UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA

NATÁSSIA CRISTINA MARTINS OLIVEIRA

ESTUDO DOS NICHOS PERIVASCULAR E VÁSCULO-

NERVOSO COMO FONTE DE CÉLULAS ESTROMAIS

MESENQUIMAIS NA POLPA DENTÁRIA HUMANA

Piracicaba

2016

NATÁSSIA CRISTINA MARTINS OLIVEIRA

ESTUDO DOS NICHOS PERIVASCULAR E VÁSCULO-

NERVOSO COMO FONTE DE CÉLULAS ESTROMAIS

MESENQUIMAIS NA POLPA DENTÁRIA HUMANA

Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de

Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como

parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de

Doutora em BIOLOGIA BUCO-DENTAL, na área de

HISTOLOGIA E EMBRIOLOGIA.

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Rocha Marques

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO

FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA

Natássia Cristina Martins Oliveira E ORIENTADA

PELO PROF. DR. Marcelo Rocha Marques.

Piracicaba

2016

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho aos meus pais Abadia e Raimundo, às

minhas irmãs Andreia e Nívea, aos meus sobrinhos Nicole e

Benjamin, e ao meu noivo Wanderson pelo amor incondicional,

suporte emocional e compreensão nos momentos de ausência.

AGRADECIMENTOS

À Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP) da Universidade Estadual de

Campinas (UNICAMP), na pessoa de seu diretor, Prof. Dr. Guilherme Elias Pessanha

Henriques.

À Profa. Dra. Cínthia Pereira Machado Tabchoury, coordenadora geral da Pós-

Graduação, e à Profa. Dra. Maria Beatriz Duarte Gavião, coordenadora do Programa de Pós-

Graduação em Biologia Buco-dental, da FOP-UNICAMP.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela

concessão da bolsa de doutorado, que me permitiu dedicação exclusiva à pesquisa.

Ao meu orientador Marcelo Rocha Marques, pela paciência, compreensão e

presença constante ao longo desses 4 anos. Deixo aqui minha admiração pela sua perseverança

e dedicação à pesquisa, pela sua disponibilidade para discutir questões profissionais e pessoais

sempre que precisei, e por além de docente, ser amigo dos alunos.

Aos professores doutores membros da banca pelo aceite e contribuição na melhoria

deste trabalho, Katiucia Batista da Silva Paiva, Karina Gonzales Silvério Ruiz, Paula Dechichi

Barbar e Alexandre Augusto Zaia.

Aos professores da área de Histologia e Embriologia da FOP-UNICAMP: Sérgio

Roberto Line, pelo exemplo de simplicidade, humildade e sabedoria; Ana Paula de Souza, pela

oportunidade de crescimento profissional e conhecimento no estágio em docência e pelas

valiosas considerações na qualificação do meu doutorado; e Pedro Duarte Novaes, pela

seriedade que realiza suas funções nesta instituição.

Ao Prof. Paulo Cézar Simamoto Júnior, à Profa. Paula Dechichi Barbar, à Profa

Camilla Christian Gomes Moura, e ao Prof. Conrado Aparicio minha eterna gratidão por terem

me iniciado na carreira científica, na docência e na pesquisa.

Aos técnicos de laboratório Gustavo Narvaes, pelo apoio no laboratório de cultura

de células; Cidinha Varela, pela microtomia das amostras; Flávia Mariano Rodrigues e Fabio

Teo, pela ajuda com a citometria de fluxo, assim como à doutoranda Lívia Alves.

Ao Prof. Alan Roger dos Santos Silva, do departamento de Estomatopatologia, pela

disposição em nos ajudar com as reações de imunohistoquímica e ao pós-doc Felipe Paiva

Fonseca, do mesmo departamento, que além da digitalização das imagens, muito contribuiu

para meu exame de qualificação, participando da banca avaliadora.

À “minha” aluna de iniciação científica, que acabou virando uma grande

companheira, Tatiane Barbosa e à mestranda Marta Bazzano pelo auxílio e disposição na coleta

e processamento dos dentes, bem como isolamento das células.

Aos meus colegas da FOP, Ingrid Sousa, Eduardo Eurioste, Roger Guedes, Marta

Bazzano, Mayra Faria, Gabriell Borgato, Zulieth Arrieta, Manuel Espejo, Francielly Felipetti,

Maria Lembring, Aline Planello, Luciana Mofatto, Danielle Portinho, Rodrigo Silva, Carolina

Carneiro, Carine Oliveira, Carlos Velazco, Miki Saito, Mércia Cunha, Thaís Oliveira, Simone

Busato, Érika Harth, Lívia Alves, Nilva Cervigne, Juliana Neves, Gustavo Narvaes, Eliene

Narvaes, Flávia Rodrigues, Adriano Luis e Suzete Neder, pela contribuição no meu crescimento

profissional e científico, e pelos momentos de descontração e risadas que tornaram os meus

dias mais fáceis.

Aos meus amigos de Uberlândia (MG), Renata Alves, Daiane Almeida, Paula

Caetano, Sara Pires, Daniela Santos, Talita Martins, Ana Paula Viadanna, Naila Machado,

Sandro Mayrink, Mauro Marques, Vinícius Silva, pelo apoio e torcida mesmo à distância, e à

minha eterna mestre e tutora, Cléo Geovanini. Podem ter certeza, que cada um de vocês

contribuiu grandemente para a idealização da pessoa que eu gostaria de ser e para a trajetória

profissional que eu venho traçando.

Às pessoas que me acolheram em Piracicaba muitas vezes fazendo às vezes da

família que estava longe, Leudiana Miranda, Juliane Gomes, Ana Carolina Correia, Beatriz

Sahadi, Jaqueline Correia, Fernanda Gennaro, Luiza Fernandes, Graciele Dib, Paula Pafetti,

Amanda Falcão, Márcia Fernandes, Thiago e Gabriela Bessa.

Ao taxista “Seu Mineiro”, pelas inúmeras vezes que se levantou de madrugada para

ir me buscar na faculdade, mesmo que a corrida não fosse valer a pena. Você foi um pai para

mim aqui e sou extremamente grata por saber que posso contar com o senhor.

Aos meus pais, às minhas irmãs, aos meus sobrinhos, aos meus cunhados e à minha

sogra, por terem compreendido todas as vezes que não pude estar presente em datas

comemorativas e por todas as vezes que não pude dar a atenção devida porque estava em

experimento.

À minha mãe, em especial, obrigada pela paciência e por não ter desistido de falar

comigo, apesar da correria. Você é meu exemplo, minha heroína e meu grande porto seguro.

Ao meu melhor amigo, que por coincidência é meu noivo e grande incentivador

pessoal e profissional, Wanderson. Gratidão por ter você ao meu lado, pelos ensinamentos

diários, pelas discussões filosóficas, pelo seu otimismo e positividade e mais do que tudo, pelo

seu amor.

EPÍGRAFE

“É melhor atirar-se à luta em busca de dias melhores, mesmo

correndo o risco de perder tudo, do que permanecer estático,

como os pobres de espírito, que não lutam, mas também não

vencem, que não conhecem a dor da derrota, nem a glória de

ressurgir dos escombros. Esses pobres de espírito, ao final de sua

jornada na Terra não agradecem a Deus por terem vivido, mas

desculpam-se perante Ele, por terem apenas passado pela vida.”

Bob Marley

RESUMO

Células estromais mesenquimais multipotentes (MSCs) têm sido reportadas em

uma estreita relação espacial com vasos sanguíneos em diversos tecidos adultos humanos e,

mais recentemente, com o feixe vásculo-nervoso (FVN) que acompanha arteríolas em modelo

de incisivo murino. Tal localização parece ser importante nas funções que estas células exercem

nos tecidos pós-natais, uma vez que estariam estrategicamente posicionadas para manter a

homeostasia e o reparo dos mesmos. Neste sentido, o presente projeto teve como objetivo

avaliar uma possível associação de células estromais mesenquimais indiferenciadas com os

nichos perivascular e vásculo-nervoso na polpa dentária humana. Para tanto, foram

selecionados 14 pacientes de ambos os gêneros, com idade entre 13 e 30 anos, e que tinham

indicação de remoção de dois terceiros molares contralaterais hígidos e sem doença periodontal.

Um dos dentes foi destinado à cultura de células: a polpa dentária foi coletada, digerida e

plaqueada para determinação da frequência de células estromais mesenquimais (por meio do

ensaio de CFU-F) e para caracterização das mesmas (por ensaios de diferenciação in vitro e

imunofenotipagem). O outro dente foi fixado e destinado ao processamento histológico de

rotina para imunomarcação de CD34, α-SMA e S100, a fim de localizar na polpa vasos

sanguíneos em geral e arteríolas associadas a fibras/feixes nervosos. A frequência de CFU-F

foi contada para cada paciente e os cortes histológicos foram digitalizados para determinação

da densidade de área vascular (DAV) e densidade de área de arteríolas associadas a nervos

(DAAN) no software Image-Pro Plus®. Aproximadamente 0,01 a 0,05% do total de células

isoladas da polpa no presente estudo eram células estromais mesenquimais indiferenciadas,

capazes de formar CFU-Fs em cultura. Este resultado foi confirmado pela habilidade desta

pequena população de células da polpa, de todos os pacientes, se diferenciarem em pelo menos

duas linhagens mesodérmicas, e pelo fenótipo antigênico das mesmas, com média de

positividade maior que 95% para CD105, CD90 e CD73 e menor que 4% para marcadores de

origem hematopoiética. Após a plotagem das médias de CFU-Fs vs. as médias de densidades

de área para cada paciente, não houve correlação significativa entre as variáveis CFU-F e DAV

(r= 0,188; p= 0,52), rejeitando-se a hipótese de que o nicho perivascular (e provavelmente

pericitos) fosse a maior fonte de células indiferenciadas da polpa. No entanto, houve uma

significativa associação entre as médias de CFU-F e DAAN (r= 0,62; p= 0,0179), aceitando-se

a hipótese de que o nicho vásculo-nervoso (e provavelmente células ao redor de arteríolas

associadas a nervos) originaria a maior parte das células mesenquimais indiferenciadas da polpa

in vitro. Estes dados preliminares são a primeira evidência, na polpa dentária humana, de

ligação indireta entre progenitores mesenquimais e arteríolas envolvidas por fibras/feixes

neurais.

Palavras-chave: Polpa Dentária. Células mesenquimais estromais. Nicho de células-tronco.

Vasos sanguíneos.

ABSTRACT

Multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) have been reported in a close

spatial relationship with blood vessels in several human adult tissues and, more recently, with

the neurovascular bundle (NVB) accompanying arterioles in mouse incisor model. This

localization appears to be important for the functions these cells exert on postnatal tissues, once

it would be strategically positioned to maintain homeostasis and repair, in case of lesions. In

this sense, this project aimed to evaluate a possible association of undifferentiated mesenchymal

stromal cells with perivascular and neurovascular niches in human dental pulp. Fourteen

patients were selected of both genders, aged between 13 and 30, undergoing extraction of two

healthy contralateral third molars, with no periodontal disease. One of the teeth was used for

cell culture: the pulp was collected, digested and plated to determine the frequency of

mesenchymal stromal cells (through CFU-F assay) and to characterize them (for in vitro

differentiation assays and immunophenotyping). The other tooth was fixed and histologically

processed for subsequent labeling by immunohistochemistry for CD34, α-SMA and S100, in

order to localize blood vessels and arterioles associated with nerve fibers/bundles at the dental

pulp. The frequency of CFU-F was counted for each patient and the histological slides were

scanned to determine the vascular area density (DAV) and arterioles associated with nerves

area density (DAAN) at Image-Pro Plus® software. In the present study, about 0.01 to 0.05%

from the pulp-isolated total cells were undifferentiated mesenchymal stromal cells, capable of

CFU-F formation under culture. This result was confirmed by the ability of these pulp cell small

populations, from all patients, to differentiate into at least two mesodermal lineages, and for

their antigenic phenotype with positivity mean greater than 95% for CD105, CD90 and CD73,

and less than 4% for markers of hematopoietic origin. After plotting the data of CFU-F

frequency vs. area densities for each patient, there was no significant correlation between the

averages of CFU-F number and DAV (r= 0.188; p= 0.52), rejecting the hypothesis that

perivascular niche (and probably pericytes) would be the major source of pulp undifferentiated

cells. However, there was a significant association between the averages of DAAN and CFU-F

(r= 0.62; p= 0.0179), accepting the hypothesis that the NVB (and probably the cells around

arterioles associated to nerves) could originate most of pulp undifferentiated mesenchymal cells

in vitro. These preliminary data are the first evidence, in human dental pulp, of indirect link

between mesenchymal progenitors and arterioles associated with neural fibers/bundles.

Keywords: Dental pulp. Mesenchymal stromal cells. Stem cell niche. Blood vessels.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO....................................................................................................... 13

2 REVISÃO DA LITERATURA............................................................................... 15

2.1 Células-tronco 15

2.2 Células-tronco mesenquimais 16

2.3 Células estromais mesenquimais da polpa dentária humana 18

2.4 Origem e localização das MSCs na polpa dentária 20

2.4.1 Origem da crista neural craniana 22

2.4.2 Origem da medula óssea 23

2.4.3 Origem do nicho perivascular 23

2.4.4 Origem do nicho vásculo-nervoso 26

3 PROPOSIÇÃO......................................................................................................... 28

4 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 29

4.1 Seleção de pacientes 29

4.2 Coleta das amostras 30

4.3 Isolamento de células da polpa dentária 31

4.4 Cultura de células da polpa dentária 32

4.5 Ensaio de CFU-F (Colony Forming Units - Fibroblast) 32

4.6 Ensaios de diferenciação in vitro 33

4.7 Citometria de fluxo 35

4.8 Imunohistoquímica 37

4.9 Análise da Imunohistoquímica 38

4.10 Análise Estatística 40

5 RESULTADOS........................................................................................................ 41

5.1 Ensaio de CFU-F 41

5.2 Ensaios de diferenciação in vitro 45

5.3 Citometria de Fluxo 49

5.4 Análise Imunohistoquímica (qualitativa) 51

5.5 Análise Imunohistoquímica (quantitativa) 53

6 DISCUSSÃO............................................................................................................ 56

7 CONCLUSÃO......................................................................................................... 66

REFERÊNCIAS.......................................................................................................... 67

ANEXO 1 – Certificado do Comitê de Ética em Pesquisa...................................... 83

13

1 INTRODUÇÃO

Células-tronco mesenquimais (native Mesenchymal Stem Cells, nMSCs) residem

em diversos órgãos e tecidos adultos, servindo como um reservatório de células indiferenciadas

para manutenção da homeostasia (turn over celular fisiológico) e o reparo de injúrias (da Silva

Meirelles et al., 2006). Os nichos de células-tronco adultas potencialmente oferecem uma fonte

de células autólogas com propriedades imunomodulatórias, tróficas e regenerativas que podem

ser úteis em uma ampla variedade de terapias celulares e na engenharia tecidual (da Silva

Meirelles et al., 2016), ainda sob investigação. No entanto, embora as nMSCs tenham sido

extensamente estudadas, a localização exata dessas células in vivo e quais seriam seus nichos

não estão totalmente esclarecidos até o presente momento.

A maioria dos modelos utilizados para estudar as nMSCs são baseados nas suas

propriedades in vitro (capacidade de se aderirem ao plástico, diferenciação multipotencial e

expressão de determinados antígenos de superfície) sendo, portanto, oportuno chamá-las de

células estromais mesenquimais multipotentes (Multipotent Mesenchymal Stromal Cells,

MSCs), ao invés de nMSCs, para melhor descrevê-las em cultura (Dominici et al., 2006).

Baseados principalmente nestes critérios in vitro, vários autores propuseram que o nicho in vivo

das MSCs em diversos tecidos adultos seria o nicho perivascular e que os pericitos, em

específico, seriam sua contrapartida in situ (da Silva Meirelles et al., 2006; Covas et al., 2008;

da Silva Meirelles et al., 2008; Crisan et al., 2008; Corselli et al., 2012; da Silva Meirelles et

al., 2015a; da Silva Meirelles et al., 2015b), inclusive na polpa dentária humana (Alliot-Licht

et al., 2001; Shi e Gronthos, 2003; Téclès et al., 2005; Arthur et al., 2009; Karbanová et al.,

2011; Martens et al., 2012; Machado et al., 2015).

Recentemente, com a incorporação da técnica de rastreamento de linhagem

(lineage-tracing) para o estudo de células-tronco, tornou-se possível identificar toda a progênie

de uma célula individual in vivo durante o desenvolvimento, a manutenção e o reparo tecidual

(Kretzschmar e Watt, 2012). Utilizando-se desta tecnologia, diversos autores demonstraram em

camundongos transgênicos outras origens não-pericíticas para as nMSCs da polpa dentária

murina (Feng et al., 2011; Kaukua et al., 2014; Zhao et al., 2014), além da possível origem

perivascular (Feng et al., 2011; Janebodin et al., 2011; Ishikawa et al., 2012; Pang et al., 2016).

Dentre eles, Zhao et al. (2014) propuseram, em modelo de incisivo de camundongo, que a

regulação e a localização das nMSCs estariam muito mais associadas ao feixe vásculo-nervoso

14

(FVN) do que à perivasculatura. De acordo com os autores, células localizadas ao redor de

arteríolas acompanhadas por nervos e marcadas positivamente para o fator de transcrição Gli1,

um possível marcador de MSCs in vivo até então desconhecido para tal função, originariam as

células mesenquimais indiferenciadas da polpa.

A polpa dentária humana é um tecido conjuntivo frouxo altamente vascularizado e

inervado (Nanci, 2013), sendo reconhecidamente uma fonte de células estromais mesenquimais

multipotentes denominadas DPSCs (Dental Pulp Stem Cells) (Gronthos et al., 2000). Embora

evidências sugiram que as MSCs da polpa estariam em estreita associação espacial com as

paredes dos vasos sanguíneos, até o momento, nenhum estudo avaliou se existe alguma relação

entre as DPSCs e arteríolas associadas a nervos. Considerando que incisivos de camundongos

diferem dos dentes humanos à medida que os primeiros crescem continuamente ao longo da

vida, é oportuno testar se a associação proposta por Zhao et al. (2014) se mantém na polpa

dentária humana. Além do mais, identificar os diferentes nichos de células-tronco/progenitores

no órgão dental é crucial para o entendimento dos mecanismos que suportam a sobrevivência

das mesmas e a proposição de abordagens terapêuticas de sucesso.

Neste sentido, o objetivo do presente trabalho foi testar a hipótese de que as MSCs

da polpa dentária humana estariam associadas à vasos sanguíneos (nicho perivascular) e/ou

arteríolas acompanhadas de feixes neurais (nicho vásculo-nervoso). Para tanto, baseado em um

modelo proposto por da Silva Meirelles et al. (2009), verificamos se existe uma associação

causal quantitativa entre o número de células mesenquimais indiferenciadas obtidas da polpa,

com a densidade de área de vasos sanguíneos e/ou arteríolas associadas a nervos, utilizando

terceiros molares contralaterais de um mesmo paciente. Estes resultados trouxeram evidência

indireta para a hipótese de que as MSCs na polpa dentária humana estão fisicamente associadas

não só às localizações perivasculares (e possivelmente pericitos), mas principalmente à

localização periarterial associada a nervos (e possivelmente células Gli1+).

15

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Células-tronco

Células-tronco (Stem Cells, SCs), por definição, são aquelas capazes de

autorrenovação ilimitada ou prolongada (habilidade de se dividir e originar células-tronco filhas

com características idênticas) e que originam pelo menos um tipo celular em estágio de

diferenciação mais avançado (Watt e Hogan, 2000). Baseado em sua origem e capacidade de

diferenciação, as células-tronco recebem diversas classificações (Rodríguez-Lozano et al.,

2012). As células-tronco embrionárias (Embryonic Stem Cells, ESCs), por exemplo, podem ser

removidas na fase de zigoto a mórula inicial do embrião, sendo caracterizadas como totipotentes

(capazes de originar todas as células do organismo). As ESCS ainda podem ser removidas a

partir da massa celular interna do blastocisto em embriões pré-implantatórios, sendo

caracterizadas como pluripotentes, isto é, capazes de formar todos os tecidos do corpo, com

exceção dos anexos embrionários (Hynes et al., 2012).

Indivíduos adultos também possuem células-tronco, as células-tronco adultas ou

pós-natais (Adult Stem Cells, ASCs), que funcionam como reservatórios para a manutenção,

renovação e reparo dos tecidos nos quais se encontram (da Silva Meirelles et al., 2006). Em

mamíferos, as ASCs normalmente permanecem em estado quiescente por longos períodos, ou

seja, fora do ciclo celular e com metabolismo baixo, mas podem tornar-se ativas (entrando no

ciclo celular novamente) frente a necessidades fisiológicas, doenças ou injúrias teciduais (Li e

Clevers, 2010). Uma vez no ciclo celular, as ASCs podem se dividir simetricamente em duas

células-tronco filhas idênticas (autorrenovação), quando a expansão do número de células-

tronco é requerida (como durante o desenvolvimento ou após uma injúria); ou assimetricamente

em uma célula-tronco filha inalterada (autorrenovação) e uma célula filha progenitora

comprometida (diferenciação), garantindo simultaneamente a perpetuação das células-tronco e

a geração de descendentes diferenciados (como durante a renovação fisiológica e o reparo de

uma injúria) (Morrison e Kimble, 2006; Li e Clevers, 2010).

Embora não apresentem a mesma capacidade de diferenciação das embrionárias, as

células-tronco adultas podem ser isoladas virtualmente de qualquer órgão ou tecido (da Silva

Meirelles et al., 2006), sem as questões éticas e legais envolvidas com as ESCs (Chagastelles

et al., 2010). Além do mais, a possibilidade de cultivar células-tronco pós-natais para uso

16

terapêutico posterior no mesmo paciente elimina dificuldades imunológicas de

imunocompatibilidade (rejeição), bem como o risco de transmissão de patógenos (Fortier, 2005;

Chagastelles et al., 2010; Hynes et al., 2012). Desta maneira, as células-tronco adultas estão

emergindo como candidatas atraentes e práticas para uso na medicina regenerativa, seja em

terapias celulares seja na engenharia tecidual (Fortier, 2005; Hynes et al., 2012).

2.2 Células-tronco mesenquimais

A primeira célula-tronco adulta reportada em humanos foi a hematopoiética

(Hematopoietic Stem Cell, HSC) (Till e McCulloch, 1961). Localizada na medula óssea, esta

célula origina as diferentes células do sangue, tanto as da linhagem mielóide (eritrócitos,

megacariócitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos e monócitos) quanto as da linhagem linfóide

(linfócitos T, linfócitos B e células natural killer) (revisado por Nardi e Alfonso, 1999). Além

da HSC, outras células-tronco pós-natais já foram descritas. Exemplos incluem as células-

tronco epiteliais presentes na epiderme e nas cristas intestinais, que originam as células das

camadas do epitélio de revestimento (Slack, 2000); as células-tronco neurais no sistema nervoso

central, que dão origem a neurônios e células da glia (McKay, 1997); as células satélites no

músculo, que originam as fibras musculares (Charge e Rudnicki, 2004); e as células-tronco

mesenquimais (Mesenchymal Stem Cells, MSCs), que também habitam a medula óssea.

Apesar do termo “células-tronco mesenquimais” ter sido utilizado pela primeira vez

por Caplan (1991), as MSCs foram inicialmente isoladas a partir da medula óssea por

Friedenstein et al. (1968) e descritas como células aderentes, fibroblastóides e clonogênicas,

capazes de formar colônias de células-filhas idênticas em cultura que lembravam pequenos

depósitos de osso ou cartilagem, mais tarde denominadas unidades formadoras de colônia de

fibroblastos (Colony Forming Units - Fibroblasts, CFU-F) (Friedenstein et al., 1970). Estudos

posteriores demonstraram que as células às quais Friedenstein et al. (1968) se referiam tinham

capacidade de se diferenciar in vitro em linhagens mesodermais (osso, tendão, cartilagem,

tecido adiposo, tecido muscular) (Caplan, 1991; Prockop, 1997; Pitenger et al., 1999),

ectodermais (células da glia e neurônios) (Kopen et al., 1999; Wislet-Gendebien et al., 2005) e

endodermais (hepatócitos) (Sato et al., 2005).

A capacidade de se diferenciar não apenas em linhagens mesodermais, levou a

questionar a inapropriação do termo “mesenquimal” para descrevê-las (da Silva Meirelles et

17

al., 2006). Somado a isso, ficou claro que nem todas as células aderentes em cultura com

capacidade de se proliferar e diferenciar in vitro, mantinham a habilidade de auto-renovação e

diferenciação in vivo, questionando-se também o rótulo de “células-tronco” (Kfoury e Scadden,

2015). A natureza heterogênea e ambígua das chamadas MSCs aliada à falta de um marcador

específico das mesmas, bem como às diferentes metodologias para seu cultivo e caracterização,

utilizadas de maneira inconsistente entre os pesquisadores (Dominici et al., 2006; Kfoury e

Scadden, 2015), levou a Sociedade Internacional de Terapia Celular (International Society for

Cell Therapy, ISCT) a emitir um esclarecimento sobre sua nomenclatura.

De acordo com a ISCT, o termo “células mesenquimais estromais multipotentes”

(Multipotent Mesenchymal Stromal Cells, MSCs) é a designação recomendada para as células

isoladas de diferentes tecidos que têm sido frequentemente chamadas de “células-tronco

mesenquimais” (Horwitz et al., 2005). Este último termo deve ser reservado apenas às células

que cumprem critérios mais rigorosos de classificação, como auto-renovação e diferenciação in

vivo (Horwitz et al., 2005). A nova nomenclatura manteve o acrônimo amplamente reconhecido

“MSC” em uso (Horwitz et al., 2005). Nesta tese, para evitar confusão dos acrônimos, usaremos

nMSCs para células-tronco mesenquimais nativas (no seu estado nativo in vivo) e MSCs para

células estromais mesenquimais (células em cultura capazes de se diferenciar em pelo menos

um fenótipo mesodermal maduro), assim como propôs da Silva Meirelles et al. (2016).

Logo em seguida, a ISCT propôs um critério mínimo para definir as MSCs humanas

(Dominici et al., 2006), a fim de prover à comunidade científica uma padronização que

permitisse comparações de células com características similares originadas de diferentes

tecidos. De acordo com esse critério, qualquer população de células que satisfaça as seguintes

características, independentemente do seu tecido de origem, é referida como MSC: (i) aderência

ao plástico, sob condições de cultura padrão; (ii) capacidade de diferenciação multipotencial in

vitro, demonstrada por coloração, para osteoblastos, adipócitos e condroblastos; (iii) fenótipo

antigênico mensurado por citometria de fluxo, com mais de 95% da população celular

expressando CD105, CD73, CD90 e menos de 2% da população expressando CD45 (marcador

pan-leucocitário), CD34 (marcador de progenitores hematopoiéticos e células endoteliais),

CD14 ou CD11b (marcadores de monócitos e macrófagos), CD79a ou CD19 (marcadores de

células B) e antígeno leucocitário humano HLA-DR (marcador de MSCs estimuladas).

Subsequentemente à descoberta das MSCs na medula óssea humana, vários outros

estudos as descreveram em inúmeros órgãos e tecidos adultos derivados de todas as três

18

camadas germinativas, como: medula óssea, osso trabecular (Noth et al., 2002), sangue

(Kuznetsov et al., 2001), sinóvia (De Bari et al., 2001), cartilagem (Hiraoka et al., 2006), tecido

adiposo (Zuk et al., 2001), músculo (Nesti et al., 2008), periósteo (Zannettino et al., 2008),

tonsilas (Janjanin et al., 2008), timo (Rzhaninova et al., 2005), fígado (Sato et al., 2005), pele

(Shih et al., 2005), folículo piloso (Cotsarelis et al., 1990), polpa dentária (Gronthos et al.,

2000). Além dos tecidos adultos, as MSCs também foram descritas em tecidos perinatais que

normalmente são descartados logo após o parto, tais como segmentos do cordão umbilical

(vasos, geléia de Wharton e sangue do cordão) (McElreavey et al. 1991; Lee et al., 2004;

Sarugaser et al., 2005), âmnio ou membrana amniótica, córion e placenta (Yen et al., 2005). A

imensa variedade de fontes para isolamento das MSCs fez dessas células um dos tipos mais

estudados de células-tronco adultas, aumentando exponencialmente o número de publicações a

respeito (da Silva Meirelles et al., 2008).

2.3 Células estromais mesenquimais da polpa dentária humana

Populações de células estromais mesenquimais derivadas de tecidos dentais estão

dentre as muitas MSCs que residem em tecidos especializados que foram isoladas e

caracterizadas. O primeiro tipo de célula estromal mesenquimal dentária foi isolado a partir da

polpa de dentes permanentes humanos e nomeado “Dental Pulp Stem Cells” (DPSCs)

(Gronthos et al., 2000). Em seguida, MSCs dos seguintes tecidos dentais foram descritas: de

polpa de dentes decíduos esfoliados ou “Stem cells from Human Exfoliated Deciduous teeth”

(SHED) (Miura et al., 2003), do ligamento periodontal ou “PerioDontal Ligament Stem Cells”

(PDLSCs) (Seo et al., 2004), do folículo dental que circunda o germe dentário em

desenvolvimento até a erupção ou “Dental Follicle Precursor Cells” (DFPCs) (Morsczeck et

al., 2005) e da papila apical de dentes permanentes em desenvolvimento ou “Stem Cells from

Apical Papila” (SCAP) (Sonoyama et al., 2006; Sonoyama et al., 2008). Todas essas populações

de células pós-natais de origem dental possuem qualidades de células estromais mesenquimais

multipotentes (MSCs). Entretanto, a relação de desenvolvimento precisa entre essas diferentes

populações de células-tronco ainda não está clara (Huang G et al., 2009).

Dentre as células estromais mesenquimais derivadas de tecidos dentais, as DPSCs

têm sido o foco de diversos estudos, talvez por compartilhar de algumas características

interessantes à medicina regenerativa como (i) fácil acesso ao sítio de coleta dessas células com

baixíssima morbidade (método não invasivo) (d’Aquino et al., 2008; Yan et al., 2011); (ii)

19

MSCs autólogas podem ser obtidas a partir da coleta da polpa dentária de terceiros molares

amplamente extraídos e rotineiramente descartados (Liu et al., 2006; d’Aquino et al., 2008; La

Noce et al., 2014); (iii) como o terceiro molar é o último dente a se desenvolver em humanos

(começa aos 6 anos de idade), encontra-se em um estágio de desenvolvimento precoce,

fornecendo uma quantidade de tecido pulpar suficiente para isolamento de DPSCs (Liu et al.,

2006; d’Aquino et al., 2008); (iv) mantêm suas propriedades após criopreservação por longos

períodos (Papaccio et al., 2006; Zhang et al., 2006a; d’Aquino et al., 2008; La Noce et al.,

2014), podendo ser utilizadas para estabelecimento de criobancos (Graziano et al., 2007); (v)

demonstram plasticidade para se diferenciarem in vitro nas linhagens odonto/osteogênica,

adipogênica, condrogênica, miogênica, neurogênica, em células epiteliais da córnea, em células

de melanoma e até mesmo em células-tronco de pluripotência induzida (iPS cells) (d’Aquino

et al., 2008; Yan et al., 2011); (vi) compartilham de propriedades imunoprivilegiadas (inibem

a resposta imune) e anti-inflamatórias favoráveis ao alotransplante (d’Aquino et al., 2008;

Leprince et al., 2012; Wada et al., 2013) e já relatadas para MSCs em geral (da Silva Meirelles,

2016); (vii) apresentam interatividade com biomateriais como matriz colágena, hidroxiapatita

(Hidroxyapatite, HA), fosfato tricálcio (TriCalcium Phosphate, TCP), quitosana, biocoral,

titânio e os polímeros biodegradáveis poli(ácido lático) (PLA) e poli(ácido lático-co-ácido

glicólico) (PLGA) (Zhang et al., 2006b; d’Aquino et al., 2008; La Noce et al., 2014).

Devido à sua versatilidade, as DPSCs já foram testadas in vivo em diversos modelos

animais, apresentando resultados positivos na melhora do reparo pós-infarto do miocárdio em

ratos (Gandia et al., 2008); no tratamento de distrofia muscular em cachorros (Kerkis et al.,

2008); na reconstrução do epitélio da córnea em coelhos com deficiência de células-tronco

límbicas (Monteiro et al., 2009; Gomes et al., 2010); na regeneração de tecido ósseo (d’Aquino

et al., 2008), associadas ou não a biomateriais e fatores de crescimento, em defeitos ósseos nos

maxilares de cães (Yamada et al., 2010; Ito et al., 2011; Yamada et al., 2011); no tratamento de

injúria da medula espinhal em ratos (Sakai et al., 2012); na melhora de lesões cerebrais

hipóxico-isquêmicas em ratos (Fang et al., 2013); na melhora da polineuropatia diabética em

ratos (Hata et al., 2015); na cicatrização de tecido lesionado da bexiga por cistite induzida

quimicamente em ratos (Hirose et al., 2015); na regeneração do complexo dentina-polpa após

transplante de DPSCs, associadas ou não a materiais bioativos, em camundongos (Gronthos et

al., 2000; Gronthos et al., 2002; Huang et al., 2010), ratos (Yu et al., 2006) e cães (Wang et al.,

2013); na regeneração do complexo periodontal associada a microscaffolds em camundongos

(Lee et al., 2014); e até mesmo na regeneração completa de dentes utilizando uma construção

20

de germe dentário-like (odontoblastos e osteoblastos diferenciados a partir de DPSCs + células

epiteliais da gengiva + scaffold bioativo) em mini porcos (Yang et al., 2016).

Embora estes e outros dados obtidos por experimentação animal forneçam clara

evidência do potencial das DPSCs para uso em terapias celulares e engenharia tecidual, ensaios

clínicos utilizando essas células não têm sido amplamente relatados (La Noce et al., 2014). A

primeira aplicação clínica de DPSCs foi realizada por D’Aquino et al. (2009b) ao enxertar o

biocomplexo composto por células-tronco/progenitores da polpa humana autológa + scaffold

de esponja colágena em defeitos ósseos na mandíbula, restituindo o tecido ósseo perdido por

completo. Atualmente, existem apenas 12 ensaios clínicos em andamento utilizando DPSCs

listados no banco de dados de estudos clínicos humanos conduzidos em todo o mundo

(ClinicalTrials.gov) contra 623 ensaios utilizando diferentes MSCs.

O desenvolvimento da medicina regenerativa de maneira segura e eficaz exige uma

profunda compreensão da biologia das nMSCs da polpa, como base essencial para o

planejamento e execução de terapias clínicas e regenerativas bem-sucedidas (Huang G et al,

2009). Sendo assim, é importante que sejam feitos mais avanços no entendimento da biologia

das DPSCs no que tange, por exemplo, à sua origem embriológica, localização espacial, nichos

nos quais estão inseridas, potencial de diferenciação, subpopulações, dentre outros, a fim de

melhor explorar a capacidade destas células para tratamento de diversas condições clínicas.

2.4 Origem e localização das MSCs na polpa dentária

A polpa dentária é um tecido conjuntivo frouxo de origem ectomesenquimal,

desenvolvido a partir da papila dental. No início do desenvolvimento embrionário, células da

crista neural craniana (Cranial Neural Crest, CNC) migram para o primeiro arco faríngeo e

participam da diferenciação do mesênquima dental para a formação da papila e folículo dentais

(Thesleff, 2003). Ao longo do desenvolvimento, a polpa dentária torna-se povoada por células

de origem tanto da crista neural que migraram, quanto por células não-neurais intrínsecas,

provavelmente derivadas do mesênquima do primeiro arco (Chai et al., 2000). Desta maneira,

a polpa dentária madura compreende uma população mista de células descendentes da CNC e

do mesênquima (Sloan e Smith, 2007).

Morfologicamente, a polpa dentária adulta é constituída por quatro camadas: (1)

uma camada de odontoblastos na periferia da polpa; (2) uma estreita zona acelular de Weil,

21

logo abaixo dos odontoblastos, apresentando densidade celular reduzida; (3) uma zona rica em

células, adjacente à zona de Weil, com alta densidade celular; e (4) uma região central rica em

vasos sanguíneos, fibroblastos e feixes neurais. As principais células que povoam a polpa são

odontoblastos, fibroblastos, células ectomesenquimais indiferenciadas (células-

tronco/progenitores), células de defesa (macrófagos, linfócitos e células dendríticas), células

nervosas, células vasculares (endoteliais) e perivasculares (pericitos, células musculares lisas e

fibroblastos perivasculares) (Nanci, 2013).

Os odontoblastos são células pós-mitóticas formadoras da dentina que possuem

uma capacidade de reparo e regeneração limitada. Em resposta a estímulos leves do ambiente

(atrição, trauma oclusal ou cárie inicial), odontoblastos pré-existentes aumentam sua atividade

secretora para sintetizar uma matriz dentinária terciária reacional. Por outro lado, fortes

estímulos nocivos (cáries profundas ou exposição pulpar) levam à destruição dos odontoblastos

existentes próximos à injúria. Uma vez que os odontoblastos vizinhos são incapazes de se

dividir, células-tronco ou células progenitoras são recrutadas, migram até a região lesionada e

se diferenciam em odontoblasts-like que formarão a dentina terciária reparadora (Balic et al.,

2010).

A origem e a localização das células-tronco/progenitores mesenquimais na polpa

dentária, assim como em outros tecidos, ainda é controversa. Acredita-se que essas células

residam em áreas específicas chamadas nichos (Scadden et al., 2006). Nichos consistem de

localizações anatômicas particulares que hospedam células-tronco quiescentes distribuídas por

todo corpo, permitindo sua autorreplicação (Mitsiadis et al., 2011). O microambiente específico

do nicho regula como as populações de células-tronco participam na manutenção, reparo e

regeneração do tecido, de acordo com suas necessidades. Sinais específicos derivados do nicho

permitem às células-tronco se manterem vivas e mudarem seu número e destino

(autorrenovação e diferenciação) (Scadden et al., 2006; Djouad et al., 2009). Moléculas

sinalizadoras solúveis como Wnt, Notch, Fator de crescimento de fibroblastos (Fibroblast

Growth Factor, FGF) e proteínas Hedgehog são importantes reguladores parácrinos da função

das células-tronco, com capacidade de induzir sua proliferação e diferenciação (Mitsiadis et al.,

2007).

Expressão aumentada de Notch, após injúria pulpar em molares de ratos, foi

observada no estroma pulpar, na camada odontoblástica e subodontoblástica e em regiões

perivasculares (Lovschall et al., 2005). Expressão da proteína Sonic Hedgehog (Shh) associada

22

a nervos sensoriais próximos de arteríolas foi observada em polpa de incisivos murinos tanto

em situações de homeostasia quanto injúria (Zhao et al., 2014). A expressão diferencial de

Notch e Shh em regiões distintas da polpa dentária, sugere que a mesma pode abrigar diferentes

nichos de células-tronco com capacidades e origens diversas (Lovschall et al., 2005).

Coincidentemente, diferenças nas capacidades de proliferação e diferenciação in

vitro e in vivo das MSCs isoladas da polpa dentária foram descritas em relatos anteriores

(Gronthos et al., 2000; Gronthos et al., 2002; Huang et al., 2006; d`Aquino et al., 2007)

indicando heterogeneidade dentro das populações de DPSC. Essa heterogeneidade, por sua vez,

pode ser atribuída à influência do ambiente local no qual as nMSCs da polpa estão inseridas no

tecido adulto (Janebodin et al., 2011), refletindo a importância do nicho no estabelecimento do

fenótipo e comportamento das células-tronco (Fuchs et al., 2004) às quais ele interage in situ.

Ao longo das passagens em culturas de longo prazo, por exemplo, células-tronco

adultas podem perder sua natureza, incluindo a habilidade de autorrenovação e a capacidade de

multidiferenciação, principalmente devido às condições de cultura in vitro (como a composição

do meio rotineiramente utilizado) não conseguirem simular por completo o nicho in situ dessas

células-tronco (Yan et al., 2011). Pensando em terapias celulares e regenerativas, a etapa de

expansão das células-tronco in vitro é essencial para obter o número de células adequado ao

transplante.

Assim, identificar possíveis nichos de células-tronco/progenitores no órgão dental

é essencial para o entendimento dos mecanismos que suportam a sobrevivência e a

diferenciação das DPSCs, bem como propôr abordagens terapêuticas que levem em conta a

biomimetização in vitro do nicho in vivo dessas células. Três possíveis origens para as as

nMSCs da polpa dentária foram revisadas por Yan et al., (2011): a partir da crista neural

craniana, a partir da medula óssea e a partir do nicho perivascular. Além dessas, discutiremos

o recém proposto nicho vásculo-nervoso como fonte de MSCs da polpa em modelo animal.

2.4.1 Origem da crista neural craniana (CNC)

A primeira hipótese é de que as nMSCs da polpa são derivadas da crista neural

craniana. Do ponto de vista da biologia do desenvolvimento, as células da crista neural originam

a maioria dos tecidos orais e dentais, incluindo a polpa dental (Chai et al., 2000). Assim, é

sensato assumir que as DPSCs in vivo são derivadas do ectomesênquima da CNC (d’Aquino et

23

al., 2009a). Sasaki et al. (2008) demonstraram que as DPSCs contêm subpopulações primitivas

de células-tronco da crista neural, incluindo células precursoras positivas para Nestin, neurônios

positivos para Tuj e células da glia positivas para S100, todos marcadores relacionados à CNC.

Waddington et al. (2009) também demonstraram uma subpopulação de progenitores dentro das

DPSCs marcada para LANGFR (Low-Affinity Nerve Growth Factor Receptor), outro marcador

de células da CNC, que também expressaram STRO-1, vimentina, CD105 e Notch2,

marcadores de células tronco/progenitoras.

2.4.2 Origem da medula óssea

A segunda hipótese é de que as nMSCs da polpa migrariam a partir da medula óssea,

via vasos sanguíneos e se acomodariam na polpa dentária, pelo menos em situações de injúria.

Evidências foram encontradas de que as DPSCs têm propriedades muito similares às MSCs de

medula óssea in vitro (Gronthos et al., 2000; Shi e Gronthos et al., 2003). Análises de

microarray de cDNA demonstraram que ambos os tipos celulares compartilham um perfil de

expressão gênica similar, como marcadores associados ao endotélio, osso e fibroblastos (Shi et

al., 2001).

Posteriormente, Zhou et al. (2010) mostraram, em modelo animal, que MSCs da

medula óssea de camundongo transgênico para a proteína fluorescente verde (Green

Fluorescent Protein, GFP), transplantadas para camundongos irradiados podiam ser

encontradas na camada de odontoblastos expressando proteínas dentinárias específicas. Os

autores concluíram que as células-tronco/progenitoras da medula óssea também se

diferenciariam em odontoblastos em situações de homeostasia. No entanto, este resultado

levanta um questionamento em relação à utilidade de se avaliar propriedades das células-tronco

por meio de transplante, uma vez que este modelo é mais similar à situação de reparo de injúria

do que homeostasia, e não é um processo fisiológico (Zhao et al., 2014).

2.4.3 Origem do nicho perivascular

A terceira hipótese e a mais aceita dentre todas, embora ainda não completamente

comprovada, é de que as nMSC da polpa se originariam do nicho perivascular, em particular

dos pericitos. Anatomicamente, pericitos são células perivasculares que residem na superfície

24

abluminal de células endoteliais mantendo contato direto com as mesmas em capilares e

microvasos (da Silva Meirelles et al., 2016). Fenotipicamente, pericitos expressam o

proteoglicano de condroitin-sulfato NG2 (Neural/Glial antigen 2), a proteína actina de músculo

liso alfa (alpha-Smooth Muscular Actin, α-SMA), a glicoproteína transmembrana CD146

(Cluster of Differentiation 146); e o receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas

(Platelet-Derived Growth Factor Receptor beta, PDGF-Rβ) (Crisan et al., 2008), embora esses

não sejam os únicos marcadores descritos na literatura.

Classicamente, os pericitos possuem as seguintes funções (i) regulam a

contratilidade dos vasos sanguíneos aos quais estão associados e, por consequência, sua pressão

sanguínea (Chen et al., 2009); (ii) controlam a proliferação das células endoteliais e,

consequentemente, a angiogênese (Chen et al., 2009); (iii) fazem parte da barreira

hematoencefálica (Blood-Brain Barrier, BBB) comunicando-se ativamente com outras células

da unidade neurovascular como as células endoteliais, os astrócitos e os neurônios (Dore-Duffy

e Cleary, 2011). Adicionalmente a essas funções, evidências crescentes indicam que os pericitos

originariam as células-tronco mesenquimais em todo o organismo (da Silva Meirelles et al.,

2006; da Silva Meirelles et al., 2008; da Silva Meirelles et al., 2009; Crisan et al., 2008;

Zannettino et al., 2008; Chen et al., 2009; Crisan et al., 2009; Corselli et al., 2010; Corselli et

al., 2012; da Silva Meirelles et al., 2015a; da Silva Meirelles et al., 2015b; da Silva Meirelles

et al., 2016), especialmente devido à ampla similaridade apresentada por ambas as células

quanto ao fenótipo e o potencial de diferenciação.

Achados em diferentes tecidos, demonstram o potencial de diferenciação de

pericitos nos seguintes tipos celulares: osteoblastos, condroblastos, fibroblastos, adipócitos

(Nehls e Drenckhahn, 1993; Lin et al., 2008; Zannettino et al., 2008), células miogênicas

(Crisan et al., 2008) e odontoblastos (Alliot-Licht et al., 2001; Shi e Gronthos, 2003; Feng et

al., 2011). A origem a partir dos pericitos explicaria a ampla distribuição de MSCs no

organismo adulto, uma vez que todos tecidos compartilham uma característica em comum:

hospedam vasos sanguíneos (da Silva Meirelles et al., 2006; da Silva Meirelles et al., 2008).

Da Silva Meirelles et al. (2006) propuseram um modelo no qual os pericitos são

fonte de células-tronco importantes na manutenção e reparo tecidual. Neste modelo, os pericitos

funcionam como um reservatório de células indiferenciadas para suprir as demandas celulares

dos tecidos cujos quais eles pertencem, adquirindo características fenotípicas locais. Quando

necessário, sinais específicos do microambiente coordenam a transição de pericitos para

25

progenitores comprometidos e, por fim, para células com fenótipo maduro que irão se integrar

ao tecido adjacente. Esse processo ocorre naturalmente, mas no caso de injúria tecidual,

processos alternativos podem ser ativados. Neste caso, pericitos podem ser mobilizados

diretamente para o tecido sem a transição para a célula progenitora.

O modelo proposto por Meirelles et al. (2006) não exclui a possibilidade de

existência de outras células-tronco específicas do tecido (não derivadas de pericitos). Inclusive,

de acordo com Feng et al. (2011), a contribuição de MSCs derivadas de pericitos e não

derivadas de pericitos para a diferenciação celular em qualquer tecido depende da sua

vascularidade e de sua cinética de crescimento e/ou reparo. Em tecidos com baixa

vascularidade, como na cartilagem articular, a contribuição de pericitos para a formação de

MSCs será menor do que em tecidos com maior suprimento sanguíneo.

A polpa dentária é um tecido altamente vascularizado e diversos estudos apontam

que o nicho perivascular seria a principal fonte de MSCs na polpa humana (Alliot-Licht et al.,

2001; Shi e Gronthos, 2003; Téclès et al., 2005; Arthur et al., 2009; Karbanová et al., 2011;

Martens et al., 2012; Janebodin et al., 2013; Machado et al., 2015) e na polpa murina (Lovschall

et al., 2005; Lovschall et al., 2007; Feng et al., 2009; Janebodin et al., 2011; Ishikawa et al.,

2012; Janebodin et al., 2013; Pang et al., 2015).

Para exemplificar alguns dos estudos clássicos na polpa humana, Shi e Gronthos

(2003) demonstraram colocalização in situ dos marcadores STRO-1 (progenitores

mesenquimais) e CD146 (progenitores de origem perivascular) restrita às paredes dos vasos

sanguíneos na polpa dentária saudável. Os autores também verificaram que DPSCs STRO-1+

expressam marcadores vasculares como CD146, α-SMA (actina de músculo liso) e 3G5

(pericito), sugerindo que as MSCs de polpa possam ter uma origem perivascular. Téclès et al.,

(2005), utilizando um modelo organotípico de cultura de dente ex vivo, monitorou a captação

de bromodeoxyuridina (BrdU) por células progenitoras proliferativas em resposta à injúria

provocada por capeamento pulpar. Os autores observaram que células marcadas por BrdU

migravam de regiões perivasculares até o sítio da injúria, possivelmente originando

odontoblastos-like e contribuindo com a dentinogênese reparativa.

A relação entre DPSCs com o nicho perivascular na polpa dentária humana foi

demonstrada por estudos in vitro, in situ e ex vivo, o que impede a confirmação absoluta de sua

origem como é possível fazer pelo rastreamento de linhagens em camundongos transgênicos.

Somado à ausência de um marcador específico de nMSCs que sinalizasse sua localização exata

26

in situ, bem como permitisse sua separação por Fluorescent-Activated Cell Sorting (FACS) ou

Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) para cultivo in vitro, mais estudos sobre esse nicho

na polpa dentária humana utilizando outros modelos ainda são necessários.

2.4.4 Origem do nicho vásculo-nervoso

Recentemente foi proposta a hipótese, em camundongos, de que as nMSCs da polpa

se originariam do nicho vásculo-nervoso, especialmente de células ao redor de arteríolas

marcadas positivamente para Gli1, um fator de transcrição ativado por sonic hedgehog (Shh)

que controla a proliferação e diferenciação celular (Hardcastle et al., 1998). Zhao et al. (2014),

utilizando modelo de incisivo murino, propuseram um papel inédito para os nervos na regulação

de células-tronco. De acordo com os autores, nervos sensoriais do feixe vásculo-nervoso (FVN)

secretam a proteína Shh que ativaria a expressão de Gli1 nas células periarteriais, mas não em

vênulas e capilares. Estas células periarteriais seriam a grande fonte de MSCs na polpa de

camundongos, participando tanto da homeostase quanto do reparo de injúrias in vivo e dando

origem à toda população de MSCs in vitro, inclusive à subpopulação derivada de pericitos.

O papel dos nervos na regulação do nicho de células-tronco ainda não é

compreendido (Zhao et al., 2014), embora alguns relatos na literatura já descrevam uma relação.

Nervos sensoriais que inervam o folículo piloso parecem regular a resposta de um grupo de

células-tronco durante o reparo frente a injúria (Brownell et al., 2011). A inervação simpática

também parece regular a saída de células-tronco hematopoiéticas da medula óssea (Katayama

et al., 2006) e o seu aparecimento durante a embriogênese (Fitch et al., 2012). Nervos

adrenérgicos se associam e regulam MSCs da medula óssea positivas para Nestin (Méndez-

Ferrer et al., 2010). Nervos parassimpáticos são essenciais para a função das células

progenitoras epiteliais durante a formação das glândulas salivares e para o reparo das mesmas

depois de adultas (Knox et al., 2010).

Nos tecidos adultos, os nervos distribuem-se ao longo das artérias e, juntamente

com o tecido conjuntivo frouxo ao redor, formam o FVN, uma estrutura anatômica comum

encontrada em diversos órgãos (Zhao et al., 2014). Essa proximidade dos nervos com as artérias

provavelmente explica porque apenas células que circundam as arteríolas teriam Gli1 ativado,

um efetor transcricional que responde especificamente à via de sinalização de Shh (Hardcastle

et al., 1998), no caso provida pelos nervos. A associação de células Gli1 apenas com arteríolas

27

acompanhadas de nervos, mas não com outras arteríolas é consistente com o papel essencial

que os nervos teriam no nicho de MSCs da polpa de incisivos murinos (Zhao et al., 2014). A

comunicação entre nervos sensoriais e arteríolas regula a formação do FVN durante o

desenvolvimento (Lawson et al., 2002) e os achados expostos por Zhao et al. (2014) indicam

que essa comunicação continua na vida adulta.

Zhao et al., (2014) também relataram de maneira inédita um novo papel para Gli1

como marcador de células-tronco mesenquimais in vivo. Os autores ressaltam que os

marcadores clássicos de MSCs, muitos deles propostos pela ISCT, não seriam apropriados para

identificar as MSCs in vivo, embora in vitro essas células os expressariam. Os marcadores

clássicos, ao contrário, identificam pericitos ao redor de toda a vasculatura in vivo. Talvez por

isso todos os estudos até então apontavam os pericitos como as células fonte das MSCs.

Entretanto, mesmo a população de pericitos seria derivada das células Gli1+ e sua contribuição

com as MSCs estariam relacionadas muitos mais com o reparo de injúrias (16% dos

odontoblastos seriam derivados de NG2+) do que com a homeostasia (2% dos odontoblastos

seriam derivados de células NG2+).

Embora o FVN seja uma estrutura anatômica comum ao longo do corpo, assim

como a vasculatura, mais estudos são necessários para determinar se o FVN também funciona

como um nicho de MSCs em outros órgãos. Há de se salientar ainda que todas essas

considerações foram feitas em modelo de incisivo de camundongo que difere dos dentes

humanos à medida que crescem continuamente. Sendo assim, é necessário testar se essa

hipótese também vale para a polpa dentária humana, assim como para outros tecidos. De

qualquer forma, os resultados inéditos achados por Zhao et al. (2014) coletivamente tem um

impacto importante no campo de estudos com células-tronco que pode vir a mudar o consenso

sobre o nicho perivascular.

28

3 PROPOSIÇÃO

3.1 Objetivo Geral

Avaliar uma possível associação de células estromais mesenquimais

indiferenciadas com os nichos perivascular e vásculo-nervoso na polpa dentária humana.

3.2 Objetivos Específicos

Avaliar in vitro o potencial de células isoladas da polpa como MSCs: capacidade

de formar colônias, extensão da multipotencialidade e fenotipagem das células

baseada na presença ou ausência de marcadores de superfície específicos;

Verificar se há correlação positiva entre a frequência de células estromais

mesenquimais indiferenciadas da polpa dentária com a densidade de vasos

sanguíneos e/ou a densidade de arteríolas associadas a feixes neurais.

29

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Seleção de pacientes

Foram selecionados 14 pacientes, de ambos os gêneros, com faixa etária entre 13 e

30 anos e que tinham indicação ortodôntica e/ou profilática de exodontia de dois terceiros

molares contralaterais (2 superiores ou 2 inferiores), extraídos no mesmo dia ou não. Os dentes

deveriam estar hígidos e não acometidos por doença periodontal ou pericoronarite, e se

apresentarem de maneira similar entre si quanto ao posicionamento na cavidade oral (incluso,

semi-incluso ou erupcionado), a rizogênese (completa ou incompleta) e as dimensões mésio-

distais (diferença ≤ 10% determinadas por radiografia panorâmica e no próprio dente após

extraído). Na Tabela 01 estão descritas características dos doadores e dos respectivos dentes

coletados.

Tabela 01 - Caracterização dos dentes coletados de diferentes doadores.

Paciente Gênero Idade Dentes Extraídos Nível de erupção Rizogênese

1 F 13 Superiores Incluso Incompleta

2 F 13 Superiores Incluso Incompleta

3 F 15 Inferiores Incluso Incompleta

4 F 19 Superiores Semi-incluso Incompleta

5 F 19 Inferiores Incluso Incompleta

6 F 19 Superiores Incluso Incompleta

7 F 19 Inferiores Semi-incluso Incompleta

8 M 19 Superiores Erupcionado Completa

9 M 19 Inferiores Semi-incluso Completa

10 F 20 Inferiores Incluso Incompleta

11 F 20 Superiores Incluso Incompleta

12 F 20 Inferiores Incluso Incompleta

13 M 22 Superiores Semi-incluso Completa

14 F 30 Superiores Incluso Completa

F: feminino; M: masculino.

30

Todos os procedimentos foram realizados sob aprovação do Comitê de Ética em

Pesquisa da Faculdade de Odontologia de Piracicaba FOP-UNICAMP (protocolo nº 090/2013,

ver ANEXO 1) e após assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) pelo

paciente.

4.2 Coleta das amostras

Os terceiros molares foram coletados nas clínicas de graduação e especialização da

FOP/Unicamp e em algumas clínicas particulares de Piracicaba/SP. A exodontia foi realizada

de modo simples, a fim de evitar danos aos dentes para que os mesmos permanecessem íntegros.

Imediatamente após a extração dos dois molares contralaterais do mesmo paciente, os dentes

foram imersos em meio de coleta a 4°C composto por meio α-MEM (α-Modification of Eagle´s

Medium – GIBCO), 2mM L-glutamina, suplementado com 5% de antibiótico (Penicilina

10.000UI/mL e Estreptomicina 10mg/mL - GIBCO) e 3% de antifúngico (Anfotericina B

25µg/mL - GIBCO).

Em seguida, as amostras foram transportadas à sala de cirurgia do Departamento de

Morfologia para limpeza em gaze embebida com soro fisiológico e remoção de tecidos moles

remanescentes com auxílio de curetas Gracey. No caso de dentes com rizogênese incompleta,

a papila apical foi removida com alveolótomo (QUINELATO), a fim de evitar a contaminação

da polpa dental com este tecido (no dente que seria destinado à cultura de células) e também

facilitar a difusão do fixador pela polpa (no dente que seria destinado ao processamento

histológico). Já no caso de rizogênese completa, o dente teve a extremidade de seu ápice

radicular cortado com disco diamantado estéril e caneta de baixa rotação, sob irrigação

constante, com o intuito de facilitar a remoção da polpa radicular no dente da cultura de células

e, novamente, facilitar a fixação do tecido pulpar no dente que seria processado.

Após os ajustes para melhor fixação da polpa, o dente destinado ao processamento

histológico foi imerso em solução de paraformaldeído a 4% por 24 horas à temperatura

ambiente. Subsequentemente, o elemento dentário foi lavado duas vezes com PBS (Phosphate

Buffered Saline) 1x e desgastado com broca carbide e ponta diamantada em alta rotação, com

irrigação, para remoção do esmalte. Em seguida, foi colocado em solução descalcificante de

ácido etilenodiamino tetra-acético (Ethylenediamine Tetraacetic Acid, EDTA) 4,13%

tamponado, sob agitação constante, por aproximadamente 90 dias. O EDTA foi trocado 3x por

semana.

31

No dente cuja polpa seria destinada à cultura de células, foi feito um sulco

horizontal ao redor da superfície radicular cerca de 2mm apicalmente à junção amelocementária

e com ~2mm de profundidade. Para tanto, foi utilizado disco de carborundum estéril e caneta

de baixa rotação, sob irrigação constante com soro fisiológico estéril, a fim de evitar danos

térmicos à polpa. Em seguida, uma fratura foi realizada na região do sulco utilizando-se

alavanca reta e fórceps devidamente esterilizados (modificado de Tjäderhane et al., 1998). Os

fragmentos obtidos (coroa e raiz) foram imediatamente imersos em meio de transferência à

37ºC, composto por meio α-MEM 2mM L-glutamina suplementado com 3% de antibiótico e

1% de antifúngico, e transportados ao laboratório de cultura de células.

4.3 Isolamento de células da polpa dentária

O protocolo de isolamento das células foi baseado no de Liu et al., (2006) e

Akiyama et al., (2012), mas com modificações. Brevemente, no interior do fluxo laminar, a

polpa foi removida da câmara pulpar e dos canais radiculares com auxílio de um escavador

pequeno (Figura 01A) e uma sonda reta, respectivamente. Em seguida, o tecido pulpar foi

picotado em fragmentos menores sobre uma placa de vidro estéril com auxílio de uma lâmina

de bisturi (Figura 01B), a fim de facilitar a dissociação de suas células da matriz extracelular.

Durante todo o processo a polpa permaneceu em condições úmidas, o que é importante para

manter a viabilidade celular.

Figura 01 - Etapas do isolamento de células da polpa dentária. (A) Remoção do tecido pulpar

com auxílio de escavador. (B) Fragmentos da polpa dental após picote com lâmina de bisturi.

32

A dissociação foi feita por digestão enzimática com uma solução de colagenase tipo

I (3 mg/mL) (SIGMA-ALDRICH) e dispase tipo II (4 mg/mL) (SIGMA-ALDRICH) por 1:30h

a 37°C, pipetando a cada 30min para digerir completamente o tecido. A inativação da atividade

enzimática se deu com a adição de meio de plaqueamento a 37ºC, composto por meio α-MEM

2mM L-glutamina suplementado com 15% de FBS (Fetal Bovine Serum - SIGMA-ALDRICH),

3% de antibiótico e 1% de antifúngico. A suspensão celular de “single cells” foi obtida pela

passagem destas células em filtro de 70 µm (MILLIPORE), para eliminar restos de tecido que

não foram digeridos, seguida de centrifugação a 3000 rpm por 3 min à temperatura ambiente.

4.4 Cultura de células da polpa dentária

O pellet resultante foi ressuspendido em meio de plaqueamento, homogeneizado e

o número de células contado pelo método de exclusão com azul de tripan 0,4%. Uma fração

dessa suspensão de células foi plaqueada para a expansão da cultura (placa petri de 60cm2 -

TPP) e a outra fração para o ensaio de CFU-F (placa de 6 poços - TPP), sendo mantidas em

estufa umidificadora a 37°C e 5% CO2. Após 3 dias em cultura, as placas foram lavadas duas

vezes com solução salina balanceada de Hanks (Hank’s Balanced Salt Solution Ca2+ e Mg2+

free, HBSS - SIGMA-ALDRICH) para remoção das células não aderentes. Em seguida, o meio

de plaqueamento foi trocado pelo mesmo volume de meio de expansão (α-MEM 2mM L-

glutamina, 15% de FBS, 1% de antibiótico e 0,1% de antifúngico) a 37ºC. Meio novo era

substituído a cada 2-3 dias.

As placas destinadas à expansão celular permaneceram em cultura até que o centro

das colônias formadas atingisse uma densidade celular alta (pós-confluência) (Akiyama et al.,

2012), quando então a subcultura foi realizada com solução de tripsina/EDTA em HBSS

(2,5g/L de tripsina e 0,3g/L de EDTA). Após a primeira passagem, o meio de expansão foi

trocado pelo meio base composto por α-MEM 2mM L-glutamina, 10% de FBS, 1% de

antibiótico e 0,1% de antifúngico. A cultura foi mantida nestas condições até a passagem P.3,

na qual todas as células foram congeladas. Com exceção do ensaio de CFU-F, todos os outros

experimentos de caracterização celular (diferenciações in vitro e imunofenotipagem) foram

realizados na quinta passagem (Akiyama et al., 2012).

33

4.5 Ensaio de CFU-F (Colony Forming Units - Fibroblast)

O ensaio de CFU-F baseia-se na capacidade de uma única célula tronco/progenitora

originar uma colônia de células fibroblastóides idênticas (clones) em baixa densidade de

plaqueamento (Bianco et al., 2006). Assim, a frequência de células indiferenciadas da polpa

recém-extraída foi estimada em placa de 6 poços por meio do plaqueamento de 6x104

células/poço, em triplicata, por 14 dias em cultura. Após esse período, as células foram lavadas

2x com HBSS, fixadas com paraformoldeído a 4% por 40min e coradas com Azul de toluidina

0,1% por 5min à temperatura ambiente. Os poços foram então lavados com água destilada por

2x para remover o excesso do corante e colocados na capela para a água evaporar.

A contagem das colônias formadas foi realizada de duas maneiras em lupa

estereoscópica (ZEISS), sendo considerados CFU-Fs: (i) agregados maiores que 50 células

(Gronthos et al., 2000) e (ii) agregados > 2mm em diâmetro (Huang A et al., 2009) (Figura 02).

A eficiência de formação de colônias in vitro (Colony Forming Efficiency, CFE) foi expressa

em porcentagem como o número total de colônias formadas (CFU-Fs) dividido pelo número de

células plaqueadas vezes 100 (Huang A et al., 2009).

4.6 Ensaios de diferenciação in vitro

Células obtidas de cada paciente, na quinta passagem, foram submetidas a ensaios

de diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica in vitro (baseados em Vater et al.,

2011), em placas de 24 poços. Brevemente, as células foram plaqueadas em triplicata nas

seguintes densidades e volumes de meio base: 0,5x104/cm2 em 0,5mL (osteogênica), 2x104/cm2

em 0,5mL (adipogênica) e 1,7x107/mL em uma gotícula de 25µL (4,25x105 células) no centro

do poço (condrogênica – sistema de cultura em micromassa). A indução da diferenciação em

cada linhagem foi realizada quando as culturas atingiram a confluência de ~70% (após 24h),

~90% (após 24h) e pós-confluência (após 3h), respectivamente.

Neste momento, o meio base foi trocado por 0,5mL dos respectivos meios de

indução com suplementos específicos para cada linhagem (Tabela 02), além da suplementação

comum de 1% de antibiótico e 0,1% de antifúngico. Com exceção da diferenciação

condrogênica, que foi induzida por kit comercial, todos os suplementos foram esterilizados por

filtração em membrana de 0,2µm. O meio de indução sem suplementos específicos foi utilizado

como controle negativo para todas as linhagens.

34

Tabela 02 - Meios de indução para diferenciação em linhagens específicas.

Linhagem Meio FBS Suplementos Específicos

Osteogênica α-MEM

2mM L-glutamina 10%

50μg/ml ácido ascórbico 2-fosfato†, 10mM

β-glicerofosfato†, 10nM dexametasona†

Adipogênica α-MEM

2mM L-glutamina 2%

Indução: 0,5mM isobutilmetilxantina†,

200µM indometacina†, 5µM rosiglitazona†,

1µM dexametasona†, 10µM insulina†

Manutenção: 10µM insulina†

Condrogênica

StemPro® Chondrocyte

Differentiation Basal

Medium‡

__ StemPro® chondrogenesis supplement‡

† SIGMA-ALDRICH, ‡GIBCO

As diferenciações foram mantidas em cultura por 21 dias (osteogênica e

adipogênica) e 14 dias (condrogênica), sendo os respectivos meios de indução e controle

trocados cuidadosamente a cada 3 dias. Na diferenciação adipogênica, em específico, o meio

era trocado alternando ciclos de indução e manutenção. Após 3 ciclos, as células permaneceram

por mais 3 dias em meio de manutenção. Ao final de cada período de indução, os poços foram

lavados com HBSS, fixados com paraformaldeído 4% por 30min à temperatura ambiente,

lavados novamente com água destilada e corados de acordo com a diferenciação.

Para a diferenciação osteogênica, foi utilizado vermelho de alizarina S (SIGMA-

ALDRICH) 2% pH 4,2 por 20min, de modo que depósitos de cálcio na matriz óssea

mineralizada pudessem ser detectados (Figura 02A). Para a diferenciação adipogênica, os poços

foram previamente lavados com isopropanol 60% por 5min e, só então, corados por 15min com

óleo vermelho O (SIGMA-ALDRICH) (solução de 60% óleo vermelho 0,3% para 40% de água

destilada), a fim de evidenciar gotículas lipídicas no citoplasma (Figura 02B). A diferenciação

condrogênica foi evidenciada com azul de alcian 1% pH 2,5 (SIGMA-ALDRICH) por 30min,

com intuito de detectar glicosaminoglicanas carboxiladas da cartilagem, como ácido

hialurônico (Figura 02C).

35

Figura 02 - Poços de indução das diferenciações osteogênica (A), adipogênica (B) e

condrogênica (C) corados com vermelho de alizarina S (depósitos de cálcio), óleo vermelho O

(depósitos de gordura) e azul de alcian (ácido hialurônico), respectivamente. Notar que a

diferenciação condrogênica foi realizada por sistema de cultura em micromassa (Zhang et al.,

2010).

Com intuito de remover o excesso de corante, as placas das diferenciações

osteogênica e adipogênica foram lavadas 4x vezes com água destilada, e as placas da

diferenciação condrogênica 3x com ácido clorídrico 0,1N. Estas últimas ainda foram lavadas

1x com água destilada para neutralizar a acidez. Durante todo o processo de coloração, as

soluções foram cuidadosamente adicionadas e removidas para evitar que as monocamadas de

células descolassem do fundo do poço. Todas as placas foram deixadas secando para que

pudessem ser fotografas em microscópio invertido em objetiva de 10x. Os experimentos de

diferenciação foram feitos pelo menos 3x com protocolos diferentes até chegarmos em um

protocolo reproduzível e confiável para cada linhagem.

4.7 Citometria de fluxo

A análise por citometria de fluxo foi utilizada para caracterizar as células isoladas

da polpa em relação ao seu fenótipo antigênico (imunofenotipagem). Seguindo o painel

estipulado pela ISCT (Dominici et al., 2006) para classificar uma célula como estromal

mesenquimal multipotente (MSC), foram utilizados marcadores positivos e negativos para

MSCs. Além destes, marcadores relacionados à uma possível origem perivascular também

foram testados (Tabela 03).

Resumidamente, células da polpa dentária de cada paciente, na quinta passagem

(~90 de confluência), foram tripsinizadas, centrifugadas e ressuspendidas em HBSS gelado

36

contendo 10% FBS (staining buffer). As amostras foram então contadas e ajustadas para a

concentração de 5x105 células/tubo em 5mL de staining buffer. Todo o processo de

imunomarcação daqui em diante foi realizado a 4°C. Assim, os tubos foram centrifugados a

3000rpm por 5min sob refrigeração e o bloqueio de sítios inespecíficos realizado com soro

humano a 10% em HBSS por 30min.

As células foram lavadas com staining buffer e novamente centrifugadas para

posterior incubação com os respectivos anticorpos monoclonais conjugados a diferentes

fluorocromos (Tabela 03) por 30min, em ausência de luz. No caso do anticorpo primário não-

conjugado CD146, após a primeira incubação de 30min com o mesmo, as células foram lavadas

e posteriormente incubadas com anticorpo secundário policlonal anti-IgG Alexa Fluor 488

(MOLECULAR PROBES) por 30min adicionais no escuro. Em seguida, as células foram

lavadas novamente com staining buffer, centrifugadas e fixadas em paraformoldeído a 1% em

HBSS. Os tubos foram então armazenados a 4ºC sob proteção da luz até o momento da

aquisição no citômetro de fluxo.

Tabela 03 - Anticorpos monoclonais anti-humanos utilizados para avaliação do fenótipo

antigênico.

Marcadores Anticorpo Clone Diluição Fabricante

Típicos de MSCs

CD105-FITC

CD90-FITC

CD73-FITC

266

5E10

AD2

1:20

1:40

1:40

BD Pharmingen

Biolegend

Biolegend

Negativos para

MSCs

CD45-APC

CD34-PerCP-Cy5.5

CD19-FITC

CD14-FITC

HLA-DR-FITC

H130

8G12

HIB19

HCD14

L243

1:40

1:5

1:50

1:50

1:50

Biolegend

BD Biosciences

Biolegend

Biolegend

Biolegend

Origem Perivascular CD146 purificado

NG2-PE

P1H12

9227

1:200

1:20

Biolegend

BD Pharmingen

Fluorocromos: Isotiocianato de fluoresceína (FITC), aloficocianina (APC), PerCP-Cy5.5, ficoeritrina (PE), Alexa

Fluor 647.

Como controle negativo da reação, células de cada paciente foram preparadas como

descrito acima, porém não foram marcadas com anticorpos (Park et al., 2013). Um total de

37

40.000 eventos foram adquiridos para cada amostra utilizando citômetro de fluxo

FACSCaliburTM® (BD Biosciences), equipamento alocado no Departamento de

Estomatopatologia da FOP-UNICAMP. As análises foram feitas por meio do software

CellQuest® (BD Biosciences) e os resultados plotados em forma de histograma para avaliação

da porcentagem de células com simples marcação para cada anticorpo.

4.8 Imunohistoquímica

A fim de localizar na polpa dentária saudável regiões possivelmente relacionadas a

nichos de células mesenquimais indiferenciadas in situ e associá-las à frequência de CFU-Fs

encontradas in vitro no mesmo paciente, foi realizada imunohistoquímica para proteínas

relacionadas à vascularização e inervação. Para tanto, foram utilizados os seguintes anticorpos:

CD34 (endotélio de vasos sanguíneos), αSMA (actina de músculo liso) e S100 (células de

Schwann).

Os dentes destinados ao processamento histológico foram mantidos em solução de

EDTA 4,18% para descalcificação por aproximadamente 90 dias. Após este período, os

mesmos foram seccionados ao longo do eixo longitudinal com uma lâmina de aço inoxidável

(WILKINSON), e submetidos ao processador automático Histotécnico (LUPE) para

desidratação, diafanização e infiltração, seguidos de inclusão em parafina. Para a realização das

reações de imunohistoquímica, os blocos de parafinas contendo os dentes foram cortados na

espessura de 3μm e os cortes obtidos, em série, colocados sobre lâminas de vidro silanizadas

(Star Frost - KNITTEL GLASS). Inicialmente estes cortes foram desparafinizados com duas

sequências de xilol por 10min cada, em temperatura ambiente, hidratados em solução de

concentrações decrescentes de etanol (100%, 90%, 70% e 50%) e, posteriormente, lavados em

água corrente por 30s.

A recuperação antigênica foi realizada com ácido cítrico 10mM pH 6 em panela de

pressão por 3min. Após a recuperação, os cortes permaneceram em repouso por 20min em

temperatura ambiente, para depois serem lavados em água corrente. O bloqueio da atividade da

peroxidase endógena foi realizado com peróxido de hidrogênio (H2O2) 20 volumes

(DINÂMICA) em cinco incubações de 5min cada. Posteriormente, os cortes foram lavados em

água corrente por 30s e colocados em solução salina tamponada com fosfato pH 7,4

(Phosphate-Buffered Saline, PBS). Em seguida, foram incubados com os respectivos anticorpos

38

primários (Tabela 04), diluídos em albumina sérica bovina (Bovine Serum Albumine, BSA) a

1% e azida sódica a 0,1% em PBS, permanecendo em câmara úmida por 18h a 4°C. Como

controle negativo da reação, cortes foram incubados com o diluente do anticorpo primário,

omitindo-se o mesmo e a reação foi realizada como descrito acima.

Tabela 04 - Anticorpos primários e suas especificações e titulações empregadas no estudo

imunohistoquímico.

Marcadores Anticorpo Primário Clone Diluição Fabricante

Vascularização CD34

α-SMA

QBEnd 10

1A4

1:50

1:400

Dako

Dako

Inervação S100 Policlonal 1:10.000 Dako

Após a incubação com os anticorpos primários, os cortes foram lavados 3x em PBS

e o anticorpo secundário biotinilado Biotinylated Link Universal (Kit LSAB® + System-HRP

- DAKO) foi adicionado e incubado por 30min, em câmara úmida a 37°C. Posteriormente os

cortes foram novamente lavados 3x em PBS e expostos ao complexo terciário Streptavidin-

HRP (Kit LSAB® + System-HRP - DAKO) por mais 30min a 37°C. A revelação da reação foi

feita com 120mg de substrato cromogênico 3,3 diaminobenzidina (DAB, SIGMA-ALDRICH)

misturando-se em 200ml de PBS, 2ml de H2O2 20 volumes e 2ml de dimetilsulfóxido (DMSO),

e incubando em câmara seca a 37°C por 5min.

Terminada esta etapa, as lâminas foram lavadas delicadamente em água corrente.

Os cortes foram contra-corados com Hematoxilina de Carazzi por 2min, desidratados com 2

banhos de etanol a 100% e diafanizados em xilol com 2 trocas de 10min cada. Em seguida, as

lâminas foram montadas com lamínula e Permount (MERCK). Controles positivos específicos

para cada anticorpo foram utilizados em todas as reações deste estudo.

4.9 Análise da Imunohistoquímica

Os resultados gerados pelas imunohistoquímicas foram analisados de duas

maneiras (i) por meio da análise histológica descritiva (qualitativa), a fim de localizar e

colocalizar estruturas possivelmente associadas a nichos de células mesenquimais

39

indiferenciadas e (ii) por meio da análise histométrica (quantitativa), a fim de obter as

densidades de área dos vasos sanguíneos e das arteríolas associadas a feixes neurais de cada

amostra. Estes dados foram importantes na associação com a frequência de células formadoras

de colônia in vitro da polpa recém extraída do dente contralateral.

Após o término das reações imunohistoquímicas, de 4 a 8 cortes histológicos

marcados com cada anticorpo testado, de cada paciente, foram digitalizados no Departamento

de Estomatopatologia da FOP-UNICAMP com auxílio do sistema Aperio ScanScope® CS

(LEICA BIOSYSTEMS). Para a análise histométrica, de 2 a 4 imagens por corte, em aumento

de 50x, foram capturadas de modo arbitrário, utilizando o software Aperio ImageScope®, a fim

de obter campos representativos da distribuição não homogênea de vasos ao longo das

diferentes camadas da polpa para todos os pacientes. Para tanto, duas retas tangentes eram

traçadas horizontalmente e paralelas entre si, uma tocando o teto da câmara pulpar e outra o

assoalho, e só então as imagens foram capturadas dentro desta delimitação evitando, sempre

que possível, que o campo fotografado localizasse fora da região de interesse: a polpa (Figura

03A).

Após a captura das imagens, a quantificação das regiões positivas para os

marcadores de interesse foi realizada pelo método de contagem de pontos no software Image-

Pro Plus® (Amenábar et al., 2003). Resumidamente, gera-se uma grade sobre a imagem

capturada e conta-se o número de pontos (intercessão entre duas linhas) totais que tocam a

estrutura (polpa dental) e o número de pontos que atingem cada variável de interesse dentro da

estrutura (vasos sanguíneos totais e arteríolas associadas a nervos) (Figura 03B). Em seguida,

multiplica-se o somatório de pontos pela área de um ponto teste, que é calculada como o

quadrado da distância entre dois pontos (no caso foi de 0,01mm). Assim, obtém-se tanto a área

total da estrutura quanto a área parcial das regiões de interesse.

Para a quantificação da densidade vascular e da densidade de arteríolas envolvidas

por fibras nervosas, foi utilizada a análise por densidade de área, que é a proporção da área

parcial em relação à área total (Amenábar et al., 2003), a fim de obter valores de densidade

normalizados pela área da polpa analisada em cada imagem, que poderia variar de amostra a

amostra. Os valores de densidade de área obtidos para cada imagem foram usados para gerar as

médias de cada corte, que por sua vez, foram utilizadas para gerar as médias de cada paciente.

40

Figura 03 - (A) Corte histológico digitalizado de um dente marcado para CD34 (aumento de

10x), mostrando a padronização com linhas tangentes (pontilhadas) para captura de 4 imagens

em regiões distintas da polpa dentária. O número de imagens capturadas por corte variou de

acordo com o tamanho da polpa no mesmo (se mais larga ou mais estreita). Notar a diferença

de distribuição e calibre dos vasos nas diferentes regiões da polpa. (B) Imagem capturada em

(A) ampliada no software Image-Pro Plus® para aplicação de grade e contagem dos pontos (em

vermelho) que atingem os vasos sanguíneos evidenciados pela marcação com CD34. Escala da

grade meramente ilustrativa.

4.10 Análise Estatística

Os dados obtidos foram tabulados e analisados no software SigmaPlot 11.0®. A

comparação entre os dois protocolos de contagem do número de CFU-F para cada paciente foi

realizada pelo teste t de Student. As variáveis possivelmente associadas à frequência de CFU-

F in vitro, como Densidade de Área Vascular (DAV) e Densidade de Área Arteriolar associada

a nervos (DAAN), foram testadas individualmente em relação à média de CFU-F por correlação

de Pearson. Regressão Linear simples também foi avaliada com CFU-F como a variável

dependente, considerando que DAV ou DAAN poderiam influenciar sua frequência. Para todas

as análises, o nível de significância foi estabelecido em α= 5%.

41

5 RESULTADOS

Ao todo foram coletados cerca de 80 dentes de diferentes pacientes ao longo do

desenvolvimento desta pesquisa. Destes, vários foram utilizados para padronização da

metodologia de coleta das amostras e obtenção de células da polpa, até que fosse alcançado um

protocolo eficaz e reproduzível (descrito nos itens 4.2 e 4.3). Outros tantos dentes chegaram a

ter suas polpas processadas, mas não tinham um número mínimo de células necessário para o

plaqueamento como precisávamos (ensaio de CFU-F e expansão). Quando tinham o número

mínimo, ou não apresentavam crescimento celular em cultura ou apresentavam um limitado

desenvolvimento das colônias após 14 dias, não atingindo o tamanho ideal para ser considerada

uma CFU-F. Pode-se citar ainda que nem sempre os pacientes retornavam às clínicas para

exodontia do lado contralateral (já que muitas das cirurgias eram realizadas em duas etapas) e,

assim, um dos dentes que precisávamos era perdido. Diante disso, muitos foram os

experimentos realizados e abortados até que chegássemos em um “n” amostral de 14 pacientes.

5.1 Ensaio de CFU-F

Células isoladas da polpa dentária de todos os 14 pacientes da pesquisa foram

capazes de formar colônias fibroblastóides após 14 dias em cultura, embora com ampla variação

no potencial de crescimento (tamanho), morfologia e no número das mesmas (Figura 04).

Alguns clones exibiram uma robusta capacidade de proliferação, o que se traduziu em colônias

de alta densidade celular com o centro intensamente corado por Azul de Toluidina, sendo

facilmente visíveis a olho nu (setas pretas Figuras 04A). Outras colônias apresentavam um

centro com densidade celular média, um pouco menores e menos coradas que as anteriores, mas

ainda visíveis a olho a nu (setas vermelhas Figuras 04A e B). Também foram observadas

colônias bem menores e fracamente coradas, com células que se organizavam de maneira mais

dispersas, não apresentando um centro denso e sendo de difícil visualização a olho nu (setas

verdes Figuras 04A e B).

De maneira geral, a maioria das colônias apresentavam em seu interior células com

morfologia típica fibroblastóide, variando de fusiforme estreita a poligonal larga (Figuras 04C

e D). A predominância de um ou outro tipo alternava-se entre as colônias: geralmente colônias

com densidade celular alta e média tendiam para o aspecto fusiforme estreito, enquanto colônias

42

menores exibiam mais células poligonais largas. Em uma quantidade bem menor, também

encontramos colônias com células de morfologia endotelióide ou epitelióide, bem como células

isoladas com longos processos citoplasmáticos que lembravam neurônios (dados não

mostrados).

Figura 04 - Imagens de colônias fibroblastóides, em diferentes aumentos, obtidas a partir de

células isoladas da polpa dentária após 14 dias em cultura (Coloração: Azul de toluidina 0,1%).

Notar a heterogeneidade do tamanho e morfologia das colônias no poço evidenciado em (A) e

na fotomicroscopia representada em (B) (Aumento de 12x). (C) Representa um aumento da

área delimitada pelo retângulo tracejado em (B) para evidenciar uma colônia em formação cujo

centro começa a tornar-se denso (Aumento de 40x). Em (D) destacam-se algumas das células

presentes em (C) chamando a atenção para seu aspecto fibroblastóide do tipo fusiforme estreito

(cabeças de seta vermelhas) e poligonal largo (cabeças de setas pretas) (Aumento de 400x).

Algumas das colônias com mais de 50 células e diâmetro menor que 2mm estão apontadas por

setas verdes, enquanto colônias maiores que 2mm estão apontadas pelas setas pretas e

vermelhas (A e B). Asterisco representa colônias possivelmente conturbadas (A e B).

43

O número de CFU-Fs formadas nos diferentes pacientes da pesquisa também variou

bastante, média de 7 a 95 colônias/6x104 células plaqueadas pelo protocolo de contagem de

Gronthos et al. (2000) (Tabela 05). Levando-se em consideração que várias colônias

alcançavam o mínimo de 50 células para serem consideradas uma CFU-F, mas apresentavam

morfologia e tamanho muito diversos de outras colônias mais robustas e com células mais

compactadas (Figuras 04A e B), a contagem foi refeita utilizando protocolo de Huang A et al.

(2009). Neste protocolo, apenas clones com mais de 2mm de diâmetro foram consideradas

CFU-Fs (Figuras 04A e B), eliminando-se assim parte da heterogeneidade das colônias. Desta

maneira, o número de CFU-Fs formadas caiu consideravelmente passando a ter média de 5,67

a 28,5 colônias/6x104 células plaqueadas (Tabela 05).

Tabela 05 - Média de CFU-Fs/poço (9,6cm2) contadas por dois protocolos distintos para os 14

pacientes e suas respectivas eficiências de formação de colônias (CFEs).

> 50 células > 2mm de diâmetro

Paciente Média Erro Padrão CFE (%) Média Erro Padrão CFE (%)

1 34,33 2,60 0,057 13,67 1,86 0,023

2 33,67 0,33 0,056 14,67 0,33 0,024

3 66,67 3,33 0,111 25,67 2,33 0,043

4 18,33 1,45 0,031 7,33 1,45 0,012

5 46,33 0,67 0,077 11,33 0,33 0,019

6 7 1,15 0,012 5,67 0,67 0,009

7 83 3,51 0,138 18 1,00 0,030

8 24 0,58 0,04 13 1,15 0,022

9 32,67 2,91 0,054 10,33 1,20 0,017

10 40,33 3,18 0,067 21,33 1,86 0,036

11 38 4,93 0,063 15,33 0,33 0,026

12 28,67 1,20 0,048 20,67 1,33 0,034

13 95 3,27 0,158 28,5 0,41 0,048

14 71,33 1,33 0,119 15,67 1,45 0,026

A eficiência de formação de colônias (CFE) mostrou-se bem baixa em ambos os

protocolos de contagem de CFU-F (Tabela 05). Uma média de 0,07% (se colônias >50 células)

44

e 0,03% (se colônias >2mm de diâmetro) das células isoladas da polpa seriam estromais

mesenquimais indiferenciadas e originariam uma CFU-F.

Embora todos os pacientes, com exceção do #6 (p> 0,05), tenham apresentado

redução considerável no número de CFU-Fs após recontagem, os pacientes #3, #5, #7, #13 e

#14 foram os que apresentaram diminuição mais expressiva (p<0,0006) (Figura 05). Essa

diminuição coincidiu com a grande quantidade de colônias fibroblástóides pequenas (~50

células) e com centro pouco denso formadas pelas células destes pacientes, especialmente o #7,

#13 e #14, que reduziram suas médias em 65, 66,5 e 55,7 colônias, respectivamente. Ainda

assim, o paciente #13 (22 anos) e o paciente #6 (19 anos) continuaram sendo os que mais e

menos formaram CFU-Fs (28,5 e 5,67), respectivamente.

Figura 05 - Frequência de colônias fibroblastóides contadas pelo protocolo de Gronthos et al.

(2000) (CFU-F = colônia > 50 células) e pelo protocolo de Huang A et al. (2009) (CFU-F =

colônia >2mm de diâmetro). Um decréscimo considerável no número de CFU-Fs foi observado

após recontagem dos poços, especialmente para os pacientes com asterisco (p<0,006).

Resultados expressos como média e erro padrão.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4

0

3 0

6 0

9 0

1 2 0

C F U -F

P a c ie n te s

Mé

dia

de

co

lôn

ias

/po

ço

(9

.6c

m2

)

> 5 0 c é lu la s

> 2 m m

* *

*

*

*

45

5.2 Ensaios de diferenciação in vitro

A confirmação da identidade das células isoladas da polpa como estromais

mesenquimais multipotentes pelas colorações para as três linhagens mesodermais mostrou

diferenças no potencial de diferenciação entre os doadores. As amostras celulares expandidas

da polpa dentária de todos os pacientes se diferenciaram em pelo menos duas linhagens

mesodérmicas, sendo que as populações celulares de 10 pacientes foram multipotentes (Tabela

06).

A linhagem osteogênica foi a que mais teve ausência de diferenciação entre as

amostras celulares estimuladas (pacientes #4, #6 e #14) (Figura 06 D, F e N). Das amostras de

células da polpa destes três pacientes, duas obtiveram a menor média de CFU-F formadas (#4

e #6) e uma, apesar de ter tido uma frequência de CFU-F intermediária, era o único paciente

com 30 anos (#14). Em alguns pacientes (#3, #10, #11 e #12), a mineralização da matriz óssea

foi tão intensa, que o poço ficou completamente corado por vermelho de alizarina (Figura 06

C2, K2, L2 e N2, respectivamente).

Apenas a amostra celular do paciente #13 não se diferenciou para a linhagem

adipogênica (Figura 07M), embora quatro outras (#2, #4, #7 e #14) tenham apresentado

pouquíssimas células acumulando gotículas lipídicas em seu interior (Figura 07 B2, D2, G2 e

N2, respectivamente). Dois pacientes apresentaram células diferenciadas repletas de vacúolos

lipídicos espalhadas por todos os poços da triplicata (#5 e #10). Nos demais, a diferenciação

ocorreu em algumas ilhas de células globosas acumulando gordura distribuídas pelo poço

(Figura 07).

As gotículas contendo células em alta densidade (cultura em micromassa),

incubadas com meio condrogênico, condensaram-se em pequenos esferóides visíveis a olho nu

de 1 a 3 dias após o início da indução (Figura 02C). Essas formações não ocorreram nas células

dos poços controle, que permaneceram aderidas à placa em monocamadas. Em pelo menos

algum nível, as células de todos os pacientes se diferenciaram para a linhagem condrogênica,

com maior ou menor formação de nódulos cartilaginosos de tamanhos diversos, dependendo

do paciente (Figura 08).

46

Figura 06 - Diferenciação osteogênica em amostras de células da polpa dentária humana de 14

pacientes (A a N) com seus respectivos poços controle (1) e indução (2), após 21 dias de cultura

(Coloração: Vermelho de Alizarina S; Aumento: 100x). Não houve formação de depósitos de

mineralização em nenhum poço controle. Nódulos de mineralização e matriz mineralizada são

evidenciados nos poços de indução da maioria dos pacientes.

47

Figura 07 - Diferenciação adipogênica em amostras de células da polpa dentária humana de 14

pacientes (A a N) com seus respectivos poços controle (1) e indução (2), após 21 dias de cultura

(Coloração: Óleo vermelho O; Aumento: 100x). Não houve acúmulo de gotículas lipídicas nas

células de todos os poços controle. Células globosas contendo vacúolos de gordura puderam

ser observadas em quase todos os poços de indução.

48

Figura 08 - Diferenciação condrogênica em amostras de células da polpa dentária humana de

14 pacientes (A a N) com seus respectivos poços controle (1) e indução (2), após 14 dias de

cultura (Coloração: Azul de alcian; Aumento: 100x). Não houve formação de nódulos

cartilaginosos em todos os poços controle. Nódulos foram formados em tamanho e número

variáveis para todos os poços de indução.

49

Tabela 06 - Diferenciação de células da polpa dentária, na quinta passagem, para fenótipos

mesodérmicos, entre os 14 pacientes da pesquisa.

Paciente Osteogênese Adipogênese Condrogênese

1 + + +

2 + + +

3 + + +

4 Ausente + +

5 + + +

6 Ausente + +

7 + + +

8 + + +

9 + + +

10 + + +

11 + + +

12 + + +

13 + Ausente +

14 Ausente + +

“+” significa que houve diferenciação.

5.3 Citometria de Fluxo

A análise dos marcadores de superfície característicos de MSCs (positivos e

negativos) foi representada como porcentagem de reatividade das células de cada paciente, na

quinta passagem, contra cada anticorpo. Os dados obtidos estão sumarizados na tabela 07. Uma

média de mais de 95% das células nos diferentes pacientes foram marcadas para CD105, CD90

e CD73 (marcadores típicos de MSCs em geral) e menos de 2% para os antígenos de origem

hematopoiética CD45, CD34, CD19 e HLA-DR, com exceção de CD14. As porcentagens de

marcação para este anticorpo foram moderadas nos pacientes #7 (17,02%), #13 (8,08%) e #14

(7,19%).

Analisando cada marcador em separado, observa-se que dentre os positivos, CD90

foi o mais fidedigno ao painel da ISCT (mais de 95,28% de células marcadas), seguido por

CD73 (mais de 93,67% de células marcadas) e CD105 (mais de 90,07%). Dentre os negativos,

CD45 foi o único que não marcou mais de 2% da população celular avaliada de todos os

50

pacientes, seguido de CD34 que marcou 4,53% apenas na amostra celular do paciente #2, e

CD19 que marcou 4,8% na amostra do paciente #7 e 3,96% do #13. O antígeno CD14 foi a

marcação mais frequentemente encontrada (7 pacientes tiveram células com marcação positiva

entre 3-17%). A marcação por HLA-DR, típico de MSCs estimuladas, se manteve baixa nas

células de todos os pacientes, com exceção do #13 (7,94%).

Como pôde ser observado na tabela 07, a população de células da polpa do paciente

#13 foi a que apresentou maior quantidade de subpopulações contaminantes de origem

hematopoiética na cultura, mesmo após cinco passagens, com 3,96% de CD19, 8,08% de CD14

e 7,94% de HLA-DR. A amostra celular do paciente #7 também teve uma contaminação

moderada de 4,8% de CD19 e 17,02% CD14, assim como o #2 com 4,53% para CD34 e 3,17%

para CD14.

Tabela 07 - Percentual de células originadas da polpa, na quinta passagem, para marcadores

positivos e negativos de MSCs, e marcadores de origem perivascular.

Marcadores

Positivos

Marcadores

Negativos

Origem

Perivascular

Paciente CD105 CD90 CD73 CD45 CD34 CD19 CD14 HLA-DR CD146 NG2

1 92,43 95,28 99,98 0,35 0,03 0,87 1,05 0,76 98,3 1,68

2 95,39 100 99,98 1,33 4,53 2,24 3,17 2,14 99,82 4,2

3 96,81 99,66 99,97 0,18 0,08 0,57 0,43 0,42 96,51 2,74

4 95,03 99,95 99,98 1,83 1,07 2,64 5,39 1,82 99,78 9,94

5 95,9 99,9 99,99 0,74 0,19 1,24 2,36 1,22 78,59 2,63

6 99,46 99,54 99,86 1,49 0,26 0,8 1,27 0,38 93,27 10,2

7 97,39 99,98 100 2,2 1,95 4,8 17,02 2,85 99,59 4,69

8 99,08 99,88 99,88 0,19 0,01 0,62 0,43 0,4 99,29 2,22

9 90,07 99,98 99,95 0,56 1,19 0,23 0,43 0,18 96,85 3,98

10 94,27 99,95 99,93 1,21 1,17 1,25 4,43 1,89 99,8 8,75

11 96,21 99,95 99,99 0,62 0,2 0,34 0,62 0,65 75,94 2,14

12 97,08 99,98 98,2 1,2 2,86 2,13 3,92 2,41 99,84 4,36

13 99,25 99,94 99,93 1,37 2,07 3,96 8,08 7,94 99,5 5,44

14 98,23 99,94 93,67 2,13 1,08 2,08 7,19 2,95 99,3 8,62

Média 96,19 99,57 99,38 1,10 1,19 1,70 3,99 1,86 95,46 5,11

E.P 0,71 0,33 0,46 0,18 0,35 0,37 1,21 0,53 2,12 0,81

E.P: Erro Padrão

51

Além da imunofenotipagem padrão proposta por Dominici et al. (2006), também

foi verificado o percentual de células marcadas em P.5 para CD146 e NG2 (Tabela 07), outros

marcadores que seriam representantes de células progenitoras derivadas da perivasculatura. Em

geral, a expressão de CD146 foi alta com média de mais de 95% de células marcadas, variando

de 75,94 a 99,84% entre os pacientes. Diferentemente, uma média de apenas 5,11% das células

da polpa entre os pacientes foram marcadas para NG2.

5.4 Análise Imunohistoquímica (qualitativa)

A expressão dos antígenos CD34, α-SMA e S-100 foi identificada em amostras dos

14 pacientes da pesquisa. O padrão de marcação foi do tipo granular intensa para todos, menos

para o paciente #14 (o único que apresentou cálculos pulpares falsos dispersos na região central

da polpa), no qual a marcação foi bem menos intensa. CD34 se mostrou específico para o

citoplasma das células endoteliais dos vasos sanguíneos (Figura 09A), possibilitando a detecção

de todos os vasos da polpa (arteríolas, capilares e vênulas) para determinação da área vascular

de cada paciente.

Figura 09 - Vasos sanguíneos da polpa dentária de formato e calibre variáveis marcados para

CD34 (A) e α-SMA (B) (Aumento: 200x). (A) Note vênulas (setas pretas) e arteríola (seta

vermelha) com citoplasma das células endoteliais marcados por CD34. (B) Intensa marcação

por α-SMA na parede vascular (túnica média) de uma arteríola cortada transversalmente (seta

vermelha). A seta preta indica uma vênula com marcação de α-SMA em pericitos (cabeças de

seta vermelhas). Pericitos se diferenciam das células endoteliais por seus núcleos proeminentes

e arredondados comparados aos núcleos achatados das últimas (cabeças de seta pretas) (Dore-

Duffy e Cleary, 2011). Não é possível distinguir pericitos de células musculares lisas nas

arteríolas devido à proximidade das túnicas íntima e média. Cabeças de setas verdes apontam

fibroblastos marcados por α-SMA.

52

As arteríolas, compostas de endotélio envolvido por uma ou mais camadas

contínuas de músculo liso (Yoshiba et al., 2012), foram identificadas pela marcação de α-SMA

na túnica média (Figura 09B). Pericitos, em íntima associação com finas células endoteliais,

também foram marcados por este anticorpo em capilares e vênulas (Figura 09B). Não foi

possível ser identificada a expressão de α-SMA em pericitos associados a arteríolas, uma vez

que os mesmos estão fisicamente próximos à túnica média, que foi intensamente marcada.

Também foi possível notar expressão de α-SMA na maioria dos fibroblastos da polpa (Figura

09B) e em algumas células no interior de feixes nervosos não associados a vasos (Figura 10).

Figura 10 - Análise imunohistoquímica de um feixe neural cortado longitudinalmente, em

aumento de 200x, com tripla marcação individual para CD34 (A), α-SMA (B) e S100 (C). Notar

pontos focais de marcação (cabeças de seta) para α-SMA no interior do feixe nervoso (B) não

correspondentes com marcação de CD34 (A), descartando a possibilidade de vasos em seu

interior.

A expressão de S-100 por imunohistoquímica foi identificada no citoplasma e no

núcleo das células de Schwann que envolvem as fibras neurais e formam os feixes (Figura 10C).

A distribuição de fibras/feixes neurais comumente acompanhava os vasos sanguíneos,

especialmente as arteríolas, principalmente na entrada dos condutos radiculares e na região

central da polpa. A identificação das arteríolas que estavam associadas aos nervos foi possível

por meio da colocalização das marcações individuais de α-SMA e S100 em cortes seriados

(Figura 11).

53

Figura 11 - Fotomicrografias de uma arteríola evidenciada ao centro, em aumento de 200x,

mostrando intensa positividade no citoplasma (seta) das células endoteliais (CD-34) (A), na

túnica média (seta) da parede arteriolar (α-SMA) (B) e no feixe de fibras nervosas (seta) a

envolvendo (C). Notar que os cortes em série possibilitaram a colocalização das marcações na

mesma estrutura.

5.5 Análise Imunohistoquímica (quantitativa)

A análise da vascularidade por densidade de área (DAV), bem como a análise da

densidade de área arteriolar associada a nervos (DAAN) para as polpas dentárias de cada

paciente estão apresentadas na Tabela 08. Os pacientes cujas polpas obtiveram as maiores

médias de DAV não necessariamente obtiveram as maiores médias de DAAN. Enquanto para

DAV os doadores #10 e #12 obtiveram os melhores resultados (6,083 e 6,777,

respectivamente), para DAAN foram os pacientes #10 e #13 (0,679 e 0,763). Já as polpas

dentárias dos pacientes #1 e #2 apresentaram os menores valores para DAV, enquanto as polpas

dos pacientes #1 e #5 os menores paras DAAN.

A verificação de uma possível associação das densidades de área DAV e DAAN in

situ como fontes de células mesenquimais indiferenciadas in vitro (estimada pelo ensaio de

CFU-F com mais de 2mm de diâmetro), no mesmo paciente, estão representadas nas Figuras

12 e 13, respectivamente. Não houve correlação significativa entre densidade de vasos

sanguíneos e frequência de CFU-F (r= 0,188; p= 0,52) (Figura 12). Diferentemente, foi

encontrada uma significativa correlação positiva entre a densidade de área arteriolar associada

a nervos com o número de CFU-Fs gerados no dente contralateral (r= 0,663; p= 0,00972)

(Figura 13). A fim de avaliar o quanto as variáveis DAV e DAAN explicam a frequência de

CFU-Fs obtidas, numa relação causal, foi realizada Regressão Linear Múltipla. Esta análise

revelou por meio de um significativo coeficiente de determinação linear (R2=0,44; p= 0.01) que

44% da variável dependente CFU-F é explicada pela variável independente DAAN, enquanto

apenas 3,5% é explicada pela variável DAV (R2=0,0354; p= 0.52).

54

Tabela 08 - Densidades de Áreas Vascular (DAV) e de Arteríolas associadas a Nervos (DAAN)

obtidas por análise histométrica da polpa dentária humana de 14 pacientes.

DAV DAAN

Pacientes Média Erro Padrão Média Erro Padrão

1 1,445 0,0813 0,236 0,004

2 1,381 0,0711 0,287 0,018

3 4,624 0,3059 0,439 0,147

4 4,019 0,3433 0,297 0,163

5 4,745 0,3125 0,132 0,024

6 3,585 0,1197 0,373 0,115

7 3,729 0,4725 0,351 0,079

8 5,396 0,4063 0,362 0,063

9 4,508 0,1509 0,438 0,162

10 6,083 0,6978 0,679 0,194

11 5,840 0,3436 0,407 0,047

12 6,777 0,3382 0,415 0,092

13 3,432 0,2062 0,763 0,020

14 3,726 0,3852 0,301 0,033

Figura 12 - Associação entre a média de CFU-F e a média da Densidade de Área Vascular

(DAV), demonstrando uma baixa correlação linear entre as variáveis (Pearson: r= 0,188; p=

0,52). Pontos correspondem a cada paciente da pesquisa (n= 14). A linha representa a regressão

linear dos dados (y= 12.470 + 0,786x; R2=0,0354; p= 0,52).

55

Figura 13 - Associação entre a média de CFU-F e a média da Densidade de Área Arteriolar

associada a Nervos (DAAN), demonstrando uma correlação moderada significativa entre as

variáveis (Pearson: r= 0,663; p= 0,00972*). Pontos correspondem a cada paciente da pesquisa

(n= 14). A linha representa a regressão linear dos dados (y= 5.417 + 26.552x; R2=0,44; p=

0,01).

56

6 DISCUSSÃO

Um dos questionamentos fundamentais no estudo de MSCs está centrado em

quais seriam seus nichos e aonde os mesmos estariam localizados. O consenso atual sustenta

que as células perivasculares, em particular os pericitos, originam as MSCs na maioria dos

tecidos (revisado por da Silva Meirelles et al., 2016), inclusive na polpa dentária (revisado por

Sloan e Smith, 2007; e por Oh e Nör, 2015). Mesmo assim, ainda permanecem dúvidas se

artérias, veias e capilares compreendem diferentes nichos de MSCs nos diferentes tecidos.

Corselli et al. (2012) demonstraram em tecido adiposo humano a coexistência de dois

progenitores perivasculares de MSCs distintos: os pericitos nos capilares e microvasos e as

células adventícias ao redor de vasos maiores. Zhao et al. (2014) utilizando o modelo de

incisivo de camundongo sugeriram que as MSCs no incisivo estão localizadas ao redor de

arteríolas e são reguladas pelo feixe vásculo-nervoso.

A fim de avaliar a contribuição que o nicho perivascular (pericitos) e o nicho

arteriolar associado a nervos teria para as MSCs na polpa humana, avaliamos a associação

causal quantitativa desses dois nichos como fonte de células mesenquimais indiferenciadas in

vitro na polpa. Nossos resultados indicam que as MSCs de polpa compõem uma população

heterogênea de possíveis subpopulações de células mesenquimais indiferenciadas que estariam

associadas quase que 45% a fontes arteriolares associadas a nervos e cerca de 4% a fontes

perivasculares (pericitos). Estes achados não descartam a possibilidade de outras localizações

para as DPSCs, além dos dois nichos avaliados.

O modelo de estudo utilizado no presente trabalho foi proposto por da Silva

Meirelles et al. (2009) para avaliar a associação quantitativa causal entre a frequência de MSCs

(estimada por ensaio de CFU-F) e a densidade vascular (acessada por área de vasos sanguíneos)

de amostras de tecido adiposo equino do mesmo indivíduo. A maneira mais simples e direta de

acessar a atividade de MSCs dentro de uma população total de células de um tecido é por análise

do ensaio de CFU-F in vitro (Bianco et al., 2006). Desta maneira, este ensaio foi utilizado aqui

para verificar variações na frequência de células estromais mesenquimais de 14 pacientes, uma

vez que cada colônia formada se origina de uma única célula-tronco/progenitora (CFU-F), que

poderiam estar relacionadas à uma maior ou menor densidade vascular total e/ou arteriolar

associada a nervos de cada paciente.

57

As colônias fibroblastóides formadas nos diferentes pacientes variaram bastante em

relação ao número, morfologia e potencial de proliferação (o que resultou em colônias de

diferentes tamanhos após 14 dias). Pelo protocolo de contagem de CFU-Fs com mais de 50

células, obtivemos média de 7-95 colônias formadas a cada 6x104 células plaqueadas (n= 14),

enquanto Gronthos et al. (2000) obtiveram uma frequência de CFU-F de 22-70/104 células (n=

6). Essas diferenças podem ser explicadas pelas densidades de plaqueamento distintas

utilizadas.

Durante a padronização do protocolo utilizado neste trabalho, testamos algumas

concentrações de plaqueamento e percebemos que densidades menores que 60.000

células/9,6cm2 nem sempre eram suficientes para que todos os pacientes formassem CFU-Fs,

ao passo que outros pacientes formavam tantas mais e tão mais rápido que algumas colônias

chegavam a se conurbar, não sendo possível sua distinção. Isso pode ter contribuído para

diminuir o número real de colônias contadas, apesar de ter mais células plaqueadas. Essa

dificuldade encontrada de nem todos os pacientes formarem CFU-Fs in vitro também foi

relatada por Alongi et al. (2010) que tiveram uma taxa de insucesso de 20% no isolamento de

DPSCs de polpas normais saudáveis, seja por contaminação ou não crescimento celular.

Embora o protocolo de contagem de CFU-Fs com mais de 50 células (Gronthos et

al., 2000) seja comumente utilizado por pesquisadores que trabalham com MSCs de polpa

(Laino et al., 2005; Tirino et al., 2011; Hilkens et al., 2013), percebemos neste estudo que ele

acaba incluindo na contagem colônias muitos heterogêneas em relação tanto à morfologia

celular intraclone quanto a morfologia e o tamanho das colônias interclones. Essa

heterogeneidade observada por nós, já havia sido inclusive relatada por outros autores

(Gronthos et al. 2000; Gronthos et al., 2002; Huang et al., 2006; Alongi et al., 2010). Alongi et

al. (2010) ao realizarem subclonagem das colônias celulares em P.0 notaram variações da

morfologia entre os clones oriundos de uma mesma colônia, o que é típico de células estromais

mesenquimais heterogêneas, sem uma seleção de subpopulações específicas.

O método de isolamento das células da polpa por digestão enzimática libera as

DPSCs assim como todos os tipos celulares presente no tecido pulpar (Huang et al., 2006) e,

diferentemente da medula óssea, cuja maioria das células não são aderentes, em tecidos de

origem conjuntiva a maioria das células são (Bianco et al., 2006). De acordo com Huang et al.

(2006), algumas dessas células, além de serem capazes de se aderir ao plástico, podem

proliferar, como os fibroblastos pulpares, as células endoteliais e os pericitos, o que explicaria

58

parte da diferença morfológica interclones. Assim, embora a formação de colônias

fibroblastóides em baixa densidade celular seja uma característica típica de MSCs, nem todas

as colônias formadas necessariamente seriam células mesenquimais indiferenciadas, sejam

multipotentes, precursores ou outros contaminantes de células adultas somáticas, que guardam

uma certa capacidade de proliferar.

Desta maneira, a fim de que o número de CFU-Fs contadas por paciente fosse o

mais representativo possível do número real de células mesenquimais indiferenciadas presentes

nas amostras, optamos pela recontagem das colônias seguindo protocolo de Huang A et al.

(2009). O mesmo propunha considerar apenas colônias fibroblastóides com mais de 2mm de

diâmetro, reduzindo a média da frequência de CFU-Fs formadas para 5,67-28,5 a cada 6x104

células plaqueadas. De acordo com Mets e Verdonk (1981) com o aumento do tamanho do

clone, mais colônias que contêm células de morfologia fusiforme estreita são incluídas na

amostra e essas células possuem maior capacidade de proliferação. Os autores ainda afirmam

que ao longo dos subcultivos de células com morfologia fusiforme gradualmente desaparecem

dando lugar a células poligonais largas, cuja capacidade de proliferação é bem reduzida. Essa

observação revelou aos autores que células fusiformes atuariam como progenitoras que

originam as poligonais.

A baixa eficiência de formação de colônia das células isoladas da polpa (0,07% para

colônias com mais de 50 células e 0,03% para colônias com mais de 2mm), somado ao restrito

número de células obtidas após seu processamento (média de 6x105 células por polpa de terceiro

molar) justificam a dificuldade de um “n” maior. Esta observação é consistente com relatos

anteriores de isolamento de MSCs de diferentes origens. Shi e Gronthos (2003) afirmaram que

isolar DPSCs é restritivo por causa da raridade destas células (uma célula formadora de colônia

a cada 2.000 células plaqueadas; CFE= 0,05%), agravado pelo número limitado de células da

polpa (aproximadamente 105 células por amostra pulpar) obtidas após o processamento.

Pittenger et al. (1999), ao isolar BMMSC da crista ilíaca, também encontraram que apenas uma

pequena porcentagem das células isoladas (aproximadamente 0,001 a 0,01%) cresciam como

células fibroblástóides que se desenvolviam como colônias simétricas visíveis após 5-7 dias do

plaqueamento inicial.

Para analisar se a outra fração de células, comum às que inicialmente foram

plaqueadas para CFU-F, poderiam ser operacionalmente definidas como MSCs, realizamos

ensaios de diferenciação in vitro e imunofenotipagem, na quinta passagem. Idealmente, a fim

59

de obter uma resposta o mais próximo da realidade in vivo e dos resultados de CFU-F que foram

adquiridos em P.0, seria realizar estes testes na mesma passagem ou com as mesmas células

das colônias que foram contadas como CFU-Fs. No entanto, a quantidade limitada de células

acima relatada impossibilitaria a realização de qualquer experimento em P.0, inviabilizando a

primeira hipótese. Já a segunda possibilidade seria inviável uma vez que é necessário fixar e

corar as colônias para realizar a contagem. Assim fez-se necessário a expansão das células em

cultura até P.5.

As populações de células estromais mesenquimais multipotentes (MSC) são melhor

caracterizadas pela capacidade de algumas células dentro dessa população se diferenciarem em

derivados mesodérmicos como osteoblastos, condrócitos e adipócitos (Dominici et al., 2006).

No entanto, esta propriedade progenitora não é compartilhada por todas as células dentro da

população de MSCs (Pevsner-Fischer et al., 2011), como foi observado no presente estudo.

Segundo Kuznetsov et al. (1997) apenas 30% das MSCs clonais, isto é, contadas como CFU-

Fs seriam verdadeiramente multipotentes. Assim, chamar culturas de células mesenquimais em

geral de “células estromais mesenquimais multipotentes” não reflete sua natureza verdadeira.

Todas as células isoladas da polpa de diferentes pacientes no presente estudo foram

capazes de se diferenciar em pelo menos duas linhagens mesenquimais. Levando-se em

consideração o critério mínimo elaborado pela ISCT (Dominici et al., 2006), dos 14 pacientes

em questão apenas 10 exibiram potencial de diferenciação para as três linhagens mesodermais

e comporiam as referidas MSCs. Por outro lado, populações celulares que mostraram potencial

em diferenciar para uma ou duas linhagens representariam precursores mesenquimais

(Mesenchymal Precursors Cells, MPCs) (Sudo et al., 2007).

Embora estes resultados demonstrem o potencial de diferenciação em

multilinhagens para 10 pacientes, de acordo com Sudo et al. (2007) não se pode afirmar com

certeza se todas teriam células estromais mesenquimais multipotentes verdadeiras ou uma

coleção de vários progenitores, cada um com uma habilidade de diferenciação unipotente, que

somados seriam multipotentes. Para responder tal questionamento, somente separando clones

das populações e avaliando sua multipotencialidade isoladamente. No entanto, considerando

que alguns estudos com clonagem de MSCs humanas, de diferentes origens, têm demonstrado

que cerca de um terço dos clones expandidos a partir de single cells são capazes de se diferenciar

em três linhagens (Muraglia et al., 2000; Bajpai et al., 2012), acreditamos que a maioria das

populações celulares que apresentaram potencial de diferenciação em multilinhagens

60

contenham MSCs verdadeiras. No entanto, outros estudos precisam ser realizados para

confirmação dessa hipótese.

A maioria dos ensaios de diferenciação tem demonstrado um considerável potencial

odonto/osteogênico e condrogênico para as MSCs de polpa (Gronthos et al., 2000; Gronthos et

al., 2002; Huang et al., 2006; Zhang et al., 2006a; Hilkens et al., 2013) e em menor grau para

adipogênica (Zhang et al., 2006a; Hilkens et al, 2013). Contrariamente, 3 dos 4 pacientes cujas

células não se diferenciaram para uma das linhagens falharam na osteogênica (#4, #6 e #14) e

apenas um na adipogênica (#13). Essas diferenças podem estar associadas à prevalência de

clones com fenótipo mais favorável a uma ou outra linhagem ao longo das subculturas.

Gronthos et al. (2002) demonstraram que somente 20% das colônias formadas são capazes de

proliferar mais que 20 populations doubling sob condições de cultura normais. Este resultado

implica que os descendentes desta pequena porcentagem de colônias altamente proliferativas é

que vão, finalmente, dominar a população de células derivadas das multicolônias.

A análise dos marcadores de superfície do painel proposto por Dominici et al.

(2006) indicou um perfil fenotípico entre os pacientes com média de mais de 95% das células

marcadas para CD105, CD90 e CD73 (típicos de MSCs em geral), sendo CD90 o mais

fidedigno no presente estudo. De maneira semelhante, a literatura tem sugerido este marcador

de superfície como o mais intenso entre as MSCs, o que também foi confirmado para as DPSCs

humanas (Rodriguez-Lozano et al., 2011; Huang G et al., 2009; Park et al., 2013).

Dos antígenos de origem hematopoiética (CD45, CD34, CD19 e HLA-DR), uma

média de menos de 2% foram expressos, com exceção de CD14. Este antígeno teve

porcentagens de marcação mais altas nas células dos pacientes #4 (5,39%) #7(17,02%), #13

(8,08%) e #14 (7,19%). De acordo com Dominici et al., (2006), CD14 e CD11b são expressos

principalmente em monócitos e macrófagos, as células hematopoiéticas com maior

probabilidade de serem encontradas numa cultura de MSCs. Coincidentemente, dos quatro

pacientes cujas células apresentaram maior marcação para CD14, três eram os mesmos que não

apresentaram multipotencialidade, o que reafirma que as populações celulares destes pacientes

não seriam MSCs verdadeiras, mas sim precursores mesenquimais (MPCs).

Tem sido sugerido que essa variabilidade das MSCs em cultura representa seu

diverso repertório de subpopulações distintas que existem in vivo (Pevsner-Fischer et al. 2011),

algumas mais comprometidas para certas linhagens, outras em um estado de indiferenciação

mais nativo. Há de se considerar ainda que MSCs originadas de tecidos conjuntivos,

61

representam uma subpopulação de uma composição celular complexa derivada do estroma

deste tecido, sendo difícil distinguí-las de células estromais mais maduras, como os fibroblastos

por exemplo (Blasi et al., 2011). Assim, acreditamos que as populações de células derivadas de

multi-colônias e caracterizadas no presente trabalho incluem, pelo menos, MPCs em 14

pacientes e MSCs em 10 pacientes, bem como fibroblastos em alguma extensão. Esta

observação é consistente com estudos anteriores de MSCs de diferentes origens (Pittenger et

al., 1999; Covas et al., 2008; Blasi et al., 2011).

Estes resultados demonstram a importância em investigar as principais

subpopulações de MSCs da polpa dentária, para melhor definir sua biologia e seu potencial em

terapias celulares. Assim, a fim de obter mais detalhes sobre possíveis origens das células

mesenquimais indiferenciadas da polpa na sua contraparte in situ, realizamos

imunohistoquímica (IHC) para marcadores relacionados à vascularização e inervação da

mesma.

Actina de músculo liso (α-SMA) é uma proteína do citoesqueleto expressa em

alguns tipos de células estromais mesenquimais e células precursoras (Kinner et al., 2002),

assim como em pericitos e células do músculo liso de vasos sanguíneos (Crisan et al., 2012).

No presente trabalho, α-SMA foi expresso na parede das arteríolas e em pericitos associados ao

endotélio de capilares e vênulas, assim como também verificou Yoshiba et al. (2012) e Yoshiba

et al. (2015) na polpa dentária normal. Embora não tenha sido possível evidenciar os pericitos

associados às arteríolas da polpa neste estudo, essa associação foi confirmada por Karbanová

et al. (2011) utilizando o proteoglicano NG2, um outro marcador pericítico. A localização dos

pericitos nos capilares e microvasos da polpa dentária encontrada no presente trabalho,

corresponde à localização que outros autores encontraram em diversos tecidos adultos e

embrionários (Corselli et al., 2012; Crisan et al., 2012).

Levando-se em consideração que toda a microvasculatura da polpa estaria

associada a pericitos, poderíamos especular que uma maior ou menor área de vasos sanguíneos

refletiria indiretamente um maior ou menor número de pericitos. Desta maneira, levantamos a

hipótese de que se o nicho perivascular, e possivelmente os pericitos, fosse a maior fonte de

MSCs na polpa, existiria uma correlação positiva significativa entre a densidade de área

vascular (DAV) in situ com a frequência de células mesenquimais indiferenciadas da polpa in

vitro, que foi rejeitada (r= 0,188; p= 0,52). De acordo com nosso modelo, cerca de 4% das

62

células mesenquimais indiferenciadas obtidas da polpa seriam determinadas pela origem

vascular.

Este resultado vai de encontro à baixa marcação de células NG2+ in vitro

encontrada no presente trabalho, média de 5,11% das células derivadas da polpa humana

guardariam o fenótipo de pericito após a quinta passagem. No entanto, há de se considerar que

mudanças fenotípicas podem ocorrem a partir do momento que pericitos são removidos da sua

localização microanatômica in vivo (nicho) ao momento que são analisados, após expansão in

vitro (da Silva Meirelles et al., 2016). Durante este processo, marcadores expressos por pericitos

in situ podem ser perdidos, ao passo que marcadores não presentes em pericitos in vivo podem

ser expressos.

Embora utilizando o modelo de incisivo que cresce continuamente, Zhao et al.

(2014) observaram uma contribuição de 7% de células NG2+ na composição das MSCs de

incisivo murino in vitro, após 10 dias em cultura. Os autores sugeriram que os pericitos seriam

uma subpopulação de MSCs da polpa que contribuiriam minoritariamente para a homeostase

de incisivos e molares in vivo ou mesmo para a população de MSCs de incisivos in vitro. Sua

principal contribuição estaria relacionada a respostas emergenciais, como o reparo de injúrias,

mas não com o reparo fisiológico da polpa. Considerando que as células isoladas no presente

trabalho vieram de dentes hígidos, bem como não estão expostas a condições que refletiriam

uma situação de injúria às mesmas (como hipóxia ou redução de FBS), essa afirmação faz

sentido.

Em termos de fenótipo, além de NG2, pericitos em cultura retêm a expressão de

CD146, α-SMA e PDGFRβ e, mais importante, compartilham o fenótipo de MSCs (expressam

marcadores clássico) e exibem multipotencialidade (Crisan et al., 2008). CD146 é uma

glicoproteína transmembrana principalmente associada aos vasos sanguíneos, estando presente

no endotélio vascular, em pericitos e células musculares lisas (Crisan et al., 2012).

Considerando que CD146 possui um espectro amplo de marcação e que no presente estudo

tivemos uma média de 95% das células estromais mesenquimais marcadas para ele, acreditamos

que as células NG2+ comporiam uma subpopulação de CD146. Zhao et al. (2014)

demonstraram em modelo murino que 95% das células NG2+ expressam CD146.

Além da ampla vascularização, o tecido pulpar caracteriza-se por ter uma dupla

inervação, sensitiva e autônoma, cuja função basicamente seria de transmissão de dor e controle

do calibre arteriolar, respectivamente. Levando-se em consideração que nos tecidos adultos os

63

nervos distribuem-se nas proximidades de vasos arteriais, a secreção da proteína sonic

hedgehog por nervos sensoriais na polpa dentária ativaria a expressão de Gli1 nas células

periarteriais, mas não em vênulas e capilares. Assim, especulamos que uma maior ou menor

área de arteríolas associadas a fibras/feixes nervosos refletiria um maior ou menor número de

células Gli1+ e, consequentemente, de MSCs (contadas por CFU-F).

Desta maneira, a fim de verificar se o nicho arteriolar associado a nervos, e

possivelmente as células Gli-1+, fosse a maior fonte de MSCs na polpa humana, existiria uma

correlação positiva significativa entre a densidade de área das arteríolas associadas a fibras

nervosas (DAAN) in situ com a frequência de células estromais mesenquimais in vitro. E aqui,

diferentemente do nicho perivascular, encontramos uma significativa correlação positiva entre

as variáveis (r= 0,663; p= 0,00972), indicando que quanto maior a área arteriolar associada a

nervos na polpa, maior seria o número correspondente de CFU-Fs. Uma parcela também

significativa das células mesenquimais indiferenciadas obtidas da polpa (cerca de 44%) seriam

determinadas pela origem arteriolar associada a nervos. Este achado corrobora com a

proposição de Zhao et al. (2014) para polpa de incisivo, mas diferentemente dos autores, não

descarta a possibilidade de outras localizações para as MSCs de polpa, além dos dois nichos

avaliados.

Zhao et al. (2014) identificaram que a maioria das células periarteriais Gli1+ não

expressam in situ marcadores clássicos usados para definir MSCs in vitro. Assim, para testar a

contribuição que as células Gli1+ teriam na composição de MSCs in vitro, eles isolaram células

da polpa do incisivo e verificaram que inicialmente apenas 5% das células foram marcadas para

Gli1, mas após 10 dias em cultura, cerca de 95% das células passaram a ser Gli1+, indicando

que os descendentes das células Gli1+ em última análise povoaram toda a placa de cultura. Os

autores ainda encontraram que todas as células CD146+ e NG2+ eram derivadas de Gli1+. Isso

nos leva a considerar a possibilidade de parte, senão a maioria, das células CD146+ no presente

estudo estariam relacionadas à origem periarterial e seriam descendentes, em cultura, das

células Gli1+, assim como as células NG2+. No entanto, para confirmar esta hipótese

precisaríamos fazer a análise de dupla marcação para os antígenos em questão.

Nossos resultados discordam de vários estudos anteriores na polpa dentária humana

que apontam o nicho perivascular (pericitos) como a principal fonte das DPSCs (Alliot-Licht

et al., 2001; Shi e Gronthos, 2003; Téclès et al., 2005; Arthur et al., 2009; Karbanová et al.,

2011; Martens et al., 2012; Machado et al., 2015). No entanto, há de se considerar que modelos

64

diferentes de análise foram utilizados para investigação, muitos baseados ou em achados in situ

ou em achados in vitro, mas nenhum fazendo uma associação quantitativa causal entre os dois

âmbitos. Além do mais, Gli1 emergiu apenas recentemente como um novo marcador de MSCs

in vivo (Zhao et al., 2014) e poucos trabalhos desde então o analisaram como contribuinte para

identificação de MSCs em outros tecidos. Zhao et al. (2015) identificaram células Gli1+, não

associadas à vasculatura, no mesênquima de suturas como a principal população de MSCs para

os ossos craniofaciais de camundongos. Kramann et al. (2015) demonstraram que células

perivasculares Gli1+ seriam MSCs que contribuiriam substancialmente para a fibrose de órgãos

após uma injúria também em camundongos. Desta maneira, a contribuição desse novo nicho

deve ser investigada para cada caso, podendo ser variável e não dependente da vasculatura ou

inervação como demonstrou Zhao et al. (2015).

Analisando ainda a imunomarcação por α-SMA no presente trabalho, foi possível

notar sua expressão na maioria dos fibroblastos pulpares, assim como também observou

Karbanová et al. (2011) e diferentemente dos achados de Yoshiba et al. (2012), ambos

analisando polpas humanas saudáveis. Actina de músculo liso também é um conhecido

marcador de miofibroblastos, que são encontrados em vários tecidos durante o reparo tecidual

e a regeneração após uma injúria (Chaponnier e Gabbiani, 2004), sendo originados de pericitos,

células musculares lisas, fibroblastos intersticiais e fibrócitos (Desmoulie et al., 2005). No

entanto, não faz sentido acreditar que os fibroblastos pulpares no presente estudo sejam

miofibroblastos, uma vez que todas as polpas vieram de dentes hígidos. Karbanová et al. (2011)

encontraram, em polpas saudáveis, fibroblastos pulpares positivos para α-SMA, NG2, Musashi-

1 e Nestin (sendo os dois últimos marcadores de progenitores neurais que também são expressos

em odontoblastos e DPSCs) e especularam que os fibroblastos seriam uma outra fonte para as

MSCs da polpa.

Além dos fibroblastos, α-SMA também foi expresso em algumas células no interior

de feixes nervosos não associados a vasos, assim como também observou Karbanová et al.

(2011) em polpa dentária humana. Estes autores ainda encontraram marcações de NG2,

Musashi-1 e Nestin em células intranervo e sugeriram que as mesmas também seriam fonte de

DPSCs. Machado et al. (2015) mostraram que células positivas para aldeído desidrogenase

(ALdehyde DeHydrogenase, ALDH1), CD90 e STRO-1, marcadores gerais de MSCs em

diversos tecidos, estavam localizadas principalmente nas áreas perivasculares e em fibras

nervosas na polpa humana, confirmando os resultados anteriores de Yoshiba et al. (2012) que

também encontraram marcação de STRO-1 em fibras nervosas de polpas saudáveis, além de

65

células musculares lisas, pericitos e células endoteliais. Diferentemente, Yoshiba et al. (2015)

também encontraram células de Schwann expressando α-SMA em cultura organotípica da

polpa dentária in vitro, mas como sinal de transdiferenciação destas células para

miofibroblastos durante simulação de reparo de feridas. Além dessas evidências in vitro,

recentemente, outro trabalho demonstrou, por meio de rastreamento da glia periférica (lineage-

tracing) in vivo, que uma população significativa de MSCs na polpa de incisivos murinos é

derivada da glia associada a nervos periféricos (Kaukua et al., 2014). Obviamente, mais

investigações a respeito de um possível nicho associado a células de Schwann são necessárias.

Os resultados preliminares do presente estudo sugerem uma associação física entre

MSCs e arteríolas associadas a nervos em polpa dentária humana. No entanto, a comprovação

da contraparte in situ e in vitro pela marcação das células Gli1+ torna-se necessária, assim como

a marcação de NG2 in situ para completar a análise de α-SMA relativa ao nicho perivascular.

Um aumento do “n” amostral também pode vir a melhor evidenciar essa associação. De

qualquer maneira, é notável que uma relação foi estabelecida com um número relativamente

pequeno de pacientes. Além do mais, a investigação de outros nichos relacionados a MSCs na

polpa dentária, como o nicho glial e o papel dos fibroblastos pulpares como contribuintes de

células indiferenciadas, também se faz necessário.

Conhecer os nichos de células-tronco/progenitores de um determinado tecido é de

extrema importância para entender os mecanismos que suportam sua sobrevivência e função,

uma vez que as mesmas são fortemente reguladas pelo microambiente no qual estão inseridas

(Mitsiadis et al., 2011). Além do mais, a habilidade em reconstruir esse microambiente que

sustenta as células-tronco é importante para o sucesso a longo prazo, seja de culturas in vitro,

seja de células transplantadas in vivo (Oh e Nör et al., 2015). Assim, esforços para identificar a

localização de nichos e quais células dentro dele seriam as células-tronco, assim como quais

moléculas sinalizadoras estão envolvidas em sua ativação, é essencial para o sucesso da terapia

celular e da engenharia tecidual.

66

7 CONCLUSÃO

De acordo com os objetivos propostos e a metodologia empregada neste estudo,

pode-se concluir que:

Células estromais mesenquimais, derivadas do pool de colônias da polpa

dentária sem seleção, representam populações heterogêneas que diferem

marcadamente em relação à clonogenicidade, potencial de diferenciação e

expressão de antígenos de superfície, reiterando a importância da caracterização

das células como MSCs seguindo critério da Sociedade Internacional de Terapia

Celular;

Células isoladas da polpa dentária e validadas como células estromais

mesenquimais indiferenciadas (sejam MSCs verdadeiras, sejam MPCs) têm sua

frequência em cultura positivamente correlacionada, de maneira significativa,

com a área correspondente de arteríolas associadas a nervos (nicho vásculo-

nervoso). Numa relação causal, o número de MSCs (CFU-Fs) é explicado em

cerca de 45% dos eventos pela variação da densidade de arteríolas + nervos.

Estes achados, embora preliminares, são a primeira evidência na polpa dentária

humana de ligação indireta entre progenitores mesenquimais e arteríolas acompanhadas por

fibras/feixes neurais, gerando um suporte quantitativo de ligação entre MSCs e o nicho vásculo-

nervoso.

67

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ANEXO 1