Mutagénesis

Ingeniería y Diseño Enzimático

2012

Lic. Hartman Matías

Alteración de la secuencia de ADN de un organismo. La forma sin modificaciones del ADN (salvaje o wild type, WT) se convierte en otra, portadora de la modificación, denominada mutante.

Las mutaciones tienen lugar en todo el genoma, nuclear o mitocondrial, en secuencias codificantes o no y en distintos tipos de células.

Definición

Hacia los años ‘80, el estudio de los mecanismos implicados en los procesos de catálisis, activación o inhibición, eran realizados por modificación química de proteínas.

Actualmente existen metodologías que pueden aportar información novedosa y complementaria a la obtenida por modificación química, como las técnicas de Mutagénesis.

Según tipo de célula

Según magnitud

Germinal (heredable)

Somática (no heredable)

Grandes mutaciones (anomalías cromosómicas)

Mutaciones “medianas”

Mutaciones pequeñas o puntuales

Clasificaciones

Según mecanismo

Mutaciones endógenas (espontáneas)

Mutaciones exógenas (inducidas)

Errores en la replicación; desaminación oxidativa de bases; inestabilidad química N-glicosídica; mutágenos endógenos.

Agentes químicos: acción directa; alquilantes e intercalantes bifuncionales

Agentes físicos: radiaciones UV y radiaciones ionizantes

Agentes biológicos: virus y transposones

Clasificaciones

Generalmente implican un sólo nucleótido

Generan cambios que podrían afectar la estructura y función de las proteínas.

Sustitución: relativamente común en ADN codificante y no codificante

Inserción: muy común en ADN codificante pero rara en ADN no codificante

Deleción: común en ADN no codificante y poco frecuente en ADN codificante

Cambios en el marco de lectura

wild type: 5'-ABCDEFGHIKLM-3'SUSTITUCIÓN 5'-ABCDEFXHIJKLM-3'INSERCIÓN 5'-ABCDEFGXHJIKLM-3'DELECIÓN 5'-ABCDEF�HIJKLM-3'

Mutaciones puntuales

Asn Ser

71 22280 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210(71)ATGGCGGAGGAAAATCAAGTCATCGGCTGCCACACTACTCAAGCCTGGGAAGAGCAGCTCCATAAGGGAAACGAGAACAAPpeTRXh (71)ATGGCGGAGGAAAATCAAGTCATCGGCTGCCACACTACTCAAGCCTGGGAAGAGCAGCTCCATAAGGGAAACGAGAGCAAMDHPpTRX01 (55)ATGGCGGAGGAAAATCAAGT-AT-GGGTGCCACACTACTCAAGCCTGGGAAGAGCAGCTCCATAAGGGAAACGAGAACAAMDHPpTRX02 (57)ATGGCGGAGGAAAATCAAGTCATCGGCTGCCACACTACTCAAGCCTGGGAAGAGCAGCTCCATAAGGGAAACGAGAACAAMDHPpTRX03 (53)

Mutaciones puntuales

Silenciosas

Aparecen con relativamente elevada frecuencia (23-25 %)

A pesar del cambio en la secuencia de ADN no se altera la secuencia de la proteína.

Tercer base: GAG GAA, Glu

Primer base: CUA UUA, Leu

CUG UUG, Leu AGA CGA, Arg

Mutaciones puntuales

La alteración de la secuencia de nucleótidos afecta a la proteína, porque codifica uno o varios AA diferentes respecto a la secuencia original

Pueden ser benéficas o perjudiciales (más frecuentes)

Mutaciones que alteran el sentido: conservadora o no conservadora

Mutaciones que cambian el marco de lectura

Mutaciones que no cambian el marco de lectura Mutaciones con terminación prematura de la proteína

Mutaciones con terminación retrasada

Mutaciones puntualesNo Silenciosas

Utilización de mutágenos sobre organismos de reproducción rápida

Función de las enzimas implicadas en las principales rutas metabólicas

La tecnología del ADN recombinante ha permitido simplificar y sistematizar dicho proceso

No es difícil obtener mutantes para determinado proceso, lo difícil es encontrar qué mutación produce el defecto de una determinada proteína.

Mutagénesis Inducida

Diseño racional y construcción de nuevas proteínas utilizando información estructural

Se utiliza para dos propósitos: 1) Disección de la estructura y actividad de proteínas existentes mediante

alteraciones sistemáticas de sus estructuras y la examinación de los cambios en sus propiedades;

2) Producción de nuevas proteínas para uso en medicina e industria.

El estudio se enfoca en experimentos de ingeniería de proteínas que permiten determinar qué AAs se encuentran involucrados en la unión a sustratos, activadores e inhibidores o toman parte en la catálisis, como así también determinar qué regiones o AAs se encuentran comprometidos en mecanismos de activación y otras propiedades alostéricas.

Ingeniería de Proteínas

Ingeniería de Proteínas

Requerimientos para estudios de mutagénesis

Elección de la mutación

Se debe minimizar la reorganización de la estructura de la enzima, ya sea local o globalmente.

La reorganización o distorsión de la estructura de la enzima se acompaña de cambios energéticos desconocidos que pueden complicar el análisis. Una enzima suele tolerar una cavidad dentro de ella, lo cual generalmente representa la pérdida de energías de interacciones no covalentes. Si el cambio implica la aparición de un grupo demasiado grande, se pueden generar energías de repulsión que deben ser reacomodadas por una distorsión en la estructura.

Roman A. Laskowski & Janet M. ThorntonNature Reviews Genetics 9, 141-151 (February 2008)

Ingeniería de Proteínas

Reglas Básicas

Elegir una mutación que elimine parte de la cadena lateral o que lleve a un cambio isoestérico. Las deleciones son preferibles a los incrementos en el tamaño de la cadena lateral.

Evitar cargas puntuales desapareadas. La remoción de un grupo que solvata una carga puntual es peligroso.

Eliminar el menor número de interacciones. Analizar el cambio de una única interacción ya es lo suficientemente difícil. Evitar la deleción de múltiples interacciones.

No agregar nuevos grupos funcionales a las cadenas laterales. Esto puede provocar reorganización local de la estructura si el nuevo grupo puede realizar nuevas interacciones.

Ingeniería de Proteínas

Mutaciones adecuadas para un análisis simple

Ile Val

Ala Gly

Thr Ser

La pérdida de un grupo –CH2– es una buena prueba para poner de manifiesto interacciones hidrofóbicas. Sólo se crea una pequeña cavidad

Ingeniería de Proteínas

Ile

Ala

Leu

Val

Se produce una mayor pérdida de energía y un mayor movimiento de las cadenas laterales dentro de la cavidad que cuando las deleciones son pequeñas

Ingeniería de Proteínas

Ser

Ala

Cys

Tyr Phe

Son buenos para probar enlaces puente de hidrógeno.

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His

Asn

Gln

Se pueden sustituir como dadores de enlaces puente de hidrógeno.

Ingeniería de Proteínas

Esta sustitución puede ser aceptable en la superficie de una proteína, aunque incluso en este lugar es peligroso, ya que el –COO- es aceptor de puente de H, y el grupo –CONH2 es dador y aceptor.

Asp Asn

Glu Gln

Ingeniería de Proteínas

Ala

Ante la duda mutar por Ala. Este suele ser un cambio deletivo y la Ala tiene pocas peculiaridades. La Gly en cambio, y debido a su mayor libertad estructural, puede provocar efectos no deseados en la estructura.

Ingeniería de Proteínas

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TyrPhe

Ingeniería de Proteínas

Los estudios completos involucran la medida del perfil de las energías libres para las proteínas WT y mutante.

Ingeniería de Proteínas

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Ingeniería de Proteínas

Ingeniería de Proteínas

Ingeniería de ProteínasPhosphorylation Mimic

El objetivo de esta clase de mutaciones es producir una carga negativa (Aminoácidos ácidos) donde se encontraría (espacialmente) la carga del grupo fosfato en los fosfoaminoácidos (Ser, Thr o Tyr)

Ingeniería de Proteínas

Ingeniería de Proteínas

Superposición y extensión

Extensión por megaprimer

Intercambio de segmentos

Reacción en cadena combinada (CCR)

PCR inversa

QuickChange (Stratagene)

Mutagénesis Sitio Dirigida

Se producen modificaciones en el ADN en un sitio definido, por lo cual la secuencia wild type debe ser conocida.

Las técnicas más utilizadas son:

Superposición y extensión

**

* *

*

*

*

Mutagénesis Sitio Dirigida

Mutagénesis Sitio Dirigida

Extensión por megaprimer

Mutagénesis Sitio Dirigida

Intercambio de segmentos

Mutagénesis Sitio Dirigida

PCR inversa

Mutagénesis Sitio Dirigida

QuickChange

Mutagénesis Sitio Dirigida

Mutágenos químicos

PCR propensa a error

Utilización de oligonucleótidos degenerados

Mutagénesis exploratoria por pentapéptido

Mezcla de ADN

Mutagénesis al Azar

Se producen modificaciones en el ADN en un sitio indefinido, por lo cual no es necesario conocer la secuencia a mutar

Las técnicas más utilizadas son:

Se hace reaccionar un fragmento de ADNdc con un mutágeno químico (ácido nitroso o hidroxilamina)

Se clona la mezcla de fragmentos mutados en un vector recombinante que contenga el resto del gen WT

Los vectores que poseen la mutación generalmente deben ser identificados por secuenciación

La frecuencia de recuperación de mutantes por este método es relativamente baja.

Mutagénesis al Azar

Mutágenos Químicos

En presencia de Mn2+ o concentraciones anormales de Mg2+ la enzima Taq DNA Pol se puede hacer propensa al error

Luego de varias rondas las mutaciones crecen en el ADN amplificado

Mutagénesis al Azar

PCR propensa a errores

Es útil cuando los codones a ser alterados se hallan en una secuencia corta de ADN

Las secuencias mutantes no pueden distinguirse de las WT por los métodos habituales de screening, sólo por secuenciación.

La introducción de oligonucleótidos en sitios de restricción facilitaría la búsqueda.

Mutagénesis al Azar

Utilización de oligonucleótidos degenerados

Se insertan nucleótidos en posiciones al azar en el ADN blanco. Se introduce un cassette, del cual la mayoría se remueve por digestión con endonucleasas de restricción.

La religación del ADN molde resulta en la inserción de nucleótidos que incluyen sitios de restricción.

Es útil para el estudio estructural y funcional de proteínas. Los segmentos superficiales de una proteína toleran inserciones de pocos AAs conservando su funcionalidad, no así los segmentos internos.

Mutagénesis al Azar

Mutagénesis exploratoria por pentapéptido

A B A B

Mutagénesis al Azar

Fragmentación aleatoria

Mutagénesis al Azar

Mezcla de ADN

Random priming recombination (RPR)

Mutagénesis al Azar

IntroducciónAlberts, Bray, Lewis, Raff, Roberts, Watson. Biología molecular de la célula. (1996) Tercera edición. Capítulo 7, pag. 313-358. Ed. Omega (Barcelona, España).Fersht. (1999) Structure and mechanism in protein structure. A guide to enzyme catalysis and protein folding. Cuarta impresión (2002). Capítulo 15, pag 420-456. Ed. Freeman (New York, USA).Lodish, Berk, Zipursky, Matsudaira, Baltimore, Darnell. (2003) Biología celular y molecular. Cuarta edición. Capítulo 8, pag. 254-293. Ed. Panamericana (Madrid, España).Luque, Herraez. (2001) Texto ilustrado de Biología molecular e ingeniería genética. Tema 25, pag. 343-356. Ed. Harcourt (Madrid, España).

TécnicasBi W, Stambrook PJ. (1998) Site-directed mutagenesis by combined chain reaction. Analytical biochemistry 256, 137-40.Giver L, Arnold FH. (1998) Combinatorial protein desing by in vitro recombination. Current opinion in chemical biology 2, 335-38.Hallet B, Sherratt DJ, Hayes F. (1997) Pentapeptide scanning mutagenesis: random insertion of a variable five amino acid cassette in a target protein. Nucleic acids research 25, 1866-67.New England Biolabs, Inc. GPS-LS Linker scanning system. Technical bulletin #E7102. http://www.neb.comStratagene. QuikChange Site-directed mutagenesis kit. Instruction manual. Revision #124001e. http://www.stratagene.com

Bibliografía