MYELODYSPLASTIC SYNDROMES: NOVELTIES IN THE …bulgarian-hematology.com/documents_hematology/hematology 1-2-2… · intimate pathogenesis and pathophysiology of MDS. The introduction

Клин. трансфуз. хематол., XLVI, 2010, № 1-2 3

МИЕЛОДИСПЛАСТИЧНИ СИНДРОМИ: НОВОСТИ В КЛАСИФИКАЦИЯТА И ЛЕЧЕНИЕТО

Л. Герчева Клиника по хематология, УМБАЛ „Св. Марина” – Варна

MYELODYSPLASTIC SYNDROMES: NOVELTIES IN THE CLASSIFICATION AND TREATMENT

L. Gercheva Clinic of Hematology, UMHAT “Sv. Marina” – Varna

Резюме. Миелодисплaстичните синдроми (МДС) са група трудно лечими заболявания, познанието ни, за които се обогати през последните години. Френско-американско-британската класификация (FAB) беше постепенно изместена от тази на СЗО, последно обновена в края на 2008 г. Вече задължител-но при поставянето на диагнозата се ползва международната прогностична скала (IPSS), чрез която се определя вероятността за и очакваното време до прогресия в остра миелоидна левкемия. Откри-ват се нови молекулярно-биологични промени, разкриващи интимната патогенеза и патофизиология при МДС. Успех в лечението се постигна с въвеждането на 5-azacitidine, decitabine и lendlidomide, кои-то подобряват цитопенията и удължават живота на пациентите.

Ключови думи:

Summary. Myelodysplastic syndromes are difficult to treat diseases. Our understanding for them was enriched in the last few years. French-American-British (FAB) classification that has been used for many years was replaced by WHO classification, last updated at the end of 2008. It is obligatory now to use International Prognostic Scoring System (IPSS) at the time of diagnosis with the help of which the possibility for and the time of progression toward acute myeloid leukemia are strictly defined. New molecular changes discovered reveal the intimate pathogenesis and pathophysiology of MDS. The introduction of new drugs – 5-azacitidine, decitabine and lendlidomide leads to improvement of cytopenia and prolongation of the life of patients.

Key words: myelodisplastic syndrome, IPSS, 5-azacitidine, decitabine, lendlidomide

Миелодиспластичните синдроми (МДС) са гру-па заболявания, характеризиращи се с дисплас-тични нарушения на клетъчните линии, усилена апоптоза в миелопоезата и в резултат – неефек-тивна хемопоеза в костния мозък. Протичат с твърде разнообразна клинична картина, но винаги с прояви на различна по тежест анемия, което обичайно става причина за диагностицирането им.

В миналото се класифицираха чрез Френско-американско-британската класификационна сис-тема (FAB) [1], а от 2001 г. е в сила нова класи-фикационна система на СЗО, последно обнове-на през 2008 г. [2].

FAB класификацията на МДС се базира на морфологичната оценка на костния мозък, на процента бласти в него и в периферната кръв. Костният мозък при МДС е типично хиперцелу-ларен, но съществуват и редки форми на хипо-целуларитет. Тази класификация все още се използва в практиката.

В края на 90-те години се набраха данни, до-казващи, че генетичните промени и мултилине-арната дисплазия играят важна роля в прогноза-та на МДС. Тъй като FAB класификацията не включва тези изменения, се наложи изграждане на нова класификационна система. Това стана

Л. Герчева. Миелодиспластични синдроми: новости в класификацията... 4

през 2001 г. под егидата на СЗО. Новата класифи-кация, включваща генетичните аномалии, морфо-логичните промени и клиничните характеристики беше обновена последно през 2008 г. Сравнението на двете класификации е посочено на табл. 1.

В новата класификация на СЗО от 2008 г. фигурира групата MDS-U (некласифицируема миелодисплазия). Приема се, че дори при малък процент диспластични нарушения в костния мо-зък (< 10%), наличието на типични за МДС хро-мозомни аномалии прави случая класифицируем към тази група МДС. На табл. 2 са посочени ти-пичните хромозомни аномалии за МДС.

Детската МДС понастоящем е класифицира-на в отделна група (рефрактерна цитопения при деца) и включва състояние с бласти под 5% в костния мозък и данни за дисплазия в 2 клетъчни линии [2].

За да бъде прогнозата на пациентите оценена по-детайлно и точно, през 1997 г. международна група въведе прогностична скала, наречена IPSS (International Prognostic Score System) [3]. Тя се базира на процента бласти в костния мозък, засег-натите от цитопения кръвни редове и кариотипни-те промени. Цели да предвиди еволюцията към остра миелоидна левкемия (ОМЛ) и средната преживяемост. Представена е на табл. 3.

Таблица 1. FAB и СЗО класификации на МДС

FAB класификация СЗО класификация

RA RCUD

Дисплазия предимно в еритроидната редица; < 5% бласти, < 15% ring-сидеробласти

Рефрактерна анемия (RA) или неутропения (RN), или тромбоцитопения (RT); еднолинеарна дисплазия в костния мозък, < 5% бласти, < 15% ring сидеробласти

RARS < 5% бласти в костния мозък ≥ 15% ring-сидеробласти

RARS < 5% бласти в костния мозък ≥ 15% ring сидеробласти Еритроидна дисплазия (единствена) RARS-t Подгрупа на RARS с висока честота на JAK2 мутация и тромбоцитоза ≥ 450 х 109/l

RCMD Дисплазия ≥ 10% от клетките в ≥ 2 миелоидни линии < 5% бласти в костния мозък RCMD-RS < 5% бласти в костния мозък ≥ 15% ring сидеробласти

RAEB 5-20% бласти

RAEB-I 5-9% бласти, унилинеарна или мултилинеарна дисплазия, без Ауерови пръчици RAEB-II 10-19% бласти, > 10% Ауерови пръчици

RAEB-t 21-30% бласти в костния мозък

Остра миелоидна левкемия

CMML > 20% бласти в костния мозък и > 1000 х 109/l моноцити в периферната кръв

Отнесена е към нова категория МДС/МПH

5q Нормален или завишен брой на мегакариоцитите с хиполобулирани ядра и изолирана делеция на дългото рамо на хромозома 5, < 5% блас-ти в костния мозък

MDS-U Дисплазия в < 10% от клетките на една или повече миелоидни линии в костния мозък, и цитогенетични аномалии, характерни за МДС, няма пръчици на Ауер

RA – refractory anemia; RAEB – refractory anemia with excess blasts; RARS – refractory anemia with ringed sideroblasts; RARS-t – refractory anemia with ringed sideroblasts with thrombocytosis; RCMD-RS – refractory cytopenia with multilineage dysplasia with ringed sideroblasts; RCUD – refractory citopenia with unilineage dysplasia; CMML – chronic myelomonocytic leukemia; МПН – миелопроли-феративни неоплазии, MDS-U –unclassified


Таблица 2. Типични хромозомни аномалии за МДС (по 2)

Небалансирани нарушения Балансирани нарушения

+8* t(11;16)(q23;p13.3)

-7 или del(7) t(3;21)(q26.2;q22.1)

-5 или del(5) t(1;3)(p36.3;q21.1)

del20(q)* t(2;1)(p21;q23)

-Y* Inv(3)( q21;)q26.2

i(17q) или t(17p) t(6;9)(p23;q34)

-13 или del(13) Комплексни (3 и повече) кариотипни промени, включващи 1 или повече от опи-саните аномалии

del(11q)

del(12p) или t(12p)

del(9q)

idic(x)9q13)

*Присъствието на тези цитогенетични промени без съчетанието им с типични морфологични и диспластични нарушения не доказва МДС. Останалите цитогенетични аномалии са показателни за МДС при наличие на необяснима цитопения дори при липсващи морфологични промени.

Таблица 3. IPSS система

Прогностичен критерий Скор 0 Скор 0,5 Скор 1,0 Скор 1,5 Скор 2,0

% бласти в костния мозък < 5% 5-10% – 11-20% 21-30%*

Кариотип** Добър Междинен Лош

Цитопения*** 0/1 2/3

***Тази група се разпознава като ОМЛ в класификацията на СЗО ***Добър кариотип: нормален,-Y, del(5q), del(20q); междинен кариотип: промени в хромозома 7, повече от 3 абнормности; лош

кариотип: всички други абнормности ***Hg < 100 g/l; неутрофили < 1,8 х 109/l, тромбоцити < 100 х 109/l

Въз основа на тази скала се определят 4 рис-

кови групи: нисък риск – при сбор от точки 0, ин-термедиерен риск – 1 (сбор 0,5-1), интермедиерен риск – 2 (сбор 1,5-2) и висок риск (над 2,5, т.е. ви-сок брой бласти и лош цитогенетичен профил).

През последните години бяха разплетени много сложни молекулярни механизми, намес-ващи се в еволюцията на МДС. Например, ока-за се, че JAK2V617F мутацията, свързана оби-чайно с миелопролиферативните неоплазии, се среща често при RARS-t [4]. Тя е установена при 12,5% от пациентите с тромбоцитен брой 400-600 х 109/l и при 61% от болните с тромбо-цитен брой над 600 х 109/l. Вероятно при тези случаи става въприс за придобита мутация на фона на генетичната нестабилност на МДС.

Друго нарушение при МДС е в молекулата на FLT3 рецептора. FLT3 е тирозинкиназен рецеп-тор, участващ в нормалната регулация на про-лиферацията и диференциацията на хемопое-тичните клетки. Мутацията в гена му чрез вът-решна тандем-дубликация (FLT3-ITD) води до постоянна активация на цитоплазмените ефек-торни молекули на пътищата, включени в апоп-

тозата, пролиферацията и диференциацията на хемопоетичните клетки [5]. Това нарушение е характерно за пациентите с ОМЛ, но се среща и в случаите с МДС (3%). Когато то е налице, трансформацията в ОМЛ, освен че е много ве-роятна [6], настъпва рано.

При МДС – 5q синдром, е установен недостиг на RPS14 рибозомния протеин ген, локализиран върху региона на хромозома 5, претърпяла де-леция. Доказа се, че загубата на този ген пре-дизвиква типичната клиниколабораторна картина при 5q МДС [7]. Този ген контролира преминава-нето на 18S PHK от прекурсорния към активния продукт и е основен елемент в биогенезата на тази малка рибозомна субединица. Пациентите с МДС 5q имат различна морфология от останали-те форми на МДС и преди всичко се оплакват от анемия. Високата пролиферативна активност на еритробластите изисква високо ниво на рибо-зомна биогенеза и недостигът на RPS14 рибозо-мен протеин предизвиква изразената анемия.

Наскоро беше описана още една мутация – в ТЕТ2 гена. Този ген е разположен върху хромо-зома 4 и мутацията му се свързва с del 4q24.


Мутация на ТЕТ2 гена се установява върху по-липотентните и комитирани към миелопоеза стволови клетки при МДС [8]. Среща се във всички типове МДС, по-често при групата с нисък риск (41%). При интермедиерен риск – 1 тази мутация се установява в по-нисък процент – в 27%, при интермедиерен риск 2 – в 13%, и при висок риск – в 14% [9]. По-рядко се среща при мултилинеарната цитопения.

Лечение на различните форми на МДС

Стандартно лечение при всички групи МДС Пациентите със симптоми на анемия или хе-

морагии при тромбоцитопения се лекуват замес-тително, с трансфузии на кръвни компоненти. При липса на хеморагии тромбоцитопенията не се лекува с трансфузии поради риск от образу-ване на алоантитела. При хемоглобин < 100 g/l някои справочници препоръчват прилагане на растежни фактори като първа линия лечение. Препоръчва се дозиране на еритропоетина от 40 000 до 60 000 единици седмично, при което се очаква отговор в 25% от случаите след 8-седмич-но лечение [10]. Еритропоетин с удължено дейст-вие (darbepoetin alpha) се препоръчва в доза 200-300 μg/седмично или двукратно седмично [11]. Установено е, че вероятността за отговор към това лечение корелира с ендогенния еритропоетин. Така пациенти с ниво на ендогенен еритропоетин под 500 mIU/mL имат шанс за траен отговор, про-дължаващ 1-2 години. Добавянето на ниски дози гранулоцитен колония-стимулиращ фактор може да увеличи еритроидния отговор, но няма значе-ние по отношение инфекциозните усложнения, дължащи се на ниския неутрофилен брой. Комби-нацията от растежни фактори е с положителен ефект най-вече при пациенти с RA и RARS. През 2003 г. беше предложен алгоритъм, който посочва параметрите, определящи най-добър отговор към еритропоетин. Това са ниското ниво на ендогенен еритропоетин и ниските необходимост от чести трансфузии на еритроцити [12].

Специфично лечение при отделните под-групи МДС

Пациенти с рискови групи Low/Int-1/Del(5q) Пациентите, които са рефрактерни на ерит-

ропоетин-стимулиращо лечение и имат изразена цитопения, трябва да се подложат на лечение с модулиращи заболяването агенти. Това са ДНК хипометилиращите медикаменти (5-azacitidine и Decitabine). Те са одобрени за лечение на всички

форми на МДС. 5-azacitidine предотвратява ме-тилацията на цитозиновите остатъци в реплики-раната ДНК. Дозира се 75 mg/m2 подкожно или венозно за 7 последователни дни при 28-дневни цикли [13]. Лечението довежда до значима ре-дукция на трансфузионната зависимост и на про-цента трансформирали в ОМЛ.

Decitabine, друг хипометилиращ агент е одобрен за лечение на всички групи МДС. Дейс-твието му е подобно на това на 5-azacitidine. Дозира се по 20 mg/m2 в инфузия за 1 час в цик-ли от по 5 дни. Скорошни проучвания показаха, че Decitabine може да бъде ефективен и в слу-чаи на рефрактерност към 5-azacitidine [14].

За трансфузионно зависимите пациенти с Del(5q)МДС е показано лечение с lenalidomide. Той се прилага при тромбоцитен брой над 50 х 109/l и неутрофили над 5 х 109/l, показатели, характерни за тази форма на МДС. Доказано е, че 67% от пациентите постигат трансфузионна независимост, а висок процент от тях – цитоге-нетична ремисия [15]. Lenalidomide се прилага перорално в доза 10 mg/дневно в ежемесечни цикли от 21 дни, като при появи на токсичност дозата може да бъде редуцирана до 5 мг/дневно. Lenalidomide може да се прилага и при пациенти с Low/Int-1 без Del(5q). При тях се отчитат също добри резултати: редукция на необходимостта от трансфузии в 43% от случаите за продължи-телен период от време [16].

Тризомия 8 Пациентите, които носят тази аномалия като

единствена цитогенетична промяна, имат пато-генетични и клинични специфичности. При тях в по-голяма честота се наблюдава вторична па-роксизмална нощна хемоглобинурия, носят във висок процент HLA-DR15 фенотип, показват по-тежка тромбоцитопения, по-слабо изразена еритроидна дисплазия и по-нисък риск за транс-формация в ОМЛ. За тази група пациенти е под-ходящо използването на антитимоцитен глобу-лин (ATG). Биологичният механизъм на действие на този медикамент се основава на потискането на CD8+Т-лимфоцити, които са отговорни за унищожаването на матуриращите клетки с три-зомия 8 и съответно за цитопенията [17]. Потис-кайки Т-лимфоцитите, ATG помага индиректно за диференциацията на миелоидните прогенитори до зрели клетки в костния мозък. Това води до увеличаване на тризомия 8 клетъчния клон. Въпреки че повлияването на цитопенията се дължи на експанзия на тризомия 8+ клетки, не се наблюдава прогресия към ОМЛ.


Лечение на подгрупите интермитентен риск-2/висок риск

Предвид високия процент бърза еволюция към ОМЛ тези групи изискват по-интензивно ле-чение, целящо бързо очистване на патологичния клон. Това не винаги е възможно предвид висо-ката средна възраст на болните с МДС. Ето за-що в зависимост от възрастта и общото състоя-ние при тези подгрупи на МДС се предприема куративно или палиативно лечение.

Потенциална възможност за излекуване пре-доставя единствено алогенната трансплантация на стволови клетки. За съжаление само 5% от всички пациенти са подходящи за тази процеду-ра, имайки предвид възрастта, коморбидността и трудното намиране на подходящ донор. Въпреки че вероятността за излекуване е висока (при 40% от болните), смъртността в групата пациен-ти над 55-годишна възраст е 38% [18]. Понасто-ящем се предпочитат редуцирани кондициони-ращи режими, които позволяват осъществяване на алогенна трансплантация при пациенти меж-

ду 55- и 75-годишна възраст, със смъртност, сравнима с тази при по-млади пациенти [18].

Палиативното лечение цели поддържане за продължително време на добър контрол на хе-мопоезата и перифернокръвната клетъчност. Много подходящи и вече с широка употреба в практическата хематология са хипометилиращи-те агенти 5-azacitidine и Decitabine. Дори без да е постигната ремисия, при използването им се отчита подобрение на преживяемостта [19]. Всички достъпни досега резултати доказват, че при пациентите с висок риск МДС трябва да се започне лечение с Azacitidine.

Нови насоки за лечение на МДС Въпреки отбелязания напредък в лечението

на МДС след въвеждането в практиката на хи-пометилиращите агенти и Lenalidomide, процен-тът на пациентите, постигащи пълна ремисия, е много нисък. Затова продължават опитите за намиране на най-добрия лекарствен агент. Но-вите препарати, тествани за преодоляване на МДС, са посочени на табл. 4.

Таблица 4. Нови възможности за лечение на МДС

Медикамент Механизъм на действие Ефективност

Thalidomide [20] TNF-alpha (антицитокинов, антиапопто-зен ефект)

Антиангиогенеза

20% - пълна трансфузионна незави-симост

PTK 787/ZK222584 Блокатор на VEGFR Ефективност само в комбинация с химиотерапия

Хистон деацетилаза инхибитори: Suberoylanilide hydroxamic acid

Valporic acid [21]

Директно въздействат върху генната транскрипция; променят ацетилацията на лизиновите остатъци в хистоните и

хроматиновата структура

Отговор между 16 и 44%

Ezatiostat Аналог на глутатиона, който стимулира пролиферацията на миелоидни прекур-

сори

В 38% редукция на цитопенията [22]

Фарнезил-трансфераза инхибитори Tipifarnib:

Намаляват експресията наVEGF чрез потискане на активността на RAS

Пълен отговор в 15%, хематологичен отговор в 17,1% [23]

TMF – tumor necrosis factor, VEGFR – vascular endothelial growth factor receptor

БИБЛИОГРАФИЯ

1. B e n n e t t , J. M. et al. Proposals for the classification of the myelodysplastic syndromes. – Br. J. Haematol., 51, 1982, 189-199.

2. V a r d i m a n , J. W. et al. The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes. – Blood, 114, 2009, 937-951.

3. G r e e n b e r g , P. et al. International scoring system for evaluating prognosis in myelodysplastic syndromes. – Blood, 89, 1997, 2079-2088.

4. H e l l s t r ö m - L i n d b e r g , E. et M. Cazzola. The role of JAK2 mutations in RARS and other MDS. – Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program., 2008, 52-59.

5. G e o r g i o u , G. et al. Serial determination of FLT3 mutations in myelodysplastic syndrome patients at diagnosis, follow up or acute myeloid leukaemia transformation: incidence and their prognostic significance. – Br. J. Haematol., 134, 2006, 302-306.

6. S h i h , L. Y. et al. Internal tandem duplication of fms-like tyrosine kinase 3 is associated with poor outcome in patients with myelodysplastic syndrome. – Cancer, 101, 2004, 989-998.

7. E b e r t , B. L. et al. Identification of RPS14 as a 5q- syndrome gene by RNA interference screen. – Nature, 450, 2008, 335-340.

8. T e f f e r i , A. et al. Detection of mutant TET2 in myeloid malignancies other than myeloproliferative neoplasms: CMML, MDS, MDS/MPN and AML. – Leukemia, 23, 2009, 1343-1345.


9. J a n k o w s k a , A. M. et al. Loss of heterozygosity 4q24 and TET2 mutations associated with myelodysplastic/myelo-proliferative neoplasms. – Blood, 113, 2009, 6403-6410.

10. P a r k , S. et al. Predictive factors of response and survival in myelodysplastic syndrome treated with erythropoietin and G-CSF: the GFM experience. – Blood, 111, 2008, 574-582.

11. G i r a l d o , P. et al. Aranesp in Myelodysplastic Syndromes (ARM) Study Group: darbepoetin alpha for the treatment of anemia in patients with myelodysplastic syndromes. – Cancer, 107, 2006, 2807-2816.

12. H e l l s t r ö m - L i n d b e r g , E. et al. A validated decision model for treating the anaemia of myelodysplastic syndromes with erythropoietin + granulocyte colony-stimulating factor: significant effects on quality of life. – Br. J. Haematol., 120, 2003, 1037-1046.

13. S i l v e r m a n , L. R. et al. Randomized controlled trial of azacitidine in patients with the myelodysplastic syndrome: a study of the cancer and leukemia group B. – J. Clin. Oncol., 20, 2002, 2429-2440.

14. B o r t h a k u r , G. et al. Activity of decitabine in patients with myelodysplastic syndrome previously treated with azacitidine. – Leuk. Lymphoma, 49, 2008, 690-695.

15. L i s t , A. et al. Lenalidomide in the myelodysplastic syndrome with chromosome 5q deletion. – N. Engl. J. Med., 355, 2006, 1456-1465.

16. R a z a , A. et al. Phase 2 study of lenalidomide in transfusion-dependent, low-risk, and intermediate-1 risk myelodysplastic syndromes with karyotypes other than deletion 5q. – Blood, 111, 2008, 86-93.

17. S l o a n d , E. M. et al. Preferential suppression of trisomy 8 compared with normal hematopoietic cell growth by

autologous lymphocytes in patients with trisomy 8 myelodysplastic syndrome. – Blood, 106, 2005, 841-851.

18. A l y e a , E. P. et al. Comparative outcome of nonmye-loablative and myeloablative allogeneic hematopoietic cell transplantation for patients older than 50 years of age. – Blood, 105, 2005, 1810-1814.

19. F e n a u x , P. et al. Efficacy of azacitidine compared with that of conventional care regimens in the treatment of higher-risk myelodysplastic syndromes: a randomised, open-label, phase III study. – Lancet Oncol., 10, 2009, 223-232.

20. D e e g , H. J. et al. Soluble TNF receptor fusion protein (etanercept) for the treatment of myelodysplastic syndrome: a pilot study. – Leukemia, 16, 2002, 162-164.

21. K u e n d g e n , A. et al. Treatment of myelodysplastic syndromes with valproic acid alone or in combination with all-trans retinoic acid. – Blood, 104, 2004, 1266-1269.

22. R a z a , A. et al. Phase 1 multicenter dose-escalation study of ezatiostat hydrochloride (TLK199 tablets), a novel glutathione analog prodrug, in patients with myelodysplastic syndrome. – Blood, 113, 2009, 6533-6540.

23. F e n a u x , P. et al. A multicenter phase 2 study of the farnesyltransferase inhibitor tipifarnib in intermediate- to high-risk myelodysplastic syndrome. – Blood, 109, 2007, 4158-4163.

Адрес за кореспонденция: Лиана Герчева Клиника по хематология УМБАЛ „Св. Марина” бул. „Христо Смирненски” № 1 9000 Варна e-mail: [email protected]


DARBEPOETIN (ARANESP®) ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА АНЕМИИ ПРИ ПАЦИЕНТИ С ОНКОЛОГИЧНИ ЗАБОЛЯВАНИЯ

И. Николов Клиника по хематология и онкология, ВМА – София

DARBEPOETIN (ARANESP ®) FOR TREATMENT OF ANEMIA IN PATIENTS WITH CANCER

I. Nikolov Department of Hematology and Oncology, Military Medical Academy – Sofia

Резюме. Darbepoetin е рекомбинантен еритропоетинов препарат с особена фармакокинетика, позволя-ваща приложение като еднократна подкожна инжекция веднъж на две до три седмици. Това го прави осо-бено удобен в клиничната практика, включително в амбулаторни условия. Лечението с него намалява трансфузионните нужди, а също така подобрява качеството на живот, свързано с повиляване на симп-томите на анемичния синдром. Терапията трябва да се провежда с внимание, насочено към описания по-висок риск към тромбоемболизъм и повишаване на артериалното налягане. В онкологията и онкохема-тологията се използва за симптоматично лечение на анемията, предизвикана от съпътстващата хи-миотерапия. Не се препоръчва употребата му при пациенти, които не провеждат химиотерапия, както и при тези с тумори на главата и шията и карцином на гърдата. Използването на еритропоетин скъсява времето до настъпване на прогресия при пациентите с авансирал карцином на главата и шията, при ко-ито е прилагана лъчетерапия, а също скъсява общата преживяемост при болни с метастазирал карци-ном на гърдата, при които се прилага химиотерапия. Препоръчва се спиране на лечението в рамките на 4 седмици след завършване на химиотерапията, както и да се прилага минимална доза за поддържане на ниво на хемоглобина не повече от 110 до 120 g/l с оглед ограничаване на тромбо-емболични инциденти и евентуално стимулиране на туморния растеж.

Ключови думи: малигнени хемопатии, анемия, рекомбинантен еритропоетин, дарбепоетин.

Summary. Darbepoetin is a rеcombinant erythropoietin with specific pharmacokinetics allowing a subcutaneous injection once every 2-3 weeks. This makes the drug very convenient for the clinical practice and especially for outpatient administration. This treatment modality reduces transfusion requirements and improves the quality of life having influence upon symptoms of the anemia. The treatment should be administered with caution regarding the higher risk for thromboembolic and hypertensive events. In the field of oncology and onco-hematology, Darbepoetin is used for treatment of anemia which is sequence of the concomitant chemotherapy. It is not indicated for patients not receiving chemotherapy, as well for these with head and neck and breast cancer. The use of erythropoietins reduces the time to progression in such patients. It is recommended the treatment to be stopped within 4 weeks after the completion of chemotherapy, as well the lowest effective dose to be applied to maintain hemoglobin level not higher than 110 до 120 g/l in order to reduce the thromboembolic risk and not to cause faster tumor growth.

Key words: cancer, anemia, recombinant erythropoietin, darbepoetin.

Увод Редица състояния, свързани с инфекциозно,

възпалително или неопластично заболяване, се асоциират с анемия. В повечето случаи тя е нор-моцитна, нормохромна и хипопролиферативна. За развитието º са отговорни няколко механизъма:

• Блокиране на желязо в макрофагите – това води до намаляване на нивото на серумното желя-зо и до неговия недостиг за хемопоетични нужди.

• Невъзможност на морфологично нормал-ния костен мозък да отговори на анемията с еритробластна стимулация въпреки увеличеното

И. Николов. Derbepoetin (Aranesp®) за лечение на анемии при... 10

ендогенно ниво на еритропоетина. Дължи се на стимулирана апоптоза на еритробластите.

• Релативно ниско ниво на ендогенния ерит-ропоетин. Пациентите с желязодефицитна ане-мия при сходни стойности на хемоглобина имат по-голямо физиологично повишаване на еритро-поетина в сравнение с тези с анемия при хро-нично възпаление.

Посочените процеси имат имунологична ос-нова. Подлежащото заболяване е свързано с продукция на цитокини, основно тумор-некро-тичен фактор (TNF), интерлевкини, β- и γ-интер-ферон. Възлова роля има хепсидинът, който освен острофазов белтък е основен регулатор на желязната обмяна. Той е негативен регулатор на желязната абсорбция в тънките черва, както и на освобождаването на желязо от макрофагите. Синтезът му е пряко свързан с интерлевкин-6. Синтезът на хепсидин е увеличен при пациенти с инфекциозни, малигнени и възпалителни забо-лявания.

Пациентите с анемия при хронично заболя-ване имат релативен железен дефицит за разли-ка от абсолютния при желязодефицитна анемия. Налице е хипосидеринемия, но съчетана с нор-мални, а не с изчерпани железни депа. Терапев-тичното приложение на железни препарати е неефективно. В идеалния случай лечението на основното заболяване води и до повлияване на анемията, но най-често се налага симптоматич-на терапия, насочена към анемичния синдром. Прилагат се хемотрансфузии, а напоследък и лечение с рекомбинантни еритропоетинови пре-парати паралелно с желязна суплементация.

Лечение на анемията Наличието на съпътстваща анемия при па-

циенти с подлежащо хронично заболяване е свързано с редуциран функционален статус, изразена астено-адинамия, нарушено качество на живот, намалена преживяемост. Освен посо-чените, при пациентите с онкологични заболява-ния редуцираната тъканна оксигенация е съпро-водена с понижена ефективност на някой от хи-миотерапевтиците и йонизиращото лъчение, които естествено са свързани с намален отговор към прилаганото лечение. От друга страна, ан-титуморното лечение в различна степен, но ви-наги, е свързано с костномозъчна супресия, като анемията е и пряко свързана с него. Терапев-тичните възможности за лечение на анемията обикновено включват:

• Хемотрансфузии. Те са универсално при-лагани и водят до бързо покачване на хемогло-биновото ниво, съответно на физическия капа-цитет и качеството на живот на пациентите. При

много от тях се налагат периодични чести кръ-вопреливания, като с това се изявяват нежела-ните ефекти и усложнения на манипулацията – посттрансфузионни реакции, алоимунизация, трансмисивни инфекции, хемосидероза, чест болничен престой. Хемотрансфузиите са подхо-дяща алтернатива за бързо овладяване на те-жък анемичен синдром с изявени прояви на тъ-канна исхемия и на свързаната с нея органна дисфункция, както и при болни с кратка очаквана преживяемост, при които липсва достатъчно време за изява на терапевтичния ефект на ерит-ропоетиновите препарати.

• Рекомбинантни ериропоетинови препа-рати. Ефективността им се основава на факта, че анемията при пациенти с хронично заболява-не води до физиологично повишение на нивото на ендогенния еритропоетин, но в степен, неп-ропорционална на тежестта на анемията. Спо-менато беше, че болните с желязодефицитна анемия имат по-висок ендогенен еритропоетин, сравнени с тези с вторична анемия и еднакво ниво на хемоглобина.

• Darbepoetin е индикиран за лечение на индуцираната от химиотерапия анемия при па-циенти с немиелоидни неоплазии. Предимство е приложението му като еднократна подкожна ин-жекция на по-голям интрервал от време – вед-нъж на 3-4 седмици [1, 4, 8, 9]. Получава се от клетъчни култури от овариални клетки на китайс-ки хамстер чрез рекомбинантна ДНК технология. Има по-дълъг плазмен полуживот in vivo в срав-нение с този на еритропоетина, както и по-ниска активност на свързване с еритропоетиновия рецептор. Тези негови фармакокинетични харак-теристики се дължат на различния начин на гли-козилиране на молекулата, докато аминокисе-линната последователност е идентична с тази на еритропоетина. Приложението му при болни с индуцирана от химиотерапия анемия е свързано с намалени трансфузионни нужди, по-висока степен на терапевтичен отговор (нарастване на хемоглобина с над 20 g/L или хемоглобин над 120 g/L), повишаване на качеството на живот ≥ 25% (оценено чрез FACT-скор), сравнено с конт-ролните плацебо-групи.

Понастоящем Darbepoetin се прилага широко при пациенти с онкологични и хематологични заболявания, при които се провежда лечение с химиотерапия. Неговата ефективност и профи-лът му на безопасност са доказани в редица клинични проучвания.

През 2006 г. са публикувани резултатите от метаанализ на 57 проучвания, включващи 9353 пациентr с онкологични заболявания, лекувани с рекомбинантни еритропоетинови препарати [3].


Сравнявана е ефективността на Epoetin-alfa и -beta и Darbepoetin-alfa, съчетани с хемотранс-фузии, срещу пациенти, при които е прилагано само кръвопреливане, за профилактика и лече-ние на анемията при онкологично болни със или без съпътстваща химиотерапия. Доказва се, че лечението с Epoetin или Darbepoetin статисти-чески значимо редуцира необходимостта от хе-мотрансфузии и подобрява хематологичния от-говор. Същевременно се установява повишен риск от тромбоемболични инциденти (RR = 1.67, 95% CI = 1.35-2.06; 35 проучвания и 6769 паци-енти). Неясно остава доколко и по какъв начин еритропоетиновете препарати повлияват общата преживяемост (hazard ratio = 1.08, 95% CI = 0.99-1.18; 42 проучвания и 8167 пациенти). Препоръ-чано е повишено внимание при приложението на тези медикаменти при едновременно лечение с тромбогенни химиотерапевтици или при пациен-ти с повишен тромбогенен риск, асоцииран с основното заболяване.

Съобщението на Bohlius и сътр. [2[ също е резултат на метаанализ на контролирани рандо-мизирани проучвания и обхваща голям брой пациенти. Обобщенията са аналогични. Прило-жението на рекомбинантен еритропоетин значи-телно понижава релативния риск за хемотрансфу-зии. Средно в групата, получаваща Epo/Darbepo, се прилага една единица еритроцитен концент-рат по-малко от контролната група. При панциен-тите с изходен хемоглобин под 120 g/L хематоло-гичен отговор се наблюдава по-често при болните, получаващи еритропоетин. Прави се статистичес-кият извод, че лечението с Epo/Darbepo би могло да подобри качеството на живот. И тук относи-телният риск за тромбоемболични усложнения е по-голям в групата, получаваща Epo/Darbepo, като същевременно е налице тенденция за по-качване на артериалното налягане. Отново дан-ните относно антитуморния отговор и общата преживяемост са несигурни.

Рекомбинантни еритропоетинови продукти се използват и за лечението на анемичния синдром при редица малигнени хемопатии. При миело-диспластичните синдроми тези продукти могат да се прилагат самостоятелно или в комбинация с други растежни фактори [7]. Ефектът при ре-дица пациенти може да е ограничен поради не-ефективната хемопоеза при тази група заболя-вания. Основата за еритропоетиново лечение е фактът, че ендогенният еритропоетин е субоп-тимално повишен сравнено със степента на анемията. Ефект от терапията може да се очак-ва при ниво на ендогенния еритропоетин < 100 до < 200 mU/mL, както и при пациенти със забо-ляване с нисък риск и еритробластна хипоплазия

в костния мозък. Обикновено Darbepoetin се при-лага в доза 75 до 300 μg веднъж седмично [6]. В цитираното проучване при 55% от лекуваните пациенти е наблюдаван терапевтичен отговор.

Еритропоетин се използва отдавна успешно за лечение на анемията при болни с множествен миелом и други неходжкинови лимфоми [10]. Про-учването засяга приложението на епоетин-бета при трансфузионно зависими пациенти, но дарбе-поетин също намалява трансфузионните нужди, в обичайна доза 200 μg на всеки 2 до 3 седмици.

Въпреки че приложението на рекомбинантен еритропоетин при болни с идиопатична миело-фиброза не е особено ефективно, някои автори съобщават за терапевтичен отговор, предимно при трансфузионно независими пациенти и при такива с ниско ниво на ендогенен еритропоетин [5].

Дозиране на Darbepoetin Дозите на Darbepoetin се увеличават или на-

маляват с 25% в зависимост от динамиката на хемоглобина 6 седмици след началото на лечени-ето. Спиране на терапията влиза в съображение, ако покачването на хемоглобина е по-малко от 10 g/L 6 до 8 седмици след адекватна промяна на дозата или ако няма промяна на трансфузионни-те нужди. Лечението може да бъде прекратено при завършване на химиотерапията, когато хе-моглобиновото ниво е стабилно и липсва необ-ходимост от хемотрансфузии. Алтернативен на-чин на приложение е 500 μg на всеки три седмици (6.75 µg/kg) като начална доза. Подобно на оста-налите еритропоетинови препарати Darbepoetin не е показан за лечение на анемия при онкологично болни в случаите, когато тя не е следствие на провеждана химиотерапия, тъй като това може да е свързано с намалена преживяемост на тези пациенти.

Суплементацията с желязо е особено важен момент при лечението на анемията. При пациенти с гранични железни запаси започването на лече-ние с рекомбинантен еритропоетинов препарат бързо води до железен дефицит. Това е и причина за субоптимален терапевтичен резултат. Дори пациенти с наситени железни депа могат да нямат адекватно повишаване на хемоглобиновото ниво, дължащо се на затруднена мобилизация на депо-нираното желязо по цитокин-медиираните меха-низми, описани по-горе. Ето защо при всички па-циенти, лекувани с еритропотин, се предписва железен препарат за поддържане на насищането на трансферина ≥ 20% и на серумен феритин ≥ 100 ng/mL. Парентералното желязо има предимст-во с това, че бионаличността му по отношение на еритропоезата е по-голяма в сравнение с перо-ралната суплементация.

И. Николов. Derbepoetin (Aranesp®) за лечение на анемии при... 12

Нежелани лекарствени реакции Често наблюдавана реакция е главоболието,

повишаване на артериалното налягане, тромбо-емболизъм, прояви на свръхчувствителност, болка на мястото на приложение, артралгии, периферни отоци. Изключително рядко може да се наблюдава чиста еритробластна аплазия (PRCA).

ASH/ASCO публикуват своите препоръки за използване на рекомбинантни еритропоетинови препарати при пациенти с онкологични заболя-вания {11, 12]. Основните моменти в ръководст-вото са:

• Приложението на еритропоетинов меди-камент би трябвало да започне при спадане на хемоглобиновото ниво до или близо до 100 g/L. Лечението при хемоглобин между 100 и 120 g/L би могло да започне при определени условия по преценка на лекуващия лекар;

• Лечението трябва да бъде прекратено при липса на терапевтичен отговор за 6-8 седмици. Липсата на отговор се дефинира като повишава-не на хемоглобина по-малко от 10-20 g/L или липса на редукция на трансфузионните нужди;

• Хемоглобиновото ниво по време на лече-нието не трябва да надвишава 120 g/L. Когато то надвиши 110 g/L, дозата на еритропоетиновия препарат се намалява с 25%. Ако по време на терапията хемоглобинът надвиши 120 g/L, лече-нието трябва да бъде спряно и да се възстанови в редуцирана доза при спадане на хемоглобина под 110 g/L.

• ASH/ASCO не препоръчват използването на еритропоетинови препарати при онкологични пациенти с анемия в случаите, когато тя не е асоциирана с химиотерапия. Установена е експ-ресия на еритропоетинови рецептори върху ма-лигнените клетки при редица тумори – на глава-та и шията, млечната жлеза и други. Тази експ-ресия би могла да доведе до активиране на ту-морния растеж при приложение на рекомбинан-тен еритропоетинов препарат, което да е причи-на за доказаната повишена смъртност при тези пациенти. Описаният ефект е именно в случаите на еритропоетиново лечение без съпътстваща химиотерапия.

Актуалните препоръки на National Compre-hensive Cancer Network (NCCN) могат да бъдат намерени на www.nccn.org.

Заключение Darbepoetin притежава фармакокинетични

особености, правещи го удобен за приложение на по-големи интервали от време. Ефективен е за повлияване на анемичен синдром и редукция

на хемотрансфузионните нужди при пациенти, провеждащи химиотерапия. Лечението налага мониториране на артериалното налягане, както и внимание по отношение на повишения риск от тромбоемболизъм, особено при надхвърляне на таргетното хемоглобиново ниво. Не се препо-ръчва терапия с Darbepoetin при пациенти с анемия, които не провеждат химиотерапия.


1. B o c c i a , R. et al. Darbepoetin alfa administered every three weeks is effective for the treatment of chemotherapy-induced anemia. – Oncologist., 11, 2006, № 4, 409-417.

2. B o h l i u s , J. et al. Erythropoietin or darbepoetin for pa-tients with cancer. – Cochrane Database Syst. Rev., 2006, Jul 19, 3, CD003407.

3. B o h l i u s , J. et al. Recombinant human erythropoietins and cancer patients: updated meta-analysis of 57 studies including 9353 patients. – J. Natl. Cancer Inst., 98, 2006, № 10, 708-714.

4. C a n o n , J. L. et al. Randomized, double-blind, active-controlled trial of every-3-week darbepoetin alfa for the treatment of chemotherapy-induced anemia. – J. Natl. Cancer Inst., 98, 2006, № 4, 273-284.

5. C e r v a n t e s , F. et al. Darbepoietin-alpha for the anaemia of myelofibrosis with myeloid metaplasia. – Br. J. Haematol., 134, 2006, 184.

6. G i r a l d o , P. et al. Darbepoetin alpha for the treatment of anemia in patients with myelodysplastic syndromes. – Cancer, 107, 2006, № 12, 2807-2816.

7. G o l s h a y a n , A. R. et al. Efficacy of growth factors com-pared to other therapies for low-risk myelodysplastic syn-dromes. – Br. J. Haematol., 137, 2007, № 2, 125-132.

8. H e d e n u s , M. et al. Efficacy and safety of darbepoetin alfa in anaemic patients with lymphoproliferative malignan-cies: a randomized, double-blind, placebo-controlled study. – Br. J. Haematol., 122, 2003, № 3, 394-403.

9. K o t a s e k , D. et al. Darbepoetin alfa administered every 3 weeks alleviates anaemia in patients with solid tumours receiving chemotherapy; results of a double-blind, placebo-controlled, randomised study. – Eur. J. Cancer, 39, 2003, № 14, 2026-2034.

10. O s t e r b o r g , A. et al. Recombinant human erythropoietin in transfusion-dependent anemic patients with multiple myeloma and non-Hodgkin's lymphoma – a randomized multicenter study. The European Study Group of Erythropoietin (Epoetin Beta) Treatment in Multiple Myeloma and Non-Hodgkin's Lymphoma. – Blood, 87, 1996, № 7, 2675-2682.

11. R i z z o , J. D. et al. Use of epoetin and darbepoetin in pa-tients with cancer: 2007 American Society of Hematolo-gy/American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline update. – Blood, 111, 2008, № 1, 25-41. Epub 2007 Oct 22.

12. R i z z o , J. D. et al. Use of epoetin and darbepoetin in pa-tients with cancer: 2007 american society of clinical oncolo-gy/american society of hematology clinical practice guideline update. – J. Clin. Oncol., 26, 2008, № 1, 132-49. Epub 2007 Oct 22.

Адрес за кореспонденция: И. Николов Клиника по хематология и онкология ВМА ул. „Св. Г. Софийски” № 3 1341 София


РОЛЯ НА HELICOBACTER PYLORI ПРИ БЕНИГНЕНИ ХЕМАТОЛОГИЧНИ ЗАБОЛЯВАНИЯ

М. Спасова1 и Ж. Грудева-Попова2 1Катедра по педиатрия, 2Клиника по онкология и хематология

УМБАЛ „Св. Георги” – Пловдив

ETIOLOGIC SIGNIFICANCE OF HELICOBACTER PYLORI FOR BENIGN HEMATOLOGIC DISEASES

М. Spasova1 and J. Grudeva-Popova2 1Department of Pediatrics, 2Department of Oncology and Hematology

UMHAT “Sv. Georgi” – Plovdiv

Резюме. Helicobacter pylori е превалиращият стомашен патоген при човека и етиопатогенетичната връзка на Helicobacter pylori инфекцията с гастрит, пептична язва, MALT лимфом и стомашен аденокар-цином е добре известна. Напоследък се проучват и екстрагастралните прояви на инфекцията, част от които са бенигнени хематологични заболявания: терапевтично рефрактерна желязодефицитна анемия и хронична идиопатична тромбоцитопенична пурпура. Авторите разглеждат наличните проучвания, изс-ледващи етиопатогенетичната връзка на Helicobacter pylori с тези заболявания, вероятните фактори от страна на микроорганизма и гостоприемника, повлияващи клиничната проява и ефекта от ерадика-ционната терапия. Посочват се потенциалните маркери за обмяната на желязото и отношението им към патогенезата на желязодефицитната анемия при инфекция с Helicobacter pylori. Дискутират се диаг-ностичните методи за наличие на Helicobacter pylori инфекция в контекста на основното хематологично заболяване. В заключение, доказването на Helicobacter pylori инфектираност и преценката за провеждане на ерадикация биха могли да се включат в общия лечебен комплекс при терапевтично рефрактерна желя-зодефицитна анемия и хронична идиопатична тромбоцитопенична пурпура.

Ключови думи: helicobacter pylori, желязодефицитна анемия, хронична идиопатична тромбоцитопе-нична пурпура

Summary. Helicobacter pylori is the prevalent gastric pathogen in humans and it’s etiopathogenetic significance for gastritis, peptic ulcer, MALT lymphoma and gastric adenocarcinoma is well established. Recent studies focus on the extragastric manifestations of the infection, some of them being benign hematologic diseases: refractory iron-deficiency anemia and chronic idiopathic thrombocytopenia. The authors review the current studies, investigating the etiopathogenetic role of Helicobacter pylori for these diseases, probable factors of the bacterium and the host, influecing the clinical presentation and the effect of eradication therapy. Potential markers of iron metabolism and their relation to the occurrence of iron-deficiency anemia in the setting of Helicobacter pylori infection are discussed. Diagnostic methods for proving Helicobacter pylori infection are reviewed in the context of the hematologic disease. In conclusion, testing for Helicobacter pylori infection and appraisal for eradication therapy could be included as a part of diagnostic workup and therapeutic approach in refractory iron-deficient anemia and chronic idiopathic thrombocytopenia.

Кey words: Helicobacter pylori, iron-deficient anemia, chronic idiopathic thrombocytopenia

Въведение Инфекцията, причинена от Helicobacter pylori

(НР), е честа бактериална инфекция при човека, като микроорганизмът е превалиращият стома-

шен патоген. Съобщава се, че около половината от населението е инфектирано с НР, като това зависи от хронологичната възраст, държавата, етническия произход и социално-икономическите

М. Спасова и Ж. Грудева-Попова. Роля на Helicobactere pylori... 14

условия на отглеждане по време на детството [12, 18]. Все още обаче недобре изяснен остава основният път на предаване на инфекцията. Предполага се предаване от човек на човек по фекално-орален, гастро-орален и оро-орален път, като при деца от особено значение е вътре-фамилното предаване. Широко дискутирана е ети-опатогенетичната връзка НР инфекция/гастрит, пептична язва, MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) лимфом, стомашен аденокарцином. Про-ведените проучвания сред български деца с гастроинтестинални оплаквания доказват нали-чие на НР при 48,66% от случаите, като преоб-ладаващата хистологична проява при това носи-телство е хроничният гастрит [3]. Напоследък НР се асоциира и с развитието на някои бенигнени хематологични заболявания: терапевтичнореф-рактерна желязодефицитна анемия (ЖДА) и хронична идиопатична тромбоцитопенична пур-пура (ИТП). Потенциалната връзка се подкрепя и от факта, че хематологичните промени могат да претърпят благоприятно развитие след ерадика-цията на НР [8, 21].

Желязодефицитна анемия и роля на НР ЖДА е най-честата форма на анемия в све-

товен мащаб. Тя представлява и най-големият световен здравен проблем, тъй като засегнатите са около 3 млрд. човека [4]. Редица потенциални маркери на обмяната на желязо се използват в клиничната практика и при научни проучвания, като е спорно дали само отклоненията в един показател могат да установят истински железен дефицит. Най-често използваните параметри на нарушена хомеостаза на желязото са: серумно желязо, сатурация на трансферина, разтворим серумен трансферинов рецептор, феритин, хеп-цидин, цинков протопорфирин (ZPP) и др. Нис-кият серумен феритин се приема като най-ранен показател за изчерпване на железните запаси в организма [25, 31]. Поради характеристиката му на острофазов протеин обаче нивата му се по-вишават при инфекция или възпаление [32].

Разтворимият серумен трансферинов ре-цептор е добър индикатор за желязодефицитна еритропоеза, като той медиира интрацелуларно-то желязно натрупване [33]. Отношението фери-тин/серумен разтворим трансферинов рецептор отразява по-добре от феритина запасите на же-лязо в организма. Нивото на разтворимия тран-сферинов рецептор обаче се влияе значимо от броя на еритроидните прекурсори в костния мо-зък и би могло да бъде увеличено при нормална експанзия на еритроидния пул (напр. растеж, таласемичен синдром).

Хепцидинът е познат с генеричното име HAMP (hepcidin antimicrobial peptide) и представ-

лява острофазов чернодробен протеин, състоящ се от 20-25 аминокиселини [4]. Синтезира се от хепатоцитите, като напоследък има данни, че подобна роля могат да имат миелоидните клетки и слезката. Идентифициран е за първи път през 2001 г. от урина и плазма на човек. Хепцидинът е първи от групата ”нови антимикробни пептиди”, имащи отношение към естествения имунитет. Името му се формира от “hep” (hepar) + “idine” (antimicrobial activity). Това е основният хормон, регулиращ хомеостазата на желязото. Ролята на хепцидина е комплексна:

• инхибира директно феропортина и така контролира железния клетъчен експорт;

• ↓ жeлязната резобция и трансфер в цир-кулацията на ниво ентероцити;

• ↑ железните депа на ниво макрофаги; • има изключително важно участие в пато-

генезата на: – вродена хемохроматоза; – анемии с желязно свръхнатоварване; – анемия при възпаление и хронични забо-

лявания поради стимулиране на секрецията му от отделените цитокини (главно интерлевкини).

ZPP е ранен продукт в синтеза на хема и се установява в повишени стойности при желязо-дефицитна еритропоеза [10, 33]. Понастоящем се използва основно при проучвания и рядко в рутинната клинична практика. Смята се за висо-коспецифичен индикатор за количеството на еритропоетично желязо и за разлика от ферити-на не се повлиява директно от остра инфекция. Използва се за цялостен контрол на желязната хомеостаза.

През 1993 г. Dufour и сътр. съобщават за първи път асоциацията между НР инфекция и:

• поява на изразена ЖДА в група на подрас-тващи и млади жени при липса на друга етиоло-гична нокса;

• наличие на подчертана рефрактерност към провежданата перорална субституираща терапия при тези пациенти [11].

Последващи проучвания посочват релативен риск за развитие на сидеропенична анемия при подрастващи, инфектирани с НР 2.9 (95% интер-вал на доверителност, 1.5-5.6) [9]. Тази анемия не е свързана с активно кървене (хематемеза или мелена) от гастроинтестиналния тракт, което предполага водещата роля на инфекцията с НР като етиологичен фактор. Дискутира се възмож-ността някои щамове на НР да се конкурират с гостоприемника при използване на желязото, необходимо за микробния растеж – така практи-чески блокират железния метаболизъм [6, 7]. Един от подозираните патогенетични механизми е променената от НР регулация на критичната hepcidin/ferroportin система – ефектът е свръхре-


гулация на hepcidin и потискане на ferroportin [14]. НР участва и в патогенезата на автоимун-ния атрофичен гастрит, което създава, от една страна, предиспозиция за поява на ЖДА, а от друга – за смутена резорбция при перорална феротерапия [4, 5].

Неизяснен все още остава въпросът защо само част от инфектираните с НР пациенти раз-виват сидеропеничен анемичен синдром, както и честотата на НР инфекцията сред пациентите с етиологично неизяснени желязодефицитни със-тояния. На този етап липсват категорични дока-зателства за повишена инфектираност с НР при тези групи. По-важни обаче за клиничната прак-тика са данните за подобряване на терапевтич-ния отговор от провежданата феротерапия след осъществена ерадикация на НР [8, 21, 28].

Идиопатична тромбоцитопенична пурпура и роля на НР

ИТП е автоимунно хематологично заболява-не с честота на заболяемост 1,6-3,7/100 000 на-селение и болестност 2,8-7,3 /100 000. Характе-ризира се с наличието на антитромбоцитни ан-титела, насочени срещу определени повърхнос-тноклетъчни тромбоцитни антигени, най-често гликопротеините GP IIb/IIIa и GP Ib/IX. При деца-та ИТП се среща с честота 3-5/100 000, пик меж-ду 3- и 5-годишна възраст. Преобладават острите форми, при които е налице оздравяване през пър-вите 6 месеца от дебюта на болестта [2]. За разли-ка от децата при възрастните преобладават хро-ничните форми с по-трудно разпознаваемо начало и по-проблемно терапевтично повлияване.

След първото съобщение на Gasbarrini и сътр. през 1998 г. върху 8 възрастни пациенти последват и други съобщения за възможна асо-циация между НР инфекцията и хроничната ИТП [15, 19]. Наличието на причинителя не може да бъде предсказано по наличието или липсата на гастроинтестинални симптоми. Честотата на НР инфектираност при пациенти с ИТП варира ши-роко в различните проучвания в зависимост от използвания диагностичен метод и географския регион – 22% до 100%, а ефектът от ерадикаци-ята на инфекцията с НР остава противоречив. Michel и сътр. установяват ниска честота на НР (21.6%) при група от 74 пациенти над 10-годишна възраст с ИТП от Северна Америка [23, 24]. До-казват липса на терапевтичен отговор от прове-дена ерадикация и приемат, че този причинител вероятно не играе роля в патогенезата на ИТП. Аналогични резултати, неподкрепящи етиоло-гичната връзка между ИТП и НР, са съобщени и в две предишни проучвания от Франция и Испа-ния. Други автори (главно от Италия и Япония)

постигат частично или пълно възстановяване на тромбоцитния брой при 38 до 73% от НР пози-тивните пациенти с ИТП след проведена еради-кация [12, 16, 26, 30]. Veneri и сътр. установяват НР инфекция при 71.4% от пациентите с ИТП чрез уреазен дихателен тест [30]. Постигат ера-дикация при 93.7% от тях, което довежда до зна-чим и продължителен (11.7 месеца) отговор по отношение на ИТП при 68.7% от случаите. По-добни резултати при 75 възрастни пациенти с ИТП съобщава и друга италианска група – Emilia и сътр. [12, 13]. Те доказват 51% честота на НР инфекцията и постигат ерадикация при 89% от инфектираните пациенти. Отчитат персистиращ добър отговор по отношение на тромбоцитния брой при продължително проследяване (60 ме-сеца) в 68% от случаите. Авторите посочват, че ефектът от проведената ерадикация не зависи от продължителността и тежестта на ИТП. Спор-но е дали късното провеждане на ерадикираща терапия (особено след имуносупресивно лече-ние) би могло да влоши очакваните резултати поради факта, че антителното производство вече не зависи в такава степен от персистиране-то на бактериалните антигени.

Тези данни доказват ролята на НР в патоге-незата на ИТП в някои географски области. Въз-можното обяснение е свързано с генетичните различия на преобладаващите щамове НР в тези райони, както и в различната степен на екс-пресия на CagA и Lewis (Le) антиген между от-делните щамове. В Япония повечето щамове НР експресират CagA антигена, докато процентът на CagA позитивните щамове в западните държави е значително по-нисък. Нещо повече, установя-ват се и различия в аминокиселинната поредица на CagA протеина между тези географски регио-ни [29]. Фактът, че различията в клиничния отго-вор към ерадикационното лечение при пациенти с ИТП корелират с CagA статуса на бактериал-ния причинител, изтъква важната роля на CagA антигена в патогенезата на ИТП при тази подг-рупа пациенти. При деца проучванията са върху ограничен брой пациенти, като НР инфекцията е доказана чрез различни методи и поради това резултатите са трудно съпоставими.

Патогенетичната връзка между инфекцията, причинена от НРу и ИТП остава не съвсем уточ-нена. Подозират се фактори от страна на имун-ния отговор на организма или генетични особе-ности на отделните щамове на инфекциозния агент. Като предполагаеми механизми от страна на НР се посочват директен бактериален ефект, системни ефекти на възпалителните медиатори или молекулярна мимикрия между протеин на НР (cytotoxin-associated gene product; CagA) и

М. Спасова и Ж. Грудева-Попова. Роля на Helicobactere pylori... 16

тромбоцитните гликопротеини. НР експресира по специфичен начин за всеки щам Le антиген [22]. Последният се адсорбира върху тромбоцитите и може да бъде потенциален таргет за производс-тво на анти-Le антитела при лица с подходящ генетичен терен. Както НР, така и ИТП се свърз-ват с развитието на имунен отговор от T helper 1 (Тh1) тип, който води до повишени нива на ин-терферон-γ и интерлевкин-2. Поради това инду-цираните от НР промени в цитокинния профил биха могли да допринесат за развитието на имунна тромбоцитопения. Някои щамове на НР се свързват с фактора на von Willebrand и прово-кират GP Ib и FcγRIIa зависима тромбоцитна агрегация при наличие на антитела срещу НР [12]. Последният механизъм се дискутира и като причина за предполагаемата връзка между НР и сърдечно-съдови заболявания. Проучванията не откриват различия в HLA клас II алелите между инфектираните с НР пациенти с ИТП и остана-лата група.

По отношение на диагностичните методи за доказване на НР инфекцията все още не същес-твува точен консенсус относно приложението им в клиничната практика. Като златен стандарт се приема eндоскопска биопсия и доказване на причинителя чрез бърз уреазен тест, хистоло-гична визуализация и култивиране в биопсичния материал [20]. Все пак инвазивността и цената на методиката поставят напоследък въпроса за диагностичната стойност на индиректните неин-вазивни тестове. При пациенти с ИТП наличната хеморагична диатеза е относителна контраинди-кация за инвазивна ендоскопска диагностика. Серологичните методи включват определяне на НР специфични IgG и IgA антитела чрез ЕLISA методи. Те не са достоверни: могат да са фал-шиво отрицателни при деца, особено под 10-го-дишна възраст и при ниска честота на разпрост-ранение [18]. От друга страна, дори след еради-кация на НР титърът на антитела се задържа в течение на няколко месеца, без това да е показа-телно за активна инфекция. Наскоро е разработен друг неинвазивен тест – определяне на антиген на НР в изпражнения чрез ЕLISA метод с помощта на поликлонални или моноклонални антитела. Някол-ко мултицентрови проучвания при деца доказват висока специфичност и сензитивност на метода с поликлонални антитела (над 93%) [17, 27]. По от-ношение верификацията на ерадикацията на НР консенсусът Maastricht 2-2000 препоръчва или 13С-уреазен дихателен тест, или биопсия и опре-деляне на антиген на НР в изпражненията. Пре-поръчва се тестване поне 4 седмици след за-вършване на пълния курс терапия [20].

Зачестилите напоследък съобщения за въз-можна етиологична роля на най-често срещания

при човека стомашен патоген – НР, при рефрак-терната на перорално лечение ЖДА и хронична-та ИТП се явяват “примамлива” терапевтична алтернатива: чрез ерадикация на микробния патоген да се постигне ремисия/излекуване на заболяването без необходимост от продължи-телно (най-често имуносупресивно) лечение.

Дискутираният терапевтичен подход все още е обект на проучване и не е включен в общопри-етите консенсуси за лечение на ЖДА и ИТП. Спорен остава въпросът дали ефектът от анти-биотичното лечение при част от тези пациенти се дължи на насочената ерадикация на НР. В подкрепа на тази теза някои автори доказват липса на ефект от ерадикационния режим при НР негативните пациенти [12, 30].

При децата и възрастните се препоръчват аналогични ерадикационни режими, като е дока-зано предимството на тройната комбинация, базирана на инхибитор на протонната помпа (ИПП) в сравнение с двойната терапевтична комбинация (амоксицилин + кларитромицин) [18]. Сравнителни проучвания не установяват досто-верна разлика между различните ИПП по отно-шение ерадикационната честота, но се предпо-чита двукратен дневен прием в сравнение с ед-нократен. Препоръчван режим е 7 до 14-дневен курс с ИПП (или Н2-блокер, или колоидален бисмутов субцитрат), комбиниран с кларитроми-цин и амоксицилин или метронидазол [20]. В повечето случаи в тройната терапевтична ком-бинация не се препоръчва съчетаване на кла-ритромицин и метронидазол поради необходи-мостта от резервно средство на втори избор. Обикновено лечението започва с кларитроми-цин-базирана терапевтична схема освен в слу-чаите с доказана популационна резистентност на НР над 15%. Проведено проучване сред бъл-гарски деца установява следната обща честота на резистентност на НР към метронидазол, кла-ритромицин и двойна – 15.6%,12.6% и 4.8%, като е доказан само един амоксицилин резистентен щам [1]. Авторите посочват местожителството като рисков фактор за резистентност към метро-нидазол (по-висока за Южна България и София) и в по-слаба степен за кларитромицин (по-висока за малките градове и села).

Заключение Потенциалната етиологична роля на Helico-

bacter pylori се дискутира през последните годи-ни и при някои бенигнени кръвни заболявания – ЖДА, ИТП. Натрупаните до момента научни дан-ни са противоречиви. С оглед на фактите, че ЖДА има широка разпространеност, а ИТП – хроничен и често инвалидизиращ ход, цитирани-


те съобщения трябва да се имат предвид в хе-матологичната практика. Доказването на НР инфектираност и преценката за провеждане на ерадикация би могло да се включи в общия ле-чебен комплекс. Решението за това зависи из-цяло от клиничния опит на хематолога и регист-рирания индивидуален терапевтичен отговор.


1. Б о я н о в а , Л, Е. Лазарова, Х. Желев и сътр. Фактори, свързани с резистентността на Helicobacter pylori, изоли-рани от деца, към антибактериални средства. – Педиат-рия, 46, 2006, № 1, 31-33.

2. К е н д е р о в а , В., Р. Кабакчиева, П. Переновска и сътр. Клинико-имунологични проблеми при деца с идиопатич-на тромбоцитопенична пурпура. – Педиатрия, 44, 2004, № 1, 26-27.

3. П е ч и л к о в а , М., Е. Генев, З. Вълканова и сътр. Чес-тота на Helicobacter pylori инфекцията при деца със за-болявания на гастродуоденалния сегмент. – Педиатрия, 39, 1999, № 1, 36-38.

4. A n d r e w s , N. Forging a field: the golden age of iron biology. – Blood, 112, 2008, № 2, 219-230.

5. A n n i b a l e B, Capurso G, Martino G, et al. Iron deficiency anemia and Helicobacter pylori infection. – Int. J. Antimicrob. Agents, 16, 2000, № 4, 515-519.

6. B a r a b i n o , A. Helicobacter pylori-related iron deficiency anemia: a review. – Helicobacter, 7, 2002, 71-75.

7. B e u t l e r , E. Hepcidin mimetics from microorganisms? A possible explanation for the effect of Helicobacter pylori on iron homeostasis. – Blood Cells Mol. Dis., 38, 2007, № 1, 54-55.

8. C a r n i c e r , J., R. Badia et J. Argemi. Helocobacter pylori gastritis and sideropenic refractory anemia. – J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr., 25, 1997, 441-444.

9. C h o e , Y. et al. Helicobacter pylori-associated iron-deficiency anemia in adolescents female athletes. – J. Pediatr., 139, 2001, 100-104.

10. C r o w e l l , R. et al. Comparative effectiveness of zinc protoporphyrinand hemoglobin concentrations in identifying iron deficiency in a group of low-income, preschool-aged children: practical implications of recent illness. – Pediatrics, 118, 2006, 224-232.

11. D u f o u r , C. et al. Helicobacter pylori gastric infection and sideropenic refractory anemia. – J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr., 17, 1993, 225-227.

12. E m i l i a , G. et al. Helicobacter pylori infection and chronic immune thrombocytopenic purpura: long-term results of bacterium eradication and association with bacterium virulence profiles. – Blood, 110, 2007, № 12, 3833-3841.

13. E m i l i a , G. et al. Helicobacter pylori eradication can induce platelet recovery in idiopathic thrombocytopenic purpura. – Blood, 97, 2001, № 3, 812-814.

14. G a n z , T. Hepcidin and its role in regulating systemic iron metabolism. – Hematology, 2006, 29-35.

15. G a s b a r r i n i , A. et al. Regression of autoimmune thrombocytopenia after eradication of Helicobacter pylori. – Lancet, 352, 1998, 878.

16. H a s h i n o , S. et al. Platelet recovery in patients with idiopathic thrombocytopenic purpura after eradication of Helicobacter pylori. – Int. J. Hematol., 77, 2003, 188-191.

17. K a t o , S. et al. Accuracy of the stool antigen testfor the diagnosis of childhood Helicobacter pylori infection: a multicen-ter Japanese study. – Am. J. Gastroenterol., 98, 2003, 296-300.

18. K a t o , S. et P. Sherman. What is new related to Helicobacter pylori infection in children and teenagers? – Arch. Pediatr. Adolesc. Med., 159, 2005, 415-421.

19. K u r t o g l u , E., E. Kayacetin et A. Ugur. Helicobacter pylori infection in patients with autoimmune thrombocytopenic purpura. – World J. Gastroenterol., 10, 2004, № 14, 2113-2115.

20. M a l f e r t h e i n e r , P. et al. Current concepts in the management of Helicobacter pylori infection: the Maastricht III Consensus Report. – Gut., 56, 2007, 772-781.

21. M a r i g n a n i , M. et al. Reversal of long-standing iron deficiency anaemia after eradication of Helicobacter pylori infection. – Scand. J. Gastroenterol., 32, 1997, 617-622.

22. M c C r a e , K. Helicobacter pylori and ITP: many questions, few answers. – Blood, 103, 2004, № 3, 752-753.

23. M i c h e l , M. et al. Does Helicobacter pylori initiate or perpetuate immune thrombocytopenic purpura? – Blood, 103, 2004, № 3, 890-896.

24. M i c h e l , M. et al. Autoimmune thrombocytopenic purpura and Helicobacter pylori infection. – Arch. Intern. Med., 162, 2002, 1033-1036.

25. M i l m a n , N. et al. Serum ferritin, hemoglobin and Helico-bacter pylori infection: a seroepidemiologic survey comprising 2794 Danish adults. – Gastroenterol., 115, 1998, 268-274.

26. N e e f j e s , V., H. Heijboer et R. Tamminga. H. pylori infection in childhood chronic immune thrombocytopenic purpura. – Haematologica, 92, 2007, 576.

27. O d e r d a , G. et al. Detection of Helicobacter pylori in stool specimens by non-invasive antigen enzyme immunoassay in children: multicenter Italian study. – BMJ, 320, 2000, 347-348.

28. S u g i y a m a , T. et al. Improvement of long-standing iron-deficiency anemia in adults after eradication of Helicobacter pylori infection. – Intern. Med., 41, 2002, 491-494.

29. T a k a h a s h i , T., T. Yujiri et Y. Tanizawa. Helicobacter pylori and chronic ITP: the discrepancy in the clinical responses to eradication therapy might be due to differences in the bacterial strains. – Blood, 104, 2004, № 2, 594.

30. V e n e r i , D. et al. Efficacy of Helicobacter pylori eradication in raising platelet count in adult patients with idiopathic thrombocytopenic purpura. – Hematologica, 87, 2002, 1177-1179.

31. W i s h , J. Assessing iron status: beyond serum ferritin and transferrin saturation. – Clin. J. Am. Soc. Nephrol., 1, 2006, S4-8.

32. W r i g h t , C. et al. The diagnosis of borderline iron defi-ciency: results of a therapeutic trial. – Arch. Dis. Child., 89, 2004, 1028-1031.

33. Z i m m e r m a n n , M. et al. Serum transferrin receptor and zinc protoporphyrin as indicators of iron status in African children. – Am. J. Clin. Nutr., 81, 2005, 615-623.

Адрес за кореспонденция: Мария Спасова Катедра по педиатрия Медицински университет бул „В. Априлов” № 15а 4000 Пловдив е-mail: [email protected]


АУТОЛОГИЧНАЯ ТРАНСПЛАНТАЦИЯ КРОВЕТВОРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПРИ РАССЕЯННОМ СКЛЕРОЗЕ: РЕЗУЛЬТАТЫ РОССИЙСКОЙ

КООПЕРАТИВНОЙ ГРУППЫ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ Ю. Л. Шевченко1, A. A. Новик1, А. Н. Кузнецов1, Ю. Н. Федотов2, В. Я. Мельниченко1,

Д. A. Федоренко1, Р. В. Круглина1, А. В. Карташов1, T. И. Ионова2, Ю. И. Райнов3 и К. А. Курбатова2 1Национальный медико-хирургический центр им. Н.И. Пирогова Росздрава – Москва, Россия

2Cеверозападный окружной медицинский центр – Санкт Петербург, Россия 3Военномедицинская академия – София, Болгария

AUTOLOGOUS HEMATOPOIETIC STEM CELL TRANSPLANTATION FOR MULTIPLE SCLEROSIS: RESULTS OF THE RUSSIAN СOOPERATIVE GROUP

FOR CELLULAR THERAPY Y. L. Shevchenko1, A. A. Novik1, A. N. Kuznetsov1, J. N. Fedotov2, V. Y. Melnichenko1,

D. A. Fedorenko1, R. V. Kruglina1, A. V. Kartashov1, T. I. Ionova2, J. I. Rainov3 and K. A. Kurbatova2 1National Medical Surgical Centre N. I. Pirogov – Moskow, Russia

2Nord-West Medical Centre – Sankt Petersburg, Russia 3Military Medical Academy – Sofia, Bulgaria

Резюме. Высокодозная химиотерапия с трансплантацией кроветворных стволовых клеток (ВИСТ + ТКСК) является перспективным методом лечения аутоиммунных заболеваний. Особый интерес представляет применение ВИСТ + ТКСК у больных рассеянным склерозом (РС), так как существую-щие методы лечения данного заболевания не позволяют достичь устойчивого терапевтического эффекта. В работе приведены результаты проспективного исследования безопасности и эффек-тивности ВИСТ + ТКСК при РС. В исследовании приняли участие 132 пациента с различными форма-ми и стадиями РС. В зависимости от стадии заболевания больным проводили раннюю транспланта-цию, этапную трансплантацию или трансплантацию спасения. В анализ клинической эффективнос-ти было включено 119 пациентов, у которых срок наблюдения составил более 9 месяцев. У всех па-циентов, кроме одного, был зарегистрирован ответ на терапию: из них у 55 больных наблюдалось клиническое улучшение; у 63 – стабилизация заболевания. Результаты исследования свидетельст-вуют о высокой клинической эффективности ВИСТ + ТКСК при РС. Данный метод лечения приводит к остановке прогрессирования заболевания у больных с различными формами и стадиями РС. Есть основания считать, что ВИСТ + ТКСК наиболее эффективна у молодых пациентов с быстро прог-рессирующим течением РС в ранних стадиях, когда основным патогенетическим механизмом забо-левания является аутоиммунное воспаление. В данной статье также представлены общие положе-ния концепции высокодозной иммуносупрессивной терапии с ТКСК при рассеянном склерозе.

Ключeвые слова: трансплантация стволовых кроветворных клеток, рассеянный склероз, качество жизни

Summary. High-dose immunosuppressive therapy (HDIT) with autologous hematopoietic stem cell transplantation (auto-HSCT) is a promising approach to treatment of autoimmune diseases. HDIT + auto-HSCT in multiple sclerosis (MS) patients is of special interest since there are no effective treatment methods for this disease. In this paper, we present results of a prospective clinical study on safety and efficacy of HDIT + auto-HSCT in MS patients. 132 patients with various types of MS were included in this study. The patients underwent early, conventional or salvage transplantation. Transplantation procedure was well tolerated by the patients. The efficacy analysis was performed in 119 patients who were monitored for more than 9 months. Response to therapy was observed in all, but one, patients, with 55 of them achieving an objective improvement of neurological symptoms, while disease stabilization was

Ю. Шевченко, А. Новик, А. Кузнецов... Аутологичная трансплантация кроветвореных… 19

registered in 63 patients. This study provides ample evidence in support of HDIT + auto-HSCT efficacy in MS patients. The results show that transplantation is effective in patients with various types of MS. They also support the assumption that patients with low disability scores and progressing disease might be the best candidates for HDIT + auto-HSCT. In this paperq we also formulate fundamental principles of the original concept of high-dose chemotherapy with autologous hematopoietic stem cell transplantation for multiple sclerosis.

Key words: stem cell transplantation, multiple sclerosis, quality of life

Введение Среди новых подходов к лечению аутоим-

мунных заболеваний (АИЗ) нервной системы особый интерес представляет программа высо-кодозной иммуносупрессивной терапии с транс-плантацией кроветворных стволовых клеток – метод лечения, позволяющий влиять на иммуно-патогенез АИЗ на клеточном уровне [3].

ТКСК используется как эффективный метод лечения многих гематологических и онкологи-ческих заболеваний в течение 40 лет. Однако лишь в последние годы была доказана эффек-тивность высокодозной иммуноаблативной тера-пии с трансплантацией аутологичных кровет-ворных стволовых клеток при неврологических аутоиммунных заболеваниях, и, прежде всего, при рассеянном склерозе (РС) [3, 12].

Рассеянный склероз-хроническое прогресси-рующее заболевание центральной нервной сис-темы (ЦНС), которое клинически проявляется мультисистемной неврологической симптомати-кой, а патоморфологически характеризуется образованием множественных очагов демиели-низации в белом веществе головного и спинного мозга [14]. Основным механизмом, приводящим к повреждению миелина, является опосредован-

ная Т-лимфоцитами реакция гиперчувствитель-ности замедленного типа, а непосредственными клетками-эффекторами иммунопатологического процесса – макрофаги (рис. 1).

РС занимает третье по частоте место (после цереброваскулярной патологии и эпилепсии) среди заболеваний ЦНС. В России распростра-ненность РС составляет 35-50 больных на 100 000 населения, число новых случаев – 1,6-4,0 на 100 000 населения в год.

Выделяют 4 формы РС: рецидивирующе-ремиттирующую, вторично-прогрессирующую, первично-прогрессирующую и прогрессирующе-рецидивирующую. У 80-85% больных диагнос-тируют рецидивирующе-ремиттирующую форму заболевания, которая у 50% пациентов через 10-15 лет трансформируется во вторично-про-грессирующую [14]. В 10-15% случаев выявляют первично-прогрессирующий РС, характеризую-щийся неуклонным ухудшением неврологичес-кой симптоматики без выраженных обострений и периодов ремиссии; у 5% больных диагности-руют прогрессирующе-рецидивирующую форму РС. Кроме того, многие эксперты выделяют злокачественную, быстро прогрессирующую форму РС.

Рис. 1


Заболевание возникает, как правило, в воз-расте 20-50 лет, чаще у молодых женщин. В це-лом для популяции больных РС не характерно заметное сокращение продолжительность жиз-ни. Общей закономерностью является формиро-вание инвалидизации пациентов в различные сроки после начала заболевания. У подавляю-щего большинства больных рассеянный склероз ведет к быстрому и значительному ухудшению качества жизни.

Существующие методы лечения не позволя-ют достичь выраженного и устойчивого терапев-тического эффекта. Выдвигалась гипотеза, осно-ванная на доклинических данных, о высокой эффективности аллогенной ТКСК. Однако неп-риемлемая посттрансплантационная леталь-ность не позволила использовать этот подход в клинической практике. Одним из перспективных методов лечения РС многие эксперты считают ВИСТ + ТКСК. В настоящее время в мире выполнено более 700 трансплантаций больным с различными формами РС. Безопасность и эффективность метода изучена в междуна-родных многоцентровых исследованиях [4, 7, 8, 10]. К нерешенным вопросам ВИСТ + ТКСК отно-сятся следующие: показания, методы трансп-лантации, режимы кондиционирования, депле-ция Т-лимфоцитов, фармакоэкономическое обоснование и др. [6, 9, 17].

Разработана концепция ВИСТ + ТКСК при РС, включающая следующие положения: содер-жание метода, основные показания, методику проведения трансплантации, общий алгоритм, направления дальнейших исследований [1]. В рамках концепции выделено две принципиальн-ые цели лечения больных РС. Первая из них патогенетическая – остановить прогрессирова-ние заболевания и предотвратить появление новых очагов демиелинизации в ЦНС за счет воздействия на иммунопатологический процесс на различных уровнях. Вторая цель, основная или конечная, состоит в сохранении и, по воз-можности, в улучшении качества жизни больных. Данные положения основаны на теории приня-тия решений в клинической медицине, согласно которой в формализованном виде существует три возможных цели лечения больного:

– излечение с учетом качества жизни боль-ного после выздоровления

– увеличение продолжительности жизни больного с учетом ее качества

– улучшение качества жизни больного. При РС, хроническом неизлечимом заболе-

вании, в большинстве случаев не снижающем продолжительность жизни больного, максималь-но возможное восстановление и сохранение

параметров качества жизни является приоритет-ной целью лечения. Вследствие этого, наряду с традиционными лабораторными и инструмен-тальными тестами, описывающими изменения в течении патологического процесса на фоне те-рапии, к ключевым критериям эффективности лечения РС следует отнести и показатели качес-тва жизни больного, отражающие сложный ком-плекс физических, психологических и соци-альных детерминант, свойственных конкретному индивидууму.

Учитывая вышесказанное, в рамках концеп-ции выделены 3 вида трансплантации, отлича-ющиеся по целям и времени проведения опера-ции [1, 19]:

Ранняя трансплантация 1. Патогенетическая цель – предупредить

развитие необратимых изменений в ЦНС в ре-зультате иммунопатологического процесса.

2. Основная цель – сохранить качество жиз-ни больного, предотвратить формирование ин-валидизации.

3. Время проведения – в дебюте заболевания. Этапная трансплантация 1. Патогенетическая цель – остановить прог-

рессирование заболевания на фоне самопод-держивающегося иммунопатологического про-цесса, имеющихся очагов необратимых измене-ний и частично утраченных функций, предупре-дить появление новых очагов поражения.

2. Основная цель – улучшить качество жизни больного и сохранить его на максимально воз-можном уровне, предупредить углубление инва-лидизации пациента.

3. Время проведения – на различных этапах прогрессирования РС при выходе заболевания из-под контроля традиционных методов лечения.

Трансплантация спасения 1. Патогенетическая цель – остановить прог-

рессирование заболевания на фоне большого количества очагов необратимых изменений и существенно нарушенных функций, предупре-дить появление новых очагов поражения.

2. Основная цель – сохранить качество жиз-ни больного на максимально возможном уровне, предотвратить наступление критической инва-лидизации.

3. Время проведения – в далеко зашедшей стадии заболевания при высокой активности иммунопатологического процесса, быстром прогрессировании инвалидизации больного.

Основные положения концепции подтверж-дены результатами проспективного многоцент-рового исследования Российской кооперативной группы клеточной терапии, направленного на

Ю. Шевченко, А. Новик, А. Кузнецов... Аутологичная трансплантация кроветвореных… 21

изучение эффективности ВИСТ + ТКСК у больных различными формами РС [2, 18].

В данной статье представлены результаты исследования безопасности и эффективности ВИСТ + ТКСК у 132 больных РС, находившихся под наблюдением в Военно-медицинской акаде-мии (Санкт-Петербург) и в Национальном меди-ко-хирургическом центре им. Н. И. Пирогова (Москва), начиная с 1999 года.

Материалы и методы Исследование проводили в соответствии с

принципами Хельсинкской декларации. Было получено одобрение комитетов по этике цент-ров, участвовавших в исследовании. Все больн-ые, включенные в исследование, подписывали информированное согласие на участие в нем.

Критериями включения пациента в исследо-вание были:

– возраст от 17 до 55 лет – верифицированный диагноз РС – значение по шкале EDSS от 1,5 до 8,5 – отсутствие когнитивных нарушений – отсутствие тяжелых сопутствующих забо-

леваний. Активность заболевания определяли с по-

мощью магнитно-резонансной томографии, показ-ывающей наличие свежих очагов демиелинизации в ЦНС, либо клинически – при наличии данных, свидетельствующих о быстром прогрессировании заболевания. Были выделены три группы пациен-тов в зависимости от вида трансплантации [19]:

– Ранняя трансплантация проводилась при EDSS от 1,5 до 3,0.

– Этапная трансплантация проводилась при EDSS от 3,5 до 6,5.

– Трансплантация спасения проводилась при EDSS от 7,0 до 8,5.

Мобилизация кроветворных стволовых клеток и процедура трансплантации

Мобилизацию кроветворных стволовых кле-ток проводили с использованием Г-КСФ в дозе 10 мкг/кг/день в соответствии с рекомендациями EBMT/EULAR [20]. Для сепарации КСК использо-вали прибор “Haemonetics MCS+”. Кондициони-рование проводили с использованием высоко-дозной иммуноаблативной терапии BEAM (BCNU, этопозид, цитозар и мелфалан) или mini-BEAM. После проведения кондиционирования в день 0 осуществляли аутологичную трансплан-тацию кроветворных стволовых клеток для вос-становления кроветворной и иммунной систем пациента. В целях деплеции Т-лимфоцитов in vivo в первый и второй дни после транспланта-ции большинству пациентов (67 человек) вводи-

ли антитимоцитарный иммуноглобулин в дозе 30 мг/кг. Для профилактики инфекционных ослож-нений проводили терапию ципрофлоксацином, флуконазолом и ацикловиром; кроме того, осу-ществляли внутривенное введение препаратов человеческого иммуноглобулина.

Оценка эффективности терапии Изучение неврологического статуса включало

определение выраженности неврологического дефицита по шкале EDSS [11] и активности забо-левания на основании данных магнитно-резо-нансной томографии (МРТ). Неврологический ста-тус оценивали до ВИСТ + ТКСК, при выписке из стационара, через 3, 6, 9 и 12 месяцев после тран-сплантации, затем – каждые 6 месяцев в течение первых 4 лет и ежегодно впоследствии.

Ответ на лечение определяли по изменению степени инвалидизации больного и активности заболевания. Клинический ответ оценивали че-рез 6, 12 и 24 месяца после ВИСТ + ТСКК на основании динамики степени инвалидизации больного. В соответствии с критериями EBMT клиническим улучшением считали уменьшение выраженности неврологической симптоматики, по меньшей мере, на 0,5 балла по шкале EDSS по сравнению с исходным уровнем, при условии, что это улучшение было подтверждено через 3 месяца на следующем визите. Стабилизацией состояния считали отсутствие изменений по шкале EDSS после трансплантации по сравнению с исходным значением. Любое увеличение выраженности нев-рологической симптоматики по шкале EDSS счи-талось прогрессированием заболевания.

Выделяли следующие варианты ответа на ле-чение по данным МРТ: улучшение, стабилизацию или ухудшение. Улучшению соответствовали сле-дующие изменения – исчезновение активных оча-гов при неизменном количестве и объеме старых очагов; уменьшение количества активных очагов при неизменном количестве и объеме старых оча-гов; уменьшение количества или объема старых очагов при отсутствии очагов, накапливающих контраст. Стабилизацию констатировали при не-изменном количестве и объеме старых очагов и отсутствии очагов, накапливающих контраст. Ухудшение диагностировали при появлении новых очагов, накапливающих контраст или увеличении количества и объема старых очагов.

Результаты Характеристика больных Основные данные о включенных в исследо-

вание больных представлены в табл. 1. В иссле-довании приняли участие 132 пациента: из них 58 мужчин и 74 женщины; их средний возраст


составил 33,7 года (от 17 до 54 лет). У всех па-циентов отмечалась ограниченная эффектив-ность предшествующей терапии стероидными гормонами, АКТГ, азатиоприном, митоксантро-ном, ИФН-β, такролимусом, иммуноглобулином, гипербарической оксигенацией, плазмафереза-ми. У 45 пациентов была диагностирована вто-рично-прогрессирующая форма заболевания (ВПРС), у 25 – первично-прогрессирующая (ППРС), у 5 – прогрессирующе-рецидивирующая (ПРРС) и у 57 – рецидивирующе-ремитирующая (РРРС). Средняя продолжительность заболева-ния составила 7,9 лет (от 0,5 года до 24 лет). В момент скрининг-визита значение шкалы EDSS варьировало от 1,5 (минимальное нарушение одной из функциональных систем) до 8,5 (отсут-ствие способности к самостоятельному перед-вижению, в основном постельный режим) при медиане 4,5 балла (способность пройти 100 метров самостоятельно, без отдыха). У одного из пациентов непосредственно перед проведе-нием мобилизации КСК наблюдалось нараста-ние неврологической симптоматики с увеличе-нием значения EDSS с 7,5 до 8,0.

Таблица 1. Демографическая и клиническая характеристи-ка больных

Показатель Значение

Общее число пациентов 132

Пол (мужчины/женщины) 58/74

Средний возраст, годы (диапазон) 33,0 (17- 54)

Форма заболевания:

Вторично-прогрессирующий РС (ВПРС) 45

Прогрессирующе-рецидивирующий РС (ПРРС) 5

Первично-прогрессирующий РС (ППРС) 25

Рецидивирующе-ремиттирующий РС (РРРС) 57

Средняя продолжительность заболевания (годы) 5,0 (0,5-24)

Медиана EDSS (диапазон) 4.5 (1.5-8.5)

64 пациентам была проведена этапная ВИСТ

+ ТКСК; 61 – ранняя трансплантация; 7 – трансп-лантация спасения (табл. 2).

Отдельно была выделена группа больных, которым проводили консолидирующую терапию (митоксантрон) после ВИСТ+ТКСК. В эту группу вошли пациенты, имеющие факторы риска. В

настоящее время данная группа включает 34 пациента; анализ результатов лечения в этой группе будет проведен в конце 2010 г.

Информация о переносимости и побочных эффектах трансплантации

Процедура трансплантации хорошо переноси-лась больными. Не было отмечено летальных исходов и тяжелых осложнений в посттрансплан-тационном периоде. Частыми побочными эффек-тами кондиционирования были тромбоцитопения (100%), нейтропения (100%), слабость (100%), aнемия (80%), aлопеция (80%), нейтропеническая лихорадка (52%), гепатотоксичность I и II ст. (48%), преходящие неврологические дисфункции (22%), энтеропатия (19%). Указанные побочные эффекты носили временный характер и полностью нивели-ровались к моменту выписки больных из стацио-нара. К симптомам, разрешение которых потребо-вало более длительного времени (от 1 до 6 мес.), относились слабость и алопеция.

Эффект трансплантации В анализ клинической эффективности были

включены 119 больных со сроком наблюдения 9 месяцев и более в соответствии с требованиями протокола. Среди них было 39 пациентов с вто-рично-прогрессирующим РС, 22 – с первично-прогрессирующим, 4 – с прогрессирующе-рециди-вирующим и 54 – с рецидивирующим ремитирую-щим РС. Из них 26 больным проведено кондицио-нирование с использованием BEAM; остальным – mini-BEAM. В этой группе больных 57 пациентам была проведена этапная трансплантация; 55 – ранняя трансплантация и 7 – трансплантация спа-сения. 8 пациентов не были включены в анализ в связи со сроком наблюдения менее 9 мес., 5 паци-ентов – не прошли необходимое обследование в объеме, предусмотренном протоколом.

Средний срок наблюдения в группе составил 21,9 месяцев (от 6 до 127 месяцев). У всех паци-ентов, кроме одного (больной Г., 39 лет, с пер-вично-прогрессирующим РС, исходный ЕDSS 6,0), был зарегистрирован ответ на терапию (табл. 3). Через 6 месяцев после ВИСТ+ТКСК у 55 (46%) больных имело место клиническое улучшение (снижение исходного значения EDSS, по крайней мере, на 0,5 балла); у 63 (53%) паци-ентов – стабилизация состояния (сохранение исходного значения EDSS).

Ю. Л. Шевченко, А. А. Новик, А. Н. Кузнецов... Аутологичная трансплантация кроветворных... 23

Таблица 2. Распределение больных в зависимости от вида трансплантации

Вид трансплантации Общее количество больных Количество больных, включенных в анализ эффективности

Ранняя трансплантация (EDSS 1.5-3.0) 61 (6 ВПРС, 3 ППРС, 52 РРРС) 55 (3 ВПРС, 3 ППРС, 49 РРРС)

Этапная трансплантация (EDSS 3.5-6.5) 64 (36 ВПРС, 19 ППРС, 4 ПРРС, 5 РРРС) 57 (33 ВПРС, 16 ППРС, 3 ПРРС 5 РРРС)

Трансплантация спасения (EDSS 7.0-8.5) 7 (3 ВПРС, 3 ППРС, 1 ПРРС) 7 (3 ВПРС, 3 ППР, 1 ПРРС)

Таблица 3. Клинический ответ на лечение в различные сроки после ВИСТ+ТСКК

Характеристика ответа на лечение

Количество больных/общее количество больных (% от

общего количества больных) через 9 месяцев после ВИСТ

+ ТСКК


общего количества больных) через 12 месяцев после

ВИСТ + ТСКК


общего количества больных) отдаленные сроки после

ВИСТ + ТСКК

Улучшение 55/119 (46%) 49/88 (56%) 37/59 (63%)

Стабилизация 63/119(53%) 38/88 (43%) 19/59 (32%)

Прогрессирование 1/119(1%) 1/88 (1%) 3/59 (5%)

Через 1 год после ВИСТ+ТКСК наблюдалось

следующее распределение больных согласно клиническому ответу на лечение: стабилизация заболевания – 38 (43%) больных, клиническое улучшение – 49 (56%) больных. Еще у одной больной зарегистрировано прогрессирование заболевания через 12 месяцев после трансплан-тации (больная А., 46 лет, с вторично-прогрессирующим РС, ЕDSS 5,5). Двое больных выбыли из исследования (через 9 месяцев боль-ной Д., 28 лет, с вторично-прогрессирующим РС, ЕDSS 6,0 и больная М., 30 лет, с вторично-прогрессирующим РС, ЕDSS 4,0) в связи с обос-трением заболевания, потребовавшим назначе-ния цитостатической терапии.

В отдаленные сроки после ВИСТ + ТКСК (медиана наблюдения 21,9 месяцев) из 59 вклю-ченных в анализ больных улучшение наблюда-лось у 37 (63%), стабилизация – у 19 (32%), прогрессирование – у 3 (5) % больных. Прогрес-сирование после проведения этапной трансп-лантации зарегистрировано через 18 месяцев у больной Д. (39 лет, рецидивирующий ремитиру-ющий РС, исходный EDSS 3,5) и через 6 лет у больного З. (44 года, первично-прогрессирующий РС, исходный ЕDSS 6,0) и после проведения ранней трансплантации через 2,5 года у больно-го К. (25 лет, рецидивирующий ремитирующий РС, исходный EDSS 2.0).

В отдаленные сроки после лечения клини-ческий эффект в виде улучшения (65% больных) или стабилизации (31% больных) зарегистриро-ван у подавляющего большинства больных, ко-торым проведена ранняя трансплантация. В группе больных с этапной трансплантацией улучшение зарегистрировано в 65,5%, стабили-зация – в 27,5% случаев, прогрессирование пос-ле клинического ответа – у 7% больных. После

трансплантации спасения улучшение зарегист-рировано в 25%, стабилизация – в 75% случаев.

Динамику активности заболевания оценива-ли по результатам МРТ. Данные МРТ с контрас-тированием до ТСКК имелись у 125 больных; из них у 45 человек очаги накапливали контраст. Через 3 и 6 месяцев после ВИСТ + ТКСК у всех больных, которым была выполнена МРТ, отсутс-твовали очаги, накапливающие контраст, и не было зарегистрировано появления новых очагов, а также увеличения размеров старых очагов в головном и спинном мозге. Через 9 месяцев пос-ле трансплантации у 3 больных были зарегист-рированы очаги, накапливающие контраст, или выявлено появление новых очагов. В отдален-ные сроки после ВИСТ + ТКСК (через 18 месяцев, 2,5 года и 9 лет) еще у 3 больных зарегистрирова-но появление очагов, накапливающих контраст, что впоследствии сопровождалось нарастанием неврологического дефицита по шкале EDSS, сви-детельствующим о прогрессировании заболева-ния. У остальных больных по данным МРТ наблю-дались либо стабилизация, либо улучшение. У всех больных с улучшением и стабилизацией от-сутствовали очаги, накапливающие контраст.

На рисунке 2 представлены кривые выжи-ваемости у больных рассеянным склерозом после ранней и этапной ВИСТ + ТСКК. Как видно из данных рисунка, 3-летняя выживаемость без прог-рессирования РС составила 92% в группе боль-ных, которым проведена ранняя трансплантация, и 94% – в группе после этапной трансплантации.

Данные клинического наблюдения Рассмотрим результаты ВИСТ+ТКСК у боль-

ного С., 1972 года рождения. Диагноз: рассеянный склероз, церебро-спи-

нальная форма, вторично прогрессирующее течение. Длительность заболевания до ВИСТ + ТКСК – 3 года.


Complete Censored

ранняя этапная0 20 40 60 80 100 120 140

months

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0pr

ogre

ssio

n-fre

e su

rviv

al

Рис. 2. Кривые выживаемости у больных рассеянным скле-розом после ранней и этапной ВИСТ + ТКСК

Анамнез: с 2004 года отметил снижение зре-ния на левый глаз. Через 6 месяцев появилась шаткость походки, двоение в глазах. При МРТ головного мозга в 2004 г. в белом веществе обо-их полушарий в проекции мозолистого тела выявлены множественные полиморфные очаги размером до 14 мм. При обследовании у нейро-офтальмолога диагностирован ретробульбарный неврит. Проводилась терапия циклофероном, плазмаферезом без отчетливого результата. В последующем наблюдались обострения 2 раза в год. По данным МРТ в 2006 г. отмечена выра-женная отрицательная динамика: появление множественных очагов в шейном отделе спинно-го мозга. На фоне проводимой терапии (пульс-терапия солюмедролом, плазмаферез, цикло-ферон, метаболическая ноотропная терапия) отмечалось прогрессирующее нарастание шат-кости походки, ухудшение зрения.

В январе 2007 г. больной С. поступил в кли-нику гематологии и клеточной терапии им. А. А. Максимова Национального Медико-хирургического центра им. Н. И. Пирогова для проведения ВИСТ + ТКСК. Значение ЕDSS до ВИСТ + ТСКК – 5,0 баллов. Данные МРТ при поступлении (от 16.01.2007г.): 48 очагов размерами от 4 mm до 22 mm (перивентрикулярная зона справа) в го-ловном мозге; 3 очага от10 до 13 mm в шейном отделе позвоночника. В головном мозге обнару-жено 22 очага, накапливающих контрастный препарат (диаметром от 3 до 12 mm); в шейном отделе спинного мозга 1 очаг, накапливающий контрастный препарат диаметром 5 мм. На рис. 3 представлены результаты МРТ больного С. до трансплантации.

ВИСТ + ТКСК проведена 06.02.2007. Конди-ционирование выполнено по программе mini-ВЕАМ-M+АТГ. В посттрансплантационном периоде были зарегистрированы следующие побочные эффекты: нейтропения IV ст. (с максимальным снижением лейкоцитов до 0,09 x 109/l) – с Д + 4 по Д + 9; тромбоцитопения IV ст. (с максимальным

снижением тромбоцитов до 10 x 109/l) с Д + 4 по Д + 11; нейтропеническая лихорадка без очаго-вой инфекции – Д + 7. Терапия сопровождения включала: G-CSF с Д + 1 по Д + 10 в дозе 5 μg/kg; меронем 3,0 g/сут – 7 дней; однократное переливание тромбоконцентрата – 1 доза.

Рис. 3. Данные МРТ больного С. до ВИСТ+ТКСК Примечание: множественные очаги, накапливающие конт-растный препарат, в перивентрикулярной зоне по ходу лучистого венца; очаг с кольцевидным накоплением конт-растного препарата в мозжечке

При контрольном обследовании через 3 ме-сяца после трансплантации у больного С. отме-чено снижение индекса инвалидизации EDSS до 4,0 баллов (исходное значение 5,0 баллов). Данные МРТ через 3 мес после ТСКК (от 25.05.07 г.): 46 очагов размерами от 4 mm до 15 mm в головном мозге; 3 очага протяженностью от 10 mm до 13 mmв шейном отделе позвоноч-ника. Очагов, накапливающих контрастный пре-парат в головном и спинном мозге, нет. Индекс центральных отделов боковых желудочков –25\135 х 100 = 18,5 (N = 18,2-26). Индекс перед-них рогов боковых желудочков – 40\138 х 100 = 29 (N = 29,4-31). По данным МРТ зарегистриро-вана положительная динамика в виде уменьше-ния количества (с 48 до 46 – исчезновение двух очагов в перивентрикулярной зоне слева) и размеров очагов в головном мозге (уменьшение размера очага в перивентрикулярной зоне справа с 22 mm до 15 mm) при отсутствии на-копления контрастного препарата в головном мозге и шейном отделе спинного мозга. Данные МРТ через 3 месяца после ВИСТ + ТКСК предс-тавлены на рис. 4.


Рис. 4. Данные МРТ больного С. через 3 месяца после ВИСТ+ТКСК Примечание: очаги, накапливающие контрастный препарат, отсутствуют.

В дальнейшем, через 6, 12 и 18 месяцев пос-ле ВИСТ + ТКСК значение EDSS сохранялось на уровне 4,0; данные МРТ были без динамики по сравнению с данными от 25.05.07 г.

Таким образом, у больного С. зарегистриро-ван ответ на лечение в виде клинического улуч-шения (снижения EDSS на 1,0 балл) и улучше-ния МРТ (исчезновение активных очагов пора-жения в головном и спинном мозге).

Обсуждение В настоящее время метод ВИСТ + ТКСК при

рассеянном склерозе проходит клинические ис-следования в ряде стран Европы, Северной и Южной Америки и Азии. Большинство рандоми-зированных исследований, посвященных оценке эффективности ВИСТ + ТКСК при РС, еще не завершены. Тем не менее, их предварительные результаты свидетельствуют о высокой эффек-тивности и безопасности данного метода.

В России этот метод лечения РС применяет-ся, начиная с 1999 года. Имеющиеся данные подтверждают результаты зарубежных коллег об эффективности ВИСТ + ТКСК у больных с разн-ыми формами и стадиями РС [7, 10, 13, 16]. По-лучены следующие данные по безопасности ВИСТ + ТКСК: процедура трансплантации хоро-шо переносилась больными; не было отмечено летальных исходов и тяжелых осложнений в посттрансплантационном периоде. Эти резуль-таты соответствуют данным зарубежных иссле-дований последних лет, согласно которым, на-

чиная с 2000 года, не было зарегистрировано летальных исходов при проведении аутологич-ной трансплантации стволовых кроветворных клеток [8, 15].

Эффект ВИСТ + ТКСК оценивали по измене-нию степени инвалидизации больного и актив-ности заболевания. Заслуживает внимания тот факт, что клинический ответ на терапию через 9 месяцев после трансплантации был отмечен у подавляющего большинства (99%) пациентов. Причем у половины больных было зарегистри-ровано клиническое улучшение (уменьшение выраженности неврологической симптоматики, по меньшей мере, на 0,5 балла по шкале EDSS по сравнению с исходным уровнем); у остальных – стабилизация состояния (отсутствие измене-ний по шкале EDSS после трансплантации по сравнению с исходным значением). По данным МРТ у всех больных (за исключение одного больного без ответа на лечение) имелось либо улучшение (исчезновение активных очагов при неизменном количестве и объеме старых очагов; уменьшение количества активных очагов при неизменном количестве и объеме старых очагов; уменьшение количества или объема старых оча-гов при отсутствии очагов, накапливающих конт-раст), либо стабилизация процесса (неизменное количество и объем старых очагов при отсутст-вии очагов, накапливающих контраст). В отда-ленные сроки после ВИСТ+ТКСК (медиана наб-людения 20 месяцев) у большинства больных наб-людалось либо клиническое улучшение, либо ста-билизация состояния. Положительный эффект ВИСТ + ТКСК в отдаленные сроки после трансп-лантации зарегистрирован у 94% больных, включенных в исследование. У всех больных с улучшением и стабилизацией отсутствовали очаги, накапливающие контраст.

Следует особо отметить, что в данное ис-следование включали больных, которым прове-дена ранняя ВИСТ + ТКСК, этапная ВИСТ + ТКСК и трансплантация отчаяния. Раннюю тран-сплантацию (EDSS от 1,5 до 3,0) проводят в де-бюте заболевания с целью предупредить его прогрессирование и последующее развитие не-обратимых изменений в ЦНС, предотвратить формирование инвалидизации пациента. Этап-ную трансплантацию (EDSS от 3,5 до 6,5) выполняют на различных этапах прогрессирова-ния РС при выходе заболевания из-под контроля традиционных методов лечения с целью остано-вить прогрессирование заболевания, предупре-дить появление новых очагов поражения. Ос-новная цель этого вида трансплантации - улуч-шить качество жизни больного и сохранить его на максимально возможном уровне, предупре-


дить углубление инвалидизации пациента. Тран-сплантация спасения (EDSS от 7,0 до 8,5) пред-назначена для больных с далеко зашедшими формами РС, с большим количеством очагов не-обратимых изменений в ЦНС, существенно на-рушенными функциями и высокой активностью иммунопатологического процесса. Целью этой трансплантации является остановка прогресси-рования заболевания, предупреждение появле-ние новых очагов поражения, сохранение качес-тва жизни больного на максимально возможном уровне, предотвращение наступления критичес-кой инвалидизации. Обратим внимание, что в рамках данного исследования у подавляющего большинства больных (95,8%), которым прове-дена ранняя трансплантация, в отдаленные сро-ки после ВИСТ + ТКСК имелся клинический эффект в виде улучшения или стабилизации. В группе больных после этапной трансплантации клиническая эффективность составила 89,6%. Можно полагать, что проведение ранней имму-носупрессивной терапии с трансплантацией КСК является одной из многообещающих стратегий ВИСТ + ТКСК. Именно этот вид ВИСТ + ТКСК позволяет обеспечить контроль над иммунопа-тологическим процессом на этапе отсутствия необратимых изменений в ЦНС. На сегодняшний день – это один из эффективных подходов, да-ющий шанс на полное прекращение прогресси-рования заболевания.

Еще один важный аспект, связанный с про-ведением ВИСТ+ТКСК, касается выбора режима кондиционирования/иммуносупрессии. Большой интерес представляют программы транспланта-ции с применением немиелоаблативных режи-мов кондиционирования [5, 12]. Они снижают вероятность посттрансплантационных осложне-ний и расширяют перечень показаний за счет включения в список кандидатов на транспланта-цию больных с плохим общесоматическим ста-тусом. В данном исследовании 26 пациентам проведено кондиционирование с использовани-ем миелоаблативного режима (BEAM); осталь-ным – немиелоаблативного (mini-BEAM). В связи с тем, что общее количество случаев прогресси-рования чрезвычайно мало (5 больных), на ос-новании полученных данных трудно проводить сравнительных анализ эффективности ВИСТ + ТКСК в зависимости от режима кондиционирова-ния. Однако и на данном этапе исследования с высокой степенью вероятности можно утверж-дать, что миелоаблативный режим BEAM не имеет преимуществ в сравнении с немиелоабла-тивным mini-BEAM с точки зрения клинической эффективности. Преимущества немиелоабла-тивных режимов с точки зрения безопасности не вызывают сомнений.

Наглядной демонстрацией высокой эффек-тивности ВИСТ+ТКСК являются данные приве-денного в статье клинического наблюдения больного С., имеющего вторично прогрессирую-щее течение РС. Результат ВИСТ+ТКСК в тече-ние 18 месяцев наблюдения - ответ на лечение в виде улучшения, характеризующийся снижением степени инвалидизации и отсутствием активнос-ти заболевания. Обратим внимание, что данному больному проведено кондиционирование по не-миелоаблативному режиму mini-BEAM.

Заключение Следует отметить, что ВИСТ+ТКСК открыва-

ет большие перспективы лечения различных форм и стадий РС. Решение сложных вопросов иммуносупрессивной терапии с трансплантацией стволовых кроветворных клеток, включая сроки проведения трансплантации, критерии отбора пациентов, режимы кондиционирования и другие, требует интеграции специалистов, занимающихся разработкой новых методов лечения РС, для оп-ределения основных направлений дальнейших клинических исследований в данной области.


1. Н о в и к , А. А. и А. Н. Богданов. Принципы трансплантации костного мозга и стволовых клеток периферической крови. Военно-медицинская академия, Санкт-Петербург, 2001.

2. Ш е в ч е н к о , Ю. Л. Аутологичная трансплантация кро-ветворных стволовых клеток при рассеянном склерозе: результаты исследования Российской кооперативной группы клеточной терапии. – Неврологический журнал, 2008, № 2, 11-18.

3. B r e n n e r , M. K. Haematopoietic stem cell transplantation for autoimmune disease: limits and future potential. – Best Pract. Res. Clin. Haematol., 17, 2004, № 2, 359-374.

4. B u r t , R. K. et al. Hematopoietic stem cell transplantation for multiple sclerosis. – Arch. Neurol., 62, 2005, 860-864.

5. B u r t , R. K. et al. Randomized controlled trials of autologous hematopoietic stem cell transplantation for autoimmune diseases: the evolution from myeloablative to lymphoablative transplant regimens. –Arthritis. Rheum., 54, 2006, № 12, 3750-3760.

6. C o m i , G. et al. Guidelines for autologous blood and marrow stem cell transplantation in multiple sclerosis: a consensus report written on behalf of the European Group for Blood and Marrow Transplantation and the European Charcot Foundation. – J. Neurol., 247, 2000, 376-382.

7. F a s s a s , A. et al. Autologous stem cell transplantation in progressive multiple sclerosis – an interim analysis of efficacy. – J. Clin. Immunol., 20, 2000, № 1, 24-30.

8. F a s s a s , A. et R. Nash. Multiple sclerosis. – Best Pract. Res. Clin. Hematol., 17, 2004, 247-262.

9. F a s s a s , A. et al. Hematopoietic stem cell transplantation for multiple sclerosis. A retrospective multicentre study. – J. Neurol., 249, 2002, 1088-1097.

10. K o z a k , T. et al. High-dose immunosuppressive therapy with PBPC support in the treatment of poor risk multiple sclerosis. – Bone Marrow Transplant., 25, 2000, 525-531.

11. K u r t z k e , J. F. Rating neurologic impairment in multiple sclerosis; an expanded disability status scale (EDSS). – Neurology, 33, 1983, 1444-1452.


12. M a r m o n t , A. M. Will hematopoietic stem cell transplantation cure human autoimmune diseases? – J. Autoimmunity, 30, 2008, 145-150.

13. N a s h , R. A. et al. High-dose immunosuppressive therapy and autologous peripheral blood stem cell transplantation for severe multiple sclerosis. – Blood, 102, 2003, 2364-2372.

14. N o s e w o r t h y , J. H. et al. Multiple sclerosis. – N. Engl. J. Med, 343, 2000, 938-952.

15. S a c c a r d i , R. et al. Autoimmune Diseases Working Party of EBMT. Autologous stem cell transplantation for progressive multiple sclerosis: update of the European Group for Blood and Marrow Transplantation autoimmune diseases working party database. – Mult. Scler., 12, 2006, № 6, 814-823.

16. S a c c a r d i , R. et al. Autologous HSCT for severe progressive multiple sclerosis in a multicenter trial: impact on disease activity and quality of life. – Blood, 105, 2005, № 6, 2601-2607.

17. S h e v c h e n k o , Y. et al. Autologous hematopoietic stem cell transplantation in multiple sclerosis. – Cell. Therapy and Transpl., 1, 2008, № 2.

18. S h e v c h e n k o , Y. et al. High-dose immunosuppressive therapy with autologous hematopoietic stem cell

transplantation as a treatment option in multiple sclerosis. – Experimental Hematology, 36, 2008, № 8, 922-928.

19. S h e v c h e n k o , Y. L. et al. Three strategies of high dose chemotherapy + autologous stem cell transplantation in autoimmune diseases. – Bone Marrow Transplantation, 33, 2004, Suppl. 1, 346.

20. T i n d a l l , A. et A. Gratwohl. Blood and marrow stem cell transplants in autoimmune disease: A consensus report written on behalf of the European League against Rheumatism (EULAR) and the European Group for Blood and Marrow transplantation (EBMT). – Bone Marrow Transplant., 19, 1997, 643-645.

Адрес за кореспонденция: Ю. Л. Шевченко Национальный медико-хирургический центр им. Н. И. Пирогова Росздрава Москва Россия


КЛИНИЧНО ПРОСЛЕДЯВАНЕ НА ТЕРАПЕВТИЧНИЯ ЕФЕКТ ПРИ БОЛНИ С НО-ВОДИАГНОСТИЦИРАНА ОСТРА МИЕЛОИДНА ЛЕВКЕМИЯ,

ЛЕКУВАНИ В НСБАЛХЗ Бр. Спасов1, П. Ганева1, М. Генова2, Г. Балаценко3 и Г. Михайлов1

1Клиника по хематология, 2Лаборатория по хематопатология и имунология, 3Лаборатория по цитогенетика и молекулярна биология

Национална специализирана болница за активно лечение на хематологичните заболявания – София

CLINICAL FOLLOW UP OF THE THERAPEUTIC RESPONSE IN PATIENTS WITH DE NOVO ACUTE MYELOID LEUKEMIA, TREATED IN NSBALHZ

B. Spassov 1, P. Ganeva1, M. Guenova2, G. Balatzenko3, G. Michailov1 1Hematology Clinic, 2Laboratory of Haematopathology and Immunology

3Laboratory of Cytogenetics and Molecular Biology

National Specialized Hospital for Active Treatment of Hematological Diseases – Sofia

Резюме. Прилагането на различни терапевтични протоколи за лечение на пациенти с остра миело-идна левкемия (ОМЛ) води до поява на значителни различия по отношение на терапевтичните ре-зултати. Целта на настоящото проучване е да се съпоставят резултатите от различни терапев-тични протоколи, прилагани в Националната болница за активно лечение на хематологични заболя-вания (НСБАЛХЗ) и други хематологични центрове по света. Бяха проследени 56 пациенти с de novo ОМЛ на възраст между 16 и 59 години, които бяха лекувани в НСБАЛХЗ – София. Пълна ремисия (ПР) беше установена при 55,4% от пациентите, общата преживяемост (ОП) на 48-ия месец беше 18,8%, докато индукционна смъртност (ИС) беше налице при 19,6% от случаите. В сравнение с данните от други световни хематологични центрове беше установено, че нашите резултати по отношение на гореспоменатите критерии са значително по-лоши поради субоптималното дозиране на антрацик-линовите производни, прилагане на ниски кумулативни дози на Цитозар в хода на консолидиращото лечение и ниската честота на прилагане на трансплантираща терапия. Необходимо е да бъде про-ведено проспективно проучване върху по-голям брой болни за валидиране на получените резултати.

Ключови думи: остра миелоидна левкемия, терапевтичен ефект

Summary. The application of different therapeutic protocols in acute myeloid leukemia (AML) patients leads to formidable differences regarding therapeutic results. The aim of the present study is to compare the results from various therapeutic protocols, performed in National Specialized Hospital for Active Treatment of Hematological Diseases (NSBALHZ) – Sofia and other hematological centers all over the world. The clinical follow up was carried out upon 56 patients with de novo ОМЛ, aged 16-59, treated in NSBALHZ. A complete remission was induced in 55,4% of the patients, overall survival was 18,8% at 48 months, whereas induction death was registered in 19,6% of the cases. Comparing the data gathered from our and other hematological centers all over the world, it was observed that our therapeutic results regarding the abovementioned criteria are significantly worse due to suboptimal dosing of anthracyclin derivatives, low cumulative doses of Cytosar during the consolidation therapy and low transplantation activity. A larger prospective study is necessary to be carried out to confirm these results.

Keywords: acute myeloid leukemia, therapeutic response

Б. Спасов, П. Ганева, М. Генова... Клинично проследяване на терапевтичния ефект... 29

Въведение

За лечението на острата миелоидна левке-мия (ОМЛ) се използват множество терапевтич-ни протоколи, при които се наблюдават различия във вида на използваните цитостатици, тяхната дозировка и начин на приложение. Налице са значителни различия по отношение на постигна-тите терапевтични резултати като честота на постигане на пълна ремисия (CR), продължител-ност на обща (OS) и на свободна от заболяване преживяемост (DFS) между отделните хематоло-гични клиники. Целта на настоящото проучване е да се съпоставят резултатите от различните терапевтични протоколи, прилагани в НСБАЛХЗ и други хематологични центрове по света.

Материал и методи Пациенти В настоящото проучване са включени 56 па-

циенти с de novo ОМЛ, диагностицирана съглас-но критериите на класификационните системи на френско-американски-британски (ФАБ) (Bennett и сътр. – 1976, Bennett и сътр. – 1985) и СЗО – Jaffe и сътр., 2001. Заболелите индивиди са леку-вани в Националната болница за активно лечение на хематологични заболявания (НСБАЛХЗ) – Со-фия, в периода септември 2003–януари 2010 г. Всички болни са на възраст между 16 и 59 годи-ни; в добро общо състояние [Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) performance status score ≤ 2]. Пациенти с ОМЛ-М3 (съгласно ФАБ) са изк-лючени от това проучване. Основните характе-ристики на пациентите са обобщени в табл. 1.

Цитогенетичен и молекулярно-биологичен анализ

Хромозомният и молекулярно-биологичният анализ към момента на поставяне на диагнозата бяха проведени в Лабораторията по цитогенети-ка и молекулярна биология към НСБАЛХЗ, съг-ласно утвърдени стандартни оперативни прото-коли. Хромозомните аномалии бяха представени в съответствие с препоръките на International System for Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN, 2009). Успоредно с цитогенетичния ана-лиз беше проведена и обратнотранскриптазна полимеразноверижна реакция (RT-PCR) за уста-новяване на най-честите хромозомни аберации при пациентите с ОМЛ – AML1-ETO, CBFb-MYH11, PML-RARa, M-BCR-ABL и m-BCR-ABL, съгласно програмата BIOMED-І (van Dongen и сътр., 1999), парциални тандемни дупликации на гена на смесенолинейната левкемия (MLL-PTD) и вътрешни тандемни дупликации на fms-подоб-на тирозин киназа 3 (FLT3-ITD).

Таблица 1. Характеристики на пациентите с ОМЛ, вклю-чени в настоящото проучване

Пациенти Възраст – години (n = 56)

Медиана 47

Обхват 19-59

Пол – брой пациенти (%)

Мъже 30 (53,6%)

Жени 26 (46,4%)

De novo ОМЛ 56

Брой левкоцити (x109/l) (n = 51)

Медиана 31

Обхват 0,5-337

Ниво на хемоглобина (g/l) (n = 51)

Медиана 93

Обхват 50-145

Брой тромбоцити (x109/l) (n = 51)

Медиана 60

Обхват 5-313

Ниво на лактат дехидрогеназа (U/l) (n = 48)

Медиана 1033

Обхват 264-4033

Бластни клетки в костния мозък (%) (n = 52)

Медиана 86

Обхват 23-100

Бластни клетки в периферна-та кръв (%) (n = 53)

Медиана 61

Обхват 0-100

ФАБ класификация – брой паци-енти (%)

М1 14 (25%)

М2 10 (17,8%)

М4 14 (25%)

М5 13 (23,2%)

М6 2 (3,6%)

Липсващи данни 3 (5,4%)

Цитостатична терапия Индукционното лечение на пациентите с ОМЛ

включваше прилагане на един или два курса – комбинация на цитозин-арабинозид (Cytosar – 100 mg/m2 на ден; в продължение на пет или се-дем дни; двукратно на ден в продължение на 3 часа); антрациклинов антибиотик – Idarubicin (12 mg/m2 на ден), Farmorubicin (45 mg/m2 на ден) или Mitoxantrone (10 mg/m2 на ден) за два или три


дни; със или без приложение на Etoposide (100 mg/m2 на ден); в продължение на три или пет дни).

При пациентите с ОМЛ, резистентна на кон-венционалната индукционна терапия (n = 24), бе-ше проведено високодозово индукционно лечение с различни „спасителни” терапевтични курсове: FLAG, IDA-FLAG, MITO-FLAG, HAM или интерме-диерни дози Cytosar в комбинация с митоксантрон. Пациенти, при които не беше постигната пълна ремисия след индукционна терапия (стандартна и високо-дозова), бяха проследявани само по отно-шение на общата преживяемост.

Консолидираща терапия беше проведена при пациенти с постигната пълна ремисия (n = 31). Тя включваше прилагане на стандартни или ин-термедиерни дози цитозар, самостоятелно или в комбинация с антрациклинови антибиотици и/или епиподофилотоксинови производни. При трима пациенти (9,4%) не беше проведена консолиди-раща терапия, поради: поява на хепатит В ви-русна инфекция, продължаване на лечението в друго лечебно заведение, настъпване на летален изход. При други двама пациенти (6,5%) статисти-ческото наблюдение беше прекратено, преди провеждането на консолидиращата терапия.

При трима от пациентите (9,7%) след прове-дената цитостатична консолидираща терапия беше осъществена трансплантация на хемопое-тични стволови клетки (СКТ) като втора консоли-дираща терапия. Алогенна СКТ беше приложена при двама болни (6,5%), докато автоложна СКТ – при един.

Критерии за терапевтичен отговор Състоянията на пълна ремисия и рецидив бяха

дефинирани съгласно критериите, предложени от Cheson и сътр., 2003. Общата преживяемост (OS) е изчислена от датата на поставяне на диагнозата до датата на настъпване на леталния изход на пациента от каквато и да е причина.

Причините са терапевтичен неуспех бяха подразделени на две категории: (I) рефрактерна левкемия (РЛ) и (II) смъртен изход, настъпил по-малко от 7 дни след завършването на първия индукционен курс (ранна смърт, РС) или смъртен изход, настъпил по време на терапевтичноинду-цираната костно-мозъчна хипоплазия (хипоплас-тична смърт, ХС) – Schlenk и сътр., 2003.

Стратифициране на пациентите според риска

Стратификацията на пациентите беше осъ-ществена въз основа на критериите, възприети от Холандско-белгийско-швейцарската хемато-логична група (HOVON-SAKK), – Cornelissen и

сътр., 2007. Пациентите бяха стратифицирани в група с добър, интермедиерен и лош риск в за-висимост от цитогенетичните или молекулярните отклонения, левкоцитния брой към момента на диагнозата и постигането на пълна ремисия след стандартен или високодозов индукционен курс.

Цитогенетичните аберации t(8;21), inv(16) или t(16;16)(p13;q22), както и молекулярните маркери AML1-ETO или CBFb-MYH11 бяха считани за благоприятни.

Наличието на комплексен кариотип (наличие на 3 или повече хромозомни аномалии), -5q, -7q, abn(3q), t(6;9)(q23;q34), abn(11q23), t(9;22)(q34;q11) или FLT3-ITD се смятаха за неблагоприятни ци-тогенетични или молекулярни маркери.

Пациенти, при които не бяха установени бла-гоприятни или неблагоприятни цитогенетични отклонения и при които кариотипът към момента на диагнозата беше неизвестен бяха класифи-цирани към интермедиерен цитогенетичен риск.

Групата на пациентите с нисък риск включ-ваше лица с: (I) t(8;21) и/или AML1-ETO – транс-крипти без наличие на допълнителни неблагоп-риятни цитогенетични аномалии и левкоцитен брой към момента на диагнозата ≤ 20 х 109/l; (II) inv(16) или t(16;16)(p13;q22), както и/или CBFb-MYH11 транскрипти, без наличие на допълни-телни неблагоприятни цитогенетични аномалии.

Болни, при които бяха установени комплексен кариотип (наличие на 3 или повече хромозомни аномалии), -5q, -7q, abn(3q), t(6;9)(q23;q34), abn(11q23), t(9;22)(q34;q11), хиперлевкоцитоза > 100 х 109/l, наличие на FLT3-ITD, бяха поставени в групата с висок риск. Към тази група бяха кла-сифицирани и пациенти с интермедиерен цитоге-нетичен риск, при които беше постигната пълна ремисия с високодозова индукционна терапия.

Всички останали пациенти бяха включени в групата с интермедиерен риск.

Статистически методи Статистическата обработка на получените ре-

зултати е извършена с помощта на готови прог-рамни продукти Microsoft Excel 2003 и SPSS for Windows, версия 13 (Chicago, IL, USA). Крайната дата на статистическото наблюдение на болните беше 1 април 2010 г. Кривите за преживяемост бяха изчислявани по метода на Kaplan-Meier, като статистическсата значимост на разликата между тях беше определена посредством log-rank теста. За сравняване на две средни величини бяха из-ползвани точния тест на Fisher и теста на Mann-Whitney. Величината p беше статистически значи-ма, когато стойността й беше по-малка от 0,05.


Резултати Цитогенетичен и молекулярно-биологичен

анализ при пациенти с ОМЛ Цитогенетичен анализ беше проведен при

89,2% (50/56) от пациентите. Той беше успешен при 82% (41/50) от случаите, докато при остана-лите 18% (9/50) от заболелите не бяха установе-ни годни за анализ метафазни пластинки.

Разпределението на пациентите в зависи-мост от цитогенетичния риск е представено на табл. 2.

Таблица 2. Цитогенетична/молекулярна класификация

Цитогенетични

n

(%)

Мол

екул

ярни

n

(%)

Общ

о

Благоприятни аномалии 4 (7,1) 5 (8,9) 9

Интермедиерни аномалии 22 (33,9) 22

Неблагоприятни аномалии 2 (3,7) 14 (25) 16

Аномалии с неизвестен риск 3 (5,4) 3

Неуспешен или непроведен цитогенетичен анализ 8

Цитогенетични аномалии с нисък риск бяха

установени при 9,8% (4/41) от болните. Хромо-зомни преустройства с висок риск бяха регист-рирани също при четирима пациента (9,8%) – комплексен кариотип (n = 1), t(11;19) (n = 1) и тризомия на 8-ма хромозома (n=2). Цитогенетич-ни преустройства със интермедиерен риск бяха

намерени при 80,4 % (33/41) от болните – нор-мален кариотип беше доказан при 73,1% (30/41), при 2-ма заболели (4,9%) беше налице монозо-мия на Х- или Y-хромозомата и при един пациент присъстваше тризомия на 14-ата хромозома.

При 26,8% (15/56) от болните цитогенетични-ят анализ не беше проведен или не бяха устано-вени годни за анализ метафазни пластини. При тази група пациенти беше осъществен RT-PCR анализ, при който не беше установено присъст-вие на най-честите молекулни маркери с прог-ностична стойност при ОМЛ. При двама пациен-та беше установено наличие на MLL-PTD.

Рискови групи пациенти и терапевтичен отговор при различните групи пациенти

Разпределението на пациентите в зависимост от техния риск и терапевтичния отговор при раз-личните рискови групи са представени на табл. 3.

Пълна ремисия беше установена при 44,6% (25 от 56) от пациентите с ОМЛ след проведена стандартна индукционна терапия. Седем болни (12,5%) завършиха летално, вследствие на РС или ХС.

При 42,9% (24/56) от болните беше установена резистентна левкемия след проведената стандар-тна индукционна терапия. При тази група пациенти беше приложена високодозова индукционна тера-пия. Пълна ремисия беше постигната при 25% (6/24) от болните, докато летален изход беше наб-людаван при 20,8% (5/24) от заболелите.

Прилагането на стандартна и високодозова индукционна терапия доведе до постигане на пъл-на ремисия при 55,4% (31/56) от болните с ОМЛ.

Таблица 3. Терапевтичен отговор след проведена индукционна терапия в зависимост от рисковата група на пациентите

Терапия след пос-тигната CR1

Изход след постигната CR1

Обща прежи-вяемост на 48-

ми мес.

Рискова група брой болни

РС/ХС n (%)

CR n (%)

Резистентна левкемия

n (%) ПХТ авто

СКТ ало СКТ

смърт в CR1

реци-див n (%)

Нисък риск 8 1 (12,5%) 6 (75%) 1 (12,5%) 6 1 2

(33,3%) 44,4%

Интермедие-рен риск 27 3

(11,1%) 17

(63%) 5 (25,9%) 17 1 1 1 9 (52,9%) 26,3%

Висок риск 21 7 (33,3%)

8 (38,1%) 6 (28,6%) 8 1 1 7

(87,5%) 0%

Общо 56 11 (19,6%)

31 (55,4%) 14 (25%) 31 1 2 3 19

(61,3%) 18,8%

РС/ХС – ранна смърт/хипопластна смърт; CR1 – първа пълна ремисия АвтоСКТ – автоложна стволовоклетъчна трансплантация АлоСКТ – алогенна стволовоклетъчна трансплантация


Четиринадесет пациенти (25%) бяха резис-тентни на проведената стандартна или високо-дозова индукционна терапия.

Пълна ремисия, обща и, свободна от забо-ляване преживяемост, при пациенти с ОМЛ, лекувани в НСБАЛХЗ

Медианата на общата преживяемост за всич-ки пациенти от момента на поставяне на диагно-зата е 27 месеца (95% CI; 17,7-36,2 месеца), докато изчислената обща преживяемост за всич-ки пациенти на 48-ия месец е 18,8% (фиг. 1).

60483624120

Време (месеци)

100

75

50

25

0

Общ

а пр

ежив

яемост

(%)

Фиг. 1. Обща преживяемост на всички пациенти, включени в проучването

При пациентите с постигната пълна ремисия медианата на общата преживяемост е 35 месеца (95% CI; 25,9-44,0 месеца), докато изчислената обща преживяемост за тези пациенти на 48-ия месец е 24,7% (фиг. 2).

60483624120


100

75

50

25

0

Общ

а пр

ежив

яемост

(%)

Фиг. 2. Обща преживяемост на пациентите, при които е постигната пълна ремисия

Пълна ремисия беше постигната при 75%; 63% и 38,1% при болните с нисък, интермедие-рен и висок риск, докато ранната смъртност бе-ше 12,5%, 11,1% и 38,1% в различните групи.

Общата преживяемост на 48-ия месец беше 44,4% при пациентите с нисък риск, 26,3% – с интермедиерен риск и 0% – с висок риск.

Установена беше статистически значима разлика в медианните стойности на общата пре-живяемост при болните с нисък и интермедиерен риск, съответно 29 и 30 месеца, в сравнение с тези с висок риск (18 месеца) – р = 0,018 (фиг. 3).

60483624120


100

75

50

25

0

Общ

а пр

ежив

яемост

(%)

нисък риск (n=7)

интермедиерен риск (n=24)

висок риск(n=14)

p=0,018

Фиг. 3. Обща преживяемост в зависимост рисковата група на пациентите

Получените терапевтични резултати от нас-тоящото проучване бяха сравнени с данните от други хематологични центрове (табл. 4).

Таблица 4. Терапевтични резултати от НСБАЛХЗ и други хематологични центрове

Проучване Брой CR (%) OS Индукционна

смъртност

НСБАЛХЗ 56 55,4 18,8% (48 мес.) 19,6%

Wahlinl и сътр. 279 80 44%

(48 мес.) 6%

Schlenk и сътр. 223 74,5 40%

(60 мес.) 11%

Castaign и сътр.e 592 76 29,8%

(60 мес.) 14,5%

Kottaridis и сътр. 854 82 41%

(60 мес.) 8%

Обсъждане В настоящото проучване са включени 56 па-

циенти под 60-годишна възраст, лекувани в НСБАЛХЗ – София между 2004 и 2010 г. Беше установена статистически значима разлика по отношение продължителността на общата пре-


живяемост между различните рискови групи па-циенти. В сравнение с други хематологични цен-трове беше установено, че нашите терапевтични данни са значително по-лоши по отношение на честотата на постигане на пълна ремисия, ин-дукционната смъртност и продължителността на общата преживяемост.

При сравнителния анализ между терапевтич-ните протоколи, прилагани в НСБАЛХЗ и другите хематологични центрове, беше установено субоп-тимално дозиране на антрациклиновите препара-ти, по-рядко използване на идарубицин и различен начин на приложение на цитозар в хода на индук-ционното лечение (двукратно приложение на ден срещу продължителна инфузия на цитозар).

В сравнение с другите центрове, при нашия терапевтевтичен протокол бяха използвани зна-чително по-ниски кумулативни дози Цитозар в хода на консолидиращата терапия (10 g срещу 18-54 g). Освен това, честотата на приложение на трансплантиращата терапия е също значи-телно по-ниска в нашия център (3,3% vs 19% алоСКТ; 1,7% срещу 15% автоСКТ).

Предвид получените данни е необходимо да се проведе проспективно проучване върху по-голям брой болни за валидиране на предварителните резултати. Също така е необходимо създаването на унифициран, риск-адаптиран протокол за лече-ние на пациенти с ОМЛ в България.

Благодарности. Авторите благодарят на д-р Исмаил Амин, д-р Петър Кулаксъзов, д-р Ирена Гъ-лъбова, д-р Юрий Жечев, д-р Георги Арнаудов и д-р Мимоза Станева за тяхното участие при лечение-то на пациенти с остра миелоидна левкемия в НСБАЛХЗ.


1. B e n n e t t , J. M. et al. Proposals for the classification of the acute leukemias. – Br. J. Haematol., 33, 1976, 451.

2. B e n n e t t , J. M. et al. Proposed revised criteria for the classification of acute myeloid leukemia. – Ann. Intern. Med., 103, 1985, 626.

3. J a f f e , E. S. et al. World Health Organization Classification of Tumors. Pathology and Genetics of tumors of Haemoto-poietic and Lymphoid Tissues. – IARC Press. Lyon, 2001.

4. C a s t a i g n e , S. et al. Randomized comparison of double induction and timed-sequential induction to a "3 + 7" induction in adults with AML: long-term analysis of the Acute Leukemia French Association (ALFA) 9000 study. – Blood, 104, 2004, № 8, 2467-2474.

5. V a n D o n g e n , J. J. et al. Standardized RT-PCR analy-sis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Report of the BIOMED-1 Concerted Action: investigation of minimal residual disease in acute leukemia. – Leukemia, 13, 1999, № 12, 1901-1928.

6. I n t e r n a t i o n a l System for Human Cytogenetic Nomenclature. Shaffer, L. G., M. L. Slovak, L. J. Campbell (eds), S. Karger, Basel, 2009.

7. C h e s o n , B. D. et al. International Working Group for Diagnosis, Standardization of Response Criteria, Treatment Outcomes, and Reporting Standards for Therapeutic Trials in Acute Myeloid Leukemia. Revised recommendations of the International Working Group for Diagnosis, Standar-dization of Response Criteria, Treatment Outcomes, and Reporting Standards for Therapeutic Trials in Acute Myeloid Leukemia. – J. Clin. Oncol., 21, 2003, № 24, 4642-4629.

8. S c h l e n k , R. F. et al. AML Study Group Ulm (AMLSG ULM). Risk-adapted postremission therapy in acute myeloid leukemia: results of the German multicenter AML HD93 treatment trial. – Leukemia, 17, 2003, № 8, 1521-1528.

9. K o t t a r i d i s , P. D. et al. The presence of a FLT3 internal tandem duplication in patients with acute myeloid leukemia (AML) adds important prognostic information to cytogenetic risk group and response to the first cycle of chemotherapy: analysis of 854 patients from the United Kingdom Medical Research Council AML 10 and 12 trials. – Blood, 98, 2001, № 6, 1752-1759.

10. C o r n e l i s s e n , J. J. et al. Results of a HOVON/SAKK donor versus no-donor analysis of myeloablative HLA-identical sibling stem cell transplantation in first remission acute myeloid leukemia in young and middle-aged adults: benefits for whom? – Blood, 109, 2007, № 9, 3658-3666.

11. W a h l i n , A. et al. Results of risk-adapted therapy in acute myeloid leukaemia. A long-term population-based follow-up study. – Eur. J. Haematol., 83, 2009, № 2, 99-107.

Адрес за кореспонденция: Бранимир Спасов Клиника по хематология Национална специализирана болница за активно лечение на хематологичните заболявания ул.”Пловдивско поле” №6 1756 София

+35929701115 e-mail: [email protected]


ОПРЕДЕЛЯНЕ НА РЕФЕРЕНТНИТЕ ГРАНИЦИ НА РОТАЦИОНЕН ТРОМБОЕЛАСТОМЕТРИЧЕН МЕТОД

А. Станчева, Л. Спасов и Г. Мутафов Университетска болница „Лозенец” – София

DETERMINATION OF THE REFERENCE RANGES FOR ROTATION THROMBELASTOMETRY METHOD A. Stancheva, L. Spassov and G. Mutafov

University Hospital „Lozenetz” – Sofia

Резюме. Ротационният тромбеластометричен анализ с апарат Rotem® (Pentapharm GmbH, Munich) [1] е глобален хемостазен метод, при който коагулационният процес се активира от повърхностен контакт и от добавени коагулационни активатори и инхибитори. Полученият графичен и цифров ROTEM® резул-тат отразява както процеса на формиране и последващо лизиране на коагулума, така и множеството хемостазни и терапевтични фактори, променящи хемостазната кинетика. Препоръчва се изработване на собствени референтни граници за всеки център, работещ тромбоеластометрия. За установяване на референтни граници за тромбоеластометричен метод Rotem®, в настоящото проучване са изследвани представителна група от 120 здрави индивиди (20-70 год.), за Rotem® тестове – INTEM, EXTEM (за пара-метри: CT,CFT, alf, A10, А15, A20, A25, MCF, MCE, CL30, ML) и FIBTEM – (за CT, A10, A20, MCF, MCE). Из-вършено е проучване за установяване на потенциална разлика в референтните стойности при разделя-не на изследваната популация по пол и възраст. Не се налага установяване на отделни пол- и възраст-зависими референтни граници, според проведения корелационен и сравнителен анализ на влиянието на тези фактори върху параметрите на ротационната тромбеластометрия.

Ключови думи: Rotem®, референтни граници, корелация

Summary. Rotation thrombelasthometric analysis, with Rotem Whole Blood Haemostasis Analyzer [1], is a global haemostasis method, initiating the coagulation process both by contact surface activation and by additional coagulation activators and inhibitors. The typical graphical and numerical Rotem result reflects the whole process of clot formation and the next-coming fibrinolysis, as well as a great number of haemostatic and therapeutic factors, changing the kinetics of the haemostasis process. The establishment of on-site reference ranges for every medical center performing thrombelasthometry is recommended. In the present study, a population group of 120 adult reference subjects (aged 20-70 years), has been studied, to determine the reference ranges for the ROTEM INTEM, EXTEM tests (parameters CT,CFT, alf, A10, А15, A20, A25, MCF, MCE, CL30, ML) and the ROTEM FIBTEM test (parameters CT, A10, A20, MCF, MCE). An investigation has been performed, for determining the potential sex- related and age- related differences in the established reference levels. The performed evaluations and comparative analysis of the influence of sex and age on the parameters of rotation thrombelastometry don’t require the establishment of separate sex and age related reference ranges.

Key words: ROTEM®, reference ranges, correlation.

Въведение Ротационният тромбоеластометричен анализ

(ROTEM®) (Pentapharm GmbH, Kreiller str. 21. Munich) [1] е глобален диференциалнодиагности-чен подход за бърза диференциация на хемостаз-ни нарушения при акутно кървене, водещо до хи-

перкоагулационни, хипокоагулационни и хиперфи-бринолитични състояния. Подобно на класичес-ката тромбеластография, тромбеластометрич-ният анализ се изразява графично (с реакционна крива – TEMограма) и цифрово – чрез параметри, изчислени с математически анализ от кривата.

А. Станчева, Л. Спасов и Г. Мутафов. Определяне на референтните граници... 35

Новият методологичен подход при ротацион-на тромбоеластометрия ROTEM® включва тесто-ве с добавяне на специфични субстанции към пробата, активиращи или инхибиращи протича-щите глобални хемостазни процеси, блокиращи или катализиращи различни компоненти от хе-мостазния механизъм: тромбопластин-тъканен фактор (TF) за EXTEM, контактен активатор (ellagic acid) за INTEM, антитромбоцитни реаген-ти (anti IIb/IIIa) за FIBTEM, aprotinin за APTEM, heparinase за HEPTEM и ecarin activator за ECATEM.

Стандартизация, качествен контрол и референтни граници

При тромбоеластографските изследвания, раз-глеждани като обект на клиничната лаборатория, се поставя въпросът за стандартизация на мето-да [2].

Качествен контрол на ROTEM® се извършва с контролен материал на Pentapharm GmbH – RO-TROL N, проследим до референтен матери-ал [3]. Препоръчва се изработване на собствени референтни граници за всеки център, работещ тромбеластометрия [4, 5]. Ориентировъчно се използват предоставените референтни граници на фирмата производител (Pentapharm GmbH, Munich).

Цел на настоящото проучване е определяне-то на национални референтни граници за пара-метрите на ротационна тромбоеластометрия ROTEM®.

Материали и методи При провеждане на проучването е спазван

следният работен протокол: 1. Изследване на представителна група от 120

здрави индивиди (20-70 год.), съгласно NCCLS doc.C28-A2, 2000, за създаване на собствени референтни граници за ROTEM® тестове – INTEM, EXTEM за следните параметри: CT,CFT, alf, A10, А15, A20, A25, MCF, MCE, CL30, ML, и FIBTEM – за CT, A10, A20, MCF, MCE.

2. Изследване за установяване на потенци-ална разлика в референтните стойности при разделяне на изследваната популация по пол.

3. Изследване за установяване на потенциал-на разлика в референтните стойности при разде-ляне на изследваната популация по възраст.

4. Оценка и сравнителен анализ на влияние-то на факторите пол и възраст върху параметри-те на ротационната тромбоеластометрия.

За определяне на референтните граници за параметрите на ротационна тромбоеластомет-рия е използвана извадка от 120 референтнии

участници в проучването, от които 60 (50%) мъ-же и 60 (50%) жени, на средна възраст 44 годи-ни, в интервала от 18 до 67 години. Двата пола са статистически изравнени по възраст.

За определяне на референтните граници на тромбоеластометричен метод ROTEM® e изпол-зувана цитратна кръв, взета според стандартите на NCCLS.

За определяне на контролни конвенционални хемостазни параметри, в настоящото проучване е използван хемостазен анализатор STA Compact Analyser (Diagnostica Stago – Roche, Asnieres, France), тромбоцити, еритроцити и хемоглобин са определяни на хематологичен брояч Cell Dyn 3700 (Abbott Diagnostica, Visbaden, Germany). При про-веденото проучване са извършвани ротационни тромбоеластометрични измервания на анализатор ROTEM® (Petapharm GmbH, Munich, Germany).

Данните са въведени и обработени със ста-тистическия пакет SPSS 16.0.1 и REFVAL v. 3.21 на IFCC. За ниво на значимост, при което се отх-върля нулевата хипотеза, е избрано p < 0,05.

Резултати Проучванията на референтните граници за

параметрите на EXTEM, INTEM и FIBTEM тесто-ве на ротационна тромбоеластометрия ROTEM® са определяни диференцирано по пол и възраст.

1. При извършеният сравнителен анализ за установяване на потенциална разлика в рефе-рентните стойности при разделянето на изслед-ваната популация по пол са получени следните резултати:

• С изключение на кинетичните показатели CT и CFT средните стойности на показателите на EXTEM (± SD) при мъжете са по-ниски, което установява незначимо по-слабо изразена коагула-ционна активност при мъжете, отколкото при жени-те. Няма разлика по отношение на фибринолитич-ната активност (равни резултати за ML и LI30).

• Установената разлика е минимална и има сигнификантен характер само при три показате-ля (CFT р < 0,002; ALF p < 0,003 и A10 p < 0,025).

2. При извършеният корелационен анализ за установяване на потенциална разлика в рефе-рентните стойности при разделяне на изследва-ната популация по възраст са получени следни-те резултати:

• От показателите на EXTEM единствено А15 корелира слабо и обратно пропорционално с възрастта (r = -0,292 – p < 0,05).

• От показателите на INTEM и FIBTEM нито един не корелира с възрастта.

3. След оценката на получените резултати от сравнителния и корелационен анализ на вли-янието на факторите пол и възраст върху изс-


ледваните параметри, референтните граници за параметрите на тестовете EXTEM, INTEM и FIBTEM на ротационна тромбоеластометрия ROTEM®, са определени без разграничаване по пол и възраст (95% ДИ).

Референтните граници за параметрите на тестовете EXTEM, INTEM и FIBTEM на ротаци-

онна тромбеластометрия ROTEM® са изчислени с помощта на програмен пакет REFVAL v. 3.21 на IFCC (табл. 1, 2, 3).

При изчисляване на референтните граници посредством критерия на Шоване са отстранени първоначално всички рязко отличаващи се стой-ности.

Таблица 1. ROTEM® (EXTEM) референтни граници

95% ДИ 95% ДИ Параметър Долна референтна

граница От До Горна референтна

граница От До

CT 41,30 36,44 46,42 80,01 72.34 87,6

CFT 56,99 53,13 61,06 129,29 123,47 135,09

ALF 65,24 64,29 66,21 78,74 77,86 79,59

A10 44,51 43,15 45,91 65,93 64,08 67,81

A15 47,98 46,46 49,49 67,99 66,37 69,62

A20 50,25 49,04 51,50 68,66 67,33 69,96

A25 50,34 49,14 51,58 68,92 67,60 70,21

MCF 51,06 49,82 52,34 69,14 67,79 70,48

MCE 107,81 103,43 112,56 221,18 208,37 235,22

LI30 91,00 – – 100,00 – –

ML 5,00 – – 21,00 – –

Таблица 2. ROTEM® (INTEM) референтни граници

Параметър Долна референтна граница 95% ДИ Горна референтна

граница 95% ДИ

CT 131,40 125,72 137,60 240,55 230,22 250,65

CFT 51,45 49,05 54,14 133,82 127,97 139,50

ALF 60,20 57,60 62,52 80,12 79,50 80,67

A10 44,42 42,92 45,93 66,08 64,12 68,11

A15 49,92 48,70 51,17 69,64 67,85 71,50

A20 52,45 51,26 53,67 71,02 69,36 72,71

A25 53,71 52,58 54,87 71,31 69,82 72,83

MCF 54,04 52,80 55,30 71,58 70,15 73,01

MCE 123,81 117,70 130,16 223,35 215,55 231,08

LI30 94,95 – – 100,00 –

ML 5,00 – – 17,00 – –

Таблица 3. ROTEM® (INTEM) референтни граници

Параметър Долна референтна граница 95% ДИ Горна референтна

граница 95% ДИ

CT 40,85 36,70 45,37 143,69 135,84 151,41

A10 7,00 – – 19,05 – –

A20 8,00 – – 20,00 – –

MCF 7,44 6,72 8,20 20,49 19,31 21,71

MCE 8,32 7,55 9,13 24,42 22,82 26,11

А. Станчева, Л. Спасов и Г. Мутафов. Определяне на референтните граници... 37

Обсъждане Системното извършване на тромбоеласто-

метрични анализи в условия на спешност ни задължава да определяме клинично специфични референтни граници, в условия еднакви с ежед-невната ни практика – до петнадесет минути след вземане и декалцификация на пробата. Нашите наблюдения се потвърждават от V. Camenzid и сътр. (2000) [7]. Определените от нас референтни граници са съпоставими със стой-ностите, получени при мултицентрово проучване на референтните граници за ROTEM тромбое-ластометрия [6].

Разликата между средните EXTEM стойности за двата пола e ниска и има сигнификантен ха-рактер (p < 0.05) само при показателите CFT, alf, A10. При INTEM разликата между двата пола има сигнификантен характер единствено при А10 (p < 0.05). Нито един от изследваните тромбо-еластографски FIBTEM показатели не показва сигнификантна разлика при сравнителния ана-лиз по пол.

Влиянието на възрастта върху параметрите на ротационната тромбоеластометрия, оценено с резултатите от проведения от нас корелацио-нен анализ, е слабо без корелация, което се потвърждава от изследванията на K. Ng и сътр. (2004) [8], и H. Gorton и сътр. (2000) [9].

Изводи 1. Установените от нас референтни граници

за популация с българска националност са съ-поставими с резултатите от мултинационалното, мултицентрово проучване на референтните гра-

ници на тромбеластометричен метод ROTEM® – T. Lang и сътр. [6].

2. Не се изисква диференциация по пол и възраст, при определяне референтните граници на ROTEM® тромбеластични тестове EXTEM, INTEM и FIBTEM.


1. C a l a t z i s , A. N. et al. A comparison of the technical principle of the ROTEG Coagulation Analyzer and conventional thrombelastographic systems. – Ann. Hematol., 1998, (Suppl. 1), 90.

2. L u d d i n g t o n , R. Thrombelastography/ Thrombelastometry. – Clin. Lab. Haem., 27, 2005, 81-90.

3. V o n P a p e , B. Method dependent reference values and preanalytical influences in rotation thrombelastography. – Ann. Hematol., 82, 2003, (S1), 13.

4. B o w r i c k , V. A., D. Mikhailidis et G. Stansby. The use of citrated whole blood in thrombelastography. – Anesthesia and Analgesia, 90, 2000, 1086-1088.

5. V i g , S. et al. Thrombelastography- arliable test. – Blood Coagulation and Fibrinolysis, 12, 2001, 555-561.

6. L a n g , T. et al. Multi-center investigation on reference ranges for ROTEM thrombelastometry. – Blood Coagulation Fibrinolysis, 16, 2005, 301-310.

7. C a m e n z i d , V. et al. Citrate storage effects thrombelastography analysis. – Anesthesiology, 92, 2000, 1242-1249.

8. N g , K. Changes in thrombelastography variables associated with aging. – Anesthesia and Aanalgesia 99, 2004, 449-454.

9. G o r t o n , H. et al. Thrombelastography identifies sex-related differences in coagulation. – Anaesthesia and Analgesia, 91, 2000, 1279-1281.

Адрес за кореспонденция: д-р Ася Георгиева Станчева ул. „Липа” № 10 1421 София

9607 431; 0886 442 017 e-mail: [email protected]


КЛИНИКО-БИОЛОГИЧЕН АНАЛИЗ НА ПАЦИЕНТИ С ОСТРА ПРОМИЕЛОЦИТНА ЛЕВКЕМИЯ, ЛЕКУВАНИ В НСБАЛХЗ ЗА ПЕРИОД ОТ 10 ГОДИНИ

П. Ганева, Г. Балаценко, М. Генова, Б. Спасов, Е. Бекриева, С. Ангелова, А. Стоименов, Г. Михайлов и С. Тошков

Национална специализирана болница за активно лечение на хематологични заболявания – София

CLINICAL AND BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF PATIENTS WITH ACUTE PROMYELOCYTIC LEUKEMIA TREATED AT THE NATIONAL HEMATOLOGY

HOSPITAL FOR A 10-YEAR PERIOD P. Ganeva, G. Balatzenko, M. Guenova, B. Spassov, E. Bekrieva, S. Angelova, A. Stoimenov,

G. Mihaylov and S. Toshkov NSHATHD – Sofia

Резюме. Целта на статията е да се проследят на клинико-биологичните характеристики и клиничното протичане на заболяването при пациенти с остра промиелоцитна левкемия (ОПЛ), за период от 10 годи-ни. Болните са лекувани в Национална специализирана болница за активно лечение на хематологични за-болявания (НСБАЛХЗ). Анализирани бяха 26 пациенти [11 мъже/15 жени, на средна възраст 44.8 г. (19-73 г.)], лекувани и наблюдавани в НСБАЛХЗ от 1998 г. до 05.2009 г. За диагноза и проследяване бяха използ-вани клинични, цитологични, клиниколабораторни, цитогенетични и молекулярни методи. От болните 23-ма (88.5%) бяха с de novo ОПЛ, а 3-ма (11.5%) – с вторична левкемия след химио-/лъчетерапия по повод карцином на млечната жлеза. Пациентите бяха лекувани според стандартните схеми за лечение на ост-ра миелогенна левкемия (ОМЛ), а от 2002 г. – с протоколи, включващи везаноид. Проследени бяха 23-ма болни. Пълна ремисия беше постигната при общо 16 пациенти, като средната продължителност на сво-бодния от болест период беше оценена на 45 месеца. При 6 от болните настъпи ранна смърт преди или в хода на индукционната фаза. Средната обща преживяемост в групата на проследените пациенти беше 65 месеца. Болните с ОПЛ са хетерогенна група, която се характеризира със специфична молекулярно-генетична аберация и възможности за прилагане на таргетно ориентирана терапия. Въвеждането на молекулярен и цитогенетичен анализ в рутинната диагностика и проследяването на пациентите пома-гат за ранно установяване на рисковите групи и определяне на риск-адаптирана терапия. По-ниският процент постигнати ремисии в настоящата група в сравнение с цитирания в литературата вероятно се дължи на късното включване на везаноид в терапията, както и на практически проблеми при осигуря-ване на заместителна терапия при усложнения от типа на ДИК.

Ключови думи: остра промиелоцитна левкемия, PML-RARA, RT-PCR, all-trans ретиноева киселина, молекулярна ремисия

Summary. The aim of the study was to analyse the clinical and biological characteristics of patients with acute promyelocytic leukemia (APL), treated at the National Specialized Hospital for Activ Treatment of Hematologic Diseas (NSHATHD) for a period of 10 years. In total, 26 patients were included in the studyq who were treated from 1998 till May 2009 at the NSHATHD. Male female ratio was 11/15, and mean age – 44.8 years (19-73 years). The diagnosis and follow-up wеие based on clinical, laboratory, morphological, cytogenetic and/or molecular analyses. In total, 23 patients (88.5%) were diagnosed with de novo APL and 3 (11,5%) with a secondary leukemia after chemo/radiotherapy for breast carcinoma. The patients were treated with standard chemotherapy regimens and since 2002 vesanoid has been included in the therapeutic protocols. A follow up was available for 23 of the patients. Complete remission was achieved in 16 patients with a mean disease free survival of 45 months. Early death occurred in 6 patients prior or during the induction therapy. The mean overall survival was 65 months. Patients with APL are a heterogeneous group characterised by a specific molecular aberration which allows for the application of a target-oriented therapy. The implementation of molecular and

П. Ганева, Г. Балаценко, М. Генова... Клинико-биологичен анализ на пациенти... 39

cytogenetic studies in the routine diagnostic work contributes to the early risk assessment thus allowing for a risk-adapted therapy. The worse results reported in our study compared to data in literature are due to the delay in the introduction of vesanoid in the therapeutic regimens in our country as well as to the practical problems with supportive therapy in the complicated cases particularly with DIC syndrome.

Key words: acute promyelocytic leukemia, PML-RARA, RT-PCR, all-trans retinoic acid, molecular remission

Увод Острата промиелоцитна левкемия (ОПЛ) М3

подтип съгласно French-American-British (FAB) класификация е специфичен тип остра миелоид-на левкемия (OMЛ), характеризиращ се със: 1) типична морфология на бластите (промиелоци-ти) според FAB класификацията; 2) клинично изразена коагулопатия, изявяваща се като ком-бинация от десиминирана интравазална коагу-лация (ДИК) и фибринолиза; 3) наличие на спе-цифична хромозомна аномалия – t(15;17), при която настъпва фузия на промиелоцитния лев-кемичен ген (PML) на хромозома 15 с алфа-гена на рецептора на ретиноевата киселина (RARА) на 17-та хромозома; 4) специфична сензитивност към all-trans ретиноевата киселина (ATRA).

Всички тези особености поставят този вид левкемия в различна позиция от другите ОМЛ. В миналото ОПЛ се свързваше с висок риск от ранна смъртност в резултат от настъпване на остра коагулопатия и фатални мозъчни кръвоиз-ливи. С въвеждането на диференцираща тера-пия – all-trans ретиноевата киселина (АТРА), се промени това схващане и понастоящем, ОПЛ се смята за най-лечимата ОМЛ. Включването на ATRA в индуционната терапия след 1988 г. от Shanghai group доведе до постигане на пълна ремисия (ПР) в 90% и 6-годишна свободна от заболяване преживяемост (DFS) при над 86% от ниско рисковите пациенти. По този начин прог-нозата на този тип левкемия се промени от фа-тална към лечима във висока степен [1, 2, 3, 4].

Въпреки успехите с въвеждането на АТРА в терапията около 10% от болните умират в ин-дукционната фаза в резултат на хеморагии, дължащи се на комплексни коагулационни проб-леми. Клинични проучвaния доказаха, че в 5-20% от пациентите в хода на лечението може да се наблюдава т.нар. АТРА синдром, а около 5-20% от болните получават рецидив въпреки модер-ната диференцираща терапия.

В нашата страна липсват системни проучва-ния върху ОПЛ, поради което ние си поставихме за цел да се направи ретроспективен анализ на честотата на ОМЛ с t(15;17)/PML-RARΑ (ОПЛ), клиничните и лабораторните характеристики и отговора към провежданата терапия при пациен-тите, преминали и лекувани в НСБАЛХЗ (бивш Национален център по хематология и транфузи-ология – НЦХТ), за 10-годишен период.

Материали и методи Пациенти За периода 01.1998–05.2009 г. в НСБАЛХЗ

бяха диагностицирани и лекувани 26 болни с ОПЛ. Всички данни по отношение на клиничните прояви, изследванията и последващото наблю-дение бяха събрани ретроспективно от докумен-тацията на пациентите (ИЗ, карта за амбулатор-но наблюдение Б25 и др.) Диагнозата беше пос-тавена на базата на клинични прояви, цитомор-фологично изследване (FAB критериите), кон-венционална цитогенетика и молекулярен ана-лиз, основаващ на използване на полимеразно-верижна реакция след обратна транскрибция (RT-PCR). Проследяването на терапевтичния отговор беше проведено чрез цитологично изс-ледване на костномозъчни аспирати, а на мини-малната резидуална болест при болни с пълна ремисия – чрез двуетапна RT-PCR за PML-RARα фузионни транскрипти.

Дефиниция на проследяването Пълна ремисия (ПР) беше дефинирана при

липса на клинични прояви на заболяване, хемог-лобин над 10 g/dl без трансфузии, неутрофили над 1.5 х 109/l, тромбоцити над 100 х 109/l, костeн мозък с нормален целуларитет или леко хипоцелуларен и наличие на под 5% абнормни промиелоцити.

Статистически анализ Методите на Kaplan–Meier бяха използвани за

оценка на общата преживяемост (OS) и на свобод-ната от заболяване преживяемост (DFS). OS беше дефинирана като времето от регистрацията на пациента (диагнозата) до смърта. DFS беше де-финирана като времето от постигнатата ПР до рецидив, смърт или друга изява на болестта.

Резултати За посочения период от общо 380 болни с

ОМЛ, изследвани в НЦХТ/НСБАЛХЗ, 26 покриваха критериите за ОПЛ (6.8%), от които 11 мъже и 15 жени. Средната възраст на болните беше 44.8 г. (граници 19-73 г.), като 12 болни (46.2%) бяха на възраст под 45 годин, а 14 (53.8%) – над 45 год. При 23-ма от болните заболяването беше класи-фицирано като de novo ОПЛ (88.4%), докато в 3 от случаите (11.6%) ОПЛ беше диагностицирана при


жени след лечение с химио/лъчетерапия по повод рак на млечната жлеза – вторична ОПЛ.

Цитоморфологично находката при 21 (80.8%) болни съответстваше на класическа ОМЛ-М3, докато при останалите 5 болни (19.2%) – на хи-пербазофилен хипогранулиран М3 вариант. При всички болни цитохимичното оцветяване за мие-лопероксидаза показа силно положителен ре-зултат при слабо до отрицателна реакция за алфа-неспецифична естераза.

Хематологични показатели и клинични осо-бености

Средният брой на левкоцитите към момента на диагнозата беше средно 11.3 х 109/l (граници 0.7-112 х 109/l). Левкопения беше наблюдавана при 11 болни, а левкоцитоза – при 5. Стойности-те на хемоглобина бяха средно 84.7 g/l (64-120 g/l), а броят на тромбоцитите – 36 х 109/l (граници 5-100 х 109/l). Клинични и лабораторни данни за ДИК бяха установени при 8/26 болни (30.8%). Ранна смърт беше установена при 6 от тях (23% от общия брой ОПЛ пациенти).

Ретроспективно беше определена рисковата група на болните, както следва: болни с нисък риск – 7 (26.9%), среден риск – 13 (50%), и висок риск – 6 (23.1%). Основните характеристики на болните са представени в табл. 1.

Таблица 1. Основни клинични характеристики на пациен-тите с ОПЛ

Показатели Стойности

Пол (м/ж) 11/15

Средна възраст (год.) 45 (19-73)

Брой левкоцити (x 109/l) средно11.3 (0.7-112)

Концентрация на хемогло-бин (g/l) средно 84.7(64-120)

Брой тромбоцити (x 109/l) средно 36 (5-100)

ДИК (брой/%) 8 (30%)

Тип М3 (М3/М3 var) 21/5

FLT3-ITD (+) (%) 6/20 (30%)

Рискови групи (определени ретроспективно)

Нисък риск 7 Среден риск 13 Висок риск 6

Вторична М3 – след рак млечна жлеза (брой / %) 3 (11.6%)

ЕД (ранна смърт) (брой/%) 6 (23%)

Особени форми (брой) 4 Видове :

1. М4 → М3 2. М3 → М2

3. Промиелоцитна бластна криза на ХМЛ

4. Екстрамедуларен късен рецидив

Имунофенотип Имунофенотипизация чрез флоуцитометрия

беше проведена при общо 12 болни. При всички

изследвани болни беше установен следният фенотип: CD13(+); CD 33(+); CD64(+); CD34(-). HLA-DR(+) беше установен само при 1/12 (8.3%). Наличие на CD117 беше намерено при 6/9 (67%). Аберантна експресия на лимфоидни ли-нейни антигени беше наблюдавана при 2-ма болни, съответно СD2(+) при единия и CD4(+)/CD19(+) при втория.

Цитогенетичен анализ Конвенционален хромозомен лентов анализ

беше проведен при 13 (50%) болни. При 8 (61.5%) от тях беше установена характерна за заболяването транслокация t(15,17) – съответно t(15,17)(q22,q21) (n = 2); t (15,17)(q22,q12) (n = 3) и t(15,17) (q24,q21) (n = 1) и данни за криптична транслокация в 2 от случаите. От останалите болни при 3-ма липсваха годни за анализ мета-фазни фигури, а при 2-ма беше намерен норма-лен кариотип.

Молекулярен анализ При всички болни чрез RT-PCR бяха устано-

вени специфичните за заболяването PML-RARα транскрипти, като при 22-ма изследването беше проведено към момента на диагнозата, а при 4-ма – при рецидив на заболяването. При 15 (57.7%) от болните беше установена дълга (L) форма от PML-RARα транскриптите, съответс-ваща на счупване на PML гена в bcr 1 или bcr 2 областта. При останалите 11 болни бяха доказа-ни къси (S) PML-RARα транскрипти (42.3%) – резултат от счупване на PML в bcr 3 областта. При 20 PML-RARα положителни болни беше изследвано и носителство на вътрешни тандем-ни дупликации на FLT3-гена (FLT3-ITD), кото аномалията беше намерена при 6 от тях (30%).

Лечение При 6 (23.1%) от болните беше проведена

стандартна индукционна терапия за ОМЛ, включваща цитозар + антрациклин, а при 18 (69.2%) индукцията се състоеше от химиотера-пия + АТРА 45 mg/m2 на ден. При 2 болни (7.7%) поради настъпила ранна смърт индукционна терапия не е провеждана. Ранната смърт е най-честата причина за фатален изход при ОПЛ и се среща при около 5-10% от всички новодиагнос-тицирани болни и най-често се дължи на фата-лен кръвоизлив и/или ДИК синдром.

В хода на лечението с АТРА, при 3/18 (16.7%) болни беше наблюдаван т. нар. АТРА синдром, който при 1 от тях е довел до смърт, при 1 – до спиране на лечението, а при 1 е отз-вучал след терапия с дексаметазон. Общо в хода на индукционното лечение при 6 (25%) болни настъпва ранна смърт и те са изключени от последващия анализ.


По-нататъшното постиндукционно лечение е провеждано според европейските протоколи с пуринетол и МТХ и АТРА на 3 месеца, а при част от болните – по местоживеене, за което нямаме достатъчно данни.

Терапевтичен отговор Пълна ремисия (ПР) беше постигната общо

при 16 от 24 лекувани болни (66,7%), от които 12 болни бяха с приложени режими, включващи везаноид, и 4-ма – с конвенционална терапия. Рецидив беше наблюдаван при 8 болни, от които 4-ма лекувани в началото без везаноид. При 2-ма болни беше постигната втора ПР, като и в двата случая лечението при рецидива беше провеждано с режими, включващи везаноид.

Сегашен статус Болните бяха проследявани средно 25 месе-

ца (от 0.5 до 129 месеца). Трима (11.53%) болни бяха загубени от проследяване. Понастоящем от всички проследени лекувани болни 8 (38,1%) са живи и са в пълна ремисия, включително и пот-върдена чрез молекулярно-генетичен анализ. Повечето от тези болни са лекувани през пос-ледните 5 години с режими, включващи везано-ид. Летален изход бе наблюдаван при общо 15 болни (65,2% от проследените пациенти), от които 2 преди започване на лечението. От почи-налите 13 болни, получили лечение (61.9% от проследените болни), 5 починаха по време на индукционната терапия, а останалите 8 – на по-късни етапи от заболяването. Най-честата при-чина за смърт в хода на индукция или при реци-див бяха хеморагичните усложнения.

Анализът на данните показа медиана на об-щата преживяемост от 20 месеца при стойности за средната OS – 65 месеца (от 2 до 129 месеца) (фиг. 1); и медиана на свободната от заболяване преживяемост (DFS) от 42 мес. при стойности за средната DFS от 45 мес. (от 1 до 103 месеца) (фиг. 2). Не беше установена значима разлика взависимост от типа на аберантните PML-RARA транскрипти. Независимо, че малкият брой бол-ни не позволи статистически значим анализ, данните показаха изразено по-кратка DFS при 4 проследени болни с M3-вариант (средно 6,25 мес.) в сравнение с болните с класическа мор-фология (средно 47 мес.), без разлики в данните за обща преживяемост. При среден период на наблюдение 48 мес. (12-93 мес.) всички болни, при които беше установена FLT3-ITD, са живи (100%) спрямо 40% от негативните случаи, при които медианата на OS беше 17 мес.

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120

20%

40%

60%

80%

100%

Кумул

атив

eн %

в рем

исия

месеци

Средна продължителност на DFS 45 мес.50% свободни от болест пациенти на 42 мес.

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120

20%

40%

60%

80%

100%

Кумул

атив

eн %

в рем

исия

месеци

Средна продължителност на DFS 45 мес.50% свободни от болест пациенти на 42 мес.

Фиг. 1. Свободна от заболяване преживяемост (DFS)

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144

20%

40%

60%

80%

100%

месеци

Кумул

атив

напр

ежив

яемос

т %

Средна преживяемост 65 мес.50%-на преживяемост 20 мес.

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144

20%

40%

60%

80%

100%

месеци

Кумул

атив

напр

ежив

яемос

т %

Средна преживяемост 65 мес.50%-на преживяемост 20 мес.

Фиг. 2. Обща преживяемост (OS)

Обсъждане В настоящото проучване установихме, че

ОПЛ представляват 6.8% от всички новодиагнос-тицирани ОМЛ, което съответства на средните световни медицински данни за честота от 5 до 13% от ОМЛ. Относителният дял на случаите с ОПЛ след химио/лъчетерапия по повод рак на млечната жлеза (11,6%) също не се различава-ше от данните в литературата. Относително по-ниска честота бе намерена по отношение на относителния дял на морфологичния М3 вариант (19,2%), докато в литературата се съобщава, че тази форма представлява до 1/3 от ОПЛ.

Представените данни показваха постигната ПР в 66,8% от лекуваните болни, което сравнено с европейските резултати на PETHEMA (92%) и GIMEMA (96%) беше значително по-ниско. При-чината, от една страна, е липсата на АТРА в първите години от анализирания период, както и проблемите с доставката на препарата. Това определя и трудностите за стриктното изпълне-ние на започнатия терапевтичен протокол както в индукционната фаза, така и в консолидацията и поддържащата терапия. Ролята на АТРА се


подвърждава и от факта, че пациентите, които продължават да са в ПР, са лекувани с този пре-парат в индукционна фаза, а ¾ от тях – и в пос-ледващата постиндуционна фаза.

По отношение на прогностичните фактори [5-7, 9, 10] в няколко европейски проучвания се отчита ролята на високия левкоцитен брой към диагнозата, възрастта и наличието на М3 вари-ант като неблагоприятен прогностичен фактoр. В нашето проучване групата болни с левкоцитоза (n = 6) беше много малка, за да можем да напра-вим по-задълбочени изводи.

Въпреки че ОПЛ е най-лечимият вид ОМЛ, около 20% от пациентите загиват рано в индук-ционната фаза или поради рецидив. Установя-ването на минимална резидуална болест (МРБ) чрез молекулярен анализ и ранното диагностици-ране на начеващ рецидив се явяват полезен метод за бързо включване на болните в противорецидив-на терапия [10]. Установяването на PML-RARА реанаранжиране чрез RT-PCR в много световни проучвания доказва значението на тази методика в ранното откриване на рецидива и добрите резул-тати от ранното лечение. Лечението на молеку-лярния рецидив е свързано с по-добър отговор, отколкото късното започване лечението на реци-дива при морфологичното му доказване.

Въвеждането на ATRA и напоследък и на ар-сениевия триоксид (АТО) в терапията на ОПЛ доведе наистина до революционни постижения в лечението на тези болни. Съществуват разнооб-разни терапевтични комбинации на европейски-те и световни хематологични групи, но във всич-ки се включва задължително АТРА + минимално добавяне на цитостатици. Лечението на ОПЛ обаче е свързано и с допълнително уточняване стратегията за реиндукционна и поддържаща терапия. От значение е и качествената и своев-ременна заместителна терапия, диагностицира-нето и лечението на страничните реакции от АТРА и химиотерапията. Понастящем има установен експертен Европейски панел (The European LeukemiaNet) с указания за диагностика, лечение и мониториране на пациенти с ОПЛ [8].

Известно е, че ОПЛ е най-лечимата ОМЛ с много успешна диференцираща терапия. Затова всяка новодиагностицирана ОМЛ бързо трябва да бъде отграничена дали става въпрос за ОПЛ, тъй като лечението с АТРА е необходимо да се започне бързо, то е високо ефективно и относи-телно безопасно. Въпреки успехите съществуват и проблеми при това заболяване. От една стра-на, ранната смъртност, дължаща се на хемора-гии поради коагулапатия. От друга страна, все още няма единно мнение дали отделните риско-ви групи трябва да се лекуват еднакво в различ-ните фази на терапия (индукция, консолидация,

реиндукция). Кой е най- добрият режим за високо рисковите ОПЛ: добавянето на високи или ин-термедиерни дози цитозар или включването на АТО в консолидация?

Втората група проблеми са рецидивите. Въп-реки европейските указания за лечение на реци-диви – включване на АТО в терапевтичната стратегия и/или насочване към алогенна трансп-лантация в България лечението на рецидивите е все още проблем. Тук е важно да се отбележи отново ролята на молекулярния мониторинг за предопределяне на рецидивите и от там на ран-ната стратификация и лечение.

Благодарности. Настоящето проучване е осъ-

ществено с финансовата подкрепа на Фонд “Научни изследвания” към Министерството на образование-то, младежта и науката (ВУ-Л-318/07; CVP01/0119-ДО02-35/2009).


1. L o - C o c o , F. et al. Acute promyelocitic leukaemia. A curable diseases. – Leukemia, 1998. № 12, 186.

2. S a n z , M. A., M. S. Tallman et F. Lo-Coco. Tricks of the trade for the appropriate management of newly diagnosed acute promyelocytic leukaemia. – Blood, 105, 2005, 3019-3025.

3. T a l l m a n , M. S. et J. K. Altman. How I treat acute promyelocytic leukaemia. – Blood, 114, 2009, 5126-5135.

4. S a n z , M. A. et al. Risk-adapted treatment of acute promyelocytic leukemia with all-trans-retinoic acid and anthracycline monochemotherapy: a multicenter study by the PETHEMA group. – Blood, 103, 2004, 1237-243.

5. S a n z , M. A., M. S. Tallman et F. Lo-Coco. Practice points, consensus, and controversial issues in the management of patients with newly diagnosed acute promyelocytic leukemia. – Oncologist, 10, 2005, 806-814.

6. F r a n k f u r t , O. et M. S. Tallman. Strategies for the treatment of acute promyelocytic leukaemia. – J. Natl. Compr. Canc. Netw, 4, 2006, № 1, 37-50.

7. S a n z , M. A. et al. Management of acute promyelocytic leukemia: recommendations from an expert panel on behalf of the European LeukemiaNet. – Blood, 113, 2009, 1875-1891.

8. T a l l m a n , M. S. Et al. Acute promyelocytic leukemia: evolving therapeutic strategies; – Blood, 99, 2002, 759-767.

9. L o - C o c o , F. et al. Genetic diagnosis and molecular monitoring in the management of acute promyelocytic leukaemia. – Blood, 94, 1999, 12-22.

10. A d è s , L. et al. Very long-term outcome of acute promyelocytic leukemia after treatment with all-trans retinoic acid and chemotherapy: the European APL Group experience. – Blood, 115, 2010, 1690-1696

11. D e l a S e r n a , J. et al. Causes and prognostic factors of remission induction failure in patients with acute promyelocytic leukemia treated with all-trans retinoic acid and idarubicin. – Blood, 111, 2008, 3395-3402.

Адрес за кореспонденция:

Д-р П. Ганева Национална специализирана болница за активно лече-ние на хематологични заболявания ул. „Пловдивско поле” № 6 1756 София


ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ПРОХЕПСИДИН, РАЗТВОРИМ ТРАНСФЕРИНОВ РЕЦЕПТОР И ZN-ПРОТОПОРФИРИН ПРИ БОЛНИ С АНЕМИЧЕН СИНДРОМ

Ж. Грудева-Попова¹, Д. Терзиева² и М. Панова² ¹Клиника по онкология и хематология, ²Централна клинична лаборатория

УМБАЛ "Св. Георги” – Пловдив

DETERMINING PROHEPCIDIN, SOLUBLE TRANSFERRIN RECEPTOR AND ZN PROTOPORPHYRIN IN ANEMIC SYNDROME CASES

J. Grudeva-Popova¹, D. Terzieva ² and M. Panova² ¹Clinic of Oncology & Hematology, ²Central Clinical Laboratory


Резюме. Точната патогенетична характеристика на анемичния синдром предопределя и възмож-ностите на ефективна съвременна терапия. Независимо че „анемията” е един от най-често среща-ните синдроми в медицината, продължават да съществуват някои диагностични въпроси. Това на-лага да се търсят и нови информативни лабораторни тестове. Споделяме придобития собствен опит от внедряването методите за определяне на нови клиничнолаборатории показатели: прохеп-сидин (pHP), разтворим трансферинов рецептор (sTfR) и Zn-протопорфирин (ZPP). Аналитичната неточност (d%) и аналитичната невъзпроизводимост (CV%) на методите, проверени при различни концентрации на контролен и нативен материал, показаха съответно за pHP < 5.47 d%, CV% < 5.20% в серия и < 6.60% във времето, за sTfR < 8.37 d% и CV% < 6.65% в серия, а за ZPP – CV% < 5.05% в серия и <9.70% във времето. Резултатите са напълно съпоставими с публикуваните данни на фирмите доставчици и предопределят възможността за по-широко използване на посочените по-казатели. Обсъждат се някои методични проблеми, както и ролята им за патогенетичната харак-теристика на анемичния синдром.

Kлючови думи: прохепсидин, разтворим трансферинов рецептор, цинков протопорфирин, хомеос-таза на желязото, анемичен синдром

Summary. The precise pathogenetic characteristics of anemic syndrome also determines the opportunities for effective modern therapy. Even though “anemia” is one of the most common syndromes, there still are some outstanding diagnostic questions. This necessitates that new informative laboratory assays be found. In this paper we share our clinical experience of introducing the methods for determining new clinical-laboratory indicators: prohepcidin (pHP), soluble tranferrin receptor (sTfR) and Zn-protoporphyrin (ZPP). The analyticаl precision (d%) and the analytical variability (CV% - coefficient of variability) of the methods, tested with different concentrations of control and native material, indicated respectively for pHP < 5.47 d%, CV% < 5.20% in series and < 6.60% in time, for sTfR < 8.37 d% and CV% < 6.65% in series, and for ZPP - CV% < 5.05% in series and <9.70% in time. Results are comparable to data published by the pharmaceutical suppliers, and suggest the possibility of wider use of the described indicators. Certain methodological issues are discussed, as well as their role in the pathogenetic characteristics of the anemic syndrome.

Key words: prohepcidin, soluble transferrin receptor, Zn protroporphirin, iron homeostasis, anemic syndrome

Въведение Еритропоезата е изключително динамичен

процес, контролът на който зависи главно от нива-та на еритропоетина и плазменото желязо [7, 25].

Нови данни дават сериозно основание да се смята, че пептидът хепцидин, открит през 2001 г., е първият и единствен засега хормон, регулиращ хомеостазата на Fe [5, 8, 10]. В отговор на био-


логични сигнали хепцидинът регулира чревната абсорбция и разпределението на Fe в организ-ма. Той потиска изнасянето на натрупаното ен-догенно Fe в дуоденалните ентероцити (първич-ните „вносители” на Fe в организма) и в ретику-ло-ендотелните макрофаги (първичното „депо” на Fe в организма). Това се осъществява след като хепцидинът се свързва с разположения върху клетъчната повърхност протеин феропор-тин, осигуряващ трансмембранния транспорт на желязото [5, 11]. Комплексът хепцидин-феропор-тин се интернализира в цитоплазмените лизозо-ми и се хидролизира. Премахвайки феропортина от плазмената мембрана, хепцидинът прекъсва изнасянето на Fe от клетките. В резултат абсор-бираното Fe се задържа в чревния епител, ре-циклираното от старите еритроцити се натрупва в макрофагите, а това в циркулацията намалява – настъпва хипоферемия. На този етап антимик-робният и острофазов протеин хепсидин се смя-та за основен негативен регулатор на желязната абсорбция и кинетика в организма. Той влияе и на желязния трансплацентарен транспорт, като точният механизъм не е изяснен. Неизвестен остава и рецепторът му [19, 26, 32].

Патогенетичната диагностика на различните форми на анемичния синдром продължава да затруднява клиницистите. Това се отнася често за случаите с анемия при хронични заболявания (АХЗ) – анемия при възпалителни, автоимунни, инфекциозни, малигнени и други заболявания. Липсата на достатъчна информация за конкрет-ното ниво на нарушение в комплексната патоге-неза влияе и на терапевтичната ефективност.

Определянето на три сравнително нови по-казателя, които все още не са въведени в наши-те лаборатории – прохепсидин (pHP), разтворим трансферинов рецептор (sTfR) и Zn-протопорфи-рини (ZPP), може да подобри диагностиката на анемичния синдром. Тяхната информативна стойност позволява да се характеризират клю-чови аспекти на железната хомеостаза – хепци-динът контролира наличното желязо в циркула-цията, както и концентрацията му в депата [19, 27, 32], sTfR илюстрира потребността от желязо в еритроидните клетки [1, 3, 20, 36], а ZPP – ефективността на еритропоезата в тях [22, 24].

Цeлта на настоящото проучване е да внедрим методите за определяне на прохепцидин (pHP), разтворим трансферинов рецептор (sTfR) и Zn-протопорфирин (ZPP); да измерим тяхната анали-тична неточност и невъзпроизводимост; да споде-лим нашия опит от внедряването и очакванията за по-пълна клинично ориентирана информация при анемичен синдром с неясна патогенеза.

Материал и методи За оценка на аналитичната неточност на но-

вовнедрените методи са използвани фирмени контролни материали, а за оценка на аналитич-ната невъзпроизводимост - отработена кръв на хоспитализирани пациенти. Означения и концен-трации на контролните материали, както и усло-вията, при които са проучвани неточност и не-възпроизводимост са посочени при резултатите за всеки метод.

Концентрацията на серумния pHP бе опре-деляна чрез внедряването на конкурентен иму-нохимичен тест-набор на фирмата IBL, Germany с кат. № RE54051. pHP от пробата и биотиниран pHP от реактива се конкурират за ограничен брой поликлонални антитела, имобилизирани върху твърдата фаза. След инкубация и проми-ване се прибавя хромоген, а получената оцветка се отчита по калибрационна крива от 7 точки (от 0 до 1000 ng/ml) (SerioS microplate reader, SEAC, Italy). Интензитетът на оцветката е обратнопро-порционален на концентрацията на pHP в проба-та. Посочените от производителя референтни граници са 58.9–158 ng/ml pHP [14].

За измерване концентрацията на серумният sTfR бе внедрен имуноензимен (ELISA) набор на фирмата BioVendor – Laboratorni medicina, a.s., Czech Republic, с кат. № RD194011100. Касае се за имунометричен сандвичев метод с две мо-ноклонални антитела срещу различни епитопи на молекулата на човешки sTfR. Едните са фик-сирани към твърдата фаза, а вторите – маркира-ни с пероксидаза. След съответни инкубации и промивания се прибавя хромоген и получената оцветка се спектрофотометрира на 450 nm. Ин-тензитетът на оцветката е пропорционален на концентрацията на sTfR в пробата и концентра-цията се отчита по калибрационна крива от 6 точки (от 0.05 до 2 μg/ml), (SerioS microplate reader, SEAC, Italy). Референтните граници, по-сочени от производителя са 0.9-3.3 μg/ml sTfR [16, 29, 30].

Концентрацията на ZPP се измери след ли-зиране на еритроцитите в проба от венозна кръв, взета с литиев хепаринат. С ProtoFluor-Z Hematofluorometer (Helena Laboratories, Inc, USA) концентрацията на ZPP се измерва бързо и лес-но, като пробата се облъчва със светлина с дължина на вълната 415 nm, а емитираната флуоресценция се измерва на 595 nm. Резулта-тите се представят като отношение между флуо-ресценцията на ZPP и абсорбцията на хема (μmol ZPP/mol Heme). Отчита се по калибраци-онна права, определена от две концентрации – ниска (86 μmol ZPP/mol Heme) и висока (μmol ZPP/mol Heme) [31,37].


Статистическата обработка на резултатите се извърши чрез вариационен анализ.

Резултати Серумен pHP. След усвояване на техниката за

определяне на серумен pHP аналитичната неточ-ност на метода се изчисли от 20 определяния на фирмен контролен материал (Control Low) с обя-вена концентрация на pHP от 90.0 ng/ml. Получе-ната средна стойност 94.9 ng/ml показва ниска аналитична неточност на метода от 5.47 d%.

Аналитичната невъзпроизводимост в серия (within-run) се проучи като три произволно избра-ни пациентски проби се изследваха по пет пъти. Невъзпроизводимостта във времето (between day) се изчисли от резултатите, получени в 20 последователни работни дни (табл. 1).

Таблица 1. Аналитична невъзпроизводимост в серия и във време на три концентрации серумен pHР

Показател Невъзпроизво-димост в серия

Невъзпроизво-димост във време

X ср. (ng/ml) 94.5 152 37.9 92.5 150 37.9

SD (ng/ml) 2.68 7.95 0.64 3.82 9.90 0.78

CV (%) 2.84 5.20 1.70 4.13 6.60 2.08

Получените коефициенти на вариация за трите

концентрации не надхвърлят CV 5.20 % в серия и 6.60% във време и се оказват близки до обявените от фирмата производител на набора – 4.74% в серия и под 10% във време. При тази потвър-дена добра аналитична надеждност наборът може да се смята приложим в рутинната лабора-торна практика.

Серумен sTfR. Аналитичната неточност се установи с два фирмени контролни материала, определяни по 20 пъти. За контролния материал QC Low, с обявена стойност 2.15 μg/ml, се полу-чи 1.97 μg/ml sTfR, което означава d% – 8.37%, а за QC High, с обявена стойност 6.56 μg/ml, се получи 6.87 μg/ml и съответно d% 4.73.

Невъзпроизводимостта се проучи с опреде-ляне на същите два контролни материала в се-рия (within-run) с 8 измервания на всеки (табл. 2.) и във време (between day) с измервания в 8 пос-ледователни дни (табл. 3).

Таблица 2. Аналитична невъзпроизводимост на sTfR в серия

Показател Quality Control Low Quality Control High

X ср. (μg/ml) 1.93 6.64

SD (μg/ml) 0.128 0.410

CV % 6.65 6.18

Taблица 3. Аналитична невъзпроизводимост на sTfR във време

Показател Quality Control Low Quality Control High

X ср. (μg/ml) 2.03 6.68

SD (μg/ml) 0.175 0.45

CV % 8.62 6.78

Невъзпроизводимостта при определяне на

серумния sTfR (CV < 6.65 % в серия и CV < 8.62 % във време) е близка до обявените от фирмата производител (CV 7.0 % в серия и CV 7.5 % във време), което е приемлив резултат за един рути-нен метод.

Еритроцитен ZPP. Контролни материали за оценка на аналитичната неточност на резултати-те за ZPP не се предоставят от доставчика на флуориметъра и се разчита само на инструмен-талната калибровка.

Аналитичната невъзпроизводимост в серия се измери с 10 определяния на ZPP в три произ-волно избрани пациентски проби (S1, S2, S3), а невъзпроизводимостта във време – в същите проби, но в продължение на 10 дни (табл. 4.).

Таблица 4. Аналитична невъзпроизводимост на ZPP (μmol ZPP/mol Heme) на три пациентски проби (n = 10)

Показател Невъзпроизво-димост в серия

Невъзпроизво-димост във време

X ср. (ng/ml) 42.3 75.4 157 43.0 79.7 1.52

SD (ng/ml) 1.25 3.81 4.95 2.05 7.72 9.98

CV % 2.96 5.05 3.15 4.77 9.70 6.58

При фирмен CV% на ZPP около 5% получе-

ните резултати за невъзпроизводимост може да се смятат за приемливи. Фирмените референтни граници са 30-80 µmol/ ZPP/mol Heme.

Обсъждане Хепсидинът (2001 г.) се синтезира от черния

дроб и притежава антимикробна активност като компонент на вродения имунитет [4, 9]. Понасто-ящем се приема като доказан фактът, че хепси-динът модулира съдържанието на Fe в организ-ма според актуалните потребности [5, 10]. Пови-шените нужди от функционално лабилно Fe (фе-номен при истински железен дефицит, хипоксия и др.) провокират намален синтез на хепсидин. В резултат се стимулират гастроинтестиналната резорбция и клетъчният експорт на Fe от макро-фагите. Повишени нива на хепсидин се устано-вяват при АХЗ [13, 34]. Възникналите диферен-циалнодиагностични възможности във връзка с последните новости в хомеостазата на Fe опре-


деля значението на изследването на серумен хепсидин при анемия с неясен произход.

Измерването на хепсидин в човешки серум обаче среща редица методични проблеми. Хро-матографските методи с масспектрална детек-ция дават възможност за определяне на изо-формите на хепсидина (Hр-25, Hp-22 и Hp-20), но както и полуколичествената SELDI-TOF масспек-трометрия изискват скъпа апаратура и са трудо-емки [18].

Потенциал за по-широко приложение в кли-ничните лаборатории имат имунологичните ме-тоди. Основната трудност при тях е генериране-то на анти-хепсидинови антитела по следните причини [12, 21, 28 ]:

• малка и компактна молекула на Hр с не-достатъчно епитоп;

• висока степен на запазване на Hр при раз-лични животински видове, което предопределя нисък имунен отговор;

• ограничена наличност на антигена със специфична конфигурация на молекулата – форма на фиба, стабилизирана от четири ди-сулфидни моста.

Клинично по-приложима е техниката ELISA, основана на антитела срещу предшественика прохепсидин (pHP), какъвто е и методът, използ-ван в това проучване. С този принцип на измер-ване се установява значителна интра-индивидуална вариация при здрави лица и липса на общопризнати референтни граници. Това наложи в световен аспект инициативата за ме-тодологична хармонизация на тестовете за оп-ределяне на хепцидин, което вероятно ще стане на принципа на масспекрометрични или на иму-нохимични методи, стандартизирани със синте-тичен хепцидин-25 [18, 21].

Разтворимият трансферинов рецептор (sTfR) е „излющен” от клетъчната мембрана трансферинов рецептор (TfR) – гликопротеин, съставен от две eднакви полипептидни субеди-ници с молекулна маса 74 kDa. Като компонент на клетъчната мембрана, TfR разпознава серум-ния трансферин, вмъква го в клетката и така доставя необходимото Fe [1, 3, 6]. Степента на генна експресия на TfR отразява нуждата от Fe в клетката и корелира правопропорционално с концентрацията на sTfR в серума. Предвид фак-та, че основната утилизация на метаболитното Fе (80%) става в еритроидните прекурсори се при-ема, че sTfR има важна информативна стойност за ранното откриване на железен дефицит в еритро-на. Освен при железен дефицит sTfR е повишен при хемолиза; доказано нисък е при паценти с апластична анемия и обичайно е непроменен при АХЗ. Използва се и за проследяване на посттран-

сплантационния ефект с цел характеристика на анемията като хипер-/хипопластна.

Поради факта, че феритинът отразява съ-държанието на Fe в депата, а sTfR отразява функционалното Fe в организма, то отношението sTfR/log феритин е много важно за добра оценка на тоталното телесно Fe [2, 23]. Клиничната практика показва, че sTfR рядко се използва в рутинната практика за характеристика на истинс-ки железен дефицит (носи допълнителна ин-формация и за АХЗ). Той дава неголеми допъл-нителни предимства пред стандартните показа-тели на Fe статус за оценка на истинския дефи-цит, особено ако в панела е включено серумно ниво на феритин. По тази причина при добре де-финирана група пациенти с нехематологични ма-лигноми (солидни тумори) sTfR не може да бъде повлиян от Fe статус, защото последният е с неиз-вестен механизъм. Много проучвания при пациен-ти с малигнени заболявания доказват, че нивото на еритропоетинова концентрация не корелира с тежестта на анемичния синдром и постмедикамен-тозно индуцираната миелосупресия. При тези слу-чаи се установява намаляване концентрацията на sTfR. Отношението sTfR/log феритин има своята диагностична стойност при пациенти с хронични възпаления или инфекции [35].

ZPP се образува в ретикулоцитите като ра-нен страничен дериват на нормалната еритро-поеза [22, 25]. При железен дефицит повече про-топорфирин IX се свърза с цинк (до 90%) вместо с желязо и се натрупва в клетката като резултат на непълноценната хемоглобинизация. Този продукт не притежава оксидативна способност. Флуоресценцията на ZPP в интактните еритро-цити позволява бързо измерване на моларното отношение ZPP/хем с малък разход на средства и материал Важно е обаче темперирането на пробите, калибраторите и реактива, за да се получи възпроизводима флуоресценция на ZPP. Серумният билирубин и някои лекарства водят до фалшивовисоки концентрации на ZPP, а не-пълната оксигенация на хемоглобина – до фал-шивониски. ZPP се използва за диагностика на ранен Fe дефицит. Отношението ZPP/heme и неговото нарастване е ранен индикатор за из-черпване на функционалното Fe и доказва желе-зен дефицит именно в еритроидния костен мозък [24]. Намира и клинично приложение като скри-нингов тест за хронична оловна експозиция (реа-гира обикновено след 3-4 месеца) и еритропое-тична порфирия.

В клиничната практика често се търси пра-вилният отговор на въпроса „налага ли се про-веждане на феротерапия” при анемия с хипофе-ремия? Зададен по друг начин той би звучал


така: „за какъв тип анемия се касае всъщност – истински феродефицит (ЖДА) или за АХЗ?” От-говорът понякога е труден дори за хематолога.

Показателите, използвани за диагностика на ЖДА, включват:

• показатели за скрининг – HGB, mcV, % хипохромни Ер, съдържание на HGB в ретикуло-цити (СНr), сатурация на трансферин, ZPP;

• дефинитивни показатели за Fe депа – феритин; за тъканно Fe – sTfR

Представен по друг начин панелът лаборатор-ни изследвания изглежда и така [1, 4, 17, 24, 33]:

– показатели с ограничена информативна стойност (ползвани най-често в клиничната прак-тика) –серумни Fe и трансферин; трансферинова сатурация;

– показатели с доказателствена стойност: серумен феритин; sTfR; sTfR/log феритин; ZPP; хепсидин (!).

АХЗ е изключително важен медицински и со-циален проблем. Правилната диагностика на АХЗ изисква главно лечение на основното забо-ляване. АХЗ е резистентна на еритропоетин или феротерапия, тъй като става въпрос за функционален железен дефицит при цитокин-медиирана анемия [4, 15, 36].

На табл. 5 е представено становището ни как би изглеждала съвременната лабораторната диференциална диагноза ЖДА/АХЗ в контекста на нововъведените тестове:

Таблица 5. Възможности за актуална диагноза ЖДА/АХЗ

Показател AХЗ ЖДА

Серумно желязо ↓ ↓

Трансферин ↓/норма ↑

Трансферинова сатурация % ↓ ↓

Феритин норма/↑ ↓

sTfR норма/↓ ↑

sTfR/log феритин нисък (< 1) висок (> 2)

Хепсидин (начални данни) ↑ ↓

ZPP норма ↑

Заключение Новите познания за биологията на желязото

след откриването на хепсидина провокира както въпроси за съвременната диагностика, така и за модерните терапевтични възможности (напр. аго-нисти и антагонисти на хепсидина, действащи на ниво рецептопорен механизъм). Хепcидин-базира-ната диагностика и терапия вероятно ще играят ключова роля в контрола на анемията в областта на онкологията и при много хронични заболявания с възпалителна и автоимунна етиология.

БИБЛИОГРАФИЯ 1. А т а н а с о в , Н. и А. Атанасов. Желязо в човешки се-

рум и „железен статус” са две различни неща. – В: Ата-насов Н, Атанасов А. Към рационалното лабораторно изследване. Пловдив. ЕТ ”В. Петров” – ВАП, 2001, 39-52.

2. A h l u w a l i a , N. Field-Level Calibration of a Method for Assessing Iron Deficiency by Ferritin Analysis in Dried Serum Spots (DSS) on Filter Paper in Population Surveys. University Park, USA, Pennsylvania State University USA 2001.

3. A l l e n , J. at al. Measurement of solubile transferring receptor in serum of healthy adults. – Clin. Chem., 44, 1998, 35-39.

4. А n d r e w s , N. Forging a field: the golden age of iron biology. – Blood, 112, 2008, № 2, 219-230.

5. B e r g a m a s c h i , G. et L. Villani. Serum hepcidin: a novel diagnostic tool in disorders of iron metabolism. – Haematologica, 94, 2009, № 12, 1631-1633.

6. B h a s k a r a m , P. et al. Serum Transferrin Receptor in Children With Respiratory Infections. – Eur. J. Clin. Nutr., 57, 2003, № 1, 75-80.

7. B r u g h a r a , C. et P. Beris. Iron therapy. – In: Disorders of erythropoiesis, erythrocytes and iron metabolism. – The Handbook of ESH 2009, 513-528.

8. D a l l a l i o , G., T. Fleury et R. Means. Serum hepcidin in clinical specimens. – Br. J. Haematology, 122, 2003, 996-1000.

9. D e i c h e r , R. Et W. Hörl. New insights into the regulation of iron homeostasis. – Eur. J. Clin. Investigation, 36, 2006, 301-309.

10. D e l a b y , C., J. Deybach et C. Beaumont. L’hepcidine et le métabolisme du fer. Hepcidin and iron metabolism. – Elsevier Masson SAS, 28, 2007, 510-512.

11. D u , X. et al. Novel Mechanism of Regulaton of Hepcidin and Iron Homeostasis. – Hematologist, 5, 2008, № 5, 1.

12. G a n z , T. et al. Immunoassay for human serum hepcidin. – Blood, 112, 2008, № 10, 4292-4297.

13. G r o t t o , H. Anaemia of cancer: an overview of mechanisms involved in its pathogenesis. – Med. Oncol., 25, 2008, 12-21.

14. H e p c i d i n prohormone ELISA (RE54051). Instruction for use, 2007.

15. H e r s h k o , C. et al. Mechanisms of iron regulation and of iron deficiency. European Hematology Association 2007, Education Book –Hematology, 1-8.

16. H u m a n sTfR ELISA (RD194011100). Product data sheet, v.08 010808 15.

17. K a n a m a r u , A. Iron deficiency anemia. – Nippon. Rinsho, 66, 2008, № 3, 499-504.

18. K e m n a , E. et al. Mass spectrometry-based Hepcidin Measurements in Serum and Urine: analytical aspects and clinical implications. – Clin. Chem., 53, 2007, № 4, 620-628.

19. K e m n a , E. et al. Hepcidin: from discovery to defferential diagnosis. – Haematologica, 93, 2008, 90-97.

20. K r a t o v i l , T. et al. Age specific reference intervals for soluble transferrin receptor (sTfR). – Clin. Chimica Acta, 380, 2007, № 1-2, 222-224.

21. K r o o t , J. et al. Results of the first international round robin for the quantification of urinary and plasma hepcidin assays: need for standardization. – Haematologica, 94, 2009, № 12, 1748-1752.

22. L a b b e , R., A. Dewanji et K. McLaughlin. Observations on the zinc protoporphyrin/heme ratio in whole blood. – Clin. Chem., 45, 1999, 146-148.

23. M a l o p e , B. et al. The ratio of serum transferrin receptor and serum ferritin in the diagnosis of iron status. – Brit. J. Haematology, 115, 2001, № 1, 84-89.

24. M e i , Z. et al. Erythrocyte protoporphyrin or hemoglobin: which is a better screening test for iron deficiency in children


and women?" – Am. J. Clin. Nutr., 77, 2003, № 5, 1229-1233.

25. M i l l o t , S., L. Falco et C. Beaumont. Iron and erythro-poiesis. – In: Disorders of erythro-poiesis, erythrocytes and iron metabolism. The Handbook of ESH 2009, 469-486.

26. N e m e t h , E. Iron regulation and erythropoiesis. – Curr. Opinion Hemat., 15, 2008, 169-175.

27. N e m e t h , E. et T. Ganz. Hepcidin and iron-loading anemias. – Haematologica, 91, 2006, № 6, 727-730.

28. O l b i n a , G. et al. Immunoassay for Human Hepcidin in Blood. – ASH Annual Meeting, 112, 2008, № 11, Abstract 3839, page 131

29. P f e i f f e r , Ch. et al. Evaluation of an automated soluble transferrin receptor (sTfR) assay on the Roche Hitachi ana-lyzer and its comparison to two ELISA assays. – Clin. Chimica Acta, 382, 2007, № 1-2, 112-116.

30. R a y a , G. et al. Soluble transferring receptor (sTfR): biological variations and reference limits. – Clin. Chem. Laboratory Med., 39, 2001, 1162-1168.

31. R o h , Y. et. al. Zinc Protoporphyrin IX Concentrations be-tween Normal Adults and the Lead-Exposed Workers Measured by HPLC, Spectrofluorometer, and Hemato-fluorometer. Industrial Health, 38, 2000, 372-379.

32. S w i n k e l s , W. et R. Fleming. Hepcidin as a potential new biomarker for disorders of iron metabolism. – Haematology, 2, 2009, 28-31.

33. T h e u r l , I. et al. Regulation of iron homeostasis in anemia of chronic disease and iron deficiency anemia: diagnostic and therapeutic implications. – Blood, 113, 2009, № 21, 5277-5286.

34. W a r d , D. et al. Increased hepcidin expression in colorectal carcinogenesis. – World J. Gastroenterol., 14, 2008, № 9, 1339-1345.

35. W e i s s , G. Pathophysiology, diagnosis and treatment of the anemia of chronic disease.Eropean Hematology Asso-ciaiton 2007, Education Book-Hematology, 9-17.

36. W i a n s , F. et al. Discriminating Between Iron Deficiency Anemia and Anemia of Chronic Disease Using Traditional Indices of Iron Status vs Transferrin Receptor Concentration. – Am. J. Clin. Pathol., 115, 2001, № 1, 112-118.

37. Q u e s t Diagnostics. Test Menus: Zinc Protoporphyrin (online information, accessed October 2007). аvailable online.


Ж. Грудева-Попова Клиника по онкология и хематология УМБАЛ "Св. Георги” Пловдив


ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ПРОХЕПСИДИН, РАЗТВОРИМ ТРАНСФЕРИНОВ РЕЦЕПТОР И ZN-ПРОТОПОРФИРИН ПРИ БОЛНИ С АНЕМИЧЕН СИНДРОМ

Ж. Грудева-Попова1, Д. Терзиева2, и М. Панова2 1Клиника по онкология и хематология, 2Централна клинична лаборатория

УМБАЛ “Св. Георги” – Пловдив

DETERMINING PROHEPCIDIN, SOLUBLE TRANSFERRIN RECEPTOR AND ZN PROTOPORPHYRIN IN ANEMIC SYNDROME CASES

J. Grudeva-Popova1, D. Terzieva2 and M. Panova2 1Clinic of Oncology & Hematology, 2Central Clinical Laboratory


Резюме. Точната патогенетична характеристика на анемичния синдром предопределя и възможностите на ефективна съвременна терапия. Независимо че „анемията” е един от най-често срещаните синдроми в медицината, продължават да съществуват някои диагностични въпроси. Това налага да се търсят и нови информативни лабораторни тестове. Споделяме придобития собствен опит от внедряването на методите за определяне на нови клиничнолаборатории показатели: прохепсидин (pHP), разтворим тран-сферинов рецептор (sTfR) и Zn-протопорфирин (ZPP). Аналитичната неточност (d%) и аналитичната невъзпроизводимост (CV%) на методите, проверени при различни концентрации на контролен и нативен материал, показаха съответно за pHP < 5.47 d%, CV% < 5.20% в серия и < 6.60% във времето, за sTfR < 8.37 d% и CV% < 6.65% в серия, а за ZPP – CV% < 5.05% в серия и < 9.70% във времето. Резултатите са напълно съпоставими с публикуваните данни на фирмите доставчици и предопределят възможността за по-широко използване на посочените показатели. Обсъждат се някои методични проблеми, както и ро-лята им за патогенетичната характеристика на анемичния синдром.

Kлючови думи: прохепсидин, разтворим трансферинов рецептор, цинков протопорфирин, хомеос-таза на желязото, анемичен синдром

Summary. The precise pathogenetic characteristics of anemic syndrome also determines the opportunities for effective modern therapy. Even though “anemia” is one of the most common syndromes, there still are some outstanding diagnostic questions. This necessitates that new informative laboratory assays be found. In this pa-per we share our clinical experience of introducing the methods for determining new clinical-laboratory indica-tors: prohepcidin (pHP), soluble tranferrin receptor (sTfR) and Zn-protoporphyrin (ZPP). The analyticаl precision (d%) and the analytical variability (CV% – coefficient of variability) of the methods, tested with different concen-trations of control and native material, indicated respectively for pHP < 5.47 d%, CV% < 5.20% in series and < 6.60% in time, for sTfR < 8.37 d% and CV% < 6.65% in series, and for ZPP – CV% < 5.05% in series and <9.70% in time. Results are comparable to data published by the pharmaceutical suppliers, and suggest the possibility of wider use of the described indicators. Certain methodological issues are discussed, as well as their role in the pathogenetic characteristics of the anemic syndrome.

Key words: prohepcidin, soluble transferrin receptor, Zn protroporphirin, iron homeostasis, anemic syndrome

Въведение Еритропоезата е изключително динамичен

процес, контролът на който зависи главно от нивата на еритропоетина и плазменото желязо [7, 25 ]. Нови данни дават сериозно основание да

се смята, че пептидът хепцидин, открит през 2001 г., е първият и единствен засега хормон, регулиращ хомеостазата на Fe [5, 8, 10]. В отго-вор на биологични сигнали хепцидинът регулира чревната абсорбция и разпределението на Fe в

Ж. Грудева-Попова, Д. Терзиева и М. Панова. Определяне на прохепсидин, разтворим... 50

организма. Той потиска изнасянето на натрупа-ното ендогенно Fe в дуоденалните ентероцити (първичните „вносители” на Fe в организма) и в ретикуло-ендотелните макрофаги (първичното „депо” на Fe в организма). Това се осъществява след като хепцидинът се свързва с разположе-ния върху клетъчната повърхност протеин фе-ропортин, осигуряващ трансмембранния транс-порт на желязото [5, 11]. Комплексът хепцидин-феропортин се интернализира в цитоплазмените лизозоми и се хидролизира. Премахвайки феро-портина от плазмената мембрана, хепцидинът прекъсва изнасянето на Fe от клетките. В резул-тат абсорбираното Fe се задържа в чревния епи-тел, рециклираното от старите еритроцити се натрупва в макрофагите, а това в циркулацията намалява – настъпва хипоферемия. На този етап антимикробният и острофазов протеин хепсидин се смята за основен негативен регулатор на же-лязната абсорбция и кинетика в организма. Той влияе и на желязния трансплацентарен транс-порт, като точният механизъм не е изяснен. Не-известен остава и рецепторът му [19, 26, 32].

Патогенетичната диагностика на различните форми на анемичния синдром продължава да затруднява клиницистите. Това се отнася често за случаите с анемия при хронични заболявания (АХЗ) – анемия при възпалителни, автоимунни, инфекциозни, малигнени и други заболявания. Липсата на достатъчна информация за конкрет-ното ниво на нарушение в комплексната патоге-неза влияе и на терапевтичната ефективност.

Определянето на три, сравнително нови по-казателя, които все още не са въведени в наши-те лаборатории – прохепсидин (pHP), разтворим трансферинов рецептор (sTfR) и Zn-протопорфи-рини (ZPP), може да подобри диагностиката на анемичния синдром. Тяхната информативна стойност позволява да се характеризират клю-чови аспекти на железната хомеостаза – хепци-динът контролира наличното желязо в циркула-цията, както и концентрацията му в депата [19, 27, 32], sTfR илюстрира потребността от желязо в еритроидните клетки [1, 3, 20, 36], а ZPP – ефективността на еритропоезата в тях [22, 24].

Цeлта на настоящото проучване е да внед-рим методите за определяне на прохепцидин (pHP), разтворим трансферинов рецептор (sTfR) и Zn-протопорфирин (ZPP); да измерим тяхната аналитична неточност и невъзпроизводимост; да споделим нашия опит от внедряването и очаква-нията за по-пълна клинично ориентирана ин-формация при анемичен синдром с неясна пато-генеза.

Материал и методи За оценка на аналитичната неточност на но-

вовнедрените методи са използвани фирмени контролни материали, а за оценка на аналитич-ната невъзпроизводимост – отработена кръв на хоспитализирани пациенти. Означения и концен-трации на контролните материали, както и усло-вията, при които са проучвани неточност и не-възпроизводимост са посочени при резултатите за всеки метод.

Концентрацията на серумния pHP бе опре-деляна чрез внедряването на конкурентен иму-нохимичен тест-набор на фирмата IBL, Germany с кат. № RE54051. pHP от пробата и биотиниран pHP от реактива се конкурират за ограничен брой поликлонални антитела, имобилизирани върху твърдата фаза. След инкубация и проми-ване се прибавя хромоген, а получената оцветка се отчита по калибрационна крива от 7 точки (от 0 до 1000 ng/ml) (SerioS microplate reader, SEAC, Italy). Интензитетът на оцветката е обратнопро-порционален на концентрацията на pHP в проба-та. Посочените от производителя референтни граници са 58.9-158 ng/ml pHP [14].

За измерване концентрацията на серумният sTfR бе внедрен имуноензимен (ELISA) набор на фирмата BioVendor – Laboratorni medicina, a.s., Czech Republic, с кат. № RD194011100. Касае се за имунометричен сандвичев метод с две мо-ноклонални антитела срещу различни епитопи на молекулата на човешки sTfR. Едните са фик-сирани към твърдата фаза, а вторите – маркира-ни с пероксидаза. След съответни инкубации и промивания се прибавя хромоген и получената оцветка се спектрофотометрира на 450 nm. Ин-тензитетът на оцветката е пропорционален на концентрацията на sTfR в пробата и концентра-цията се отчита по калибрационна крива от 6 точки (от 0.05 до 2 μg/ml), (SerioS microplate reader, SEAC, Italy). Референтните граници, по-сочени от производителя са 0.9-3.3 μg/ml sTfR [16, 29, 30].

Концентрацията на ZPP се измери след лизи-ране на еритроцитите в проба от венозна кръв, взета с литиев хепаринат. С ProtoFluor-Z Hemato-fluorometer (Helena Laboratories, Inc, USA) кон-центрацията на ZPP се измерва бързо и лесно, като пробата се облъчва със светлина с дължина на вълната 415 nm, а емитираната флуоресценция се измерва на 595 nm. Резултатите се представят като отношение между флуоресценцията на ZPP и абсорбцията на хема (μmol ZPP/mol Heme). Отчита се по калибрационна права, определена от две концентрации – ниска (86 μmol ZPP/mol Heme) и висока (μmol ZPP/mol Heme) [31,37].


Статистическата обработка на резултатите се извърши чрез вариационен анализ.

Резултати Серумен pHP. След усвояване на техниката

за определяне на серумен pHP аналитичната неточност на метода се изчисли от 20 определя-ния на фирмен контролен материал (Control Low) с обявена концентрация на pHP от 90.0 ng/ml. По-лучената средна стойност 94.9 ng/ml показва ниска аналитична неточност на метода от 5.47 d%.

Аналитичната невъзпроизводимост в серия (within-run) се проучи като три произволно избра-ни пациентски проби се изследваха по пет пъти. Невъзпроизводимостта във времето (between day) се изчисли от резултатите, получени в 20 последователни работни дни (табл. 1).

Таблица 1. Аналитична невъзпроизводимост в серия и във време на три концентрации серумен pHР

Показател Невъзпроизводимост в серия

Невъзпроизводимост във време

X ср. (ng/ml) 94.5 152 37.9 92.5 150 37.9

SD (ng/ml) 2.68 7.95 0.64 3.82 9.90 0.78

CV (%) 2.84 5.20 1.70 4.13 6.60 2.08

Получените коефициенти на вариация за

трите концентрации не надхвърлят CV 5.20 % в серия и 6.60% във време и се оказват близки до обявените от фирмата производител на набора – 4.74% в серия и под 10% във време. При тази потвърдена добра аналитична надеждност на-борът може да се мячита приложим в рутинната лабораторна практика.

Серумен sTfR. Аналитичната неточност се установи с два фирмени контролни материала, определяни по 20 пъти. За контролния материал QC Low, с обявена стойност 2.15 μg/ml, се полу-чи 1.97 μg/ml sTfR, което означава d% –8.37%, а за QC High, с обявена стойност 6.56 μg/ml, се получи 6.87 μg/ml и съответно d% 4.73.

Невъзпроизводимостта се проучи с опреде-ляне на същите два контролни материала в се-рия (within-run) с 8 измервания на всеки (табл. 2) и във време (between day) с измервания в 8 пос-ледователни дни (табл. 3).

Таблица 2. Аналитична невъзпроизводимост на sTfR в серия

Показател Quality Control Low

Quality Control High

X ср. (μg/ml) 1.93 6.64

SD (μg/ml) 0.128 0.410

CV % 6.65 6.18

Taблица 3. Аналитична невузпроизводимост на sTfR във време

Показател Quality Control Low

Quality Control High

X ср. (μg/ml) 2.03 6.68

SD (μg/ml) 0.175 0.45

CV % 8.62 6.78 Невъзпроизводимостта при определяне на

серумния sTfR (CV < 6.65 % в серия и CV < 8.62 % във време) е близка до обявените от фирмата производител (CV 7.0 % в серия и CV 7.5 % във време), което е приемлив резултат за един рути-нен метод.

Еритроцитен ZPP. Контролни материали за оценка на аналитичната неточност на резултати-те за ZPP не се предоставят от доставчика на флуориметъра и се разчита само на инструмен-талната калибровка.

Аналитичната невъзпроизводимост в серия се измери с 10 определяния на ZPP в три произ-волно избрани пациентски проби (S1, S2, S3), а невъзпроизводимостта във време – в същите проби, но в продължение на 10 дни (табл. 4).

Таблица 4. Аналитична невъзпроизводимост на ZPP (μmol ZPP/mol Heme) на три пациентски проби (n = 10)

Показател Невъзпроизводимост в серия

Невъзпроизводимост във време

X ср. 42.3 75.4 157 43.0 79.7 1.52

SD 1.25 3.81 4.95 2.05 7.72 9.98

CV % 2.96 5.05 3.15 4.77 9.70 6.58 При фирмен CV% на ZPP около 5% получе-

ните резултати за невъзпроизводимост може да се смятат за приемливи. Фирмените референтни граници са 30-80 μmol/ ZPP/mol Heme.

Обсъждане Хепсидинът (2001 г.) се синтезира от черния

дроб и притежава антимикробна активност като компонент на вродения имунитет [4, 9]. Понасто-ящем се приема като доказан фактът, че хепси-динът модулира съдържанието на Fe в организ-ма според актуалните потребности [5, 10]. Пови-шените нужди от функционално лабилно Fe (фе-номен при истински железен дефицит, хипоксия и др.) провокират намален синтез на хепсидин. В резултат се стимулират гастроинтестиналната резорбция и клетъчният експорт на Fe от макро-фагите. Повишени нива на хепсидин се устано-вяват при АХЗ [13, 34]. Възникналите диферен-циалнодиагностични възможности във връзка с последните новости в хомеостазата на Fe опре-деля значението на изследването на серумен хепсидин при анемия с неясен произход.


Измерването на хепсидин в човешки серум обаче среща редица методични проблеми. Хро-матографските методи с масспектрална детек-ция дават възможност за определяне на изо-формите на хепсидина (Hр-25, Hp-22 и Hp-20), но както и полуколичествената SELDI-TOF масспек-трометрия изискват скъпа апаратура и са трудо-емки [18].

Потенциал за по-широко приложение в кли-ничните лаборатории имат имунологичните ме-тоди. Основната трудност при тях е генериране-то на анти-хепсидинови антитела по следните причини [12, 21, 28 ]:

• малка и компактна молекула на Hр с не-достатъчно епитоп;

• висока степен на запазване на Hр при раз-лични животински видове, което предопределя нисък имунен отговор;

• ограничена наличност на антигена със специфична конфигурация на молекулата – фор-ма на фиба, стабилизирана от четири дисул-фидни моста.

Клинично по-приложима е техниката ELISA, основана на антитела срещу предшественика прохепсидин (pHP), какъвто е и методът, използ-ван в това проучване. С този принцип на измер-ване се установява значителна интра-индиви-дуална вариация при здрави лица и липса на общопризнати референтни граници. Това нало-жи в световен аспект инициативата за методоло-гична хармонизация на тестовете за определяне на хепцидин, което вероятно ще стане на прин-ципа на масспекрометрични или на имунохимич-ни методи, стандартизирани със синтетичен хепцидин-25 [18, 21].

Разтворимият трансферинов рецептор (sTfR) е „излющен” от клетъчната мембрана трансферинов рецептор (TfR) – гликопротеин, съставен от две eднакви полипептидни субедини-ци с молекулна маса 74 kDa. Като компонент на клетъчната мембрана, TfR разпознава серумния трансферин, вмъква го в клетката и така доставя необходимото Fe [1, 3, 6]. Степента на генна екс-пресия от TfR отразява нуждата на Fe в клетката и корелира правопропорционално с концентраци-ята на sTfR в серума. Предвид факта, че основна-та утилизация на метаболитното Fе (80%) става в еритроидните прекурсори се приема, че sTfR има важна информативна стойност за ранното откри-ване на железен дефицит в еритрона. Освен при железен дефицит sTfR е повишен при хемолиза; доказано нисък е при паценти с апластична ане-мия и обичайно е непроменен при АХЗ. Използва се и за проследяване на посттрансплантационния ефект с цел характеристика на анемията като хипер-/хипопластна.

Поради факта, че феритинът отразява съ-държанието на Fe в депата, а sTfR отразява функционалното Fe в организма, то отношението sTfR/log феритин е много важно за добрата оценка на тоталното телесно Fe [2, 23]. Клинич-ната практика показва, че sTfR рядко се използ-ва в рутинната практика за характеристика на истински железен дефицит (носи допълнителна информация и за АХЗ). Той дава неголеми до-пълнителни предимства пред стандартните по-казатели на Fe статус за оценка на истинския дефицит, особено ако в панела е включено се-румно ниво на феритин. По тази причина при добре дефинирана група пациенти с нехемато-логични малигноми (солидни тумори) sTfR не може да бъде повлиян от Fe статус, защото пос-ледният е с неизвестен механизъм. Много про-учвания при пациенти с малигнени заболявания доказват, че нивото на еритропоетинова концен-трация не корелира с тежестта на анемичния синдром и постмедикаментозно индуцираната миелосупресия. При тези случаи се установява намаляване концентрацията на sTfR. Отношени-ето sTfR/log феритин има своята диагностична стойност при пациенти с хронични възпаления или инфекции [35].

ZPP се образува в ретикулоцитите като ра-нен страничен дериват на нормалната еритро-поеза [22, 25]. При железен дефицит повече про-топорфирин IX се свърза с цинк (до 90%) вместо с желязо и се натрупва в клетката като резултат на непълноценната хемоглобинизация. Този продукт не притежава оксидативна способност. Флуоресценцията на ZPP в интактните еритро-цити позволява бързо измерване на моларното отношение ZPP/хем с малък разход на средства и материал Важно е обаче темперирането на пробите, калибраторите и реактива, за да се получи възпроизводима флуоресценция на ZPP. Серумният билирубин и някои лекарства водят до фалшивовисоки концентрации на ZPP, а не-пълната оксигенация на хемоглобина – до фал-шивониски. ZPP се използва за диагностика на ранен Fe дефицит. Отношението ZPP/heme и неговото нарастване е ранен индикатор за из-черпване на функционалното Fe и доказва желе-зен дефицит именно в еритроидния костен мозък [24]. Намира и клинично приложение като скри-нингов тест за хронична оловна експозиция (реа-гира обикновено след 3-4 месеца) и еритропое-тична порфирия.

В клиничната практика често се търси пра-вилният отговор на въпроса „налага ли се про-веждане на феротерапия” при анемия с хипофе-ремия? Зададен по друг начин той би звучал така: „за какъв тип анемия се касае всъщност –


истински феродефицит (ЖДА) или за АХЗ?” От-говорът понякога е труден дори за хематолога.

Показателите, използвани за диагностика на ЖДА, включват:

• показатели за скрининг – HGB, mcV, % хипохромни Ер, съдържание на HGB в ретикуло-цити (СНr), сатурация на трансферин, ZPP;

• дефинитивни показатели за Fe депа – феритин; за тъканно Fe – sTfR

Представен по друг начин панелът лабора-торни изследвания изглежда и така [1, 4, 17, 24, 33]:

– показатели с ограничена информативна стойност (ползвани най-често в клиничната прак-тика) – серумни Fe и трансферин; трансферино-ва сатурация

– показатели с доказателствена стойност: серумен феритин; sTfR; sTfR/log феритин; ZPP; хепсидин (!)

АХЗ е изключително важен медицински и со-циален проблем. Правилната диагностика на АХЗ изисква главно лечение на основното забо-ляване. АХЗ е резистентна на еритропоетин или феротерапия, тъй като става въпрос за функци-онален железен дефицит при цитокин-медиирана анемия [4, 15, 36].

На табл. 5 е представено становището ни как би изглеждала съвременната лабораторната диференциална диагноза ЖДА/АХЗ в контекста на нововъведените тестове:

Таблица 5. Възможности за актуална диагноза ЖДА/АХЗ

Показател AХЗ ЖДА

Серумно желязо ↓ ↓

Трансферин ↓/норма ↓

Трансферинова сатурация % ↓ ↓

Феритин норма/↓ ↓

sTfR Норма/↓ ↓

sTfR/log феритин нисък (< 1) висок (> 2)

Хепсидин (начални данни) ↓ ↓

ZPP норма ↓

Заключение Новите познания за биологията на желязото

след откриването на хепсидина провокира както въпроси за съвременната диагностика, така и за модерните терапевтични възможности (напр. агонисти и антагонисти на хепсидина, действащи на ниво рецептопорен механизъм). Хепcидин-базираната диагностика и терапия вероятно ще играят ключова роля в контрола на анемията в областта на онкологията и при много хронични заболявания с възпалителна и автоимунна етио-логия.

БИБЛИОГРАФИЯ 1. А т а н а с о в , Н. и А. Атанасов. Желязо в човешки се-

рум и „железен статус” са две различни неща. В: Атана-сов Н, Атанасов А. Към рационалното лабораторно изс-ледване. Пловдив, ЕТ ”В. Петров”– ВАП, 2001, 39-52.

2. A h l u w a l i a , N. Field-Level Calibration of a Method for Assessing Iron Deficiency by Ferritin Analysis in Dried Serum Spots (DSS) on Filter Paper in Population Surveys. University Park, USA, Pennsylvania State University USA 2001

3. A l l e n , J. at all. Measurement of solubile transferring receptor in serum of healthy adults. – Clin. Chem., 44, 1998, 35-39.

4. А n d r e w s , N. Forging a field: the golden age of iron bi-ology. – Blood, 112, 2008, № 2, 219-230.

5. B e r g a m a s c h i , G. et L. Villani. Serum hepcidin: a novel diagnostic tool in disorders of iron metabolism. – Haema-tologica, 94, 2009, № 12, 1631-1633.

6. B h a s k a r a m , P. et al. Serum Transferrin Receptor in Children With Respiratory Infections. – Eur. J. Clin. Nutr., 57, 2003, № 1, 75-80.

7. B r u g h a r a , C. et P. Beris. Iron therapy. – In: Disorders of erythropoiesis, erythrocytes and iron metabolism.– The Handbook of ESH, 2009, 513-528.

8. D a l l a l i o , G., T. Fleury et R. Means. Serum hepcidin in clinical specimens. – Br. J. Haematology, 122, 2003, 996-1000.

9. D e i c h e r , R. et W. Hörl. New insights into the regulation of iron homeostasis. – Eur. J. Clin. Investigation, 36, 2006, 301-309.

10. D e l a b y , C., J. Deybach et C. Beaumont. L’hepcidine et le métabolisme du fer. Hepcidin and iron metabolism. 2007 Elsevier Masson SAS, 28, 2007, 510-512.

11. D u , X. et al. Novel Mechanism of Regulaton of Hepcidin and Iron Homeostasis. – The Hematologist, 5, 2008, № 5, 1.

12. G a n z , T. et al. Immunoassay for human serum hepcidin. – Blood, 112, 2008, № 10, 4292-4297.

13. G r o t t o , H. Anaemia of cancer: an overview of mecha-nisms involved in its pathogenesis. – Med. Oncol., 25, 2008, 12-21.

14. H e p c i d i n prohormone ELISA (RE54051). Instruction for use, 2007.

15. H e r s h k o , C. et al. Mechanisms of iron regulation and of iron deficiency. European Hematology Association 2007, Education Book –Hematology, 1-8.

16. H u m a n sTfR ELISA (RD194011100). Product data sheet, v.08 010808 15.

17. Kanamaru, A. Iron deficiency anemia. – Nippon Rinsho, 66, 2008, № 3, 499-504.

18. K e m n a , E. et al. Mass spectrometry-based Hepcidin Measurements in Serum and Urine: analytical aspects and clinical implications. – Clin. Chem., 53, 2007, № 4, 620-628.

19. K e m n a , E. et al. Hepcidin: from discovery to defferential diagnosis. – Haematologica, 93, 2008, 90-97.

20. K r a t o v i l , T. et al. Age specific reference intervals for soluble transferrin receptor (sTfR). – Clin. Chimica Acta, 380, 2007, № 1-2, 222-224.

21. K r o o t , J. et al. Results of the first international round robin for the quantification of urinary and plasma hepcidin assays: need for standardization. – Haematologica, 94, 2009, № 12, 1748-1752.

22. L a b b e , R., A. Dewanji et K. McLaughlin. Observations on the zinc protoporphyrin/heme ratio in whole blood. – Clin. Chem., 45, 1999, 146-148.

23. M a l o p e , B. et al. The ratio of serum transferrin receptor and serum ferritin in the diagnosis of iron status. – Brit. J. Haematology, 115, 2001, № 1, 84-89.

24. M e i , Z. et al. Erythrocyte protoporphyrin or hemoglobin: which is a better screening test for iron deficiency in children


and women?" – Am. J. Clin. Nutr., 77, 2003, № 5, 1229-1233.

25. M i l l o t , S., L. Falco et C. Beaumont. Iron and erythro-poiesis. – In: Disorders of erythro-poiesis, erythrocytes and iron metabolism. The Handbook of ESH 2009: 469-86.

26. N e m e t h , E. Iron regulation and erythropoiesis. – Current Opinion in Hematology, 15, 2008, 169-175.

27. N e m e t h , E. et T. GanzT. Hepcidin and iron-loading anemias. – Haematologica, 91, 2006, № 6, 727-730.

28. O l b i n a , G. et al. Immunoassay for Human Hepcidin in Blood. – ASH Annual Meeting, 112, 2008, № 11, Abstract 3839, page 131.

29. P f e i f f e r , Ch. et al. Evaluation of an automated soluble transferrin receptor (sTfR) assay on the Roche Hitachi analyzer and its comparison to two ELISA assays. – Clin. Chimica Acta, 382, 2007, № 1-2, 112-116.

30. R a y a , G. et al. Soluble transferring receptor (sTfR): biological variations and reference limits. – Clin. Chem. Lab. Med., 39, 2001, 1162-1168.

31. R o h , Y., et. al. Zinc Protoporphyrin IX Concentrations between Normal Adults and the Lead-Exposed Workers Measured by HPLC, Spectrofluorometer, and Hematofluo-rometer. – Industrial Health, 38, 2000, 372-379.

32. S w i n k e l s , W. et R. Fleming. Hepcidin as a potential new biomarker for disorders of iron metabolism. – Haematology, 2, 2009, 28-31.

33. T h e u r l , I. et al. Regulation of iron homeostasis in anemia of chronic disease and iron deficiency anemia: diagnostic and therapeutic implications. – Blood, 113, 2009, № 21, 5277-5286.

34. W a r d , D. et al. Increased hepcidin expression in colorectal carcinogenesis. – World J. Gastroenterol., 14, 2008, № 9, 1339-1345.

35. W e i s s , G. Pathophysiology, diagnosis and treatment of the anemia of chronic disease.Eropean Hematology Associaiton 2007, Education Book-Hematology, 9-17.

36. W i a n s , F. et al. Discriminating Between Iron Deficiency Anemia and Anemia of Chronic Disease Using Traditional Indices of Iron Status vs Transferrin Receptor Concentration. – Am. J. Clin. Pathol., 115, 2001, № 1, 112-118.

37. Q u e s t Diagnostics. Test Menus: Zinc Protoporphyrin (online information, accessed October 2007). аvailable online.

Адрес за кореспонденция: Ж. Грудева-Попова Клиника по онкология и хематология УМБАЛ “Св. Георги” Пловдив


СРАВНИТЕЛНО ИЗСЛЕДВАНЕ НА РЕЗИДУАЛНИ ЛЕВКЕМИЧНИ БЛАСТИ ЧРЕЗ ФЛОУЦИТОМЕТРИЯ И RT-PCR ПРИ БОЛНИ С ОСТРИ ЛЕВКЕМИИ М. Генова1, Г. Балаценко2, Б. Спасов3, Н. Стоянов1, П. Ганева3 и Г. Михайлов3

1Лаборатория по хематопатология и имунология 2Лаборатория по цитогенетика и молекулярна биология, 3Клиника по хематология


COMPARATIVE STUDY OF MINIMAL RESIDUAL DISEASE IN PATIENTS WITH ACUTE LEUKEMIA USING FLOW CYTOMETRY AND REVERSE TRANSCRIPTASE

POLYMERASE CHAIN REACTION M. Guenova1, G. Balatzenko2, B. Spassov3, N. Stoyanov1, P. Ganeva3 and G. Michailov3

1Laboratory of Hematopathology and Immunology, 2Laboratory of Cytogenetics and Molecular Biology, 3Hematology Clinic

National Specialised Hospital for Active Treatment of Haematological Diseases – Sofia

Резюме. Основните методи, използвани за оценка на минималната резидуална болест (МРБ) при ос-три левкемии (ОЛ), са имунофенотипният анализ и полимеразно-верижната реакция (PCR). В насто-ящото едноцентрово проучване сравнихме резултатите от изследване на МРБ чрез ≥ 6-цветна флоуцитометрия (ФЦМ) и високо-чувствителен RT-PCR (nested или количествен в реално време) при 22-ма болни с ОЛ. Използвахме следните критерии за дефиниране на положителна МРБ при изслед-ването: 1) установяване на аберантен маркер – левкемично асоциирана имунофенотипна констела-ция при флоуцитометричното изследване и аберантен молекулярен маркер при PCR; 2) идентифи-циране на нива на аберантния маркер > 1 x 10–3. ФЦМ установи наличие на 0 до 8,8 x 10-2 левкемични бласти (средно 7,2 x 10-3 ± 4 x 10-4) и резултатът беше оценен като положителен при 9 болни. RT-PCR даде положителен резултат в 9 от случаите, установи ниски нива на транскпипти < 1 x 10-3 – в 7, а в 3 случая не показа наличие на аберантен маркер. Резултатите ни показаха добра степен на съответствие между ФЦМ и RT-PCR, освен в 6 случая, при които само една от двете техники уста-нови положителен резултат. В заключение, използването на тандема от двата метода винаги, ко-гато това е възможно, позволява подобряване на мониторирането на болните с ОЛ.

Ключови думи:

Summary. Two main techniques are being used for the detection of minimal residual disease (MRD) in acute leukemia (AL): immunophenotypic analysis and polymerase chain reaction (PCR). In this paper, we compara-tively analyzed the results of assessing MRD by means of ≥ 6-colour flow cytometry (FC) and high sensitive RT-PCR (nested or quantitative real time) in a group of 22 patients with AL in a single institution. The samples were considered positive for MRD when two conditions were met: 1) detection of an aberrant leukemia-associated immunophenotypic combination and molecular marker, and 2) presence of > 1 x 10-3 cells or transcripts. FC de-tected 0 up to 8,8 x 10-2 blasts (mean 7,2 x 10-3 ± 4 x 10-4) and was positive in 9 cases. RT-PCR was positive in 9 cases, detected low levels of transcripts < 1 x 10-3 in 7 cases and was completely negative in 3 cases. Our re-sults showed a good correlation between FC and RT-PCR but in 6 samples that were positive using only one of both techniques. We conclude that immunologic and molecular techniques can be used in tandem to improve monitoring of MRD in AL.

Key words: minimal residual diseas, acut leukemia, diadnosis

М. Генова, Г. Балаценко, Б. Спасов... Сравнително изследване на резидуални... 56

Използваните рутинно в клиничната практика класически морфологични (светлинно-микро-скопски) подходи очаквано установяват наличие-то на средно 2% бластни клетки по време на ремисияq без да е възможно отграничаването на левкемични бласти от нормалните регениращи прекурсори. Основните методи, използвани за прецизиране на параметрите на ремисията, са многопараметърна флоуцитометрия и полиме-разно верижна реакция (PCR), които се характе-ризират с по-висока чувствителност – 10-4÷10-5. Основното ограничение на приложението на флоуцитометрията за изследване на минимална резидуална болест (МРБ) е отсъствието на от-четлив асоцииран с малигнено заболяване фе-нотип. Друго ограничение е, че имунофенотипът на малигнените клетки може да претърпи промя-на в хода на заболяването. Ако тези промени засегнат маркери, които се използват за монито-риране на МРБ, може да получат фалшивоотри-цателни резултати (Oelschlagel и сътр., 2000; Baer и сътр., 2001; А. Al-Mawali, 2009). От друга страна, изборът на най-подходящ PCR метод за всяка една клинична ситуация зависи от биоло-гията на съответното малигнено заболяване и от наличието на специфичен маркер, което да поз-воли идентифицирането на малигнените клетки: фузионни транскрипти при хромозомни анома-лии или експресия на аберантни гени или абе-рантно експресирани нормални гени (свръхексп-ресия на транскрипти от мутирали или нормални гени) (Van der Velden и сътр., 2003; M. Bene и сътр, 2009). Така всяка една от техниките за мо-ниториране на МРБ има своите предимства и ограничения и следва внимателно да бъде оце-нена за най-правилното º използване при взема-не на клинични решения.

Материали и методи При общо 22-ма болни с остри левкемии (13

с остри миелоидни левкемии [ОМЛ], 7 с В-остри лимфобластни левкемии [ОЛЛ] и по 1 с Т-ОЛЛ и остра бифенотипна левкемия [ОБЛ]), след про-ведено лечение и морфологични данни от изс-ледването на костномозъчен материал, съответ-стващи на ремисия, беше проведен сравнителен анализ на резултатите, получени от изследване на МРБ в костния мозък чрез моногопараметър-на ≥ 6-цветна флоуцитометрия и високочувстви-телни PCR подходи, основаващи се на ампли-фикация на продукти на обратна транскрипция (RT) – двуетапен nested PCR или количествен Q-RT-PCR в реално време в едни и същи времеви точки от наблюдението на пациентите.

За провеждане на флоуцитометричен ана-лиз, след директна еритроцитна лиза, материали

от костномозъчни аспирати бяха маркирани с моноклонални антитела, конюгирани с флуорох-роми съгласно инстукциите на производителя. Използван беше широк панел от анти лимфоид-ни, анти миелоидни и линейно неспецифични моноклонални антитела: CD1aFITC, CD2PE, CD3PerCP, CD4APC-Cy7, CD5PE, CD7FITC, CD8PE, CD10APC, CD11bAPC, CD13PE, CD14FITC, CD15FITC, CD16PE-Cy7, CD19APC-Cy7, CD20PE, CD22FITC, CD33PE-Cy7, CD34PerCP, CD38FITC, CD45AmCyan, CD56APC, CD64PE, CD79bFITC, CD117APC (Becton Dickinson, BD). Приемането и анализът на кли-ничните проби се осъществи на 10-параметърен флоуцитометър с 3 светлинни източника – FACSCanto II (Becton Dickinson). За всяка епру-ветка бяха записвани данните за светлинното разсейване, отразяващи размера (FSC) и грану-лираността (SSC) на изследваните клетки, както и за интензитета на излъчваната флуоресценция (FL-1 , FL-2, FL-3, FL-4, FL-5, FL-6, FL-7, FL-8) при преминаването през флуидната камера на апа-рата. Набирана беше информация за не по-малко от 1-2.104 клетки към момента на диагно-зата и 2,5-5.105 по време на ремисия, като беше използван програмният продукт за приемане и анализ на пробите FACS-DIVA (B.D.).

За молекулярен анализ беше изследвана то-тална РНК, екстрахирана от ядроносни клетки от костен мозък с Trizol Reagent (Invitrogen) или с колони NucleoSpin RNA II kit (Мachery-Nagel), в случаите, когато изолираните ядроносни клетки са относително малко, съобразно указанията на производителя. Така получената РНК беше из-ползвана като матрица за синтез на комплемен-тарна ДНК (кДНК) съобразно препоръките на Европейската програма BIOMED-1 (Van Dongen и сътр., 1998). Kачеството на изолираната РНК и ефективността на обратната транскрипция бяха контролирани чрез амплификация на b-actin с теpмосайклъp RotorGene 6000 (Corbett Research).

За изследване на фузионни транскрипти, както към момента на диагнозата, така и при проследяване на МРБ, беше използван унифи-циран протокол и праймери, препоръчани от Eвропейската програма за стандартизиран RT-PCR анализ на фузионни транскрипти за изслед-ване на минималната резидуална болест при остри левкемии BIOMED-1 Concerted Action (Van Dongen и сътр., 1999). За оценка на МРБ чрез качествена RT-PCR беше използвана следната скала: силно положителна реакция при едное-тапна PCR (10-100% разреждане на съответната положителна контрола); слабо положителна ре-акция при едноетапна PCR (≈ 1-10% разреждане на положителната контрола); отрицателен ре-


зултат при едноетапна PCR, силна реакция при двуетапна (≈ 0,1-0,01% разреждане на положи-телната контрола); отрицателен резултат при едноетапна PCR, слабо положителна реакция след реамплификация (≤ 0,01% разреждане на положителната контрола); отсъствие на продукт на PCR, включително и след реамплификация (0%).

Количественото характеризиране на броя на фузионните транскрипти в част от пробите беше извършено в съответствие с препоръките на Европейската програма за стандартизиране на изследванията на фузионните транскрипти чрез количествена RT-PCR в реално време при лев-кемии – Europe Against Cancer program (Gabert и сътр., 2003). Като реакционна среда за количес-твена PCR беше използван Taqman Mix и Taq полимераза (Bioer). За амплификацията беше използван RotorGene 6000 (Corbett Research). Резултатите бяха представени като съотноше-ние на фузионните транскрипти/контролните транскрипти х 100 (%), спазвайки препоръките на производителя. При част от маркерите (WT1) беше използвана количествена PCR, основава-ща се на използването на QPCR SYBR® Green (ABgene) и RotorGene 6000 (Corbett Research). Като положителна контрола бяха използвани серийни десетични разреждания на РНК, екстра-хирана от клетъчна линия K562.

Резултати При всички 22-ма болни беше проведено по-

не едно флоуцитометрично изследване за конт-рол на МРБ в хода на лечението (средно 3, от 1 до 10). За всеки един от тях към момента на ди-агнозата беше определен така нареченият “лев-кемичен имунофенотипен отпечатък” (“leukemia immunophenotypic fingerprint”) на базата на уни-калните левкемичноасоциирани фенотипни конс-телации: кръстосано-линейна експресия на нати-гени, асоциирани с миелоидна, В-клетъчна и/или Т-клетъчна линия на диференциация (n = 12), асинхронна експресия на антигени, свързани с ранни и късни етапи на съзряване и диференциа-ция (n = 15); ектопична антигенна експресия (n = 2). Изключение правят двама болни – ”№ 15”, при който не беше установена аберантна имунофе-нотипна констелация, отграничаваща левкемич-ни и нормално регенериращи бласти, и ”№ 8”, на-сочен от друго лечебно заведение след започна-то лечение и без данни за изходния фенотип.

При същите 22-ма болни беше проведен мо-лекулярен анализ на МРБ на базата на предва-рително установени аберантни маркери в две основни категории, както следва: първата кате-гория маркери включваше специфични молеку-лярни аномалии, които не се срещат в нормал-

ните клетки или имат много ниско фоново ниво в организма, каквито са фузионните транскрипти – М-BCR-ABL (n = 2-ма болни), PML-RARA (n = 1), AML1-ETO (n = 2), CBFb-MYH11 (n = 5), пренареж-дания на MLL гена – MLL-AF4 и MLL-ELL (n = 3), SIL-TAL1 (n = 1); втората група маркери включ-ваше аберантно експресирани гени WT1 (n = 5), EVI1 (n = 2) и наличие на FLT3-ITD (n = 2).

За сравнителния анализ бяха избрани вре-меви точки, в които са проведени и двете изс-ледвания върху един и същи клиничен материал от костномозъчен аспират. Данните за включе-ните в проучването пациенти и получените ре-зултати са представени в табл. 1.

Флоуцитометричният анализ установи рези-дуални левкемични бласти, чието количество варираше от 0 до 8,8.10-2 от общия клетъчен състав (средна стойност – 7,2.10-3 ± 4.10-4). Мо-лекулярният анализ на фузионни или аберантно експресирани гени показа липса на доловими транскрипти при 7 от изследваните болни, много ниски нива от 1.10-4 ÷ 1.10-3 (n=5), нива от 1.10-3 ÷ 1.10-2 (n = 6), а при 3-ма болни експресията беше ясно установима на високи нива над 1.10-2. Сравнителният анализ на получените данни по-каза добра корелация между двата метода (Pearson Chi-Square, p = 0.041) (табл. 2). При 10 от болните и двата метода установиха липсващи или ниски нива < 1.10-3 на резидуална болест в изследвания материал, а при 6 и двата методоло-гични подхода доказаха по-високи от тези нива.

Несъответствие между получените резултати беше намерено в 6 от случаите. При 3-ма болни, при които флоуцитометричното изследване даде стойности над 1.10-3, молекулярният анализ не установи наличие на търсените аберантни марке-ри, както следва: (i) болен „№ 15” е случай, при който изходното изследване не е установило абе-рантна „левкемичноасоциирана” имунофенотипна констелация и проследяването чрез флоуцитомет-рия беше в състояние да определи количествено броя на миелоидните бласти, без да може да разг-раничи левкемичната популация от нормално ре-генериращите миелоидни прекурсори, което е ве-роятно причина за „фалшивоположителен” резул-тат; (ii) стойностите за резидуалните бласти от флоуцитометричното изследване на болен „№ 18” от 1,1.10-3 (0,11%) бяха гранични за прецен-ка; (iii) изследванията при болен „№ 22” бяха извършени непосредствено след провеждане на първи индукционен курс по повод на първи ре-цидив, при пациента няма специфичен молекуля-рен биомаркер за мониториране, а използваният за тази цел универсален маркер WT1 няма устано-вено изходно ниво на експресия при конкретния болен, на което може да се дължи „фалшивоот-рицателния” резултат при проследяването.


Таблица 1. Сравнителни данни от изследване на резидуална болест при болни с остра левкемия в ремисия чрез многопа-раметърна флоуцитометрия и PCR.

Флоуцитометрия PCR № Болен Год. Диагноза

Аберантен фенотип Бласти % Молекулярен маркер

Тип реакция Количество

1 ЛБЦ 47 ОМЛ с t(8;21) CD34+CD56+ 0,06% AML1-ETO качествен nested PCR < 0,1%

2 ЛМП 42 ОМЛ с t(8;21) CD34+CD56+ 0,10% AML-ETO качествен nested PCR > 1%

3 БМД 29 ОМЛ с inv16 CD15+CD34+CD117+ 0,04% CBFb-MYH11 качествен nested PCR < 0,1%

4 БМД 29 ОМЛ с inv16 CD15+CD34+CD117+ CD14+CD2+45low

0,46% 0,64% CBFb-MYH11 качествен

nested PCR 0,1-1%

5 ДОЙ 23 вторична ОМЛ

CD34+CD56+ CD34+CD15+

0,10% 0,08% CBFb-MYH11 качествен

nested PCR <0,1%

6 КИУ 34 ОМЛ с inv16 CD34+CD15+ 0,26% CBFb-MYH11 качествен nested PCR 0,1-1%

7 СГВ 38 ОМЛ с inv16 CD117+CD34+ 0,21% CBFb-MYH11 качествен nested PCR 0,1-1%

8 ЖАС 53 В-ОЛЛ CD34+CD22+ 0,02% EVI1 качествен 1-етапен

PCR 0,1-1%

9 ЛМК 53 В-ОЛЛ CD34+CD13+CD19+ CD22+ 8,80% EVI1

качествен 1-етапен

PCR >1%

10 СГК 54 ОМЛ-M1 CD33+CD7+ 0,00% FLT3-ITD качествен 1-етапен

PCR 0%

11 АИЙ 22 В-ОЛЛ CD34± CD19+CD10+CD33+ 0.07% M-BCR-ABL Q-RT-PCR 0,10%

12 ЙВК 33 В-ОЛЛ CD19+CD34+CD10+ CD13+CD20± 0,01% M-BCR-ABL Q-RT-PCR 0,02%

13 ЛАС 76 Бифенотипна ОЛ

CD34+CD15+ CD34+CD15+CD19+

0,09% 0,06% MLL-AF4


PCR > 1%

14 РПЙ 63 В-ОЛЛ CD34+CD22+CD33+ CD13+ 0,02% MLL-AF4


PCR < 0,1%

15 ИМП 21 ОМЛ с MLL CD33+CD13+CD34+* 1,49% MLL-ELL качествен nested PCR 0%

16 НКА 37 ОПЛ CD34+CD15+ 0,02% PML-RARA качествен nested PCR 0%

17 СДП 53 Т-ОЛЛ CD5+CD3-TCR- cyCD3+CD4+CD8+

0,20% 0,04% SIL-TAL1 качествен

nested PCR 0,1-1%

18 ВГК 52 В-ОЛЛ CD34+CD10+CD19+ CD13+ 0,11% WT1 Q-RT-PCR 0%

19 ВИМ 52 ОМЛ-M0 CD33+CD7+CD56+ CD117+ 0,02% WT1 Q-RT-PCR 0%

20 ДДВ 38 ОМЛ-M4 CD13+CD33+CD117+CD4+CD19+/- 0,01% FLT3-ITD, WT1 Q-RT-PCR 0.01%

21 ЖИВ 56 ОМЛ-M1 CD33+CD7+ CD117+CD15+

0,10% 0,02% WT1 Q-RT-PCR 0%

22 МБК 28 В-ОЛЛ CD34+CD22+CD13+/- 0,28% WT1 Q-RT-PCR 0%


Фиг. 1. Флоуцитометричен анализ на минимална резидуална болест чрез 6-цветно имуномаркиране. Идентифициране на 10-4 резидуални бласти с аберантен фенотип CD45lowCD19+CD22+CD10+CD13+CD33+

Фиг. 2. Определяне на количеството на фузионните BCR-ABL и нормалните ABL транскрипти при болен „№ 12” чрез стандарни криви на серийните разреждания на съответните положителни стандарти при амплификация чрез количест-вена Real-Time PCR

Таблица 2. Корелация между резултатите от флоуцито-метрично и PCR изследване на резидуална болест при болни с остри левкемии в ремисия

RT-PCR за МРБ Флоуцитометрично изследване на МРБ 0-0,1% >0,1%

Общо

0-0,1% 10 3 13

> 0,1% 3 6 9

Общо 13 9 22

Pearson Chi-Square P = 0,041 От друга страна, при 3-ма болни, независимо

от ясно установимите чрез молекулярен анализ нива на резидуална болест, флоуцитометрично-то изследване не можа да идентифицира съот-ветните нива на левкемични бластни клетки в изследвания материал: (i) при болен ”№ 8”, на-сочен от друго лечебно заведение след започна-то лечение, поради липса на данни за изходния фенотип флоуцитометричното изследване беше проведено, като са използвани най-чести и зна-чими според опита и литературните данни анти-генни констелации, които очевидно не успяват

да идентифицират конкретната левкемична по-пулация; (ii) интерес представляват находките при болните ”№ 2” и ”№ 13”, при които 2 месеца след проведеното изследване за МРБ настъпи изявен клиничен рецидив.

Обсъждане и изводи Изследванията на минимална или субмик-

роскопска резидуална болест при болните с ост-ри левкемии притежават сериозен потенциал за подобряване на клиничните резултати при тези пациенти чрез прецизиране оценката на резиду-алния туморен обем и избор на индивидуалноа-даптирани терапевтични подходи (Bassan и сътр., 2009). Основните техники, използвани за по-добра оценка на отговора към проведената терапия в сравнение с конвенционалните свет-линно-микроскопски методи, са имунофенотип-ният анализ и молекулярните методи, които по-настоящем дават най-висока чувствителност и възпроизводимост на изследванията. Независи-мо от предимствата си, и двата методични под-хода не са лишени от проблеми и ограничения.


Основните проблеми са свързани с необхо-димостта от наличие на левкемичноасоциирани маркери и/или комбинации от маркери, които да отграничават надеждно левкемични и нормални бластни клетки. В допълнение, клонална еволю-ция по време на и след проведеното лечение, което може да доведе до загуба на един или повече биомаркери, установени към диагнозата. От друга страна, неравномерното разпределе-ние на левкемичните клетки по време на реми-сия, както и техническото осъществяване на изследването, може да доведе до вариации меж-ду отделни клинични проби, необходима е екс-пертна квалификация и т.н. Затова си поставих-ме за цел в условията на едноцентрово проучва-не да съпоставим резултатите от изследване на едни и същи проби от костномозъчни аспирати на пациенти с остри левкемии при постигане на морфологична ремисия чрез многопараметърна ≥ 6-цветна флоуцитометрия и RT-PCR.

Използвахме следните критерии за дефини-ране на минималната резидуална болест при изс-ледването: (i) установяване на аберантен маркер – аберантна левкемично-асоциирана имунофенотип-на констелация при флоуцитометричното из-следване и аберантен молекулярен маркер при PCR; (ii) идентифициране на нива на аберантния маркер > 1 x 10-3. Това ни позволи възпроизводи-мост и сравнимост при двата метода.

Анализът на данните показа, че на практика при всички изследвани пациенти флоуцитомет-ричното изследване идентифицира резидуални клетки с търсения фенотип, като при 13/22 от тях нивата са под 1 x 10-3. Тези резултати са в съот-ветствие и с данни на други автори и отразяват невъзможността на индукционната химиотера-пия да елиминира напълно неопластичния клон, като подкрепят концепцията, че съвременните стандарти за оценка на терапевтичния отговор включват само документиране на факта, че за-боляването е значително редуцирано до нива, достатъчни за осигуряване на нормализирането на костномозъчните функции (Paietta, 2002; San Miguel и сътр., 2001; Langebrake и сътр., 2006; Voskova и сътр., 2007). Съпоставени бяха резул-татите от клиничните проби с < 1 x 10-3 резиду-ални левкемични клетки, идентифицирани на базата на имунофенотипните характеристики, с тези от изследването на молекулярни маркери. Установена беше добра корелация на флоуци-тометричните данни с молекулярното изследва-не, което показа нулеви или ниски <1x10-3 нива на аберантните транскриmти също при 10 от 13-те проби. Подобна степен на съответствие се съобщава и в други подобни проучвания. При сравнение на резултатите от изследване на МРБ

в проучване на Ruiz-Argüelles и сътр., 2007, в 10% от клинични проби на болни с остри левке-мии в ремисия RT-PCR за BCR/ABL, TEL-AML1, PML-RARa, AML1-ETO или CBFb-SMMH с чувст-вителност 1×10-4 се позитивира при липсваща МРБ чрез 4-5-цветна флоуцитометрия. За разли-ка от нашите резултати, в нито един от случаите не е наблюдавана позитивна флоуцитометрична находка при негативен PCR резултат, но същест-вена разлика представлява значително по-ви-сокият възприет от авторите праг за имунофено-типно определените резидуални клетки от 2.10-2. При използване на аналогични на нашето проуч-ване прагови стойности Luz Muñoz и сътр., 2000, установяват 5 дискордантни резултата от 23 проби на болни с BCR-ABL(+) ОЛЛ – 3 случая положителни за МРБ с флоуцитометрия при неустановими BCR-ABL транскрипти, и 2 PCR негативни случая при положително имунофено-типно маркиране. Причините за дискордантност на резултатите могат да бъдат различни. Про-мени, свързани с клонална еволюция на левке-мичната популация в хода на лечението, могат да доведат до фалшивонегативни резултати (Langebrake и сътр. 2005; Béné и сътр., 2009), но от практическа гледна точка, причина може да бъде и липсата на информация за установени към момента на диагнозата аберантни левке-мично-асоциирани биомаркери, както имунофе-нотипни, така и молекулярни (общо три от нашите случаи). При използването на „универсални” мар-кери, какъвто е WT1, независимо от данните за значима корелация между нивата на маркера и риска от рецидиви, трябва да се вземе предвид фактът, че в не по-малко от 10% маркерът не по-казва аберантна свърх-експресия (Østergaard и сътр., 2004).

Интерес представляват случаите, при които на фона на ниски нива на МРБ чрез флоуцито-метрична имунофенотипизация позитивирането на молекулярния маркер е до значими стойности > 1.10-3 ÷ 1.10-2. Една от възможностите би могла да бъде идентифициране на маркера в клетки, които са носители само на първичната генетична аберация без необходимите вторични транс-формиращи събития, данни за каквито случаи има при болни с дълготрайна ремисия на ОМЛ и AML1/ETO или CBFβ/MYH11 фузионни транск-рипти, което се назовава от някои автори като „псевдо-МРБ” (Marcucci и сътр., 2001; Miyamoto и сътр., 2000; Paietta, 2002). Ако обаче тези клетки все пак притежават генетичния потенциал за рецидив на заболяването, идентифицирането на аберантния маркер представлява действителна МРБ с потенциални терапевтични последствия.


Вероятно е рецидивите да се предхождат от значимо покачване на експресията на аберант-ните гени в резидуалната неопластична попула-ция, независимо от липса на динамика в самото количество бластни клетки, изброени чрез свет-линно-микроскопски или имунофенотипни мето-ди. Тази висока експресия може да бъде доло-вена с високочувствителните PCR техники и но-си съществена клинична информация. Обясне-ние може да бъде и установената от някои авто-ри по-висока степен на клетъчно делене в попу-лацията на неопластичните клетки, носещи гене-тичната аберация, което води до значително скъсяване на периода до пълната изява на ре-цидива, така че проведените изследвания за количествено определяне на броя левкемични клетки не могат да установят динамиката на на-растване, освен ако не се скъсят значително интервалите между изследванията (Van Dongen и сътр., 1992). В подкрепа на тази хипотеза са и наши предходни непубликувани наблюдения за настъпване на изявен костномозъчен рецидив с над 30% бластна инфилтрация един месец след провеждане на автоложна трансплантация на хемопоетични стволови клетки, като проведени-те флоуцитометрични изследвания за МРБ са дали негативен резултат както в костномозъчен материал преди кондициониращия режим, така и в приложения аферезен продукт.

В заключение, използването на двата основ-ни метода за контрол на МРБ при болни с остри левкемии като цяло показва висока степен на съответствие независимо от известните вариа-ции в установените нива при някои от изследва-нията. Използването на тандема от двата мето-да винаги, когато това е възможно, позволява мониториране на всички паиценти. С нарастване на чувствителността на използваните методи важен въпрос към по-нататъшните проучвания ще бъде да се дефинира праговата стойност, съвместима с „излекуване”.

Благодарности. Изследването е финансирано

от Национален фонд Научни изследвания (ВУ-Л-318/07). М.Г. и Г.Б. са взели равностойно участие в разработване на проучването и подготовката на ръкописа. Авторите благодарят на екипа на Клини-ка по хематология към СБАЛХЗ-София за предоста-вения клиничен материал, на д-р Велизар Шиваров и д-р Веселка Николова за проведени цитологични и флоуцитометрични анализи, на Пламенка Йотова, Лили Лазарова, Магдалена Костова, Моника Борисо-ва, Любка Янакиева и Цветелина Янкова за техни-ческата подготовка на пробите.

БИБЛИОГРАФИЯ 1. A l - M a w a l i , A., D. Gillis et I. Lewis, The Role of Multi-

parameter Flow Cytometry for Detection of Minimal Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia. – Am. J. Clin. Pathol., 131, 2009, № 1, 16-26.

2. B a e r , M. R. Et al. High frequency of immunophenotype changes in acute myeloid leukemia at relapse: implications for residual disease detection (Cancer and Leukemia Group B Study 8361). – Blood, 97, 2001, 3574-3580.

3. B a s s a n , R. O. et al. Improved risk classification for risk-specific therapy based on the molecular study of minimal re-sidual disease (MRD) in adult acute lymphoblastic leukemia (ALL). – Blood, 113, 2009, 4153-4162.

4. B é n é , M. C. et J. S. Kaeda. How and why minimal residual disease studies are necessary in leukemia: a review from WP10 and WP12 of the European LeukaemiaNet. – Haema-tologica, 94, 2009, 1135-1150.

5. G a b e r t , J. et al. Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia – a Europe Against Cancer program. – Leukemia, 17, 2003, № 12, 2318-2357.

6. L a n g e b r a k e , C. et al. Immunophenotypic differences between diagnosis and relapse in childhood AML: Implica-tions for MRD monitoring. – Cytometry B Clin. Cytom., 63, 2005, № 1, 1-9.

7. L a n g e b r a k e , C. et al. Residual Disease Monitoring in Childhood Acute Myeloid Leukemia by Multiparameter Flow Cytometry: The MRD-AML-BFM Study Group. – J. Clin. On-col., 24, 2006, № 22, 3686-3692.

8. M a r c u c c i , G. et al. Quantification of CBF_/MYH11 fu-sion transcript by real-time RT-PCR in patients with inv(16) acute myeloid leukemia. – Leukemia, 15, 2001, 1072-1080.

9. M i y a m o t o , T., I.L. Weissman et K.Akashi. AML1/ETO-expressing nonleukemic stem cells in acute myelogenous leukemia with 8;21 chromosomal translocation. – Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 2000, 7521-7526.

10. M u ñ o z , L. et al. Combined use of reverse transcriptase polymerase chain reaction and flow cytometry to study minimal residual disease in Philadelphia positive acute lymphoblastic leukemia. – Haematologica, 85, 2000, № 7, 704-710.

11. O e l s c h l a g e l , U. et al. Shift of aberrant antigen expres-sion at relapse or at treatment failure in acute leukemia. – Cytometry, 42, 2000, № 4, 247-253.

12. Ø s t e r g a a r d , M. et al. WT1 gene expression: an excellent tool for monitoring minimal residual disease in 70% of acute myeloid leukaemia patients - results from a single-centre study. – Br. J. Haematol., 125, 2004, № 5, 590-600.

13. P a i e t t a , E. Assessing minimal residual disease (MRD) in leukemia: a changing definition and concept? – Bone Mar-row Transplant., 29, 2002, № 6, 459-465.

14. R u i z - A r g ü e l l e s , G. J. et al. Minimal residual disease testing in acute leukemia by flow cytometry immunophe-notyping: prognostic significance. – Lab. Hematol., 13, 2007, № 1, 22-26.

15. S a n M i g u e l , J. F. et al. Early immunophenotypical evaluation of minimal residual disease in acute myeloid leu-kemia identifies different patient risk groups and may con-tribute to postinduction treatment stratification. – Blood, 98, 2001, 1746-1751.


16. V a n d e r V e l d e n , V. H. et al. Detection of minimal re-sidual disease in hematologic malignancies by real-time quantitative PCR: principles, approaches, and laboratory aspects. – Leukemia, 17, 2003, № 6, 1013-1034.

17. V a n D o n g e n , J. J. et al. Detection of minimal residual disease in acute leukemia by immunological marker analysis and polymerase chain reaction. – Leukemia, 6, 1992, (Suppl. 1), 47-59.


19. V a n D o n g e n , J. J. et al. Prognostic value of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukaemia in child-hood. – Lancet, 352, 1998, (9142), 1731-1738.

20. V o s k o v a , D. et al. Use of five-color staining improves the sensitivity of multiparameter flow cytomeric assessment of minimal residual disease in patients with acute myeloid leu-kemia. – Leuk Lymphoma, 48, 2007, № 1, 80-88.

Адрес за кореспонденция: Маргарита Генова Лаборатория по хематопатология и имунология Национална специализирана болница за активно лече-ние на хематологични заболявания ул. ”Пловдивско поле” № 6 1756 София

+35929701107 e-mail: [email protected]


РЕТРОСПЕКТИВЕН АНАЛИЗ НА ТЕРАПЕВТИЧНИТЕ РЕЗУЛТАТИ ПРИ ПАЦИЕНТИ С ОСТРА МИЕЛОИДНА ЛЕВКЕМИЯ В КЛИНИКА ПО ХЕМАТОЛОГИЯ – ВАРНА

Л. Герчева, А. Желязкова, Вл. Геров, Х. Върбанов, Р. Рачев, И. Мичева и Н. Ставрев Клиника по хематология, УМБАЛ “Св. Марина” – Варна

RETROSPECTIVE ANALYSIS OF THERAPEUTIC RESULTS IN PATIENTS WITH ACUTE MYELOID LEUKEMIA IN THE CLINIC OF HEMATOLOGY – VARNA L. Gercheva, A. Zhelyazkov, Vl. Gergov, H. Varbanov, R. Rachev, I. Mincheva, N. Stavrev

Clinic of Haematology, UMHAT “Sv. Marina” – Varna

Резюме. Цел на настоящата работа е проучване ефктивността на използваните терапевтични режими при пациенти с остри миелоидни левкемии (ОМЛ). Анализирани са общо 227 болни с ОМЛ, ди-агностицирани и лекувани в Хематологична клиника – Варна, за 10-годишен период. Пациентите са разпределени в две възрастови групи: ≤ 60 и ≥ 61 години, класифицирани според FAB и/или СЗО (2008) системите. Прилагани са рутинни терапевтични режими, определяни според степените на риск. За статистическия анализ е използван SPSS software v.15 за Windows. От общо 147 пациенти, премина-ли индукционен режим, ранна смъртност е регистрирана при 30.6%. Постигната е ремисия при 52% (60.3% в първата възрастова група и 35% във втората). Общата преживяемост (OS) е 25.5 ± 4 месеца за всички пациенти. Средната продължителност на първата ремисия при пациенти < 60 г. (N = 41) е 21.7 ± 5.3 месеца, а при болни > 61 г. (N = 12) 12.7 ± 4.5 месеца. Получените резултати по отношение на постигане на пълна ремисия при пациенти под 61 години са съпоставими с тези в достъпната лите-ратура, но ремисията е с двойно по-кратка продължителност. Данните от настоящия анализ нала-гат два важни извода: необходимост от ранно включване на интензифицирани терапевтични режими и осъществяване на стволовоклетъчна трансплантация при предварително определен висок риск още при първата постигната ремисия.

Ключови думи: остра миелоидна левкемия, лечение, прогностични фактори

Summary. The present study aimed at investigation of the efficacy of the therapeutic regimens used in patients with acute myeloid leukaemia (AML). A total of 227 patients with AML, diagnosed and treated in the clinic of Hematology – Varna, in 10-year period, are analyzed. The age distribution is as follows: ≤ 60 and ≥ 61 years, routinely classified according to the FAB and/or WHO 2008 systems. Standard regimens are used in accordance with the defined risk. SPSS software v.15 is applied for the statistics. Early death is registered in 30.5% of the patients who have conducted an induction treatment (N = 147). The overall remission rate is 52% (60.3% for the younger and 35% for the elderly). The mean overall survival (OS) is 25.5 ± 4 months in both groups. The relapse free-survival on first remission (RFS) in patients < 61 (N = 41) is 21.7 ± 5.3months, respectively 12.7 ± 4.5 months in the elderly (N = 12). Concerning the remission rate, our results are compatible with other studies, but the RFS and OS account for nearly twice shorter period. Two main conclusions come on to discussion: the necessity of early introduction of more intensified therapies as well as the appliance of the stem cell transplantation on first remission in the patients at high risk of relapse.

Key words: acute myeloid leukemia, treatment, prognostic factors

Увод ОМЛ е най-честият тип остра левкемия при

възрастните, със заболsемост 2.5-3/100 000 го-дишно. Медианната възраст при поставяне на диагнозата е 64 год. [1]. С навлизането на нови,

прецизни диагностични методи в рутинната практика познанията за ОМЛ се обогатиха. Ста-рата FAB класификация стана малка част от по-нова класификационна система, базираща се на клинични, морфологични, генетични и молеку-

Л. Герчева, А. Желязкова, Вл. Геров... Ретроспективен анализ на терапевтичните... 64

лярно-биологични промени в левкемичните клет-ки. WHO класификацията (ревизия – 2008) [1] разделя ОМЛ на 4 групи:

1. ОМЛ с повтарящи се генетични нарушения ~ 14% от всички ОМЛ (без М3).

2. ОМЛ с миелодиспластични нарушения ~ 24-35% от всички случаи на ОМЛ.

3. ОМЛ, свързана с предходна цитотоксична терапия ОМЛ ~ 10-15%.

4. ОМЛ, некласифицирана другаде ~ 20-35%. С развитие на познанията за ОМЛ стана ясно,

че изходът от индукционното лечение на ОМЛ зависи освен от клиничното състояние на пациента още от редица показатели, които се използват за определяне на различните рискови групи при за-боляването. Стратификацията на риска при паци-ентите с ОМЛ има следните клинични цели:

1. В краткосрочен план: – определяне на групи с повишен риск от

ранна смърност (Short Term Mortality); – избор на терапевтична стратегия: прила-

гане на стандартна индукция или на нискодозова химиотерапия.

2. В дългосрочен план (Long-term cure rate): – предиктивност по отношение на постигане

на ремисия; – резистентност към химиотерапия; – предиктивност по отношение на цялостна-

та преживяемост (OS); – продължителност на ремисията (RFS); – навременно включване в трансплантаци-

онна програма. Натрупаните данни за ролята на цитогене-

тичните промени в протичането на ОМЛ и отго-вора към проведеното лечение дадоха основа-ние за изграждане на MRC-UK (Medical Research Council – United Kingdom) класификация [2, 3, 4]. Тя се базира изцяло на определянето на цитоге-нетични рискови групи, които са от значение предимно в дългосрочна перспектива: постигане на пълен отговор (CR), OS, преживяемост без съ-бития (EFS), преживяемост без заболяване (DFS). MRC класификацията определя 3 рискови групи:

1. Благоприятна рискова група: inv [16], t(8;21), t(15;17) – установява се при около 10% от случаите.

2. Междинна рискова група – нормален карио-тип, +8, +21, +22, del(7q), del(9q), 11q23, комплек-сен кариотип с < 5 цитогенетични нарушения – обхваща 50-60% от случаите

3. Неблагоприятна рискова група: -7, -5, del(5q), 3q, комплексен кариотип с > 5 цитогенетични на-рушения – среща се при 30-40% от случаите.

Широкозастъпени независими прогностични фактори, които са от значение за постиндукци-онното лечение, както и за EFS, DFS и OS, са

минималната остатъчна болест (MRD) и процен-тът бласти в КМ на ден 8 [5, 6].

Понастоящем е изключително дискутабилен въпросътq при кои пациенти трябва да се започ-не стандартна индукция, тъй като чувствител-ността на всеки прогностичен фактор се ограни-чава от преобладаващата честота на ОМЛ при пациентите над 60 год. По тази причина са раз-работвани множество прогностични формули, тествани със специфични статистически модели, в големи проспективни проучвания [3, 7, 8]. Тес-твани са различни рискови фактори, обединени във възраст-ориентирани прогностични системи. Въпреки че все още липсва консенсус за тяхната специфичност, един добър модел за рискова стратификация според 6 независими прогностични фактора: възраст > 70 год., кариотип, общо състо-яние (PS) ≥ 2, WBC > 50, вторична (sAML), LDH > 600, би могъл да послужи за стратификация на риска при пациентите с ОМЛ в краткосрочна и в дългосрочна перпсектива [7, 8]. Този модел разп-ределя пациентите в 3 рискови групи:

1. Нисък риск (0 ) 2. Междинен риск (1-2 фактора) 3. Висок риск (≥ 3 фактора).

Цел на настоящото проучване Да се анализират резултатите от стратифи-

кацията на риска при пациентите с ОМЛ; ефек-тивността на индукционните режими за постига-не на пълен отговор; да се определят смърт-ността, общата преживяемост и свободният от рецидив период (RFS).

Материал и методи Анализирани са 227 пациента, диагностицира-

ни и лекувани в Хематологична клиника – Варна, за десетгодишен период. Пациентите са разпре-делени в 2 възрастови групи: ≤ 60 год. и ≥ 61 год.

Използвани са класификацията на СЗО (2008) и FAB системата. Стратификация на риска е осъществена според многофакторна прогнос-тична скала при 227 пациенти и според MRC класификацията при 78 пациенти.

На пациентите са прилагани стандартни или нискодозови терапевтични режими, определени според степента на риск и коморбидност.

Статистическият анализ е реализиран с SPSS software v. 15 за Windows.

Резултати Възрастови групи, коморбидност и общо

състояние Медианната възраст на анализираните паци-

енти е 63 (18-87) год., като 45% от болните са на възраст < 60 год., 26% в групата 61-69 год. и 29%


> 70 год. Коморбидност – умерена до тежка, се установява при 50% от пациентите над 61 год. (фиг. 1). Общо състояние (PS) ≥2 (независим неблагоприятен прогностичен фактор), опреде-ляно според ECOG системата, регистрирахме при 53% от пациентите под 60-годишна възраст и при 82% за групата над 60 год. (фиг. 2). Дори в групата относително по-млади болни процентът на коморбидност е впечатляващо висок. При поставяне на диагнозата средният левкоцитен брой (WBC) за всички пациенти е 51 G/l, а сред-ното ниво на LDH 1209 IU/L.

Фиг. 1. Възрастови групи при пациентите с ОМЛ и комор-бидност

Фиг. 2. Възрастови групи и общо състояние на пациен-тите с ОМЛ

Разпределение според WHO и FAB класифи-кациите

Базирайки се на WHO 2008 класификацията на ОМЛ, на проведените цитогенетични изслед-вания и анамнестичните данни за предшестващи заболявания, при 91 болни (40%) стана възмож-но определянето на следните видове ОМЛ:

– ОМЛ с повтарящи се генетични абнорм-ности – при 8 пациенти (9%);

– ОМЛ с МДС-свързани промени – при 40 пациенти (44%);

– ОМЛ, свързана с предшестваща терапия – при 3-ма болни (3%);

– ОМЛ, с неспецифични промени – при 40 болни (44%).

При 136 пациенти (60%) цитогенетика не е осъществена поради технически причини (това са пациенти, пролежали между 1999 до 2004 г.). В тази група болните са разпределени според FAB системата: M0, M1, M2 (55%), M4 (30%), M5 (9%), M6 (2%), M7 (1%).

Стратификация на риска При 78 пациенти беше възможно определя-

нето на цитогенетична рискова група според MRC. С благоприятен риск са 8 болни (10.26%), с интермедиерен риск 48 (61.5%) и с лош риск 22 (28.2%) (фиг. 3). Най-висок е процентът на паци-ентите с интермедиерен риск, което е съпоста-вимо с редица публикации [9, 10].

Фиг. 3. Цитогенетични рискови групи при пациенти с ОМЛ според MRC

Осъществена беше многофакторна рискова стратификация, според която 26 пациенти (11.5%) са с нисък риск (липсват рискови факто-ра); 110 пациенти (48.5%) – с междинен риск (1-2 фактори за риск), и с висок риск (≥ 3рискови фак-тора) са 91 болни (40%) (фиг. 4).

Фиг. 4. Рискови групи според многофакторната скала (LR – нисък риск, MR – междинен риск, HR – висок риск)


Терапевтично поведение Пациентите са лекувани според определени-

те рискови групи. При много възрастни болни, с изразена коморбидност е провеждано нискодо-зово лечение с Cytarabinе. Пациентите, при кои-то коморбидността позволява провеждане на стандартна терапия, са лекувани с най-често използваните индукционни режими. На табл. 1 са посочени най-често използваните терапевтични режими при първа, втора и трета линия лечение. За първа линия това е 7 + 3, за втора – AML 10/ICE, и за трета – FLAG.

Таблица 1. Индукционни режими при ОМЛ и честота на из-ползването им

1-ва линия 2-ра линия 3-та линия

7 + 3 (65%) AML10/ICE (45%) FLAG (16%)

AML10/ICE (18%) 7 + 3 (25%) AML10/ICE (13%)

EMA86/93 (1%) EMA86/93 (3%) 7 + 3 (12%)

GOELAM SA4 (6%) FLAG (5%) EMA86/93 (6%)

TAD2 (4%) 5 + 2, TAD2 (13%) IMD-Ara C + Novantone (6%)

5 + 2 (6%) GOELAM SA (3%)

Отговор след индукция От 227 диагностицирани пациенти, стандар-

тен индукционен режим е приложен при 147 (65%). При останалите болни е започната ниско-дозова терапия (N = 25, 11%) или е регистриран ранен фатален изход (N = 55, 25%), причинен от различни фактори – тежка коморбидност, тумор-лизис синдром, инфекциозни усложнения и др. От групата, преминала индукционно лечение, ранна смъртност е регистрирана при 45 пациен-ти (30.6%), почти 1/3 от случаите. Водещи при-чини за ранна смъртност са мултиорганната не-достатъчност вследствие на тумор-лизис или токсичност от лечението (21%), фатални кръво-изливи (14%) и инфекциозни усложнения (11%). Процентът на ранна смъртност в групата паци-енти, преминали индукционно лечение, е значи-мо по-висок от този, посочен в литературните източници [11, 12, 13].

От останалите пациенти (N = 102) пълна реми-сия е постигната при 53 (52%). Разпределението на процентите пълна ремисия при двете възрасто-ви групи е посочено на фиг. 5. Резултатите за гру-пата под 60 год. са близки до тези в литературните източници [12, 13, 14]. Лоши са резултатите за възрастните пациенти (над 60 год.). Тези резултати се свързват с високата коморбидност в тази група, ограничаваща прилагането на пълен обем лечение в определеното за това време.

Средната продължителност на първата ре-мисия е различна в двете възрастови групи: при

пациентите < 60 (N = 41) тя е 21.7 ± 5.3 месеца; при пациентите > 61 (N = 12) 12.7 ± 4.5 месеца.

Фиг. 5. Оценка на отговора към провежданото индукционно лечение спрямо възрастовата група на пациентите

Средната OS за всички пациенти е 25.5 ± 4 месеца. Не се установява статистическа разлика между двете възрастови групи (фиг. 6). Продъл-жителността на живота в нашата група пациенти е значимо по-кратка в сравнение с литературни-те източници [3, 4, 8, 9], което свързваме с ло-шия статус на пациентите и затрудненията за осъществяване на алогенна трансплантация на стволови клетки.

Фиг. 6. Средна преживяемост при пациентите, постигна-ли пълна ремисия

Анализ на преживяемостта и RFS според рисковата стратификация

При многофакторно обусловените рискови групи най-голям брой пациенти са систематизи-рани в групата с умерен риск, следвана от тази с висок риск. На табл. 2 е представена разликата


Таблица 2. Рискови скали, обща преживяемост и свободна от прогресия преживяемост при пациентите с ОМЛ

Многофакторно обособени рискови групи Цитогенетични рискови групи

Нисък риск Умерен риск Висок риск Добра прогноза Умерена прог-ноза Лоша прогноза

OS (мес.) 30 ± 8 7 ± 1 3 ± 1 16.5 ± 7 13.8 ± 3.8 4.6 ± 1.2

RFS (мес.) 32.9 ± 10.3

N = 26 12.6 ± 2.3 N = 110

6.4 ± 1.8 N = 91

13.3 ± 7.8 N = 7

24.8 ± 9 N = 19

7.3 ± 3 N = 3

между общата преживяемост и свободната от прогресия преживяемост при двете стратифика-ционни системи: многофакторната рискова скала и цитогенетичните рискови групи (MRC). Разли-ките в OS и RFS са значими за двете групи па-циенти – с нисък и умерен риск при многофак-торната скала.

Сравнителна характеристика на нашите ре-зултати с литературни данни от големи мулти-центрови проучвания е посочена на табл. 3 [3, 5, 6, 7, 8]. От таблицата се вижда, че нашите ре-зултати са по-лоши, особено по отношение на ранната смъртност и общата преживяемост.

Таблица 3. Сравнителни данни за пълен отговор (CR), ранна смъртност (EM) и обща преживяемост (OS) в наше-то и в други проучвания

Възраст < 60

CR EM OS (3-5 год.) Ref/Study

72% 9% 34% CALGB (N = 474)

82% 9% 38% ALFA (N = 345)

74% 11% 39% GAMLCG (N = 535)

60.3% 23% 15-20% Варна N = 88

Възраст > 61

CR EM OS (2-7г.) Ref

52% 25% 15% CALGB (N = 388)

42% 17% 10% ECOG (N = 348)

55% 19% 10% MRC (N = 1314)

35% 42% 10% Варна N = 59

Изводи и обсъждане Няколко показателя правят впечатление при

анализа на нашите пациенти: • Висока съпътстваща заболяемост и статус

по ECOG 2, лимитиращи приложението на стан-дартно лечение и определящи лошия изход при използването му.

• Висока ранна смъртност: пред- и постин-дукционна, която се свързва с преобладаващата коморбидност, голям туморен обем при диагнос-тицирането, липса на възможност за осъществя-ване на левкоцитафереза като спешна мярка при хиперлевкоцитоза и левкостаза, финансови ог-раничения за прилагане на адекватна профилак-тика в стадий на миелосупресия – антибиотична,

гастро- и хепатопротективна терапия, непълно-ценна хематологична реанимация (тромбоцитни концентрати?).

• Процентът на постигната ремисия при па-циенти под 60г. е сравним от този от литератур-ната справка.

• Процентът на постигната ремисия при па-циенти над 61 год. е статистически значимо по-нисък от този по литературни данни и се опре-деля основно от прилагане в непълен обем на индукционното лечение (най-вече поради лош статус на пациентите).

• Продължителността на ремисия (RFS) и общата преживяемост (OS) са по-кратки от тези по литературна справка [3, 4, 8, 9], което се свързва с непълноценната консолидация, вкл. липсата на възможност за прилагане на алоген-на трансплантация на стволови клетки.


1. S w e r d l o w , S. H. et al (edts). WHO Classification of Tu-

mours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues (4-th edi-tion), IARC, 2008.

2. G r i m w a d e , D. et al. The importance of diagnostic cyto-genetics on outcome in AML: analysis of 1,612 patients en-tered into the MRC AML 10 trial. The Medical Research Council Adult and Children's Leukaemia Working Parties. – Blood, 92, 1998, № 7, 2322-2333.

3. W h e a t l e y , K. et al. United Kingdom National Cancer Research Institute Haematological Oncology Clinical Studies Group and Acute Myeloid Leukaemia Subgroup. Prognostic factor analysis of the survival of elderly patients with AML in the MRC AML11 and LRF AML14 trials. – Br. J. Haematol., 145, 2009, № 5, 598-605.

4. B y r d , J. et al. Pretreatment cytogenetic abnormalities are predictive of induction success, cumulative incidence of re-lapse, and overall survival in adult patients with de novo acute myeloid leukemia: results from Cancer and Leukemia Group B (CALGB 8461). – Blood, 100, 2002, № 13, 4325-4336.

5. G r i m w a d e , D. et R. K. Hills. Independent prognostic fac-tors for AML outcome. – Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program., 2009, 385-395.

6. K e r n , W. et al. Early blast clearance by remission induc-tion therapy is a major independent prognostic factor for both achievement of complete remission and long-term out-come in acute myeloid leukemia: data from the German AML Cooperative Group (AMLCG) 1992 Trial. – Blood, 101, 2003, № 1, 64-70.

7. G a r d i n , C. et al. Postremission treatment of elderly pa-tients with acute myeloid leukemia in first complete remis-sion after intensive induction chemotherapy: results of the


multicenter randomized Acute Leukemia French Association (ALFA) 9803 trial. – Blood, 109, 2007, № 12, 5129-5135.

8. M a l f u s o n , J. V. et al. Acute Leukemia French Associa-tion (ALFA) Risk factors and decision criteria for intensive chemotherapy in older patients with acute myeloid leukemia. – Haematologica, 93, 2008, № 12, 1806-1813.

9. J a b b o u r , E. J. Estey E, Kantarjian HM. Adult Acute Mye-loid Leukemia. – Mayo Clin. Proc., 81, 2006, № 2, 247-260.

10. C a s s i l e t h , P. et al. Intensified induction chemotherapy in advanced acute myeloid leukemia followed by high-dose che-motherapy and autologous peripheral blood stem cell transplantation: an Eastern Cooperative Oncology Group trial (E4995). – Leuk. Lymph., 46, 2005, 55-61.

11. C h e s o n , B. et al. Revised Recommendation Of The In-ternational Working Group For Diagnosis Standardization Of Response Criteria, Treatment Outcomes And Reporting Standards For Therapeutic Trials In Acute Myeloid Leuke-mia. – J. Clin. Oncol., 21, 2003, 4642.

12. B r i t i s h Committee for Standards in Haematology – Guidelines on the management of acute myeloid leukaemia in adults, 2006.

13. F e r r a r a , F. et A. Pinto. Acute Myeloid Leukemia in the Elderly: Current Therapeutic Results and Perspectives for Clinical Research. – Reviews on Recent Clinical Trials., 2, 2007, 33-41.

14. C o r t n e y , V. J. et A. Edward. Copelan Treatment of Acute Myeloid Leukemia With Hematopoietic Stem Cell Transplan-tation. – Future Oncology, 5, 2009, № 4, 559-568.


Л. Герчева Клиника по хематология УМБАЛ “Св. Марина” Варна


РЕЗУЛТАТИ ОТ ЛЕЧЕНИЕТО НА ПАЦИЕНТИ НАД 60 ГОД. С ОСТРИ МИЕЛОИДНИ ЛЕВКЕМИИ В КЛИНИКАТА ПО ХЕМАТОЛОГИЯ КЪМ УМБАЛ АЛЕКСАНДРОВСКА

Л. Шемелекова1, М. Зюмбюлева1, Цв. Василева1, Д. Попова1, Г. Балаценко2, М. Велизарова1 и Е. Хаджиев1

1Медицински факултет, УМБАЛ "Александровска” – София 2Лаборатория по цитогенетика и молекулярна биология


OUTCOMES OF PATIENTS OVER 60 YEARS WITH ACUTE MYELOID LEUKEMIA IN THE CLINIC OF HEMATOLOGY, UNIVERSITY HOSPITAL ALEXANDROVSKA

L. Shemelekova1, M. Zyumbyuleva1, Ts. Vassileva1, E. Popova1, D. Balatsenko2, M. Velizarov1 and E. Hadzhiev1

1Medical Faculty, UMHAT “Alexandrovska” – Sofia 2Laboratory of Cytogenetics and Molecular Biology

National Specialized Hospital for Active Treatment of Hematologic Diseases – Sofia

Резюме. Острите миелоидни левкемии (ОМЛ) са най-честата форма на левкемии при възрастни – 34%, като честотата им нараства с възрастта. Въпреки напредъка в разбирането на биологични-те, генетичните и епидемиелогичните характеристики на заболяването, лечението му представ-лява проблем, особено във възрастовата група над 60 год. В настоящото изложение са представени резултатите от лечението на пациенти над 60-годишна възраст с ОМЛ, лекувани в Клиниката по хематология към УМБАЛ „Александровска”, като е направено сравнение с група пациенти под 60 г.с ОМЛ, провели индукционна терапия за същия период от време.

Ключови думи: остра миелоидна левкемия, пациенти в напреднала възраст/лечение

Summary. Acute myeloid leukemia (AML) is the most common type of leukemias in adults. Despite the progress in understanding the biological, genetic and epidemiological characteristics of the disease, its treatment remains a challenge especially in the elderly. This article discusses the treatment results of patients older than 60 years with AML treated in Clinic of Hematology in University Hospital Alexandrovska. They are compared with a group of patients younger than 60 years with AML treated in the clinic for the same period of time.

Key words: acute myeloid leukemia in elderly patients/treatment

Острите миелоидни левкемии (ОМЛ) са хе-терогенна група злокачествени кръвни заболя-вания, засягащи предимно по-възрастните паци-енти. Те са най-честата форма на левкемии при възрастни – 34% от всички левкемии [5]. Често-тата им нараства с възрастта – от 1/100 000 при 40-годишните до 15/100 000 във възрастовата група над 75 год. [3, 4, 5]. Въпреки напредъка в разбирането на биологичните, генетичните и епидемиологичните характеристики на заболя-ването, неговото лечение все още представлява проблем, особено във възрастта над 60 год. [7].

Един от основните проблеми е ниският толе-ранс на тези пациенти към химиотерапия поради по-голямата честота на съпътстващи хронични заболявания при тях, както и поради намаления костномозъчен резерв, водещ до тежки и про-дължителни костномозъчни аплазии. Друг проб-лем е по-високата резистентност на болестта към химиотерапия поради по-често срещаните в тази възрастова група прогностично неблагопри-ятни цитогенетични и молекулярни маркери, както и по-високата честота на вторичните лев-кемии, развили се след миелодиспластични син-дроми (МДС) [1, 2, 3, 4, 5, 10].

Л. Шемелекова, М. Зюмбюлева, Цв. Василева...Резултати от лечението на пациент... 70

Всичко това затруднява избора на терапев-тично поведение и повдига въпроса – дали при възрастни пациенти да се прилага индукционна терапия, или да се предпочетат палиативно ле-чение или атенюирани дози химиотерапия.

В настоящото изложение са обсъдени тера-певтичните проблеми и резултатите от лечение-то на пациентите над 60 год. с ОМЛ, лекувани в Клиника по хематология при УМБАЛ „Александ-ровска” за 7-годишен период.

Използваните статистически методи са вари-ационен и честотен анализ, Т-критерий и крите-рий на Ман Уитни.

Материали и методи Ретроспективно са проучени 129 пациенти с

ОМЛ. За поставяне на диагнозата и прецизиране на подтипа ОМЛ съгласно Френско-Американско-Британската (ФАБ) класификация са използвани морфологични, цитохимични методи, флоуцито-метрия. Цитогенетичен и/или молекулярен ана-лиз е осъществен при много малък брой болни над 60 год., поради което резултатите не са включени в настоящия преглед.

Пациентите са разпределени в 3 групи: 1. Възрастни болни над 60 год., провели ин-

дукционна терапия; 2. Възрастни болни над 60 год., получили

атенюирани дози химиотерапия или палиативно лечение;

3. Пациенти под 60 год., провели индукцион-но лечение.

Индукционната терапия включва антрацик-линов препарат и цитозинарабинозид в стандар-тни дози. Основният критерий за избор на тера-пия в групата над 60 год. – дали ще се провежда индукционна, или палиативна терапия – е изход-ният performance status (PS) и съпътстващите заболявания.

Групата на активно лекуваните пациенти над 60 год. е сравнена с групата на възрастните па-циенти, не провеждали индукционна терапия, и с групата на пациентите под 60 години. Сравнени са характеристики като възраст, пол, общо със-тояние, левкоцитен брой и стойности на лактат-дехидрогеназата (ЛДХ) при диагностициране на заболяването, както и честота на ремисиите, продължителност на ремисиите и преживяемост.

Резултати От анализираните общо 129 пациенти, група-

та на възрастните, провели палиативна терапия, обхваща 47% (n = 61), възрастните пациенти провели индукционна терапия – 14% (n = 18), а тези на възраст под 60 год. – 39% (n = 50).

Средната възраст на цялата анализирана популация е 61 год. (медиана 65 +16,8 год.). Преобладава мъжкият пол (62%). От ОМЛ над 60 год. 11% са вторични, развили се след МДС; във възрастта под 60 год. – вторични са 2% от ОМЛ. Основните характеристики на изследваните гру-пи са представени в табл. 1.

Таблица 1. Основни характеристики на изследваните групи

Пациенти > 60 г., провеждали индук-ционна терапия

(n = 18)

Пациенти > 60 г., провеждали палиа-тивно лечение

(n = 61)

Общо пациенти > 60 г. (n = 79)

Пациенти < 60 год., провеждали индук-ционна терапия

(n = 50)

Ср. стойност граници 66.8 г. 74.5 г. 72,8 г. 43.0 год. Възраст

(61-84) (61-86) (61-86) (22-60)

Мъже 78% (n=14) 57% (n = 35) 62% (n = 49) 62% (n = 31) Пол

Жени 22% (n=4) 43% (n = 26) 38% (n = 30) 38% (n = 19)

1-2 61% (11/18) 31% (19/61) 38% (30/79) 62% (31/50) PS

3-4 39% (7/18) 69% (42/61) 62% (49/79) 38% (19/50)

(+) 50% (9/18) 31% (19/61) 35% (28/79) 48% (24/50) CD34

(–) 17 %( 3/18) 15% (9/61) 15%(12/79) 24% (12/50)

Над нормата > 460 U/l 50% (9/18) 69% (42/61) 65% (51/79) 50% (25/50)

Ср.стойност 896 U/l 1177 U/l 969 U/l 1364 U/l

В норма < 460 U/l 33% (6/18) 18 % (11/61) 22% (17/79) 26% (13/50) LDH

Ср.стойност 327 U/l 331 U/l 329 U/l 350 U/l

> 100 х 109/l 17% (3/18) 15% (9/61) 15% (12/79) 18% (9/50)

Ср.стойност 194 х 109/l 190 х 109/l 191 х 109/l 129 х 109/l

<100х109/l 83% (15/18 ) 85% (52/61) 85% (67/79) 82% (41/50) Leu

Ср.стойност 11 х 109/l 21 х 109/l 19 х 109/l 23 х 109/l


Средната възраст в групата на палиативно

лекуваните възрастни е значимо по-висока от тази на активно лекуваните (р = 0,001). Разпре-делението по пол в отделните групи повтаря това в цялата популация – и в трите групи пре-обладава мъжкият пол.

В групата на палиативно лекуваните възрас-тни преобладават тези с PS 3-4, докато в групата на активно лекуваните възрастни и тази под 60 год. по-голямата част от пациентите са с изходен PS 1-2. Във всички групи преобладават пациенти с левкоцитен брой под 100 х 109/l и със стойнос-ти на лактатдехидрогеназата (ЛДХ) над нормата.

Резултатите от проведеното лечение – чес-тота на ремисиите, продължителност на ремиси-ята и средна продължителност на живота от диагностициране на болестта, са посочени в табл. 2 и 3. Честотата на ремисиите в групата на активно лекуваните възрастни е значимо по-висока от тази на палиативно лекуваните (p = 0,006), установява се също и значимо по-висока преживяемост в групата на активно леку-ваните (p = 0,006). Няма значима разлика по отношение на продължителността на постигната ремисия в двете групи.

Таблица 2. Сравнение на терапевтичните резултатите на пациентите над 60 год. на индукционно и палиативно лечение

Пациенти > 60 год. палиативно

лечение (n = 61) индукционно

лечение (n = 18)

Честота на ремисии (p = 0,006) 3,3% (n = 2) 28% (n = 5)

Средна продължи-телност на ремисия-та (дни); (p = 0,333)

240 ± 00.0 338 ± 89,5

Средна продължи-телност на живота (дни); (p = 0,006)

112 ± 232 310 ± 489

Таблица 3. Сравнение на терапевтичните резултати на пациентите над 60 год.и под 60 год. на индукционно лече-ние

Пациенти на индукционно лечение

> 60 год. (n = 18) < 60 год. (n = 50)

Индукционна смърт-ност (p = 0,048) 30% 8%

Честота на реми-сиите (p = 0,011) 28% (n = 5) 66% (n = 33)

Средна продължи-телност на ремисия-та (дни) (p = 0,803)

338,0 ± 89,5 544,0 ± 453,0

Средна продължи-телност живота (дни) (p = 0,003)

310 ± 489 682 ± 748

Честотата на ремисиите в групата под 60 год. е значимо по-висока от тази на активно лекува-ните възрастни (p = 0,011), значимо по-висока е и средната продължителност на живота в група-та под 60 год. (p = 0,003), не се отчита значима разлика в продължителността на ремисиите в двете групи (p = 0,8).

Обсъждане Пациентите над 60 год., при които е прове-

дено индукционно лечение, представляват едва 23% от всички пациенти над 60 год., лекувани в клиниката за 7-годишен период. Като основна причина, ограничаваща провеждането на индук-ционна терапия, може да се обсъжда преобла-даването на пациенти с изходен PS 3-4 и с тежки съпътстващи заболявания. Възрастта също мо-же да се обсъжда като рестриктивен фактор - средната възраст в групата на палиативно леку-ваните е значимо по-висока от тази на активно лекуваните възрастни.

Честотата на ремисиите при пациентите под 60 год. е значимо по-висока от тази при възраст-ните, провели индукционна терапия, най-вероят-но резултат от по-високата резистентност на болестта и по-високата индукционна смъртност във втората група. Прави впечатление по-ниската честота на ремисиите при активно леку-ваните възрастни пациенти в сравнение с цити-раната в научната литература: 28% спрямо 45-50% [3]. Като причина за тези различия може да се обсъжда по-високата смъртност в хода на индукционната терапия поради трудностите в провеждането на адекватно заместително лече-ние в периодите на костномозъчна аплазия при нашите болни. Съпътстващите заболявания и биологичните особености на ОМЛ при възраст-ните най-вероятно са причина за значимо по-ниската преживяемост в групата над 60 год., провела индукционна терапия, в сравнение с групата под 60 год.

Посочените резултати потвърждават цити-раните в научната литература – значимо по-нисък процент на ремисиите при възрастни па-циенти, провели индукционна терапия, по-кратка ремисия и по-ниска преживяемост в сравнение с пациентите под 60 год., но по-добра преживяе-мост при активно лекуваните възрастни болни в сравнение с тези на палиативна терапия или атенюирана химиотерапия [1, 3, 4, 5].

От друга страна, е възможно по-кратката об-ща преживяемост при групата на възрастни бол-ни, лекувани с палиативна или атенюирана хими-опетарпия, да се дължи и на по-високата средна възраст в тази група (74.5 г. спрямо 66.8 г.), което

Л. Шемелекова, М. Зюмбюлева, Цв. Василева...Резултати от лечението на пациент... 72

безспорно трябва да се има предвид при интер-претацията на този показател.

Всичко това още веднъж потвърждава необ-ходимостта от индивидуализиран подход в тера-пията на възрастните пациенти [4]: при тези в добро общо състояние, с PS 1-2, без съпътства-ща тежка патология, без наличие на прогностич-но неблагоприятни цитогенетични или молеку-лярни маркери е уместно провеждане на индук-ционна терапия с оглед по-високата честота на ремисиите и по-добрата преживяемост в сравне-ние с пациентите, оставени на палиативна тера-пия. Въпреки това в сравнение с пациентите под 60 год. резултатите не са обнадеждаващи, което налага търсене на нови терапевтични подходи.


1. A p p e l b a u m , F. еt al. Age and acute myeloid leukaemia. – Blood, 107, 2006, 3481-3485.

2. S t o n e , R. I. A. The difficult problem of acute myeloid leu-kemia in the older adults. – Cancer J. Clin., 52, 2002, 363-371.

3. R a t h a s a b a p a t h y , R. J. Management of acute myelogenous leukemia in the elderly. – Cancer Control., 10, 2003, № 8, 469-479.

4. J a b b o u r , E., E. Estey et H. Kantarjian. Adult acute mye-loid leukaemia. – Mayo Clin. Proc., 81, 2006, № 2, 247-260.

5. F e l i c e t t o , F. et A. Pinto. Acute myeloid leukemia in the elderly: Current therapeutic results and perspectives for

clinical research. – Reviews on recent clinical trials, 2007, 2, 33-41.

6. B r e e m s , D. et al. Prognostic index for adult patients with acute myeloid leukemia in first relaps. – J. Clin. Oncol., 3, 2005, № 9, 1-10.

7. F e r r a r a , F., S. Palmieri et G. Mele. Prognostic factors and therapeutic options for relapsed or refractory acute myeloid leukaemia. – Haematologica, 89, 2004, 998-1008.

8. M i l l i g a n , D. W. at al. Guidelines on the management of acute myeloid leukaemia in adults. – Br. Committee for Standarts in Haematology (BCSH) 23.05.2005, 1-77.

9. J u l i u s s o n , G. et al. Age and acute myeloid leukaemia: real world data on decision to treat and outcomes from the Swedish Acute Leukemia Regystry. – Blood, 113, 2009, 4179-4187.

10. L e i t h , C. P. et al. Acute myeloid leukemia in the elderly: assesment of multidrug resistance (mdr1) and cytogenetics distinguished biologic subgroups with ramarkably distinct re-sponses to standart chemotherapy: A Southwest Oncology Grooup Study. – Blood, 98, 1997, 3323-3329.

11. T a l l m a n , M. D., G. Gilliand et J. M. Rowe. Drug therapy for acute myeloid leukaemia. – Blood, 106, 2005, 1154-1163.

12. Z a r e t s k y , Y. et al. Treatment of acute myeloid leukemia in older patients: Guideline Recommendations. – Cancer Care Ontario, 08.12.2008, 1-5.

Адрес за кореспонденция: Л. Шемелекова Медицински факултет УМБАЛ "Александровска” ул. „Св. Г. Софийски” № 1 1431 София


ПРОГНОСТИЧНАТА ТЕЖЕСТ НА КАРИОТИПНИТЕ НАХОДКИ В СРАВНЕНИЕ С ДРУГИ ЗНАЧИМИ МЕДИКО-БИОЛОГИЧНИ ФАКТОРИ

ПРИ БОЛНИТЕ С ПЪРВИЧНА ОМЛ С. Ангелова1, И. Христов2, М. Симеонова3, П. Ангелова3, Н. Цветков2, А. Стоименов1,

А. Велкова4 и С. Тошков1 1Лаборатория по цитогенетика и молекулярна биология, НСБАЛХЗ – София

2Клиника по хематология, УМБАЛ „Г. Странски” – Плевен 3Секция „Медицинска генетика”, МУ – Плевен 4Катедра „Социална медицина”, МУ – Плевен

PROGNOSTIC IMPACT OF THE KARYOTYPE FINDINGS COMPARED TO OTHER SIGNIFICANT BIOLOGICAL FACTORS IN PATIENTS WITH DE NOVO

ACUTE MYELOID LEUKEMIA S. Angelova1, I. Christov2, M. Simeonova3, P. Angelova3, N. Tsvetkov2, A. Stoimenov1,

A. Velkova4 and S. Toshkov1 1National Hospital of Hematological Diseases – Sofia

2Clinic of Hematology, Medical University Hospital – Pleven 3Section of Medical Genetics, Medical University – Pleven

4Department of Social Medicine, Medical University – Pleven

Резюме. Целта на нашето проучване е да открием значими прогностични фактори при група прос-ледявани болни с de novo ОМЛ, да определим има ли функционална зависимост между тях и да срав-ним относителната сила на въздействие на всеки от значимите фактори. В изследването са вклю-чени 128 последователно цитогенетично изследвани болни с първична ОМЛ. Върху този брой случаи е направен анализ за разпределяне на типове хромозомни аберации в три възрастови групи. Послед-ващо проследяване, както и оценка на комулативно действащи прогностични фактори са извършени върху данните от 97 лекувани болни. Избраните за анализ фактори са: пол, възраст, кариотип, брой на левкоцитите в периферната кръв, процент на бластите в костния мозък, органни усложнения. При 74 от 128 (57,8%) болни с ОМЛ се откриват аномалии в кариотипа. Най-висок процент аберации (65%) се установява в най-младата възрастова група до 45 години. Като цяло с възрастта се увели-чават случаите с нормален кариотип (от 35% при младите до 42,2% при възрастните), но относи-телният им дял в цитогенетичната група със стандартен риск намалява (от 87,5% при младите до 57,6% при възрастните). След статистически анализ не се открива функционалната зависимост между признати за независими прогностични фактори. Относителната им сила при съвместното въздействие намалява в последователност: органни усложнения, кариотип, възраст, брой на левко-цитите в переферната кръв.

Ключови думи: кариотип, прогностична тежест, остра миелоидна левкемия

Summary. The aim of our research is to discover significant prognostic factors in patients with de novo AML, to analyze whether functional relations between these factors exist and to assess the extent of the impact of each of the significant factors on the development of the disease. 128 cytogenetically examined patients with AML were included in an analysis on distribution of chromosome aberrations in 3 age groups. In 97 of the followed up cases, an assessment of the cumulatively acting prognostic factors was made. The factors included in the re-search are: age, gender, karyotype, count of leukocytes in the peripheral blood, percentage of blasts in the bone marrow and comorbidity. Abnormal karyotype was detected in 74 out of 128 patients (57,8%). The highest per-

С. Ангелова, И. Христов, М. Симеонова... Прогностична тежест на кариотипните... 74

centage of aberrations was found in the youngest age group (under 45 years old). On the whole, the cases with normal karyotype are increasing with age (from 35% in the youngest to 42,2% in the oldest). However, in the cy-togenetic group with standard risk the relative share of normal karyotypes is decreasing with age (from 87,5% in the youngest to 57,6% in the oldest). There was no functional relation found among the significant prognostic factors. The relative intensity of the cumulative effect of these factors is decreasing in the following succession: comorbidity, karyotype, age, number of leucocytes in the peripheral blood.

Key words: karyotype, prognostic impact, acute myeloid leukemia

Увод Анализът на кариотипа има голямо значение

в определянето на терапевтичната стратегия при новодиагностицирани болни с остра миело-идна левкемия (ОМЛ). Няколко международни изследователски кооперативни групи са допри-несли за изграждането на прoгностични цитоге-нетични критерии при тези болни [14]. Освен кариотипните находки при болните с ОМЛ за рискови се смятат следните медико-биологични фактори: напреднала възраст, мъжки пол, уве-личение над определени граници на броя на левкоцитите в периферната кръв и на процента на бластите в костен мозък (BMB – bone marrow blasts) по време на диагностициране и на 16-и ден след започването на терапия [8, 11, 12,13]. Наличието на органни усложнения най-често възпрепятства провеждането на интензивна хи-миотерапия и драматично съкращава общата преживяемост (OS) на болните [5, 7].

С напредването на възрастта се намалява продължителността на хематологичната реми-сия (CRD) и OS на болните с ОМЛ [6, 9, 18]. От друга страна, при различни възрастови групи се наблюдава различно разпределяне на типовете хромозомни аберации [3, 16].

Определянето на рискова граница на броя на левкоцитите (РГ Leu) в периферната кръв по време на диагностициране, която достоверно корелира с CRD и OS, е въпрос на дискусия. По данни на отделните автори РГ Leu варира от 20 х 109/L до 100 х 109/L [4, 5, 8, 13]. Някои автори не откриват сигнификантно повлияване на броя на левкоцитите върху OS и CRD при болните с ОМЛ [12].

Жените с ОМЛ показват по-дълга CRD и OS в сравнение с мъжете, но мнозинство от авторите не намират тези различия за достоверни [5, 18]. Само отделни изследователски екипи са устано-вили сигнификантни различия в CRD и продъл-жителността на OS между мъже и жени в полза на последните [8].

Съществуват различни мнения, дали процен-тът на BMB при болните с ОМЛ към момента на диагностициране може да бъде независим прог-ностичен фактор. Отделни автори смятат, че има

корелация между процента ВМВ и OS [8]. Други-те изследователи не са открили такава зависи-мост [1, 13]. За по-перспективен подход се смята отчитането на процента на ВМВ в динамика: по време на диагностициране и на 16-и ден след започване на терапията. Болните с ОМЛ, при които количеството на ВМВ след 1-ви курс химиотерапия спада под 10% имат достоверно по-добър отговор на терапията и по-продължителна свободна от рецидиви и обща преживяемост [11].

Корелират ли прогностичните фактори при ОМЛ помежду си и колко значителна е корела-цията, ако такава съществува? Кои от факторите имат по-голяма прогностична тежест?

Целта на нашето проучване e да открием значими прогностични фактори при група болни с ОМЛ, да определим дали има функционална зависимост между тях и да сравним относител-ната сила на въздействие на всеки от значимите фактори.

Материали и методи Описание на болните, включени в изследва-

нето В проучването са включени 128 пациенти с

първична ОМЛ от 16 до 79 години, изследвани цитогенетично по време на диагностициране в Медико-диагностична лаборатория по медицинс-ка генетика в град Плевен за периода от 1995 до 2006 г. включително. За 97 от 128 болни беше събрана цялостна информация за лечение и проследяване в клиниката по хематология при УМБАЛ „Георги Странски” – Плевен. Проследя-ваните пациенти с ОМЛ са получили поне един курс стандартна химиотерапия съгласно общоп-риетите протоколи.

Цитогенетичен анализ на костен мозък при болни с ОМЛ

Анализ на кариотипа е правен върху не по-малко от 15 GTG-лентувани метафазни пластини от костен мозък, с използване на директен метод и/или след краткосрочно (48-часово) култивира-не. Отчитането на морфологията на хромозоми се провежда съгласно International System for Human Cytogenetic Nomenclature (2004).


Критерии за рисковите групи и постигане-то на хематологична ремисия

За критерий на хематологичната ремисия се приема отсътствие в периферната кръв на блас-тни клетки при съдържание на неутрофили ≥ 1,5 х 109 /L и тромбоцити ≥ 100 х 109/L, наличието на нормобластен костен мозък с ≤ 3% бласти.

Коморбилитет се отчита съгласно Charlson comorbidity index, модифициран от M. L. Sorror и съавт. [17]. Болните със стойности на индекс на Charlson-Sorror ≥ 1 се смятат за притежаващи рискови органни усложнения.

Определени са три възрастови групи за тър-сене на прогностична стойност на фактор „въз-раст”: 1) от 16 до 44 години; 2) от 45 до 64 годи-ни; 3) над 65 години.

Цитогенетичните находки са разпределени в следните групи съгласно оптимизираните критерии на SWOG/ECOG: 1) структурни аберации с очакван добър прогностичен ефект – inv(16)(p13q22), t(15;17)(q22;q12-21), t(8;21)(q24;q22) без комп-лексен кариотип; 2) аберации със стандартен прогностичен ефект: нормален кариотип, +8, +6, -Y и др., невлизащи в 1-ва и 3-та група; 3) аберации, които имат лош прогностичен ефект: t(6;9), t(9;22), преустройства в 11q23 (без t(9;11)), 5q/7q, 3q, 9q, 17p, монозомия 5 и 7, а също така – комплексен кариотип (3 и повече несвързани аберации) [14].

Статистически анализ За отчитане на продължителността на реми-

сиите и преживяемостта на пациентите в раз-лични рискови групи е прилаган методът на Kaplan-Meier. За отчитане на достоверни разлики в кривите на преживяемост в групите е използ-ван log-rank тест. Корелационният анализ на Pearson е използван за разкриването на въз-можна функционална зависимост между отдел-ните критерии, свързани с преживяемостта на пациентите. Регресионният анализ на Cox е при-лаган за изчисляване на достоверни разлики и определяне на коефициентите, пропорционални на силата на въздействие на съвместно дейст-ващи рискови фактори. Използването на горепо-сочените методи се реализира с помощта на

компютърна програма за статистически анализ „StatGraphics – 2000”.

Резултати Разпределяне на прогностичните цитоге-

нетични аномалии по възрастови групи В трите определени от нас възрастови групи

се наблюдават различия в честотата и структу-рата на кариотипните находки.

Най-висок процент хромозомни аберации се отчита в най-младата група (до 45 години), но той е за сметка на цитогенетичните находки с добър прогностичен ефект, който е най-висок в тази група. При пациентите над 65 години хро-мозомни аберации с добър прогностичен ефект се срещат изключително рядко. При младите пациенти се наблюдава най-голям процент на нормални кариотипи в групата със стандартен риск, в същата група при пациентите над 65 го-дини този дял е най-нисък, макар че преоблада-ва над дела на кариотипи с аномалии (табл. 1).

Връзка между кариотипните находки, CRD и OS на болните с ОМЛ

Получили поне един курс химиотерапия 97 болни с ОМЛ са разпределени в 3 прогностични цитогенетични групи: І група с благоприятен риск – 12 болни; ІІ група със стандартен риск – 63 болни; ІІІ група с неблагоприятен риск – 22 бол-ни. Кривите на преживяемостта при 3-те групи болни с различни категории кариотип, построени по метода Каплан-Майер, показват значимо раз-личие в преживяемостта на тези групи (фиг. 1).

Проверка с log-rank test показа, че трите ка-риотипни групи се различават достоверно по отношение на OS (р < 0,001) и продължител-ността на CRD (p < 0,001). Най-добри показатели са установени при група І с благоприятни хромо-зомни находки: средната преживяемост в група-та е 66 мес., 50% от болните остават живи до 33 мес. В група ІІ с находки със стандартен риск средната преживяемост е 15,3 мес., като 50% от болните остават живи до 7 мес. В групата с „ло-ши” аберации и комплексни кариотипи средната преживяемост е около 5 месеца.

Таблица 1. Разпределяне на типове кариотип с прогностично значение в трите възрастови групи

І група от 18 до 45 г. ІІ група от 46 до 65 г ІІІ група над 66 год. общо

Брой болни 40 43 45 128

С „добрър” кариотип 11 (27,5%) 5 (11,6%) 1 (2,2%) 15

Със „станд. риск” кариотип 16 (40%) 31 (72,1%) 33 (73,4%) 82

Нормален кариотип 14 от 16 (87,5%) 21 от 31 (67,7%) 19 от 33 (57,6%) 54 от 82

С „лош” кариотип 13 (32,5%) 7 (16,3%) 11 (24,4%) 31

Общо аберантни 26 от 40 (65%) 22 от 43 (51,2%) 26 от 45 (57,8%) 74 от 128


Влияние на кариотипа върху

преживяемостта на пациенти с ОМЛ

Месеци

140120100806040200

Кумулативна

преживяемост

1,0

,8

,6

,4

,2

0,0

Кариотип

3,00

3,00-censored

2,00

2,00-censored

1,00

1,00-censored

Фиг. 1. Обща преживяемост на болни с ОМЛ при три раз-лични категории кариотип (І група с благоприятен риск – горната крива, ІІ група със стандартен – средната крива, ІІІ група с неблагоприятен риск – долната крива)

Връзка между OS и други прогностични фактори

Направихме опит за търсене на функционал-на зависимост между OS на болните и такива показатели, като пол, възраст, брой на левкоци-тите в периферната кръв, процента на бластите в костен мозък и наличие или отсъствие на ор-ганни усложнения, регистрирани към момента на диагнозата.

При болните с ОМЛ, включени в проучване-то, се наблюдава следното разпределяне по пол: 53-ма мъже и 44 жени. Средната OS при жените е по-висока от тази при мъжете, но раз-

ликата е статистически недостоверна. Също така не се открива достоверна разлика в средната OS в групите с BMB ≤ 50% и с BMB > 50%.

Има статистически достоверна разлика в OS в трите възрастови групи. Най-добра средна OS беше постигната в най-младата по възраст гру-па І – 29,9 мес. Петдесет процента от болните в тази група са доживели до 11 мес. след диагнос-тициране. В група ІІ средната OS беше 18,2 мес., като 50% от болните са доживели до 9 мес. Най-ниската средна OS (4 мес.) беше наблюдавана в най-възрастната група ІІІ. Трите възрастови гру-пи се различават достоверно по отношение на OS (р < 0,001).

Средната OS при болните с Leu < 100 х 109 е статистически достоверно по-голяма от тази при болните с Leu > 100 х 109/L (23,7 мес. versus 6,7 мес.; р < 0,001).

Болните, имащи органни усложнения, които се оценяват по индекса на Charlson ≥ 1 (бъбреч-на недостатъчност, сърдечна недостатъчност, въвличане на ЦНС, нарушена функция на чер-ния дроб, диабет, инфекциозни усложнения и т.п.), имат по-ниска OS от болните без органни усложнения (6,9 мес. versus 27,9 мес.; р < 0,001) (табл. 2).

Търсене на функционална зависимост меж-ду кариотипа и други прогностични фактори

Корелационен анализ на Pearson С цел проверка за наличие или отсътствие

на функционална зависимост между вида на кариотипа и други критерии, имащи доказана връзка с преживяемостта на болните с ОМЛ в нашето проучване беше направен мултивариан-тен корелационен анализ по метода на Pearson.

Таблица 2. Връзка между различни показатели и продължителността на живота при болни с ОМЛ

Групи по показател Брой лица Средна преживяемост, мес

Стандартна грешка

95% доверителен интервал (долна и горна граници)

Пол: жени 44 25,40 6,52 12,62 38,18

мъже 53 15,46 4,10 7,43 23,49

Възраст от 18 до 44 год. 31 29,90 1,24 13,84 45,97

Възраст от 45 до 64 год. 35 18,23 4,65 9,11 27,35

Възраст над 65 год. 31 4,00 1,23 3,53 8,35

BMB ≤ 50% 29 12,68 2,56 7,66 17,70

BMB > 50% 68 17,89 4,02 10,02 25,77

Leu < 100 х 109 73 23,74 4,82 14,28 33,19

Leu > 100 х 109/L 24 6,68 1,48 3,78 9,59

Без органни усложне-ния 56 27,95 5,27 17,62 38,27

С органни усложнения 41 6,94 3,26 ,54 13,34


За провеждане на анализа са избрани крите-рии, за които с помощта на log-rank test е дока-зано, че имат прогностично значение по отноше-ние на преживяемостта на болни с ОМЛ. Крите-риите са: възраст на пациентите по време на диагностициране, брой на левкоцитите в пери-ферната кръв, цитогенетични прогностични групи („кариотип”) и наличието на органни усложнения. Критерите „пол” и „процент на бласти в костен мозък” са отхвърлени, понеже не са открити ста-тистически достоверни разлики в преживяемост-та на двата пола и при болните с BMB ≤ 50% и с BMB > 50%.

Коефициентите на корелация показват, че между избраните от нас прогностични фактори съществува слаба положителна корелация, кое-то говори за еднопосочното им действие (табл. 3). Получените резултати от корелационния ана-лиз на Pearson изключват функционалната зави-симост между посочените фактори. Отсътствие-то на функционална зависимост потвърждава, че избраните от нас фактори имат независимо прогностично значение. Кариотипът на нашите пациенти е независим и не е свързан функцио-нално с други прогностични фактори.

Таблица 3. Резултати от корелационния анализ на чети-рите независими прогностични фактора (Pearson Correlation)

Фактори Възраст Лев-коци-ти

Карио-тип

Услож-нения

Възраст 1 0,132 0,290 0,183

Левкоцити 0,132 1 0,137 0,138

Кариотип 0,290 0,137 1 0,436

Усложнения 0,183 0,138 0,436 1

Мултивариантен регресионен анализ на Cox За доказване на тежестта на всеки избран от

нас прогностичен фактор при съвместното им въздействие върху OS на пациентите беше изб-ран мултивариантен регресионен анализ на Cox.

След третата стъпка на регресионен анализ за значими бяха признати следните фактори: въз-растови групи, групи по кариотип и групи със и без органни усложнения (табл. 4). За всяка група беше изчислен коефициент В (Exp B), отразяващ тежестта на всеки фактор по групи.

Наличието на органни усложнения носи най-високия риск по отношение на OS. Наблагоприят-ните аберации в кариотипа се нареждат на второ място по силата на въздействието. Напредналата възраст е трети лимитиращ фактор за OS.

Обсъждане Случаите с ОМЛ се увеличават с напредва-

нето на възрастта: те варират от 0.7 до 3.9 на 100.000 население до 60-годишна възраст и от 6,7 до 19,2 на 100 000 население след 60-годишна възраст [16]. Като цяло делът на нор-мални кариотипи нараства с възрастта, но при различните възрастови групи се наблюдава раз-лично разпределение на хромозомните аберации: при по-младите преобладават балансираните пре-устройства, включително имащи диагностично значение, а при възрастните пациенти нараства делът на небалансираните аномалии [3, 16]. Спе-цифичната структура на цитогенетичните анома-лии при отделни възрастови групи по всяка веро-ятност е свързана с различия в биологията на ОМЛ при младите и по-възрастните пациенти.

При нашите болни, както и в горепосочените проучвания, се наблюдава нарастване на случа-ите с нормален кариотип с напредването на въз-растта (35% под 45 години срещу 42% над 66 години). Но като дял от кариотипи със стандартен риск, нормалните преобладават значимо при мла-дите пациенти в сравнение с възрастните (87,5% срещу 57,6%). Тези две противоположни тенден-ции са свързани с това, че при младите болни в сравнение с възрастните е по-висок процентът на балансираните аберации с добър прогностичен ефект и аберации с лош прогностичен ефект, за сметка на аберации със стандартен риск. Трябва

Таблица 4. Окончателен резултат от мултивариантен регресионен анализ на Cox. Трета съпка

B SE Sig. Exp(B) 95,0% CI for Exp(B)

Lower Upper

Step 3 Кариотип І група ,069

Кариотип ІІ група 1,044 ,463 ,024 2,342 1,147 7,044

Кариотип ІІІ група 1,093 ,513 ,033 2,982 1,091 8,148

Усложнения 1,331 ,289 ,000 3,784 2,147 6,668

Възраст І група ,039

Възраст ІІ група ,286 ,288 ,321 1,331 ,757 2,342

Възраст ІІІ група ,749 ,299 ,012 2,116 1,177 3,802


да се отбележи, че процентът на „лоши” абера-ции при нашите пациенти в млада възраст (32,5%) е по-висок от този в голямото проучване на U. Bacher и съавт. (2005), включващо 2555 болни с ОМЛ (20,7%). Не е ясно, какъв точно фактор на средата способства за появата на по-висок процент на небалансираните аберации с лош прогонстичен ефект при нашите болни до 45-годишна възраст.

С напредването на възрастта намалява CRD и OS на нашите болните с ОМЛ, което съответс-тва на литературните данни [6, 9, 18]. Но имайки предвид, че само при 24% от нашите болни от третата възрастова група се откриват хромозом-ни аберации с висок прогностичен риск, можем да предположим, че водеща роля в патогенеза на ОМЛ при възрастните играят други генетични и епигенечини фактори. Така A. V. Rao и съавт. (2009) посочват, че при по-възрастните вероят-ността за активацията на RAS, Src и TNF сигнал-ни трансдуктни пътища е по-висока в сравнение с другите възрастови групи [15].

J. Grimwade и съавт. на XIV конгрес на EHA в Берлин (2009) са изнесли данни за 5635 болни с ОМЛ до 59-годишна възраст, окончателно опре-деляйки прогностичните групи въз основа на цитогенетичните аберации като независим фак-тор [10]. В нашето изследване се наблюдава същата закономерност: кариотипните находки са независим прогностичен фактор, който е свързан с CRD и OS на болните с ОМЛ.

Такива фактори, като пол и процент на блас-тите в костен мозък по време на диагностицира-не, в нашето проучване нямат достоверно прог-ностично значение, което съответства на лите-ратурните данни [18].

Както и други автори [4, 8, 13], които предла-гат различни рискови граници за броя на левко-цитите (от 20 х 109/L до 100 х 109/L), ние сме изпробвали различни варианти и установихме, че CRD и OS на болните с брой на левкоцитите ≥ 100 х 109/L са достоверно по-ниски от тези с ≤ 100 х 109/L. Последните проучвания на междуна-родни кооперативни изследователски групи пот-върждават нашите данни [13].

В наскоро излязло италианско ръководство за мениджмънт и лечение на болните с ОМЛ е постигнат консенсус по въпроса за риска от ор-ганни усложнения [13]. Нашите резултати подк-репят изводите на италианската група, че нали-чието на поне едно органно усложнение по кри-терия на Charlson, модифициран от Sorror за хемотологични заболявания е значим прогности-чен фактор по отношение на OS.

В достъпната за нас литература се откриват само отделни проучвания, в които изследова-

телските групи поставят за цел определянето на прогностичната тежест на различни медико-биологични фактори при съвместното им въз-действие върху болните с ОМЛ [2, 4]. Тези изс-ледвания най-често са свързани с опити да бъ-дат разработени точкови системи за изчислява-нето на риска, определящ избора на терапията, в това число трансплантация на стволови хемо-поетични клетки. Авторите отбелязват, че небла-гоприятните цитогенетични находки са по-тежък рисков фактор от напредналата възраст на бол-ните с ОМЛ, което съответства на получените от нас данни [2, 4].

Факторът „брой на левкоцитите ≥ 100 х 109/L” е значим за прогнозата [13], но в нашето проуч-ване е отхвърлен на втората стъпка на регреси-онен анализ, като имащ най-малка тежест в сравнение с останалите три: органни усложне-ния, неблагоприятни кариотипни находки, нап-редналата възраст. Той се нарежда по тежест след фактора „възраст над 65 г.”.

БИБЛИОГРАИФЯ

1. A p p e l b a u m , F. R. et al. Age and acute myeloid leuke-mia. – Blood, 107, 2006, № 9, 3481-3485.

2. A r m a n d , P. et al. A Prognostic Score for Patients with Acute Leukemia or Myelodysplastic Syndromes Undergoing Allogeneic Stem Cell Transplantation. – Biol. Blood Marrow Transplant., 14, 2008, № 1, 28-35.

3. B a c h e r , U. et al. Population-based age-specific inci-dences of cytogenetic subgroups of acute myeloid leukemia. – Haematologica, 90, 2005, № 11, 1502-1510.

4. B r e e m s , D. A. et al. Prognostic Index for Adult Patients With Acute Myeloid Leukemia in First Relapse. – J. Clin. Oncol., 23, 2005, № 9, 1969-1978

5. C h e n , C. C. et al. Pretreatment prognostic factors and treatment outcome in elderly patients with de novo acute myeloid leukemia. – An. Oncol., 16, 2005, 1366-1373.

6. E r b a , H. P. Prognostic Factors in Elderly Patients with AML and the Implications for Treatment. – Hematology, 2007, № 1, 420-427.

7. E t i e n n e , A. et al. Comorbidity is an independent predic-tor of complete remission in elderly patients receiving induc-tion chemotherapy for acute myeloid leukemia. – Cancer, 109, 2007, № 7, 1376-1383.

8. F a r a g , S. S. et al. Pretreatment cytogenetics add to other prognostic factors predicting complete remission and long-term outcome in patients 60 years of age or older with acute myeloid leukemia: results from Cancer and Leukemia Group B 8461. – Blood, 108, 2006, № 1, 63-73.

9. F e r r a r a , F. Unanswered questions in acute myeloid leu-kaemia. – Lancet Oncol., 5, 2004, № 1, 443-450.

10. G r i m w a d e , J. et al. Refinement of cytogenetic classifica-tion in AML: determination of prognostic significance of rear recurrent chromosomal abnormalities amongst 5635 younger adults treated in UK MRC trials. 14-th Congress of EHA, Berlin, 2009, Abstracts, 533.

11. K e r n , W. et al. Early blast clearance by remission induc-tion therapy is a major independent prognostic factor for both achievement of complete remission and long-term out-come in acute myeloid leukemia: data from the German AML Cooperative Group (AMLCG) 1992 Trial. – Blood, 101, 2003, № 1, 64-70.


12. M a u r i t z s o n , N. et al. Survival time in a population-based consecutive series of adult acute myeloid leukemia – the prognostic impact of karyotype during the time period 1976–1993. – Leukemia, 14, 2000, 1039-1043.

13. M o r r a , E. et al. Clinical management of primary non-acute promyelocytic leukemia acute myeloid leukemia: practice Guidelines by the Italian Society of Hematology, the Italian Society of Experimental Hematology and the Italian Group for Bone Marrow Transplantation. – Haematologica, 94, 2009, № 1, 102-112.

14. M r o z e k , K., N. A. Heerema et C. Bloomfield. D. Cytoge-netics in acute leukemia. – Blood Reviews, 18, 2004, № 1, 115-136.

15. R a o , A. V. et al. Age-Specific Differences in Oncogenic Pathway Dysregulation and Anthracycline Sensitivity in Pa-tients With Acute Myeloid Leukemia. – J. Clin. Oncol., 27, 2009, № 33, 5580-5586.

16. S c h o c h , Cl. Et al. Dependence of age-specific incidence of acute myeloid leukemia on karyotype. – Blood, 98, 2001, № 12, 3500.

17. S o r r o r , M. L. et al. Hematopoietic cell transplantation–specific comorbidity index as an outcome predictor for pa-tients with acute myeloid leukemia in first remission: com-bined FHCRC and MDACC experiences. – Blood, 110, 2007, № 13, 4606-4613.

18. W a h l i n , A., B. Markevärn, I. Golovleva et M. Nilsson. Im-proved outcome in adult acute myeloid leukemia is almost entirely restricted to young patients and associated with stem cell transplantation. – Eur. J. Haematol., 68, 2002, № 1, 54-63.


Светлана Ангелова Лаборатория по цитогенетика и молекулярна биология НСБАЛХЗ ул. „Пловдивско поле” № 6 1756 София

02б/ 9701133 e-mail: [email protected]


МОЛЕКУЛЯРЕН КОНТРОЛ НА ЛЕЧЕНИЕТО С IMATINIB ПРИ БОЛНИ С ХРОНИЧНА МИЕЛОИДНА ЛЕВКЕМИЯ

Г. Балаценко1, М. Генова1, B. Хрисчев1, А. Лилова1, Г. Михайлов1, Ж. Грудева-Попова2, К. Александрова3, А. Антонов4 и И. Мичева5

1Национална специализирана болница за активно лечение на хематологични заболявания – София 2Клиника по онкология и хематология, УМБАЛ “Св. Георги” – Пловдив

3Хематологична клиника, УМБАЛ „Александровска” – София 4Клиника по хематология, МБАЛ – Плевен

5Клиника по хематология, УМБАЛ "Света Марина" – Варна

MOLECULAR CONTROL OF TREATMENT WITH IMATINIB IN PATIENTS WITH CHRONIC MYELOIF LEUKEMIA

G. Balatzenko1, M. Guenova1, V. Hristchev1, A. Lilova1, G. Mihailov 1, J. Grudeva-Popova2, K. Alexandrova3, A. Antonov4 and I. Micheva5

Клинките на английски

Резюме. Количественото изследване на BCR-ABL транскриптите широко се използва за оценка на терапевтичния отговор при хронична миелоидна левкемия (ХМЛ). Тъй като в нашата страна липс-ват проучвания в тази насока, ние изследвахме нивото на BCR-ABL при 93 пациенти (43 жени; 50 мъ-же) в различни стадии на ХМЛ, по време на лечение с Imatinib (IM) като втора линия на лечение, както и в пробите от 10 болни в хронична фаза (ХФ), взети към момента на диагнозата. Наличието и ко-личеството на BCR-ABL беше определено чрез двуетапна (д) RT-PCR и количествена (к) RT-PCR. Чрез д-RT-PCR бяха обособени 2 групи болни: (І) с отчетлива редукция на BCR-ABL, вкл. негативира-нето им (n = 56; 60,2%); (ІІ) без какъвто и да е молекулярен отговор (МО) (n = 37; 39,8%), вкл. и 8 (8.6%) с бластна криза (БК). Чрез к-RT-PCR нивото на BCR-ABL/ABL в контролната група с ХФ преди лечение показа 71.2 ± 23.2%. В І-та група, BCR-ABL/ABL беше значително по-ниско (0.58 ± 1.2%), като при 31 (33,3%) бяха намерени нива ≤ 0.1% [голям МО (ГМО)], при 5 (5.4%) отсъствие на BCR-ABL и по 2-та метода [пълен МО (ПМО)], а при 21 – редукция на BCR-ABL/ABL между 5.0 и 0.22%. Преди 18-ия месец, МО беше намерен при 7/37 (18.9%) болни, докато след 18-ия – при 29/56 (51.8%), вкл. и 5 с ПМО (р = 0.002). Във ІІ-та група, BCR-ABL/ABL при БК бяха значително по-високи спрямо ХФ (102.6 ± 10.3% vs 71.2 ± 23.2%), докато при хематологичен и/или цитогенетичен отговор – по-ниски (30.0 ± 15,6%). В заключение, резултатите от нашето проучване в съответствие с утвърждаването на ГМО като прогностичен фактор, корелиращ с извънредно нисък риск от прогресия на ХМЛ, определят молеку-лярния мониторинг като ключов елемент от оптимизирането на терапевтичното поведение.

Ключови думи: хронична миелоидна левкемия, BCR-ABL, Imatinib mesylate, количествена PCR, молеку-лярен отговор, минимална резидуална болест

Summary. Quantitative assessment of BCR-ABL transcripts is a common approach for therapeutic response monitoring in chronic myeloid leukemia (CML). In our country, evaluation of the clinical relevance has not been conducted so far. Therefore, we analysed 93 CML patients (pts) (43 females; 50 males) at different disease stages, at different time-points during the treatment with Imatinib (IM) as a second-line therapy. A control group

Г. Балаценко, М. Генова, В. Хрисчев... Молекулярен кнотрол на лечението... 81

of 10 pts in chronic phase (CP) at the time of diagnosis was also included. Detection and quantitative assess-ment of BCR-ABL transcripts were performed using nested RT-PCR (N-RT-PCR) and quantitative RT-PCR (Q-RT-PCR). By applying N-RT-PCR, 2 groups were clearly distinguished: (group І) pts with a distinct reduction of BCR-ABL transcripts, including cases with a negative BCR-ABL result (n = 56; 60,2%); and (group ІІ) pts without visible molecular response (МR) (n = 37; 39,8%), including 8 (8.6%) cases with blast crisis (BC). Using Q-RT-PCR, the value of BCR-ABL/ABL ratio was determined. The mean ratio was 71.2 ± 23.2% in the control group of pts in CP prior therapy. In group І, BCR-ABL/ABL was significantly lower (mean = 0.58 ± 1.2%), including 31 (33,3%) pts with values ≤ 0.1% [Major МR (MМR)], 5 (5.4%) – with no detectable BCR-ABL by both methods [Complete МR (CМR)], and 21 pts with BCR-ABL/ABL levels between 5.0% and 0.22%. In the first 18 months of treatment, МR was found in 7/37 (18.9%) pts, while after the 18th month – in 29/56 (51.8%), including 5 cases with CMR (р = 0.002). In group ІІ, the mean BCR-ABL/ABL value in BC samples was significantly higher in comparison to CP (102.6 ± 10.3% vs 71.2 ± 23.2%). In contrast, patients with hematological and/or cytogenetic response in the same group were characterised by significantly lower values (mean = 30.0 ± 15.6%). In conclu-sion, our results define the molecular monitoring as a key element for the optimization of therapy in the individual patient which is in agreement with the recent recognition of MMR as a major prognostic factor that correlates with an extremely low risk of CML progression.

Key words: Chronic myeloid leukemia, BCR-ABL; Imatinib mesylate; quantitative PCR; molecular response, minimal residual disease

Въведение През последните години беше постигнат зна-

чителен напредък в разбирането на молекуляр-ните нарушения при хроничната миелоидна лев-кемия (ХМЛ), което промени коренно терапев-тичния подход и прогнозата на заболяването. Установeнo беше, че характерните генетични нарушения – Филаделфийска хромозома и фу-зионните BCR-ABL транскрипти, образувани при t(9;22)(q34;q11), водят до синтез на Bcr-Abl онкоп-ротеини с повишена тирозин киназна активност (ТКА), които имат ключова роля в патогенезата на ХМЛ. Това от своя страна доведе до разработва-нето и успешното прилагане на таргетно лечениеq основаващо се на използването на селективни ТКА инхибитори, които прекъсват специфично основни-те патогенетични механизми и позволяват възс-тановяване на нормалната хемопоеза.

Imatinib mesylate (IM) е първият разработен селективен BCR-ABL инхибитор. Понастоящем, IM в дневна доза от 400 mg е стандарт за лече-нието на хроничната фаза (ХФ) на ХМЛ и се про-поръчва от European LeukemiaNet (ELN) (Baccarani и сътр., 2009] и National Comprehensive Cancer Network (NCCN) (O’Brien и сътр., 2009). Благода-рение на високата си активност препаратът поз-волява постигане на 81% свободна от събития преживяемост, 93% свободна от прогресия пре-живяемост и 86% обща преживяемост на 7-ата година от прилагането му (O’Brien и сътр., 2008).

При ХМЛ контролът на ефективността на ле-чение се основава на оценка на хематологичния, цитотогенетичния и молекулярния отговор (Baccarani и сътр., 2009; O’Brien и сътр., 2009).

Същевременно, когато IM се използва като пър-ва линия на лечение, още в края на първата година се постига пълен хематологичен отговор (ПХО) при 96% от болните и пълен цитогенети-чен отговор (ПЦО) при 59% (Druker и сътр., 2006). На 5-година, ПЦО се наблюдава при 87% и 57% от болните в зависимост от това, дали ІМ се използва като първа, или като втора линия на терапия (Druker и сътр., 2006; Hochhaus и сътр., 2008). При тези болни, единственият подход за контрол на МРБ, притежаващ достатъчно висока чувствителност, е полимеразноверижната реак-ция (PCR) след обратна транскрибция (RT) (Muller и сътр., 2009). В практиката като опти-мални за тази цел се приемат 2 метода: (1) ко-личествената Real-Time PCR, която позволява бързо, прецизно и с намален риск от контамина-ция да се определи точното количество на фузи-онните BCR-ABL транскрипти; и (2) двуетапна PCR (nested PCR) – при пациенти, при които не се установяват BCR-ABL при количественото изследване (Hughes и сътр., 2006). Получените резултати са с доказана прогностична значимост и са ключов елемент от оптимизирането на те-рапевтичното поведение при отделния болен (Hughes и Branford, 2009).

В нашата страна до настоящия момент липс-ват системни количествени проучвания върху нивото на BCR-ABL при болни с ХМЛ. Поради тази причина ние поставихме за цел да се апро-бира в практиката метод за количествено изс-ледване на BCR-ABL и да се определи тяхното ниво на различни стадии на заболяването и да се проследи молекулярният отговор към IM, из-ползвайки критериите на ELN.


Материали и методи В проучването бяха включени 93 пациенти (43

жени; 50 мъже) с ХМЛ на средна възраст 47.9 ± 15.4 години, лекувани с IM, като втора линия на лечение. Към момента на изследването, продъл-жителността на лечението при отделните болни беше както следва: 3 месеца (n = 3); 6 месеца (n = 12); 12 месеца (n = 10); 18 месеца (n = 12); 24 ме-сеца (n = 16); 36 месеца (n = 14); 48 месеца (n = 16); 60 месеца (n = 10). Петдесет и четири от бол-ните бяха от НСБАЛХЗ – София, а останалите 39 – от други хематологични клиники в страната. В про-учването бяха включени и проби от 10 болни с ХМЛ, взети към момента на диагнозата, като конт-ролна група за определяне на изходното ниво на BCR-ABL преди започване на лечение.

Молекулярният отговор беше определен чрез изследване на тотална РНК, екстрахирана от мононуклеорни клетки (МНК), сепарирани от костен мозък или периферна кръв след селективна лиза на еритроцитите, чрез Trizol (Invitrogen) или с колони NucleoSpin RNA (MACHEREY-NAGEL), в случаите, когато количеството на МНК беше малко. Комплементарна ДНК (кДНК) беше синте-зирана чрез обратна транскрибция на 1 µg РНК, използвайки случайни хексамерни олигонуклео-тиди и MMLV обратна транскриптаза.

Началното скринингово изследване на BCR-ABL транскриптите беше проведено чрез качест-вена двуетапна мултиплексна RT-PCR с коамп-лификация на β-Actin като вътрешна контрола, използвайки праймери и режим на амплифика-ция, препоръчани от Европейската програма за стандартизиране на изследванията на МРБ – Biomed 1 (Van Dongen и сътр., 1999). Чувстви-телността на реакцията при първия етап на PCR беше определена посредством амплификация на серийни десетични разреждания на РНК от

клетъчна линия K562, като максималното раз-реждане, даващо отграничим продукт на реакци-ята, беше 0,1% (фиг. 1). Всички проби, показали отрицателен или слабо положителен резултат, бяха подложени на реамплификация с вътрешни праймери (nested PCR).

Количественото определяне на BCR-ABL беше проведено чрез количествена Real-Time PCR, ос-новаваща се на използването на Taqman сонди, посредством FusionQuant Kit BCR-ABL Mbcr (Ipsogen), FusionQuant Kit ABL (Ipsogen), pеакционна среда Taqman PCR Master Mix (Bioer) и Real-Time Thermocycler Corbett RotorGene, съглас-но препоръките на Европейската програма Europe Against Cancer (Gabert и сътр., 2003). Количеството на фузионните BCR-ABL и нормалните ABL транс-крипти беше определено чрез построяване на стандартна крива, използвайки серийни разрежда-ния на плазмидни стандарти, съдържащи точно определен брой копия от съответния маркер, въз основа на Ct (threshold cycle) – поредния цикъл, при който флуоресцетната емисия, генерирана от Taqman сондата по време на амплификацията, надвиши фоновия сигнал (фиг. 2).

Резултатите бяха представени като процент на количеството на фузионните от това на нор-малните транскрипти (BCR-ABL/ABL).

Mолекулярният отговор (МО) беше дефини-ран, както е в препоръките на ELN, както следва: (1) пълен МО (ПМО) – отсъствие на BCR-ABL транскрипти чрез количествена и/или двуетапна RT-PCR при две последователни изследвания с чувствителност на реакцията > 104; (2) голям МО (ГМО) – съотношение на фузионните транскрип-ти BCR-ABL към нормални транскрипти ABL ≤ 0,1% (в настоящото проучване стойностите са представени като абсолютна стойност, без да са преобразувани съгласно международната скала) (Baccarani и сътр., 2009).

Таблица 1. Молекулярен отговор на различни етапи от лечението с IM при болни с ХМЛ

Лечение

Месеци Болни с молекулярен отговор Болни без молекулярен отговор

Общо изследвани

болни

ПМО ГМО Общо Отслабване 0.1% ÷ 10% Без отговор Прогресия Общо

3 0 0 0 0 3 [100%] 0 3 [100%] 3 [100%]

6 0 0 0 5 [41.7%] 4 [33.3%] 3 [25.0%] 12 [100%] 12 [100%]

12 0 2 [20.0%] 2 [20.0%] 2 [20.0%] 5 [50.0%] 1 [10.0%] 8 [80.0%] 10 [100%]

18 0 5 [41.7%] 5 [41.7%] 3 [25.0%] 2 [22.2%] 2 [22.2%] 7 [58.3%] 12 [100%]

24 1 [6.2%] 7 [43.8%] 8 [50.0%] 3 [18.8%] 4 [25.0%] 1 [6.2%] 8 [50.0%] 16 [100%]

36 0 5 [35.7%] 5 [35.7%] 3 [21.4%] 5 [35.7%] 1 [7.2%] 9 [64.3%] 14 [100%]

48 1 [6.2%] 6 [37.5%] 7 [43.7%] 5 [31.2%] 4 [25.0%] 0 9 [56.3%] 16 [100%]

60 3 [30.0%] 6 [60.0%] 9 [90.0%] 0 1 [10.0%] 0 1 [10.0%] 10 [100%]

Общо 5 [5.4%] 31 [33.3%] 36 [38.7%] 21 [22.6%] 28 [30.1%] 8 [8.6%] 57 [61.3%] 93 [100%]


Фиг. 1. Скриниг за BCR-ABL транскрипти чрез качествена PCR. Отсъствие на различие в интензивността на продукта на амплификация на 100% и 10% на положителната контрола – клетъчна линия К562 (b3a2). Отчетливо разграничаване на разреждане 0,1% на K562. Силно положителна реакция за BCR-ABL при 2-ма пациенти, с интензивност, еднаква с тази на вътрешната контрола (β-Actin) положителната контрола

BCR-ABL

Фиг. 2. Стандартна крива на серийни разреждания на BCR-ABL(+) плазмидни стандарти и концентрация на BCR-ABL при пациенти (означени със стрелки), лекувани с IM, получени при количествена Real-Time PCR

Резултати Оценка на нивото на BCR-ABL чрез качест-

вена двуетапна PCR При 37 (39,8%) от пациентите беше устано-

вено отсъствие на какъвто и да е молекулярен отговор – силно изразена реакция, съответства-ща на експресията на 10-100% разреждане на РНК от клетъчна линия К562. При 8 (8.6%) от тези болни беше наблюдавана прогресия на заболяването с развитие на бластна криза на фона на провежданото лечение.

При останалите 56 (60,2%) болни беше уста-новено отчетливо отслабване на експресията на фузионните транскрипти, от които при 20 (21,3%) – интeнзивността на реакцията съответстваше на около 1% BCR-ABL(+), при 31 (32,6%) – на 0.1% BCR-ABL(+), а при 5 (5,3%) болни не бяха дока-зани BCR-ABL транскрипти, включително и след реамплификация (пълен молекулярен отговор).

Оценка на нивото на BCR-ABL чрез коли-чествена Real-Time PCR

Нивото на BCR-ABL беше определено чрез количествена Real-Time PCR при следните групи

болни: [i] 10 с хронична фаза към момента на диагнозата, преди започване на лечение; [ii] при 8 по време на бластна криза; [iii] при 7 със силно изразена експресия на BCR-ABL при постигнат пълен хематологичен отговор и/или минорен цито-генетичен отговор; [iv] при 56 с отчетливо нама-ление на BCR-ABL по време на лечение с IM.

При BCR-ABL(+) болни в хронична фаза (n = 10) средната стойност на BCR-ABL/ABL към мо-мента на диагнозата беше определена като 71.2 ± 23.2%.

При BCR-ABL(+) болни, без какъвто и да е молекулярен отговор и c прогресия на заболява-нето и развитие на бластна криза на фона на провежданото лечение (n = 8), средно 19,5 ме-сеца от започването му (граници 6-36 мес.), средната стойност на BCR-ABL/ABL беше значи-телно по-висока от намерената по време на хро-ничната фаза – 102.6 ± 10.3% (р = 0,002).

При болни със силно изразена експресия, но с постигнат пълен хематологичен отговор и/или минорен цитогенетичен отговор (n = 7), средното ниво на BCR-ABL/ABL беше значително по-ниско 30.0 ± 15,6% (р = 0.001).

Контрола(+):K562

β-Actin

10% 1% 0.1% Контрола(-)

BCR-ABL

Пациент ХМЛ b2a2

Пациент ХМЛ b3a2

100%


При всички болни с установена редукция на фузионните транскрипти при качествената PCR (n = 56), находката беше верифицирана с коли-чествена PCR, като средното ниво на BCR-ABL/ABL в тази група беше 0.58 ± 1.2%. В зави-симост от намерените резултати, болните бяха обособени в подгрупи, както следва:

(1) Болни с молекулярен отговор [n = 36; (38.7%)], от които:

• При 29/36 беше намерено BCR-ABL/ABL ≤ 0.1%, съответстващо на ГМО (средно 0.06 ± 0.03%). Към същата група бяха отнесени и други 2/36 болни, при които количественото изследва-не не показа BCR-ABL транскрипти, въпреки наличието на слабоположителна реакция при двуетапна PCR;

• При 5/36 не бяха намерени фузионни транскрипти и чрез двата подхода – пълен моле-кулярен отговор.

При всички болни от тази група, при които е било проведено цитогенетично изследване, е установен пълен цитогенетичен отговор.

(2) При останалите 21 беше установено отс-лабване на експресия, без да покрива критерии-те за молекулярен отговор - BCR-ABL/ABL между 5.0% и 0.22% (средно 1.41±1.56%).

Оценка на молекулярния отговор в зависи-мост от продължителността на провеждано-то лечение

При нито един от изследваните болни на 3-тия и 6-ия месец от лечението не беше отчетен молекулярен отговор. За пръв път ГМО беше доказан на 12-ия месец от лечението, а ПМО – на 24-тия месец.

След 12-ия месец се наблюдава отчетливо нарастване на относителния дял да болните с МО, който се запазва относително постоянен между 24-48-ия месец (20.0% на 12-ти месец vs 35.7-50.0% на 24-48-мия месец), след което от-ново нараства на 60-ия месец (90.0%)

От всички болни с продължителност на ле-чение до 18 месеца, молекулярен отговор под формата на ГМО беше установен при 7/37 (18.9%) изследвани болни. При болни с > 18 ме-сеца лечение стабилен или подобряващ се мо-лекулярен отговор беше намерен при 29/56 (51.8%), включително 5 с ПМО (р = 0.002).

Динамика на BCR-ABL при проследяване При 10 болни екскпресията на BCR-ABL бе-

ше проследена след 12 месеца. При почти всич-ки бяха наблюдавани известни колебания в аб-солютната стойност на BCR-ABL/ABL в посока нарастване или намаляване. При нито един от болните, включително и при тези с ГМО, нараст-ването не достигаше 10 пъти (фиг. 3).

0,01

0,1

1

10

100

BCR-ABL/ABL %

12 мес. Фиг. 3. Динамика в стойността на BCR-ABL/ABL при прос-ледяване

Обсъждане В настоящото първо за страната проучване

беше изследвано нивото на BCR-ABL транскрип-тите при болни с ХМЛ на различни стадии на заболяването и по време на лечение с IM.

При количественото определяне на eкспре-сията на BCR-ABL в проби, взети към момента на диагнозата, бяха намерени значителни вари-ации в нивото на фузионните транскрипти [BCR-ABL/ABL: 31.9-104.3%], които не могат да бъдат разграничени посредством конвенционалните качествени PCR техники и които трябва да се имат предвид при по-нататъшното проследяване на болните (Rosti и сътр., 2003).

При бластна криза средната стойност на BCR-ABL/ABL значително надвишава тази, уста-новена по време на хроничната фаза. Това под-чертава значението на експресията на BCR-ABL, респективно – на абсолютното количество син-тезиран химерен онкопротеин, за вида и степен-та на биологичните нарушения, които настъпват в клетката, което от своя страна рефлектира върху клиничния ход на заболяването. Това е важно от практическа гледна точка, тъй като наличието на високи нива на Bcr-Abl при напред-нали стадии на заболяването може да бъде при-чина за бързото развитие на резистентност (Barnes и сътр., 2005). От друга страна, фактът, че не при всички болни с прогресия се установя-ва свръх-експресия на фузионния ген, подкрепя идеята, че в трансформацията на хроничната фаза участват различни по своята същност ме-ханизми (Zhang, 2008).

По време на лечение с IМ се наблюдава об-ратна зависимост – постепенно намаляване на количеството на транскриптите в зависимост от индивидуалния отговор и продължителността на провежданата терапия. Поради тази причина определянето на нивото на BCR-ABL е един от ключовите елементи при оценката на терапев-


тичния отговор към IМ, особено при болни с пос-тигнат ПЦО.

Чрез количествена real-time PCR ПМО беше установен при 7 болни, като само при 5 (5.4%) от тях фузионни транскрипти не бяха установени и чрез качествена двуетапна PCR, докато при ос-таналите 2-ма беше наблюдавана слабо поло-жителна реакция, съответстваща на минимални количества BCR-ABL. Нееднозначните резултати се обясняват с различието в чувствителността на двата метода, която при двуетапната "nested" PCR е около 10 пъти по-висока (Hughes и сътр., 2006). Това е причината, към групата на пациен-тите с ПМО да се отнасят само тези, при които е установен негативен BCR-ABL резултат и чрез двата подхода (Baccarani и сътр., 2009).

Намерената от нас честота на ПМО (5.4%) трудно може да се съпостави с установената в други проучвания, в които данните варират в значителна степен от 4 до 34% (Baccarani и сътр., 2009). От една страна, възможността да се докажат BCR-ABL транскипти зависи до голяма степен от качеството на получената РНК, ефек-тивността на обратната транскрипция и чувстви-телността на използваните лабораторни техники. Това от своя страна е причината някои болни да имат неустановими транскрипти при едни изс-ледвания и наличие на такива при други. От дру-га страна, относителният дял на болните с ПМО може да варира в зависимост от продължител-ността на проследяването, тъй като както в на-шето, така и в други проучвания, честотата на ПМО е ниска през първите няколко години след започване на лечение с IM (Branford и сътр., 2007). И не на последно място, вероятността за постигане и стабилността на ПМО е непосредст-вено свързана с ранното постигане на ГМО [Hughes и Branford, 2009).

Доколко постигането на ПМО има специфич-на клинична значимост, все още е обект на дис-кусии. При пациенти, при които IM е приложен като втора линия на терапия, се съобщава, че болните с ПМО имат по-благоприятна свободна от рецидив преживяемост и отсъствие на пос-ледващ неуспех от лечението, ако ПМО е запа-зен 6 или повече месеца. По отношение на бол-ните, при които IM е приложен като първа линия, прогностичното значение на ПМО не е потвър-дено (Hughes и Branford, 2009).

С най-голямо практическо значение остава доказването на ГМО (BCR-ABL/ABL ≤ 0.1%). Той, съгласно препоръките на ELN е белег на опти-мален отговор, показващ че терапията ще осигу-ри максимална преживяемост, която понастоя-щем след 6-7-годишно лечение се доближава до 100% (Baccarani и сътр., 2009). Относителният

дял на пациентите с постигнат ГМО в нашето проучване е 33.3%, като e по-нисък от този, кой-то се съобщава в други проучвания, вариращ между 43% (Kantarjian и сътр., 2004) и 67% (Hess и сътр., 2008).

Съпоставянето на относителния дял на бол-ните с постигнат ГМО на ранните етапи от лече-нието в нашето проучване (20.0% на 12-ия ме-сец; 41.7% на 18-ия месец; 50.0% на 24-тия ме-сец) показва по-ниски стойности от тези, устано-вени от други автори. Така например, Hughes и сътр., 2003 съобщават за постигнат ГМО на 12-ия месец при 39%, а O'Brien и сътр., 2008 – на 18-ия месец при 63-65%. Една от вероятните причини за тези различия са вариациите в про-дължителността на периода от диагнозата до започване на лечение с IМ. Тази хипотеза се подкрепя от данните на Jiang и сътр., 2010. Те съобщават честота на ГМО на 12-ия и 18-ия ме-сец съответно 25% и 37% при пациенти, при които лечението е започнало след ≥ 6 месеца от диагнозата, докато, когато този период е < 6 месеца, намерените стойности са значително по-високи – съответно 48% и 60%. Сходни са и дан-ните на Palandri и сътр., 2007 – когато лечението с IM е започнало < 1 година от диагнозата, чес-тота на ГМО на 12-ия, 24-тия, 36-ия и 60-ия ме-сец е съответно 74%, 78%, 82% и 72%. Същев-ременно, когато този период е > 1 година, стой-ностите са 46%, 53%, 70% и 68% (Branford и сътр., 2007).

Съгласно препоръките на ELN наличието на ГМО е благоприятен прогностичен фактор, коре-лиращ с извънредно нисък риск от прогресия на заболяването (Baccarani и сътр., 2009). Същев-ременно клиничната значимост на отсъствието на ГМО е различна в зависимост от продължи-телността на провежданото лечение, като с най-голяма практическа информативност по отноше-ние на клиничното поведение и прогнозата е оценката на молекулярния отговор на 12-ия и след 18-ия месец от лечението. В нашето проуч-ване на 12-ия месец при 80.0% от болните не беше постигнат ГМО, което е алармиращ белег, най-вероятно свързан с по-късното започване на терапията с IM при голяма част от пациентите (Baccarani и сътр., 2009).

След 18-ия месец от лечението около поло-вината от изследваните от нас болни бяха без ГМО. Съгласно препоръките на ELN отговорът към терапията при тези пациенти е субоптима-лен. При тях вероятността за постигане на опти-мален лечебен резултат в далечен план значимо е намалена, поради което те са подходящи за алтернативни терапевтични подходи, първият от които е прилагане на второ поколение тирозин-


киназни инхибитори (Nilotinib, Dasatinib). (Baccarani и сътр., 2009).

В заключение, количественото изследване на BCR-ABL чрез Real-Time PCR e бърз и прецизен метод за определяне на броя на фузионните тран-скрипти и проследяване на тяхната динамика. В допълнение, получените чрез него резултати се влияят в много по-малка степен от външни факто-ри, които са критични при качествената двуетапна PCR, като риск от контаминация, наличие на дег-радационни процеси, вариации в количеството на РНК и/или в ефективността на амплификацията и др. Значимостта на методите на молекулярен кон-трол на отговора към терапията при пациентите с ХМЛ нарасна много през последните години, осо-бено с утвърждаването на ГМО като прогностичен фактор, корелиращ с извънредно нисък риск от прогресия на заболяването.

Благодарност. Настоящето проучване е осъ-ществено с финансовата подкрепа на Фонд “Научни изследвания” към Министерството на образование-то, младежта и науката – Проект №ВУ–Л-318/07


1. B a c c a r a n i , M. et al. European LeukemiaNet. Chronic myeloid leukemia: an update of concepts and management recommendations of European LeukemiaNet. – J. Clin. On-col., 27, 2009, № 35, 6041-6051.

2. O ' B r i e n , S. et al. National NCCN clinical practice guide-lines in oncology: chronic myelogenous leukemia. Compre-hensive Cancer Network. – J. Natl. Compr. Canc. Netw., 7, 2009, № 9, 984-1023.

3. O ' B r i e n , S. G. et al. International Randomized Study of Interferon Versus STI571 (IRIS) 7-Year Follow-up: Sus-tained Survival, Low Rate of Transformation and Increased Rate of Major Molecular Response (MMR) in Patients (pts) with Newly Diagnosed Chronic Myeloid Leukemia in Chronic Phase (CMLCP) Treated with Imatinib (IM). Blood (ASH An-nual Meeting Abstracts) 2008. 112. Abstract 186.

4. D r u k e r , B. J. et al. Five-year follow-up of patients receiv-ing imatinib for chronic myeloid leukemia. – N. Engl. J. Med., 355, 2006, № 23, 2408-2417.

5. H o c h h a u s , A. et al. Favorable long-term follow-up re-sults over 6 years for response, survival, and safety with imatinib mesylate therapy in chronic-phase chronic myeloid leukemia after failure of interferon-alpha treatment. – Blood, 111, 2008, № 3, 1039-1043.

6. M ü l l e r , M. C. et al. Harmonization of molecular monitor-ing of CML therapy in Europe. – Leukemia, 23, 2009, № 11, 1957-1963.

7. H u g h e s , T. et al. Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: review and recom-mendations for harmonizing current methodology for detect-

ing BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. – Blood, 108, 2006, 28-37.

8. H u g h e s , T. P. et S. Branford. Monitoring disease re-sponse to tyrosine kinase inhibitor therapy in CML. – Hema-tology Am. Soc. Hematol., Educ, Program, 2009, 477-487.


10. G a b e r t , J. et al. Standardization and quality control stud-ies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase poly-merase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia – a Europe Against Cancer program. – Leukemia, 17, 2003, № 12, 2318-2357.

11. R o s t i , G. et al. Molecular response to imatinib in late chronic-phase chronic myeloid leukemia. – Blood, 103, 2004, № 6, 2284-2290.

12. B a r n e s , D. J. et al. Bcr-Abl expression levels determine the rate of development of resistance to imatinib mesylate in chronic myeloid leukemia. – Cancer Res., 65, 2005, № 19, 8912-8919.

13. Z h a n g , S. The role of aberrant transcription factor in the progression of chronic myeloid leukemia. – Leuk. Lym-phoma, 49, 2008, № 8, 1463-1469.

14. H e s s , G. et al. Sustained remissions and low rate of BCR-ABL resistance mutations with imatinib treatment chronic mye-logenous leukemia in patients treated in late chronic phase: a 5-year follow up. – Am. J. Hematol., 83, 2008, № 3, 178-184.

15. H u g h e s , T. P. et al. International Randomised Study of Interferon versus STI571 (IRIS) Study Group. Frequency of major molecular responses to imatinib or interferon alfa plus cytarabine in newly diagnosed chronic myeloid leukemia. – N. Engl. J. Med., 349, 2003, № 15, 1423-1432.

16. J i a n g , H. et al. Seven-year response to imatinib as initial treatment versus re-treatment in Chinese patients with chronic myelogenous leukemia in the chronic phase. – Ann. Hematol., 2010, Jul 29. [Epub ahead of print]

17. P a l a n d r i , F. et al. GIMEMA Working Party on CML. Long-term molecular responses to imatinib in patients with chronic myeloid leukemia: comparison between complete cytogenetic responders treated in early and in late chronic phase. – Haematologica, 92, 2007, № 11, 1579-1580.

18. D e L a v a l l a d e , H. et al. Imatinib for newly diagnosed patients with chronic myeloid leukemia: incidence of sus-tained responses in an intention-to-treat analysis. – J. Clin. Oncol., 26, 2008, № 20, 3358-3363.

19. B r a n f o r d , S. et al. BCR-ABL messenger RNA levels con-tinue to decline in patients with chronic phase chronic myeloid leukemiatreated with imatinib for more than 5 years and ap-proximately half of all first-linetreated patients have stable undetectable BCR-ABL using strict sensitivity criteria. – Clin. Cancer Res., 13, 2007, № 23, 7080-7085.

Адрес за кореспонденция: Доц. Д-р Георги Балаценко Лаборатория по цитогенетика и молекулярна биология Национална специализирана болница за активно лече-ние на хематологични заболявания ул. „Пловдивско поле” № 6 1756 София

9701 132


ЕКСТРАМЕДУЛАРЕН ПЛАЗМОЦИТОМ С АНГАЖИРАНЕ НА МАКСИЛАРЕН СИНУС

Цв. Василева, Л. Шемелекова, С. Христова, М.Зюмбюлева и Е. Хаджиев УМБАЛ „Александровска” – София

EXTRAMEDULLARY PLASMOCYTOMA WITH INVOLVEMENT OF THE MAXILLARY SINUS

Ts. Vassileva, L. Shemelekova, S. Hristova, M. Zyumbyuleva and F. Hadjiev University Hospital “Alexandrovska” – Sofia

Резюме. Екстрамедуларните плазмоцитоми на меките тъкани са редки и обхващат 4% от всички плазмоклетъчни неоплазми. Голяма част от тях са локализирани в назалните пътища – назална ку-хина, назофаринкс или параназалните синуси, но има описани случаи на локализация в ларинкс, тон-зиларна ямка, основата на езика, бели дробове, гастроинтестинален тракт, урогенитален тракт. В статията се представя пациент с екстрамедуларен плазмоцитом на десен максиларен синус. Пред-ставеният клиничен случай покрива критериите – наличие на солитарна туморна формация в об-ластта на десен максиларен синус, с ангажиране на болестта, липсват други костни лезии, няма продукция на моноклонален парапротеин. Той преставлява интерес поради факта, че екстрамеду-ларните плазмоцитоми са много рядко срещани в клиничната практика и клиничното им проучване е затруднено. Най-вероятно предстои в бъдеще да бъдат изучавани по-задълбочено като биология и възможности за терапевтично поведение.

Ключови думи: екстрамедуларен плазмоцитом/клиничен случай, локализации

Summary. Extramedullary plasmocytomas of the soft tissues are rare and comprise 4% of all plasma cell neo-plasms. Most of them are localized in the nasal ways – nasal cavity, paranasal sinuses or nasopharyux but there are described cases of localization in larynx, tonsillar fossa, base of the tongue, lungs, gastrointestinal tract, uro-genital tract. The article presents a patient with extramedullary plasmocytoma of the right maxillary sinus. This clinical case exhibit a solitary tumor formation in the right maxillary sinus of the disease, no other bone lesions, and production of monoclonal paraprotein. The case is interest because extramedullary plasmocytomas are very rare in clinical practice and clinical research is difficult. In future they should to studied compreheusvely in order to improve the therapy.

Key words: extramedullary plasmocytoma, maxillary sinus, diagnosis

Екстрамедуларните плазмоцитоми на меките тъкани са редки и обхващат 4% от всички плаз-моклетъчни неоплазми. Голяма част от случаите (80%) са локализирани в назалните пътища – назална кухина, назофаринкс или параназалните синуси, но има описани случаи на локализация в ларинкс, тонзиларна ямка, основата на езика, бели дробове, гастроинтестинален тракт, уроге-нитален тракт [1, 2, 3]. Възрастовата граница за развитие на болестта е между 50 и 80 год. По-често се засяга мъжкият пол. Тези тумори имат

по-добра прогноза в сравнение със солитарните костни плазмоцитоми поради по-ниската честота на трансформация в мултиплен миелом.

Представяме случай на пациент с екстрамеду-ларен плазмоцитом на десен максиларен синус.

Описание на клиничния случай Пациентът е 63-годишен мъж, при който екс-

трамедуларен плазмоцитом е диагностициран по повод появата на неболезнена формация в об-

Цв. Василева, Л. Шемелекова, С. Христова... Екстрамедуларен плазмоцитом с ангажиране... 88

ластта на дясната максила и гнойна секреция от дясната ноздра с давност една година. От про-веденото КТ изследване се установява туморна формация на горната челюст вдясно с размери 5/7 cm. Изказано е съмнение за карцином. Осъ-ществена е частична оперативна резекция на туморната формация, като хистологичното изс-ледване, включително с имунохистохимия, по-казва – плазмоцитом с висока пролиферативна активност (пролиферативният маркер Ki 67 е позитивен в 85% от туморните клетки) и преоб-ладаване на плазмобласти.

По време на първата хоспитализация в хе-матологична клиника физикалното изследване установява наличие на лицева асиметрия с ди-фузен оток на десните инфраорбитални и зигома-тична области, палпаторно неболезнени с твърда консистенция; не се установяват увеличени пе-риферни лимфни възли, слезка и черен дроб. От лабораторните изследвания: СУЕ-10 mm, Hb – 128 g/l, Er – 4,18 x 1012/l , Leu – 4,3 x 109/l, Plt – 262 x 109/l, Prot – 65 g/l, alb – 37 g/l, LDH – 218 U/L, Creat – 62 mkmol/l, Ca2+ – 2,12 mmol/l, P+ – 1,24 mmol/l. Протеинограма: alb – 57,6%, alpha 1 – 3,2%, alpha 2 – 12,5%, betta – 13,1%, gamma – 13,6%, няма данни за парапротеинемия. Имуно-електрофореза на серум и урина: не се устано-вява моноклонален парапротеин, при стойности на имуноглобулините в серума – IgG – 16,8 g/l, IgM – 1,3 g/l, IgA – 3,64 g/l. Количество белтък в 24 ч. урина – отрицателно.

Аспирационната костномозъчна биопсия и трепанобиопсията с имунохистохимично изслед-ване не показват ангажиране на костния мозък.

Рентгенологично изследване на плоски кости (череп, мандибула, таз и поясни прешлени) представя нормален костен строеж, без данни за остеолитични дефекти.

Следоперативно проведеното КТ изследване показва наличие на остатъчна туморна форма-ция на мезофаринкса и десния максиларен си-нус. Не се установяват увеличени шийни лимф-ни възли.

Въз основа на проведените изследвания при пациента няма данни за мултиплен миелом. Приета е диагнозата екстрамедуларен плазмо-цитом на десен максиларен синус.

Поради неблагоприятните прогностични фак-тори – голяма туморна маса с висок пролифера-тивен индекс и хистологичен вариант с висока степен на малигненост се започна полихимиотера-пия по схема VСР (Vincristine, Cyclophosphamid и Prednisolon) – проведени са два цикъла, послед-вани от лъчетерапия – реализирана обща доза 30 Gy, след което лъчелечението беше прекра-тено поради тежък мукозит. Продължи се с хи-

миотерапия по протокол VСАР (Vincristine, Cyclophosphamid, Farmorubicin, Prednisolon). След проведени шест курса се отчита частичен тера-певтичен отговор – редукция на туморния обем с не повече от 50% по данни от КТ изследването, без клиниколабораторни данни до края на лече-нието за трансформация в мултиплен миелом. Пациентът се проследява системно и до този момент, в продължение на 17 месеца от прик-лючване на лечението, няма данни за прогресия на болестта.

1. КТ изследване:

Фиг. 1. КТ1 – туморна формация, ангажираща десен макси-ларен синус и горна челюст, с размери 5/7 cm – при диаг-ностициране на заболяването


Фиг. 2. КТ2 – остатъчна туморна маса след проведено лечение

2. Хистологична находка (фиг. 1): Фрагмент от туморна формация, чиито клетки

показват позитивна мембранна реакция за Plasma cell и негативна за CD20. Пролиферативният мар-кер Ki67 е позитивен в 85% от туморните клетки.

Обсъждане Представеният случай описва една сравнител-

но рядка форма на плазмоклетъчна неоплазия – екстрамедуларен плазмоцитом на меките тъкани, в случая с локализация в десен максиларен синус.

Приети са следните критерии за диферен-циране на солитарния плазмоцитом от екстра-

медуларна манифестация на мултиплен миелом [1, 2, 3]:

Солитарен плазмоцитом

Екстрамедуларен плазмоцитом

1. Единично огнище на костно засягане, със-тавено от клонални плазматични клетки

1. Единична екстрамедулар-на мекотъканна маса, със-тавена от клонални плаз-матични клетки, доказани хистологично

2. Липса на ангажиране на костния мозък от болестта, доказано чрез костномозъчна биопсия

2. Липса на ангажиране на костния мозък от болестта, доказано чрез костномо-зъчна биопсия

3. Липса на костни лезии, потвърдено с рентге-нологично изследване

3. Липса на костни лезии, потвърдено с рентгеноло-гично изследване

4. Липса на анемия, хиперкалциемия или нарушена бъбречна функция

4. Липса на анемия, хипер-калциемия или нарушена бъбречна фонкция

5. Липса или ниски нива на моноклонален иму-ноглобулин в серума и урината

5. Липса или ниски нива на моноклонален имуногло-булин в серума и урината

6. Без допълнителни лезии от MRT на гръб-начен стълб

Необходимо е да се диференцира и от реак-

тивна плазмоцитоза, както и от някои неходжки-нови лимфоми, поради сходната хистологична характеристика. За целта от значение е имуно-хистохимично изследване и потвърждаване на моноклоналността на туморните клетки, чрез установяване наличието на плазматични клетки, експресиращи CD 38 и съпътстваща цитоплаз-мена експресия на капа- или ламбда-вериги. Тези имунофенотипни характеристики обикнове-но изключват реактивна плазмоцитоза. .

Eкстрамедуларните плазмоцитоми са лъче-чувствителни, което определя основното тера-певтично поведение – локална лъчетерапия- обща терапевтична доза от 40 Gy, която има отношение и към предотвратяването на локал-ните рецидиви на болестта [1, 2, 3]. Прилагане на химиотерапия се препоръчва единствено при пациенти с висок риск – с туморна маса над 5 cm или тумор с висока степен на малигненост. Прогнозата при екстрамедуларните плазмоци-томи е сравнително по-добра от тази на соли-тарните костни плазмоцитоми, тъй като рядко – едва в 30%, еволюират в системна болест, за разлика от солитарните костни плазмоцитоми – в 70% от случаите [1, 2, 3]. Около 70 % от пациен-тите преживяват над 10 години [1, 2, 3]. Перио-дът, за който настъпва прогресия, е 2-3 години. Прогресията на болестта основно се изявява

Цв. Василева, Л. Шемелекова, С. Христова... Екстрамедуларен плазмоцитом с ангажиране... 90

като мултиплен миелом, но в някои случаи може да е под формата на множество екстрамедулар-ни лезии със или без костно засягане, но без наличие на костномозъчно ангажиране [1]. Често може да има засягане на регионарните лимфни възли или костта по съседство, но в тeзи случаи поведението е както при солитарна екстрамеду-ларна лезия [1]. По отношение на прогнозата на болестта от основно значение е големината на туморната маса – размер над 5 cm е неблагоп-риятен фактор, докато засягането на регионар-ните лимфни възли или кост не се смята за неб-лагоприятен прогностичен белег [1, 3].

Представеният клиничен случай покрива ци-тираните по-горе критерии – наличие на соли-тарна туморна формация в областта на десен максиларен синус, с ангажиране на болестта, липсват други костни лезии, няма продукция на моноклонален парапротеин.

Описаният клиничен случай преставлява ин-терес поради факта, че екстрамедуларните плазмоцитоми са много рядко срещани в кли-ничната практика и клиничното им проучване е затруднено. Най-вероятно предстои в бъдеще да бъдат изучавани по-задълбочено като биология и възможности за терапевтично поведение.


1. M e l e t i o s , A. Dimopoulus, George Hamilos - Solitary Bone Plasmocytoma and Extramedullary Plasmocytoma. – Current Treatment Options in Oncology, 3, 2002, 255-259.

2. G u i d e l i n e s on the diagnosis and management of soli-tary plasmocytoma of bone and solitary extramedullary plasmocytoma. – Br. J. Haematology, 124, 717-726, 2004 United Kingdom Myeloma Forum.

3. D o n n a , M. Weber – Solitary Bone and Extramedullary Plasmocytoma. – Hematology, 2005.

4. M e l e t i o s , A. Dimopoulos, Lia A. Moulopoulus, Alice Ma-niatis, Raymond Alexanian – Solitary plasmocytoma of bone and asymptomatic multiple myeloma. – Blood, 96, 2000, 2037-2044.

5. A t t a n a s i o , G. et al. Filipo- Extramedullary plasmocy-toma of paranasal sinuses. A combined therapeutic strategy. – Acta Otorhinolaryngol., Ital., 26, 2006, 118-120.

6. A g y e m a n , B. Akosa et H. Mufeed. Ali- Extramedullary Plasmocytoma of Skeletal Muscles. – Cancer, 64, 1989, 1504-1507.

7. T a - C h u a n , L. et al. Extramedullary plasmocytoma of the Gall Bladder: A case report. – J. Intern. Med. Taiwan, 2006, 114-117.

8. S h e n g - F o n g , K., et al. Extramedullary plasmocytoma of the thyroid. – J. N. Zealand Med. Association, 119, 2006, № 1235.

9. R e b e c c a , S. et al. Entramedullary Plasmocytoma. – Ap-plied radiology Online, 34, 2005.

10. P a u l , G. Richardson, Ara Kassarjian, Wen Jing. A 40-year-old man with a large tumor of the skull. – N. Engl. J. Med., 351, 2004, 2637-2645.

Адрес за кореспонденция: Цв. Василева УМБАЛ „Александровска” ул. „Св. Г. Софийски” № 1 1431 София


СЛУЧАЙ С 5q СИНДРОМ – РЕЗУЛТАТИ ОТ ЛЕЧЕНИЕ С LENALIDOMIDE И. Гигов1, Л. Митев2, А. Недева1, Р. Станчев1, В. Узунова2, И. Дамянов1,

И. Николов1 и Ю. Райнов1 1Клиника по хематология и онкология, 2Лаборатория по цитогенетика и молекулярна биология Военномедицинс-

ка академия – София

CASE OF 5q SYNDROME – RESULTS OF TREATMENT WITH LENALIDOMIDE I. Gigov1, L. Mitev2, A. Nedeva1, R. Stanchev1, V. Uzunova2, I. Damyanov1,

I. Nikolov1 and Y. Raynov1 1Clinic of Hematology and Oncology, 2Laboratory of Cytogenetics and Molecular Biology

Military Medical Academy – Sofia

Резюме. Целта на изследването е да се оцени ефектът от приложението на Lenalidomide върху конк-ретните клинични, хематологични и цитогенетични промени, както и терапевтичните зависимости при един от вариантите на миелодиспластичните синдроми, т.нар. 5q синдром. При 51-годишна жена на 6-ия месец след поставянето на диагнозата е започнато самостоятелно лечение с Lenalid tabl. x 5 mg NATCO Farma Limited, Hyderabad, India. Продължителността му е 6 месеца в доза х 10 mg дневно р.о. 3 върху 4 седмици. Използвани са хематологични, цитоморфологични, цитогенетични и молекулярно-биологични методи за поставяне на диагнозата и отчитане на ефекта от предприетото лечение. В периода преди горепосоченото лечение трансфузионната зависимост е била от 2 до 3 единици ерит-роцитен концентрат месечно. Наблюдава се постепенно покачване на хемоглобина, постигане и спон-танно поддържане на състояние на трансфузионна независимост за целия 6- месечен период на наблю-дение, както и намаление на клетъчния клон, носител на del 5q (от 50 на 9%).

Ключови думи: 5q синдром, диагноза/хематологични, цитоморфологични, цитогенетични и молеку-лярнобиологични методи, Lenalidomide, лечение

Summary. The aim of the study was to evaluate the effect of administration of Lenalidomide on specific clinical, hematological and cytogenetic changes and therapeutic relationships with one variant of cytomorphologyc. '5 q-syndrome. A 51-year-old woman 6 months after diagnosis began self-initiated treatment with Lenalid tabl. x 5 mg NATCO Farma Limited, Hyderabad, India. Duration was six months at a dose of 10 mg/day per os for 3 or 4 weeks. There were used hematologic, cytogenetic and molecular biological methods of diagnosis and reporting of the effect of treatment was undertaken. Results: In the period prior to this treatment, transfusion therapy was 2 to 3 units of erythrocyte concentrate per month. There was a gradual increase in hemoglobin, a spontaneous state of transfusion independence for the entire 6-month period of observation and reduction of the cell branch, carrier of del 5q (50% to 9%) was achieved and maintained.

Key words: 5q syndrome diagnosis, hematologic, cytomorpholodic, cytogenetic and molekular-biolodic, methods, Lenalidomide, treatment

Въведение 5 q(–) cиндромът е единствената парадигма

сред миелодиспластичните синдроми (МДС), характеризираща се със съответствие между цитология, цитогенетика и нисък риск на клинич-на еволютивност.

Представлява отделна нозологична единица в класификацията на СЗО, когато изпълнява 2

основни критерия: бласти в к.м. < 5% и доказана 5q- аномалия.

Описан е за първи път през 1974 г. От Van den Berghe и сътр. като своеобразен тип реф-рактерна анемия, по-често срещаща се при жени (обратно на другите типове МДС), изявена пе-риферна макроцитоза, честа еритробластопения с повишено количество на монолобирани с екс-

И. Гигов, Л. Митев, А. Недева... Случай с 5q-синдром – резултати... 92

центрично разположено ядро мегакариоцити с голям размер, бластни клетки под 5% в к.м., изо-лирана интерстициална del 5q и рядка (около 10%) еволюция към остра миелобластна левке-мия и накрая, една удължена преживяемост [1].

Въпреки, че прогнозата e добра, продължи-телността на живота е по-ниска в сравнение с общата човешка популация и обременяването с еритроцитни трансфузии е значимо [2].

Що се отнася до нивото на засягане на хемо-поетичните клетки – предшественици при МДС с del 5q цитогенетичните анализи c използване на FISH методиката доказаха, че делецията е пред-ставена основно в плурипотентните CD34+; CD38 клетки и персистира до комитираните про-генитори [3]. Доказа се също, че del 5q е предс-тавена основно в не повече от 35 до 50% от еритробластите [4].

Лечебният ефект от приложението на стиму-латори на еритропоезата може да достигне 50%, но този отговор обичайно e краткотраен.

Леналидомидът, един по същество имуномо-дулатор, има специфично цитотоксично дейст-вие върху анормалния клетъчен клон и води в 80% до пълен терапевтичен, а в някои от случа-ите, и до цитогенетичен отговор [5]. Като после-дица е възможно той да променя естествения ход на заболяването с подобряване на преживя-емостта. В клинично ефикасни дози леналидо-мидът е миелосупресор и неутропенията следва да бъде лекувана с растежни фактори, в част-ност през първите месеци на лечението.

Цeл Да се проследи ефектът от лечението, про-

ведено с Lenalidomide, на случай с миелодисп-ластичен синдром, уточнен като 5q- синдром, наблюдаваната динамика на хематологичните, цитологичните и цитогенетичните промени, както и поносимостта и страничните явления при при-ложението на медикамента.

Материал и методи Обект на предприетото лечение е 49-годиш-

на жена с постепенно задълбочаващ се анеми-чен синдром.

Лекувана е над една година с железни пре-парати, витамини и вливане на еритроцитни кон-центрати без траен успех. Ние разширихме ди-агностичното търсене и след миелограма и цито-генетично изследване уточнихме, че се касае за миелодиспластичен синдром – по класификацията на СЗО “5q- syndrome”, без допълнителни цитоге-нетични аномалии и < 5% бластни клетки в к.м.

За цитологичното изследване е използвано оцветяване по May-Grunwald-Giemsa. Уточнява-

нето на кариотипа е направено с методите на класическата цитогенетика (G-лентуване), а мо-лекулярнобиологичното – с използване на FISH с двуцветна FISH-реакция с проби за критичните райони 5q31 и 5q33.

Лечебният период е 6 месеца, а следлечеб-ното наблюдение – 4 месеца. Лечението е про-ведено в доза 10 mg дн. p.o. за 21-дневни пери-оди от всеки месец. Използван е препаратът Lenalid tabl. 5 mg, NATCO-Farma Limited Banjara Hills, Hyderabad, India.

През целия лечебен период ежеседмично са проследявани: ПКК, серумно желязо, протеино-грама, кръвна захар, биохимичните параметри на чернодробната и бъбречната функция.

Възприети стандарти за терапевтично пове-дение и лечебен ефект:

І. За субституиращо трансфузионно лечение:

1. С еритроцитни концeнтрати:

– при хематокрит 0,24-0,21 вливане на 2 единици Е.К.

– при хематокрит 0,20-0,18 вливане на 3 единици Е.К.

– при хематокрит < 0,18 вливане на 4 единици Е.К.

2. С растежни фактори (G-CSF-300 mkg/d s.c.): PNN < 1,5 G/l

ІІ. За “сигнификантна тромбоцитопения”:

– ниво на тромбоцити < 100 G/l.

ІІІ. Време за достигане на лечебен отговор:

– “частична трансфузионна независимост” – достигане на ниво на Нв 80g/l

– “пълна трансфузионна независимост” – достигане на ниво на Нв 110g/l

ІV. Цитогенетичен отговор:

– пълен (изчезване на del 5q)

– частичен (намаление броя на митозите с del 5q > 50%)

– минимален (намаление на броя на митозите с del 5q < 50%)

Резултати и обсъждане Пациентката И. Х. К. Л.И.Б. № 13543/27.05.2008

г. постъпва при нас с анамнестични сведения от 4 години за анемия, бледност, силна отпадна-лост и уморяемост. Изследванията на перифер-ната кръв потвърждават изразен анемичен син-дром (НВ 64 g/l) със стигми на мегалобластно кръвотворене (изобилие на мегалоцити (фиг. 1), МСV 120 fl, тенденция към тромбоцитопения), но с нормален брой левкоцити, при нормални стой-ности на серумното желязо и ЖСК. Значимо е покачването на серумното съдържание на ерит-ропоетин и vit. B12. Налице са стигми за лекос-тепенна хемолиза: Нв F = 1,2 N, общ билирубин = 1,3 N за сметка на индиректната фракция. Не се установява спленомегалия.


Фиг. 1. Наличие на мегалоцити в периферната кръв

Направената миелограма с кариотип (класи-ческа, лентова цитогенетика) и FISH потвърждават нормо- до хипоцелуларитет, еритробластопения (фиг. 2), унилобирани едри мегакариоцити с екс-центрични ядра (фиг. 3) и бластни клетки < 5% в костния мозък, интерстициална del(5)(q15;q33) съответно в 44% и в 50% (фиг. 4 и фиг. 5).

Фиг. 2. Костен мозък – намаление на еритробластната по-пулация

Фиг. 3. Наличие на унилобулиран мегакариоцит с ексцент-рично разположено ядро, типично за 5q- синдрома

Фиг. 4. Частичен G-лентуван кариотип на пациента, по-казващ del(5)(q15q33)

Фиг. 5. Двуцветна флуоресцентна in situ хибридизация на костен мозък. А и Б находки преди лечението (червена стрелка нормална клетка; жълти стрелки клетки с 5q- делеция) и В след лечението

А

В

Б

И. Гигов, Л. Митев, А. Недева... Случай с 5q-синдром – резултати... 94

До започване на приложението на Lenali-domide лечението е било заместващо (2-3 Е.К. месечно) + кортикостероиди.

С оглед по-точното отчитане на лечебния ефект от леналидомида, през целия 6-месечен период на приема му еритроцитни трансфузии и кортикостероиди не са били прилагани.

Динамиката в повлияването на хемоглобина, левкоцитите и тромбоцитите е показана на гра-фиките 1, 2, 3.

0

20

40

60

80

100

120

140

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Months

Hb

g/I

Series1

Графика 1. Динамика на хемоглобина под влияние на ле-чението

0

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Months

G/l Series1

Графика 2. Динамика на левкоцитния брой по време на лечението

0

50

100

150

200

250

300

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Месеци

Series1G/l

Графика 3. Динамика на тромбоцитния брой по време на лечението

Повишението на хемоглобина и хематокрита е успоредно и довежда пациентката до състоя-ние на “относителна трансфузионна независи-мост” още към края на втория, а в началото на четвъртия месец от стартиране на лечението – и “абсолютно независима” от трансфузии на ерит-

роцитни концентрати. В края на лечението хемог-лобинът достига пиково ниво от 128 g/l и за 4- ме-сечния период на наблюдение без лечение, въпре-ки слабата тенденция към понижение, се запазва около 120 g/l, което превръща пациентката вече 8 месеца в “трансфузионно независима”.

Наблюдавани бяха две основни странични действия: слабо изразено, но продължително гадене и дребен уртикариален, сърбящ, транзи-торен обрив по кожата, предимно на гърдите и ръцете, предолени съответно с антиеметична и антихистаминна перорална медикация.

Контролната миелограма показва изразена тенденция към нормализиране на съотношение-то между гранилоцитната и еритробластната клетъчни популации и на мегакариоцитопоезата.

Набюдаваният положителен ефект върху еритроцитната продукция, води до удвояване на еритроцитния брой, но се запазват проявите на мегалобластно кръвотворене. Не бихме могли да дадем изчерпателен отговор на наблюдава-ния феномен, но поради запазване на нормалнo нивo на vit. B12 и невъзможност да определим нивото на фолата допускаме две хипотези: не-пълно потискане на 5q- еритробластното кръ-вотворене и състояние на фолатен недоимък.

В съответствие с литературните данни, ние наблюдавахме транзиторна миелотоксичност на леналидомида, касаеща левкоцитите и тромбо-цитите съответно 1 и 2 ст. по скалата на СЗО за хематологична токсичност. Това не наложи при-ложение на растежни фактори или тромбоцитни трансфузии. Наблюдаваният надир на левкоци-тите бе двуфазов между 1,5 и 2,5 мес. и между 5-6 месец. Не бихме могли да обясним този дву-фазов феномен, но предполагаме намеса на външен, засега неидентифициран фактор.

Медикаментозно предизвиканата тромбоцито-пения е по-продължителна и по-забавена (между 2,5 и 4,5 месеца от началото на лечението), но не води до дозова или трансфузионна зависимост.

Съществени отклонения в биохимичен план по време на лечението и след прекратяването му не сме забелязали.

Наблюдавани бяха две основни странични действия: слабо изразено, но продължително гадене и дребен уртикариален, сърбящ, транзи-торен обрив по кожата, предимно на гърдите и ръцете, предолени съответно с антиеметична и антихистаминна перорална медикация.

Контролната миелограма показва изразена тенденция към нормализиране на съотношение-то между гранилоцитната и еритробластна линии и на мегакариоцитопоезата.

Цитогенетичният и молекулярният контрол след приключване на лечението дефинират час-


тична ремисия в изследвания материал, като намалението на патологичния клон е от 44 на 13%, съответно от 50 на 9% (при оценка върху 100 клетки).

Изводи 1. Проведеното от нас лечение с леналидо-

мид на случай с “5q- синдром” е успешно и е в съгласие с литературните данни.

2. То е довело пациента до състояние на трансфузионна независимост и е подобрило качеството на живота му.

3. След 6-месечен лечебен период се дефи-нира частичен цитогенетичен и молекулярен отговор.

4. Подходящо e за лечение в амбулаторни условия.

5. Изисква редовен хематологичен контрол поради наблюдавана миелотоксичност в начал-ните месеци на приложение на медикамента.

БИБЛИОГРАФИЯ 1. V a n d e n B e r g h e, H. et L. Michaux. 5q- twety-five years

later: a synopsis. – Cancer Genet Cytogenet, 94, 1997, 1-7. 2. G i a g o u n i d i s , A. A., U. Germing et C. Aul. Biological

and prognostic significance of chromosome 5q deletions in myeloid malignancies. – Clin. Cancer Res., 12, 2006, 5-10.

3. N i l s s o n , L. et al. Isolation and characterization of hema-topoietic progenitor/ stem sells in 5q-deleted myelodysplastic syndromes: evidence for involvement at the hematopoietic stem cell level. – Blood, 96, 2000, 2012-2021.

4. B i g o n i , R. et al. Multilineage involvement in the 5q- syn-drome: a fluorescent in situ hybridization study on bone mar-row smears. – Hematologica, 86, 2001, 375-381.

5. L i s t , A. et al. Myelodysplastic Syndrome- 003 Study Inves-tigators. Lenalidomide in the myelodysplastic syndrome with chromosome 5q deletion. – N. Engl. J. Med., 355, 2006, 1456-1465.

Адрес за кореспонденция: Доц. Иван Гигов,дм Клиника по хематология и онкология Военномедицинска академия ул. “Св. Г. Софийски” № 3

359 (2) 9 22 56 93; +359 887 787 162


УСПЕШНA БРЕМЕННОСТ ПРИ СЪПРУГИ НА МЪЖЕ С ХРОНИЧНА МИЕЛОИДНА ЛЕВКЕМИЯ, ЛЕКУВАНИ С ГЛИВЕК

Ж. Грудева-Попова1, К. Александрова2 и И. Ненова1 1Клиника по онкология и хематология, УМБАЛ ”Св. Георги” – Пловдив

2Клиника по хематология, УМБАЛ „Александровска” – София

SUCCESSFUL PREGNANCIES OF SPOUSES OF MALE PATIENTS WITH CHRONIC MYELOID LEUKEMIA ON IMATINIB THERAPY

J. Grudeva-Popova1, K. Alexandrova2 and I. Nenova1 1Clinic of Oncology and Hematology, UMHAT “Sv. Georgi” – Plovdiv

2Clinic of Hematology, UMHAT “Alexandovska” – Sofia

Резюме. Imatinib е утвърден като първа линия терапия при пациенти с хронична миелодна левкемия. Модерното лечение промени изцяло протичането на заболяването. Това именно наложи мениджмън-тът на заболяването да бъде адаптиран към актуалния начин на живот на пациентите. Нормално е някои от тях да се надяват на поколение. Ние съобщаваме за двете (единствени до момента в страната) успешно завършили бременности на съпруги на мъже, получаващи продължителна тера-пия с Imatinib. В първия случай заболяването е диагностицирано през 1999 г., на 29-годишна възраст. Терапията с Imatinib (400 mg на ден) е от есента на 2005 г., при пациента е постигнат голям моле-кулярен отговор. При втория пациент диагнозата е поставена през 2003 г., лечението с Imatinib (400 mg на ден) е от пролетта на 2005 г., постигнат е аналогичен терапевтичен резултат. Родените деца (момиче и момче) са от нормално протекли бременности, имат нормални растеж и развитие до момента (1 г. след раждането). Преценката за родоразрешение и при двата случая е единствено по акушерски индикации на майката. Примери за жени, позволили си бременност по време на лечение с тирозин-киназен инхибитор, в България засега няма.

Ключoви думи: иматиниб, хронична миелодна левкемия, бременност, мъже

Summary. Imatinib represents the first step in treating chronic myeloid leukemia. The modern therapy signifi-cantly changed the natural disease progression, and allowed for the treatment to adapt to the patient’s lifestyle. This gave the patients hope to have a child. This paper discusses the country' only two cases of successful pregnancies of spouses of male patients treated with Imatinib. The first patient was diagnosed in 1999, at the age of 29. Imatinib therapy (400 mg/day) started in the fall of 2005, and achieved significant molecular response. The second patient was diagnosed in 2003, and has been treated with Imatinib (400 mg/day) since the spring of 2005, with analogous therapeutic result. The children – a boy and a girl – were born оne year ago after normal pregnancies, and are developing well. Delivery considerations in both cases are solely based on the obstetric indicators of the mother. In Bulgariaq there are still no cases of pregnancies of female patients treated with tyro-sine kinase inhibitors.

Key words: imatinib, chronic myeloid leukemia, pregnancy, male

Въведение Утвърждаването на Imatinib като първа линия

терапия при пациенти с хронична миелоидна левкемия (ХМЛ) промени революционно хода на заболяването. Това именно наложи мениджмън-тcj на болестта понастоящем да бъде адаптиран

към новия начин на живот на пациентите [13, 15]. Нормално е някои от тях да се надяват на поко-ление. От друга страна, е известно, че при живо-тински модели терапията с Imatinib има потенци-ален тератогенен ефект [1, 9, 16]. Честотата на съчетание на ХМЛ с бременност е около 1/75

Ж. Грудева-Попова, К. Александрова и И. Ненова. Успешна бременност при съпруги на мъже... 97

000 [3, 5, 12, 15]. Съобщаваме за двете (единст-вени до момента в страната) успешно завърши-ли бременности на съпруги на мъже, получава-щи продължителна терапия с Imatinib.

Първи клиничен случай В първия случай заболяването е диагности-

цирано по класически критерии през 1999 г. Ди-агнозата е ХМЛ, Ph(+) – хронична фаза. Пациен-тът е на 29-годишна възраст. Лечението е про-веждано съгласно терапевтичната концепция за периода – Hydrea, интерферони. През 2005 г. заболяването преминава в акселирираща фаза, което налага добавяне на Ara-C и антрациклини към терапията. Лечението с Imatinib 400 mg дневно. започва през есента на 2005 г.. Пациен-тът е с пълен цитогенетичен отговор след една година и с голям молекулярен отговор след 24 месеца.

При изказаното желание за поколение (есен-та на 2008 г.) беше направена подробна оценка на статуса на хематологичното заболяване – потвърдена молекулярна ремисия. Показателите на изследваната спермограма бяха в референт-ни граници. Забременяването стана без спиране на терапията от страна на бащата. Майката се следеше стриктно от акушер, особено в първия триместър на бременността – генетичен анализ, 4D видеозон контрол. Родоразрешението е осъ-ществено оперативно поради акушерски индика-ции от страна на майката (предшестваща травма на таза). За майката това беше първа нормално протекла бременност. Роденото момиченце на-върши една година в началото на август 2010 г., има нормални растеж и развитие до момента. Наблюдението на детето продължава.

Втори клиничен случай Отнася се за пациент на 40 год. с доказана

през 2003 г. диагноза: ХМЛ, Ph(+), хронична фа-за. Провеждано е лечение с Hydrea, интерферо-ни – постигната хематологична ремисия, но без цитогенетичен отговор. Терапията с Imatinib 400 mg дневно започва в началото на 2005 г. с пос-тигане на пълен хематологичен отговор на трети месец и пълен цитогенетичен отговор на 12-и месец. Пациентът е с голям молекулярен отго-вор 18 месеца след началото на приема на Imatinib. Не са наблюдавани прояви на хемато-логична и/или нехематологична токсичност. Заб-ременяването на съпругата на пациента е ста-нало без спиране на терапията му и без предва-рително съгласуване с лекуващия хематолог.

Майката е следена активно от акушер-гинеколог. Бременността е протекла нормално с раждане на здраво момче, което е на една година. Детето е под активно наблюдение.

Обсъждане Касае се за два сравнително аналогични

случая – млади мъже; на терапия с Imatinib 400 mg на ден веднага след регистрирането му в страната; с отличен и своевременен терапевти-чен отговор на постигната молекулярна ремисия. Протичането и на двете бременности е нормал-но, липсва специфика или допълнителни изиск-вания за начинa на родоразрешение. Развитието и на двете разнополови деца е нормално една година след раждането.

Винаги обаче трябва да се има предвид, че създаването на поколение по време на терапия с цитостатици обикновено се оценява като рис-ково поведение [4, 7, 11, 17]. Причината е дока-зан или предполагаем тератогенен и мутагенен ефект на лекарствата. Откриването на новите групи медикаменти [8, 14] и въвеждането на тар-гетна терапия позволиха промяна на тази кон-цепция [2, 10]. И все пак има въпроси и отговори, които е добре да коментираме:

Химиотерапия и фертилитет [4, 7, 15] • при мъжете рискът от стерилитет зависи

от типа, дозата и продължителността на лече-ние, независимо от възрастта. Спермогенезата започва 72 дни преди еакулацията, поради което ефектът на химиотерапията е около 10 седмици след последната цитостатична доза;

• за жените рискът от стерилитет зависи от типа, дозата и продължителността на лечение. За разлика от мъжете зависи и от възрастта. Максималната продукция на яйцеклетки е около рождението, след което продукцията намалява. При менопауза около 51-годишна възраст има < 1000 яйцеклетки. Всички фактори, които нама-ляват физиологичната продукция, ускоряват менопаузата. Възстановяването на фертилитета може да бъде преходно.

Какво може/трябва да се направи с цел съх-ранение на фертилност преди започване на химиотерапия или костномозъчна трансплан-тация

• Замразяване на сперма (криосъхранение). • Замразяване на ембриони. • Замразяване на яйцеклетки. • Замразяване на овариална тъкан.

Бременност и ХМЛ Приема се за доказано, че бременността не

повлиява заболяването [15]. Възможни изключе-


ния може да има единствено при бременност на пациентки с ХМЛ след костномозъчна трансп-лантация.

ХМЛ и бременност [2, 10, 16] • Заболяването може да повлияе негативно

нормалното развитие на плода, износването и термина на бременността. Шансът на жени с хронична фаза на ХМЛ за успешен изход вече е много голям.

• Данните преди ерата на модерна терапия с тирозин-киназни инхибитори показват повише-на честота на аборти, повишен брой преждевре-менни раждания и недосени деца при майки с ХМЛ.

• Няма регистрирани съобщения за преда-ване на ХМЛ от майката на новороденото.

Понастоящем в света са докладвани около 60 бременности при партньорки на мъже, леку-вани с Imatinib. Няма внушения за проблеми в зачеването, протичането на бременността, ро-доразрешението или повишена честота на кон-генитални аномалии (13).

По-важен е въпросът за бременности при па-циентки с ХМЛ, лекувани с Imatinib [6, 10, 15, 16]. Известни са 180 такива случая, като регистриран изход има само при 125 от тях. По отношение на продължителността на терапията > 70% от же-ните са получавали медикамента само в първия триместър на бременността; 26% са приемали Imatinib по време на цялата бременност. Какво показват резултатите (n = 125):

• 50% от бременностите са завършили ус-пешно с раждане на здраво бебе;

• 26% са пожелали прекъсване на бремен-ността;

• 14,4% - спонтанен аборт по „неизвестни” причини;

• 9,6% - спонтанен аборт поради аномалии на фетуса.

Основните фетални аномалии са: сraniosyno-stosis, omphalocele, exomphalos, ren duplex, age-nesia renis, скелетови аномалии (дълги кости, прешлени), хипоплазия на белите дробове [6, 15, 16]. Наблюдаваните аномалии са аналогични на тези, срещани при животинските модели. Очак-ваната честота на exomphalos в общата попула-ция е приблизително 1/4000 души. Установените три случая с подобна аномалия при тези 125 бременности показват значително по-висока честота от стандартната.

Заключение Бременността при партньорки на мъже,

лекувани с Imatinib, е безопасна предвид док-ладваните до момента данни. Има нарастваща честота на такива деца, родени в различни стра-ни на света. Липсват доказателства за проблеми в зачеването, нормалното протичане на бремен-ността, начина на родоразрешение или повише-на честота на конгенитални аномалии.

Бременността при жени с ХМЛ, лекувани с Imatinib, може да доведе до повишена честота на сериозни фетални аномалии или спонтанни абор-ти. Препоръките са категорични, че трябва да се спазва строга антиконцепция. В случаите на слу-чайна или желана бременност решението и отго-ворността за последиците трябва да бъдат на са-мата двойка. Задължително трябва да има пред-шестващ професионален разговор от екип хема-толог и акушер. Примери за жени с ХМЛ, позволи-ли си бременност по време на лечение с тирозин-киназен инхибитор, в България засега няма.

Съществува международен регистър на бре-менности, настъпили по време на терапия с Imatinib. Целта е натрупване на нови данни за възможни усложнения и създаване на съвре-менни препоръки за поведение.


1. A l i , R. et al. Imatinib and Pregnancy. – J. Clin. Oncol., 24, 2006, № 23, 3812-3813.

2. A u l t , P. et al. Pregnancy among patients with chronic mye-loid leukemia treated with imatinib. – J. Clin. Oncol., 24, 2006, 1204-1208.

3. B a z a r b a s h i , M. et al. Successful management of Ph chromosome chronic myelogenous leukemia with leu-kapheresis during pregnancy. – Am. J. Hematol., 38, 1991, 235-257.

4. B u e k e r s , T. E. et T. A. Lallas. Chemotherapy in pregnancy. – Obstet Gynecol. Clin. North Am., 25, 1998, 323-329.

5. C e l i l o g l u , M., S. Altunyurt et B. Undar. Hydroxyurea treatment for chronic myeloid leukemia during pregnancy. – Acta Obstet Gynecol. Scand., 79, 2000, 803-804.

6. C h o u d h a r y , D. et al. Pregnancy on imatinib: fatal out-come with meningocele. – Ann. Oncol., 17, № 1, 178-179.

7. D e l m e r , A. et al. Pregnancy during myelosuppressive treatment for chronic myelogenous leukaemia. – Br. J. Haematol., 82, 1992, 783-784.

8. F a d i l l a h , S. A. et al. Successful treatment of chronic myeloid leukemia during pregnancy with hydroxyurea. – Leukemia, 16, 2002, 1202-1203.

9. G o l d m a n , J. M. et al. Clinical decisions for chronic mye-loid leukemia in the imatinib era. – Semin. Hematol., 40, 2003, 98-103.

10. H e n s l e y , M. L. Et J. M. Ford. Imatinib treatment: specific issues related to safety, fertility and pregnancy. – Semin. Hematol., 40, 2003, 21-25.

Ж. Грудева-Попова, К. Александрова и И. Ненова. Успешна бременност при съпруги на мъже... 99

11. J u a r e z , S. et al. Association of leukemia and pregnancy: clinical and obstetric aspects. – Am. J. Clin. Oncol., 11, 1988, 159-165.

12. K u r o i w a , M. et al. Interferon-alpha therapy for chronic myelogenous leukemia during pregnancy. – Am. J. Hema-tol., 58, 1998, 101-102.

13. L u c i a n o , L. et al. Successful pregnancies in chronic myeloid leukemia male patients on imatinib therapy. – Haematologica, 95, 2010, (s2), 541.

14. M u b a r e k , A. A. S. et al. Normal outcome of pregnancy in chronic myeloid leukemia treated with interferon – in 1st tri-mester: report of 3 cases and review of the literature. – Am. J. Hematol., 69, 2002, 115-158.

15. P y e , S. et al. The effects of imatinib on pregnancy out-come. – Blood, 2008, DOI: 10.1182/blood-2007-10-114900.

16. R u s s e l l , M. et al. Imatinib mesylate and metabolite con-centrations in maternal blood, umbilical cord blood, placenta and breast milk. Imatinib concentrations in pregnancy and lactation. – J. Perinatol., 27, 2007, 241-243.

17. S t r o b l , F. J., K. Y. Voelkerding et E. P. Smith. Manage-ment of chronic myeloid leukemia during pregnancy with leu-kapheresis. – J. Clin. Apheresis, 14, 1999, 42-44.

Адрес за кореспонденция: Ж. Грудева-Попова Клиника по онкология и хематология УМБАЛ ”Св. Георги” Пловдив

100

ПРЕПОРЪКИ КЪМ АВТОРИТЕ

Редакционната колегия на списанието моли всички, които биха предложили материали за публикуване в него, да се придържат към след-ните изисквания:

1. Ръкописите се представят в два идентични екземпляра, написани на стандартни машинаписни страници (30 реда, 60-66 знака на ред). Имената на авторите (разположени под заглавието) са в поря-дъка: собствено (съкратено) и фамилия, следвани от местоработата.

2. Поради ограничения обем материалите не трябва да превишават следните размери:

Оригинални статии, включително илюстра-ции и литература (до 10 източника), без резюме-тата – 5-6 страници.

Обзори – 10-15 страници. За раздел "Случаи от практиката" (лечебни,

диагностични методи, казуистика и др.) – 3 стр. Реферати на статии – 3 стр. 3. Всяка статия трябва да съдържа следните

рездели: увод, материал и методи, резултати, об-съждане, заключение, библиография и резюме на български и английски език.

Библиографията се пише на отделна стра-ница и съдържа до 10 източника (за обзорите до 20 източника), цитирани в текста със съответния номер, подредени по азбучен ред по фамилията на първия автор. Изписването на всеки автор да бъде на нов ред в следния порядък:

* Статии: Фамилия и инициали на първия ав-тор, инициали и фамилия на останалите автори, ако не са повече от трима (при повече от трима

автори се изписва само първия и др.). Заглавие на статията.Заглавие на списанието (в съкраще-ние по Index Medicus), том, година, номер на книжката, стр. (от-до).

* Книги: Автор(и). Заглавие. Местоиздаване, издателство, година на издаване, стр.

Резюмето (до 15 реда) се представя на бъл-гарски и на английски език в три екземпляра, съ-държащи имената на авторите и заглавието.

4. Илюстрациите (фигури, диаграми, формули, черно-бели снимки 9х12 см) се представят на от-делни листове със съответните заглавия, минима-лен обяснителен текст и легенда на български език. Те трябва да са максимално контрасни (на-чертани с туш), с размери 10х16 см, с едри букви и цифри, годни за непосредствено полиграфско въз-произвеждане. На гърба на всеки лист се написва името на автора и заглавието на статията. В ляво-то бяло поле на текста се посочва желаното място за поместване на всяка илюстрация.

Таблиците могат да се дадат в текста или на отделни листове. Във втория случай се следват изискванията за илюстрациите.

Всички материали, които са извън текста, се поставят в плик, надписан със заглавието на ста-тията и авторите.

5. В края на статията или на отделен лист се посочват трите имена на водещия автор и адре-сът за кореспонденция.

6. Всички материали да се изпращат на адреса на редакцията на сп. "Клинична и трансфузионна хематология" (вж. стр. 1).

Documents

MYELODYSPLASTIC SYNDROMES: NOVELTIES IN THE …bulgarian-hematology.com/documents_hematology/hematology 1-2-2… · intimate pathogenesis and pathophysiology of MDS. The introduction