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Nanopartículas magnéticas para
aplicaciones biomédicas
Sonia García Jimeno
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UNIVERSITAT DE BARCELONA
FACULTAT DE FARMÀCIA
DEPARTAMENT DE FISICOQUÍMICA
NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS PARA
APLICACIONES BIOMÉDICAS
Sonia García JimenoBarcelona, 2012
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UNIVERSITAT DE BARCELONA
FACULTAT DE FARMÀCIA
DEPARTAMENT DE FISICOQUÍMICA
Programa de Doctorado: “Biotecnología”
Nanopartículas magnéticas para aplicaciones
biomédicas
Memoria presentada por Sonia García Jimeno para optar al grado
de doctor
por la Universidad de Barcelona
Director: Doctoranda:
Joan Estelrich Latrás Sonia García Jimeno
Barcelona, 2012
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“Entre libremente, por su propia voluntad,
y deje parte de la felicidad que trae”
A mi familia
Por estar siempre ahí
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AGRADECIMIENTOS
La lectura de esta tesis
cierra una etapa no solo
académica en mi vida.
Es un buen
momento
de
mirar
hacia
atrás,
hacer
recuento,
y
agradecer
a
todas
las
personas
que
han contribuido directa o
indirectamente en la realización de
este trabajo. A ellos
están dedicadas estas líneas.
En primer lugar al Dr. Joan Estelrich; director, gracias por apoyarme a lo largo de estos
5 años, por la acogida, el cariño y por haber confiado en mí desde el primer momento
y haber sido persistente en conseguirme un futuro.
Gracias a todos
los profesores del departamento de
Fisicoquímica de la facultad de
Farmacia, donde he pasado
la mayor parte de mi doctorado,
por el buen trato, la
ayuda
y
las
sugerencias
que
me
han
prestado
en
muchos
momentos,
y
en
especial,
a
la
Dra. María Antonia Busquets, por
su cariño, apoyo e interés
tanto en el terreno
científico como en el personal.
A
todos mis compañeros de departamento pero en especial a: Mari, Patricia,
Joana,
Lucyanna y Eli. Chicas, gracias
por todas las alegrías, las
lágrimas, los nervios… en
definitiva, todos
los momentos que hemos compartido. Gracias por haber estado ahí,
por la paciencia, por
los consejos, porque el haberos conocido es otra de
las razones
por las cuales ha merecido la pena todo este tiempo… GRACIAS.
Al Dr. Josep Queralt y a la Dra. Elvira Escribano, por todos los ratos que hemos pasado
en el estabulario, por la paciencia, por las clases de jardinería, por enseñarme tanto.
Al Dr. José Callejas y Dr. Sándalo Roldán de
la universidad de Granada; al Dr. Lorenzo
Leija y Dr. Arturo Vera del Cinvestav, Mexico, quisiera agradecerles por haber hecho
mis estancias en sus respectivos institutos tan provechosas y agradables.
También me gustaría agradecer todo
el apoyo recibido de mi
grupo NanoUp, en el
recorrido final de esta tesis, por el consuelo, el ánimo y los consejos.
Las últimas líneas las voy a dedicar a aquellas personas que siempre han estado ahí, en
los buenos y malos momentos, esa es mi familia… Sin ellos y sin su apoyo constante en
todas mis decisiones, no hubiera sido posible
llegar hasta aquí. Espero que se sientan
orgullosos de mí.
A todos amigos de Barcelona
por la alegría, el cariño,
palabras de ánimo en los
momentos más difíciles y sobre todo por hacerme sentir que en Barcelona tengo a otra
nueva familia.
A
mis
amigos
de
Donostia
y
León,
por
seguir
estando
ahí
y
seguir
haciéndome
partícipe
de vuestras vidas, a pesar de la distancia.
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A mis padres y hermanos,
sois mi vida mi apoyo, los
que me habéis enseñado a
trabajar y a luchar por las cosas, los que me habéis inculcado unos valores de
los que
me siento muy orgullosa. Gracias
a vosotros he conseguido todo
lo que soy. A mis
sobrinas Eva y María, por alegrarme la vida.
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Índice
Página
1.
Introducción……………………………………………………….……
1
1.1. Nanotecnología………………………………………………………………………..…………
3
1.2.
Nanopartículas magnéticas…………………………………................................
4
1.3.
Comportamiento magnético…………………………………………………….………… 5
1.3.1.
Superparamagnetismo………………………………………………………….…… 7
1.3.2.
Magnetita/Maghemita……………………………………………....................
9
1.4.
Síntesis de nanopartículas magnéticas………………………………………….…….
12
1.5.
Nanopartículas magnéticas en biomedicina………………………………….…….
12
1.5.1.
Aplicaciones in vivo……………………………..…………………………….………
13
1.5.2.
Aplicaciones in vitro……………………………………………………………..….
18
2.
Objetivos……………………………………………………….………..
21
3.
Resultados………………………………………………………….…… 25
3.1.
Artículo 1: Magnetoliposomes prepared by reverse‐phase
followed by
sequential extrusion: Characterization
and possibilities in the treatment
of
inflammation……………………………………………………………………………………………..………
29
3.2. Artículo 2: Using
nanoparticles for enhancing the
focusing heating
effect of an external
waveguide applicator for oncology
hyperthermia:
evaluation in muscle and tumor phantoms……………………………………………….………
39
3.3. Artículo 3: Improved Thermal
Ablation Efficacy Using Magnetic
Nanoparticles: A Study in Tumor Phantoms……………………………………………….……..
63
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1. Introducción
1
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2
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1. Introducción
1.1. Nanotecnología
La nanotecnología constituye la
base de la próxima revolución
tecnológica, es la continuación de
las revoluciones industriales surgidas
en los tres últimos siglos:
la
Primera Revolución
Industrial aparecida alrededor de 1750 con
la introducción de la
máquina de vapor y
la obtención del acero, y
la Segunda Revolución
Industrial, que
empezó a finales del s. XIX, como consecuencia de
la introducción de
la electricidad a
escala industrial. Más recientemente, se ha producido la Revolución de la Información,
caracterizada por el desarrollo de
los sistemas de computación y
del desarrollo de
internet. Como el desarrollo de los circuitos integrados a gran escala empleados en los
procesos de información depende de
la reducción del tamaño hasta
una escala
nanométrica de los componentes
individuales de los circuitos, la
Revolución de la
Información se ha convertido en
la Revolución del mundo nanométrico o
sea en la Nanotecnología. La
nanotecnología es el estudio, diseño,
creación, manipulación y
aplicación de materiales, aparatos
y sistemas funcionales a través
del control de la
materia a escala nano, así
como la explotación de determinados
fenómenos y
propiedades de la materia a esta escala (1‐100 nm).
Las nanopartículas son partículas
con dimensiones comprendidas entre
las moléculas y las
estructuras microscópicas
(Figura 1). Cuando se manipula
la materia a una escala
tan minúscula como son los
átomos y las moléculas, la
materia presenta fenómenos y
propiedades totalmente
nuevos. En concreto, las propiedades físicas de las nanopartículas son muy distintas de
las que se observan en un sólido de tamaño macroscópico con la misma composición
química. Así,
la investigación del comportamiento de la materia a escala nanométrica
abre una prometedora perspectiva
de nuevos conocimientos y de
aplicaciones en
todos los campos científicos y/o tecnológicos. En la vanguardia de estas aplicaciones se
encuentran las relacionadas con las Ciencias de la Salud: nanopartículas como sistemas
de diagnóstico y de administración
de fármacos. Vistas como materiales,
las
nanopartículas son tan pequeñas
que exhiben características no
observables en
estructuras más grandes (incluso
después de alcanzar tamaños de
100 nm); vistas
como moléculas, son tan grandes
que proporcionan acceso al reino
del
comportamiento cuántico, que no
sería accesible de otra manera
[Akbarzadeh et al.
2012].
3
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Figu
1.2.
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4
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magnéticas, sellos magnéticos en
motores, instrumentos para memoria
óptica,
giroscopios, unidades de refrigeración magnética, etc. Cada aplicación potencial de las
NPMs requiere tener propiedades
diferentes. Por ejemplo, en las
aplicaciones de
almacenamiento de datos, las
partículas requieren poseer un estado
magnético
estable y cambiante para
representar bits de
información que no
se vean afectados por fluctuaciones de temperatura.
Para usos biomédicos, es necesario
que las partículas magnéticas sean
estables en
agua a pH 7 y,
también, en un entorno fisiológico.
La estabilidad coloidal del fluido
dependerá de la carga y de
la química de
la superficie, que dará lugar a
repulsiones
estéricas y/o culombianas. Otro
factor importante son las dimensiones
de las
partículas, que deben ser
suficientemente pequeñas para evitar
o, como mínimo,
enlentecer la precipitación [Akbarzadeh et al.
2012].
1.3. Comportamiento magnético
El comportamiento magnético de un material depende básicamente de los electrones
de los átomos que lo constituyen, en concreto del número de electrones desapareados
que posea cada átomo, así
como del orbital en el que
se encuentren. Los efectos
magnéticos son causados por los movimientos de aquellas partículas que poseen masa
y cargas eléctricas. Una partícula cargada eléctricamente crea, cuando gira, un dipolo
magnético, el llamado magnetrón. Al aplicar un campo magnético externo al material,
los dipolos magnéticos se ordenan
con el campo dando lugar a
un momento
magnético dentro del material. Un
electrón presenta dos tipos de
momentos
angulares: el momento de orbital y el momento de espín. Ambos pueden
interactuar
como cualquier par de dipolos
y producir un acoplamiento
espín‐orbital. De las
características de este acoplamiento surgen las propiedades magnéticas de los átomos
y las moléculas, y los materiales se clasifican según la respuesta a un campo magnético
externo en cinco formas básicas
de magnetismo:
diamagnetismo, paramagnetismo,
ferromagnetismo, antiferromagnetismo y ferrimagnetismo (Cullity 1972; Jilles 1991).
En presencia de un campo
magnético aplicado externamente, la
corriente atómica
creada por el movimiento orbital de los electrones se opone al campo aplicado. Todos
los materiales muestran esta repulsión débil como respuesta a un campo magnético, y
esta propiedad es la que se
conoce como diamagnetismo. Un ejemplo
de material
diamagnético es el agua y
las proteínas (Pankhurst et al.
2003). Como ya se ha
indicado, el diamagnetismo es muy débil, y, por consiguiente, cualquier otra forma de
comportamiento magnético que el material pueda poseer
supera, generalmente, los
efectos de la corriente generada por el movimiento de los electrones. En términos de
la configuración electrónica, el diamagnetismo se observa en aquellos materiales que
tienen completas las
subcapas electrónicas, hecho que comporta que
los momentos
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magnéticos estén apareados y, en conjunto, unos se contrarrestan con
los otros. Los
materiales diamagnéticos tienen una
susceptibilidad magnética negativa
( χ
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magnetización permanente en ausencia de un campo magnético aplicado se conocen
como imanes duros. Por el contrario, los materiales que tienen momentos magnéticos
atómicos de igual magnitud y dispuestos de manera antiparalela muestran, por debajo
de la temperatura de Néel (análoga a la temperatura de Curie pero aplicada a este tipo
de materiales), el comportamiento conocido como antiferromagnetismo (por ejemplo, la troilita, FeS), caracterizado por poseer una magnetización neta nula. Por encima de
la temperatura de Néel, la
energía térmica es suficiente para
producir que los
momentos magnéticos atómicos alineados
de manera opuesta fluctúen de
manera
aleatoria, comportando la desaparición
de su ordenación de largo
alcance. En este
estado,
los materiales exhiben comportamiento paramagnético. Si los electrones, por
debajo de la temperatura de
Curie, están alineados de forma
antiparalela, pero el
momento magnético resultante no se anula, el material es ferrimagnético (Raikher et
al. 1974). Por encima de la
temperatura de Curie, la substancia
se transforma en
paramagnética.
1.3.1. Superparamagnetismo
Debido a que, si todos los momentos magnéticos se orientasen en la misma dirección
se generaría una gran cantidad
de energía magnetostática, el
material agrupa los
magnetrones en regiones denominadas
dominios magnéticos (Kittel 1946).
Un
dominio magnético es un volumen
de material ferromagnético en el
que todos los
magnetrones se alinean en
la misma dirección
(magnetización uniforme). Dentro de
cada dominio los espines están orientados en la misma dirección pero distinta a la de
otros dominios magnéticos (Figura
2). El concepto de dominio
permite distinguir el
ferromagnetismo del paramagnetismo. Cada
región de magnetización uniforme está
separada por una pared. La
formación de las paredes de
dominio es un proceso
condicionado por el equilibrio
entre la energía magnetostática, que
aumenta
proporcionalmente con el volumen
de los materiales, y la energía
superficial de la
pared del dominio, que aumenta
proporcionalmente con el área
interfacial entre
dominios. Aunque se genere energía de
interfacial de unos dominios con otros, esta
configuración multidominio dentro del material es la más favorable desde el punto de
vista energético. Sin embargo, cuando el tamaño de la partícula de material disminuye,
el número de dominios magnéticos decrece hasta un valor crítico (DCRIT) en el que el
elevado valor de la energía
asociada con la pared de los
dominios es
termodinámicamente desfavorable, y el material se convierte en monodominio
(Este
tamaño se alcanza cuando se igualan las energía magnetostática con la superficial). Así,
el valor DCRIT indica el tamaño de la transición monodominio‐multidominio. Por debajo
de DCRIT, el material posee
todos sus momentos magnéticos orientados en
la misma
dirección cuando se le aplica
un campo magnético. Esto da
lugar a un dipolo
permanente dentro del material de
una magnitud similar a la de
los materiales
7
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9
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(magnetita) y
γ‐Fe2O3 (maghemita). Los metales puros presentan los valores más altos
de susceptibilidad magnética que los óxidos (Tabla 1).
Substancia Magnetización de
saturación
Ms (emu cm‐3 ) a 298 K
Temperatura de Curie
(K)
Ni 485 631
Co (cúbico) 1400‐1422 1404
Fe (cúbico) 1700‐1714 1043
γ‐Fe2O3 394 820‐986
Fe3O4 480‐500 858
MnO∙Fe2O3 410 573
CoO∙Fe2O3 400 793
NiO∙Fe2O3 270 858
CuO∙Fe2O3 135 728
Tabla 1. Datos magnéticos de metales de transición y óxidos metálicos.
Sin embargo, los metales de
transición son fuertemente
tóxicos y muy sensibles a la
oxidación. Bajo condiciones atmosféricas el Ni, Fe y Co se oxidan dando aleaciones de
NiO2, CoO, y FeO, que son
antiferromagnéticos. En la actualidad,
no existe ningún
método físico o de síntesis que evite el mecanismo de oxidación, lo que constituye un
problema de gran importancia en las nanopartículas a causa de la gran área superficial
que presentan. Por consiguiente,
los óxidos de hierro, a pesar
de su inicial
magnetización más baja, ofrecen un gran potencial para formar NPMs oxidativamente
estables con diversas posibilidades de aplicación en entornos ricos en oxígeno.
Como la magnetita es el
material más magnético de todos
los minerales naturales
existentes en la Tierra, se
emplea profusamente en forma de
nanopartículas
magnéticas para todo tipo de aplicaciones industriales y biológicas. La maghemita, que es el producto de oxidación de la magnetita, es, también, muy empleado.
Estos dos óxidos tienen propiedades físicas y estructuras cristalinas similares (Tabla 2).
10
-
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22/125
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11
-
8/9/2019 nanoparticulas biomedicas
23/125
En estos óxidos, la disminución de tamaño de las nanopartículas por debajo de los 10
nm es contraproducente. La
presencia de iones de hierro en
la superficie crece a
medida que disminuye el
tamaño de la partícula.
Los átomos de hierro poseen una
naturaleza especial ya que poseen falta de simetría al no encontrarse coordinados en
todas las direcciones. Esto da
lugar a una disminución de la
magnetización de
la magnetita y de la maghemita (Cornell y Schwertmann, 1996).
1.4.
Síntesis de nanopartículas magnéticas
Durante los últimos años se
han descrito diferentes rutas para
obtener de manera
eficiente NPMs de tamaño
controlable, estables, y
con una estrecha distribución de
tamaños. Estos métodos incluyen la
co‐precipitación, la microemulsión, la
descomposición térmica,
la deposición química de vapor,
la síntesis por pirolisis, etc. (Una descripción de estos métodos puede encontrarse en Lu et al. (2007)). El método
más utilizado, y el seguido
en el trabajo experimental de
esta tesis, es, por su
simplicidad y bajo coste,
la co‐precipitación de sales de Fe3+
y Fe2+
en medio altamente
alcalino. Es un proceso fácilmente escalable y por ello es utilizado en la industria para
el diseño y fabricación de
nanopartículas de óxido de hierro
como agentes de
contraste.
1.5.
Nanopartículas
magnéticas
en
biomedicina
La utilización de nanopartículas magnéticas dentro del campo de la biomedicina viene
realizándose desde la década de
los 90 del s. XX. El
hecho de que el hierro sea
fácilmente metabolizado dentro del
cuerpo, que las partículas tengan
tamaños
comparables al de las proteínas,
células, virus y ADN, que la
superficie de estas
partículas pueda ser modificada a
fin de unir moléculas de
interés biológico, que las
partículas posean un elevado momento magnético, así como que las líneas de campo
puedan atravesar el cuerpo humano,
hace que las partículas posean
un futuro
prometedor en la búsqueda de
metodologías poco invasivas de
asistencia al diagnóstico y
tratamiento de enfermedades (Pankhurst
et al. 2003; Huber 2005;
Arruebo et al. 2007). Recientemente, han aparecido aplicaciones que combinan tanto
la terapéutica como
la diagnosis, permitiendo un elevado control de la eficacia de un
tratamiento individual. Esta combinación es conocida en la actualidad como teranosis
(Mornet et al., 2004; Shubayev et al. 2009).
En ausencia de recubrimiento, las
NPMs muestran superficies hidrofóbicas
que
facilitan la fuerza atractiva de
Van der Waals y dan lugar
a la formación de
aglomerados que pueden
llegar a alcanzar valores micrométricos. Esta agregación se
produce de manera especial en
fluidos biológicos, debido a la
presencia de sales y
12
-
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14
-
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-
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ablación térmica se ha empleado como terapia de rescate tras fallos post‐radioterapia.
La hipertermia, además de la
aplicación de campos electromagnéticos,
puede
producirse mediante ultrasonidos,
terapia de perfusión, fotocoagulación
de láser
intersticial, y administración de calor por contacto externo.
La termoterapia con NPMs es una opción nueva, mínimamente invasiva.
La generación
de calor depende de las
propiedades de magnetización de las
formulaciones
específicas de las NPMs, así como de la intensidad y frecuencia del campo magnético.
Se prefiere el uso de
partículas nanométricas (de dominio
único) frente a los
materiales micrométricos (de dominios múltiples), ya que las nanopartículas absorben
mucha más potencia a tolerables campos magnéticos de corriente alterna. Es de cabal
importancia, por lo tanto, hacer
uso de rutas de síntesis bien
establecidas que
produzcan partículas uniformes a
fin de poder tener un control
riguroso de la
temperatura.
En esta técnica se inyecta
directamente en tumores superficiales
o profundos, un
fluido que contiene SPIONs
con dimensiones entre 10 a 100 nm. A
continuación, se
aplica un campo magnético alterno de suficiente intensidad y frecuencia que provoca
mediante relajaciones de Néel (por rotación del espín) y de Brown (por rotación de la
partícula) una disipación de la
energía y su transformación en
calor, llegando a un
sobrecalentamiento del tejido donde
se habían dispersado las NPMs.
La energía
liberada al medio circundante
dependerá de la cantidad, del
tamaño de las NPMs
utilizadas y de la fuerza del campo magnético aplicado (Jordan et al. 1999).
1.5.1.2. Liberación de fármacos. La posibilidad de utilizar atracción magnética externa
o la funcionalización de
las NPMs con moléculas que reconocen dianas sobre
las que
actuar, hace que sea posible el guiado de
las NPMs hacia las zonas de
interés, donde
debe producirse la liberación del
fármaco. Esta función de liberación
focalizada de
drogas terapéuticas, conlleva la reducción de la dosis del fármaco y la desaparición de
efectos secundarios no deseados
sobre otras células o tejidos
sanos (Duguet et al.
2006).
El guiado está relacionado con
el movimiento y la trayectoria
que pueden
experimentar
las NPMs al aplicárseles un campo magnético estático o alterno, de tal
manera que adquieran una velocidad
y puedan ser manipuladas controlando
dicho
campo. El mismo efecto puede
lograrse si
las partículas están direccionalizadas, por
ejemplo si presentan en su
superficie un anticuerpo específico
para un antígeno
presente en
las células o tejido que se quieren tratar. Como consecuencia del guiado
de
las NPMs, éstas pueden focalizarse, o sea, concentrarse en un
lugar específico del
organismo.
16
-
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28/125
Como ya se ha indicado, se
pueden modificar las superficies de
las NPMs con
polímeros orgánicos para hacerlas
biocompatibles y adecuadas para una
posterior
funcionalización mediante el engarce
de moléculas bioactivas, El proceso
de
localización de
fármacos empleando sistemas de
liberación magnéticos se basa en
la
competición entre las fuerzas
ejercidas sobre las partículas por
el
compartimiento sanguíneo y las fuerzas magnéticas generadas por el imán.
1.5.1.3. Aplicaciones diagnósticas: RMI. La RMI es una de las técnicas más utilizadas en
la actualidad como herramienta diagnóstica no
invasiva
(Mitchell y Cohen, 2004). Se
basa en la diferencia de las relajaciones magnéticas nucleares de los protones del agua
entre los fluidos biológicos y
los tejidos sólidos. Un agente de
contraste modifica la
velocidad de relajación magnética nuclear de
los protones de su entorno y cambia el
contraste de la señal. Las NPMs se administran a fin de (a) aumentar el contraste de la
imagen entre el tejido sano
y el enfermo, y/o (b)
indicar el estado funcional de
los
órganos o del flujo sanguíneo (Corod et al. 2006).
Las NPMs como agentes de contraste para RMI permiten una mejor interpretación de
las imágenes obtenidas al aumentar
las diferencias entre tejidos normales
y tejidos
patológicos. Se pueden distinguir dos
tipos de agentes de contraste:
los agentes de
contrate T1 (por ejemplo, iones
metálicos paramagnéticos, como el
Gd3+), y los
agentes de contraste T2
(las NPMs)
(Ho et al. 2011). Los
contrastes T1 aumentan la
brillantez de la imagen mientras que los T2 dan negativos de las imágenes. Los agentes
de contraste de RMI convencionales
son más efectivos sólo en un
modo único de
imágenes, T1 o T2. Sin embargo, la combinación del uso simultáneo de ambos agentes
en un único agente de
contraste puede representar una gran
innovación, ya que
potencialmente puede proporcionar imágenes más precisas. El fundamento se basaría
en el
fuerte acoplamiento magnético entre
los agentes de contraste T1 y T2 cuando
éstos se encuentran próximos, entonces, los procesos de relajación espín‐malla de los
materiales tipo T1 provocan
la disminución de este contraste. Una de
las estrategias
para alcanzar esta situación es la de preparar nanopartículas que contengan un núcleo
superparamagnético y una cubierta paramagnética separada por una capa de material
no magnético (Figura 7) (Yoo et al. 2011).
Por otra parte, las NPMs
tienden a acumularse en los
lugares donde existe una
alteración de la vasculatura del tejido, caso de los tumores (Maeda, et al. 2000). Este
fenómeno, unido al hecho de que en el
tejido tumoral existe un
sistema de drenaje
linfático defectuoso, provoca la acumulación en las zonas tumorales de aquellas NPMs
con de tamaños entre 10 y
100 nm. Actualmente, también se
están sintetizando
nuevas NPMs para realizar el
diagnóstico de enfermedades inflamatorias,
con una
futura aplicación en enfermedades
tan comunes como aterosclerosis,
esclerosis
múltiple o artritis reumatoide, en las que los macrófagos juegan un papel fundamental.
17
-
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29/125
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18
-
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30/125
parte, se han usado NPMs conjugadas a anticuerpos para descontaminar la sangre de
agentes infecciosos (Weber y
Falkenhagen 1997). También se han
utilizado los
principios de bioseparación magnética en
tecnologías de biosensores
integrales. Por
ejemplo, con la estrategia basada en
la amplificación bio‐barcode se pueden detectar
analitos proteicos (como los
oligómeros asociados a la enfermedad
de
Alzheimer) empleando anticuerpos unidos a NPMs (Nam et al. 2003).
1.5.2.2. Magneto‐relaxometría. Se
introdujo como método de evaluación
de
inmunoensayos. La magnetorelaxometría
mide la viscosidad magnética, esto
es, la
relajación del momento magnético neto de un sistema de NPMs después de quitar el
campo magnético. Existen dos tipos diferentes de relajación. En una muestra seca de
NPMs monodominio, la relajación de
Néel es el tiempo requerido
para volver al
equilibrio de
la magnetización después de una perturbación. La
relajación de Brown
caracteriza la rotación viscosa de las partículas en su conjunto. La figura 8 muestra los
dos componentes de la relajación
magnética de un ferrofluido. El
hecho que la
magnetorelaxometría dependa del tamaño
del núcleo magnético, del radio
hidrodinámico y de la anisotropía, posibilita, en base a su comportamiento magnético
diferente, distinguir entre conjugados unidos y
libres, y, por consiguiente, emplearse
como herramientas analíticas en la evaluación de inmunoensayos. Para esta aplicación,
los beneficios de reducir el
tamaño de partícula a escala
nano son similares a los
indicados para aplicaciones de separación y selección.
Figura 8. Ilustración de los dos componentes de la relajación magnética de un fluido magnético (Figura 2
de Laurent et al., 2011).
19
-
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2. Objetivos
21
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3. Resultados
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3. Resultados
Los resultados de la presente tesis están reflejados en los
siguientes artículos
científicos, los cuales se presentan a continuación acompañados
por un breve resumen
en castellano.
Artículo 1. García-Jimeno, S., scribano, ., !ueralt, J.,
stelric", J., #$%&&'.
(agnetoliposomes prepared b) reverse-p"ase follo*ed b)
se+uential etrusion
"aracteri/ation and possibilities in t"e treatment of
inflammation. 0nternational
Journal of 1"armaceutics, 2%3, &4&5&46.
Artículo 2. . J. 7rujillo-8omero, S. García-Jimeno, 9.
:era, L. Leija, J. stelric". #$%&&'.
;sing nanoparticles for en"ancing t"e focusing "eating effect of
an eternal *aveguide
applicator for oncolog) ")pert"ermia evaluation in muscle and
tumor p"antoms.
1rogress 0n lectromagnetics 8esearc", &$&,
-
8/9/2019 nanoparticulas biomedicas
39/125
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Artículo 1.
Magnetoliposomes prepared by
reverse‐phase followed by sequential
extrusion:
Characterization and possibilities in the treatment of inflammation.
International Journal
of
Pharmaceutics,
405,
181–187.
Se ha realizado una optimación
en la eficiencia de encapsulación
de ferrofluido en
liposomas, utilizando dos métodos:
el de fase reversa y el
de extrusión simple. Se
describe la cuantificación y la
optimización de la encapsulación de
ferrofluido en
liposomas mediante una modificación
del método de fase reversa con
la posterior
extrusión, para obtener liposomas
unilamilares de 200 nm. Para
determinar qué
relación de Fe3O4/fosfolípido es
la más adecuada, el film de
fosfolípido es hidratado
con diferentes diluciones de FF que
van desde 1.28 ‐
32.11 mg de Fe3O4 por mL de
suspensión. Una vez que se
forma la
suspensión de magnetoliposomas,
se purifican
eliminando el ferrofluido no
encapsulado mediante columna cromatografía
de
separación de tamaños (SEC), con Sepharosa 4B. La cantidad de Fe3O4 encapsulada se
determinó midiendo la cantidad de hierro que se obtienen de las primeras fracciones,
mediante un método colorimétrico
usando o‐phenantroline. El contenido
en
fosfolípido se determinó mediante el método de Steward‐Marshall. Así es calculado el
porcentaje de
encapsulación,
mediante
la
relación
Fe3O4/fosfolípido.
En
ambos
casos,
se ha utilizado una relación de 0.056 g de hierro por mmol de fosfolípido. En el método
de extrusión simple, se obtienen después de
la purificación por cromatografía, 15.0 ±
1.7 mg de hierro/mmol PC (n=4) y en el método de fase reversa obtenemos 23.8 ± 1.7
mg de hierro/mmol PC (n=4).
El análisis estadístico indica que
la encapsulación es
significantemente diferente (P=0.0002).
Se ha valorado la biodistribución de nanopartículas en el foco inflamatorio inducido en
el lomo de ratón. Se utilizaron ratones hembra CD‐1 de 7‐8 semanas de edad (28‐32 g
de peso). Los MLs se
administraron por vía intravenosa a
ratones sanos y con
inflamación inducida, una dosis expresada en contenido de hierro de 0.5 mg/mL. Se ha
valorado la concentración de
hierro, a los 20 minutos de
ser administrados, en el
exudado
inflamatorio, plasma, hígado y bazo, mediante
la técnica, espectrometría de
emisión óptica con fuente de
plasma de acoplamiento inductivo
(ICP‐OES), previa
digestión acida de
la materia orgánica. Se observa que
los MLs son acumulados en la
zona de inflamación, lo que
sugiere que estas partículas podrían
contener
medicamentos para tratar algunos de
los procesos
inflamatorios. El estudio realizado
esta aprobado por el comité ético de la universidad de Barcelona.
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International Journal of Pharmaceutics
j o u r n a l h o m e p a g e : w w w . e l s e v i
e r . c o m / l o c a t e / i j p h a r m
Pharmaceutical Nanotechnology
Magnetoliposomes prepared by reverse-phase followed by
sequential extrusion:Characterization and possibilities in the
treatment of inflammation
Sonia García-Jimeno a, Elvira Escribano b, Josep Queralt c, Joan
Estelrich a,∗
a Departament de Fisicoquímica, Facultat de Farmàcia,
Universitat de Barcelona, Avda. Joan XXIII, 08028 Barcelona,
Catalonia, Spainb Departament de Farmàcia i Tecnologia
Farmacèutica, Facultat de Farmàcia, Universitat de Barcelona, Avda.
Joan XXIII, 08028 Barcelona, Catalonia, Spainc Departament de
Fisiologia, Facultat de Farmàcia, Universitat de Barcelona, Avda.
Joan XXIII, 08028 Barcelona, Catalonia, Spain
a r t i c l e i n f o
Article history:
Received 16 September 2010Received in revised form17 November
2010Accepted 24 November 2010Available online 1 December 2010
Keywords:
BiomaterialsInflammationLiposomesMagnetic propertiesMagnetic
materials
a b s t r a c t
Anionicferrofluid was encapsulated in 200nm-diameter liposomes.
The processinvolved phase-reverseevaporation followed by sequential
extrusion. Magnetoliposomes were characterized by
transmissionelectron microscopy, Doppler laser electrophoresis,
SQUID magnetometry, dynamic light scattering andiron content by
atomic absorption spectrophotometry. The absence of hysteresis of
the magnetic powerof particles at room temperature is
characteristic of a material with superparamagnetic properties.
Theencapsulationefficiency was determined for several
iron/phospholipid ratios, and this parameter rangedfrom 0.016 to
0.024mg iron per mmole of phospholipids, depending on the initial
magnetite concentra-tion. Incomparisonwithmagnetoliposomes
thatwereobtained solelyby extrusion,this
methodaffordedsignificantly better encapsulation (P = 0.0002).
Magnetic particles were intravenously administered tohealthy or
inflammation-induced mice. After 1 h, the content of iron was
determined in exudates, liver,spleen and
plasma.Magnetoliposomesaccumulated in the exudates collected from
the inflammation site,which suggests that these particles could be
loaded with the drugs needed to treat some
inflammatoryprocesses.
© 2010 Elsevier B.V. All rights reserved.
1. Introduction
Nanoparticles offer exciting opportunities for technologies
attheinterfacesbetween chemistry,physics andbiology, as theyforma
bridge between bulk materials and atomic or molecular struc-tures.
A bulk material should have constant physical propertiesregardless
of its size, but this is often not the case at nanoscale. Forbulk
materials larger than a fewm,the percentage ofatoms atthesurface is
rather insignificant relative to the total number of atomsof
material.However, when the size of the material approaches
thenanoscale, the percentage of atoms at the surface becomes
signifi-cant.Magneticnanoparticles show considerable promise for a
widerange of applications, provided the monodispersity of
nanoparti-cles andthe surface properties are controlled (Craig,
1995).Theuseof magnetic nanoparticles as non-volatile datastorage
media
offerscertainadvantagesoverotherformsofstorage.Moreover,magneticnanoparticles
are or may soon be used in several biomedical
appli-cations.Forexample,thecombinationofbiomoleculeswithasinglemagnetic
nanoparticle is expected to open new avenues in medi-cal
diagnostics, drugtargeting or innovativecancer therapies (Reissand
Hütten, 2005; Arruebo et al., 2007). The movements of mag-
∗ Corresponding author. Tel.: +34 934024559; fax: +34
934035987.E-mail address: [email protected] (J.
Estelrich).
netic nanoparticles can be deliberately controlled and
magneticfields can penetrate human tissues without impediment.
Conse-quently, magnetic nanoparticles can be used to deliver
packages,such as anticancer drugs or radionuclide atoms, to a
targeted areaof the human body. Additionally, magnetic
nanoparticles respondstrongly to time-modulated magnetic fields,
and hence enabledynamic methods of cancer treatment. Alternatively,
they couldbe used to enhance the contrast in magnetic resonance
imaging.The ability of such particles to convert magnetic energy
into heatby relaxation and hysteresis effects has also gained much
attentionin antitumor therapy. This simple physical effect could be
used todestroy cells directly or to induce a modest rise in
temperaturethat could increase the efficacy of chemotherapy or
radiotherapy(Schmitt, 2007). Finally, the viscoelastic architecture
inside livingcells canbe studied by controlled positioning of
magnetic nanopar-ticles inside the internal skeleton of cells. The
response of suchparticles to dynamic magnetic fields can then be
followed.
For most of these applications, magnetic nanoparticles areformed
by ferromagnetic material such as cobalt, iron or
nickel,andparticularly by ferrimagnetic iron oxides
(maghemite,-Fe2O3,and magnetite, Fe3O4). The magnetic material
presents differ-ent properties according to particle size.
Macroscopic materials(of the order of one micron or more) tend
towards the forma-tion of magnetic domains that are characterized
by the parallelalignment of magnetic moments on the atomic scale
within the
0378-5173/$ – see front matter © 2010 Elsevier B.V. All rights
reserved.doi:10.1016/j.ijpharm.2010.11.044
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run. The value (93±2 mg Fe3+ per mL of ferrofluid) was the
aver-age of three replicates. In the case of magnetoliposomes, iron
wasmeasured by atomic absorption spectrophotometry as
previouslydescribed, and by a colorimetric method based on the
titration of ferrous ion by o-phenanthroline (Kiwada et
al., 1986). Both resultscoincided. The magnetization of
magnetoliposomes and ferrofluid
was measured as a function of the applied external magnetic
fieldin a SQUID Quantum Design MPMS XL magnetometer. The
externalmagnetic field was swept from +5000 to −5000Oe, and then
backto +5000 Oe. Measurements were taken at room temperature.
Thehydrodynamic diameter of magnetoliposomes was determined
bydynamic light scattering at 90◦ with a Zetasizer Nano
(Malvern,EU) at 25 ◦C. The particle size distribution was
designated by thepolydispersity index (PI), which ranged from 0.0
for an entirelymonodisperse sample to 1.0 for a polydisperse
sample. The -potential measurements of
magnetoliposomes were performed at25 ◦C using a Zetasizer Nano ZS
(Malvern, EU).
2.4. Encapsulation efficiency determination
To establish the best magnetite/phospholipid ratio, we
preparedliposomes hydrated with 1.28–32.11 mg of magnetite per mL
of suspension. Non-entrapped ferrofluid particles were removed
bysize exclusion chromatography (SEC) on Sepharose 4B (GE
Health-care, EU). A total of 250L of magnetoliposomes were
appliedto a 1×30cm column saturated with lipids before sample
elu-tion and eluted with bidistilled water. The amount of
encapsulatedmagnetite was determined on the basis of the ferrous
ion
using o-phenanthroline(Kiwadaetal.,1986).Thephospholipidcontentwasdetermined
by the Steward-Marshall method
(Steward-Marshall,1980).Athighmagnetiteconcentrations,thecolouroftheferrofluidis
added to the colour developed in the chemical reaction.
Conse-quently, the magnetite must be separated from the
phospholipidsprior to the phospholipid determination. For this
purpose, a MACS
separation column was used. If a powerful magnet is placed in
thesystem, iron oxideparticlespass through the
liposomalmembrane.Once it has been verified that phospholipid is
recovered at 100%
intheeffluent,thepercentageofencapsulationcanbecalculatedfromthe
magnetite/phospholipid ratio.
2.5. Animal and biological methods
We used twenty-seven eight-week-old female CD-1 mice witha body
weight of 28–32 g (Harlam Ibérica, Sant Feliu de
Codines,Barcelona,EU).Thestudywasconductedunderaprotocolapprovedby
the Animal Experimentation Ethics Committee of the Universityof
Barcelona.
The mice were randomly divided into four groups (five ani-
mals per group): (a) healthy control-saline (C ): animals
with aback air pouch that received saline intravenously (i.v.)
(0.1mL/10gbody weight); (b) healthy control-magnetoliposomes
(CM ): ani-mals with a back air pouch that received
magnetoliposomes i.v.(10 mg of iron/kg body weight); (c) an
inflammation-control group(I ): animals with
carrageenan-induced inflammation in the airpouch; and (d)
inflammation-magnetoliposomes (IM ): animalswith
carrageenan-induced inflammation in the air pouch thatreceived
magnetoliposomes i.v. (10mg of iron/kg body weight).
The methodused to induce acute inflammation is similar to
thatdescribed by Romano et al. (1997). Briefly, sterile air pouches
wereproduced by injecting 5mL of air subcutaneously into the back
of the mouse. Then, 1 mL of sterile saline (groups C and CM)
or 1 mL of the phlogogen, 1.2% carrageenan lambda
(Sigma–Aldrich, Saint
Louis, MO) in saline (groups I and IM), was injected into the
airpouch. Five hours later, saline (groups C and I) or
magnetolipo-somes in saline (groups CM and IM) was administered
through the
jugular vein to anesthetized (isoflurane, Dr Esteve S.A.,
Barcelona,EU) mice. The mice were sacrificed twenty min after the
saline ormagnetoliposome administration.
The iron content in plasma, exudates (pouch) and organs
wereanalyzed by inductively coupled plasma atomic emission
spec-troscopy (ICP-AES, Perkin-Elmer Optima 3200RL,
Massachusetts,
USA) after acid digestion of the organic material. The
statisticalsignificanceof iron concentrations wasanalyzed
usingANOVA. Sta-tistical significance was accepted at the 5% level
(P ≤0.05). Valuesare expressed as mean±SEM.
3. Results and discussion
3.1. Characterization of magnetic particles
A TEM micrograph of magnetoliposomes is shown in Fig. 1.The
size of the magnetoliposomes ranged from 130 to 180nmand they were
full of clusters of particles of ferrofluid. The mag-netization
curve of the magnetoliposomes is shown in Fig. 2.
Thesaturation magnetization (taken as magnetization at the
maximum
field of 5 kOe, that is, 0.025emu g−1
or 0.028emucm−3
; the vol-ume magnetization was calculated by assuming that the
density of the overall solution was 1.1 g cm−3) was lower than
the theoreticalvalue for the bulk Fe3O4 of 96.43 emu g−1 (4),
but was neverthelessconsistent with a magnetic colloid in water
(1.8 vol% Fe3O4, accord-ingto thetechnical information on
theferrofluid) andencapsulatedin liposomes.The magnetization
curvealsoshowed negligiblerem-nant magnetization at zero field,
which is also characteristic of asoft ferromagnetic material of
smalldimensions such as magnetite.However, the absence of
hysteresis at room temperature demon-strated the superparamagnetic
behaviour of the magnetite powderof the magnetic particles.
The dependence of the -potential on pH was
investigated inmagnetoliposomes. Buffer solutions of pH ranging
from 2.25 to11.30 were prepared with phosphate, citrate and borate
solutions.Samples were prepared by adding 1.5L of magnetoliposomes
toaliquots of 3mL of each pH solution. The -potential
results areshown in Fig. 3. The external phospholipid
monolayer conferred
anegativechargetothemagnetoliposomesforthe3.9–11.30rangeof pH,
as evidenced by the negative values of -potential
determined.At pH 7.4, a -potential value of −26.3
mV was obtained (the pH of
Fig. 1. TEM micrographof magnetoliposomes. In this
figure,the magnetoliposomeswere not stained.
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Fig. 2. Mass magnetization as a function of the external
magnetic field for mag-netoliposomes at ˜300K. The external
magnetic fluid was swept from +5000 to
−5000 Oe (circles) and then back to +5000 Oe (squares).
the saline suspension of magnetoliposomes is 6.7). Under the
sameconditions, the ferrofluid gave a maximal value
of −41.8 mV at apH of 3.5. Electrostatic stabilization
was confirmed by the fact thatno sedimentation wasobservedwhen
magnetoliposomes at pH 7.4were centrifuged at
∼50,000× g for 15 min at room temperature.
The influence of salts on -potential was also checkedin
magne-toliposomes. In water, magnetoliposomes presented
a -potentialof −33.2 mV.When a 1:1electrolytewas
added (KBr or NaNO3),the -potential was greatly reduced at the
lowest salt concentrationused (Fig. 4). After this reduction, the
values of -potential under-went a slight, but
continuous, variation with salt concentration: anincrease in salt
concentration was concomitant with less negativevalues
of -potential. A different effect was observed with
divalentsalts (Ca[NO3]2 or Mg[NO3]2). These salts reversed
the negativeinitial values of the charge to the positive values.
This finding canbe explained by the adsorption of the counter ions
on the exter-nal layer of the phospholipid. Since positive values
were observedat salt concentrations of less than 0.01 molL −1,
such divalent ionsclearly have high adsorption ability. Whereas
monovalent ions donot produce any aggregation on liposomes,
divalent ions, namelycalcium and magnesium, result in the
aggregation of charged lipo-somes (Roldán-Vargas et al., 2009).
Fig. 3. The -potential of magnetoliposomes as
a function of pH. Buffer solutionswith an ionic strength of 0.002
were used. Lines are given as a guide (n =3).
Fig. 4. Influence of electrolytes (monovalent and
divalent ions) on electrophoreticproperties of magnetoliposomes (n
=3).
Fig.5 showstheprofilesofmultilamellarmagnetoliposomesandextruded
magnetoliposomes before and after the SEC
purificationofaliposomalsamplecontaining0.140gofFe3+
permmoleofphos-pholipids. Thesize distributionof ferrofluidis
displayedin theinsetin Fig. 5. This distribution was centred
at 104nm, and, althoughmonomodal, it was polydisperse (PI = 0.291).
The hydrodynamicradius of ferrofluid exceeded the radius of the
magnetite particle(̃10 nm) that was obtained by TEM. Thus, a
ferrofluid particle maycontain more than oneparticleof magnetite.
Theclustering of mag-netic nanoparticles has also been observed in
magnetite stabilizedsurfactants (Ditsch et al., 2005; Sabaté et
al., 2008). Multilamel-lar magnetoliposomes obtained after solvent
evaporation that didnot undergo the extrusion step exhibited a
bimodal distribution,
with a peak centred at 369 nm (76.2% of the entire intensity)
corre-spondingtomagnetoliposomes,whereastheminorpeakat80.5nm(23.8%
of the intensity) corresponded to the non-encapsulated fer-rofluid.
This pattern was observed for all the iron concentrationstested.
After extrusion, a wide, unique peak with maxima between160 and
190nm was observed. A value of 187 nm was found forthe preparation
described above. Purification by size exclusionchromatography
afforded a narrower peak with a z -mean diam-eter shifted
to approximately 200nm (in this case, 218 nm). Thisvalue is in
agreement with the diameter obtained by TEM. These
Fig. 5. Distribution of hydrodynamic diameters expressed
as z -diameters at 298 Kof multilamellar
magnetoliposomes(red circles), unpurified extrudedmagnetolipo-somes
(green triangles), and purified extruded magnetoliposomes (blue
squares).The concentration of the samples was 0.140 g Fe3+ by mmol
of phospholipid. Inset:sizedistribution of ferrofluidparticles.
(Forinterpretationof thereferences tocolourin this figure legend,
the reader is referred to the web version of the article.)
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Table 1
Encapsulation efficiency of magnetoliposomes.
Initial iron/phospholipid ratio (g/mol) forpreparing
magnetoliposomes
Final iron/phospholipid ratio (g/mol) for
preparingmagnetoliposomes after their purification by SEC
Percentage of Fe3O4 encapsulated
0.0280.001 0.0160.001 57.10.10.0370.001 0.0180.001
48.60.10.0560.001 0.0240.002 44.60.10.1400.006 0.0160.001
11.40.1
values imply that the recovered magnetoliposomes were mainlyfree
of contaminating external magnetite, and that the
distributionobtained with non-purified magnetoliposomes was the
result of overlapping of the ferrofluid and liposome
distributions.
3.2. Encapsulation efficiency determination
The encapsulation efficiency was determined in liposomeswith
varying initial weight/mol ratios of magnetite to phospho-lipids,
ranging from 0.028giron/mmol PC to 0.140giron/mmol
PC. In all set ups, an identical amount of phospholipid was
usedinitially. Magnetite and phospholipid concentrations were
deter-mined before extrusion and after purification by
chromatography.Table 1 shows the results obtained for
encapsulation efficiency.
The amount of encapsulated iron steadily increases asthe
starting iron/phospholipid ratio increases from 0.028
to0.056giron/mmol PC. The low percentage of encapsulation
from0.140giron/mmol PC can be explained by the loss of
magnetiteduring the extrusion process, since the polycarbonate
membraneis completely covered by a dark film of magnetite. Although
mag-
Fig. 6. (A)Pouchvolume (mL); (B)plasmaironconcentration
(g/mL); (C) pouch (exudates)iron concentration (g/g);
(D)pouchtotaliron(g); (E) liver ironconcentration
(mg/g), and (F) spleen iron concentration (mg/g). Bars represent
mean± SD. From left to right bars correspond to: healthy control
mice (C, ), control mice that receivedmagnetoliposomes i.v.
(CM, ), mice with inflammatory pouch (I, ) and mice with
inflammatory pouch with magnetoliposomes i.v. (IM,
). P < 0.05 between controland inflammation groups of
mice with or without magnetoliposomes (inflammatory effect).
P
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netite is much smaller than the magnetoliposomes, the
formationof clusters of ferrofluidparticles could explain
thepresence of mag-netite on the surface of membranes.
Aswewantedtodeterminewhetherthereverse-phaseevapora-tion
presented an improvement in the encapsulation of magnetite,we
compared the encapsulation in magnetoliposomes prepared
using this method with that obtained by a simple extrusion.
Inboth cases, we used initial ratios of 0.056 g of iron per mmole
of phospholipid. After SEC purification, we obtained the
followingencapsulations: 15.0±1.0mgiron/mmolPC(n
=4)fortheextrudedmagnetoliposomes and 23.8±1.7mgiron/mmol PC (n =
4) for thereverse-phase extruded magnetoliposomes. A statistical
analysisof the corresponding means indicated that the encapsulation
wassignificantly different (P = 0.0002).
3.3. Biological results
Fig. 6 summarizes the biodistribution of iron after the
admin
