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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA PARA APLICAÇÃO
EM SANIDADE DE TAMBAQUIS AMAZÔNICOS
(Colossoma macropomum)
ANA CAROLINA DA SILVA COSTA
BELÉM - PARÁ 2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA PARA APLICAÇÃO
EM SANIDADE DE TAMBAQUIS AMAZÔNICOS
(Colossoma macropomum)
Autor: Ana Carolina da Silva Costa
Orientador (a): Profa Dra Roseane Maria Ribeiro Costa
Co-Orientador: Profº Dr. Humberto de Mello Brandão
Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação
em Ciências Farmacêuticas, área de concentração em
Fármacos e Medicamentos, do Instituto de Ciências da
Saúde da Universidade Federal do Pará em cumprimento
às exigências para obtenção do título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
BELÉM - PARÁ 2013
FOLHA DE APROVAÇÃO
ANA CAROLINA DA SILVA COSTA
“NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA PARA APLICAÇÃO EM SANIDADE DE
TAMBAQUIS AMAZÔNICOS (Colossoma macropomum)”
Área de Concentração: Fármacos e Medicamentos.
Aprovado em: ____/____/_____
BANCA EXAMINADORA
Profa Dra Roseane Maria Ribeiro Costa (Orientador)
Instituição: Universidade Federal do Pará (UFPA)
Assinatura:_____________________________________
Profª Drª Alexandra Regina Bentes de Sousa
Instituição: Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – Embrapa Amazônia
Oriental.
Assinatura:_____________________________________
Profª Drª Jaqueline Rodrigues da Silva
Instituição: Universidade Federal do Pará (UFPA)
Assinatura:____________________________________
Dedico este trabalho, em especial aos
meus pais José Nazareno Costa e
Juscelina Costa e a todos aqueles
que de alguma maneira colaboraram
para tornar este sonho realidade.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus por ter me proporcionado o dom da vida, permitindo
estar aqui neste momento.
Aos primeiros mestres, meus pais José Nazareno Costa e Juscelina Costa pelo
apoio, compreensão e dedicação incondicional disponibilizada durante toda a minha
vida.
Às minhas queridas irmãs, Camila Costa e Giovanna Costa, pelo carinho e apoio
dado em muitos momentos.
Ao meu namorado, Thyago da Costa Vilhena pela amizade, momentos de
descontração e carinho e apoio durante toda fase de construção deste trabalho.
À professora orientadora Dra Roseane Maria Ribeiro Costa, pela oportunidade de
convívio, amizade, pelo incentivo, revisão, paciência e compreensão.
Ao professor Co-orientador Dr. Humberto de Mello Brandão pelas sugestões,
apoio e incentivo dado.
A professora Dra Alexandra Bentes de Sousa pela amizade, apoio e colaboração
com os tambaquis estudados e pela orientação sobre manejo e sanidade de peixes.
A professora Drª Marly de Fátima Carvalho Melo pela amizade e ajuda nos
conhecimentos de necropsia e tratamento de parasitoses de peixes.
Ao Professor Dr. Edilson Matos e a equipe do Laboratório de Pesquisa Carlos
Azevedo da Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA), por me introduzir no
âmbito da medicina veterinária e por me possibilitar aprendizado importante de
necropsia e processamento histológico de peixes.
Ao Professor Dr. João de Jesus Pinheiro pela atenção e disponibilizar sempre que
possível o microscópio de fluorescência.
Ao Professor Dr. José Antônio Picanço, pela ajuda na microscopia eletrônica de
transmissão (MET).
Aos amigos do Laboratório de Controle de Qualidade Físico-Químico e do
Laboratório de Planejamento e Desenvolvimento de Fármacos da UFPA Suellen
Sanches, Taylon Aguiar, Raimundo Silva, Polyane Alencar, Eliana Nascimento,
Marcos Pena e Marina Costa pela amizade e ajuda em muitos momentos do dia a
dia do laboratório.
Aos amigos de graduação Cristina Pereira, Izabelle Camões e Thiago Leite pela
amizade e carinho.
Ao laboratório de Oleoquímica da Faculdade de Química da UFPA, por me
disponibilizarem analisador térmico.
Aos amigos da Estação de Piscicultura da EMBRAPA Amazônia Oriental pela
convivência e pelo auxilio durante os testes com alevinos de tambaqui.
Aos participantes da banca examinadora por disponibilizarem seu valioso tempo,
contribuindo com seus conhecimentos para a melhoria deste trabalho.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências (PPGCF/UFPA).
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo
apoio financeiro.
E a todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste
estudo, meus sinceros agradecimentos.
“De tudo ficaram três coisas:
A certeza de que estamos sempre começando...
A certeza de que precisamos continuar...
A certeza de que seremos interrompidos antes de
terminar...
Portanto devemos:
Fazer da interrupção, um caminho novo...
Da queda, um passo de dança...
Do medo, uma escada...
Do sonho, uma ponte...
“Da procura, um encontro...”
(Fernando Pessoa)
RESUMO
COSTA, A. C. S. Nanopartículas de quitosana para aplicação em sanidade de
tambaquis amazônicos (Colossoma macropomum). 2013. 90f. Dissertação de
Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Faculdade de
Farmácia/ICS, Universidade Federal do Pará, 2013.
O Tambaqui (Colossoma macropomum) é um peixe de água doce com grande
potencial econômico para o agronegócio tropical amazônico, porém, em criações
comerciais o aumento da densidade animal favorece a manutenção e disseminação
de agentes infecciosos e parasitários, bem como, a produção de efluentes
contaminados por drogas e produtos químicos de uso veterinário que podem
interferir nos ecossistemas aquáticos. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi
desenvolver e caracterizar um sistema nanoparticulado de quitosana e analisar sua
mucoadesividade em tecidos de tambaquis amazônicos a partir de banhos de
exposição das nanopartículas fluorescentes em tempos de 30, 60 e 90 minutos. As
nanopartículas fluorescentes de quitosana reticulada com tripolifosfato de sódio (NP-
FITC) foram preparadas pelo método de gelatinização ionotrópica e caracterizadas
por FT-IR, TG/DTG, DTA, MET, tamanho de partícula e carga superficial. A
espectroscopia FT-IR demonstrou grupos NH2 e OH característicos da quitosana em
3434 cm–1, assim como, espectro em 1154 cm–1 que corresponde a reticulação do
grupo tripolifosfato (TPP) com os grupos amínicos da quitosana nas NP-FITC. As
curvas de termodecomposição revelaram degradação térmica da quitosana pura em
300°C e nas NP-FITC evidenciou uma menor estabilidade térmica em função da
neutralização de grupos aminos positivos da quitosana com os grupos fosfóricos
aniônicos do TPP. As NP- FITC revelaram tamanho e carga superficial de 211,1nm e
+32,51mV, respectivamente. A quantificação da fluorescência apresentou
significância estatística para os tecidos de brânquias, pele, estômago e intestino
garantindo a excelente interação dos grupos amino da quitosana com grupamentos
aniônicos da mucina. Esses resultados favorecem a aplicação desse sistema
nanoparticulado como potencial veículo para a liberação modificada de fármacos
relacionados a sanidades de peixes.
Palavras-chave: Tambaquis, Nanopartículas, Quitosana, FITC, TPP.
ABSTRACT
COSTA, A. C. S. Chitosan nanoparticles for application in sanity tambaquis
Amazon (Colossoma macropomum). 2013. 90f. Master's Dissertation - Graduate
Program in Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy / ICS, Federal University
of Pará, in 2013.
Tambaqui (Colossoma macropomum) is a freshwater fish with great economic
potential for Amazonian tropical agrobusiness, but in commercial flocks, the
increased in the fish population favors the maintenance and spread of infectious and
parasitic agents, as well as the production of effluents contaminated by drugs and
chemicals for veterinary use that can interfere with aquatic ecosystems. This way, the
aim of this study was to develop and characterize a chitosan nanoparticulate system
and analyze its mucoadhesive in tissues from Amazon tambaquis from baths of
fluorescent nanoparticles in exposure times of 30, 60 and 90 minutes. The
fluorescent nanoparticles of crosslinked chitosan with sodium tripolyphosphate (NP-
FITC) were prepared by the ionotropic gelation method and characterized by FT-IR,
TG / DTG, DTA, TEM, particle size and surface charge. The FT-IR spectroscopy
showed characteristic OH and NH2 groups of chitosan in 3434 cm -1, as well as
spectrum 1154 cm -1 which corresponds to the crosslinked group tripolyphosphate
(TPP) with the amine groups of chitosan in NP-FITC. Thermodecomposition curves
showed thermal degradation of pure chitosan at 300 °C and the NP -FITC showed a
lower thermal stability due to the neutralization of positive amino groups of chitosan
with anionic groups of the phosphoric TPP. The NP - FITC revealed size and surface
charge of 211.1 nm and + 32.51 mV respectively. The quantification of fluorescence
showed statistical significance for gills, skin, stomach and intestine tissue ensuring
excellent interaction of the amino groups of chitosan with anionic groups of mucin.
These results favor the application of nanoparticulate as a potential vehicle for the
modified fish sanities related drug delivery system.
Keywords: Tambaquis, Nanoparticles, Chitosan, FITC, TPP
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Tambaqui (Colossoma macropomum) ................................................................................. 20
Figura 2 - Diferença entre o perfil de liberação controlada de fármacos ............................................. 25
Figura 3 - Nanopartículas: (A) esfera (sistema matricial) e (B) (sistema reservatório ......................... 26
Figura 4 - Representação estrutural da quitina (A) e quitosana (B) ..................................................... 29
Figura 5 - Esquema da síntese de marcação da Quitosana com FITC ............................................... 33
Figura 6 - Estrutura química do Tripolifosfato (TPP) ............................................................................ 34
Figura 7 - Gelatinização da quitosana com Tripolifosfato de Sódio .................................................... 34
Figura 8 - Tipos de vibrações ............................................................................................................... 35
Figura 9 - Esquema de um interferômetro de Michelson ..................................................................... 36
Figura 10 - Desenho de um equipamento de termogravimetria ........................................................... 39
Figura 11 - Esquema da Analise térmica diferencial ............................................................................ 41
Figura 12 - Potencial Zeta .................................................................................................................... 42
Figura 13 - Componentes de um microscópio eletrônico de transmissão (MET) ................................ 43
Figura 14 - Espectros de FT-IR das Quitosana (A); TPP(B); FITC (C); NP-FITC (D) ......................... 55
Figura 15 - Curvas TG de QTS obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com as
razões de aquecimento de 5°C,10°C e 15°C/min ................................................................................ 57
Figura 16 - Curvas DTG de QTS obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com as
razões de aquecimento de 5°C,10°C e 15°C/min ................................................................................ 58
Figura 17 - Curvas DTA de QTS obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com as
razões de aquecimento de 5°C,10°C e 15°C/min ................................................................................ 58
Figura 18 - Curvas TG-DTG e DTA do TPP obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min)
na razão de aquecimento de 10°C/min. ............................................................................................... 60
Figura 19 - Curvas TG –DTG e DTA de FITC obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50
mL/min) na razão de aquecimento de 10°C/min ................................................................................... 61
Figura 20 - Curvas TG de NP-FITC obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com as
razões de aquecimento de 5°C,10°C e 15°C/min ................................................................................ 63
Figura 21 - Curvas DTG de NP-FITC obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com
as razões de aquecimento de 5°C,10°C e 15°C/min ........................................................................... 63
Figura 22 - Curvas DTA de NP-FITC obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com
as razões de aquecimento de 5°C,10°C e 15°C/min ........................................................................... 64
Figura 23 - Micrografia de MET de nanopartículas fluorescentes de quitosana; aumento 35.000x .... 66
Figura 24 - Distribuição do tamanho médio de nanopartículas fluorescentes em função dos
percentuais acumulativo e da intensidade ............................................................................................ 67
Figura 25A - Seção longitudinal de filamento de branquial de tambaquis, grupo controle; objetiva 10 X
............................................................................................................................................................... 70
Figura 25B - Seção transversal de brânquias de tambaquis submetido a banho de 30 minutos de NP-
FITC; objetiva 10X ................................................................................................................................. 70
Figura 25C - Seção transversal de brânquias de tambaquis submetido a banho de 60 minutos de
NP-FITC; objetiva 10X .......................................................................................................................... 70
Figura 25D - Seção transversal de brânquias de tambaquis submetido a banho de 90 minutos de
NP-FITC; objetiva 10X .......................................................................................................................... 70
Figura 26A - Seção longitudinal de pele de tambaquis, grupo controle; objetiva 10 X ....................... 71
Figura 26B - Seção transversal de pele de tambaquis submetido a banho de 30 minutos de NP-FITC;
objetiva 10X ........................................................................................................................................... 71
Figura 26C - Seção transversal de pele de tambaquis submetido a banho de 60 minutos de NP-FITC;
objetiva 10X ........................................................................................................................................... 71
Figura 26D - Seção transversal de pele de tambaquis submetido a banho de 90 minutos de NP-
FITC; objetiva 10X ................................................................................................................................. 71
Figura 27A - Seção longitudinal de estômago de tambaquis, grupo controle; objetiva 10 X .............. 72
Figura 27B - Seção transversal de estômago de tambaquis submetido a banho de 30 minutos de NP-
FITC; objetiva 10X ................................................................................................................................. 72
Figura 27C - Seção transversal de estômago de tambaquis submetido a banho de 60 minutos de
NP-FITC; objetiva 10X .......................................................................................................................... 72
Figura 27D - Seção transversal de estômago de tambaquis submetido a banho de 90 minutos de
NP-FITC; objetiva 10X .......................................................................................................................... 72
Figura 28A - Seção longitudinal de intestino de tambaquis, grupo controle; objetiva 10 X ................. 73
Figura 28B - Seção transversal de intestino de tambaquis submetido a banho de 30 minutos de NP-
FITC; objetiva 10X ................................................................................................................................. 73
Figura 28C - Seção transversal de intestino de tambaquis submetido a banho de 60 minutos de NP-
FITC; objetiva 10X ................................................................................................................................. 73
Figura 28D - Seção transversal de intestino de tambaquis submetido a banho de 90 minutos de NP-
FITC; objetiva 10X ................................................................................................................................. 73
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Lista de polímeros disponíveis para uso em sistemas de liberação de fármacos .............. 28
Tabela 2 - Valores de referência para PDI ........................................................................................... 49
Tabela 3 - Principais bandas de Infravermelho (cm-1) da quitosana e nanopartículas fluorescentes . 55
Tabela 4 - O efeito do calor, durante a degradação térmica de quitosana nas razões de 5, 10 e
15ºC/min ................................................................................................................................................ 59
Tabela 5 - O efeito do calor, durante a degradação térmica de NP-FITC nas razões de 5, 10 e
15ºC/min ................................................................................................................................................ 65
Tabela 6 - Valores médios e desvio padrão dos parâmetros de qualidade da água do tanque de
tambaquis .............................................................................................................................................. 69
Tabela 7 - Intensidade de fluorescência de brânquias, pele, estômago e porções iniciais de intestino
de alevinos de tambaqui expostos a 0,1 g/L de NFQ nos tempos (0- controle negativo, 30 60 e 90
minutos). ................................................................................................................................................ 75
LISTA DE SIGLAS
DLS Espalhamento dinâmico da luz
DTG Termogravimetria derivada
DTA Análise Térmica Diferencial
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
FITC Isotiocianato de Fluoresceína
FT-IR Espectroscopia na região do Infravermelho por Transformada de Fourier
IBAMA Instituto Brasileiro de Meio Ambiente e Recursos Renováveis
KBr Brometo de Potássio
MG Miligrama
Ml Mililitros
mV Milivolts
MET Microscopia eletrônica de Transmissão
MPA Ministério da Pesca e Aquicultura
NP-FITC Nanopartículas fluorescentes de quitosana reticuladas com TPP
Nm Nanômetros
OECD Organisation for economic Co-operation and development
pH Potencial Hidrogeniônico
PTA Ácido fosfotúngstico
PIB Produto Interno Bruto
PDI Índice de Polidispersão
QTS Quitosana
SUFRAMA Superintendência da zona franca de Manaus
TG Termogravimetria
TPP Tripolifosfato de Sódio
UV-Visível Ultravioleta visível
UFRA Universidade Federal Rural da Amazônia
UFPA Universidade Federal do Pará
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................................... 16
2 REVISÃO DA LITERATURA ...................................................................................................... 18
2.1 O agronegócio da piscicultura no Brasil ................................................................................ 18
2.2 Tambaqui (Colossoma macropomum) .................................................................................. 20
2.2.1 DOENÇAS ENCONTRADAS EM CRIAÇÕES COMERCIAIS DE TAMBAQUIS (Colossoma
macropomum) ....................................................................................................................................... 21
2.3 Nanotecnologia ...................................................................................................................... 23
2.3.1 CONCEITOS E APLICAÇÕES .................................................................................................... 23
2.3.2 SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE FÁRMACOS ...................................................... 24
2.3.3 VEÍCULOS POLIMÉRICOS ....................................................................................................... 27
2.3.4 QUITOSANA ........................................................................................................................... 29
2.3.5 APLICAÇÕES DA QUITOSANA COMO VEÍCULO DE LIBERAÇÃO NA ÁREA VETERINÁRIA ....... 32
2.3.6 NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA FLUORESCENTES PREPARADAS PELO MÉTODO DE
GELATINIZAÇÃO IONOTROPICA............................................................................................................. 33
2.3.7 MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO .......................................................................................... 35
2.3.7.1Espectroscopia do Infravermelho por Transformada de Fourier (FT-IR) ................................... 35
2.3.7.2 Análises Térmicas ....................................................................................................................... 38
2.3.7.2.1 Termogravimetria e Termogravimetria Derivada .................................................................. 38
2.3.7.2.2 Análise Térmica Diferencial .................................................................................................... 40
2.3.7.3 Potencial Zeta ............................................................................................................................ 42
2.3.7.4 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) ......................................................................... 43
3 OBJETIVOS .............................................................................................................................. 45
3.1 Objetivos Geral ...................................................................................................................... 45
3.2 Objetivos específicos ............................................................................................................ 45
4 MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................................... 46
4.1 Material .................................................................................................................................. 46
4.1.1 SOLVENTES E REAGENTES ..................................................................................................... 46
4.1.2 EQUIPAMENTOS .................................................................................................................... 46
4.2 Métodos ................................................................................................................................ 47
4.2.1 MARCAÇÃO DA QUITOSANA COM FITC ................................................................................ 47
4.2.2 PREPARAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS PELO MÉTODO DE GELATINIZAÇÃO IONOTRÓPICA . 47
4.2.3 CARACTERIZAÇÃO E ANÁLISE FÍSICO-QUÍMICA DA QTS, FITC, TPP E DAS NP- FITC .............. 48
4.2.3.1 Espectroscopia na região do Infravermelho por Transformada de Fourier (FT-IR) ................. 48
4.2.3.2 Análise térmica: termogravimetria e análise térmica diferencial ............................................. 48
4.2.3.3 Medidas de tamanho (diâmetro médio), e polidispersividade ................................................. 48
4.2.3.4 Medidas de carga superficial (potencial zeta) .......................................................................... 49
4.2.3.5 Microscopia eletrônica de Transmissão (MET) ........................................................................ 50
4.2.4 TAMBAQUIS........................................................................................................................... 50
4.2.4.1 Exposição dos tambaquis amazônicos aos banhos contendo NP-FITC ..................................... 51
4.2.4.2 Avaliação da biodistribuição de nanopartículas mucoadesivas em tecidos de tambaquis
amazônicos ............................................................................................................................................ 51
4.2.4.3 Estatística .................................................................................................................................. 52
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................................... 53
5.1 Síntese de nanopartículas fluorescentes por Gelatinização Ionotrópica ............................ 53
5.2 Espectroscopia na região do Infravermelho por Transformada de Fourier (FT-IR) ............. 54
5.3 Análises Térmicas .................................................................................................................. 56
5.3.1 QUITOSANA ........................................................................................................................... 56
5.3.2 TRIPOLIFOSFATO DE SÓDIO E ISOTIOCIANATO DE FLUORESCEÍNA ...................................... 60
5.3.3 NANOPARTÍCULAS FLUORESCENTES ............................................................................................ 61
5.4 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) ..................................................................... 66
5.5 Análise doTamanho e Polidispersividade das NP-FITC ........................................................ 67
5.6 Análise da Carga Superficial das Nanopartículas ................................................................. 68
5.7 Ensaio de NP-FITC em tecido de tambaquis ........................................................................ 69
5.7.1 ANÁLISE DA QUALIDADE DE ÁGUA DO TANQUE DOS TAMBAQUIS ..................................... 69
5.7.2 AVALIAÇÃO DA BIODISTRIBUIÇÃO DA FLUORESCÊNCIA EM TECIDOS DE TAMBAQUIS ........ 70
6. CONCLUSÕES ............................................................................................................... 76
REFERENCIAS ............................................................................................................................... 77
16
1 INTRODUÇÃO
A fauna de peixes de água doce do Brasil é a mais rica do mundo, com cerca
de 2.587 espécies (GODINHO, 2007). Segundo dados do Ministério de Pesca e
Aquicultura, o Brasil gera um PIB pesqueiro de R$ 5 bilhões com potencial para se
tornar um dos maiores produtores mundiais de pescado (BRASIL, 2011). Dentre os
peixes de grande interesse econômico para a aquicultura comercial amazônica, o
Tambaqui (Colossoma macropomum) vem emergindo com grande potencial de
cultivo, devido as suas características zootécnicas favoráveis, qualidade,
palatabilidade da carne e valor comercial alcançado (ARAUJO-LIMA & GOULDING,
1997).
Em face desse aumento significativo da piscicultura no país, a valorização de
tecnologias para a sanidade em peixes, torna-se importante ferramenta para a
minimização das perdas econômicas substanciais geradas com a evolução das
enfermidades provocadas por parasitoses, bacterioses e doenças fungicas
comumente encontradas em ambiente de cultivo e que se tornam fatores limitantes
para a criação de peixes (LUQUE, 2004, PIZOLLATI, 2000). Nesse contexto, a
nanotecnologia relacionada a sistemas de liberação de fármacos, mesmo estando
em fase precoce em aquicultura, se destaca como ferramenta para o
desenvolvimento de novas formulações e a liberação do principio ativo com
potencial terapêutico aumentado. Seu uso a partir de sistemas poliméricos possibilita
uma liberação lenta e gradual do fármaco e o direciona a alvos específicos do
organismo possibilitando a redução de número de mortes (AULTON, 2005; BRAUN,
2005; DAVIS, 2004, RATHER et al. 2011).
Os sistemas poliméricos de liberação de drogas são largamente utilizados e
não só permitem uma liberação lenta e gradual do principio ativo, como também
possibilitam o direcionamento a alvos específicos do organismo (LOPES et al. 2005).
A Quitosana é um biopolímero natural derivado da quitina e tem se tornado muito
atraente em medicina veterinária, sua utilização como veículo de liberação de
fármacos é devida as suas características de atoxicidade, biocompatibilidade,
biodegradabilidade e mucoadesão, propiciada pelo grande número de grupos
hidroxila e grupos amino presentes em sua cadeia polimérica, que realçam suas
propriedades de permeação (KUMAR, 2008; GÜNBEYAZA et al. 2010)
17
A aplicação de sistemas de liberação controlada em peixes é capaz de
reduzir o estresse animal provocado pela administração e manipulação, fator
predisponente a baixa de imunidade e susceptibilidade dos peixes a infecções, além
da redução dos custos em tempo e dinheiro devido essa tecnologia reduzir a
necessidade de doses múltiplas. Esse estudo trata do desenvolvimento tecnológico
de nanopartículas mucoadesivas de quitosana, bem como, a avaliação de sua
biodistribuição em tecidos de tambaquis amazônicos, para aplicação como sistema
de liberação controlada de fármacos relacionados à sanidade de peixes.
18
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 O agronegócio da piscicultura no Brasil
O Brasil é um dos líderes mundiais na produção e exportação de vários
produtos agropecuários com projeções que indicam sua liderança em vários
insumos, com destaque para o algodão e biocombustíveis, feitos a partir de cana-de-
açúcar e óleos vegetais, milho, arroz, frutas frescas, cacau, castanhas, nozes; além
de suínos e dentre eles o pescado (BRASIL, 2012a; FILHO et al. 2012).
A aquicultura é praticada em todos os Estados brasileiros e corresponde a
diferentes modalidades que vão desde a piscicultura (criação de peixes), à
carcinicultura (camarões), à ranicultura (rãs) e à malacocultura (moluscos: ostras,
mexilhões, escargot) (FILHO, 2012).
Após a criação pelo Governo Federal, em 2009 do Ministério da Pesca e
Aquicultura (MPA), foi aumentada a ênfase do aproveitamento do extenso potencial
hídrico disponível no Brasil para a criação de organismos aquáticos. São mais de
cinco milhões de hectares de laminas d’água, oito mil quilômetros de litoral, 12% da
água doce do mundo, clima e disponibilidade de mão de obra (FILHO & FRASCÁ-
SCORVO, 2011).
A produção de pescados tem crescido no país desde a década de 90 e,
atualmente, se consolida como grande fornecedor de proteína de qualidade para a
população. Segundo dados do Ministério de Pesca e Aquicultura, o Brasil gera um
Produto Interno Bruto (PIB) pesqueiro de R$ 5 bilhões com potencial para se tornar
um dos maiores produtores mundiais de pescado (BRASIL, 2010).
No ano de 2010, a piscicultura conseguiu índices de crescimento relativo em
torno de 68% com destaque para a produção de tilápia, tambaqui e tambacu. Os
estados que mais se destacaram foram Santa Catarina, Pará e Bahia que detém
37% da produção nacional, conforme levantamento da Produção Pesqueira e
Aquícola do Brasil publicado em 2010 pelo Ministério da Pesca e Aquicultura (MPA)
(BRASIL, 2011).
A piscicultura mostra que os produtores têm-se preocupado, à exceção das
tilápias, com a criação de novas espécies com os mais variados hábitos alimentares
19
e ambientes de vida, indo desde espécies de clima tropical (em sua grande maioria)
até aquelas de climas temperado e frio (FILHO, 2012). Em função do aumento da
população global e de mudanças de hábito alimentar, houve aumento da demanda
por pescados.
A Amazônia possui grande potencial para criação de peixes, com recursos
hídricos abundantes, clima favorável o ano todo, grande diversidade de espécies
valorizadas no mercado e oferta de alevinos das principais espécies (FILHO, 2012;
ONO, 2005; SANTOS, 2010). A pesca é o alicerce da economia da região
amazônica e não só se destaca em relação às demais regiões brasileiras pela
riqueza das espécies exploradas, mas pela quantidade de pescado anualmente e
pela dependência da população tradicional a esta atividade. Dessa forma, há um elo
cultural, econômico e social com a população (COSTA, 2006).
Esse contexto de crescimento da piscicultura no país prevê a adoção de
várias medidas destinadas a minimização de perdas econômicas geradas em
ambiente de cultivo. Dentre os principais desafios que acompanham a intensificação
desses sistemas produtivos, pode-se destacar o aumento da densidade animal que
favorece a manutenção e disseminação de agentes infecciosos e parasitários, bem
como, a produção de efluentes contaminados por drogas e produtos químicos de
uso veterinário que podem interferir nos ecossistemas aquáticos (OECD, 2011).
Assim, para manter o crescimento sustentável da atividade pesqueira e para que a
mesma se mantenha nos próximos anos, novas formulações farmacêuticas mais
eficientes devem ser desenvolvidas para o setor.
Como modelo de estudo, foi utilizado o Tambaqui (Colossoma macropomum)
(Cuvier,1818), uma espécie nativa da região amazônica com grande potencial
produtivo.
20
2.2 Tambaqui (Colossoma macropomum)
O Tambaqui (Colossoma macropomum) (Cuvier, 1818) (Figura 1), é a maior
espécie da ordem dos Characiformes, pertence à família Characidae e gênero
Colossoma (BALDISSEROTO, 2006) é uma espécie frequentemente encontrada na
foz do rio Xingu, no estado do Pará, até o médio rio Ucaiali no Peru e também ao
longo dos tributários de águas barrentas do rio Amazonas e nas partes baixas dos
tributários claras e negras (ARAÚJO- LIMA& GOULDING, 1977, ISAAC & RUFINO,
1996).
Em ambiente natural atinge porte máximo de 100 cm e acima de 30 kg de
peso. Possui dentição forte, que permite quebrar os frutos e sementes que caem na
água no período de cheia dos rios. O hábito alimentar é baseado no consumo de
frutos e sementes. Mas também, pode-se alimentar de insetos, caramujos e
raramente de outros peixes. Na fase de pós-larva, o alevino, alimenta-se de
plâncton. Em cativeiro aceita bem ração, grãos e subprodutos agro-industriais, o que
garante sucesso da adaptação do tambaqui para o cultivo em cativeiro, além a sua
capacidade de filtrador de plâncton (SUFRAMA, 2003).
O Tambaqui é uma das espécies que mais desperta interesse na piscicultura
no Brasil (ARAÚJO-LIMA e GOULDING, 1997; COSTA, 2006; GRAEF, 1987).
Apesar de ser uma espécie nativa da bacia Amazônica, seu cultivo também é
crescente em outras regiões do Brasil como nordeste, centro-oeste e sudeste. Isso é
Figura 1 - Tambaqui (Colossoma macropomum)
21
dado em função das boas condições para a criação do animal como: rápido
crescimento, alta produtividade, além de consumo e aceitabilidade elevada
(ALMEIDA et al. 2006).
Uma qualidade primordial é a consistência, bem como, o sabor de sua carne
muito apreciada pelo consumidor. Esses atrativos lhe conferem um alto valor
comercial e importância para a economia regional (ARAÚJO-LIMA & GOULDING,
1997; IBAMA, 2007; VAL & HONCZARYK, 1995).
2.2.1 DOENÇAS ENCONTRADAS EM CRIAÇÕES COMERCIAIS DE TAMBAQUIS
(Colossoma macropomum)
A sanidade é um dos aspectos mais relevantes para a produção comercial
de animais aquáticos. Doenças comprometem o bom desempenho zootécnico dos
animais gerando prejuízos consideráveis ao piscicultor. Em criações os peixes são
submetidos a condições estressantes, como por exemplo, pequenas áreas com altas
densidades ocasionam a concentração de espécies parasitas e vários patógenos
como bactérias e fungos que podem causar doenças e grandes mortalidades de
peixes (LIMA, 2007).
Silva (2001) em estudo encontrou 22 espécies bacterianas em tambaquis,
das quais, as 19 espécies descritas a seguir foram mais representativas em
brânquias: Aeromonas sp., Flavobacterium sp., Alcaligenes sp., Moraxella sp.,
Pasteurella sp., Rochalimae henselae, Xenorhabdus sp., Enterobacter sp., Yersinia
sp., Actinobacillus sp., Haemophilus sp., Proteus sp., Cardiobacterium sp.,
Chromobacterium violaceum, Klebsiela sp, Escherichia coli, Hafnia sp., Providencia
sp., Pseudomonas sp. Entretanto, em trabalhos como Chagas (2010); Belem-Costa
& Cirino (2006 apud CHAGAS, 2010, p.12); Vimal et al (2012), que desenvolveram
trabalho com criação de peixes de água doce, a principal espécie bacteriana
encontrada foi Aeromonas hydrophila, responsável por grande mortalidade de
tambaquis em cultivo.
Silva-Junior e Ferreira (2007) identificaram os gêneros de fungos:
Rhyzophydium, Chytriomyces e Podochytrium que são pertencentes ao Filo
22
Chytridiomycota e o gênero Achlya pertencente à classe Oomycota. Destes, apenas
o gênero Achlya é considerado possível causador de prejuízos à piscicultura.
Para o Tambaqui são relatadas espécies de metazoários parasitos: os
monogenóides Anacanthorus spathulatus, Linguadactyloides brinkmanni,
Notozothecium janauachensis, Mymarothecium boegeri, Gyrodactylus sp. Um
digenético da família Paramphistomida, larvas de plerocercóides de Cestoda da
família Proteocephalidae, o acantocéfalo Neoechinorhynchus buttnerae, os
nematóides Spirocamallanus inoinatus, espirocamallanus spp. (FERRARIS, 2003).
O número de parasitas necessários para causar danos em um peixe pode
variar com seu estado de saúde, com a espécie do peixe em estudo e com o
tamanho do hospedeiro (LEMOS et al. 2007, LIMA, 2007;. NUNES, 2007; PIAZZA et
al. 2006).
FISHER et al (2003) em trabalho realizado no Baixo Rio Amazonas (Estado
do Pará) e no médio Rio Solimões (estado do Amazonas) identificaram nove
espécies de parasitas em tambaqui, entre os quais, três parasitas foram da classe
dos Monogenoidea (o Anacanthorus spathulatus, Linguadactyloides brinkmanni e
Nothozothecium sp), uma espécie trematoda da família Paraphistosmidae, uma do
filo Acanthocefala, Neoechinorhyncus buttnerae, duas do filo nematoda
Spirocamallanus sp e Procamallanus sp e duas da classe da subclasse Copepoda,
Gamydactylus jaraquensis e Perularneae gamitanae. Com registro do monogenético
Notozotheciumsp., espécies imaturas da família Paramtophistomidade, larvas do
nematoide Promallanus sp., e o copépodo Gamidactylus jaraquensis.
MORAIS et al (2009) caracterizaram a fauna de parasitos em juvenis de
tambaquis da Amazona central. Das espécies encontradas Anacanthorus
spathulatus foi a espécie de Monogenenoidea que apresentou maiores índices
parasitários, principalmente localizados em brânquias e pele. Notozothecium
janauachensis foi à segunda, com infecção em fossas nasais e brânquias e
Mymarothecium boegeri foi à terceira espécie que mais parasitou os tambaquis,
sendo encontrada somente nos filamentos branquiais.
SANTOS et al (2012) em trabalho realizado para descrever a fauna
parasitária de tambaquis em tanques de rede no estado do Amapá verificaram
maiores taxas de infecção por protozoários Ichthyophthirius multifiliis e
Piscinoodinium pillulare, seguido por monogenoideas Mymarothecium boegeri
Anacanthorus spathulatus. Infecções por esses agentes causadores de doenças
23
podem reduzir a sobrevivência dos peixes, causando prejuízos econômicos aos
produtores.
A busca por tecnologias em piscicultura comercial são de grande
importância para a minimização de doenças em ambientes de cultivo.
2.3 Nanotecnologia
2.3.1 CONCEITOS E APLICAÇÕES
O termo nanotecnologia se fundamenta em tecnologias que possibilitam a
construção de materiais ou estruturas na escala de nanômetros (10-9 nm).
Em 1959, o físico Richard Feynman sugeriu átomos manipulados como
forma de construir novos materiais. Em 1974, O termo Nanotecnologia, foi criado, na
Universidade de Ciências de Tókio pelo então professor Norio Taniguchi para
descrever a manufatura precisa de materiais com tolerâncias nanométricas (ARAKI,
2007; FEYNMAN, 1960).
A manipulação atômica através de elementos nanotecnológicos traz a
possibilidade de construção de estruturas átomo a átomo, que possibilita a criação
de materiais com estruturas químicas novas. O rearranjo destas estruturas traz
mudanças às características físico-químicas, tais como resistência mecânica ou
pontos de fusão e condução de calor e eletricidade, variáveis muito importantes
(ARAYANE, 2006).
Atualmente, os países desenvolvidos que investem grandes quantias em
dinheiro no desenvolvimento de nanotecnologia são os Estados Unidos, seguidos da
Alemanha e Japão. O objetivo desse investimento é a criação de novos materiais e
desenvolver novos produtos e processos baseados na crescente capacidade
tecnológica moderna de manipulação atômica e molecular. A nanotecnologia é
transdisciplinar envolvendo profissionais como físicos químicos, engenheiros e
farmacêuticos (HAMIDI et al. 2008).
24
O incentivo a nanotecnologia é crescente no nosso país. A portaria n° 245
de 5 de abril de 2012, do Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação publicada em
09 de abril de 2012 em Diário Oficial, anuncia a criação do Sistema Nacional de
Laboratórios em Nanotecnologias (SisNano), para o aumento do peso da atividade
industrial no Produto Interno Bruto do país. Esse apelo é principalmente voltado à
indústria farmacêutica e de cosméticos (BRASIL, 2012b; INOVAÇÃO
TECNOLOGICA, 2012).
2.3.2 SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE FÁRMACOS
Com a revolução da ciência e tecnologia, o medicamento evoluiu e
possibilitou que a terapêutica moderna permitisse a liberação controlada e alta
especificidade de compostos de fármacos, contribuindo para a saúde humana e
animal.
Na terapia convencional, a concentração sanguínea de fármacos oscila em
picos máximos e mínimos de declínio, o que pode ocasionar toxicidade em altas
concentrações ou a ineficiência do tratamento em baixas concentrações sanguíneas
(AULTON, 2005) (Figura 2). Um sistema de liberação controlada, objetiva manter a
concentração do fármaco na faixa terapêutica a partir de uma única dosagem
(AZEVEDO, 2002). As vantagens desses sistemas são numerosas, entre elas:
liberação modificada da ação do fármaco, administração segura (sem reações
inflamatórias locais) e conveniente (menor número de doses). Dessa forma, essa
tecnologia visa à diminuição de efeitos tóxicos e/ou aumento do índice terapêutico
(AZEVEDO, 2002; BARBUCCI, 2002).
25
Fonte: LQES - Laboratório de Química do Estado Sólido – Instituto de Química – UNICAMP (http://lqes.iqm.unicamp.br).
Sistemas nanoparticulados são muito úteis na manutenção da dose
terapêutica em níveis seguros, na diminuição dos picos e valores plasmáticos, além
de conferir proteção e economia de fármaco (LIMA, 1999; KREUTER, 2001).
A nanotecnologia aplicada a sistemas de liberação faz uso e pesquisa novas
estratégias para a liberação do princípio ativo. Entre os comumente usados em
liberação controlada estão: lipossomas, nanopartículas, microcápsulas,
microesferas, táxis ou bioadesivos.
Em conceito, nanopartículas apresentam tamanho entre 1 a 1000 nm, e
podem ser constituídas de polímeros naturais e/ou sintéticos, lipídios ou
fosfolipídios, até mesmo metais (LIMA, 1999; KREUTER, 2001). O termo
nanopartículas faz referência a dois tipos de estruturas: nanoesferas (Figura 3A) e
nanocápsulas (Figura 3B). Nanoesferas são sistemas em que o fármaco encontra-se
disperso homogeneamente ou solubilizado na matriz polimérica ou cerosa
(AZEVEDO, 2002). Dessa forma, obtém-se um sistema matricial, onde não é
possível identificar um núcleo diferenciado.
Nanocápsulas são definidos como sistemas reservatórios, sendo possível a
identificação de um núcleo diferenciado, que pode ser sólido ou líquido. Neste caso,
a substância encontra-se envolvida por uma membrana, geralmente polimérica,
isolando o núcleo do meio externo (AULTON, 2005).
Figura 2 - Diferença entre o perfil de liberação controlada de fármacos
26
Fonte: Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37.
As vantagens da utilização das nanopartículas poliméricas como sistemas
de liberação de fármacos são dadas por diversas razões como: proteção do
fármaco, direcionamento a sítios específicos, estabilidade física e biológica
suficiente para reter o fármaco e promover a liberação controlada, boa tolerabilidade
dos componentes, simplicidade do processo de formulação e possibilidade do
escalonamento do processo. Outra vantagem é o aumento da estabilidade de
fármacos voláteis (KAYSER et al. 2005)
Os sistemas de liberação poliméricos são ferramentas de grande
importância para a tecnologia farmacêutica com a finalidade de conseguir um
controle temporal ou espacial da liberação do fármaco (AULTON, 2005; BRAUN,
2005; DAVIS, 2004).
Figura 3 - Nanopartículas: (A) esfera (sistema matricial) e (B) (sistema reservatório
27
2.3.3 VEÍCULOS POLIMÉRICOS
A ciência dos polímeros tem exercido grande importância para o
desenvolvimento de novos sistemas de liberação controlada. Dentre as várias
propriedades dos polímeros, algumas se demonstram mais importantes quando na
elaboração de um sistema de liberação de fármacos, como a permeabilidade
propriedades de superfície como hidrofilicidade, lubrificação, lisura, energia de
superfície adesão, solubilidade e temperatura de transição vítrea (BRAUN, 2005;
DAVIS, 2004).
Outra característica físico-química importante é o peso molecular de um
polímero. Um aumento no peso molecular, bem como uma distribuição estreita de
massas moleculares, traz uma melhoria em relação a algumas propriedades do
material, como rigidez e resistência à tensão, à abrasão, a agentes químicos e à
degradação térmica, porém isso ocasiona uma diminuição na solubilidade e nas
propriedades de adesão (DAVIS, 2004).
Materiais poliméricos sintéticos e ou naturais podem ser utilizados como
veículos carreadores para liberar uma grande variedade de fármacos (OLIVEIRA,
2006). A Tabela 1 demonstra lista de polímeros disponíveis para uso em sistemas
de liberação de fármacos.
28
Tabela 1 - Lista de polímeros disponíveis para uso em sistemas de liberação de fármacos
Fonte: OLIVEIRA, 2006 (* com adaptações)
CLASSIFICAÇÃO POLÍMERO
POLÍMEROS NATURAIS
- Polímeros a base de proteína - Colágeno, Albumina e gelatina
- Polissacarídeo
- Agarose, Alginato, Carragenina, Ácido hialurônico, Dextrana, Quitosana, Ciclodextrinas, Sulfato de condroitina
POLÍMEROS SINTÉTICOS - Biodegradáveis
- Poli(ácido) lático, Poli(ácido) glicólico, PLGA (copolimero de acido láctico e glicolico)
- Poliéster -Poli(hidroxibutirato),Poli(ecaprolactona),
Poli(ácido β-málico), poli(dioxanonas)
- Polianidro - Poli(ácido sebálico), Poli(ácidoadipico), Poli(ácido terftálico) e vários copolímeros
- Poliamidas - Poliminocarbonatos, Poliminoácidos
- Polímeros Fosforosos
- Polifosfato, Polifosfanatos e Polifosfazenos
- Outros - Poli(cianoacrilatos), Poliuretanos, éster Poliorto, Polihidropirans, poliacetais
NÃO BIODEGRADÁVEIS
- Derivados da celulose
-Carboximetilcelulose,Etilcelulose, Celuloseacetato, Hidroxipropilmetilcelulose
- Silicones - Polimetilsiloxano, Sílica coloidal
- Polímeros Acrílicos
- Polimetacrilatos, Polimetilmetacrilato (N-NIPAM; NIPAM) Polietilhidrometacrilato
- Polivinilpirrolidona, Etilvinilacetato, Poloxameros, Poloxaminas
29
Polímeros biodegradáveis são cada vez mais importantes para a liberação
controlada de agentes terapêuticos como fármacos ou enzimas, com a finalidade de
interagir com as diversas partes do corpo humano e/ou do animal, e com capacidade
de garantia da liberação do princípio ativo durante um longo período de tempo sob
um período constante. Embora um polímero para algumas aplicações deva ser
absolutamente estável contra a degradação, em sistemas de liberação controlada, a
biodegradação fácil é necessária, para que após ter desempenhado sua funções, o
polímero seja adsorvido ou eliminado por uma via metabólica (BRAUN, 2005;
DAVIS, 2004). Polímeros naturais e sintéticos são empregados na medicina como
materiais biodegradáveis (DAVIS, 2004)
2.3.4 QUITOSANA
A quitosana é definida como um copolímero de 2-amino-2-desoxi-D-
glicopiranose e 2-acetamida-2-desoxi-D-glicopiranose, de composição variável em
função do grau residual de acetilação, cujas unidades também são unidas por
ligações glicosídicas β-(1,4). A quitosana é um polissacarídeo linear obtido a partir
da reação de desacetilação da quitina em soluções alcalinas (DAMIAN, 2005;
KUMAR, 2008, MUZZARELLI, 1978), conforme Figura 4.
Fonte: GUIMARAES, 2005
Figura 4 - Representação estrutural da quitina (A) e quitosana (B)
30
A quitina é um polissacarídeo nitrogenado, natural, branco, duro e
inelástico presente nas carapaças dos crustáceos, nos exoesqueletos de insetos,
em nematoides e nas paredes celulares de fungos e de leveduras (MUZZARELLI,
1978).
Durante a reação de desacetilação, os grupamentos acetamido (-NHCOCH3)
da quitina são transformados, em graus variados, em grupos amino (NH2), dando
origem a quitosana. Essa característica somada a linearidade do polímero e grupos
hidroxilas reativos de quitosana confere um caráter mais versátil em relação quitina,
como a formação de quelatos com substâncias como o colesterol, gorduras,
proteínas e células tumorais (GOY, 2004).
A quitina e a quitosana são considerados biopolímeros distintos. O grau de
desacetilação é um parâmetro que define a fração de unidades desacetiladas
contidas na cadeia polimérica. Assim, a quantidade de monômeros desacetiladas faz
distinção entre esses dois biopolímeros. Quando a desacetilação é maior que 40% o
polímero é quitosana (BARROS et al. 2006; DE SOUZA, 2009).
A quitosana é um biopolímero cujo grau de desacetilação, distribuição de
massa molar e conteúdo de impurezas dependem das fontes naturais de matéria-
prima e dos métodos de preparação. A massa molar média da quitina nativa é
geralmente maior do que 106 Daltons, enquanto a quitosana comercial tem uma
massa molar média na faixa de 1,0 x 10 – 1,2 x106 Daltons (DUTTA, 2004; DAMIAN,
2005).
Valores altos de grau desacetilação encontrado em quitosanas demonstram
que essa possui uma grande quantidade de grupos aminos e grupos hidroxila
disponíveis na cadeia polimérica, que justificam a sua alta hidrofilicidade. A
determinação do grau de desacetilação é importante já que permite o uso do
biomaterial nas suas várias formas de aplicações como micropartículas, géis,
membranas e como veículo de liberação de fármacos (LARANJEIRA; 2009).
Na literatura valores do grau de desacetilação foram encontrados variando de
50 a 92,3% (DE SOUZA, 2009) e de 70 a 96% (JANEGITZ et al. 2007;CANELLA;
2001).
A quitosana exibe comportamento catiônico moderadamente básico
(pka=6,3). Em relação ao parâmetro solubilidade, é insolúvel em soluções neutras e
alcalinas e soluvel em soluções ácidas diluidas, como ácido acético, cloridrico,
31
perclorico, que desprotonam os grupamentos amino do polímero (HORN, 2008;
GUIMARAES, 2005).
A presença de uma alta porcentagem de grupos amino reativos distribuídos
na matriz polimérica permite inúmeras modificações químicas, tais como
imobilização de agentes quelantes, quaternização, carboxilação, acilação,
sulfonação, amidação, formação de complexo polieletrolítico (LARANJEIRA, 2009).
Recentemente, muita atenção tem sido dada à quitosana e aos seus
oligômeros como materiais bioativos. Dentre as principais vantagens da quitosana
em relação a outros polissacarídeos são: sua sensibilidade ao pH,
biocompatibilidade, bioadesão, atoxicidade e permeabilidade. Além de ser
bactericida,fungicida e biodegradável, age como composto cicatrizante,
apresentando vantagem em relação aos polímeros sintéticos que, na sua grande
maioria, são tóxicos (AJUN,2009;CALVO et al. 1997;KUMAR, 2008). Seu caráter
biodegradável é devido a sua metabolização por enzimas como a lisozima
(PRABAHARAN, 2008).
A alta hidrofilicidade da quitosana, devida ao grande número de grupos
hidroxila e grupos amino presentes na cadeia polimérica, permite sua utilização
como biomaterial na forma de nanopartículas, e como veículo de liberação de
fármacos (CANELLA, 2001; MAURO, 2009; SENEL, 2004). Estas características
tornam a quitosana atrativa para aplicação na área veterinária.
A quitosana tem provado ser um excipiente polimérico seguro em
formulações farmacêuticas, sendo empregada como veículo carreador de fármacos,
peptídeos, proteínas e vacinas de DNA (GAVINI et al. 2002; GÜNBEYAZ et al. 2010;
VIMAL et al. 2012).
32
2.3.5 APLICAÇÕES DA QUITOSANA COMO VEÍCULO DE LIBERAÇÃO NA ÁREA
VETERINÁRIA
Na área veterinária, o desenvolvimento de sistemas de liberação controlada
é muito interessante, uma vez que, proporcionam um melhor manejo do animal com
redução do estresse provocado pela administração e manipulação e redução dos
custos em tempo e dinheiro.
Na literatura são reportados diversos trabalhos que relatam o crescente
apelo para o desenvolvimento tecnológico de sistemas de liberação de fármacos e
vacinas voltados para aplicação em animais sejam de grande ou pequeno porte. No
artigo de revisão realizada por Sun et al (2004), eles reportam a necessidade de
desenvolver formulações de ação prolongada de antibióticos voltados para uso na
área veterinária. Em outro trabalho de revisão, Vandamme e Ellis (2004) analisaram
os conceitos necessários, as questões e os desafios para a construção de sistemas
de distribuição de fármacos em ruminantes.
Segundo Gavini et al (2002), as principais áreas de aplicação da tecnologia
liberação controlada no domínio veterinário são: a prevenção de doenças e controle
através da entrega de anti-helmínticos, antibióticos, antiparasitários, promotores de
crescimento, agentes nutricionais e vitaminas e à produção de alimentos para
animais.
A literatura relata a possibilidade de utilizar vacinas de DNA em piscicultura,
Kumar e colaboradores (2008) fizeram um trabalho com uso de nanopartículas de
quitosana para liberação oral de vacinas de DNA em robalo Asiático, para proteção
contra Vibrio (Listonella anguillarum). A quitosana também é vista como adjuvante
de vacinação mucosa, Günbeyaz et al (2010) desenvolveram uma vacina de
quitosana contendo BHV-1, para imunização das mucosas contra o herpesvirus
BHV-1 bovina.
Gavini et al (2002) utilizaram comprimidos vaginais mucoadesivos para
liberação controlada de um fármaco antimicrobiano, acriflavina, à partir de
microsferas de quitosana. Os autores verificaram através dos ensaios in vitro de
mucoadesão que esse sistema demonstrou uma boa capacidade mucoadesiva.
33
2.3.6 NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA FLUORESCENTES PREPARADAS
PELO MÉTODO DE GELATINIZAÇÃO IONOTROPICA
A quitosana é um polissacarídeo linear catiônico, devido aos seus
grupamentos amino livres, principal vantagem em relação a outros biopolímeros.
Sua capacidade de formar sais em presença de ácidos faz com que a quitosana seja
reativa e solúvel (CAMPOS et al. 2004).
Os grupos amino primários da cadeia polimérica da quitosana facilitam seu
acoplamento a vários tipos de biomoléculas, tais como: proteínas, enzimas,
anticorpos, assim como moléculas fluorescentes como o FITC (Isotiocianato de
Fluoresceína) (ZHAO &WU, 2006). A reação entre o grupamento isotiocianato do
FITC e o grupo amino primário da quitosana é demonstrado na Figura 5.
O método de gelatinização ionotrópica consiste na reticulação iônica da
quitosana com contra-íons multivalentes, como o TPP (tripolifosfato de sódio). As
partículas resultantes da gelatinização ionotrópica possuem tamanhos da ordem de
nanômetros (CAMPOS et al. 2004).
Para promoção de uma melhor estabilidade física e química de veículos
poliméricos utilizados como biomateriais, vários agentes reticulantes podem ser
usados, entre eles: glutaraldeído, epicloridrina, diglicil etilenoglicol, porém, estes
Fonte: ZHAO& WU, 2006
Fluoresceína-5-
Isotiocianato
(FITC)
Quitosana
Quitosana marcada
com FITC
Figura 5 - Esquema da síntese de marcação da Quitosana com FITC
34
apresentam toxicidade (MI et al. 2002). Dessa forma, o uso do TPP como agente de
reticulação iônica, possui vantagem em relação aos reticulantes citados
anteriormente, devido ao fato de ser atóxico (SHU & ZHU, 2000; SILVA, 2006).
O TPP (Figura 6) apresenta-se na forma de pó branco, com pouca com peso
com molecular de 367, 86 e pouca higroscopicidade (GUIMARAES 2005 apud
MERCK, INDEX, 2001).
Fonte: GUIMARAES, 2005
A preparação das nanopartículas é realizada a partir da adição de uma fase
alcalina contendo TPP (pH= 7-9) e uma fase ácida contendo quitosana (pH= 4-6). A
formação das partículas após adição dessas fases é concretizada a partir de
ligações intermoleculares que ocorreram entre o grupamento amino da quitosana e
grupo fosfato do TPP (BODMEIER et al.1989).
A facilidade de reticulação iônica do TPP com a quitosana é devida ao seu
grande número de cargas negativas (Figura 7).
Fonte: Silva, 2006
Figura 6 - Estrutura química do Tripolifosfato (TPP)
Figura 7 - Gelatinização da quitosana com Tripolifosfato de Sódio
35
2.3.7 MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO
2.3.7.1Espectroscopia do Infravermelho por Transformada de Fourier (FT-IR)
A espectroscopia do infravermelho é um importante método analítico para a
identificação de grupos funcionais de moléculas orgânicas no estado sólido, líquido e
gasoso. A faixa espectral de 4000 a 400 cm-1 corresponde à região espectral do
infravermelho médio no qual a espectroscopia estuda a interação da radiação
eletromagnética para as moléculas orgânicas. Dessa forma, quando a radiação na
região do infravermelho interage com as moléculas, há alterações nos modos
vibracionais e rotacionais das mesmas, gerando variação de seu momento dipolo.
Em função disso, o campo elétrico alternante da radiação incidente interage com a
molécula e origina os espectros (FREITAS, 2009; NASCIMENTO, 2011).
As vibrações moleculares podem ser classificadas pelo seu estiramento, ou
seja, pela deformação axial, além dos tipos de deformação angular divididas em
simétricas ou assimétricas (ALMEIDA, 2009; PAVIA & LIZ, 2001).
As vibrações angulares podem ainda ser classificadas como no plano ou
fora do plano. Os diferentes tipos de vibração são mostrados na Figura 8.
Fonte: PUC- Rio de Janeiro- Certificação digital N ° 0114349 CA
Simétrico
Assimétrico
Deformação Angular
Assimétrico
no plano
Simétrico
fora do
plano
Simétrica
no
plano
Assimétrico
fora do
plano
Estiramento
Figura 8 - Tipos de vibrações
36
Ate a década de 1980, a maioria dos espectrômetros era do tipo dispersivo,
baseados nas redes de difração. Após esse período, esses espectrofotômetros
foram substituídos pelos equipamentos com transformadas de Fourier (FT-IR),
devido à sua velocidade e conveniência (FREITAS, 2009; NASCIMENTO, 2011).
O principio de todo espectro de FT-IR é o interferômetro de Michelson, onde
os espectros são obtidos pelo cálculo da transformada de Fourier do referido
interferograma Um espectrômetro baseado no princípio interferométrico atua em
sistema de mono ou duplo feixe, constituindo-se de uma fonte, um interferômetro,
um compartimento de amostra, um detector e um computador (Figura 9).
Fonte: Helfer et al.2006
A radiação policromática, oriunda da fonte é dividido em duas fontes de
intensidade aproximadamente iguais (fonte fixa e fonte móvel). Assim conforme
Figura 10, o feixe da fonte fixa é refletido pelo espelho fixo, e o feixe da fonte móvel
pelo espelho móvel. Após as reflexões no espelho fixo e espelho móvel, os feixes da
fonte fixa e fontes móveis são recombinados no divisor de feixe, dando origem a um
interferograma. Dessa forma, esse é formado pela soma de todas as ondas de
diferentes amplitudes e frequências que chegam ao interferômetro e possui todas as
informações espectrais da amostra (ALMEIDA, 2009; FREITAS, 2009;
NASCIMENTO, 2011).
Figura 9 - Esquema de um interferômetro de Michelson
37
A relação entre o interferograma e o espectro é dada pela equação1:
(1)
Onde B(ν) é a intensidade do espectro em função da frequência.
Os espectros FT-IR possuem inúmeras vantagens:
Possuem um único componente em movimento, o espelho móvel, que resulta
em medidas com menor desgaste e alta confiabilidade;
Um grande número de amostras podem ser medidas;
Uma única varredura, mesmo em velocidade baixa, dura poucos segundos e
fornece a mesma sensibilidade em relação sinal/ruído, devido o sinal de o
interferograma ser multiplexado;
Quanto maior o número de varreduras maior a relação sinal/ruído;
Os aparelhos com FT-IR possuem uma maior abertura óptica resultando em
sistemas com uma maior entrada de energia quando comparados aos
sistemas dispersivos.
38
2.3.7.2 Análises Térmicas
Segundo a Confederação Internacional de Análise Térmica e Calorimetria
(ICTAC), a definição do termo análise térmica é dado a um grupo de técnicas, onde
a propriedade física de uma substância e/ou seus produtos de reação é medida em
função da temperatura ou tempo, enquanto, a substância é submetida a uma
programação controlada de temperatura (ANTONINO, 2007; GIOLITO, 2003).
Várias são as técnicas termoanalíticas, dentre as mais utilizadas tem-se: a
Termogravimetria e sua Derivada (TG e DTG), Análise Térmica Diferencial (DTA), a
Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC), Detecção de gás desprendido (EGA),
Análise termomecânica (TMA), etc. Essas técnicas permitem ao analista obter
informações sobre variação de massa, estabilidade térmica; água livre e; água
ligada; pureza, ponto de fusão, ponto de ebulição, calores de transição, calores
específicos, diagramas de fase, cinética da reação, estudos de catalisadores,
transições vítreas (GIOLITO, 2003; HATAKEYAMA & QUINN 1994).
Na literatura, encontram-se diversos trabalhos que utilizaram métodos
termoanalíticos para avaliar a estabilidade térmica de nanomateriais e veículos
poliméricos visando o controle de qualidade dos constituintes da formulação (SINHA
et al. 2004; XU& DU, 2003; HASSAN et al. 2012)
2.3.7.2.1 Termogravimetria e Termogravimetria Derivada
A termogravimetria é uma técnica onde a massa é medida como uma função
de temperatura ou tempo, enquanto, a amostra é submetida a um programa de
temperatura e atmosfera controladas (GIOLITO, 2005).
A principal ferramenta de um analisador termogravimétrico é a
termobalança, junto a ela estão acoplados um forno, termopares e um sistema de
fluxo de gás que possibilitam a medição da massa da amostra em função da
temperatura e do tempo (Figura 10) (WENDHOUSEN et al. 2004).
39
Figura 10 - Desenho de um equipamento de termogravimetria
Fonte: WENDHOUSEN et al.2004.
Os fatores que podem influenciar o aspecto das curvas TG, pertencem a
dois grandes grupos (ANTONINO, 2007; GIOLITO, 2003):
Fatores instrumentais - razão de aquecimento e atmosfera do forno,
geometria do suporte de amostras e do forno;
Fatores associados às características da amostra - tamanho de partículas,
quantidade de amostra, solubilidade dos gases liberados na própria amostra, calor
de reação, compactação da amostra, natureza da amostra, condutividade térmica da
amostra.
A termogravimetria derivada é a relação da variação de massa em função da
temperatura ou tempo (dm/dt), equação 2.
Dessa forma, são obtidas curvas que correspondem à primeira derivada da
curva TG, que equivalem a picos que delimitam áreas proporcionais às alterações
de massa sofridas pela amostra.
dm/dt= f (T ou t) (2)
40
Como principais vantagens, a DTG apresenta:
Curvas que indicam temperaturas exatas no inicio e no instante em que a
velocidade máxima de reação é ocorrida;
A visualização de picos agudos para a distinção de uma sucessão de
reações que muitas vezes não são evidenciadas nas curvas TG;
Áreas de picos que correspondem a real perda ou ganho de massa e dessa
forma são utilizadas em determinações quantitativas.
2.3.7.2.2 Análise Térmica Diferencial
A análise térmica diferencial caracteriza-se como uma técnica termoanalítica de
medição contínua entre as temperaturas da amostra e de um material de referência
termicamente inerte (Figura 11). Ambos vão sendo aquecidos ou resfriados em um
forno e registrado a diferença entre a temperatura da referência (Tr) e da amostra
(Ta) em função da temperatura ou do tempo do aquecimento ou resfriamento,
conforme equação 3 (CRAIG & READING, 2007; GIOLITO, 2003)
(Tr – Ta = ΔT), em ritmo linear (dT/dt = Cte) (3)
41
Figura 11 - Esquema da Analise térmica diferencial
Fonte: ANTONINO, 2007
Através desta técnica, podem-se acompanhar os efeitos de calor associados
com alterações físicas ou químicas da amostra, dentre as quais se destacam:
transições de fase (fusão ebulição, sublimação, congelação, inversões de estruturas
cristalinas) e/ou reações (cristalização, desidratação, dissociação, decomposição,
óxido-redução) que são capazes de causar variações de calor. De modo geral, as
transições de fase como desidratações produzem efeitos endotérmicos, por outro
lado às reações de cristalizações, oxidações, algumas reações de decomposição
produzem efeitos exotérmicos (ANTONINO, 2007; GIOLITO, 2003).
42
2.3.7.3 Potencial Zeta
O estado de dispersão de uma suspensão nanométrica pode ser
caracterizado pelo potencial elétrico da superfície das partículas. Em meio aquoso,
as partículas possuem uma carga superficial formando uma camada que difere do
meio dispersante. Quando uma partícula se move (movimento browniano), os íons
dentro do limite (camada de superfície da partícula e do meio dispersante) se
moverão com ela, mas os íons para além do limite não iram se mover com a
partícula. Este limite é chamado de superfície de plano hidrodinâmico de
cisalhamento (MORAES, 2009; PAPINI, 2003). Portanto, o potencial zeta é
calculado pela medida do potencial elétrico aplicado na superfície de cisalhamento
(Figura 12).
Figura 12 - Potencial Zeta
Fonte: Zeta Potential Overview, da empresa Brookhaven Instruments
Dupla camada elétrica
Plano hidrodinâmico de cisalhamento
Partícula com carga negativa
Potencial do meio dispersante
Potencial de superfície da partícula
Potencial Zeta
43
Determina-se o potencial zeta através da mobilidade eletroforética, sendo
também calculado em equipamento de espalhamento de luz, uma vez que a
variação na frequência de luz espalhada equivale à mobilidade eletroforética
(PAPINI, 2003).
2.3.7.4 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
Microscopia eletrônica de transmissão é uma importante ferramenta de
caracterização morfológica de compostos nanométricos. Utiliza-se a MET para a
visualização dessas estruturas com resolução espacial de tamanho entre 2 nm a 1
µm (PAPINI, 2003).
Um microscópio eletrônico de transmissão é composto por: um canhão de
elétrons, lentes condensadoras, lente objetiva, conjunto de lentes intermediarias e
um sistema de detecção (Figura 13).
Fonte: TIZEI, 2008.
Figura 13 - Componentes de um microscópio eletrônico de transmissão (MET)
44
O equipamento é mantido em alto vácuo (10-5 Pa). Além disso, é utilizado
nitrogênio liquido como forma de eliminar possíveis contaminantes que venham
dessorver das amostras (TIZEI, 2008). Assim, a formação da imagem é
acompanhada por um sistema de projeção, aonde uma onda plana de elétrons é
transmitida através de uma coluna composta por lentes eletromagnéticas e
aberturas que direcionam a intensidade e colimação do feixe antes e após o
atravessamento da amostra até atingir o filme fotográfico ou a tela de observação. A
onda resultante da transmissão, responsável pela formação da imagem, encontra-se
na faixa típica de voltagens de aceleração dos elétrons de 100kV-400kV (PAPINI,
2003; TIZEI, 2008).
Neste trabalho, desenvolveu-se uma nanoformulação de quitosana, a qual
foi caracterizada pelas técnicas descritas nesta revisão, voltada para aplicação da
sanidade de peixes de grande importância para o agronegócio da piscicultura.
45
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivos Geral
O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver e caracterizar um sistema
carreador nanoparticulado de quitosana com aplicação voltada para sanidade de
Tambaquis Amazônicos.
3.2 Objetivos específicos
Analisar as características físico-químicas da quitosana (QTS), do
tripolifosfato de sódio (TPP) e do Isotiocianato de fluoresceína (FITC) por
análise térmica e espectrometria na região do infravermelho por
Transformada de Fourier (FT-IR);
Obter os sistemas nanoestruturados de QTS marcados com FITC;
Realizar a caracterização físico-química das nanopartículas de QTS
marcadas com FITC pelo método de gelatinização ionotrópica, através das
análises: termoanalíticas, FT-IR, distribuição do tamanho de partícula, análise
da carga superficial e microscopia eletrônica de transmissão;
Avaliar a biodistribuição das partículas fluorescentes em tecidos de
tambaquis;
Quantificar a fluorescência em tecidos de tambaquis amazônicos.
46
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material
Quitosana obtida da Sigma, Baixo Peso molecular, grau de desacetilação
94,15%
Tripolifosfato de sódio (TPP) SIGMA®
Isoticiocianato de Fluoresceína (FITC) SIGMA®
4.1.1 SOLVENTES E REAGENTES
Ácido acético (Vetec ®)
Metanol desidratado (Merck ®)
Hidróxido de sódio (Vetec ®)
Brometo de Potássio (KBr)(Vetec ®)
4.1.2 EQUIPAMENTOS
Analisador de partículas ZetasizerNano ZS- Malvern e software DTS nano.
Liofilizador FreeZone® 4.5 Liter Freezer Dry Systms – Labconco Corporation
(Kansas City- MO, USA);
Termobalança Shimadzu DTG-60H
Analisador Térmico Shimadzu modelo DSC- 60
Espectrofotômetro na região do infravermelho Perkin Elmer modelo1760 X
FT- IR;
Peagâmetro HANNA ®
Microscópio de fluorescência Axioplan I (Carl Zeiss, Germany) equipado com
filtro BP450-490 e LP515 e câmera AxioCam ERc
Microscópio FEI Tecnai G20
47
4.2 Métodos
4.2.1 MARCAÇÃO DA QUITOSANA COM FITC
Inicialmente, preparou-se uma solução de FITC (100 mg) em 150 mL de
metanol desidratado. Em seguida, esta solução foi adicionada a um volume de 100
mL de solução de quitosana (1%) em ácido acético 0,1M, permanecendo essa
reação em repouso durante 3 horas protegida da luz, tempo necessário para que
ocorra a ligação entre o grupo isotiocianato da fluoresceína e o grupo amino primário
da quitosana.A quitosana marcada com FITC foi então precipitada por elevação do
pH do meio de 8 a 9 com solução de hidróxido de sódio 0,5M. A remoção do
excesso de FITC não conjugada foi retirada através de sucessivos ciclos de lavagem
e centrifugação (40.000g durante 10 min), até que a não fluorescência foi detectada
no sobrenadante por espectrofotometria na faixa do UV-Visível (ƛ exc 490 nm e ƛ
exc 520 nm). A quitosana marcada com FITC (QTS-FITC) foi dissolvida em 80 mL
de uma solução de acido acético 0,1M e colocada em membrana de diálise, para
então, ser dialisada durante três dias em ambiente escuro com uso de 5L de água
destilada substituída diariamente (MA et al. 2003).
4.2.2 PREPARAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS PELO MÉTODO DE
GELATINIZAÇÃO IONOTRÓPICA
As nanopartículas fluorescentes de quitosana reticulada com tripolifosfato de
sódio (NP-FITC) foram preparadas através da metodologia de Calvo et al (1997)
com adaptações. Uma solução de 2 mL de TPP (0,1% em hidróxido de sódio a
0,05M) foi gotejada em 4 mL de uma solução de QTS-FITC (0,2% em 0,25% de
ácido acético) sob agitação magnética (SARMENTO et al. 2006). A solução final foi
congelada para posterior liofilização das NP-FITC.
48
4.2.3 CARACTERIZAÇÃO E ANÁLISE FÍSICO-QUÍMICA DA QTS, FITC, TPP E
DAS NP- FITC
4.2.3.1 Espectroscopia na região do Infravermelho por Transformada de Fourier
(FT-IR)
Os espectros de infravermelho foram obtidos a partir das amostras de QTS,
FITC, TPP e NP-FITC, que foram misturadas com Brometo de Potássio (KBr) e
prensadas em alta pressão para a formação das pastilhas. Os espectros foram
obtidos através do registro de 128 varreduras de 400 a 4000 cm-1, com resolução de
2 cm-1 (VIMAL et al. 2012)
4.2.3.2 Análise térmica: termogravimetria e análise térmica diferencial
As amostras de QTS, FITC, TPP e NP-FITC foram submetidas aos ensaios
térmicos TG-DTG e DTA em termobalança Shimadzu DTG 60H. Uma quantidade de
4mg de cada amostra foi colocada em cadinho de alumina, sob as seguintes
condições termoanalíticas: razão de aquecimento de 5°C/min, 10°C/min e 15°C/min;
atmosfera dinâmica de nitrogênio (fluxo de 50mL/min); e intervalo de temperatura
entre 25 a 600°C (CHAVES et al. 2009 ; SARMENTO et al. 2006).
4.2.3.3 Medidas de tamanho (diâmetro médio), e polidispersividade
A técnica de espalhamento dinâmico da Luz “Dynamic light scattering”
(DLS), foi utilizado para determinação do tamanho médio das partículas (diâmetro
49
hidrodinâmico) e índice de polidispersão (PDI) (MENDES, 2013; SILVA, 2010;
TRIERWEILER, 2009).
O índice de polidispersão fornece informações sobre a homogeneidade
distribuição dos tamanhos das partículas. A Tabela 2 a seguir mostra os valores de
referência para PDI.
Tabela 2 - Valores de referência para PDI
Fonte: COSTA, 2012
As NP-FITC foram dispersas em água de um afluente do rio Amazonas,
previamente filtrada em um sistema PELLICON (Millipore Co. Billerica, MA) com
membrana 0,1 micron PVDF. As análises foram determinadas diluindo (1/10 v/v) das
suspensões de nanopartículas. O diâmetro médio e a polidispersividade das NP-
FITC foram determinados em triplicata no equipamento Zetasizer Nano ZS (Malvern
Instruments Limited- Worcestershire, UK) e os resultados foram obtidos em
nanômetros para as medidas em tamanho médio (SILVA, 2010).
4.2.3.4 Medidas de carga superficial (potencial zeta)
As NP-FITC foram dispersas em água de um afluente do rio Amazonas,
previamente filtrada em um sistema PELLICON (Millipore Co. Billerica, MA) com
PDI CARACTERISTICAS
0,00 a 0,05 Usual e somente para medidas encontradas para padrão de látex e/ou
partículas produzidas e classificadas como monodispersas
0,05 a 0,08 Amostra quase monodispersa
0,08 a 0,7 Faixa de polidispersividade média
0,7
Amostra muito polidispersa: Toma-se cautela na interpretação dos resultados,
pois amostra pode não ser adequada para a técnica de DLS, como por
exemplo, deve haver quantidade significativa de partículas maiores.
50
membrana 0,1 micron PVDF. As análises foram determinadas diluindo (1/10 v/v) das
suspensões de nanopartículas. A carga superficial das NP-FITC foi determinada em
triplicata no equipamento Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Limited-
Worcestershire, UK) e os resultados foram obtidos em mV (SILVA, 2010).
4.2.3.5 Microscopia eletrônica de Transmissão (MET)
A microscopia eletrônica de transmissão foi realizada para verificar a forma e
homogeneidade das NP-FICT, no microscópio FEI Tecnai G20, com fonte de 200
kV. Grades de cobre aderidas a um filme de formivar (0,5 %) foram previamente
metalizadas com ouro. A suspensão das NP-FITC foi sonicada por 5 minutos, para
melhorar dispersão e evitar a sua aglomeração. Em seguida, uma gota da
suspensão foi adicionada sobre a grade de cobre por 30 segundos, retirando-se, o
excesso com papel-filtro para então ser adicionada uma gota da solução de ácido
fosfotúngstico (PTA) a 2% como contraste (como excesso também retirado com
papel-filtro) (MOURA, 2008).
4.2.4 TAMBAQUIS
Foram utilizados para realização desse estudo 40 alevinos de tambaquis
advindos da região de Santarém/PA, conforme autorização do IBAMA n° 27119-1,
emitida em 25 de fevereiro de 2011 (Anexo 1).
51
4.2.4.1 Exposição dos tambaquis amazônicos aos banhos contendo NP-FITC
O estudo foi realizado na Estação de Piscicultura da Embrapa Amazônia
Oriental, localizada no parque ambiental do Utinga no Estado do Pará durante o mês
de janeiro de 2012. Foram utilizados alevinos de Tambaqui (Colossoma
macropomum) previamente submetidos à biometria (± 5 cm). Os tambaquis foram
aclimatados em tanques de polietileno com volume de 20L por um período de 72
horas, antes da exposição aos banhos contendo NP-FITC.
Os tambaquis foram divididos em quatro grupos, contendo sete alevinos,
em tanques de polietileno com volume fixo de 500 mL. Os grupos foram identificados
de acordo com os diferentes períodos de exposição dos tambaquis frente aos
banhos de NP-FITC nos tempos de 30, 60 e 90 minutos e o grupo controle.
As NP-FITC (0,2 g) foram ressuspensas em 30 mL de água do Lago
Bolonha e Água Preta (afluentes do rio Amazonas). Os parâmetros físico-químicos
das unidades experimentais, como temperatura, pH, oxigênio dissolvido,
condutividade elétrica e transparência da água foram monitorados. As partículas
ressuspendidas foram então expostas aos diferentes grupos de banho de
tambaquis. Após cada período de exposição, os peixes de cada grupo foram
transferidos vivos em sacos plásticos contendo oxigênio para o Laboratório de
Histologia da Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA).
4.2.4.2 Avaliação da biodistribuição de nanopartículas mucoadesivas em tecidos de
tambaquis amazônicos
A preparação histológica foi realizada no Laboratório de Pesquisa Carlos
Azevedo/UFRA, sob a coordenação do Dr. Edilson Rodrigues Matos. Os tambaquis
foram submetidos à analgesia com água gelada, e em seguida, eutanasiados
através da secção da medula espinhal após o período de 3,5 horas de manutenção
dos peixes em água livre de NP-FITC. A necropsia foi realizada com remoção dos
arcos branquiais, pele, estômago e segmento inicial de intestino delgado com
52
fixação dos materiais em solução de formalina tamponada a 10% para posterior
processamento histológico. Os tecidos de cada órgão foram processados em
parafina e submetidos a cortes utilizando o micrótomo rotativo. Os cortes
histológicos de ± 6 cm de espessura foram dispostos em lâminas de vidro e
encaminhados à microscopia de fluorescência do Laboratório de Microscopia de
Cultivo Celular da UFPA, a fim de verificar a presença das nanopartículas
mucoadesivas de quitosana aderidas aos tecidos de tambaquis dos órgãos
analisados.
A intensidade de fluorescência foi determinada com auxílio do programa
Image J conforme metodologia descrita por Burgess et al (2010).
4.2.4.3 Estatística
Toda estatística foi realizada com o auxílio do programa Bioestatic 5.0,
utilizando Análise de Variância Kruska-Walis a partir da comparação entre as médias
pelo método de Dunn.
53
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Síntese de nanopartículas fluorescentes por Gelatinização Ionotrópica
A quitosana é um polímero que apresenta a característica de um polieletrólito
positivo quando em solução, devido à grande quantidade de grupos aminos
presentes ao longo da cadeia polimérica. A marcação QTS-FITC foi realizada a partir
da reação entre o grupo amino primário da quitosana e o grupamento isotiocianato
do TPP e observou-se que após os sucessivos ciclos de lavagem e centrifugação,
foi detectada ausência de fluorescência no sobrenadante por uv-vis. O que significa
que o processo de diálise, o qual fora submetido às nanopartículas removeu o
excesso de FITC não conjugada.
Segundo Calvo et al (1997), a formação das nanopartículas após adição da
solução de QTS-FITC com a solução de TPP foi resultante das ligações
intermoleculares que ocorreram entre o grupamento amino da quitosana e grupo
fosfato do TPP, observando-se um composto de aspecto levemente turvo, e com pH
final de síntese corrigido para 6,6. O pH foi corrigido para tal valor, devido ser o pH
das águas dos lagos Bolonha e Água Preta, no qual as partículas foram
ressuspendidas para realização dos banhos e posterior avaliação de biodistribuição
das mesmas em alevinos tambaquis.
54
5.2 Espectroscopia na região do Infravermelho por Transformada de Fourier
(FT-IR)
A técnica da espectroscopia do infravermelho objetiva a identificação dos
grupos funcionais característicos dos compostos. Para analisar a formação de
nanopartículas fluorescentes, os espectros de infravermelho (FT-IR) da QTS, FITC,
TPP e das NP-FITC foram analisados (Figura 14). A Tabela 3 registra as principais
bandas que confirmam a formação de NP-FITC.
Na Figura 14A, uma pequena banda que aparece em 2880 cm–1 é
decorrente do estiramento dos grupos -CH2 presentes no polímero quitosana
(CHAVES et al. 2009). O pico em 662,18 cm-1 refere-se às vibrações dos anéis
piranosídicos da quitosana (AOUADA, 2009).
Outras bandas também são evidenciadas em 3434 cm–1, que caracterizam o
estiramento axial de -OH e NH2 , comumente estudado em quitosana pura (CHAVES
et al. 2009; QI, 2004; XU et al. 2003). Porém, quando comparado com o espectro de
nanopartículas fluorescentes (Figura14D), percebe-se um deslocamento da banda
de 3434 para 3400 cm–1, resultado também verificado por Xu et al (2003) em seu
trabalho com nanopartículas de quitosana preparadas por reticulação iônica. Esse
dado corresponde à ligação de hidrogênio aumentada, resultando em um pico em
3400 cm–1 mais largo.
Para a quitosana, uma banda próxima a 1651 cm–1 pode ser atribuída ao
estiramento da ligação C=O de amina I (AOUADA, 2009; CHAVES et al. 2009), uma
vez que a estrutura polimérica sempre apresentará quantidades de quitina ainda
associadas justificando a presença dos grupos carbonilas verificadas no espectro. O
pico próximo a 1594 cm–1 refere-se às deformações relacionadas às ligações dos
grupos NH2 e C–N, características do grupo amino (CHAVES et al. 2009). Logo,
observou-se que as bandas em 1651 cm –1 e1594 cm –1 de quitosana foram
modificadas respectivamente para 1634,53 cm–1 e 1538,20 cm–1 em NP-FITC
(Figura 14D).
Pode-se observar através da análise da Figura 14D, que houve reticulação
com o TPP pelo aparecimento de um pico em 1154 cm -1 característico da
deformação do éster fosfato (PAVIA et al. 2001; SILVERSTEIN et al. 2007) desta
forma, há formação de nanopartículas de quitosana reticuladas com TPP.
55
Visualiza-se ainda na Figura 14D que o espectro 1634 cm-1 de amina das
nanopartículas é diminuído quando comparado com a quitosana pura em 1651 cm-1,
resultado próximo ao encontrado por Campos e colaboradores (2004). Significa que
a reação entre o grupo ácido da fluoresceína e grupamento amino quitosana
resultou na formação de nanopartículas fluorescentes com um menor número de
grupos amino livres.
Tabela 3 - Principais bandas de Infravermelho (cm-1) da quitosana e nanopartículas fluorescentes
Figura 14 - Espectros de FT-IR das Quitosana (A); TPP(B); FITC (C); NP-FITC (D)
Possíveis atribuições Quitosana Pura ( cm
-1)
NP-FITC ( cm
-1)
Estiramento ligação O-H e NH2 3434 3400
Estiramento CH2 2880 2920
Estiramento C=O de Amina I 1651 1634
Deformações NH2 e C-N 1594 1538
Estiramento C-O 1076 1383
Vibrações de Anéis Piranosídicos 662 -
Deformação P=O - 1154
56
5.3 Análises Térmicas
Técnicas termoanalíticas são amplamente empregadas para caracterização
e controle de qualidade de formulações farmacêuticas (NETO, 2005; RAO, 2008,
ARORA et al. 2011). Assim este estudo fez uso das técnicas termoanalíticas de TG,
DTG e DTA para verificar a estabilidade térmica e comportamento de pirólise da
QTS, TPP, FITC NP-FITC em diferentes razões de aquecimento de 5, 10 e
15°C/min.
5.3.1 QUITOSANA
As Figuras 15 e 16 ilustram os eventos de termodecomposição da quitosana.
A tabela 4 registra o efeito do calor em função das razões de aquecimento testadas.
Foi observado que as formas das curvas de degradação térmica foram bastante
semelhantes, mudando apenas quando o polímero foi submetido na razão de
aquecimento de 10°C/min, Isto é devido ao atraso de transferência de calor com o
aumento da taxa de aquecimento (ARORA et al. 2011).
Nas duas primeiras razões de aquecimento houve dois eventos de perda de
massa. Na razão de 5° C/min, o primeiro evento de perda de massa ocorreu no
intervalo de 39°C a 87ºC, com perda de aproximadamente 12% e o segundo evento
entre as temperaturas de 279°C a 336°C, perda de massa de 53%. Na razão de
aquecimento de 10°C/min, foi possível observar dois eventos térmicos, o primeiro
evento ocorre entre 45°C e 89°C com perda de massa de 14% e o segundo no
intervalo de 28°C e 339°C, com perda de 55%. Em contrapartida, para a razão de
aquecimento de 15°C/min, três eventos termoanalíticos foram observados. O
primeiro entre as temperaturas de 35ºC e 95°C e perda de massa de 14%, o
segundo no intervalo de 279°C e 329°C e perda de massa de 51% e o terceiro
evento térmico entre 509°C e 592°C com perda de 33%.
57
A decomposição da quitosana ocorreu em passo único, como confirmado
pelas curvas DTG (Figura 16). A decomposição principal da quitosana ocorreu em
torno de 300°C.
O primeiro processo de decomposição de quitosana ocorreu em média de
39°C, e é confirmado por eventos endotérmicos (Figura 17). A literatura relata que
isso corresponde à evaporação da água, ou seja, a eliminação da água fisicamente
adsorvida e/ou fracamente ligada às moléculas de quitosana. O segundo evento que
iniciou em media de 279°C correspondeu à reação de despolimerização do polímero
através da decomposição dos anéis de piranose (processo de desidratação e
desaminação) (ARORA et al. 2011; AOUADA, 2009; DAMIAN, 2005).
Na razão de 10°C/min, evidenciou-se o terceiro evento térmico, marcado por
efeito exotérmico em 565°C que foi atribuído a cisão da junção C-O-C do polímero e
separação dos grupos acetila. A pirólise do polissacarídeo inicia-se pela perda de
ligações glicosídicas que leva a decomposição e formação de ácido acético butírico
e outros ácidos de cadeias C2, C3 e C6 (HASSAN et al. 2011; NETO, 2005).
Dessa forma a análise termogravimétrica permitiu concluir que a quitosana
estudada é termicamente estável até 279ºC em atmosfera de nitrogênio.
Figura 15 - Curvas TG de QTS obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com as razões de aquecimento de 5°C,10°C e 15°C/min
58
Figura 16 - Curvas DTG de QTS obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com as razões de aquecimento de 5°C,10°C e 15°C/min
Figura 17 - Curvas DTA de QTS obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com as razões de aquecimento de 5°C,10°C e
15°C/min
59
Tabela 4 - O efeito do calor, durante a degradação térmica de quitosana nas razões de 5, 10 e
15ºC/min
Razão de aquecimento
(°C/min)
1° estágio (°C)/Perda de massa
(%)
Pico Temp. (°C)/Efeito
térmico
2° estágio (°C)/Perda de massa
(%)
Pico Temp. (°C)/ Efeito
térmico
3° estágio (°C)/Perda
de massa(%)
Pico Temp. (°C)/Efeito
térmico
5 39-87 (12) 63 (endo) 279-336 (53) 307 (exo) 403(exo)
- -
10 45-89 (14) 69 (endo) 147 (exo)
268 (endo) 280-339 (55)
307 (exo) 350 (exo) 456 (exo)
556(endo) 571 (exo)
- -
15 35-95 (14) 72 (endo) 279-329 (51)
247(endo) 315 (exo) 380 (exo)
509-592 (33) 565 (exo)
60
5.3.2 TRIPOLIFOSFATO DE SÓDIO E ISOTIOCIANATO DE FLUORESCEÍNA
As Figuras 18 e 19 ilustram os eventos de termodecomposição do TPP e
FITC, respectivamente, para a razão de aquecimento de 10°C/min.
Observou-se que o TPP apresentou cinco eventos térmicos (Figura 18). O
primeiro evento ocorre entre 38°C e 56°C com perda de massa de 0,478%; segundo
no intervalo de 77°C e 94°C, com perda de 0,542%; o terceiro entre as temperaturas
de 172°C e 138°C com perda de massa de 0,797%; o quarto evento entre 176°C e
201°C com perda de 0,462% e o quinto evento foi entre 220°C e 369°C com perda
de massa de 1,212%. Dessa forma, a primeira etapa de degradação correspondeu a
uma perda aproximadamente 0,5 mols de água por mol de Na4HP3OI.H20. As perdas
posteriores e reduzidas de massa foram devido à superfície de área reduzida do sal
(MARIJUAN et al. 2013).
O FITC também apresentou cinco eventos térmicos (Figura 19). O primeiro
evento ocorreu entre 27°C e 51°C com perda de massa de 2,38%; o segundo no
intervalo de 79°C e 116°C, com perda de 2,52%; o terceiro entre as temperaturas de
173°C e 195°C com perda de massa de 0,3%; o quarto evento entre 244°C e 197°C
com perda de 0,44% e o quinto evento foi entre 438°C e 528°C com perda de massa
de 1,67%, com estágios de perda de massa marcados pela perda e água do
material.
Figura 18 - Curvas TG-DTG e DTA do TPP obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) na razão de aquecimento de 10°C/min.
61
5.3.3 NANOPARTÍCULAS FLUORESCENTES
As NP-FITC também foram identificadas através das análises térmicas como
mostra as Figuras 20, 21 e 22. A tabela 5 registra o efeito do calor em função das
razões de aquecimento testadas. Durante os estudos de termodegradação (Figuras
20 e 21) as duas primeiras razões de aquecimento testadas apresentaram quatro
eventos de perda de massa. A razão de aquecimento de 5°C/min apresentou quatro
eventos de perda de massa: o primeiro evento ocorreu no intervalo de 41°C a 61ºC,
com perda de aproximadamente 29%; segundo evento entre as temperaturas de
115°C a 162°C, com perda de massa de 6,71%; o terceiro no intervalo de 223°C a
276°C com perda de 12% e o quarto evento entre as temperaturas de 317°C e
369°C com perda de massa de 14%. Na razão de aquecimento de 10°C/min o
primeiro evento ocorreu entre 52 °C a 70°C com perda de massa de 29%; o segundo
no intervalo de 121°C e 164°C, com perda de 6%; o terceiro no intervalo de 237°C a
285°C com perda de 12% e o quarto evento de perda de massa entre 345°C a
409°C, com perda de massa de 13%.
Em contrapartida, são visualizados na razão de aquecimento de 15°C/min,
três eventos termoanalíticos de perda de massa. O primeiro entre as temperaturas
Figura 19 - Curvas TG –DTG e DTA de FITC obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) na razão de aquecimento de 10°C/min
62
de 35ºC a 71°C com perda de massa de 30%, o segundo no intervalo de 126°C a
172°C e perda de massa de 6% e o terceiro evento térmico entre 239°C a 383°C
com perda de 28%.
Foram obtidos os termogramas das nanopartículas de quitosana por análise
térmica diferencial os quais estão ilustrados na Figura 22. A razão de 5°C/min
mostrou dois efeitos endotérmicos, o primeiro em 56°C e o segundo em 296°C,
seguido por um pico exotérmico em 324°C. Na razão de 10°C/min foi possível
identificar oito efeitos térmicos. Um endotérmico em 62°C, seguido por sete
exotérmicos: o primeiro em 103°C, seguidos em 322°C, 327°C, 565°C, 576°C,
583°C e 590°C. Para a razão de 15°C/ min, foram obtidos três efeitos térmicos, os
dois primeiros foram endotérmicos com picos em 60°C e 300°C, seguido por um
exotérmico em 344°C.
O maior número de eventos térmicos de perda de massa foi verificado nas
NP-FITC. Isso se atribui a presença de compostos higroscópicos como o TPP e o
FITC, mantendo-se dessa forma maior quantidade de nível de água no material,
comprometendo a estabilidade do sistema. Outra explicação para a menor
estabilidade das NP-FITC deve-se ser fundamentada na neutralização dos grupos
amino da quitosana pelos grupos aniônicos do FITC e TPP. Conforme estudo de
Sinha et al (2004), na qual utilizaram micropartículas de quitosana preparadas em
meio acido e reticuladas com sulfato de sódio, a instabilidade da formulação deveu-
se a neutralização de grupos aminos carregados positivamente da quitosana pelo
sulfato de sódio.
63
Figura 20 - Curvas TG de NP-FITC obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com as razões de aquecimento de 5°C,10°C e 15°C/min
Figura 21 - Curvas DTG de NP-FITC obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com as razões de aquecimento de 5°C,10°C e 15°C/min
64
Figura 22 - Curvas DTA de NP-FITC obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com as razões de aquecimento de 5°C,10°C e 15°C/min
65
Tabela 5 - O efeito do calor, durante a degradação térmica de NP-FITC nas razões de 5, 10 e
15ºC/min
Razão de
aquecimento (°C/min)
1° estágio
(°C)/ Perda
de massa
(%)
Pico Temp. (°C)/
Efeito térmico
2° estágio
(°C) /Perda
de massa
(%)
Pico Temp. (°C)/
Efeito térmico
3° estágio
(°C)/ Perda
de massa(%)
Pico
Temp. (°C)/
Efeito térmico
4° estágio (°C)/
Perda de
massa(%)
Pico
Temp. (°C)/
Efeito térmico
5 41-61 (29)
56 (endo)
115-162 (6)
296 (endo)
223-276 (12)
317-369
(14)
324 (exo)
10 52-70 (29)
62 (endo) 103 (exo)
121-164 (6)
- 237-285
(12)
322 (exo)
327 (exo)
345-409 (13)
565 (exo)
576 (exo)
590 (exo)
15 35-71 (30)
60 (endo) 126-172
(6) -
239-383(28) 300
(endo) 344 (exo)
- -
66
5.4 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
As nanopartículas em suspensão após a síntese de preparação por
gelatinização ionotrópica foram analisadas pelas imagens de MET e apresentaram
formato esférico com discretos pontos de agregação e distribuição de tamanho de
partículas de 107 nm como apresentado na Figura 23.
Conforme Schaffazick & Guterres et al (2003), nanopartículas podem ser
geradas com diâmetros médio de 1 a 300 nm, este resultado vai depender sobretudo
da escolha do material polimérico e do método de obtenção a ser empregado.
Figura 23- Micrografia de MET de nanopartículas fluorescentes de quitosana; aumento 35.000x
67
5.5 Análise doTamanho e Polidispersividade das NP-FITC
A análise do tamanho e da polidispersividade das NP-FITC realizada no
aparelho Zeta Size Nano mediu o raio hidrodinâmico do material nanoparticulado em
suspensão na água do rio Amazonas e revelou diâmetro da partícula em suspensão
de 211,1 nm (Figura 24).
Segundo Costa (2012), esta técnica baseia-se no movimento aleatório das
partículas sob o impacto das moléculas do solvente sobre a sua superfície. Desta
forma, pode-se inferir que a medida de tamanho das NP-FITC ressuspendidas na
água do rio Amazonas mostrou-se alterada daquela visualizada na imagem da MET
(Figura 23) passando de 107 nm para 211,1 nm. Este fato é justificado pela
formação de pequenos pontos de agregação oriundos da ressuspensão das
partículas na água do rio e pela sua discreta polidispersão (PDI = 0,34), classificada
na faixa de polidispersão média (Tabela 2).
Figura 24 - Distribuição do tamanho médio de nanopartículas fluorescentes em
função dos percentuais acumulativo e da intensidade.
Fonte: Aparelho Zeta size nano (Malven Instruments)
Tamanho de partícula (nm)
68
5.6 Análise da Carga Superficial das Nanopartículas
As NP-FITC, apresentaram potencial zeta positivo de + 32,51 mV ± 0,8 mV
em pH 6,6 da água do rio. Dessa forma, ressalta-se que apesar da formulação ter
apresentado polidispersividade média (PDI =0,34), o potencial zeta maior que 30 mV
confere estabilidade a formulação e menor tendência a agregação das partículas
(TRIERWEILER, 2009). Os autores Schaffazick & Guterres (2003), afirmam que uma
boa estabilidade físico–química de suspensões coloidais é alcançada com valores
de potencial zeta relativamente altos, devido às forças repulsivas que tendem evitar
a agregação em função das colisões ocasionais de nanopartículas adjacentes,
dessa forma, a repulsão eletrostática gerada evita a aglomeração e agregação.
Além disso, o potencial zeta é medido para determinar a propriedade
mucoadesiva das partículas (HE et al. 1998).Nanopartículas com cargas positivas na
sua superfície são capazes de se aderir à mucosa e abrir de forma transitória as
junções apertadas entre as células epiteliais adjacentes, de modo a favorecer a
absorção do principio ativo (FANGUEIRO, 2012).
O muco é formado em sua grande maioria por glicoproteínas (mucina),
lipídios, eletrólitos e água (BRAVO-OSUNA et al. 2007; HE et al. 1998). Ressalta-se
que para esse estudo a propriedade mucoadesiva destas nanopartículas, é uma
característica que favorece a interação com os grupos aniônicos da mucina, logo, há
formação de uma dupla camada de carga elétrica na interface polímero-mucina
(WATTANAKORN et al. 2010) que foi frequentemente encontrada nos tecidos dos
peixes analisados.
69
5.7 Ensaio de NP-FITC em tecido de tambaquis
5.7.1 ANÁLISE DA QUALIDADE DE ÁGUA DO TANQUE DOS TAMBAQUIS
Os parâmetros limnológicos que determinam a qualidade da água como: pH,
temperatura da água, condutividade elétrica, oxigênio dissolvido e transparência de
água estão descritos na Tabela 6.
Tabela 6 - Valores médios e desvio padrão dos parâmetros de qualidade da água do tanque de
tambaquis
Parâmetro observado Variação
pH 6,65 ± 0,049
Temperatura (°C) 30°C
Condutividade elétrica (µS/cm2) 29,86 ± 0,60
Oxigênio Dissolvido (mg/L) 6,35 ± 0,049
Transparência em disco de Secchi 2m e 20 cm
A avaliação de qualidade da água é um item muito importante para a criação
dos animais em qualquer fase do crescimento (TAVARES-DIAS, 2009). Todas as
variáveis analisadas no experimento apresentaram-se relacionadas com o nível
hidrológico em faixas consideradas toleráveis às populações ícticas. Os valores de
qualidade de água encontrados nos tanques conferem com a maioria dos trabalhos
encontrados para padrão de qualidade da água necessário à criação de tambaquis
(BRASIL, 2000; TAVARES-DIAS, 2009).
70
5.7.2 AVALIAÇÃO DA BIODISTRIBUIÇÃO DA FLUORESCÊNCIA EM TECIDOS
DE TAMBAQUIS
As análises da quantificação de fluorescência foram realizadas através das
micrografias das seguintes secções de: brânquias (Figuras 25A, 25B, 25C e 25D),
pele (26A, 26B, 26C e 26D), estômago (Figuras 27A , 27B, 27C e 27D) e segmentos
iniciais de intestino delgado (Figuras. 28A, 28B, 28C e 28D). As setas nas
respectivas figuras sinalizam os pontos de fluorescência ao longo dos tecidos
analisados.
Figura 25C - Seção transversal de brânquias de tambaquis submetido a banho de 60 minutos de NP-FITC; objetiva 10X.
Figura 25D - Seção transversal de brânquias de tambaquis submetido a banho de 90 minutos de NP-FITC; objetiva 10X.
Figura 25A- Seção longitudinal de filamento branquial de tambaquis, grupo controle; objetiva 10 X
Figura 25B - Seção transversal de brânquias de tambaquis submetido a banho de 30 minutos de NP-FITC; objetiva 10X.
71
Figura 26B - Seção transversal de pele de tambaquis submetido a banho de 30 minutos de NP-FITC; objetiva 10 X.
Figura 26A- Seção longitudinal de pele de tambaquis, grupo controle; objetiva 10 X.
Figura 26C- Seção Transversal de pele de tambaquis submetido a banho de 60 minutos de NP-FITC; objetiva 10 X.
Figura 26D - Seção Transversal de pele de tambaquis submetido a banho de 90 minutos de NP-FITC; objetiva 10 X.
72
Figura 27A- Seção longitudinal de estômago de tambaquis, grupo controle; objetiva 10X
Figura 27B- Seção transversal de estômago de tambaquis submetido a banho de 30 minutos de NP-FITC; objetiva 10X.
Figura 27C- Seção transversal de estômago de tambaquis submetido a banho de 60 minutos de NP-FITC; objetiva 10 X.
Figura 27D - Seção transversal de estômago de tambaquis submetido a banho de 90 minutos de NP-FITC; objetiva 10 X.
73
Em todos os tecidos avaliados fo
Figura 28B- Seção transversal de intestino de tambaquis submetido a banho de 30 minutos de NP-FITC; objetiva 10 X
Figura 28A - Seção longitudinal de intestino de tambaquis, grupo controle; objetiva 10X.
Figura 28C- Seção transversal de intestino de tambaquis submetido a banho de 60 minutos de NP-FITC; objetiva 10X.
Figura 28D- Seção transversal de intestino de tambaquis submetido a banho de 90 minutos de NP-FITC; objetiva 10X
74
Em todos os tecidos avaliados foi identificada a presença de nanopartículas
com grande intensidade de fluorescência, mesmo após três horas e meia, relativa
manutenção dos peixes em água livre de NP-FITC (p<0,05).
As médias da quantificação das áreas de fluorescência dos tecidos
analisados e seus respectivos erros padrão estão demonstrados na tabela 7.
A diferença de comportamento de fluorecência entre brânquias e demais
tecidos pode ser atribuída ao fato da camada de muco na brânquia ser mais delgada
quando comparada aos demais tecidos (DICKERSON, 2006). Por sua vez, a
tendência redução da fluorescencia no tempo 90' do tecido estomacal é coincidente
com o aumento de fluorescencia na porção inicial do intestino, que pode estar
associado ao esvaziamento do estômago e uma baixa retenção de nanopartículas
nesse tecido, devido a diminuição da carga superficial da mucina e de ácido siálico
ionizada em pH inferiores 5.5 (HE et al.1998).
De acordo estes resultados, nanopartículas de quitosana apresentam grande
potencial como nanocarreadores de medicamentos e antígenos vacinais para
piscicultura, em especial, porque peixes doentes, parasitados ou sob efeito de
estresse aumentam drasticamente a produção de muco, direcionando a retenção de
princípios ativos nos peixes doentes. Seu uso na forma de uma dispersão em água,
como realizada nesse experimento, configura uma nova abordagem terapêutica na
piscicultura uma vez as formas tradicionais de uso de medicamentos são limitadas
devido aos custos da mão de obra de aplicação, estresse de tratamento, tempo de
exposição ao princípio ativo etamanho dos peixes (BURKA et al. 1997; ESTEBAN,
2012).
75
Tabela 7 - Intensidade de fluorescência de brânquias, pele, estômago e porções iniciais de intestino de alevinos de tambaqui expostos a 0,1 g/L de NFQ nos tempos (0- controle negativo, 30 60 e 90
minutos).
Tecido
Intensidade de Fluorescencia ± EP (pixel/area)*
0' (control) 30' 60' 90'
Brânquias 5632,8 ± 1375,5 a
59367.5 ± 11.816.9 b
18806,3 ± 3291,5 b
187213,7 ± 39007,6
b
Pele 16019,1 ± 1947,6 a
61512,4 ± 8141,7 b
99181,2 ± 9353,3 bc
147295,6 ± 18604,9
c
Estômago 2790,6 ± 578,2 a
51882,1 ± 6472,1 b
202290,2 ± 31066,9
c
91457,5 ± 14637,2
bc
Intestino 11840,9 ± 865,2 a
59097,2 ± 4699,5 b
83123,9 ± 4292,0 b
292691,7 ± 29609,5
c
*Letras distintas na mesma linha diferem entre si (p<0,05) pelo método de Dunn.
76
6. CONCLUSÕES
Nanopartículas fluorescentes de quitosana reticuladas com tripolifostado
de sódio obtidas neste trabalho apresentaram os grupos funcionais referentes
à deformação do éster fosfato característico da reticulação da quitosana com
o TPP e diminuição do espectro amino para 1154 cm-1. O resultado foi à
formação de nanopartículas fluorescentes com um menor número de grupos
amino livres.
Nas diferentes razões de aquecimento investigadas para quitosana pura
as curvas de termodecomposição revelaram perfil térmico semelhante, com
decomposição do material em torno de 300°C. As NP-FITC apresentaram-se
termicamente menos estáveis, devido à neutralização de grupos aminos
positivos com os grupos fosfóricos aniônicos do TPP.
Quanto ao tamanho e carga superficial, as NP- FITC revelaram valores de
211,1nm quando ressuspensas na água do rio Amazonas e carga catiônica
de + 32,51 mV ± 0,8 mV em pH 6,6.
Em todos os tecidos avaliados foi identificada a presença das
nanopartículas com grande intensidade de fluorescência, com diferença
estatística de fluorescência entre brânquias e demais tecidos, que pode ser
atribuída à camada de muco na brânquia por ser mais delgada quando
comparada os demais tecidos.
Observou-se que a redução da fluorescência no tempo 90' do tecido
estomacal coincidiu com o aumento da fluorescência na porção inicial do
intestino, associado ao esvaziamento do estômago.
Compreende-se que mais pesquisas serão necessárias para plataforma
de desenvolvimento de nanopartículas mucoadesivas de quitosana como
“drug delivery” de fármacos e antígenos vacinais na piscicultura comercial,
que promoverá uma aplicação mais efetiva, racional e sustentável destes
sistemas gerando uma maior rentabilidade no agronégocio.
77
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APÊNDICE A – PRODUÇÃO CIENTÍFICA Publicação em anais e participação em congresso Ana Carolina da Silva Costa, Alexandra Regina Bentes de Sousa, Eraldo José M.
Tavares, Humberto de Mello Brandão, Edilson Rodrigues Matos, Marly Fátima C.
Melo ; João de Jesus Viana Pinheiro, José Otávio Carrera Silva Junior , Roseane
Maria Ribeiro Costa. Avaliação da biodistribuição de nanopartículas
mucoadesivas em brânquias de Tambaquis Amazônicos. VI Workshop da Rede
de Nanotecnologia Aplicada ao Agronegócio no Fortaleza/CE. (EMBRAPA), 2012,
90
ANEXOS
