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CENTRO UNIVERSITÁRIO HERMÍNIO DA SILVEIRA - IBMR
LAUREATE INTERNATIONAL UNIVERSITIES
CURSO DE BIOMEDICINA
GUSTAVO FAURE FARINA FONSECA
Nanopartículas Metálicas no Diagnóstico e Terapia de
Cânceres de Mama
Rio de Janeiro
2017
GUSTAVO FAURE FARINA FONSECA
NANOPARTÍCULAS METÁLICAS NO DIAGNÓSTICO E
TERAPIA DE CÂNCERES DE MAMA
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao IBMR - Laureate International Universities como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharelado em Biomedicina.
Instituto Brasileiro de Medicina de Reabilitação
ORIENTADOR: Prof. Dr. Sérgio Henrique Seabra
Rio de Janeiro
2017
GUSTAVO FAURE FARINA FONSECA
NANOPARTÍCULAS METÁLICAS NO DIAGNÓSTICO E
TERAPIA DE CÂNCERES DE MAMA
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao IBMR - Laureate International Universities como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharelado em Biomedicina.
Aprovado em _______________ de_________________ de 2017.
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________
Prof. Dr.
IBMR - Laureate International Universities
_____________________________________________
Prof. Dr.
IBMR - Laureate International Universities
AGRADECIMENTOS
À minha família que sempre esteve presente, me apoiou e me incentivou nos
momentos em que mais precisei.
A meu tio Wilson Faure e meus primos Vitor Faure e Aline Faure que sempre
apostaram em mim e acreditaram no meu potencial.
À minha querida irmã Aline Fonseca que me ajudou imensamente tanto na minha
formação acadêmica quanto pessoal.
A meus pais Rosa Maria Faure e Jorge Farina Fonseca que sempre zelaram por mim e
sempre me desejaram tudo de melhor.
A meus amigos que confiaram em mim e me ouviram falar sobre este trabalho tanto
em ambiente acadêmico quanto em eventos informais.
E um agradecimento especial para minha avó Selma Barbosa Faure que é uma das
pessoas que eu mais amo e admiro nesta vida.
“Todos nós fazemos o ‘dó, ré, mi’, mas você tem
que encontrar as outras notas por si mesmo.”
Louis Armstrong
RESUMO
O câncer de mama é uma doença que acomete principalmente mulheres e possui uma
gama de apresentações clínicas, divergindo entre si em sintomas, alterações histológicas,
alterações moleculares e subtipagem. Em relação à sua atual abordagem diagnóstica e
terapêutica, nota-se que não são totalmente adaptadas, eficazes e estáveis para cada paciente e
perfil clínico de câncer de mama em questão, podendo levar a erros de diagnóstico e
utilização de tratamentos altamente tóxicos e invasivos que além de causarem uma série de
efeitos colaterais, podem acabar não curando totalmente o câncer que acaba por levar à
reincidência, metástase e consequentes óbitos. Devido a esse notável problema de saúde
pública surgem alternativas a fim de contornar essa situação, a de maior relevância sendo o
uso da nanotecnologia, mais especificamente nanopartículas metálicas. Metais em escalas
nanométricas possuem diversas propriedades óticas e eletrônicas interessantes que
normalmente não existem quando estes mesmos metais estão em escalas maiores. Estas
propriedades aliadas a seus tamanhos característicos tornam-nas ferramentas de extrema
utilidade biológica e médica, possuindo aplicações tanto no diagnóstico quanto terapia de
cânceres de mama. Podem ser formadas a partir de ferro, cádmio ligado com semimetais e
ouro, cada tipo de metal possuindo propriedades distintas uns dos outros fazendo com que
possuam diferentes capacidades. Este trabalho teve como objetivo central discutir e fazer um
levantamento acerca das nanopartículas aplicadas ao diagnóstico e terapia em diversos
subtipos de cânceres de mama tratando-se de ser um levantamento bibliográfico descritivo
feito através de pesquisa em bases de dados. Foi levantado neste trabalho que nanopartículas
metálicas de diferentes tamanhos e composições podem formar imagens bem definidas de
massas tumorais mamárias, gerar com facilidade diagnósticos moleculares quantitativos e ser
utilizadas em terapias mais específicas, eficazes e menos tóxicas.
Palavras-chave: CÂNCER DE MAMA. DIAGNÓSTICO E TERAPIA.
NANOPARTÍCULAS METÁLICAS.
ABSTRACT
Breast cancer is a disease that mostly affects women and has a range of clinical
presentations, diverging from each other in symptoms, histological changes, molecular
changes and subtyping. Regarding its current diagnostic and therapeutic approach, it is
observed that they are not totally adapted, effective and stable for each patient and clinical
profile of breast cancer in question, and may result in diagnosis errors and use of highly toxic
and invasive treatments which, besides causing a series of side effects, may end up not totally
healing the cancer which finally leads to recurrence, metastasis and consequent deaths. Due to
this remarkable public health problem, alternatives arise in order to overcome this situation,
the one of greater relevance being the use of nanotechnology, more specifically metallic
nanoparticles. Metals in nanometric scales have several interesting optical and electronic
properties that normally do not exist when these same metals are on larger scales. These
properties allied to their characteristic sizes make them tools of extreme biological and
medical utility, holding applications both in the diagnosis and therapy of breast cancers. They
can be formed from iron, cadmium bonded with semimetals and gold, each type of metal
having properties different from each other causing them to possess different capacities. This
work aimed to discuss and make a survey about the nanoparticles applied to the diagnosis and
therapy in several subtypes of breast cancers, it trying to be a descriptive bibliographical
survey done through a database search. It has been demonstrated through this work that
metallic nanoparticles of different sizes and compositions can form well defined images of
mammary tumor masses, easily generate quantitative molecular diagnostics and be used in
more specific, effective and less toxic therapies.
Keywords: BREAST CANCER. DIAGNOSIS AND THERAPY. METALLIC
NANOPARTICLES.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Figura do interior de uma mama e uma comparação entre lóbulos saudáveis e o
carcinoma lobular in situ .............................................................................................................. 14
Figura 2 - Corte histológico do epitélio ductal saudável e células lobulares saudáveis .............. 15
Figura 3 - Corte histológico de carcinoma ductal invasivo e carcinoma lobular invasivo.......... 15
Figura 4 - Corte histológico de carcinoma ductal in situ e carcinoma lobular in situ ................. 16
Figura 5 - Imunohistoquímica representando os subtipos existentes de câncer de mama de
acordo com a expressão de moléculas específicas ....................................................................... 19
Figura 6 - Imagem obtida de uma hibridização fluorescente in situ exibindo amplificação
gênica de HER2, os pontos verdes são os genes HER2 e os pontos vermelhos são os
centrômeros do cromossomo 17. .................................................................................................. 22
Figura 7 – Plano axial de modelo murino infectado com linhagem humana de câncer de
mama triplo negativo .................................................................................................................... 28
Figura 8 – Plano axial de modelo murino infectado com fragmento de câncer de mama
murino subtipo luminal B ............................................................................................................. 29
Figura 9 - Imagem de autofluorescência de células vivas do subtipo luminal A e imagem
composta pela autofluorescência de células do subtipo luminal A e imagem de emissão de
fluorescência perto do infravermelho ........................................................................................... 30
Figura 10 - Imagem de autofluorescência de células vivas do subtipo HER2 positivo e
imagem composta pela autofluorescência de células do subtipo HER2 positivo e imagem de
emissão de fluorescência perto do infravermelho ........................................................................ 31 Figura 11 - Figura que relaciona o tamanho das nanopartículas quantum dots em relação a
seus comprimentos de onda emitidos ........................................................................................... 32
Figura 12 - Imagens de microscopia confocal a laser multiespectral da expressão das
moléculas ER, PR e HER2 marcadas pelas quantum dots dos subtipos luminal B, luminal A e
triplo negativo ............................................................................................................................... 32
Figura 13 - Gráfico representando a média de crescimento do câncer de mama de linhagem
murina em função do tempo ......................................................................................................... 33
Figura 14 – Imagens obtidas de microscopia de fluorescência de viabilidade celular e
permeabilidade de membrana ....................................................................................................... 34
Figura 15 – Gráfico de viabilidade celular de células do subtipo HER2 .................................... 35
LISTA DE SIGLAS
BRCA – Gene do câncer de mama
CdCl2 – Cloreto de cádmio.
CD44 – Grupamento de diferenciação 44.
CdTe – Telureto de cádmio.
DNA – Ácido desoxirribonucleico.
ER – Receptor de estrogênio.
FE3O4 – Óxido de ferro.
FISH – Hibridização fluorescente in situ.
HauCl4 – Ácido cloroáurico.
HER2 – Receptor de fator de crescimento humano 2.
NaBH4 – Borohidreto de sódio.
NaHTe – Telureto de sódio e hidrogênio.
PH – Concentração de prótons de hidrogênio.
PR – Receptor de progesterona.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................................... 10
2 OBJETIVOS ............................................................................................................................ 12
2.1 Objetivo geral ......................................................................................................................... 12
2.2 Objetivos específicos .............................................................................................................. 12
3 METODOLOGIA .................................................................................................................... 13
4 DESENVOLVIMENTO .......................................................................................................... 14
4.1 Anatomia da mama e sintomas do câncer de mama ............................................................... 14
4.2 Histologia do câncer de mama ............................................................................................... 15
4.3 Alterações moleculares do câncer de mama ........................................................................... 16
4.4 Subtipos de câncer de mama .................................................................................................. 18
4.5 Diagnóstico de cânceres de mama .......................................................................................... 19
4.6 Terapia de cânceres de mama ................................................................................................. 22
4.7 Nanopartículas: sintetização e aplicações............................................................................... 24
4.8 Nanopartículas de óxido de ferro na formação de imagens de cânceres de mama ................ 27
4.9 Nanopartículas quantum dots no diagnóstico molecular de cânceres de mama ..................... 29
4.10 Nanopartículas de ouro na terapia de cânceres de mama ..................................................... 33
5 CONCLUSÃO .......................................................................................................................... 36
6 REFERÊNCIAS ...................................................................................................................... 37
10
1. INTRODUÇÃO
Entende-se como câncer de mama um grupo muito diverso de doenças em questão de:
apresentação, morfologia, características biológicas e comportamento clínico. O câncer de
mama é originado de mutações somáticas comumente nas células epiteliais que revestem o
ducto terminal de lóbulos mamários ou nas próprias células lobulares secretoras de leite.
Células cancerosas que permanecem enclausuradas pelas suas membranas basais são
classificadas como não invasivas e células cancerosas que ultrapassam esta membrana basal e
se disseminam em tecidos adjacentes saudáveis, invasivas (SAINSBURY, 2000).
Tumores que aparentemente possuem características morfológicas homogêneas variam
em resposta à terapia e resultados, na qual pode refletir a grande variedade de características
biológicas e perfis genéticos do câncer de mama (EDWARDS, 2005). Esta heterogeneidade
aliada ao grande avanço no entendimento do câncer de mama fazem o diagnóstico vigente e
estratégia terapêutica ser uma tarefa desafiadora, uma vez que não são precisamente
adaptados para cada paciente (RAKHA, 2009).
Nanomedicina é uma área relativamente nova e interdisciplinar que envolve a
aplicação da nanotecnologia na medicina e vem ganhando destaque nos últimos anos (MIN,
2015). Uma das tecnologias que estão sendo difundida e pesquisadas são as nanopartículas
metálicas, que são partículas nanométricas normalmente compostas por metais como ouro ou
ferro, que integradas com moléculas bioquímicas se ligam a alvos específicos e geram sinais
óticos analiticamente úteis (CHEN, 2014).
Devido à alta especificidade do câncer de mama em relação a seu diagnóstico e
tratamento, emergem novas alternativas para suprir essa demanda, uma delas é o uso de
nanossondas. Para o diagnóstico, é possível usar estas nanopartículas metálicas bioconjugadas
com moléculas de anticorpos para detectar e quantificar biomarcadores importantes que estão
associados ao câncer de mama, a partir de apenas uma única seção de tumor. Pode-se usar
também nanossondas supermagnéticas como agentes de contraste na formação de imagens de
ressonância magnética para detectar o câncer de mama in vivo ou até mesmo monitorar o
câncer de mama quanto a sua resposta ao tratamento utilizado. Para o tratamento é possível
formular fármacos e quimioterápicos em doses nanométricas e ligá-los a nanossondas;
11
conferindo mesma eficácia, maior especificidade e menos efeitos tóxicos em comparação a
formulações convencionais destas mesmas drogas (YEZHELYEV, 2006).
O potencial uso de nanopartículas metálicas para fins clínicos é muito interessantes
devidos seus tamanhos e propriedades físicas que possuem excelentes interações e
compatibilidade com elementos celulares. Trata-se de uma tecnologia nova que vêm
ganhando destaque em diversos campos da pesquisa principalmente nas áreas biomédicas
onde estão sendo medidos esforços para esclarecer o funcionamento destas nanopartículas
metálicas em ambiente tanto in vitro quanto in vivo, podendo ser um método alternativo
substituto aos atuais métodos de diagnóstico e terapia, no futuro.
12
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
O objetivo deste trabalho é discutir acerca da ciência das nanopartículas aplicadas a
diagnóstico e terapia de cânceres de mama, a fim de esclarecer e determinar sua eficácia e
viabilidade tanto in vitro quanto em modelos in vivo não humanos.
2.2. Objetivos específicos
Caracterizar o câncer de mama quanto à anatomia, histologia, características celulares
e subtipos.
Determinar o grau de complexidade acerca de diagnóstico e terapia nos mais variados
tipos de câncer de mama existentes.
Esclarecer sobre a sintetização de nanopartículas, determinando suas capacidades,
aplicações e limitações.
Introduzir a utilização da nanotecnologia como uma opção alternativa ao diagnóstico e
terapia de cânceres de mama, determinando eficácia e viabilidade do uso de nanopartículas
para fins clínicos.
13
3. METODOLOGIA
Este trabalho trata-se de um levantamento bibliográfico, descritivo, feito através de
pesquisa nas bases de dados Pubmed (U.S. National Library of Medicine National Institutes
of Health) e Scielo (Scientific Eletronic Library Online). A pesquisa limitou-se a publicações
entre 1994 a 2017, no idioma inglês, utilizando-se de palavras chaves como: “breast cancer”,
“ductal carcinoma”, “lobular carcinoma”, “breast cancer diagnosis”, “breast cancer therapy”,
“nanoparticles”, “nanoprobes”, “nanoparticles and breast cancer”, “breast cancer”. Foram
utilizados também nesse estudo livros acadêmicos de anatomia humana e artigos publicados
pelo Ministério da Saúde do Brasil.
14
4. DESENVOLVIMENTO
4.1. Anatomia da mama e sintomas do câncer de mama
As mamas (Figura 1) se encontram sobre o músculo peitoral maior e serrátil anterior,
sendo suportadas por uma camada de tecido conjuntivo, cada uma possui uma projeção
denominada papila mamária, que dão abertura ao exterior, estas por sua vez possuem uma
rede de ductos (Figura 2. A) por onde passará o leite que será secretado para fora. Mais
internamente nesses ductos há mais ramificações e são encontrados de 15 a 20 lobos, os
ductos ramificam-se mais ainda para o interior de cada lobo estando dispostas em unidades
lobulares (Figura 2. B) cujos interiores são encontrados as glândulas mamárias especializadas
na produção de leite (TORTORA, 2012).
Os sintomas mais relevantes associados ao câncer de mama são o aparecimento de
nódulos na mama ou axila, dor na região mamária, alterações de pigmentação na pele na
região da mama ou até mesmo ulcerações na mesma e descargas papilares unilaterais
cristalinas ou sanguinolentas, todos estes sintomas podem estar relacionados à proliferação
desordenada das células epiteliais encontradas nos ductos ou das células produtoras de leite,
encontradas nos lóbulos. (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002).
Figura 1 – Figura do interior de uma mama e uma comparação entre lóbulos saudáveis e o carcinoma lobular in
situ.
Fonte: American Cancer Society.
15
4.2. Histologia do câncer de mama
O tipo mais comum de câncer de mama é o câncer de mama ductal denominado
adenocarcinoma ductal; aonde as células epiteliais que revestem os ductos proliferam
exacerbadamente podendo ou ser invasivas ou não invasivas, dependendo de sua capacidade
de degradar a membrana basal onde estão enclausuradas, ou seja, se estas células conseguem
degradar a membrana basal são classificados como carcinoma ductal invasivo (Figura 3. A) e
se não conseguem degradar a membrana basal, carcinoma ductal in situ (Figura 4. A). Há
também o carcinoma originado nas células dos lóbulos, denominado carcinoma lobular, que
possui menor ocorrência em relação aos carcinomas ductais e também são classificados como
invasivo (Figura 3. B) ou in situ (Figura 4. B) (CARANGIU, 2005).
(A) (B)
Figura 2 – Corte histológico do (A) epitélio ductal saudável e (B) células lobulares saudáveis.
Fonte: (A) MBBS Medicine; (B) Digital Atlas of breast pathology.
(A) (B)
Figura 3 – Corte histológico de (A) carcinoma ductal invasivo e (B) carcinoma lobular invasivo.
Fonte: Breast Cancer: Nuclear Medicine in Diagnosis and Therapeutic Options.
15 µm 50 µm
50 µm 50 µm
16
(A) (B)
Figura 4 – Corte histológico de (a) carcinoma ductal in situ e (B) carcinoma lobular in situ.
Fonte: (A) Breast Pathology Info; (B) MORROW, 2015.
4.3. Alterações moleculares do câncer de mama
As alterações celulares mais conhecidas e que são amplamente investigadas em um
diagnóstico de câncer de mama são alterações nos receptores de membrana: receptor de
progesterona (PR), receptor de estrogênio (ER) e receptor de fator de crescimento humano 2
(HER2); os dois últimos citados sendo reconhecidamente os alvos com melhor resposta ao
tratamento endócrino anticâncer (ESTEVA, 2004).
O receptor de estrogênio possui um importante papel no desenvolvimento e progressão
do câncer de mama. A superexpressão deste receptor está ligada a alguns fatores de risco que
são associados a mudanças na secreção de estrogênio como idade, menopausa e gravidez
(PARSA, 2016).
Uma vez que o estrogênio estimula a divisão celular ao ligar-se a seu receptor, as
chances de erro durante a divisão do material genético aumentam, aumentando a possibilidade
do aparecimento de mutações e consequentemente o desenvolvimento de células cancerosas
mamárias (FOIDART, 1998). Cânceres de mama que são positivos para ER, ou seja, que
possuem ER superexpresso na membrana celular compreende cerca de 80% de todos os
cânceres de mama diagnosticados (LI, 2015). Positividade para ER costuma apresentar bons
resultados à terapia endócrina com fármacos antagonistas de estrogênio, como por exemplo, o
tamoxifeno (MANNA, 2016).
Junto com ER, o receptor de fator de crescimento humano 2 também é um
biomarcador importante no desenvolvimento do câncer de mama e é um alvo terapêutico
50 µm 50 µm
17
extremamente valoroso (KRISHNAMURTI, 2014). Receptor de fator de crescimento humano
2 ou HER2, é considerado um oncogene, ou seja, se seu gene decodificador no material
genético for amplificado por erros na divisão celular, ocorrerá superexpressão do receptor,
conferindo malignidade à célula, que a partir desde evento, já pode ser considerada uma
célula cancerosa (GUTIERREZ, 2011). Quando este receptor é ativo, ele regula cascatas
relacionadas à proliferação, apoptose, invasão e metástase, angiogênese e diferenciação
celular; fazendo com que cânceres de mama HER2 positivos sejam extremamente agressivos,
apresentando desenvolvimento maligno rápido, metástase precoce e prognóstico
extremamente ruim. Cerca de 20% de todos os cânceres de mama são positivos para HER2,
sendo que cerca de 50% dos cânceres de mama que superexpressam HER2 também
superexpressam ER. HER2 positivos também apresentam bons resultado à terapia endócrina,
só que neste caso, utiliza-se o fármaco trastuzumab que é bloqueador específico do receptor
HER2 (RIMAWI, 2015).
Outras moléculas que são importantes e que apresentam grande valor prognóstico para
o desenvolvimento do câncer de mama são os genes BRCA1 e BRCA2. Estes genes
expressam proteínas de mesmo nome que são supressores de tumor e estão relacionados ao
reparo por recombinação homóloga, que é um processo de reparo da dupla fita de DNA
quando este é danificado. Mutações em uma ou nas duas cópias nos genes BRCA1 e BRCA2
resultam na não expressão ou na expressão deficitária de suas respectivas proteínas,
consequentemente os processos de reparo de DNA associados não funcionarão, aumentando a
suscetibilidade da célula de acumular mutações, se tornando uma célula cancerosa (LORD,
2016).
Genes BRCA1 e BRCA2 mutantes nas células da linhagem germinativa são
associados ao aparecimento de cânceres de mama hereditários. Cânceres de mama
hereditários representam entre 5- 7% dos casos de câncer de mama e portadores de genes
BRCA mutantes hereditários possuem um risco entre 50-80% de desenvolver câncer de mama
até o fim da vida (ROY, 2012). É possível realizar testes de sequenciamento de DNA para
identificar genes BRCA mutantes quando há casos de câncer de mama familiar, sendo
necessário acompanhar o portador da mutação com exames preventivos regulares para
detectar o câncer de mama caso ele apareça e tratá-lo o quanto antes para que ele não se
desenvolva (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009).
18
4.4. Subtipos de câncer de mama
Devido à heterogeneidade do câncer de mama, foi possível identifica-los separando-os
em subtipos (Figura 5) de acordo com expressão de moléculas e agressividade. O subtipo
mais comum é o luminal A, representando entre 50-60% de todos os cânceres de mama,
possui ótimo prognóstico. São caracterizados por altos níveis de expressão de ER e/ou PR e
negativos para HER2, respondem bem à terapia endócrina. A taxa de reincidência deste
subtipo é significativamente menor que a dos outros subtipos (YERSAL, 2014).
Temos o subtipo luminal B representando entre 15-20% de todos os cânceres de mama
(KUMMAR et al, 2009). Apresentam baixa expressão de ER e PR e alta expressão de genes
de proliferação e genes relacionados ao ciclo celular como os genes de receptores de fatores
do crescimento, sendo que aproximadamente 20% destes são de genes HER2 (ADES, 2014).
Representando entre 15-20% de todos os cânceres de mama, temos o subtipo HER2.
Prognóstico é ruim, são muito agressivos, pois possuem alta capacidade metastática e
proliferativa (GABOS, 2006). Este subtipo de câncer apresenta negatividade para ER e PR e,
como o nome sugere superexpressam HER-2 (CIANFROCCA, 2004).
Representando aproximadamente 15% de todos os cânceres de mama temos o triplo
negativo, que é um subtipo de câncer de mama que não superexpressa ER e PR nem HER2,
caracterizado por ser extremamente indiferenciado e possuir fenótipo mesenquimal, sendo
conhecido também como subtipo “basal-like” (COLLIGNON, 2016). É um câncer que possui
prognóstico ruim, altamente agressivo pois possui afinidade de metástase para o cérebro e
pulmão nos primeiros 5 anos a partir do diagnóstico e entrada com tratamento, fazendo com
que seja altamente letal além de possuir alta taxa de reincidência tanto local quanto em outros
tecidos. Basicamente seu tratamento é à base de agentes que danificam o DNA diretamente,
como compostos de platina ou radiação ionizante (NEWMAN, 2014).
19
Figura 5 – Imunohistoquímica representando os subtipos existentes de câncer de mama de acordo com a
expressão de moléculas específicas.
Fonte: Adaptado de http://fontemd.com/exames/imuno-histoquimica/.
4.5. Diagnóstico de cânceres de mama
Pelo câncer de mama ser uma doença altamente heterogênea, deve-se realizar um
estudo minucioso no paciente a partir da detecção de uma alteração nas mamas através da
mamografia digital. A mamografia digital é o primeiro passo na detecção de um câncer de
mama, utilizando-se de raios-x para visualizar calcificações, massas e outras estruturas
aberrantes que são possivelmente indicativas de cânceres de mama em estágio inicial e é
devido à possibilidade de visualização dessas anormalidades assintomáticas que este exame
preventivo e de rotina é altamente recomendado para mulheres acima de 50 anos, uma vez
que o quanto mais rápido for a detecção e o diagnóstico do câncer de mama mais fácil e mais
bem sucedido será o seu tratamento, diminuindo a taxa de mortalidade desta enfermidade
(NOBLE, 2008). Apesar de ser um teste relativamente fácil de ser realizado, que apresenta
baixa toxicidade e consegue detectar estruturas anormais densas, o mesmo não apresenta
grande especificidade; um exemplo disso é a ocultação das margens do tumor que faz com
que não seja possível visualizar sua real extensão e dimensão, levando à avaliação e
20
tratamento errados e por consequência, o desenvolvimento do câncer, tornando-se mais difícil
seu tratamento (MANDELSON, 2000).
Outro exame, que possui mais especificidade e sensibilidade que a mamografia digital,
é a ressonância magnética, que não é realizado como exame de rotina, mas como um
adjuvante na detecção de cânceres de mama (GOETHEM, 2006). A mamografia por
ressonância magnética é baseada no realce de lesões após injeção intravenosa de compostos à
base de gadolínio que são usados para o contraste da imagem, este realce sendo dependente de
vascularização, permeabilidade dos vasos e espaço intersticial do tumor a ser observado
(FROUGE, 1994). Como se sabe, tumores malignos tendem a realizar angiogênese, ou seja,
estimulam o desenvolvimento de novos vasos ao seu redor, estes vasos sendo de má qualidade
e com permeabilidade aumentada, fazendo com que haja maior afluência do agente
contrastante para a região abrangente da massa tumoral e consequentemente sendo possível
visualizá-la ao realizar o exame de ressonância magnética (MILLET, 2012). Devido a estes
fatores e a alta sensibilidade de aproximadamente 93% da mamografia por ressonância
magnética, este tipo de ressonância é especialmente sensível a cânceres de mama invasivos e
consequentemente ajuda no diagnóstico ou exclusão deste padrão de câncer em uma avaliação
(BERG, 2004).
Sua especificidade vai de baixa a moderada, sendo dependente de alguns fatores como
se o paciente é sintomático ou não, tumores benignos que podem estar presentes na área do
câncer fazendo com que também sejam realçados na formação da imagem, não sendo possível
distinguir a real área da massa tumoral maligna e o padrão do câncer de mama, se este é in
situ ou invasivo (MUMTAZ, 1997). Por exemplo, o padrão excepcional de crescimento do
carcinoma lobular invasivo, que se dá pelo crescimento difuso, arranjo celular em “fila
indiana”, padrão invasivo ao estroma caracterizado por ser por células individuais e o fato de
que cânceres invasivos tendem a usar vasos preexistentes fazem com que haja realce
diminuído nas regiões que de fato existem massas tumorais, assim dificultando a formação da
imagem e podendo levar a um falso negativo (GILLES, 1994).
O único método definitivo para diagnóstico de câncer de mama é a biópsia, existindo
dois métodos de remoção de amostras para diagnósticos atualmente, estes sendo a aspiração
com agulha fina que é um método que se utiliza de uma agulha fina e oca que é inserida na
mama com intuito de remover células da lesão suspeita de câncer. É o método menos
21
invasivo, mais rápido e mais fácil de ser realizado além de ser possível de avaliar a qualidade
da amostra realizando uma rápida distensão da mesma (CHAIWUN, 2007). A aspiração com
agulha grossa, como o nome sugere, usa-se uma agulha mais grossa e ao invés de células, esta
aspiração remove de 3 a 5 pequenos cilindros de tecido do tamanho de um grão de arroz
(NEAL, 2014).
Estas amostras então vão para análise em laboratório aonde serão visualizadas e
devidamente caracterizadas por patologistas que apontarão malignidade ou não e mais
informações relevantes sobre a massa em questão, além de serem feitos testes moleculares,
estes sendo o teste de receptor de hormônio que se utiliza da técnica de imunohistoquímica,
que tem como princípio ligação antígeno e anticorpo, realiza-se coloração específica e fixa-se
a amostra, que posteriormente em contato com complexos de enzimas conjugadas com
anticorpos monoclonais ou policlonais anti-ER ou anti-PR reagirão, acionando a enzima
conjugada se houver ligação antígeno/anticorpo específica, resultando em coloração castanha
caso a amostra seja positiva para receptores hormonais superexpressos, esta coloração poderá
ser visível diretamente nas células da lâmina histológica ao observá-las no microscópio ótico
podendo também ser observadas em microscópio de fluorescência, dependendo do tipo de
coloração realizada e tipo de anticorpos empregados (NOFECH-MOZES, 2012). O teste de
HER2 é idêntico ao teste de receptor de hormônio só que com anticorpos mono ou policlonais
anti HER2 que se ligam à proteína HER2. Não é o método mais indicado para avaliação de
negatividade e positividade para HER2, devido a vários laboratórios possuírem critérios de
avaliação diferentes além de ser um teste semiquantitativo e instável (KROESE, 2007).
O método mais eficaz para avaliar a positividade da amostra para HER2 é utilizando-
se o método FISH. Hibridização fluorescente in situ (Figura 6), ou FISH, baseia-se na
identificação de sequências de DNA através de ligação complementar de partículas de DNA
previamente identificadas que são marcadas com moléculas fluorescentes, sendo possível
visualizar em microscópio de fluorescência se há amplificação do gene HER2 na amostra e
consequentemente revelando se a amostra é negativa ou positiva. Este método é bastante
específico fazendo com que seja altamente valorizado para fins diagnósticos, porém este
método possui um grande contra, este sendo o fato de ser muito trabalhoso, portanto, a chance
de erro por falha humana durante a preparação é alta, resultando em um experimento perdido
ou um falso negativo (GOUD, 2012).
22
Figura 6 – Imagem obtida de uma hibridização fluorescente in situ exibindo amplificação gênica de HER2, os
pontos verdes são os genes HER2 e os pontos vermelhos são os centrômeros do cromossomo 17.
Fonte: Adaptado de https://pt.slideshare.net/FonteMD/aula-mastologia-mama-patologia-molecular
4.6. Terapia de cânceres de mama
O avanço na caracterização bem definida de subtipos de câncer mama junto com a
identificação de alterações genéticas e cascatas de sinalização envolvidas levou ao
desenvolvimento clínico de alguns agentes moleculares alvos direcionados bem sucedidos,
isto é, agentes moleculares que bloqueiam direcionadamente alvos moleculares específicos
responsáveis pelo crescimento e sobrevivência de células cancerosas (HIGGINS, 2011).
Tumores em estágio inicial de desenvolvimento podem ser removidos cirurgicamente,
tanto tumores in situ quanto invasivos e palpáveis e não palpáveis, sendo que para não
palpáveis é necessário realizar a remoção com auxílio de mamografia por ressonância
magnética e uma agulha guiada em formato de “v” para localizar o tumor e posteriormente
realizar a remoção. Este método é considerado o mais eficaz para localizar e remover cânceres
de mama não palpáveis, porém existe casos maus sucedidos de remoção devido à agulha
migrar de posição e o cirurgião perder a localização do tumor, podendo gerar uma remoção
errônea de tecido saudável, favorecendo o desenvolvimento do tumor além de ser um
procedimento altamente invasivo. Pacientes que passam por qualquer processo de remoção
então passam pelo tratamento com o uso dos fármacos antitumorais e dependendo dos casos
15 µm
23
passam por sessões de radioterapia, tudo para conter a reincidência do tumor (AHMED,
2015).
Pacientes com positividade para receptores hormonais geralmente recebem
tratamentos endócrinos com fármacos seletivos bloqueadores de receptores de estrogênio,
como o tamoxifeno e fármacos inibidores da aromatase, estas duas classes de fármacos sendo
as opções mais utilizadas no tratamento deste tipo de câncer e no caso de luminal B, os
pacientes recebem também quimioterápicos citotóxicos como compostos de platina e
radioterapia. Pacientes com tumores que superexpressam HER2 geralmente recebem terapia
anti HER2 alvo específico como o fármaco trastuzumab, combinada com agentes
quimioterápicos e radioterapia (TINOCO, 2013). Pacientes com câncer triplo negativo não
possuem alvos específicos para tratamento então as estratégias terapêuticas se baseiam apenas
no uso de agentes quimioterápicos citotóxicos e radiações ionizantes localizadas (ISMAIL-
KHAN, 2010).
O mecanismo de ação do tamoxifeno acontece pelo bloqueio seletivo dos receptores
superexpressos de estrogênio da célula de câncer de mama, uma vez que os receptores são
bloqueados, o estrogênio não se ligará a ER, impossibilitando que o complexo estrogênio/ER
migre para o núcleo celular e se ligue a coativadores transcricionais responsáveis pela
proliferação e crescimento do tumor (LONNING, 1995). O tratamento com tamoxifeno tem
duração de 2 a 3 anos e seus efeitos colaterais são de baixa e moderada gravidade, os mais
comuns sendo sintomas parecidos a da menopausa como ondas de calor repentinas,
menstruação irregular, sangramento e prurido vaginal (CLEMONS, 2002). Os sintomas mais
raros e mais graves estão associados a mulheres com 50 anos ou mais aonde já foi reportado:
embolia pulmonar, cataratas, desenvolvimento de câncer uterino e doença isquêmica do
coração (FISHER, 2005).
O mecanismo de ação dos inibidores da aromatase acontece pelo bloqueio específico
da enzima aromatase, que é responsável pela conversão da androstenediona em estrona e
testosterona em estradiol sendo que, estrona e estradiol são hormônios estrógenos. A não
formação destes hormônios estrógenos implica na não ligação de estrogênios com o ER das
células do câncer de mama, impossibilitando proliferação e crescimento destas células
cancerosas e consequentemente inviabilizando-as (BERRY, 2005). O tratamento com
inibidores da aromatase tem duração de 2 a 3 anos, é usado como fármaco que continua a
terapia do câncer de mama positivo para receptores hormonais após o uso de tamoxifeno,
24
somando 5 anos de tratamento no total (LONNING, 2013). Seus efeitos colaterais são de
baixa, moderada e alta gravidade, os mais comuns sendo parecido com os sintomas da
menopausa e sintomas inespecíficos como náuseas, dor de cabeça, diarreia e perda de cabelo.
Sintomas mais raros e mais graves são: dores nas juntas, rigidez musculoesquelética, perda de
densidade óssea que pode resultar em osteoporose e atrofia geniturinária (FILES, 2010).
Já para o tratamento de cânceres de mama HER2 positivo utiliza-se fármacos
bloqueadores da ativação do HER2, um destes é o trastuzumab que têm como mecanismo de
ação a ligação ao sítio extracelular do HER2, impedindo sua clivagem proteolítica que gera a
formação do fragmento de HER2 ativo, que quando fosforilado têm como função ativar
cascatas de sinalização relacionadas proliferação, apoptose, invasão e metástase, angiogênese
e diferenciação celular. Pacientes com câncer de mama HER2 positivo em estágio inicial
recebem tratamento com trastuzumab por 1 ano, prolongamento do tratamento com este
fármaco não é recomendado pois não aumenta sua eficácia além de aumentar os riscos de
efeitos adversos que basicamente se resumem à cardiotoxicidade (MAXIMIANO, 2016). Para
pacientes com câncer de mama HER2 positivo em estágio avançado sugere-se que o
tratamento deve ser feito num período de 3 a 4 anos, dependendo da idade dos pacientes e
terapia adotada, trastuzumab por 1 ano e agentes quimioterápicos como o taxol, que é um
quimioterápico que impede a formação de microtúbulos das células tumorais as impedindo de
se dividir, sendo a combinação mais reconhecida para o tratamento deste padrão de câncer de
mama (MRSIC, 2001).
4.7. Nanopartículas: Sintetização e Aplicações
Nanotecnologia é o ramo da ciência dedicada ao estudo de materiais que possuem
dimensões nanométricas, a peculiaridade acerca do tamanho e propriedades destes materiais
os tornou artifícios indispensáveis para muitas atividades humanas, duas destas sendo a
biologia e a medicina (SALATA, 2004). Células humanas geralmente possuem 10
micrometros, no entanto, os componentes internos que constituem estas células são bem
menores e estão abaixo da escala micrométrica, fazendo parte da escala nanométrica. Por
questões de comparação, proteínas geralmente possuem 5 nanômetros, que é o tamanho de
uma das menores nanopartículas já criadas pelo homem (TATON, 2002).
25
Em geral, nanopartículas empregadas no ramo da biotecnologia possuem espectro de
tamanho de 10 a 500 nanômetros. O tamanho destas partículas permite comunicação direta
com biomoléculas da superfície ou do interior das células, podendo revelar aspectos físicos e
bioquímicos destas, fazendo com que possuam potenciais aplicações na entrega de fármacos
que interagem com moléculas específicas e formação não invasiva de imagem, tornando o uso
destas partículas uma alternativa interessante que pode ser superior ao uso de agentes
farmacêuticos e métodos de formação de imagem convencionais, dependendo de
enfermidades em questão (MODY, 2009).
Os três tipos de nanopartículas metálicas mais utilizadas na biotecnologia são as
nanopartículas de ouro, nanopartículas magnéticas e nanopartículas semicondutoras que
também são conhecidas como nanopartículas quantum dots (GASPARYAN, 2013).
Nanopartículas de ouro são sintetizadas a partir do ácido cloroáurico, um composto de
fórmula HAuCl4, que é formado pela dissolução do ouro por ácido nítrico e ácido clorídrico
(KING, 2015). O ácido cloroáurico então é exposto a ácido cítrico e água à temperatura de
ebulição, aonde o ácido cítrico atua servindo como agente redutor e estabilizador do ácido
cloroáurico, criando assim uma solução diluída com nanopartículas esféricas de ouro
moderadamente estáveis com diâmetros entre 10 a 20 nanômetros, sendo possível criar
nanopartículas menores que 10 nanômetros e maiores que 20 nanômetros, por exemplo,
dependendo do protocolo de execução do processo (YEH, 2012). Estas nanopartículas então
passam por um processo de funcionalização aonde são tratadas com o composto surfactante
não iônico tween 20, que atua revestindo estas partículas impedindo assim a agregação
irreversível destas após sua formação, e posteriormente compostos alcanotióis, que possuem
caráter orgânico aonde os átomos de enxofre criam ligação covalente com o ouro e atuam
criando uma monocamada na superfície das nanopartículas conferindo-as maior estabilidade,
capacidade de manipulação de uma gama de agentes químicos e realização de procedimentos
físicos como secagem e ressuspensão em solução sem que as nanopartículas se desfaçam ou
degradem (ASLAN, 2002).
Estas nanopartículas esféricas de ouro possuem características muito interessantes para
uso biomédico devido seu tamanho, propriedades óticas e eletrônicas, relação superfície de
contato para volume, notável biocompatibilidade e baixa toxicidade (MURPHY, 2008). A
habilidade mais característica das nanopartículas esféricas de ouro é relacionada ao sistema de
26
entrega de fármacos, aonde estas nanopartículas são previamente sensibilizadas com fármacos
antitumorais específicos e quando são introduzidas in vivo conseguem escapar à fagocitose
pelas células mononucleares, extravasam a vasculatura frágil criada pelos tumores e
depositam-se no microambiente tumoral, restringindo a ação do fármaco apenas ao tumor e
com isso reduzem a circulação deste fármaco no organismo, aumentando a eficácia e
seletividade da terapia e diminuindo sua toxicidade (PACIOTTI, 2004).
Nanopartículas magnéticas possuem larga escala de produção e baixo custo, ao
contrário das nanopartículas de ouro. Sua sintetização acontece por métodos químicos simples
e eficientes aonde composição, tamanho e formato podem ser conduzidos. São formadas a
partir da adição de uma base a uma mistura aquosa de cloreto de ferro +2 e +3 em alta
temperatura, obedecendo a uma escala molar de 1 para 2, que resulta coloração negra a
solução e precipitação dos íons de ferro, formando nanopartículas esféricas de óxido de ferro,
cuja fórmula é Fe3O4 de 15 a 100 nanômetros, tamanho sendo dependente de controle de PH,
concentração de cátions da precipitação e temperatura da reação. Para prevenir a oxidação e
agregação irreversível das partículas elas são revestidas com moléculas inorgânicas como
sílica e orgânicas como alcanotióis (ALI, 2016). A aplicação destas nanopartículas Fe3O4 é
limitada devida sua sensibilidade à oxidação (BAO, 2010).
A aplicação mais significante destas nanopartículas Fe3O4 é na formação não invasiva
de imagem por ressonância magnética aonde estas atuam como agente de contraste de baixa
toxicidade na detecção de tecidos e formações anormais quando administrados localmente
(CHERTOK, 2008). Existem desafios acerca da formação da imagem por nanopartículas
Fe3O4 devido sua instabilidade em condições fisiológicas e sua distribuição não seletiva in
vivo, quando estas não estão revestidas com biomarcadores, fazendo com que estas
nanopartículas não atinjam concentração suficiente no ambiente tumoral para produzir sinal
necessário para a formação da imagem do tumor durante a ressonância magnética (PENG,
2008).
Nanopartículas semicondutoras, ou quantum dots, são nanopartículas geralmente
formadas de telureto de cádmio. O início de sua sintetização acontece adicionando o pó de
telúrio com borohidreto de sódio, cuja fórmula é NaBH4, e água deionizada à 80 graus, todos
esses compostos então reagem por 30 minutos e formam o telureto de sódio e hidrogênio cuja
fórmula é NaHTe, durante esse processo a reação é protegida por uma cuba que expele
27
nitrogênio, garantindo que a reação não sofra alteração pelo oxigênio atmosférico, uma vez
que este pode pode alterar a quantidade de cádmio livre na solução na próxima etapa da
sintetização, aumentando a toxicidade da solução e inviabilizando a ligação do telúrio com o
cádmio (MA, 2014). A segunda etapa acontece em um aparelho condensador onde a solução
de NaHTe é misturada a uma solução saturada de nitrogênio contendo cloreto de cádmio, cuja
fórmula é CdCl2, e ácido mercaptopropiônico, que é um tiol estabilizador. Então estes
compostos reagem, telúrio liga-se ao cádmio formando nanopartículas de telureto de cádmio,
cuja fórmula é CdTe, e o ácido mercaptopropiônico atua estabilizando a formação esférica das
nanopartículas revestindo-as, garantindo uma capa orgânica ao redor destas nanopartículas
fazendo que elas já sejam funcionais. O tamanho destas nanopartículas é dependente do
controle de PH e tempo de refluxo. A remoção destas nanopartículas do aparelho condensador
acontece por precipitação simples utilizando etanol, que também ajuda na remoção do excesso
de ácido mercaptopropiônico e íons de cádmio livres (WENG, 2006).
Após sua formação, quantum dots emitem fluorescência através de um efeito
conhecido como confinamento quântico, que é quando as partículas tornam-se menores que o
comprimento de onda de seus elétrons fazendo com que estes sejam excitados, isso aumenta a
energia dos elétrons forçando-os a dissipar energia em forma de luzes fluorescentes de
diversos comprimentos de onda, dependendo do tamanho das nanopartículas. Além dessa
característica, as nanopartículas quantum dots CdTe possuem resistência a degradação
química e metabólica, fotoestabilidade, largo espectro de emissão de fluorescência e alto
coeficiente de absorção em relação à fluoróforos orgânicos convencionais (SCHULZE, 2017).
Todas estas características tornam as nanopartículas quantum dots uma classe promissora de
fluoróforos para captação de moléculas e consequente diagnóstico (YEH, 2005).
4.8. Nanopartículas de óxido de ferro na formação de imagens de cânceres de
mama
Devido à simplicidade de produção, baixo custo, baixa toxicidade e excelente
formação não invasiva de imagens por ressonância magnética, as nanopartículas Fe3O4 são
altamente estudadas no campo do diagnóstico (AHMED, 2013). Estas nanopartículas também
possuem boa biocompatibilidade, fazendo com que estratégias diagnósticas sejam adotadas
como a bioconjugação de substâncias que se ligam com alvos moleculares de células de
28
câncer de mama na superfície dessas nanopartículas, sendo possível formar uma imagem com
excelente visualização e contraste (WORTMANN, 2014). Sabe-se que cânceres
superexpressam glicoproteína CD44, que é um receptor para ácido hialurônico, então ácido
hialurônico é bioconjugado às moléculas orgânicas tióis da superfície das nanopartículas
Fe3O4, em paralelo, um modelo murino recebe injeção subcutânea de 1x10^7 células de
linhagem humana de câncer de mama triplo negativo. Então, quando este tumor completa 1
centímetro de diâmetro, 40 micromolar por quilo de nanopartículas Fe3O4 bioconjugadas
com ácido hialurônico são injetadas pela veia da cauda do murino e a ressonância magnética
(Figura 7) é realizada antes da injeção de nanopartículas Fe3O4, 30 minutos, 90 minutos e 24
horas após a injeção. Nanopartículas Fe3O4 são excelentes agentes de contraste em aquisições
T2, ou seja, escurecem o tecido alvo quando este parâmetro é adotado na formação da
imagem na ressonância magnética (YANG, 2016).
Figura 7 – Plano axial de modelo murino infectado com linhagem humana de câncer de mama triplo negativo
aonde foi realizado ressonância magnética em T2 antes da injeção de nanopartículas Fe3O4 bioconjugadas com
ácido hialourônico, 30 minutos, 90 minutos e 24 horas depois da injeção.
Fonte: Adaptado de YANG, 2016.
Em outro trabalho, as nanopartículas Fe3O4 foram revestidas com moléculas
orgânicas de dextran, um polímero biocompatível de alta retenção em organismos, que foi
bioconjugado com anticorpo monoclonal humanizado anti HER2, mais conhecido como
trastuzumab. O modelo murino recebeu implantação subcutânea de um fragmento de câncer
de mama murino do subtipo luminal B, que é positivo para superexpressão de HER2. As
nanopartículas bioconjugadas com anti HER2 a 30 micromolar por quilo então foram
29
injetadas na veia da cauda do murino infectado quando o tamanho do tumor chegou entre 0,9
a 1 centímetro de diâmetro. Foi realizada a ressonância magnética em aquisição T2 antes da
injeção das nanopartículas Fe3O4 bioconjugadas com anti HER2 e 4 horas, 24 horas e 72
horas depois da injeção das nanopartículas (RASANEH, 2010).
Figura 8 – Plano axial de modelo murino infectado com fragmento de câncer de mama murino subtipo luminal b
aonde foi realizado ressonância magnética em T2 antes da injeção de nanopartículas Fe3O4 bioconjugadas com
trastuzumab, 4 horas, 24 horas e 72 horas depois da injeção.
Fonte: Adaptado de RASANEH, 2010.
4.9. Nanopartículas quantum dots no diagnóstico molecular de cânceres de
mama
Devido à capacidade de emitir diversas fluorescências relacionadas à condução de
seus tamanhos, estratégias para que essas nanopartículas quantum dots emitam fluorescência
perto do infravermelho emergem. Emissão de fluorescência perto do infravermelho (entre 700
a 1300 nanômetros) são ideiais para formação de imagem in vitro e de tecidos profundos
devido à autofluorescência biológica ser transparente a esses comprimentos de onda (PIC,
2009). Então, nanopartículas quantum dots podem ser bioconjugadas a moléculas de interesse
que se ligam a receptores específicos das células de cânceres de mama, criando assim imagens
que podem ser visualizadas por emissão de infravermelho (YONG, 2009). Logo, as
nanopartículas CdTe quantum dots que emitem fluorescência perto do infravermelho podem
ser uma valorosa e potente alternativa no diagnóstico molecular tanto in vivo quanto in vitro
de cânceres de mama, in vitro sendo uma alternativa mais sensível, estável e barata que a
imunohistoquímica e menos trabalhosa e tão sensível quanto o FISH. Por exemplo, ao
bioconjugar trastuzumab ao revestimento de tióis das nanopartículas quantum dots e depois
incubar essas nanopartículas com células de linhagem humana do subtipo luminal A, que não
30
superexpressa HER2, e células de linhagem humana do subtipo HER2 positivo, é possível
visualizar por microscopia confocal de varredura a laser os receptores HER2 marcados pelas
nanopartículas, que emitem fluorescência perto do infravermelho, sendo visualizadas por
pequenos pontos vermelhos. Para o controle negativo sem presença das nanopartículas, as
células são visualizadas por autofluorescência azul e a imagem com o HER2 marcado, com
presença das nanopartículas, é uma composição digital formada da imagem de
autofluorescência com a imagem da emissão de fluorescência perto do infravermelho.
Observa-se que quando as células do subtipo luminal A são marcadas com quantum dots
bioconjugadas com trastuzumab (Figura 9), apenas alguns pontos na imagem aparecem em
vermelho, mostrando que houve baixa absorção das quantum dots por receptores HER2, ou
seja, não há superexpressão de HER2. Já quando as células do subtipo HER2 positivo são
marcadas com as mesmas quantum dots (Figura 10), o cenário é diferente e observa-se muitos
pontos vermelhos na imagem formada, mostrando que houve alta absorção das quantum dots
por receptores HER2, comprovando superexpressão de receptores HER2 (RIZVI, 2014).
Figura 9 – Imagem de autofluorescência de células vivas do subtipo luminal A (A) e imagem composta pela
autofluorescência de células do subtipo luminal A e imagem de emissão de fluorescência perto do
infravermelho(B).
Fonte: Adaptado de RIZVI, 2014.
80 µm 80 µm
31
Figura 10 - Imagem de autofluorescência de células vivas do subtipo HER2 positivo (A) e imagem composta
pela autofluorescência de células do subtipo HER2 positivo e imagem de emissão de fluorescência perto do
infravermelho (B).
Fonte: Adaptado de RIZVI, 2014.
O diagnóstico molecular dos cânceres de mama é baseado em imunohistoquímica, que
é incapaz de realizar testes simultâneos para mais de uma molécula, possui apenas uma cor
(castanho) independente da molécula que for marcada na amostra e além do mais é um teste
semiquantitativo e subjetivo (THOMSON, 2001). Como o comprimento de onda da
fluorescência das nanopartículas quantum dots pode ser manipulado via controle do tamanho
das nanopartículas, aonde nanopartículas menores emitem comprimento de onda de
fluorescência de maior frequência que nanopartículas maiores (Figura 11), abrangendo todo o
espectro da luz visível, é possível bioconjugar anticorpos diferentes à nanopartículas quantum
dots de diferentes tamanhos, sendo possível realizar testes simultâneos de marcação de
biomoléculas de interesse em uma única amostra de células de câncer de mama. Ao
bioconjugar-se anticorpos anti-HER2 com quantum dots de emissão de 525 nanômetros, anti-
ER com quantum dots de emissão de 565 nanômetros e anti-PR com quantum dots de emissão
de 605 nanômetros e incubar todas essas nanopartículas junto com linhagens de células de
câncer humano do subtipo luminal A, luminal B e triplo negativo individualmente, é possível
visualizar a absorção das quantum dots pelas moléculas alvo ao visualizar-se as amostras
individualmente por microscopia confocal de varredura a laser multiespectral, sendo possível
confirmar diagnóstico de subtipo baseado na intensidade de comprimentos de onda
específicos captados por espectroscópio (YEZHELYEV, 2007).
80 µm 80 µm
32
Figura 11 – Figura que relaciona o tamanho das nanopartículas quantum dots em relação a seus comprimentos
de onda emitidos, quanto menor a partícula maior será a frequência de onda emitida.
Fonte: Adaptado de https://www.intechopen.com/books/biomedical-engineering-technical-applications-in-
medicine/quantum-dots-in-biomedical-research.
Figura 12 – (A) Imagens de microscopia confocal a laser multiespectral da expressão das moléculas ER, PR e
HER2 marcadas pelas quantum dots dos subtipos luminal B, luminal A e triplo negativo. As cores destas
imagens não são as cores reais que foram captadas pelo microscópio, portanto estão colorizadas artificialmente
devido ao efeito de confluência dos três comprimentos de ondas emitidos pelos três tipos de quantum dots
utilizados que faz com que não seja possível distinguir as cores a olho desarmado, apenas por espectroscópio.
(B) Gráfico obtido através da medição por espectroscópio da intensidade de comprimentos de onda específicos
emitidos pelas quantum dots quando ligadas as moléculas específicas de interesse, aonde expressão de HER2 é
determinada pelo comprimento de onda 525 nanômetros, expressão de ER 565 nanômetros e expressão de PR
605 nanômetros.
Fonte: Adaptado de YEZHELYEV, 2007.
15 µm
33
4.10. Nanopartículas de ouro na terapia de cânceres de mama
Nanopartículas de ouro usadas para pesquisas terapêuticas tendem a ter diâmetro em
média de 5 nanômetros devido a sua melhor bioabsorção e maior inêrcia química (HILLYER,
2001). Não são citotóxicas, mesmo em tamanhos muito diferentes e revestidas com diferentes
tióis (CONNOR, 2005). Existem três relevantes tipos de terapia envolvendo as nanopartículas
de ouro estes sendo realce de radiação, hipertermia induzida e marcação de tumor (LEE,
2014). A energia de radiação da maioria das radioterapias de raios-X é em megavolts, porém,
existem radioterapias aonde a exposição à energia é menor, denominadas radioterapias em
quilovolts, que não são utilizadas convencionalmente e sabe-se que o ouro reage à emissão de
energia em quilovolts, ocorrendo sua radiosensibilização devido à absorção de fótons,
causando um efeito fotoelétrico onde o ouro passa a emitir elétrons incessantemente enquanto
for irradiado por raios X, acontecendo este mesmo efeito com o ouro em escala nanométrica
(JAIN, 2011). Estas liberações de elétrons estimuladas pelos raios x em quilovolts podem
realçar o efeito da radioterapia localizada quando as nanopartículas estiverem na localização
do tumor, aumentando a eficácia da radioterapia e diminuindo sua toxicidade. Foi realizado
em modelos murinos este experimento, aonde os murinos foram infectados com câncer de
mama de linhagem murina e posteriormente foram tratados apenas com nanopartículas de
ouro injetadas, apenas com irradiação quilovoltáica localizada e com nanopartículas de ouro
injetadas mais irradiação quilovoltáica localizada. Nota-se que as nanopartículas de ouro
injetadas mais irradiação quilovoltáica localizada conseguem reduzir drasticamente o volume
da massa tumoral, comprovando o efeito fotoelétrico e sua possível aplicação terapêutica
(HAINFELD, 2004).
Figura 13 – Gráfico representando a média de crescimento do câncer de mama de linhagem murina em função
do tempo aonde os modelos murinos foram tratados apenas com nanopartículas de ouro, não receberam
tratamento, apenas irradiação quilovoltáica e nanopartículas de ouro mais irradiação quilovoltáica
respectivamente no gráfico. Fonte: Adaptado de HAINFELD, 2004.
34
Nanopartículas de ouro possuem interessantes propriedades de absorção de ondas
eletromagnéticas, dependendo de tamanho e formato (JAIN, 2006). É possível elaborar
nanopartículas de 110 nanômetros de diâmetro, aonde seu interior é formado por 100
nanômetros de diâmetro de sílica e seu exterior formado por 10 nanômetros de diâmetro de
ouro, que possuem absorção máxima em 800 nanômetros, ou seja, perto do infravermelho
(OLDENBURG, 1999). Comprimentos de onda perto do infravermelho são excelentes para
penetrar tecidos e assim emerge o princípio não invasivo da destruição de tumores por
hipertermia induzida aonde as nanopartículas de ouro com interiores de sílica são irradiadas
por laser com comprimento de onda em 800 nanometros, fazendo com que elas sejam
estimuladas e produzam calor localizado na região das células que estas estão ligadas,
destruindo-as (HAINFELD, 2014). Ao aplicar apenas laser localizado a 800 nanometros em
células de linhagem humana do subtipo HER2 e aplicar este mesmo laser localizado às
mesmas células, porém estas foram previamente incubadas com nanopartículas de ouro com
interior de sílica, posteriormente realizar marcações com fluoróforos de viabilidade celular
(Figura 14 A. e B.) e permeabilidade de membrana (Figura 14 C. e D.), é possível visualizar a
área localizada em que houve a destruição celular por aumento de temperatura (HIRSCH,
2003).
Figura 14 – Imagens obtidas de microscopia de fluorescência de (A-B) viabilidade celular da área localizada
atingida pela emissão de laser de comprimento onda de 820 nanômetros (C-D) permeabilidade de membrana da
área localizada atingida pela emissão de laser de onda de comprimento de onda 820 nanômetros.
Fonte: Adaptado de HIRSCH, 2003.
15 µm
35
Devido à capacidade de ultrapassar a vasculatura permeável criada por tumores e ficar
retido no ambiente tumoral, nanopartículas de ouro são potentes carreadores de fármacos
(KHLESTKIN, 2008). Ao bioconjugar-se nanopartículas de ouro com trastuzumab
incubando-as com células de linhagem humana do subtipo HER2 e realizar testes de
viabilidade celular comparados entre incubação apenas com nanopartículas de ouro, apenas
com solução de agente poliestireno, que é o agente que bioconjuga o tiól da superfície da
nanopartícula ao trastuzumab e nanopartículas de ouro bioconjugadas com trastuzumab, nota-
se baixa proliferação celular de células incubadas com nanopartículas de ouro bioconjugadas
com trastuzumab devido o bloqueio do receptor HER2, fazendo com que as células morram e
se tornem inviáveis (RATHINARAJ, 2015).
Figura 15 – Gráfico de viabilidade celular de (azul) células do subtipo HER2 incubadas com solução de
poliestireno; (vermelho) células do subtipo HER2 incubadas apenas com nanopartículas de ouro; (verde) células
do subtipo HER2 incubadas com nanopartículas bioconjugadas com trastuzumab.
Fonte: Adaptado de RATHINARAJ, 2015.
p<0,05
36
5. CONCLUSÃO
# O câncer de mama é uma doença altamente heterogênea possuindo diferentes
padrões histológicos e moleculares que faz com que ele possua diversas apresentações
clínicas.
# Tanto o diagnóstico quanto a terapia estão ultrapassados e não são totalmente
específicos, fazendo com que o diagnóstico não seja estável e a terapia muita vezes recorra a
métodos mais invasivos e com acentuada toxicidade.
# Com a clara falta de personalização do diagnóstico e terapia, emergem novas
alternativas para suprir essa carência, uma delas é o uso de nanopartículas, que possuem um
leque tão grande de aplicações e propriedades quanto à heterogeneidade dos cânceres de
mama.
# A aplicação das nanopartículas para fins clínicos de larga escala cada vez mais se
torna algo concreto, com diversos estudos que demonstram sua eficácia, aplicabilidade e
viabilidade tanto in vitro quanto em modelos in vivo.
# Ainda há de ser esclarecido acerca da metabolização e excreção dessas
nanopartículas em modelos vivos, pois esses dois pontos estão associados à toxicidade em
longo prazo, sendo um direcionamento interessante para estudos futuros acerca de
nanopartículas metálicas, contudo, o diagnóstico e terapia utilizando estes artifícios se
mostram de extrema eficácia e relevância para o avanço da medicina moderna.
37
6. REFERÊNCIAS
1. ADES, Felipe et al. Luminal B breast cancer: molecular characterization,
clinical management, and future perspectives. Journal of Clinical Oncology, v. 32, n. 25, p.
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localization and treatment of breast cancer. BioMed research international, v. 2013, 2013.
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and in situ breast cancer. Nature Reviews Clinical Oncology, v. 12, n. 11, p. 645-663, 2015.
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iron oxide nanoparticles. Nanotechnology, science and applications, v. 9, p. 49, 2016.
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gold by chemisorption of alkanethiols in the presence of a nonionic surfactant. Langmuir, v.
18, n. 16, p. 6059-6065, 2002.
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