na TATA-škatlo veže TFIID, nato pa še IIA in IIB ter končno RNA-pol in TFIIE, ki skupaj tvorijo osnovni transkripcijski aparat. TFIID (700 kDa) vsebuje TBP (30 kDa podenota), 'protein, ki se veže na TATA-škatlo'. Po vezavi pride do strukturnih sprememb na DNA, ki se upogne na obeh straneh TATA-škatle, DNA pa se tudi delno razvije. Na transkripcijo lahko vplivajo tudi oddaljena zaporedja DNA, ki se zapogne, da aktivatorji, vezani na ojačevalna zaporedja DNA, pridejo v stik s transkripcijskim aparatom. Evkariontska mRNA se na 5'-koncu takoj po sintezi modificira; po odcepu fosfata pride do interakcije med difosfatom in GTP, da nastane nenavadna 5'-5' trifosfatna vez. Nastala struktura = kapica, se nato metilira, metilirajo pa se lahko tudi riboze navzdol po sekvenci. Kapice povečajo stabilnost mRNA in odpornost proti fosfatazam in nukleazam. Na 3'-koncu imajo evkar. mRNA poli-A rep, ki ni kodiran na nivoju DNA, po drugi strani pa se pogosto 3'-konec primarnega transkripta (AAUAAA) odcepi pred encimsko sintezo poli-A (~250 ostankov ob porabi ATP). Rep se ovije okrog več kopij vezavnega proteina z maso 78 kDa. Vloga poliA: zaščita pred nukleazami, povečuje učinkovitost matrice pri sintezi proteinov. Po sintezi tRNA se pred dokončnim oblikovanjem s konca in iz sredine izcepita kratki zaporedji, na 3'-koncu pa se pripne trinukleotid, ki nato veže aminokisline. Pri teh procesih sodeluje več encimov. Iz prekurzorske mRNA se izcepijo introni z veliko natančnostjo. Meje stikov z eksoni so strukturno podobne pri vseh evkariontih. Intron se začne z GU in konča z AG. Značilna so tudi bližnja zaporedja in razvejitveno mesto 20-50 b navzgor od mesta cepitve na 3'-koncu introna. Introni so dolgi 50-10.000 baz. 5'-cepitveno mesto napade 2'-OH adenozina na razvejitvenem mestu. Nastane nov 3'-konec zgornjega eksona, ki napade 3'-cepitveno mesto. Eksona se povežeta, intron se sprosti v obliki lariata. Reakcije tečejo, ko je mRNA vezana na proteine: spliceosom. V jedru in citoplazmi je več vrst malih molekul RNA (<300 b): snRNA, scRNA, ki se vežejo s proteini v ribonukleoproteinske komplekse (RNPs) – sestavne dele spliceosomov.

V posebnih primerih lahko izcep delov RNA povzroči sama (katalitska) RNA. Npr. procesiranje prekurzorjev rRNA pri bičkarju Tetrahimena (evkariontski enoceličar - protozoj). Katalitska RNA (ribocim) je lahko dolga tudi <50 b in je specifična. Sinteza proteinov Translacija: zaporedno dodajanje AA (=aminokislin) na karboksilni konec polipeptidne verige; sinteza od N- do C-konca. AA se dodajajo preko aktiviranih prekurzorjev (aminoacil-tRNA), kjer je karboksi-skupina AA povezana s 3'-OH tRNA (sintetaza, ATP). Sinteza: iniciacija (vezava iniciacijske tRNA na startni signal mRNA; mesto P na ribosomu), elongacija (vezava aminoacil-tRNA na mesto A, tvorba peptidne vezi, preskok na mesto P, iniciacijska tRNA pa na E; poganja hidroliza GTP), terminacija (sprostitveni faktor prebere signal stop in loči polipeptid od ribosoma). Mesta: P=peptidilno, A= aminoacilno, E=izhodno Ribosomi so veliki ribonukleoproteinski kompleksi iz 2 podenot (E. coli: 30 S+50 S=70 S): 3 RNA, 55 proteinov. Ala-tRNA: prva sekvencirana NA (=nukleinska kislina) (76 b, 7 let dela, 1965). Vse tRNA so podobne (ker morajo interagirati s podobnimi proteini in RNA na istih mestih ribosoma): l=73-93 b, fosforiliran 5-konec (pG), prosta 3' –OH skupina. Veliko baz (7-15) je drugačnih od ACGU (=> se ne parijo in so na voljo za druge interakcije + so bolj hidrofobne, kar je pomembno za interkacije s sintetazami in z ribosomskimi proteini ter za zvitje), ~50% baz je sparjenih, oblika je ~deteljasta, na enem koncu je antikodonska zanka (7 b), ki se s 3 bazami pari z mRNA. 3D zgradba (Phe-tRNA, 1974): oblika črke L, dva segmenta z dvojno vijačnico (po ~10 bp=1 zavoj). V nehelikalnih delih se tvorijo neobičajne H-vezi (terciarne interakcije G-G, A-A, A-C); z bazami interagira tudi ribofosfatni skelet, pa tudi sam s sabo; stabilizirajo tudi nalaganja aromatov zaradi baz, ki so ena nad drugo. Razdalja med antikodonom in CCA-koncem, kamor se pripenja aminokislina (ozn. AA), je 80 Å . CCA-konec ima malo interakcij z ostankom molekule in je fleksibilen. Tvorba peptidne vezi je energetsko neugodna. Rešitev je aktivacija karboksilne skupine. Gre za estre aminokislin, pri čemer je karboksilna skupina vezana na tRNA preko 2'- ali 3'-OH skupine riboze na 3'-koncu: aminoacil-tRNA. Razen tega se preko tRNA povežeta aminokislina in genetska informacija. Sintetaza hidrolizira ATP do AMP + 2 Pi (1 Pi za estrsko vez, 1 za poganjanje reakcije). Najprej se AA modificira do aminoacil-adenilata (AA-AMP), nato se ustvari povezava s tRNA -> aminoacil tRNA + AMP. Za vsako AA obstaja vsaj 1 aminoacil-tRNA sintetaza. Razdelimo jih v 2 razreda z različno sestavo značilnih regij. Encimi razreda II aktivirajo manjše in hidrofobne AA in so evolucijsko starejši. Acetilirajo 3'-OH (razen Phe), razred I pa 2'. Struktura Tyr-tRNA sintetaze iz E. coli: dimer razreda I (2x47 kDa); N-termin. 320 AA: aktivacija, C-term. 99 AA: vezava tRNA in tvorba vezi. Encimi so zelo specifični in prepoznajo majhne razlike na tRNA in AA. Razen tega imajo aktivnost kontrolnega branja in lahko hidrolizirajo premajhne intermediate oz. v acilacijska mesta ne morejo vstopati preveliki intermediati. Nekatere sintetaze prepoznajo tRNA preko antikodona, druge pa preko specifičnih parov v akceptorskem steblu oz. kombinirano. Antikodon se veže na kodon ne glede na AA, ki bi bila vezana na tRNA. Nekatere tRNA pa se vežejo na več kot 1 kodon zaradi ohlapnosti parjenja na 3. bazi.

Ribosom E. coli: ~2.700 kDa, 2r=200 Å; skupaj v celici ~20.000 ali 25% celotne mase bakterije. Podenota 30 S: 21 P (S1-21) + RNA 16 S; podenota 50 S: 34 P (L1-34) + RNA 23 S + RNA 5 S. Samo L7 in L12 nastopata 2x (L7 = acetiliran L12). Prekurzor 30 S se procesira do posameznih RNA-elementov ribosoma (5 S, 16 S, 23 S). rRNA 16 S: 1542 b, 3 domene. Vezavno mesto za mRNA je med obema podenotama; v reži sta tudi 2 vezavni mesti za tRNA. Velika podenota ima 3 izrastke; v dolini med 2 je peptidil-transferazno mesto, na 1 prstu pa je GTPaza, ki skrbi za premikanje tRNA in mRNA; na nasprotni strani je mesto izstopa mRNA. S pulznim označevanjem novosintetiziranih proteinov so pokazali, da sinteza teče od N- proti C-koncu polipeptidne verige. mRNA se prevaja v smeri 5'->3' (ista kot je smer sinteze mRNA); pri prokariontih tečejo postopki sočasno (prepisovanje in prevajanje sta prostorsko in časovno sklopljena procesa). Hkrati prevajanje teče na več ribosomih (poliribosomi = polisomi), ki so med seboj neodvisni. Max. gostota je 1 rbs/80 b. Po končani sintezi proteina ribosom disociira na obe podenoti. Prvi prevedeni kodon ni z začetka mRNA, pač pa >25 b navzdol; razen tega so mRNA pri prokariontih pogosto policistronske (več proteinov zapisanih na 1 mRNA z ločenimi start- in stop-kodoni). Prva AA je formil-metionin (pri bakterijah), ki se vgradi s posredovanjem iniciacijske tRNA: tRNAf (notranji Met: tRNAm – ta se ne more formilirati, vendar za obe obliki obstaja le ena sintetaza, le da v 1. primeru naknadno deluje še transformilaza). Start je AUG (Met), redko tudi GUG (Val), pred katerim je zaporedje, bogato s purini, oddaljeno ~10 b. Imenuje se Shine-Dalgarnovo zaporedje in se veže na rRNA 16 S (3'-konec). Gre torej za parjenje mRNA s 16S-rRNA in parjenje antikodona z iniciacijskim kodonom . Najprej se na podenoto 30S vežejo 3 proteini: iniciacijski faktorji (IF) 1-3. Po vezavi GTP na IF2 se kompleksu pridružita še mRNA in inciacijska tRNA, IF3 pa se sprosti. Tedaj se lahko veže podenota 50 S, IF1 in IF2 pa se sprostita ob hidrolizi GTP in nastane iniciacijski kompleks 70 S. fMet-tRNA je na mestu P, mesti A in E pa sta nezasedeni. Začne se faza elongacije: aminoacil-tRNA se veže na prosto mesto A (katera aa-tRNA je odvisno od kodona na mRNA na tem mestu) s posredovanjem elongacijskega faktorja Tu (EF-Tu, 5% vseh bakterijskih proteinov), ki ima vezan GTP. Po postavitvi v mesto A pride do hidrolize GTP, kompleks disociira z ribosoma, na kompleks se veže EF-Ts in povzroči disociacijo GDP. Na EF-Tu se veže GTP, EF-Ts pa se loči od kompleksa. Hitrost sinteze proteinov je odvisna od GTPazne aktivnosti EF-Tu. Znotraj nekaj milisekund, kolikor traja ta faza, se tudi napačno postavljena aminoacil-tRNA loči iz kompleksa in naredi prostor pravi. (EF-Tu torej ne interagira s fMet-tRNAf in ta torej nikoli ne pride na mesto A. Met-tRNAm pa se obnaša kot vsaka druga AA in vstopa v A. Tako tudi notranjih AUG ne prebere iniciacijska tRNA.) Tvorbo peptidne vezi katalizira peptidil-transferaza znotraj 50S-podenote. 3'-CCA na tRNA interagira s 23S-rRNA, ki tvori aktivno mesto encima. Aktiviran fMet se prenese na amino-skupino aa-tRNA in nastane dipeptidil-tRNA. S tvorbo peptidne vezi se zmanjša afiniteta tRNA do 50S-podenote. Deacilirana tRNA na 50S podenoti je vezana na mestu E, na mestu P pa še vedno na P; dipeptidil-tRNA je na mestu P na podenoti 50 S in na mestu A na podenoti 30 S. Zdaj pride do faze translokacije – 3 premikov: deacilirana tRNA se umakne z mesta P na podenoti 30 S, dipetidil-tRNA se na 30 S premakne z A na P, mRNA pa se premakne za 1 kodon naprej. Pri premikih posreduje translokaza = EF-G ob razgradnji GTP in sodelovanju več proteinov iz podenote 50 S. Ko se na sproščeno mesto A veže nova aminoacil-tRNA, se z mesta E sprosti deacilirana tRNA – obe mesti hkrati ne moreta biti zasedeni. Stop-kodonov ne prepozna tRNA, pač pa proteini - sprostitveni faktorji (release factor, RF), sodeluje pa tudi rRNA 16 S. Vezava RF na mesto A aktivira peptidil-transferazo, da hidrolizira vez med polipeptidom in tRNA na mestu P. mRNA in tRNA zapustita ribosom, ki nato razpade na posamezni podenoti. Antibiotik puromicin inhibira sintezo proteinov zaradi predčasne terminacije, saj je analog dela aminoacil-tRNA. Veže se na mesto A in preprečuje vstop pravi aminoacil-tRNA, hkrati pa povzroči vgradnjo antibiotika na C-konec polipeptidne verige. Tudi več drugih antibiotikov deluje na nivoju translacije pri prokariontih, pa tudi evkariontih.

Pri evkariontih je proces sinteze proteinov podoben, čeprav so ribosomi večji (60 S + 40 S = 80 S, 4.200 kDa; 40 S = rRNA 18 S + proteini; 60 S = 5 S+23 S+5,8 S + proteini) in tu sodeluje še več drugih proteinov. Iniciacijska AA je Met (ne fMet), vendar je tRNA prav tako posebna Met-tRNAi. Start je vedno AUG brez Shine-Dalgarnovega zaporedja in do prevajanja pride na prvem AUG v mRNA. Pritrditev na podenoto 40 S poteka preko kapice. Evkar. mRNA ima vedno samo 1 startno mesto, prokariontska mRNA pa lahko več. Iniciacijskih faktorjev je več (9) in so kompleksno sestavljeni. Evkar. homolog EF-Tu je EF1α, EF-TS pa EF1βγ. Translacijo regulirajo protein-kinaze, ki inaktivirajo enega od IF. Difterija-toksin (gen je preko faga prisoten v nekaterih sevih povzročitelja oslovskega kašlja) je inhibitor sinteze proteinov. Deluje na EF2 (ADP—ribozilacija) in tako prepreči translokacijo, kar ustavi sintezo proteinov in povzroči celično smrt. Pozor: 4. izdaja učbenika (Stryer 4) ima poglavje 35: Protein targeting, ki ga v novi izdaji (Stryer 5) ni. Sledijo poglavitni podatki: Ciljanje proteinov Biosinteza proteinov poteka na prostih ribosomih v citoplazmi z izjemo tistih, ki so zapisani na mitohondrijski in kloroplastni DNA. Pri evkariontskih proteinih, ki vsebujejo signalna zaporedja, se ribosomi prbiližajo ER. SRP – kompleks, ki prepozna signal, je ribonukleoproteinske narave in se veže na receptor na ER. Signalna zaporedja imajo lahko tudi prokariontski proteini. Skupna značilnost je, da so dolgi okrog 20 aminokisl. ostankov in imajo več hidrofobnih ostankov ter nekaj bazičnih. Prevedeni protein prehaja membrano ER, signalno zaporedje pa se odcepi. V ER prihaja do zvitja proteina ob pomoči šaperonov – proteinov, ki prehodno vežejo novonastale proteine in jim olajšujejo pravilno zvitje. V ER prihaja tudi do glikozilacije nekaterih proteinov. Aminokislina, ki se glikozilira, je Asp. Na stransko verigo se pripne 14 sladkornih ostankov z dolihol-pirofosfata, vendar se 4 kmalu odcepijo. Preko transportnih veziklov proteini nato pridejo do GA, kjer prihaja do nadaljnje modifikacije glikoproteinov. Proteini, namenjeni v lizosome, vsebujejo konformacijski motiv, ki povzroči pripenjanje manoza-6-fosfatne enote. S pomočjo membranskega receptorja taki glikoproteini pridejo v prelizosom, ta pa se kasneje zlije z lizosomom. Večina mitohondrijskih in kloroplastnih proteinov je sicer zapisana v jedru, sortiranje pa poteka s pomočjo posebnih signalnih zaporedij. V ciljni organel prehajajo lahko samo v (delno) razviti obliki, signalna zaporedja pa se po prehodu odcepijo. Kontrola izražanja genov Bakterije so se sposobne odzivati na razmere v okolju z do 1000x povečano sintezo potrebnih proteinov. Regulacija poteka pretežno na nivoju transkripcije. Geni so pogosto nanizani v operone z usklajeno regulacijo. Transkripcijo blokirajo represorji, pospešujejo pa aktivatorji. Gre za proteine, ki se vežejo na DNA. Klasični primer reguliranega izražanja pri E. coli sta laktozni in triptofanski operon. E. coli lahko porablja laktozo kot edini vir ogljika. Encim β-galaktozidaza (gen lacZ) razcepi disaharid laktozo na galaktozo in glukozo. V gojišču z laktozo imajo bakterije več 1000 kopij molekul encima, če pa so na voljo drugi viri ogljika pa <10 → inducibilni encim. Hkrati se sintetizirata še 2 encima: gal-permeaza (lacY) in tiogalaktozid-transacetilaza (lacA). Analog laktoze, ki deluje kot induktor, je IPTG

(izopropil-tiogalaktozid), ki pa ga encim ne more razgraditi. S študijem mutant so ugotovili, da za usklajeno sintezo 3 encimov skrbi produkt gena lacI; to je proteinski represor. Nastal je operonski model regulacije sinteze RNA: regulatorski gen kodira za represor, ki se veže na operatorsko regijo DNA, temu pa sledijo strukturni geni. Operon sestavljajo samo operator in strukturni geni. Operator razen mesta za vezavo represorja sestavlja še promotorska regija. Represor je homotetramer enot s po 37 kDa in s po 1 mestom za vezavo induktorja. Na simetrično zaporedje operatorja (22 bp) se veže 4x106-krat močneje kot na nespecifična mesta DNA. V prisotnosti glukoze se mnogi katabolni encimi ne izražajo. Način regulacije imenujemo katabolna represija in vključuje molekule cAMP, ki so pogost iniciator transkripcije pri bakterijah, pa tudi pri sesalcih. Glukoza namreč znižuje intracelularno koncentracijo cAMP in s tem onemogoča aktivacijo mnogih promotorjev. V odsotnosti glukoze pa prihaja do pozitivne regulacije – katabolne aktivacije: pri bakterijah se cAMP veže na protein CAP (katabolni aktivatorski protein), homodimer z enoto 22 kDa, ki ima vezavno mesto za DNA in za cAMP. Kompleks s cAMP se veže na nekatere promotorje in tako stimulira prepisovanje ~50x. V primeru operona lac se mesto za vezavo represorja delno prekriva s promotorjem, medtem ko je mesto vezave CAP tik pred promotorjem. Stimulacija izražanja je mogoča zato, ker CAP, vezan na DNA, predstavlja dodatno površino za vezavo RNA-polimeraze, razen tega pa CAP nekoliko ukrivlja DNA (2x43°), tako kot to počne polimeraza. Skupna značilnost regulatornih proteinov, ki se vežejo na DNA, je prisotnost strukturnega motiva α-vijačnica – zavoj – α-vijačnica s ponovitvijo v oddaljenosti 34 Å; vijačnica prvega dela se veže v veliki žleb DNA in tam interagira z robovi baznih parov, drugi del pa se veže na skelet dvojne vijačnice. Pri regulaciji Trp-operona (sinteza Trp iz prekurzorja) se Trp (korepresor) veže v represorski protein (dimer s po 107 AA) in s tem poveča razdaljo med helikalnima motivoma s 26 Å na 34 Å. Obstajajo pa tudi regulatorni proteini, pri katerih kontaktno regijo z DNA predstavlja β-strukturni element (npr. represor metionina). Možna pa je tudi kontrola izražanja genov na posttranskripcijskem nivoju. Tak primer so operoni za sintezo aminokislin, ki so večinoma kontrolirani preko atenuatorjev. Pri Trp-operonu se na 5'-koncu policistronske mRNA, še pred zapisom za prvi protein, pojavlja 162 b dolgo vodilno zaporedje. Ugotovili so, da z mutacijami v tej regiji lahko vplivajo na nivo sinteze encimov, ki so zapisani v strukturnih genih tega operona. Vodilno zaporedje vsebuje značilni regiji: eno, bogato z GC, za njo pa z AT-bogato regijo, vsako z notranjo simetrijo zaporedja, kot je to značilno za terminatorske regije. Tu lahko pride do kontrolirane terminacije – atenuacije. Pri Trp-operonu gre za dodaten način regulacije, ob regulaciji z represorjem, ko je v mediju prisoten končni produkt reakcije – Trp. Ko se nivo Trp v celici znižuje, represija popusti in RNA-pol začne prepisovati z matrice. Vendar zaradi sekundarne strukture vodilnega zaporedja večina molekul RNA-pol ne more preko tega zaporedja. Bolj, ko se zniža nivo Trp, več molekul polimeraze preide preko atenuatorja. Razlog je v tem, da sta pred terminacijskim signalom dva kodona za Trp in ker v celici zaradi pomanjkanja Trp ni dovolj Trp-tRNA, sinteza proteina na ribosomu nekoliko zastane. Pred ribosomom zato ostane izpostavljena mRNA, ki ustvari drugačno zanko, ta pa ne deluje kot terminator. Polimeraza zdaj lahko nadaljuje s sintezo mRNA – zapisom za encime, ki sodelujejo pri sintezi triptofana. Tak način regulacije je mogoč samo pri prokariontih, kjer sta transkripcija in translacija tesno povezani. Evkariontski kromosomi in izražanje genov Bakterijska celica vsebuje 1000x manj DNA kot človeška. Pri evkariontih je DNA pakirana s pomočjo bazičnih proteinov, histonov, okrog katerih se ovija in tako tvori nukleosome. Kromatin označuje celoten kompleks genomske DNA in proteinov, na katere je navita. Kvasni kromosom je samo 3x večji od bakterijskega, ima pa 16 kromosomov, ki jih med seboj lahko ločimo elektroforezno. Približno 50% mase kromosomov predstavljajo histoni. Poznamo 5 različnih vrst, ki se ločijo po velikosti (11 kDa – 21 kDa) in deležu posameznih bazičnih aminokislin. Histon H1 deluje kot povezovalec med

posameznimi enotami, ostali 4 (H2A, H2B, H3 in H4) pa so v sredini klobčiča, ki ga ovija DNA. Histoni (predvsem H3 in H4) imajo zelo filogenetsko ohranjeno aminokislinsko zaporedje, pogoste pa so modifikacije aminokislinskih ostankov (acetiliranje, metiliranje, fosforiliranje, ADP-riboziliranje). Nukleosom sestavljata po 2 H2A, H2B, H3 in H4 (torej proteinski oktamer) z ovitimi ~200 bp DNA (odvisno od vrste; v neposrednem stiku s histoni je vedno 145 bp oz. 1,75 zavoja). Nekaj DNA povezuje posamezne enote med sabo in celotni strukturi zagotavlja fleksibilnost. V sredini sta H3+H4; H1 se povezuje s H2A in veže linkersko DNA. Zaradi ovijanja se dolžina DNA skrajša z 68 nm na 10 nm na enem nukleosomu (pakirno razmerje 7). Metafazni kromosomi pa so kondenzirani v razmerju104 (intefazni: 100-1000). Obstajajo torej višje stopnje organiziranja DNA: nukleosomi se združujejo v helikalno razmeščene strukture (6 nukleosomov na zavoj, širina 36 nm) s pakirnim razmerjem 40, te pa se razporejajo v zanke ob sodelovanju drugih proteinov. Največje pakiranje je v glavi spermija, kjer namesto histonov nastopajo protamini, bazični proteini, ki po vezavi na DNA zavzamejo helikalno zgradbo. Pri delitvi se histoni prenašajo z vodilno verigo DNA in med delitvijo celo ostanejo vezani na DNA. Mitohondriji in kloroplasti imajo lastno DNA. Človeški mitohondrij vsebuje 16,6 kb DNA in zapisuje za 13 proteinov (7 podenot NADH-Q-reduktaze in podenote citokrom-reduktaze, citokrom-oksidaze in ATP-sintaze), 22 tRNA (nekatere berejo 4 različne kodone) in 2 rRNA. Značilnost evkariontskih genomov je prisotnost velikega deleža zaporedij, ki ne zapisujejo za proteine (samo 2-5% jih zapisuje) in veliko ponavljajočih se zaporedij (>30% genoma vsebuje zaporedja, ki se ponovijo vsaj 20x): SINE – kratke razpršene ponovitve (100-500 bp) in LINE – dolge razpršene ponovitve. Primer SINE so Alu-zaporedja (~300 bp), ki se ponovijo skoraj 106x. Večina SINE izhaja iz zapisov za snRNA. Ponovljeni geni pa so lahko tudi nabrani v nizih, npr. geni za rRNA, ki so nameščeni na delih kromosomov, povezanih z jedrcem, in geni za histone. Vseeno pa za večino pomembnih proteinov obstaja samo 1 kopija gena. Z enega gena se lahko prepiše več tisoč mRNA in če je ta stabilna, lahko vsaka mRNA služi kot matrica za biosintezo tudi 100.000 proteinskih molekul v nekaj dneh (primer fibroina pri sviloprejki). Pri evkariontih poteka regulacija izražanja genov tako kot pri prokariontih na nivoju transkripcije, vendar je tu večina genov utišanih, vse dokler se nanje ne vežejo transkripcijski faktorji. Transkripcijski aktivatorji vsebujejo dve domeni; z eno se vežejo na specifično zaporedje DNA, z drugo pa sodeluje pri tvorbi transkripcijskega kompleksa na škatli TATA. Aktivatorjev pri evkariontih je več in regulacija poteka na nivoju hitrosti tvorbe transkripcijskega kompleksa (RNA-pol ne more začeti prepisovanja, če na škatli TATA niso predhodno vezani pomožni proteini). Strukturni motiv, ki najpogosteje nastopa pri regulatorjih izražanja evkariontskih genov, je cinkov prst. To je zaporedje ~30 AA z 2 Cys in 2 His, ki koordinirajo 1 ion Zn. Na nivoju sekundarne strukture je Zn-prst običajno antiparalelna β-lasnična zanka, ki je preko zavoja povezana z α-vijačnico. Helikalni del prepoznava zaporedje baz in pomnoženi Zn-prsti lahko prepoznajo daljša zaporedja na nivoju DNA. Steroidni hormoni (estradiol, testosteron,...) regulirajo delovanje celic tako, da vstopijo vanjo in se vežejo na specifičen receptorski protein. Kompleks receptor-hormon se v jedru veže na določena nukleotidna zaporedja in jih modulira. Jedrni receptorji so vsi podobno zgrajeni: imajo 66 AA dolgo domeno, ki se veže na DNA in 240 AA dolgo domeno, odgovorno za vezavo hormona. Dokler hormon ni vezan, ta domena preprečuje interakcijo druge domene z DNA. Tarčna zaporedja DNA (odzivni elementi za estrogen – ERE) interagirajo z α-vijačnico, ki se veže v veliki žleb DNA. Po vezavi liganda en helikalni element spremeni svojo lego v molekuli receptorja in s tem omogoči vezavo koaktivatorskih proteinov na receptor. Sam receptor namreč ne more modulirati izražanja genov – vezava koaktivatorjev je bistvenega pomena. Koaktivatorji imajo v svoji zgradbi strukturni motiv levcinske zadrge, pri katerem dimer stabilizirajo Leu-ostanki v obvitem klobčiču. Take domene interagirajo z jedrnim hormonskim receptorjem, druge pa so odgovorne za vezavo na DNA in na še druge proteine. Zdravila, ki delujejo na estrogenske receptorje, se

vežejo na mesto hormona, a zaradi drugačne zgradbe onemogočajo konformacijsko spremembo na receptorju, s tem pa preprečujejo vezavo koaktivatorja. Primer takega zdravila je tamoksifen, ki zavira rast nekaterih tumorskih celic. Koaktivatorji in korepresorji delujejo na DNA s tem, da kovalentno spremenijo aminske konce histonov (in nekaterih drugih proteinov); pogosto pride do acetiliranja lizinskih ostankov, s čimer se spremeni naboj, to pa povzroči zmanjšanje afinitete histona do DNA. Posledično so deli DNA bolj dostopni za transkripcijo. Razen tega so acetilirani histoni vezavna mesta za regulatorne proteine, tiste, ki se vežejo na TBP, pa tudi kompleksne proteine, ki sodelujejo pri preoblikovanju kromatina. Ponovno vrnitev v začetno stanje omogočajo histon-deacetilaze. Acetiliranje proteinov, ki se vežejo na DNA, ima pri uravnavanju transkripcije podoben pomen kot ga ima fosforiliranje pri prenašanju signalov z membranskih receptorjev na površini celice. Biosinteza nukleotidov Nukleotidi niso samo gradniki nukleinskih kislin, pač pa – kot derivati – sodelujejo pri sintezi različnih drugih makromolekul (npr. glikogena, fosfogliceridov). ATP je univerzalni prenašalec energije v bioloških sistemih, GTP pa nastopa pri premikih makromolekul (translokacija na ribosomu). Adeninski nukleotidi so tudi sestavni deli najpomembnejših koencimov: NAD+(nikotinamid-adenin-dinukleotid), FAD (flavin-adenin-dinukleotid) in CoA (koencim A). cAMP uravnava delovanje mnogih hormonov in je torej regulator metabolizma, deluje pa tudi pri regulaciji izražanja genov in kot sekundarni obveščevalec pri prenosu signalov skozi membrane. Nukleotidi v celici nastajajo po dveh poteh: preko sinteze de novo in po reciklažni poti (salvage pathway). Pri tej se purinske baze iz razgrajenih nukleinskih kislin povežejo s fosforibozil-pirofosfatom (PPRP – aktivirano ribozo), kar je energetsko bistveno ugodnejše kot je sinteza iz sestavnih delov. PPRP deluje kot splošni aktivator spojin z dušikovim obročem. Nastaja iz riboza-5-fosfata ob pretvorbi ATP v AMP. Ko se na PRPP veže purin, nastane purinski ribonukleotid ob odcepu PPi. Izhodne molekule za sintezo de novo so aminokisline, derivat tetrahidrofolata, NH4

+ in bikarbonat. Pirimidinski obroč nastane iz karbamoil-fosfata (ta je tudi prekurzor pri sintezi uree, a pri evkariontih prva poteka v citoplazmi, slednja pa v mitohondriju ob sodelovanju različnih encimov) in aspartata. Karbamoil-fosfat je iz bikarbonata, 2 fosfatnih skupin iz 2 ATP in amonijaka. Ključni encim pri sintezi obroča je aspartat-transkarbamoilaza. Ribozno-fosfatna skupina prihaja iz PRPP (fosforibozil-pirofosfata) in reagira z orotatom; nastane uridilat (UMP). Celotna sinteza pri E. coli zahteva delovanje 6 nepovezanih encimov, pri evkariontih pa je 5 od teh povezanih v dva kovalentna encimska kompleksa – s tem se encimi, ki sodelujejo v isti poti, sintetizirajo hkrati, so bolj stabilni in verjetnost stranskih reakcij je zmanjšana. Aktivne oblike nukleotidov so trifosfatne. Monofosfatne prehajajo v difosfatne s pomočjo kinaz; fosfatna skupina prihaja v 1.stopnji z ATP, v drugi pa s kateregakoli NTP (difosfat-kinaze so manj specifične od monofosfat-kinaz). CTP nastaja z aminacijo UTP; pri evkariontih prihaja amino-skupina z glutamina, pri E. coli pa z amonijaka, vsakič ob porabi ATP. Purinski obroč nastaja iz aminokislin (Gly, Asp, Gln), tetrahidrofolatnih derivatov in CO2. Riboza-fosfatni del pride tudi tu od PRPP; na njem se sintetizira obroč preko 5-fosforibozilamina (ob pretvorbi Gln v Glu). Po vezavi Gly, N10-formil-tetrahidrofolata (THF), Gln in ob vložku energije kot ATP nastane 5-členski obroč 5-aminoimidazol-ribonukleotida. Sledi dodajanje komponent drugega, 6-členskega obroča, kar poteka v 5 stopnjah ob dodajanju CO2, Asp in formil-THF ter ob porabljanju ATP, izločata pa se fumarat in voda. Končni produkt teh reakcij je inozinat (IMP) s ksantinom kot purinsko bazo. IMP nato služi kot osnova za sintezo AMP (ob dodatku Asp in odcepu fumarata) in GMP (dodatek Gln in energije). Regulatorji sinteze purinov so AMP, GMP in IMP, ki delujejo kot povratni inhibitorji v več stopnjah biosinteze.

Deoksiribonukleotidi nastajajo z redukcijo ribonukleotid-di- ali tri-fosfatov ob delovanju encima ribonukleotid-reduktaze in z NADPH kot reducentom. Elektroni z NADPH pa prehajajo na substrat preko serije prenosnikov (flavin, mali proteini z –SH-skupinami, atomi železa, ki generirajo tirozilni radikal). dTMP nastaja iz dUMP z metilacijo. Timidilat sintaza prenaša metilno skupino z metilen-THF, ki pri tem preide v dihidrofolat. Slednji se z reducentom NADPH regenerira v THF (+NADP+). Več zdravil proti raku deluje na nivoju sinteze dTMP (npr. fluorouracil) ali regeneracije THF (aminopterin). NAD+ (nikotinamid-adenin-dinukleotid) se sintetizira iz nikotinata (=niacin, izhaja iz triptofana) in PRPP ter amida, ki izvira iz Gln. Razgradnja nukleotidov poteka do sestavnih enot. Del baz se obnavlja skozi reciklažno pot za sintezo novih nukleotidov, del riboza-fosfata gre za prekurzorje sinteze PRPP. Purini se pri človeku v več stopnjah razgradijo do urata. Zaradi nizke topnosti (7 mg/100 ml seruma) se pri nekaterih ljudeh odlaga v ledvicah in sklepih – putika. Zgradba in dinamičnost membran Membrane omejujejo celice in razdelke. Sestavljene so iz lipidov in proteinov in so selektivno prepustne. Kanali in črpalke uravnavajo sestavo celice, receptorji pa uravnavajo pretok informacij med okoljem in celico. Na membranah, bogatih z encimi, potekajo tudi procesi pretvorbe energije, kot je to pri fotosintezi in oksidativni fosforilaciji. Memebrane so debele 6-10 nm. Delež proteinov je 25-400% mase lipidov. Ogljikovi hidrati so lahko vezani na lipide ali proteine. Membranski lipidi so majhne molekule s hidrofobnim in hidrofilnim delom (amfipatične molekule): polarna glava, 2 nepolarna repa. Lipidni dvosloj se lahko ustvari spontano in predstavlja bariero za polarne molekule. Membrane so nekovalentni združki – proteini in lipidi so povezani z nekovalentnimi interakcijami. Notranja in zunanja stran membrane imata različno sestavo (asimetričnost membran). Molekule v membrani niso čvrsto vezane – gre za tekočo strukturo: so dvodimenzionalne raztopine orientiranih molekul. Večina membran je električno polariziranih (notranjost je –60 mV glede na zunanjost), kar je pomembno za transport, pretvorbo energije in vzdražnost. Lipidi so v vodi netopne molekule, ki v organizmu služijo kot zaloga energije, signalne molekule in sestavine membran. V membranah nastopajo predvsem fosfolipidi, glikolipidi in holesterol. Pri fosfolipidih in glikolipidih nastopajo maščobne kisline z običajno parnim številom C-atomov (14-24; najpogosteje 16 ali 18); lahko so nasičene ali nenasičene. Dolžina in nasičenost vplivata na topnost. Fosfolipidi so derivati glicerola (fosfogliceridi) ali sfingozina. Najenostavnejši fosfoglicerid je fosfatidat, pri katerem pa se fosfatna skupina pogosto zaestri z različnimi alkoholi, tako da dobimo fosfatidil-serin, f.-etanolamin, f.-inozitol, f.-holin, itd. Edini negliceridni fosfolipid v membranah je sfingomielin, pri katerem kot alkohol nastopa sfingozin, amino-alkohol z dolgo nenasičeno verigo iz ogljikovodikov, na aminsko skupino pa je vezana 1 molekula maščobne kisline. Glikolipidi imajo na sifingozin vezan mono- (cerebrozid) ali oligosaharid (do 7 enot; gangliozidi). Holesterol je evkariontski lipid, prisoten v celičnih membranah večine živalskih celic in spada med steroide iz 4 povezanih ogljikovodikovih obročev. V vodi lipidi spontano tvorijo micele (2r<20 nm) ali dvoslojne membrane (2r~1 mm) - za večino fosfo- in glikolipidov je ugodnejša tvorba membran, ker so repi preveliki za stiskanje v notranjosti micela. Membrane same težijo k zapiranju v vezikle (liposome). V laboratoriju jih lahko pripravimo sami in vanje vključimo snovi, ki jih hočemo spraviti v celico ali snovi, ki jih hočemo preučevati, kako prehajajo skozi lipidni dvosloj. Membrane so slabo prepustne za ione in polarne molekule, kar pa ne velja za vodo, ker je majhna in je njena koncentracija v celici in izven nje visoka. Prehajanje polarnih snovi omogočajo črpalke in kanalčki.

Večino membranskih funkcij opravljajo proteini. Integralni proteini večinoma prehajajo skozi membrano in interagirajo z ogljikovodiki lipidov. Periferni proteini pa so vezani na membrano predvsem preko elektrostatskih in vodikovih vezi; pogosto se vežejo na integralne proteine. Lipidi v membrani so mobilni; lateralna difuzija poteka hitro, transverzalna (flip-flop) pa redko (vsakih nekaj ur). Singer in Nicholson sta 1972 zato predlagala 'fluidni mozaični model' bioloških membran: membrane so dvodimenzionalne raztopine orientiranih lipidov in globularnih proteinov. Vse biološke membrane so asimetrične. Značilen primer je Na-K črpalka, ki lahko črpa Na samo iz celice in K samo v celico ob prisotnosti ATP v celici. Tudi membrane so različno zgrajene; npr. celična membrana pri Gram-negativnih in Gram-pozitivnih bakterijah. Ogljikovodikovi repi lipidov v membranah so lahko v urejeni, rigidni obliki, ali pa v neurejenem, fluidnem stanju, kar je odvisno od temperature. Temperatura prehoda med oblikama je odvisna od dolžine in stopnje nenasičenosti ogljikovodikovih verig. Rigidna oblika je bolj stabilna pri dolgih in pri nasičenih verigah kot pri nenasičenih, kjer pride do tvorbe kolena in s tem krajše regije interagiranja s sosednjim lipidom – Tm se zniža. Prokarionti uravnavajo fluidnost membran preko spreminjanja dolžine in nasičenosti lipidov (rast pri nižji temperaturi – več nenasičenih maščobnokislinskih verig). Pri evkariontih ima regulatorno vlogo tudi holesterol; ki interagira s sosednjimi lipidnimi molekulami. Za študij evkariontskih membran so zelo primerni eritrociti, ki nimajo notranjih membran, vsebino celic pa lahko sprostimo s osmoznim šokom. Analiza membran je pokazala, da vsebujejo tudi ogljikove hidrate. Večinoma so vezani na transmembranski protein glikoforin A, ki ima na N-koncu (zunanja stran membrane) 16 glikozilacijskih mest, ki skupaj prispevajo 60% mase glikoproteina (skupaj ~100 monosaharidnih enot; pogosta je sialinska kislina, ki je negat. nabita in daje eritrocitom anionski plašč in preprečuje prijemanje na stene žil ali na druge celice). Transmembranske regije je mogoče z gotovostjo napovedati na osnovi aminokislinskega zaporedja – nepolarne helikalne regije dolžine ~20 ostankov. Graf hidropatičnosti pokaže regije na proteinu, ki ustrezajo kriterijem za transmembransko regijo. Transmembranske regije pa se lahko oblikujejo tudi iz prečno razporejenih β-struktur. Membranski kanalčki in črpalke Prepustnost membran zagotavljata dve skupini alosteričnih proteinov: kanalčki in črpalke. Kanalčki omogočajo pretok ionov skozi membrano v termodinamsko ugodni smeri (olajšana difuzija ali pasivni transport), črpalke pa prenašajo ione ali molekule preko membrane ob porabi energije (kot ATP ali svetloba; aktivni transport). Acetilholin je nevrotransmiter, ki posreduje živčne impulze preko sinaps. Sinaptična reža (50 nm) ločuje predsinaptično membrano s sinaptičnimi vezikli od postsinaptične. Vezikli vsebujejo po ~10.000 molekul acetilholina. Ob impulzu se sprosti vsebina ~300 vezikov v sinapso in koncentracija acetilholina v reži se dvigne z 10 nM na 0,5 mM v manj kot 1 milisekundi. Acetilholin se veže na postsinaptično membrano in spremeni njeno prepustnost za Na in K-ione. Na-ioni vstopajo v celico, s tem depolarizirajo membrano in sprožijo akcijski potencial. Acetilholin povzroči odprtje kationskega kanala, ki je enako prepusten za Na in K, vendar Na vstopa hitreje kot izstopa K, to pa zaradi večje razlike v koncetraciji. Acetilholinski receptor iz elektr. skata je 5-mer s 4 različnimi podenotami (skupna masa 268 kDa) razmeščenimi okrog kanalčka. Vezavni mesti za acetilholin sta na sinaptični strani. Kanalček ima na konceh premer ~20 Å, v sredini, kjer je najožji, pa 10 Å. Po dodatku acetilholina se receptorski kanal prehodno odpre; steče tok 4 pA pri membranskem potencialu –100 mV, to pa ustreza pretoku 2.5 x 107 Na-ionov/s. Acetilholinski receptor je predstavnik z ligandom uravnavanih kanalčkov. V kratkem času po dodatku nevrotransmiterja pride do večkratnega odprtja in zaprtja kanalčka. Do vezave acetilholina pride v <100 µs. Vezava povzroči strukturno spremembo in kanalček se odpre za ~1 ms, saj acetilholin v sinaptični reži hitro razpade do acetata in holina ob delovanju acetilholin-esteraze, ki je

zasidrana v postsinaptični membrani. Organski fluorofosfati delujejo kot inhibitorji acetilholin-esteraze, zato jih uporabljajo kot insekticide in kot živčne bojne strupe. Kanalček je prepusten samo za katione, ker ima skupaj 3 obroče negativno nabitih aminokislinskih ostankov, ki preprečujejo prehod anionom. Notranjost nevronov (pa tudi drugih celic) je bogata s K-ioni, zunanjost pa z Na-ioni, kar vzdržujejo ionske črpalke ob porabi ATP. Akcijski potencial, ki sproži živčni impulz, nastane ob depolarizaciji membrane nad –40 mV (membranski potencial nevzdražene celice je -60 mV). Od tu dalje proces jačanja potenciala in širjenja impulza po nevronu prevzemajo drugačne molekule. V 1 ms se membranski potencial dvigne do ~+30 mV, nato pa se ponovno zniža. Do depolarizacije pride zaradi spremembe v prevodnosti membrane aksonov za Na- in K-ione. Obstajati morata dva različna kanalčka, ki sta odvisna od napetosti, eden za Na- drugi za K-ione. Najprej se odprejo Na-kanalčki zaradi velikega elektrokemičnega gradienta teh ionov. Vdor Na v celico povzroči nadaljnjo depolarizacijo membrane (pozitivna povratna zveza). Natrijevi kanalčki se nato spontano zaprejo, odprejo pa se K-kanalčki. Zaradi izhajanja K-ionov se v nekaj ms ponovno vzpostavi mirujoči membranski potencial in prevodnost za K se vrne na normalno. Na-kanalček je 11x bolj prehoden za Na kot za K, K-kanalček pa >100x bolj za K kot za Na-ione. Študij delovanja kanalčkov je omogočil tetrodotoksin, močan strup – nevrotoksin iz ribe napihljivke (fugu), ki preprečuje prevajanje živčnih impulzov (ustavi se dihanje zaradi blokade Na-kanalčkov). Podobno učinkuje tudi saksitoksin iz kremenastih alg, ki lahko preide v školjke in povzroča zastrupitve. Izoliran Na-kanalček iz električne jegulje je enoverižen protein z mol. maso 260 kDa; pri sesalcih je več verig (2 kratki β1 in β2 ter 360 kDa enota α) in skupna masa je nekoliko večja. Kanalček ima 4 podobna ponovljena zaporedja, vsako pa ima po 5 hidrofobnih segmentov in enega (S4), ki je močno pozitivno nabit in ima vlogo senzorja napetosti. Skozi kanalček potujejo lahko samo ioni s premerom <5 Å (v hidratirani obliki). Tudi K-kanalček ima nabit segment S4, kot so ugotovili na osnovi analiz cDNA. Kanalčke so študirali pri mutanti vinske mušice imenovane 'shaker' in ugotovili, da obstaja 5 različnih mRNA za K-kanalčke. Protein je velik le 70 kDa, a se sestavlja v tetramer, ki tvori kanalček. Tudi Ca-kanalčki imajo podobno četverno zgradbo. Premer K-kanalčka je le 3 Å, kar pomeni, da lahko prehajajo le ioni v nehidratirani obliki. Čeprav je Na-ion sicer manjši od K-iona, slednji prehaja skozi kanalček 100x hitreje. Razlog je v tem, da je za dehidracijo Na-iona potrebne več energije kot za dehidracijo K-iona. Tako Na- kot K-kanalček se inaktivirata nekaj milisekund po odprtju. Mutanta K-kanalčka, ki ji manjka 42 aminokislinskih ostankov na N-koncu, se ne more inaktivirati, razen če ji dodajo peptid (20-mer), ki ima zaporedje identično samemu N-koncu. Ta poskus podpira model krogle in verige: krogla je citoplazemski del, ki pri zaprtem kanalčku prosto rotira. Ko se kanalček odpre, pa krogla najde komplementarno mesto ob ustju in ga zapre. Presledkovni (votli) stiki med sosednjimi celicami imajo premer 20 Å in dolžino 35 Å. Prehajajo lahko male hidrofilne molekule (do 1 kDa) in ioni. Kanalček je sestavljen iz 12 molekul koneksina (32 kDa), po 6 z vsake strani. Kanalčki so odprti do več minut; zaprejo se ob povečanju konc. Ca-ionov ali ob nizkem pH v eni od celic (znak odmiranja). Kanalčki so enako prepustni za ione v obe smeri; smer neto pretoka je odvisna od termodinamskega gradienta. Za aktivni transport proti gradientu je potreben vložek energije. Za ionske razmere v živalskih celicah (veliko K, malo Na) je odgovorna Na-K črpalka. Tretjino ATP v mirujočem organizmu se porabi za vzdrževanje ionskih razmer Na in K. Na-K črpalka je sestavljena iz 2α (112 kDa) in 2β (35 kDa) podenot. α-podenota ima 8 transmembranskih heliksov; ATPazno mesto je na citoplazemski strani α-verig. Fosforilacija poteče ob prisotnosti Na ali Mg-ionov. Fosfatna skupina z ATP fosforilira stransko skupino aspartata na ATPazi; nastane β-aspartilni fosforilni intermediat (E-P), ki se hidrolizira le v prisotnosti K-iona. Ob porabi 1 ATP preidejo v 10 ms membrano 3 Na- in 2 K-iona.

Nekateri rastlinski steroidi – kardiotonični steroidi - so inhibitorji Na-K črpalke, npr. digitoksigenin (iz rastline Digitalis purpurea = naprstec). Delujejo na stopnji defosforilacije, če so prisotni na zunajcelični strani membrane. Kot zdravilo delujejo tako, da povečujejo moč krčenja srca. Zaradi inhibicije črpalke pride do povečane koncentracije Na znotraj celice, posledično pa tudi počasnejšega izločanja Ca preko Na/Ca izmenjevalca. Zaradi več Ca v notranjosti se ojača krčenje mišice. V nevzdraženi celici je konc. Ca 0,1 µM, zunaj celice pa 1.500 µM. Razmere vzdržujeta 2 transportna sistema: Ca-ATPaza in Na-Ca izmenjevalec, ki črpa energijo iz prehoda Na-ionov skozi membrano. V mnogih celičnih razdelkih je konc. Ca višja kot v citoplazmi, tako na primer v ER (skeletne mišice imajo sarkoplazemski retikulum, SR). Da se mišica skrči, mora priti do hipnega povečanja konc. Ca v citoplazmi, sprosti pa se zaradi hitrega odvzema Ca. Zato 50% površine SR pokrivajo Ca-ATPaze, ki tam predstavljajo 80% vseh integralnih membranskih proteinov (25.000 molekul / µm2). Mehanizem delovanja je enak kot pri sorodni ATPazi v celični membrani. Asp-ostanek ATPaze se prehodno fosforilira preko ATP v prisotnosti Ca2+ (ali Mg2+). Ob tem pride do konformacijske spremembe, ki ji sledi še ena ob defosforilaciji (hidroliza v prisotnosti Mg2+). Encim ima torej 2 konformacijski obliki (E1 in E2). Stopnje v prenosu so: vezava Ca-ionov, fosforilacija ATPaze, preklop strukture (v E1) in odprtje pore, sprostitev Ca-ionov, hidrolizni odcep Ca-ionov, preklop strukture (vE2) in zaprtje pore. Ob preklopu v E2 se afiniteta za ione zmanjša 1000x. Ca-ATPaza iz SR ima Mr=110 kDa in ima trojno strukturo: citosolni del je velik (vsebuje mesto za vezavo ATP in fosforilacijsko domeno) in je pripet na transmembransko domeno (10 heliksov), v SR pa je le majhen del molekule. Ca-iona se vežeta v osrednji transmembranski del. Na podoben način kot Ca-ATPaza delujejo tudi Na-K črpalka in nekatere druge membranske črpalke. Za aktivni transport pa energija ne pride vedno od ATP, pač pa je lahko prenos ionov proti gradientu povezan s transportom drugega iona v smeri gradienta: npr. Na-Ca izmenjevalec. S 3 Na-ioni, ki preidejo v celico, se 1 Ca-ion izloči. Da pa je tak pretok možen, mora Na-K črpalka najprej ustvariti ustrezen nivo Na-ionov zunaj celice. Na-Ca izmenjevalec ima manjšo afiniteto do Ca-ionov kot Ca-ATPaza, a je bolj zmogljiv (2.000 molekul/s proti 30/s) in lahko zniža koncentracijo Ca v citosolu do µM koncentracije, nižje pa deluje ATPaza. Na splošno pa velja, da je pretok ionov preko kanalčkov bistveno hitrejši kot pretok s pomočjo črpalk. Na-gradient preko membrane je lahko povezan s prenosom drugih ionov ali snovi v isto smer (simporter; npr. Na in glukoza v celico) ali obratno smer (antiporter). Sistem simporterjev in antiporterjev je evolucijsko star; zelo znan je simporterski sistem prehoda laktoze preko membrane E. coli s pomočjo laktoza-permeaze (47 kDa integralni membranski protein). Transport deluje, če je zunanjost bolj kisla od notranjosti – vnos protona in laktoze poteka hkrati. Gradient protonov pa nastaja ob toku elektronov skozi dihalno verigo. Kaskade prenašanja signalov Celice se odzivajo na razmere v okolju. Zaznavanje in procesiranje signalov poteka preko kaskad, v katerih sodelujejo receptorji, encimi, kanalčki in regulatorni proteini. Izvajajo detekcijo, ojačanje in integriranje signalov iz okolja. Receptorji sprejmejo signal iz okolja. Za prenos signalov so odgovorni sekundarni obveščevalci; njihova prednost je, da se prosto gibljejo po celici in da se ob prenosu s primarnih na sekundarne obveščevalce signal lahko ojača. Ker so sekundarni obveščevalci enaki za različne vrste dražljajev, pride do medsebojnega vplivanja signalnih poti in skupnega odgovora. Prenos informacije pogosto vključuje fosforilacijo proteinov. Sekundarni obveščevalci povzročijo odgovor preko aktivacije protein-kinaz, ki prenašajo fosfatno skupino z ATP na Ser, Thr ali Tyr ostanke. Signalni proces se ustavi z delovanjem fosfataz, ki spet odcepijo fosfatno skupino s proteina. Značilna skupina receptorjev so 7TM-receptorji (imajo 7 transmembranskih vijačnic). Sposobni so zaznati različne dražljaje in danes je znanih že več tisoč takih receptorjev. Med njimi so receptorji za svetlobo

(rodopsin; se odziva na fotone) in za kemične dražljaje (β-adrenergični receptor za epinefrin = adrenalin). Ob vezavi liganda pride do konformacijske spremembe na dveh delih receptorja: zunaj in znotraj celice. Zaradi te spremembe pride do aktivacije G-proteinov (proteini, ki vežejo gvanil-nukleotid), ta pa aktivira adenilat-ciklazo, ki sintetizira cAMP iz AMP. V neaktivirani obliki je na G-protein vezan GDP. Protein je heterotrimer (α veže nukleotid, β je propelerska β-struktura, γ sestavljata 2 α-vijačnici, vezani na β), ki je s podenotama α in γ preko kovalentno vezanih maščobnih kislin vezan na membrano. Receptor z vezanim ligandom povzroči izmenjavo GDP z GTP na G-proteinu. Ob tem podenota α oddisociira iz trimera, saj tri regije, ki so bile prej proste (stikala I-III), zdaj interagirajo z GTP. Odcep Gα je znak, da je na receptor vezan ligand. Ena molekula receptorja z vezanim ligandom lahko povzroči strukturno spremembo več sto molekul G-proteina, kar privede do ojačanja signala. Vsi receptorji 7TM so povezani z G-proteini in jih imenujejo tudi GPCR (z G-proteini povezani receptorji). G-proteinov pa je več vrst (morda >1000) in interagirajo z različnimi receptorji. Obstaja 15 genov za Gα, 5 za Gβ in 10 za Gγ. Aktivirani G-proteini prenašajo signale preko vezave na druge proteine.β-adrenergični receptor po vezavi epinefrina veže G-protein, ki se nato poveže z adenilat-ciklazo. Ta ima 12 transmembranskih heliksov, na intracelularni strani pa dve katalitski domeni. Po vezavi Gα se encimska aktivnost ciklaze poveča in nastaja cAMP. Gα ima lastno GTPazno aktivnost, ki pa je šibka, zato traja nekaj sekund do minut, da se GTP hidrolizira; takrat pride do prekinitve signalne poti in celica je sposobna za sprožitev novega signala: Gα se poveže v heterotrimer in G-protein je ponovno pripravljen za fosforilacijo. Prekiniti pa se mora tudi povezava med ligandom in receptorjem: pride do disociacije (odvisno od koncentracije liganda) in do fosforilacije Ser in Thr na C-koncu receptorja s pomočjo kinaze, na tako spremenjen del molekule pa se lahko vežejo druge molekule (npr. beta-arestin) in ovirajo vezavo G-proteinov. Povečana koncentracija cAMP lahko deluje na različne celične procese in to pri evkariontih preko protein-kinaze A (PKA). Ta ima 2 regulatorni (R) in 2 katalitski (C) verigi. Brez cAMP je kompleks neaktiven, po vezavi cAMP na R-verigi pa se sprostita aktivni C-verigi, ki nato fosforilirata Ser in Thr ostanke mnogih proteinov. 7TM-receptorji in G-proteini pa lahko delujejo tudi preko drugih molekul, ne samo preko cAMP; drug pogost sekundarni obveščevalec je fosfoinozitid, ki nastane po cepitvi membranskega fosfolipida PIP2 (fosfatidil-inozitol-bifosfat) s fosfolipazo C. Na 7TM-receptor se veže hormon (npr. vazopresin), to pa preko Gα aktivira fosfolipazo C-beta. PIP2 se razcepi na ITP (tôpen) in diacilglicerol (ostane v membrani). Obstaja več izooblik fosfolipaze C, a pri prevajanju signalov deluje le izooblika β, ki ima v svojem jedru katalitsko domeno, okrog nje pa so nameščene domene, ki interagirajo z membranskimi komponentami. N-terminalni del predstavlja domena, homologna plekstrinu (PH), ki veže PIP2. Po vezavi G-proteina na C-konec fosfolipaze, encim preide v aktivno konformacijo; domeni PH in C2 interagirata z membrano in približata aktivno mesto substratu, nato pa pride do cepitve PIP2. Oba razpadna produkta sprožita dodatne signale v prenašalni kaskadi. ITP (=IP3) sproži povečanje koncentracije Ca-ionov v celici zaradi sproščanja teh ionov iz ER (SR), kar je polsedica vezave ITP na IP3-receptor, ki deluje kot kanalček. Sestavljen je iz 4 enakih podenot in tvori K-kanalčku podobno poro. Po vezavi 3 molekul ITP na citosolno stran receptorja pride do prehoda Ca2+. ITP je kratkoživa oblika (do nekaj sekund), ki se pretvori v derivate, ki ne odpirajo kanalčka – npr. tetrafosfat, inozitol,... Diacilglicerol pa aktivira protein-kinazo C (PKC), ki fosforilira Ser in Thr pri mnogih proteinih. PCK veže diacilglicerol preko domen C1A in B. Na N-koncu je kratko zaporedje, podobno substratu (psevdosubstrat) – gre za podobnost s PKA. Po cepitvi PIP2 se domeni C1A in B vežeta na diacilglicerol in PCK se še preko domene C2 zasidra na membrano, psevdosubstrat pa potegne iz aktivnega mesta kinaze. IP3 in diacilglicerol delujeta v tandemu: IP3 zvišuje koncentracijo Ca-ionov, ti pa spodbujajo aktivacijo PKC in zvišujejo aktivnost fosfolipaze C. Tudi diacilglicerol se hitro fosforilira ali hidrolizira (nastajajo še drugi signalni produkti, npr. prostaglandin).

Kalcij ima pomembno vlogo pri prenašanju signalov. Razen tega, da sodeluje pri fosfoinozitidni kaskadi, deluje tudi direktno. Prednosti Ca-ionov so v tem, da je znotrajcelična koncentracija zelo nizka, sistemi za odpiranje rež učinkoviti, vezava na proteine pa dovolj kompleksna, da omogoča najrazličnejše efekte in strukturne spremembe. Pri skoraj vseh evkariontskih celicah je senzor za Ca kalmodulin (CaM). Ima maso 17 kDa in 4 vezavna mesta za Ca. Ko znotrajcelična konc. Ca2+ naraste nad 500 nM, se CaM aktivira ob vezavi Ca-ionov. Vezavni motiv za Ca imenujemo EF-roka (heliks-zanka-heliks). Sodeluje 6 O-atomov na proteinu in en na molekuli vode. Neaktiviran CaM ima dve povezani domeni s po 2 EF-rokama, ki pa imata aminokisl. ostanke, ki bi lahko vezali Ca, obrnjene navzven. Ob vezavi Ca se obrnejo navznoter, na površino pa se obrnejo bolj hidrofobni ostanki, ki lahko interagirajo z drugimi proteini. Značilna predstavnika sta CaM-kinaza (od kalmodulina odvisna protein-kinaza), ki fosforilira več tarčnih proteinov, in Ca-ATPaza, ki znižuje znotrajcelično koncentracijo Ca-ionov in tako pomaga pri ustavitivi signala. Nekateri receptorji ob vezavi liganda ne spremenijo konformacije (kot 7TM), pač pa pride do spremembe na nivoju kvartarne strukture: nekateri ligandi povzročijo dimerizacijo receptorja (npr. receptor za rastni hormon). Z dimerizacijo se aktivira protein-kinaza, ki fosforilira in s tem aktivira trankripcijski faktor. Receptorja za epidermalni rastni faktor in za inzulin pa imata kot sestavni del Tyr-kinazo. Ob dimerizaciji pride do navzkrižne fosforilacije, tako aktivirani deli pa služijo kot sidrišča za SH2-domene signalnih proteinov. Pogosto sodeluje v tovrstnih transportnih poteh mala GTPaza Ras, ki prevzame funkcijo G-proteina in se tudi podobno aktivira (obliki z GDP/GTP). Mutacije v genih za prenašanje signalov privedejo do bolezni, večinoma do raka (mutirani geni – onkogeni, nemutirani - protoonkogeni). Uvod v metabolizem Med najbolj temeljnimi vprašanji v biokemiji sta: Kako celica iz okolja dobiva energijo in redukcijsko moč in Kako celica sintetizira gradbene elemente (gradnike) za makromolekule in makromolekule same. Procesi, ki zagotavljajo energijo, reducente, gradnike in makromolekule, potekajo v prepletenih biokemijskih reakcijah, ki jih imejujemo metabolizem. Kljub ogromnemu številu reakcij in njihovi zapletenosti pa najdemo v metabolizmu mnoge skupne motive, na primer uporabo iste energetske valute in sorazmerno ozko število aktiviranih intermediatov, pa tudi mehanizem biokemijskih reakcij je sorazmerno preprost. Živa bitja rabijo energijo za mehansko delo, aktivni transport molekul in ionov in za sintezo bioloških molekul iz prekurzorjev. Energija lahko prihaja samo iz okolja. Fototrofi sončno energijo uporabljajo za pretvorbo energetsko revnih molekul v bolj zapletene molekule, ki služijo kot goriva. Fotosinteza je najpomebnejši vir kemijske energije za večino organizmov, tudi za človeka. Kemotrofi dobivamo kemijsko energijo z oksidacijo hranil, ki so jih ustvarili fototrofi. Metabolizem prestavlja povezane kemijske reakcije, ki se začnejo z eno molekulo in končajo z drugo in potekajo po točno določenih načelih. Takih kemijskih poti je v celici veliko in so med seboj povezane. Za koordinirano aktivnost poti skrbijo predvsem alosterični encimi. Na splošno metabolizem sestavljata dve skupini reakcij: katabolične, ki pretvarjajo celična goriva v kemijsko energijo, in anabolične, ki energijo porabljajo za sintezo kompleksnih molekul. Govorimo o katabolizmu in anabolizmu, pri čemer je včasih točno mejo med njima težko potegniti. Poenostavljeni reakciji bi bili:

a) katabolizem: goriva (oglj. hidrati, maščobe) CO2 + H2O + uporabna energija b) anabolizem: uporabna energija + male molekule kompleksne molekule

Metabolične poti morajo biti sestavljene iz specifičnih reakcij (točno določeno je, kaj vstopa in kaj nastaja, za kar skrbijo encimi) in celotna pot mora biti termodinamsko ugodna. Termodinamsko neugodne reakcije pa vendarle lahko tečejo, če so povezane s termodinamsko ugodnimi. Na primer, če v eni reakciji metabolične poti iz A nastajata B in C, a je to termodinamsko neugodno (sprememba proste energije >0), v drugi pa se produkt B pretvarja v D in je to termodinamsko ugodno, lahko ta (druga) reakcija poganja prvo.

Pri katabolizmu je ključna naloga nastanek ATP, reducirajoče moči in gradnikov za biosintezo. ATP je univerzalna enota energije, ker ima sposobnost prenašanja fosforilne skupine. Zato sodeluje pri krčenju mišic, aktivnem transportu, ojačanju signalov in biosintezi. ATP je energetsko bogata molekula, ker vsebuje dve fosfoanhidridni vezi; pri njuni hidrolizi se sprosti veliko proste energije. Razgradnja je možna na dva načina: ATP + H2O ↔ADP + Pi (ortofosfat) (-7 kcal/mol), ali pa ATP + H2O ↔ AMP + PPi (pirofosfat) (-11 kcal/mol) Sproščena prosta energija poganja različne reakcije, po drugi strani pa se ATP ponovno sintetizira pri oksidaciji goriv (kemotrofi) in pri zajemu svetlobe (fototrofi). Osnovni način izmenjave energije v bioloških sistemij je ravno kroženje med ATP in ADP. Vendarle pa pri nekaterih rekacijah namesto ATP nastopajo drugi nukleotidi (GTP, UTP, CTP). Derivata ATP pa sta tudi prenašalca elektronov v metabolizmu, NAD+ in FAD. Hidroliza 1 ATP spremeni ravnotežno razmerje in hitrost sklopljene reakcije za 108x – tako termodinamsko sicer neugodne reakcije lahko potečejo ob hkratni hidrolizi zadostnega števila molekul ATP. ATP je učinkovit donor fosforilne skupine (npr. v primerjavi z glicerol-fosfatom) – pravimo, da ima visok potencial prenosa fosforilne skupine. Vzroka za to je velika razlika med prostimi energijami reaktantov (ATP) in produktov (ADP in Pi). Pi in ADP imata močno resonančno stabilizacijo, voda pa se na produkta veže bolj učinkovito in s tem stabilizira molekuli. Na drugi strani pa je ATP šibko stabilen zaradi odbijajočih se bližnjih negativnih nabojev na molekuli, pa tudi voda se nanj težje veže. Vendar pa ATP nima najvišjega potencial prenosa fosforilne skupine. Fosfoenolpiruvat (PEP), kreatinfosfat in 1,3-bisfosfoglicerat (BPG) imajo višji potencial, zato lahko oddajo fosforilno skupino na ADP, pri čemer se regenerira ATP. ATP je neposredni donor proste energije, dolgoročno pa je energija shranjena v drugih vrstah molekul. Količina ATP v telesu je ~100 g, vendar pa ga človek dnevno porabi ~40 kg, kar pomeni, da je njegovo kroženje zelo hitro. ATP nastaja ob oksidaciji ogljika iz gorivnih molekul do CO2. Pri aerobnih organizmih je končni akceptor elektronov kisik, oksidacijski produkt pa CO2. Bolj ko je ogljik reduciran, več energije lahko iz njega dobimo z oksidacijo. Pri kompleksnih gorivih se oksidira le po en C-atom naenkrat. Način nastajanja ATP pri oksidaciji goriv dobro ponazarja naslednji primer. Pri oksidaciji glukoze nastaja kot intermediat gliceraldehid-3-fosfat (GAP). Da bi ta aldehid (-CHO) prešel v kislino (-COOH), oksidacija ne poteče direktno, pač pa preko fosforiliranega intermediata BPG (-COOPO3

2-). Pri tem sproščeni elektron zajame NAD+ ( NADH). BPG, ki ima visok potencial prenosa fosforilne skupine, fosforilira ADP, ob tem pa se acilfosfat zamenja z –OH in nastane 3-fosfoglicerna kislina. Večino sinteze ATP v celicah poganja elektrokemični potencial ionskih gradientov skozi membrane. Ti gradienti nastajajo pri fotosintezi ali pri oksidaciji goriv. Pri živalih 90% ATP nastane s protonskimi gradienti ob oksidaciji ogljika v gorivih: oksidativna fosforilacija. Pri ekstrakciji energije iz hranil ločimo 3 stopnje: razgradnja velikih molekul iz hranil do majhnih, razgradnja malih molekul do preprostih enot, ki so ključne za metabolizem (predvsem acetilkoencim A) in tvorba ATP (s popolno oksidacijo acetilkoencima A). V prvi stopnji še ne nastaja uporabna energija, nastajajo le hidrolizni produkti polimernih hranil. V 2. stopnji nastane le malo ATP, večina pa v 3. stopnji, ki vključuje cikel citronske kisline in oksidativno fosforilacijo. Metabolizem je bolj pregleden, kot se sprva zdi, ker vključuje nekatere skupne metabolite, podobne reakcije in regulacijske postopke. Več različnih metaboličnih poti vključuje enake aktivirane prenosnike (ATP, NADH, Ac-CoA). ATP in NADPH neprestano nastajata in se porabljata v zelo raznolikih procesih. Aktivirana prenosnika elektronov za oksidacijo goriv sta NAD+ in FAD. NAD+ na nikotinamidni obroč veže vodikov ion in 2 elektrona, ki ju prenese do O2, končnega akceptorja elektronov pri oksidaciji goriv. FAD pa veže 2 protona in 2 elektrona in preide v FADH2. Aktivirani prenosnik elektronov v redukcijskih

biosinteznih procesih je NADPH, ki sodeluje takrat, ko so prekurzorji bolj oksidirani kot produkti. Obstajajo pa tudi aktivirani prenosniki dvoogljikovih (2C) fragmentov (acilnih skupin); tak je na primer acetil-CoA. Vsi našteti aktivirani prenosniki so kemijsko stabilni, a v odsotnosti katalizatorjev šibko reaktivni. To omogoča encimom, da regulirajo procese, v katere so vključeni. Metabolične reakcije lahko razvrstimo v 6 skupin: redukcijsko-oksidacijske, ligacijske, izomerizacijske, reakcije prenosa skupin, hidrolitične in reakcije dodajanja ali odvzemanja skupin v zvezi z dvojnimi vezmi. Na splošno lahko rečemo, da regulacijske procese uravnavajo količina encimov, njihova aktivnost in dostopnost substratov. Regulacija metabolizma poteka na več nivojih – od uravnavanja sinteze proteinov do njihove razgradnje, z alosteričnimi interakcijami in s kovalentnimi modifikacijami. Razen tega se uravnava tudi vstop substratov v celice ali celične razdelke. Energetski nivo celice (koncentracija ATP, ADP in AMP) vpliva na metabolične poti, tako da v prisotnosti dovolj ATP potekajo pretežno anabolične poti (ki porabljajo ATP), katabolične pa so inhibirane. Svetlobne reakcije fotosinteze Prosta energija v bioloških sistemih prihaja (skoraj) izključno iz sončne energije, ki jo organizmi zajemajo v procesu fotosniteze. Osnovna reakcija je: CO2 + H2O + svetloba (CH2O) + O2Organska snov, ki nastaja, je pretežno saharoza in škrob. V zelenih rastlinah poteka fotosinteza v kloroplastih. Svetloba se ujame v pigmentnih molekulah (klorofil) in ustvarja visokoenergetske elektrone, ki imajo močan redukcijski potencial. Porabljajo se za nastanek NADPH in ATP v seriji reakcij, ki jih imenujemo svetlobne reakcije. Nastala ATP in NADPH nato reducirata CO2 in ga pretvarjata v 3-fosfoglicerat (Calvinov cikel ali nočne reakcije). Absorpcija fotonov (energije) povzroči odteg elektronov iz vode in tvorbo NADPH, hkrati pa prehajajo protoni v notranjost. Vračajo se preko ATP-sintaze, ki generira nastanek ATP iz ADP. Letno se na Zemlji s fotosintezo asimilira >1010 ton ogljika v obliki ogljikovih hidratov in drugih organskih snovi. Aerobni metabolizem (živali) poteka lahko le na osnovi organskih snovi in kisika, ki nastajata v procesu fotosinteze. Kloroplasti so analogi mitohondrijev, kjer prav tako poteka sinteza ATP v procesu oksidativne fosforilacije. Kloroplasti imajo lastno zunanjo in notranjo membrano in so dolgi ~5 µm. Notranja membrana obdaja stromo, v njej pa so tilakoide, diskaste membranske strukture, ki se nalagajo v grane (ednina: granum), te pa so med seboj povezane s stromalnimi lamelami. Rastlinske celice vsebujejo 1-100 kloroplastov. Redoks-reakcije potekajo v tilakoidnih membranah, ki vsebujejo potrebne proteine za prenos elektronov: zbiralce svetlobe, reakcijske centre, elektronsko-transportne verige in ATP-sintazo. V stromi pa so encimi, ki porabljajo NADPH in ATP za sintezo sladkorjev. Kloroplasti so v evoluciji nastali preko endosimbioze z fotosinteznimi mikroorganizmi, najverjetneje predhodniki cianobakterij. Kloroplasti rdečih in rjavih alg verjetno izvirajo iz neodvisnega endosimbiontskega dogodka. Kloroplasti imajo lasten genom; krožni kromosom vsebuje manj genov kot pri cianobakterijah, ker je v evoluciji več operonov prešlo v gostiteljski genom. Ključni dogodek pri fotosintezi je zajetje svetlobne energije. Svetlobni receptor je klorofil, reducirana tetrapirolna molekula z Mg-ionom. Vsebuje tudi fitol, hidrofobni 20-C alkohol, ki je zaestren na kislinsko stransko verigo pirola. Klorofili učinkovito lovijo svetlobo zaradi izmenjujočih se enojnih in dvojnih vezi (polieni). Močno absorbirajo v vidnem delu spektra, kjer je sončna svetloba, ki doseže površino zemlje, najmočnejša. Ob absorpciji svetlobe pride do ekscitacije elektrona z osnovnega v vzbujeno stanje. Če je v bližini primeren akceptor, lahko vzbujeni elektron preskoči nanj, kar povzroči nastanek pozitivnega

naboja na svetlobnem receptorju, sprejemnik pa je zaradi elektrona negativno nabit: fotoinducirana ločba nabojev. Do te ločbe nabojev pride v reakcijskem centru. Sredica reakcijskega centra je pri fotosintetskih bakterijah in zelenih rastlinah enako zgrajena, čeprav je bakterijski sistem enostavnejši kot rastlinski, ki vključuje dva fotosistema. Prostorska zgradba bakterijskega sistema je znana. Vsebuje 4 polipeptidne verige: L, M (ti dve sestavljata sredico), H in C (ta je citokrom). Verigi L in M imata po 5 transmembranskih vijačnic, veriga H pa 1 in leži na citoplazemski strani membrane. Citokromska podenota vsebuje 4 molekule hema in je na periplazemski strani. Na L- in M-podenoto se vežejo 4 molekule bakterioklorofila b, 2 molekuli bakteriofeofitina b, 2 kinona in železov ion. Bakterioklorofil se od običajnega razlikuje po tem, da ima reducirana 2 pirolna obroča in ima absorpcijski maksimum premaknjen proti višjim valovnim dolžinam (IR), bakteriofitin pa je oblika klorofila, ki ima namesto Mg-iona vezana 2 protona. Dimer klorofila b (zaradi ključne vloge se imenuje 'posebni par' ali P960, ker ima maksimum absorpcije pri 960 nm) na periplazemski strani absorbira svetlobo. To povzroči ekscitacijo elektrona, ki preskoči na drugo molekulo klorofila b, nato pa na bakteriofitin, vezan na podenoto L. Stopnja ločbe naboja poteče v <10 ps. Elektron se ne vrača na P960, ker to preprečuje bližnji hem na citokromski podenoti, s katerega se sprosti elektron in preide na P960+, hkrati pa je v neposredni bližini bakteriofitina kinon (Qa), na katerega hitro preide elektron. S tega preide na šibko vezani Qb. Ko se pretoči še en elektron in se naboj nevtralizira z zajetjem 2 protonov iz citoplazme, se kinon reducira v QH2. Ta kinon se reoksidira preko kompleksa III dihalne verige, pri čemer se elektrona posredno preneseta na citokromsko podenoto reakcijskega centra. S tem je pretok elektronov krožen proces, gradient protonov pa poganja sintezo ATP s pomočjo ATP-sintaze. Pri rastlinah sta za fotosintezo odgovorna dva fotosistema, ki ju povezujejo skupni intermediati. PSI se odziva na svetlobo <700 nm, PSII pa na svetlobo <680 nm. Svetlobo zajame najprej PSII. Elektroni se prenesejo na membranski citokrom bf, nato pa na PSI. Elektroni izhajajo iz vode in na koncu reducirajo NADP+ v NADPH. Ob tem nastaja gradient protonov preko tilakoidne membrane, kar poganja sintezo ATP. PSII vključuje vsaj 10 polipetidnih verig in >30 molekul klorofila, v osnovi pa je podoben bakterijskemu fotosistemu. Sredico sestavljata D1 in D2 (homologni L in M), dodatne podenote pa vežejo še dodatne molekule klorofila in s tem povečujejo učinkovitost zajemanja svetlobe. Reakcije na PSII povzema shema 2 Q + 2 H2O O2 + 2 QH2 (Q=plastokinon, QH2=plastokinol). Medtem ko bakterijski fotosistem zajema elektrone s citokroma, pri rastlinah elektroni izhajajo iz vode, pri čemer nastaja kisik. Reakcijski center vsebuje 4 Mn-ione. Najprej pride do ekscitacije posebnega para klorofilnih molekul – gre za klorofil a, ki ima vrh absorpcije svetlobe z λ=680 nm. P680 prenese elektron na feofitin (klorofil z 2H+ na mestu Mg2+), nato pa na plastokinon. Po pretoku 2 elektronov pride do redukcije v QH2. P680+ je zelo močan oksidant in v 4 stopnjah potegne 4 elektrone z molekul vode, ki so vezane v manganov center. PSII je nameščen v tilakoidni membrani tako, da redukcija kinona poteka na stromalni strani, manganov center pa je na strani tilakoidnega lumna. Protona za redukcijo plastokinona torej prihajata iz strome, 4 protoni, ki nastanejo zaradi oksidacije vode, pa se sprostijo v lumen, kar pomeni, da nastaja gradient protonov z viškom v lumnu. Plastokinol (QH2) prenese po 1 elektron hkrati na plastocianin, bakrov protein v tilakoidnem lumnu: QH2 + 2 Pc(Cu2+) Q + 2 Pc(Cu+) + 2 H+ (v tilakoidnem lumnu). Reakcijo katalizira kompleks citokroma bf, ki ima 4 podenote. Reakcija se imenuje cikel Q. Plastokinol se v 2 stopnjah oksidira v plastokinon, ob tem pa se reducira plastocianin. Ob oksidaciji plastokinola se sprostita 2 protona v tilakoidni lumen, potem pa citokrom bf reducira še drugo molekulo plastokinona iz rezervoarja Q v plastokinol, pri čemer potegne protona z ene strani membrane, na drugi strani pa ponovno oksidira plastokinol in protona sprosti na drugo stran. Encim je v membrani orientiran tako, da zajema protone iz strome in jih oddaja v tilakoidni lumen, s čimer prispeva h gradientu protonov.

PSI je sestavljen iz 13 polipeptidnih verig, >60 molekul klorofila in pomožnih proteinov, tako da je skupna masa >800 kDa. Osrednji del sestavljata psaA in psaB, ki sta večji kot homologni podenoti v PSII. Vključen je posebni par klorofila a (λmax. 700 nm). Elektron s P700 se prenese preko prostega klorofila in kinona na set skupkov 4Fe-4S, nato pa na feredoksin. P700+ se nevtralizira s prenosom elektrona z reduciranega plastocianina. Povzetek reakcij je: Pc(Cu+) + Fdox + svetloba Pc(Cu2+) + Fdred. Gledano skupaj imenujemo prenos elektronov Z-shema fotosinteze (glede na obliko grafa spremembe redukcijskega potenciala v PSII in PSI). Z reduciranega feredoksina se elektron prenese na NADP+ s pomočjo flavoproteinskega encima feredoksin-NADP+-reduktaze na stromalni strani membrane. V molekuli encima je vezan FAD, ki sprejme po 1 elektron z 2 molekul reduciranega feredoksina, nato pa prenese hidridni ion na NADP+, tako da nastane NADPH. Vezava protona dodatno prispeva k protonskemu gradientu. Sinteza ATP poteka v kloroplastu, ob čemer se porablja energija, ki izvira od pretoka protonov skozi tilakoidno membrano. Encim ima 4 vrste podenot (I-IV v stehiometričnem razmerju 1:2:12:1) in je po zgradbi podoben mitohondrijski ATP-sintazi. Ob delovanju kloroplastne ATP-sintaze prihaja do toka protonov iz tilakoidnega lumna v stromo, kamor se izloča tudi ATP. Elektroni iz PSI pa ne prehajajo nujno na NADP, pač pa lahko tudi nazaj na kompleks citokroma bf, kar privede do redukcije plastocianina, to pa spet do reoksidacije P700+. Na ta način pride do črpanja protonov, kar pa poganja sintezo ATP: ciklična fotofosforilacija – tvorba ATP brez posredovanja NADPH in delovanje PSII pri tem ni potrebno, tako da ne nastaja niti kisik. Ta cikel poteka, če NADPH+ ni na voljo. Celokupna stehiometrija svetlobnih reakcij je: 4 fotoni v PSII 1 O2 + 4 protoni v tilakoidnem lumnu 2 plastokinola plastokinon + 8 protonov v lumen 4 plastocianini + 4 fotoni + 4 feredoksini 4 reduc. feredoksini + 2 NADPH skupaj: 8 fotonov + 2 H2O + 2 NADP+ + 10 H+

stroma O2 + 2 NADPH + 12 H+lumen

ATPaza: 3 ADP3- + 3 Pi2- + 3 H+ + 12 H+lumen 3 ATP4- + 3 H2O + 12H+

stroma Ciklična fotofosforilacija je bolj učinkovita kar se tiče sinteze ATP. 4 fotoni dajo 8 protonov v lumnu, kar generira sintezo 2 ATP (brez NADPH). Pomožni pigmenti usmerjajo energijo v reakcijske centre. To je smiselno, ker klorofil a zajema fotone le v omejenem območju svetlobnega spektra, nekaj fotonov pa bi se izgubilo zaradi redke razmestitve klorofila v reakcijskem centru. Pri delovanju pomožnih barvil gre za drugačen način prenosa elektronov, ne za ekscitacijo in prenos. Pojav imenujemo prenos resonančne energije zaradi elektromagnetnih interakcij na kratke razdalje. Akceptor mora imeti enako ali nižjo energijo kot donor. Posebni par klorofila je zato primeren sprejemnik in lahko sprejema energijo z monomernih barvil. Zajem fotonov poteka predvsem preko klorofila b in karotenoidov. Klorofil b se od a-oblike razlikuje po eni formilni na mestu metilne skupine, kar povzroči premik absorpcijskega vrha proti 450-500 nm. Karotenoidi so polieni, ki absorbirajo svetlobo z λ=400-500 nm. Dajejo rumeno in rdečo barvo večini sadežev in rožam ter so odgovorni za jesensko barvo listja (klorofil se razgradi). Razen tega karotenoidi ščitijo rastline pred oksidacijo v fotokemičnih reakcijah. Pomožna barvila so razmeščena v več kompleksih za zajem svetlobe, ki obkrožajo reakcijski center. Najpogostejši protein v zajemnem kompleksu II je podenota s 26 kDa, ki veže 7 molekul klorofila a, 6 molekul klorofila b in 2 molekuli karotenoida. Pri cianobakterijah in rdečih algah (živijo v vodi na globinah, do katerih prodreta pretežno zelena in rumena svetloba) imajo podobno funkcijo zajemanja svetlobe fikobilisomi. Fikobilisomi so vezani na

zunanjo stran tilakoidne membrane in prenašajo ekscitacijsko energijo v reakcijski center PSII. So zelo velike strukture (več milijonov Da), sestavljene iz fikobiliproteinskih podenot. Vsaka od njih ima kovalentno vezanih več bilinov, kakršna sta npr. fikocianobilin in fikoeritrobilin. Elementi fotosinteznega aparata so asimetrično razporejeni v tilakoidnih membranah. Nenaložene regije vsebujejo PSI in ATP-sintazo, naložene regije pa PSII. Kompleks citokroma bf je v obeh delih, se pa hitro premika med obema regijama. Taka razmestitev npr. omogoča PSI, da je v neposrednem stiku s stromo in lahko reducira NADP+. ATP sintaza je v nenaloženi regiji, ker vsebuje velike podenote in da je v stiku z ADP. PSII pa sprejema elektrone z vode, ki zlahka pride v naložene dele, elektrone pa nato prenaša plastokinon, ki je dobro topen v lipidih. Herbicidi pogosto delujejo na PSI (preusmerjajo elektrone s končnih reakcij) ali PSII (blokirajo prenos elektronov). Inhibitorja PSII sta npr. diuron in atrazin, ki se vežeta na mesti Qb na podenoto D1 in blokirata nastanek plastokinola (QH2). Oksidativna fotosinteza se je v evoluciji razvila pred pribl. 2 milijardama let, pred tem pa so organizmi dobivali energijo iz neoksidativne fotosinteze, pri kateri so donorji elektronov bili H2, H2S, S, ali organske molekule. Fotosinteza pa se je razvila šele na stopni bakterij – pri arhejah je ne najdemo. Calvinov cikel in cikel pentoza-fosfata Fotosinteza ima razen svetlobne še temno fazo. V svetlobni fazi se svetlobna energija pretvori v ATP in NADPH. V temni fazi pa se ogljik iz popolnoma oksidirane oblike – CO2 – reducira v heksozo. Avtotrofi so sposobni sinteze glukoze iz anorganskih snovi (zelene rastline), heterotrofi pa energijo dobivajo iz kemičnih goriv (organskih snovi). Calvinov cikel poteka v stromi kloroplastov. Podoben proces sinteze sladkorjev pa poteka tudi v citoplazmi – glukoneogeneza. Cikel ima 3 faze:

• Fiksacija ogljika z ribuloza-bisfosfatom (karboksilacija) – nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata • Redukcija 3-fosfoglicerata v heksozo • Regeneracija ribuloza-bisfosfata.

Najprej se CO2 veže na ribuloza-1,5-bisfosfat in preko nestabilnega intermediata nastaneta 2 molekuli 3-fosfoglicerata. Reakcijo katalizira ribuloza-1,5-bisfosfat-karboksilaza/oksigenaza (=rubisko), ki je locirana na stromalni površini tilakoidnih membran. Sestavljena je iz 8 L in 8 S-podenot. Vsaka L-veriga prispeva po eno aktivno in regulatorno mesto. Rubisko predstavlja ~16% vseh kloroplastnih proteinov in je verjetno najpogostejši protein na Zemlji. Velike količine so potrebne, ker deluje počasi (3/s). Potebuje vezan Mg-ion, ki aktivira substrat, potem ko se ta veže. Pri namestitvi Mg2+ v protein se porabi še 1 molekula CO2, ki pretvori Lys v karbamat (rubisko-aktivaza), ta pa lahko veže Mg. Ribuloza-bisfosfat se veže na rubisko (preko keto- in hidroksilne skupine) in se aktivira zaradi delovanja kovinskega centra. Na Mg-centru poteče reakcija sinteze fosfoglicerata preko več intermediatov (deprotonacija, vezava CO2, hidratacija, cepitev z odcepom protonov). Občasno pa reaktivni intermediat na Mg namesto CO2 veže O2. Pri tej stranski ("zapravljivi") reakciji nastajata fosfoglikolat in 3-fosfoglicerat. Ta oksigenazna reakcija poteka v fizioloških pogojih 4x redkeje kot običajna karboksilazna, pri višjih T pa je proces pogostejši. Nastali fosfoglikolat se ne vgrajuje v derivate, pač pa se večinoma razgradi. Fosfataza ga prevede v glikolat, ta pa preide v peroksisome, kjer se modificira do glioksilata (pri tem nastaja H2O2, ki ga razgrajuje katalaza). Ta se v mitohondrijih pretvori v 2 glicinski molekuli, iz njiju pa nastane serin. Ob tem se odcepita amoniak in CO2; amoniak se reciklira v glutamin. Proces, v katerem se porabljajo sestavni deli glikolata, se imenuje fotorespiracija, ker se porablja kisik in sprošča CO2, ne da bi pri tem nastajal ATP ali NADPH.

V 2. fazi Calvinovega cikla se 3-fosfoglicerat pretvori v 3 oblike heksoze-fosfata: Glu-1P, Glu-6P in Fru-6P, ki se lahko prehajajo ena v drugo. Prehod iz fosfoglicerata je podoben kot pri glukoneogenezi. V zadnji stopnji pa se regenerira ribuloza-bisfosfat, ki je 5C-sladkor, nastati pa mora iz 6C- in 3C-sladkorja. Pri tem sodelujeta transketolaza in aldolaza. Transketolaza ima koencim tiamin-pirofosfat (TPP) in prenaša 2C-enote s ketoze na aldozo, aldolaza pa katalizira kondenzacijo aldola. Postopek regeneracije ribuloza-bisfosfata je zapleten in poteče iz Fru-6P in gliceraldehid-3-fosfata ob sodelovanju dihidroksiacetonfosfata najprej do riboza-5-fosfata in ksiluloza-5-fosfata, končno pa do ribuloza-bisfosfata. Iz 6C- in 3C-sladkorja najprej nastaneta 4C- in 5C-sladkorja (transketolaza); aldolaza nato rekombinira nastali 4C-sladkor z drugim 3C-sladkorjem do 7C-sladkorja, ki se nato s transketolazo in 3C-sladkorjem pretvori v 2 različni molekuli 5C-sladkorja. Ti dve se pretvorita v 5C-fosfat, ta pa v bisfosfat. Calvinov cikel mora poteči 6x, da se sintetizira heksoza; za to se porabi 18 ATP in 12 NADPH ter 6 CO2 in 12 H2O. Za vgradnjo vsakega C-atoma v heksozo se torej porabijo 3 ATP in 2 NADPH. V rastlinah se sladkorji shranjujejo kot škrob in kot saharoza. Škrob se sintetizira in shranjuje v kloroplastih; je polimer glukoze, manj razvejan kot glikogen pri živalih. Saharoza se sintetizira v citoplazmi, saj kloroplasti ne prepuščajo heksoza-fosfatov, pač pa le trioza-fosfate. Iz njih nastane Fru-6P, ki z aktivirano UDP-glukozo tvori saharoza-6-fosfat, fosfatna skupina pa se na koncu hidrolitično odcepi. Asimilacija CO2 v Calvinovem ciklu poteka čez dan, razgradnja ogljikovih hidratov pa ponoči. Sintezo in razgradnjo uravnavajo spremembe koncentracij posameznih reagentov in pH, kar vodi do večje ali manjše aktivnosti encimov, ki sodelujejo v ciklu. Rubisko je bolj aktiven, če je svetlo, saj je takrat v stromi več Mg-ionov in je pH višji zaradi delovanja protonskih črpalk, ki jih poganja svetloba. Svetlobne reakcije vodijo elektrone z vode do feredoksina in NADPH, ki tudi regulirata encime Calvinovega cikla. Regulacija je posredna, preko tioredoksina, ki v reducirani obliki aktivira mnoge biosintezne encime in inhibira razgradne encime. V kloroplastih se tioredoksin reducira s feredoksinom (ob posredovanju reduktaze). Zaradi visokih temperatur v tropih bi rastline imele velike izgube energije zaradi povečane fotorespiracije. Rastline rešijo problem z ustvarjanjem visoke lokalne koncentracije CO2 v celicah, ki izvajajo Calvinov cikel. Tako 4C-spojine (oksaloacetat, malat) prenašajo CO2 iz mezofilnih celic, ki so v stiku z zrakom, na snopaste celice v notranjosti, kjer poteka Calvinov cikel in kjer se te 4C-spojine dekarboksilirajo, 3C piruvat pa se vrača v mezofil. Ta C4-cikel se začne v mezofilnih celicah s kondenzacijo CO2 in fosfoenol-piruvata v oksaloacetat (ponekod se pretvori naprej v malat). V reakciji se porablja 1 ATP in 1 molekula vode za vsak kondenzirani CO2. Gre za obliko aktivnega transporta CO2, ki pa lahko doseže 40x višjo koncentracijo CO2 v snopastih celicah. Če gledamo reakcijo v povezavi s Calvinovim ciklom, porabimo za 1 heksozo 30 ATP in 12 NADPH. Visoka koncentracija CO2 pa zagotavlja, da bo rubisko deloval predvsem po karboksilazni in manj po oksigenazni poti. C4-rastline prevladujejo v tropih z visokimi temperaturami in veliko svetlobe, C3-rastline pa pri T<28°C – v zmernih klimatih. Rubisko je evolucijsko star encim in je prisoten že pri arhejah. Optimalno je deloval v atmosferi z zelo malo kisika, pred 60 milijoni let, ko pa se je vzpostavila današnja koncentracija CO2, pa je postala fotorespiracija pomemben problem. Cikel C4 se je razvil pred 30-7 milijoni let. Pri sukulentih se je razvila še ena prilagoditev na nivoju Calvinovega cikla. Da bi se zmanjšal učinek suše, so te rastline začele listne reže zapirati čez dan in tako zmanjšale izločanje vode. Zato pa se čez dan CO2 ne more absorbirati in ne more priti do sinteze glukoze. Namesto tega se CO2 fiksira v hladnejšem delu dneva, ko se reže spet odprejo, preko cikla C4 in to preko malata, ki se shranjuje v vakuolah. Čez dan se ta malat dekarboksilira in CO2 je na voljo za Calvinov cikel. V ciklu pentoza-fosfata se iz glukoze sintetizirajo velike količine NADPH, ki jih organizem potrebuje za biokemijske reakcije, predvsem za sintezo maščob. Cikel je evolucijsko povezan s Calvinovim ciklom in ima dve fazi: oksidativno tvorbo NADPH in neoksidativno pretvorbo sladkorjev. V oksidativni fazi

nastaja NADPH, ko se Glu-6-P oksidira v riboza-5-P (ta je sestavni element nukl. kislin in nukleotidov). Ob razgradnji 1 Glu-6-P nastaneta 2 NADPH. V neoksidativni fazi pa se pretvarjajo 3-7C sladkorji, kar privede do sinteze 5C-sladkorjev za sintezo nukleotidov ali za razgradnjo v glikolizni poti. Cikel se začne z dehidrogenacijo Glu-6-P; sledi hidroliza in oksidativna dekarboksilacija do ribuloza-5-P. Ker so potrebe po NADPH večje kot po ribulozi, se ta pretvarja v 3 reakcijah s transketolazo in transaldolazo v gliceraldehid-3-fosfat in Fru-6-P. Neto reakcija je: 3 C5 2 C6 + C3. Glu-6-P se lahko razgrajuje po glikolizni poti ali v ciklu pentoza-fosfata. O poti razgradnje odloča koncentracija NADP+ v citoplazmi. V ciklu pentoza-fosfata je za hitrost odločilna 1. stopnja, kjer je za reakcijo potreben NADP+ kot akceptor elektronov. Razporeditev reakcij razgradnje Glu-6-P lahko obravnavamo v različnih scenarijih potreb po posameznih intermediatih – smiselno šele, ko razumemo tudi glikolizo (16. poglavje). Metabolizem glikogena Glukoza je v telesu shranjena v polimerni obliki kot glikogen. Polimerizacija poteka preko α-1,4 glikozidnih vezi, razvejanost pa povzročijo α-1,6 glikozidne vezi na vsakih ~10 ostankov. Glikogen ni zelo reducirana molekula in zato ni tako bogata z energijo (kot npr. lipidi), vendar pa je uporaben, saj se razgradi direktno do glukoze in s tem ohranja nivo glukoze v krvi med obroki. Glukoza pa je edini vir energije za možgane. Iz glikogena izvira tudi glukoza za premagovanje nenadnih naporov, tudi v odsotnosti kisika (anaerobna aktivnost). Glikogen je shranjen predvsem v jetrih (10% teže) in v skeletnih mišicah (2% teže, vendar jih je skupaj več). V citosolu je glikogen v obliki granul s premerom 10-40 nm. Sinteza in razgradnja glikogena potekata v jetrih v skladu s potrebami celotnega organizma, v mišicah pa ti procesi potekajo le za potrebe mišic samih. Razgradnja glikogena teče v 3 stopnjah:

- sproščanje glukoza-1-fosfata iz glikogena - premodeliranje glikogenskega substrata za nadaljnjo razgradnjo - pretvorba glukoza-1-fosfata v glukoza-6-fosfat.

Glukoza-6-fosfat se porablja za: - glikolizo (v mišicah in možganih se pretvarja preko piruvata v laktat + CO2 +H2O) - cikel pentoza-fosfata ( NADPH in derivati riboze) - pretvorbo v glukozo in sproščanje v kri (v jetrih, manj pa v črevesju in ledvicah)

Za sintezo glikogena je potrebna aktivirana oblika glukoze (UDP-glu UTP + glukoza-1-fosfat), ki se dodaja na nereducirajoči konec glikogenske molekule. Regulacija procesov sinteze in razgradnje je zapletena in poteka preko alosterične modulacije encimov. Modulatorji so metaboliti, ki so indikatorji energetskega stanja celic. Razen tega delujejo kot regulatorji tudi hormoni, ki privedejo do fosforilacije encimov, to pa spremeni kinetične lastnosti encimov. Hormonalna regulacija zagotavlja prilagajanje zahtevam celega organizma. Ključni encim razgradnje glikogena je glikogen-fosforilaza. Substrat cepi z dodajanjem ortofosfata (fosforoliza), pri čemer se sprošča glukoza-1-fosfat. Odcepljanje poteka vedno z nereducirajočih koncev glikogena (imajo proste 4-OH skupine). Sproščeni glu-1-P se nato pretvarja v glu-6-P s pomočjo fosfoglukomutaze. Fosforilaza pa ne more cepiti α-1,6 vezi na mestu razvejitve in reakcija se ustavi že 4 ostanke pred razvejitvijo. Zato je potrebno delovanje 2 dodatnih encimov, transferaze in α-1,6-glukozidaze. Transferaza prenese blok 3 glikozilnih ostankov z ene veje na drugo, tako da pred razvejiščem ostane le še en ostanek, ki ga nato odcepi α-1,6 glukozidaza, heksokinaza pa ga nato fosforilira. Pri evkariontih sta transferazna in glukozidazna aktivnost združeni v enem proteinu (160 kDa).

Fosfoglukomutaza ima v akt. mestu fosforiliran Ser. Fosforilna skupina se najprej prenese na na C-6 –OH, nato pa se serin ponovno fosforilira s fosforilno skupino s C-1. Ena najpomembnejših nalog jeter je, da vzdržujejo konstantnen nivo glukoze v krvi. Pri razgradnji glikogena do fosforilirane glukoze pa produkt ne prehaja učinkovito iz celic, zato se ta v jetrih razgrajuje do nemodificirane glukoze ob delovanju glukoza-6-fosfataze (na lumenski strani ER; sodeluje tudi pri glukoneogenezi). Tega encima v večini drugih tkiv ni, zato glu-6-P porabijo za tvorbo ATP. Glikogen-fosforilaza je homodimer (2x97 kDa). Mesto za vezavo substrata je 30 Å oddaljeno od katalitskega mesta (dolžina 4-5 glukoznih enot), kar omogoča, da pride do več cepitev, ne da bi substrat moral med posameznimi cepitvami disociirati in se reasociirati - to je značilno za encime, ki sintetizirajo ali razgrajujejo dolge polimere (procesivni encimi). Glikogen-fosforilaza iz mišic obstaja v dveh oblikah: pretežno aktivni obliki _a_ in pretežno neaktivni obliki _b_. Razlika med obema oblikama je ena dodatna fosforilacija (Ser14) pri obliki _a_; povzroči jo fosforilaza-kinaza, to pa aktivira epinefrin (ob strahu, naporu) ali električna stimulacija mišic. Konformacijska sprememba se odrazi v aktivnem mestu, ki je oddaljeno od mesta fosforilacije. Pride do manjšega zasuka in do premikov helikalnih delov, ki delno odkrijejo aktivno mesto. Mišična fosforilaza _b_ je aktivna le ob prisotnosti visoke koncentracije AMP, ki se veže na posebno vezavno mesto in stabilizira aktivno stanje (R); ATP deluje kot negativni alosterični efektor in stabilizira neaktivno (T) stanje. V večini fizioloških stanj je fosforilaza b neaktivna zaradi prisotnega ATP in zaradi povratne inhibicije z glu-6-P. Po drugi strani pa je fosforilaza a v celoti aktivna, ne glede na koncentracije AMP, ATP in glu-6-P. V neaktivni mišici je večina fosforilaze v neaktivni _b_ obliki, ob začetku vadbe pa pride do zvišanja nivoja AMP in s tem do aktivacije fosforilaze b. Hkrati bo z naporom prišlo do sproščanja hormonov, ki aktivirajo obliko _b_ v obliko _a_ . V jetrih je fosforilaza a, ki je 90% identična z mišično, pa vendar deluje drugače: glukoza povzroči prehod iz R v T-stanje, kar povzroči upočasnitev delovanja. Glukoza nastaja v jetrih za potrebe drugih tkiv, zato prisotnost glukoze v jetrih pomeni, da je nivo glukoze v krvi visok in da je ta verjetno prišla iz hrane, tedaj pa ni potrebna pretvorba iz glikogena. AMP na jetrno fosforilazo ne deluje. Gre za primer izocima: zelo podobna encima z enako substratno specifičnostjo v različnih tkivih različno odgovarjata na modulatorje. Fosoforilaza-kinaza je encim z maso 1200 kDa in tetramerno zgradbo (aβγδ)4. Katalitične so podenote γ, ostale pa so regulatorne. Regulacija poteka preko fosforilacije: fosforilacija podenote β preko protein-kinaze A (vklaplja jo cAMP) poveča aktivnost encima. Podenota δ je kalmodulin, ki je občutljiv na nivo Ca-ionov in aktivira mišično kinazo v primeru večje mišične aktivnosti, ko nivo Ca-ionov naraste zaradi sproščanja iz sarkopl. retikuluma. Na metabolizem glikogena vplivajo mnogi hormoni. Epinefrin (adrenalin) se izloča iz nadledvične žleze ob povečani telesni aktivnosti ali ob pripravi nanjo. Vpliva predvsem na povečano razgradnjo glikogena v mišicah. Razgradnjo glikogena v jetrih pa stimulira glukagon, polipeptidni hormon, ki se izloča iz trebušne slinavke, ko je nivo glukoze v krvi nizek. Vsak od teh hormonov se veže na svoj receptor na membrani mišičnih oz. jetrnih celic in nato sproži signalno kaskado preko G-proteinov. Ojačanje signala je tako močno, da bi do razgradnje vseh zalog glikogena prišlo v nekaj sekundah, če ne bi v celicah bilo mehanizmov ustavljanja delovanja encimov. Tudi tu se sproži signalna kaskada, ki privede do defosforilacije in s tem inaktivacije fosforilaza-kinaze in glikogen-fosforilaze z encimom protein-fosfataza 1 (PP1). Hkrati s tem se sproži sinteza glikogena. Sinteza glikogena poteka po drugačni poti kot razgradnja: iz glukoza-1-P in UTP nastaja UDP-glukoza, nato pa glikogen-sintaza prenese glukozni del na rastočo verigo glikogena. Prva enota, na katero se pripne glukoza, je glikoprotein glikogenin (2x37 kDa). Do razvejanosti privede pretvorba običajne α-1,4-vezi v α-1,6 vez, kar katalizira razvejitveni encim. Tako nastane več koncev, s katerih se nato lahko hitreje

odceplja glukoza, ko za to nastane potreba, pa tudi sinteza poteka hitreje na več koncih. Aktivnost sintaze uravnava fosforilacija N- in C-konca encima. S tem se spremeni naboj in zmanjša aktivnost sintaze. Učinek fosforilacije na aktivnost je torej obraten kot pri glikogen-fosforilazi. Za vgradnjo 1 glu-6-P v glikogen se porablja 1 ATP (pri regeneraciji UDP), pri odcepu pa ponovno nastaja glu-6-P brez porabe energije. Samo enote ob razvejišču (10% vseh glu) je treba fosforilirati, da lahko vstopajo v naslednje reakcije. Izgube so torej zelo majhne. Razgradnja in sinteza glikogena sta recipročno regulirani preko hormonov in signalnih kaskad, ki vključujejo cAMP in protein-kinazo A. Ta inaktivira glikogen sintazo in posredno aktivira fosforilazo; tako ne more teči sinteza hkrati z razgradnjo. Obraten učinek ima protein-fosfataza 1 (PP1). Sintezo glikogena pospešuje inzulin, ki v pogojih visoke konc. glukoze sproži pot aktivacije PP1. Metabolizem maščobnih kislin Maščobne kisline so gradniki fosfolipidov in glikolipidov – sestavin cel. membrane, sodelujejo pri modificiranju proteinov in jih usmerjajo v membrano, kot triacilgliceroli so gorivo za celice, derivati mašč. kislin pa so tudi hormoni in znotrajcelični obveščevalci. Pri razgradnji mašč. kislin nastaja acetil-CoA, ki prehaja v cikel citronske kisline. Cepitev aktiviranih mašč. kislin poteka v stopnjah: oksidacija, hidratacija, oksidacija in cepitev, sinteza pa teče v obratni smeri in vključuje kondenzacijo, redukcijo, dehidracijo in ponovno redukcijo. Triacilgliceroli predstavljajo visoko koncentrirano zalogo energije, ker so reducirani in brezvodni. Popolna oksidacija 1 g čistih mašč. kislin da 38 kJ energije, oksidacija proteinov ali oglj. hidratov pa le 17 kJ, pri čemer pa glikogen veže še 2 g vode / g suhe snovi, kar prinese razmerje 1:6 v korist energetske vrednosti maščob. V evoluciji se je zato razvil sistem hranjenja rezervne energije v obliki maščobe; 70 kg človek ima zaloge energije razporejene približno takole: 420 MJ kot triacilgliceroli (11 kg), 100 MJ kot proteini, 2.5 MJ kot glikogen in 0.17 MJ kot glukoza. Če bi hoteli 11 kg maščobe zamenjati z enako energetsko vrednostjo glikogena, bi to bilo 66 kg! Zaloge energije v obliki glikogena in glukoze zadoščajo za 24-urne potrebe, medtem ko maščobe omogočajo daljše preživetje brez prehranjevanja – npr. pri pticah selilkah. Triacilgliceroli so shranjeni v telesu sesalcev v adipocitih. Zaužite maščobe se v črevesnem lumnu s pomočjo žolčnih soli (npr. glikoholat) dispregirajo v micele. Te pankreasne lipaze lahko razgrajujejo do maščobnih kislin in monoacilglicerola, ki se lahko resorbirajo v epitel. Črevesne mukozne celice nato ponovno sintetizirajo triacilgliceride in jih pakirajo v lipoproteinske delce – hilomikrone (premer 180-500 nm). Proteinsko komponento (apolipoproteini) predstavlja večinoma apoprotein B-48. Hilomikroni prehajajo v limfo in nato v kri, ki jih prenese do membranskih lipaz na površini adipocit in mišic. Tu pride do ponovne pretvorbe v proste maščobne kisline in monoacilglicerol, ki preidejo membrano in iz njih v celicah ponovno nastajajo triacilgliceroli. Iz maščobnega tkiva se triacilgliceroli mobilizirajo (lipoliza: razgradijo se do mašč. kislin in glicerola, ki s krvjo preidejo do tkiv, kjer so potrebni). V tarčnih tkivih pride do aktivacije mašč. kislin in prenosa v mitohondrije. Tam se mašč. kisline postopno razcepijo do AcCoA, ki vstopa v cikel citronske kisline. Lipaze adipocitov se aktivirajo po delovanju hormonov (epinefrin, glukagon in podobni), ki po vezavi na receptorje 7TM na površini adipocit sprožijo signalno kaskado; protein-kinaza A fosforilira in s tem aktivira lipazo. Obratno deluje inzulin. Sproščene mašč. kisline v krvni plazmi niso topne, zato se vežejo na serumski albumin, glicerol pa se v jetrih pretvori do gliceraldehid-3-fosfata (intermediat v glikolizni in glukoneogenezni poti – pretvarja se torej v piruvat ali v glukozo). Pred vstopom v mitohondrij se mašč. kisline aktivirajo v acil-CoA na zunanji mitohondrijski membrani, nato pa v matriksu pride do oksidacije.

Transport v notranjost mitohondrija poteka po vezavi na karnitin (alkohol v obliki iona-dvojčka) ob delovanju translokaze. Sledi 4-stopenjska razgradnja: oksidacija s FAD, hidratacija, oksidacija z NAD+, tioliza s CoA. Pri oksidaciji ob za 2 C-atoma skrajšani mašč. kislini nastajata še FADH2 in NADH, ki elektrone v dihalni verigi prenašata na O2, Ac-CoA pa se kondenzira z oksaloacetatom v ciklu citr. kisline. V seriji reakcij nastane ob popolni oksidaciji 1 aktivirane molekule palmitata 106 molekul ATP. Mašč. kisline z dvojnimi vezmi se morajo pred vstopom v oksidacijski proces še dodatno modificirati, tiste z lihim številom C-atomov pa se oksidirajo do propionil-CoA, ki nato preide v sukcinil-CoA (za kar je potreben vitamin B12 kot koencim). Sinteza je razgradnji obraten proces samo shematsko gledano. V resnici sta (1) procesa ločena (sinteza poteka v citosolu, razgradnja pa v mitohondrijih), (2) intermediati sinteze so vezani na acilni prenosni protein (pri razgradnji pa gre za vezavo na CoA), (3) sinteza pri višjih organizmih poteka na enem samem polipeptidu (razgradnih proteinov pa je več), (4) pri sintezi gre za zaporedno dodajanje 2-C enot, ki izhajajo iz Ac-CoA, pri tem pa se sprošča CO2, (5) reducent pri sintezi je NADPH (oksidanta pri redukciji pa NAD+ in FAD), (6) sintazni kompleks podaljšuje verigo le do 16 C (palmitat), nadaljnje spremembe pa katalizirajo drugi encimi. Prva stopnja v sintezi je tvorba malonil –CoA ob posredovanju acetil-CoA-karboksilaze, ki je ključni regulatorni encim za celotno sintezo; vsebuje vezan biotin in reakcija teče ob porabljanju ATP. Intermediati v sintezi maščobnih kislin so vezani na acil-prenašalni protein preko fosfopanteteinske skupine. Evkariontske sintaze so kompleksni proteini; pri sesalcih gre za homodimer (2x260 kDa) s po 3 domenami v vsaki enoti. Za nastanek palmitata mora poteči 7 reakcijskih ciklov. Za sintezo potrebni acetil-CoA prihaja iz mitohondrijev ob sodelovanju citrata in piruvata, ki omogočata prehod preko membrane. Za sintezo potrebni NADPH prihaja iz mitohondrijev in iz cikla pentoza-fosfata. Kontrola metabolizma maščobnih kislin poteka preko acetil-CoA-karboksilaze v stopnji sinteze malonil-CoA. Karboksilazo v tej stopnji aktivira inzulin, inhibirata pa jo glukagon in epinefrin; molekularno gre za fosforilacijo (inaktivacija z od AMP odvisno protein-kinazo na enem Ser ostanku) in defosforilacijo (aktivacija s protein-fosfatazo 2A). Kot aktivator lahko deluje tudi citrat, ki je pokazatelj ugodnega energetskega stanja celice. Pri sintezi maščobnih kislin sodelujejo še pomožni encimi. Potrebni so za podaljševanje osnovne verige (palmitat) – na citosolni strani membrane ER in za uvedbo dvojnih vezi. Pri podaljševanju verige se dodajajo 2-C enote (malonil-CoA). Pri desaturaciji pa sodelujejo flavoprotein, citokrom in nehemski železov protein. Pri sesalcih uvedba dvojne vezi za C-9 ni mogoča, zato morajo linoleat in linonenat dobiti s hrano. Eikozanoidni hormoni nastajajo iz arahidonata (maščobne kisline 20:4). So predvsem kratkožive signalne molekule: prostaglandini, tromboksani, prostaciklin, levkotrieni. Delujejo lokalno preko receptorjev 7TM. Metabolizem proteinov – cikel uree Za biosintezo proteinov so potrebne aminokisline. Te nastanejo z razgradnjo proteinov v prebavilu in v celici, kjer se nekateri proteini nenehno obnavljajo. Poškodovane ali nedokončane proteine označuje za razgradnjo ubikvitin, ki se na tarčne proteine veže kovalentno. Poliubikvitinirane proteine nato razgradi proteasom, proteolizni kompleks, ki deluje ob porabljanju ATP. Aminokislne so tudi gradniki za sintezo baz nukleinskih kislin in vir dušika za druge aminokisline. Viška aminokislin organizmi ne morejo shraniti za kasnejšo uporabo, lahko pa ga porabijo kot gorivo. Aminoske skupine se pretvorijo v ureo (cikel uree), ogljikovo ogrodje pa se pretvori v acetil-CoA, piruvat ali intermediate cikla citronske kisline, pri čemer nastajajo maščobne kisline, ketonska telesca ali glukoza. Najpomembnejši konecim pri razgradnji proteinov je piridoksal-fosfat.

Proteini v hrani se razgradijo do aminokislin, ki lahko potujejo po telesu. Razgradnja se začne z nakisanjem v želodcu, kjer zaradi kisline pride do denaturacije; denaturirani proteini so bolj občutljivi za delovanje encimov (pepsin v želodcu, pankreasne proteaze). Nastajajo kratki peptidi in aminokisline. V membrani črevesnih celic so aminopeptidaze, ki razgrajujejo proteine z N-konca. Celični proteini se razgrajujejo različno hitro; predvsem hitro se reciklirajo tisti proteini, ki sodelujejo pri regulaciji metabolizma. Eden najbolj kratkoživih proteinov v celicah je ornitin-dekarboksilaza (t1/2=11 min), ki sodeluje pri sintezi poliaminov. Pretvorba celičnih proteinov je reguliran proces. V njem pride do kovalentne vezave ubikvitina (8,5 kDa) na proteine, ki so namenjeni razgradnji. Ubikvitin je evolucijsko zelo ohranjen protein (razlika med kvasovko in človekom je le na 3 mestih od 76). C-terminalni Gly se poveže z Lys na tarčnem proteinu preko izopeptidne vezi (ne gre za običajno povezavo z α-amino skupino, pač pa z ε-amino skupino), ki nastane ob porabi ATP. Pri pripenjanju ubikvitina sodelujejo 3 encimi. Ko je vezan prvi ubikvitin, se naj lahko vežejo še nadaljnji (preko Lys48), tako da so na enem tarčnem proteinu 4 oznake ali več. Odločilno za vezavo ubikvitina je, katera je prva aminokislina v zaporedju tarčnega proteina (pravilo N-konca). Označene proteine razgrajuje proteasom z velikostjo 26 S. Sestavljen je iz katalitske podenote (20S) in regulatorne podenote (19 S). Katalitski del (700 kDa) je iz 2x14 homolognih podenot, ki so razporejene v 4 obročih (po 7); zgornji in spodnji predstavljata podenote α, srednja dva pa podenote β. Aktivna mesta so na nekaterih podenotah β in to v notranjosti sodčkaste strukture. Substrat razgrajujejo do dolžine 7-9 aminokislinskih ostankov. 20 S-proteasom lahko z obeh strani zapirata regulatorni enoti, sestavljeni iz po 20 podenot (700 kDa), ki se vežejo na poliubikvitinske verige. Del podenote 19 S je tudi 6 ATPaz, ki verjetno pomagajo pri razvitju substrata in konformacijskih spremembah katalitske podenote, ki omogočajo vstopanje substrata v notranjost proteasoma. Na regulatornem delu je tudi izopeptidaza, ki odceplja ubikvitin. Pri prokariontih ubikvitina ni, čeprav imajo proteasomu podobne strukture. Ubikvitinu strukturno podobni proteini pa pri prokariontih sodelujejo pri biosintezi koencima tiamina. Po tem, ko proteaze razgradijo proteine do monomerov, se ti lahko uporabijo za ponovno sintezo proteinov ali pa se v jetrih razgradijo. Najprej se odcepi amino-skupina, saj dušikove spojine ne nastopajo v ciklih prenosa energije. Preostanek pa organizem uporabi kot gorivo. Najprej pride do odcepa α-aminske skupine (transaminacija); nastanejo α-keto-kisline. Odcepljene aminske skupine se vežejo na α-ketoglutarat, ki preide v glutamat, ta pa se deaminira do NH4+; pri tem kot akceptor deluje NAD+ ali NADP+. Primer encima, ki katalizira odcep aminske skupine, je mitohondrijska aspartat-aminotransferaza, ki je odvisna od koencima piridoksala. Tudi več drugih encimov, ki sodelujejo pri razgradnji aminokislin ima kot kofaktor piridoksal v obliki pridoksal-fosfata. Samo Ser in Thr se lahko deaminirata direktno v dehidratacijski reakciji, vse ostale aminokisline pa prehajajo preko α-ketoglutarata. V mišicah in drugih tkivih prav tako prihaja do razgradnje aminokislin z odcepom aminske skupine. Dušik pa se mora pretvoriti do oblike, ki se lahko prenese do jeter, kjer pride do končne razgradnje v ciklu uree. Transportna oblika dušika je lahko Ala, ki iz krvi preide v jetra, se modificira nazaj do piruvata in porablja za glukoneogenezo, aminska skupina pa se pretvori v ureo. Druga transportna oblika dušika iz tkiv pa je Gln. Amoniak, ki nastane pri razgradnji aminokislin, se delno porabi za biosintezo dušikovih spojin, prebitek pa se pri večini kopenskih vretenčarjev pretvori v ureo in izloči (urotelni organizmi). V ciklu uree najprej v mitohondrijih iz CO2, NH4

+ in 2 ATP nastane karbamoil-fosfat. Ta potem modificira ornitin do citrulina, ki zapusti mitohondrije in se v citosolu kondenzira z aspartatom v argininosukcinat, ta pa razpade na Arg in fumarat. S hidrolizo Arg se regenerira ornitin, nastane pa še urea. Za sintezo 1 molekule uree se porabijo 4 molekule ATP. V reakciji nastaja fumarat, ki vstopa v cikel citronske kisline. Alternativni način izločanja dušika pa je direktno kot amoniak (amoniotelni organizmi: vodni vretenčarji in

nevretenčarji) ali kot sečna kislina (urikotelni organizmi, npr. ptice) – v slednjem primeru izločanje ni odvisno od vode. Ogljikovi atomi iz razgrajenih aminokislin se vključujejo v različne metabolične intermediate, ki vodijo do sinteze glukoze ali pa se oksidirajo v ciklu citronske kisline. Vseh 20 aminokislin se pretvarja v skupaj 7 intermediatov: piruvat, acetil-CoA, acetoacetil-CoA, sukcinil-CoA, α-ketoglutarat, fumarat in oksaloacetat. Ketogene so tiste aminokisline, ki se razgrajujejo do acetil-CoA ali acetoacetil-CoA. Te lahko tvorijo ketonska telesca ali maščobne kisline. Ostale aminokisline imenujemo glukogene, ker iz njih posredno lahko nastane glukoza. Izključno ketogena sta samo Lys in Leu, nekaj aminokislin ima značilnosti obeh skupin, 14 pa je izključno glukogenih. Nekatere dedne bolezni zadevajo metabolizem aminokislin; najbolj znana je fenilketonurija, ki nastane zaradi pomanjkljivosti fenilalanin-hidroksilaze. Fenilalanin se nabira v vseh telesnih tekočinah, ker se ne more pretvarjati v Tyr, zato se ojača pretvorba v fenilpiruvat, ki je pri zdravih ljudeh stranskega pomena. Posledica bolezni je mentalna zaostalost; možgani imajo nižjo maso, živci so nenormalno mielinirani in refleksi so hiperaktivni. Molekularna osnova razvoja bolezni še ni razjasnjena. Integracija metabolizma (v štud. letu 2003/4 predava prof. Turk, predstavljen je povzetek lanskega predavanja doc. Dolinarja) V živih organizmih potekajo metaboliče poti hkrati in posamezne poti morajo delovati v skladu s statusom ostalih poti, da lahko sledijo potrebam organizma. Poti se stikajo na nekaterih ključnih intermediatih (križiščih) kot so glu-6-P, piruvat in acetil-CoA. ATP nastaja pri oksidaciji gorivnih molekul: glukoze, maščobnih kislin in aminokislin. Večina teh reakcij ima kot intermediat acetil-CoA. C-atomi iz acetilne skupine se v ciklu citronske kisline v celoti oksidirajo do CO2, nastajata pa še NADH in FADH2. To sta prenašalca elektronov, ki jih vodita do dihalne verige. S tem, ko se elektroni prenašajo do O2, prihaja do črpanja protonov skozi notranjo mitohondrijsko membrano, ta gradient protonov pa poganja sintezo ATP (30 molekul iz glukoze, ki se pretvori do CO2). ATP nastaja tudi v glikolizi, vendar bistveno manj kot pri oksidativni fosforilaciji (2 molekuli iz glukoze, ki se pretvori do piruvata). Pri večini biosinteznih poti so produkti bolj reducirani od prekurzorjev. Za potek reakcije sta potrebna ATP in reducent (reducirajoča moč). NADPH je najpomembnejši donor elektronov pri reduktivni biosintezi. Nastaja večinoma pri ciklu pentoza-fosfata. Veliko število različnih bioloških molekul v organizmu nastaja iz majhnega števila gradnikov. Nastajajo pogosto v istih procesih, ki dajejo tudi ATP in NADPH. Tako na primer acetil-CoA, ki je intermediat pri razgradnji večine goriv, služi kot vir 2-C enot za biosintezo mašč. kislin, holesterola, prostaglandinov... Osnovne metabolne poti so torej pomembne za anabolizem in katabolizem. Metabolne poti sinteze in razgradnje so med seboj skoraj vedno ločene, kar omogoča, da so cikli termodinamsko ugodni: biosintezne reakcije so eksergone, ker so povezane z razgradnjo ATP. Ločenost poti omogoča tudi učinkovit nadzor nad metabolizmom v celoti. Informiranost o stanju posameznih komponent metabolnega omrežja in nadzor nad reakcijami omogočajo: alosterične interakcije, kovalentne modifikacije, nivoji encimov, organizacija v celične razdelke in metabolna specializacija organov.

Pretok molekul v metabolnih poteh večinoma ni odvisen od količine substrata, ki je na voljo, pač pa od aktivnosti encimov. Kontrola poteka najpogosteje preko encimov, ki katalizirajo prvo ireverzibilno reakcijo v ciklu (ključno reakcijo). Primer alosterične regulacije uravnavanje glikolize preko fosfofruktokinaze in sinteze maščobnih kislin preko acetil-CoA-karboksilaze. Nekatere regulatorne encime razen alosteričnih interakcij uravnavajo tudi kovalentne modifikacije. Tako na primer fosforilacija poveča aktivnost glikogen-fosforilaze in hkrati zmanjša aktivnost glikogen-sintaze. Za pripenjanje in odcepljanje modificirajočih skupin obstajajo posebni encimi. Kovalentne modifikacije encimov so običajno zadnja stopnja v ojačevalni kaskadi, ki jo sprožijo zelo nizke koncentracije signalnih snovi. Razen tega so kovalentne modifikacije bolj dolgotrajne (nekaj sekund do nekaj minut), medtem ko so reverzibilne alosterične interakcije kratkotrajne (nekaj milisekund do sekund). Kontrola poteka tudi na nivoju biosinteze (-> koncentracije) encimov. Na hitrost sinteze in razgradnje mnogih regulatornih encimov vplivajo hormoni. Pri evkariontih prispeva k regulaciji tudi prisotnost razdelkov (kompartmentalizacija): neka molekula v citosolu bo vstopala v druge poti kot enaka molekula v mitohondriju. Pretok molekul skozi notranjo mitohondrijsko membrano je uravnavan proces; tako npr. maščobne kisline prehajajo v mitohondrij samo, kadar je potrebna energija. Pri višjih evkariontih je specializacija funkcij še bolj izrazita zaradi prisotnosti organov, ki so prevzeli nekatere posebne funkcije. Metabolna specializacija organov je posledica diferencialnega izražanja genov. Pregled glavnih metaboličnih poti in kontrolnih mest: glikoliza: Glikoliza proizvaja ATP iz glukoze, hkrati pa zagotavlja ogljikov skelet za biosintezo. V citosolu se v zaporedju reakcij 1 molekula glukoze pretvori v 2 molekuli piruvata ob hkratni tvorbi po 2 molekul ATP in NADH. V reakciji, ki jo katalizira gliceraldehid-3-fosfat-dehidrogenaza se porablja NAD+, ki pa se nato regenerira. Regeneracija lahko poteka v anaerobnih pogojih ob pretvorbi piruvata v laktat, v aerobnih pogojih pa s prenosom elektronov z NADH na O2 preko verige elektronskega transporta. Kontrola procesa poteka v glavnem preko fosfofruktokinaze, pri čemer je ATP hkrati substrat (v reakciji prenosa fosforila) in regulatorna molekula, pri čemer se veže v različnih vlogah na različna mesta. Aktivatorja sta AMP in fruktoza-2,6-bisfosfat [F-2,6-BP], ATP in citrat pa sta inhibitorja. Hitrost glikolize je odvisna od potreb po ATP (malo ATP => veliko AMP) in po gradnikih (nivo citrata). V jetrih je najvažnejši regulator F-2,6-BP; njegov nivo je odvisen od aktivnosti kinaze (ki ga sintetizira iz F-6-P) in fosfataze (ki mu odceplja 2-P). Ko je nivo glukoze v krvi nizek, se ob delovanju glukagona aktivira fosfataza in inhibira kinaza, zato nivo F-2,6-BP pada, s tem pa aktivnost fosfofruktokinaze. Glikoliza se zaustavlja, viški glukozi preidejo v kri in prehajajo v druga tkiva. cikel citronske kisline in oksidativna fosforilacija: Reakcije oksidacije gorivnih molekul tečejo v mitohondrijih. Vstopna točka večine gorivnih molekul je acetil-CoA. Ob popolni oksidaciji acetilnega dela pride do tvorbe 1 molekule GTP in 4 parov elektronov (v obliki 3 molekul NADH, 1 FADH2). Ti elektroni se prenašajo na O2 preko transportne verige elektronov, kar ustvarja gradient protonov, ta pa poganja sintezo 9 molekul ATP. Donorji elektronov se oksidirajo in reciklirajo v ciklu citronske kisline, a le takrat, ko se ADP ponovno fosforilira v ATP. To imenujemo "respiratorna kontrola", ki zagotavlja, da hitrost delovanja cikla citronske kisline ustreza potrebam po ATP. Prebitek ATP zmanjšuje aktivnost dveh ključnih encimov v ciklu: izocitrat-dehidrogenaze in α-ketoglutarat-dehidrogenaze. Hkrati cikel citronske kisline deluje v anabolnih procesih, saj ob delovanju piruvat karboksilaze zagotavlja intermediate za biosintezo: npr. sukcinil-CoA za sintezo porfirinov, citrat za sintezo maščobnih kislin. cikel pentoza-fosfata: Cikel poteka v citosolu v 2 stopnjah: oksidativna dekarboksilacija glu-6-P in neoksidativna pretvorba 5-C fosfo-sladkorjev v fosforilirane 3-C in 6-C intermediate glikolize. V prvi stopnji nastajata 2 NADPH (za reduktivno biosintezo) in 1 riboza-5-P (za sintezo nukleotidov). Ključna reakcija je dehidrogenacija glu-6-P, uravnava pa jo nivo NADP+, ki je akceptor elektronov. V 2. stopnji pa riboze vstopajo v glikolizo (katabolizem) ali pa iz intermediatov glikolize nastajajo riboze.

glukoneogeneza: V jetrih in ledvicah nastaja glukoza iz prekurzorjev, ki niso ogljikovi hidrati – npr. laktat, glicerol, aminokisline. Izhodišče cila je piruvat, ki se v mitohondriju karboksilira v oksaloacetat, ta pa se v citosolu pretvori v fosfoenol-piruvat. Regulacija glukoneogeneze poteka recipročno glede na glikolizo, tako da je visoko aktivna vedno samo ena pot. Fruktoza-1,6-bisfosfatazo zavira AMP in aktivira citrat, ki pa imata nasprotni učinek na fosfofruktokinazo (glikoliza). Isti encim zavira tudi F-2,6-BP – ko je glukoze dovolj, je veliko tudi F-2,6-BP, ki inhibira glukoneogenezo in aktivira glikolizo. metabolizem glikogena: Fosforilaza katalizira cepitev glikogena v prisotnosti ortofosfata; nastaja glu-1-P, ki se hitro pretvarja v glu-6-P za nadaljnji metabolizem. Pri sintezi glikogena iz UTP in glu-1-P nastaja UDP-glukoza, ki se ob delovanju glikogen sintaze dodaja na rastočo verigo glikogena. Regulacija poteka preko ojačevalne kaskade, ki jo sprožajo hormoni. Ko je aktivna fosforilaza, je sintaza neaktivna in obratno. Oba encima regulira fosforilacija in nekovalentne alosterične interakcije. metabolizem maščobnih kislin: Sinteza maščobnih kislin poteka v citosolu z dodajanjem enot 2-C na rastočo verigo, pritrjeno na acilnem nosilnem proteinu (ACP). Aktivirani intermediat je malonil-CoA, ki nastaja s karboksilacijo acetil-CoA. Acetilne skupine prehajajo v cistosol iz mitohondrija kot citrat preko citratno-malatnega prenosa. V citosolu se citrat cepi in nastane acetil-CoA. Citrat pa ne samo prenaša acetil-CoA, pač pa v citosolu tudi stimulira ključni encim acetil-CoA-karboksilazo. Ko je prisotnega veliko ATP in acetil-CoA, nivo citrata narašča, kar pospešuje sintezo maščobnih kislin. Razgradnja mašč. kislin poteka v mitohondriju. Vanj prihajajo maščobne kisline s posredovanjem karnitina in se v matriksu razgradijo v acetil-CoA (β-oksidacija). Ta prehaja v cikel citronske kisline, če je prisotnega dovolj oksaloacetata, nastajajo pa lahko tudi ketonska telesca. V procesu β-oksidacije nastajata FADH2 in NADH, ki preneseta svoje elektrone na kisik v verigi transporta elektronov. Tako kot pri ciklu citronske kisline β-oksidacija poteka samo, če se NAD+ in FAD regenerirata. Na ta način je hitrost razgradnje maščobnih kislin povezana s potrebami po ATP. Malonil-CoA (prekurzor sinteze) je inhibitor razgradnje mašč. kislin s tem, da preprečuje tvorbo acil-karnitina in s tem onemogoča prehajanje mašč. kislin v mitohondrije. Križišča metabolnih poti Cikli se križajo predvsem v treh intermediatih: glu-6-P, piruvatu in acetil-CoA. glukoza-6-fosfat Ko vstopi glukoza v celico, se hitro fosforilira do glu-6-P, nato pa se lahko shrani kot glikogen, razgradi do piruvata ali pretvori v riboza-5-P. Glikogen nastaja ob prebitku glu-6-P in ATP. Če pa je ATP malo ali se pojavi potreba po C-ogrodjih za biosintezo, se začne glikolizna pot razgradnje proti piruvatu (dvojna vloga: katabolizem ali anabolizem). Lahko pa pride do prehajanja glu-6-P v cikel pentoza-fosfata, ki zagotavlja NADPH za redukcijsko biosintezo in riboza-5-P za sintezo nukleotidov. Glu-6-P nastaja z mobilizacijo glikogena ali s sintezo iz piruvata in glukogenih aminokislin v glukoneogenezi. piruvat To je α-keto-kislina tipa 3-C. Nastaja večinoma iz glu-6-P, pa tudi iz Ala (ter drugih aminokislin) in iz laktata, lahko pa se tudi pretvarja v laktat (dehidrogenaza), pri čemer se regenerira NAD+; to omogoča, da se glikoliza nekaj časa nadaljuje tudi v anaerobnih pogojih (mišice: tako nastali laktat se kasneje pretvarja nazaj v piruvat v nemišičnih tkivih). Piruvat se lahko v citosolu tudi vrača v Ala v procesu transaminacije. V mitohondrijih se piruvat ireverzibilno pretvarja v oksaloacetat (karboksilacija), kar predstalja prvo stopnjo glukoneogeneze, hkrati pa intermediat v ciklu citronske kisline. Piruvat pa lahko v mitohondrijih

prehaja tudi v acetil-CoA (oksidativna dekarboksilacija). To je ključnega pomena za več poti – C-atomi aminokislin in oglj. hidratov tako prehajajo v oksidacijo v ciklu citronske kisline ali v sintezo lipidov. Pretvorbo v acetil-CoA katalizira piruvat-dehidrogenazni kompleks, ki ga regulira več alosteričnih interakcij in kovalentnih modifikacij. Piruvat se hitro pretvarja v acetil-CoA samo, če so potrebe po ATP ali fragmentih 2-C za sintezo lipidov. acetil-CoA Predstavlja aktivirano enoto 2-C in nastaja predvsem iz piruvata in iz maščobnih kislin, delno pa tudi iz ketokenih aminokislin. Metabolizem acetil-CoA je omejen: acetilna enota se oksidira do CO2 v ciklu citronske kisline ali pa se 3 molekule združijo v 3-hidroksi-metilglutaril-CoA, prekurzor holesterola in ketonskih telesc (transportna oblika acetilnih enot, ki se sproščajo v jetrih in potujejo do perifernih tkiv). Acetil-CoA se lahko tudi izloča v citosol v obliki citrata za sintezo maščobnih kislin. Organi so metabolno različni Možgani: Energijo dobivajo izključno iz glukoze, ki je rabijo ~120 g dnevno (420 kcal=1760 kJ), to je ~60% vse glukoze, ki jo potrebuje mirujoč organizem. Večina energije (do 70%) se porablja za vzdrževanje membranskih potencialov (Na/K) pri prenašanju impulzov, nekaj pa še za biosintezo nevrotransmiterjev in receptorjev zanje. Glukoza vstopa v možganske celice preko transporterja GLU3, ki zagotavlja konstantno visoke nivoje v celici (~1 mM; v plazmi 4.7 mM). Glukoza ne more nastajati iz mašč. kislin, ker so te v plazmi vezane na albumin in ne morejo vstopiti v celice. V primeru stradanja lahko glukozo delno nadomestijo ketonska telesca, ki nastajajo v jetrih. Mišice: Gorivo predstavljajo glukoza, mašč. kisline in ketonska telesca. Zaloge glikogena v telesu so večinoma (3/4) v mišicah. Glikogen se pretvarja v glu-6-P samo za lastne potrebe, saj mišične celice nimajo glu-6-fosfataze, ki bi generirala glukozo za prehod v kri. V aktivnih skeletnih mišicah je glikoliza bolj aktivna od cikla citronske kisline, zato se veliko piruvata iz glikolize reducira do laktata. Del laktata prehaja v jetra, kjer se pretvarja v glukozo. V tem (Corijevem) ciklu se del metabolnih obremenitev mišic prenese na jetra. V mišicah pa piruvat delno preide tudi v Ala, ki prav tako preide v jetra. Tam se dušik odstrani (preide v ureo), preostanek pa pretvori nazaj v piruvat, ki preide v glikozo ali v maščobne kisline. Opisani procesi so značilni za aktivno mišico, medtem ko v mirujoči mišici večino (85%) energije zagotavljajo maščobne kisline. Srčna mišica ne more delovati v anaerobnih pogojih, tako kot skeletna. V srcu tudi ni rezerv glikogena, zato dobiva energijo pretežno iz mašč. kislin, delno pa tudi iz ketonskih telesc in laktata. Acetoacetat je v srcu preferenčno gorivo (pred glukozo). Maščobno tkivo: Triacilgliceroli predstavljajo največjo zalogo energije v telesu. Adipociti so specializirani za esterifikacijo maščobnih kislin in za njihovo sproščanje iz triacilglicerolov. Sinteza maščobnih kislin sicer poteka v jetrih, kjer pride do esterifikacije do glicerol-fosfata; nastane triacilglicerol, ki se nato veže na proteine ter kot lipoproteinski delci potujejo do adipocitov. Izvencelična lipoprotein-lipaza (stimulira jo posredno insulin) nato odcepi mašč. kisline, ki vstopijo v celico. V adipocitih pride nato do aktivacije in prenosa teh derivatov CoA na glicerol-3-P, ki pa nastaja iz glukoze. Ko nastopi potreba, se triacilgliceroli z intracelularnimi lipazami hidrolizirajo do mašč. kislin in glicerola. Odcep prve mašč. kisline je reguliran preko fosforilacije (na katero vplivajo hormonski signali: epinefrin povzroči nastajanje cAMP, ki aktivira protein kinazo). Glicerol se vrača v jetra, maščobne kisline pa se reciklirajo v adipocitih, če je le na voljo dovolj glicerol-3-P, sicer pa prav tako prehaja v jetra. Na to, ali se maščobne kisline sproščajo v kri, vpliva predvsem nivo glukoze v adipocitih.

Ledvica: Glavna naloga ledvic je tvorba urina, ki je topilo za odpadne produkte in zagotavljanje osmolarnosti telesnih tekočin. Krvna plazma se prefiltrira skozi ledvica ~60x dnevno, vendar se večina snovi ponovno absorbira, za kar pa se porablja veliko energije. Zato ledvica (0.5% teže telesa) porabijo 10% vsega kisika, ki se v telesu porablja za celično dihanje. Ob stradanju v ledvicah poteka glukoneogeneza, ki zagotavlja do 50% krvne glukoze. Jetra: Glavna naloga je zagotavljanje goriv za druge organe. Ker gre kri iz prebavil najprej v jetra, se tam uravnavajo nivoji mnogih metabolitov v krvi. Jetra iz krvi odstranijo 2/3 vse glukoze in vse monosaharide. Glukoza se pretvori v glu-6-P in naprej predvsem v glikogen, ki se ga precej shrani kar v jetrih. Nekaj glu-6-P se pretvori v acetil-CoA (→ mašč. kisline, holesterol, žolčne soli), nekaj pa v ciklu pentoza-fosfata zagotavlja NADPH za reduktivno biosintezo. Glikogen se lahko razgradi do glukoze, ki prehaja v kri, glukoza pa lahko nastaja tudi z glukoneogenezo (← laktat in Ala iz mišic, glicerol iz mašč. tkiva, glukogene aminokisline iz hrane). V jetrih se uravnava tudi metabolizem lipidov. V pogojih obilja goriv prihaja do eseterifikacije maščobnih kislin, ki izvirajo iz prehrane ali sinteze v jetrih, in prehajanja v kri v obliki VLDP (lipoproteini z zelo majhno gostoto). V pogojih stradanja pa jetra pretvarjajo maščobne kisline v ketonska telesca. Regulacija poteka na nivoju prehajanja mitohondrijske membrane. Maščobne kisline z dolgimi verigami jo lahko prehajajo le, če so vezane na karnitin, to vezavo pa katalizira karnitin-aciltransferaza I. Inhibitor tega encima je malonil-CoA, intermediat sinteze maščobnih kislin. V njegovi prisotnosti maščobne kisline ne morejo vstopati v mitohondrij, kjer bi sicer prišlo do β-oksidacije in tvorbe ketonskih telesc. Zato se mašč. kisline izločajo in nabirajo v adipocitih, kjer se vgrajujejo v triacilglicerole. Nivo malonil-CoA pa je v pogojih stradanja nizek in ketonska telesca lahko nastajajo. Jetra so pomembna tudi za metabolizem aminokislin, ki izhajajo iz hrane. Večino absorbiranih aminokislin iz prebavil jetra prestrežejo, nekaj pa jih ostane v krvi za uporabo v drugih tkivih. Aminokisline so namenjene v prvi vrsti za biosintezo proteinov, ne pa za razgradnjo. To je biokemijsko mogoče uravnavati, ker imajo aminoacil-tRNA-sintetaze večjo afiniteto do aminokislin kot encimi, ko sodelujejo pri njihovi razgradnji. Ko pa vendarle pride do razgradnje, pa se najprej odcepi dušik in pretvori v ureo. Dnevno se je izloči 20-30 g. Preostale α-keto-kisline se porabljajo za glukoneogenezo ali za sintezo maščobnih kislin. Lastne potrebe po energiji jetra zadovoljijo prav iz α-keto-kislin; glikoliza v jetrih je namreč namenjena predvsem za tvorbo biosinteznih gradnikov. Prehranjevanje in stradanje povzročata spremembe v metabolizmu Insulin predstavlja signal sitosti: stimulira nastajanje glikogena, triacilglicerolov in proteinov. Izločanje inzulina iz trebušne slinavke stimulira visok nivo glukoze in parasimpatični živčni sistem. Glukagon signalizira nizek nivo glukoze v krvi in pospešuje razgradnjo glikogena ter glukoneogenezo v jetrih, kakor tudi hidrolizo triacilglicerolov v maščobnem tkivu. Ob vsakem obroku pride do povečanega izločanja inzulina in zmanjšanja izločanja glukagona. Zato mišice in jetra začenjajo pospešeno sintetizirati glikogen. Po nekaj urah pride do padca koncentracije glukoze v krvi, zato pride do obrnjenega procesa. Jetra in mišice začenjajo kriti lastne potrebe po energiji iz maščobnih kislin, tako da je glukoza na voljo možganom. Prilagoditve metabolizma ob stradanju so namenjenje zmanjševanju razgradnje proteinov. Nekaj dni po začetku stradanja jetra začenjajo tvoriti in izločati v kri velike količine ketonskih telesc in po nekaj tednih ta postanejo glavni vir energije za možgane. Potrebe po glukozi se tako zmanjšajo in preprečijo razgradnjo mišičnih proteinov ter zvečajo možnost preživetja. Pri sladkorni bolezni prihaja do metabolnih motenj zaradi nezadostne sinteze inzulina in prebitka glukagona glede na potrebe organizma. Zato prihaja do povečanja nivoja glukoze v krvi in prekomerne tvorbe ketonskih telesc, kar lahko pripelje do acidoze, kome in smrti. Izbira goriva med mišično aktivnostjo je odvisna od intenzitete in trajanja

Tek na kratke proge poganjajo ATP, kreatin-fosfat in anaerobna gllikoliza. Pri teku na dolge proge pa so procesi aerobni in energija prihaja z oksidacijo mišičnega glikogena in maščobnih kisin (iz adipocitov). Etanol spremeni energetski metabolizem v celici Etanol se v jetrih pretvarja preko acetaldehida (alkohol dehidrogenaza) do acetata (aldehid dehidrogenaza). Ob oksidaciji zaužitega etanola prihaja do prekomerne tvorbe NADH in protonov, kar ima več posledic: zaradi povečane koncentracije mlečne kisline in ketonskih telesc pride do acidoze (znižanja pH krvi). Do poškodbe jeter pride zaradi prekomerne tvorbe maščob (← NADH) in acetaldehida, ki je zelo reaktiven. Imunološke tehnike (niso izpitna snov)