MULTIPLICATION VeGeTATIVE IN VITRO DE L'ARABUSTA

P. DUBLIN Directeur de recherches ORSTOM

Laboratoire de culture fn vltro, GERDAT,

B.P. 5035, 34032 Montpellier cedex

i'

INTRODUCTION

Coi" vous avez pu l e constater , p'lusieurs des communications concernant l e chapitre Amélioration des Plantes, sont consacrées 2 l 'emploi des techniques de cul ture de tissus in v i t ro .

Cette nouvelle or ientat ion des recherches chez les caféiers cu l t ivës , est t r ë s in té ressante . En e f f e t , jusqu'à une date récente, les recherches sur l a cul ture de t i s s u s végétaux avaient é t é l i v i t é e s presque uniquement aux plantes des pays t.emoérés.

.

Depuis quelques temps, ces types de recherche o n t é t ë étendus aux plantes t ropicales , e t ti l ' heu re ac tue l le i l ex i s t e plusieurs exemples pratiques de l ' u t i i i s a t i o n des techniques de cul ture í n v i t r o dans 1 'amélioration génëtique des plantes t ropicales u t i l e s .

les cul tures de t i s sus peuvent présenter différents aspects, d i f fé ren tes formes, en fonction des organes mis en cul ture e t en fonction du type de développepent impos6 ti ceux-ci. Parmi ces différentes formes, l a multiplication végétative i n Vi t ro e s t sans aucun doute, l a plus repandue e t c e l l e q u i a 'le pius contribué au dëveloppement que connaît aujourd'hui, l 'emploi de ces techniques.

Chez l e café ie r , l a multiplication végétative i n vitro consti tue un des thëmes,prfn- cipaux de recherche sur l a cul ture de tissus de ces végétaux.

On do i t à STARITSKY d 'avoi r pour a insi d i r e ouvert 3 l a voie 6. l a multiplication végetative i n v i t ro du ca fé i e r , par sa découverte de plusieurs cas d'embryoagnése somatique chez C. canaphora en 1970.

Depuis , plusieurs auteurs HARN, SONDAHL, ont , avec des succès d i f fë ren ts expérimenté les techniques de cul ture i n v i t r o dans la multiplication végétative des caféiers .

La plupart de ces travaux ont é t é effectués sur Arabica, espèce autog me dont l a reproduction conforme par graines peut fac i lement ê t r e obtenue. 85 NOV. 4983

Q, R. S. 1.0. U, b d 8 5 ~ E ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ c-71,- --

ASIC, 9" Colloque, Londres, 1980 No i 3734 ktt? 's

572

Le t rava i l qui vous sera présenté a é t é r éa l i s é principalement sur l e café ie r Arabusta. C 'es t un caféier hybride F i de C . arabica e t de C . canephora, créé par CAPOT en Côte d ' Ivoire e t dont l a aénèse vous a déjâ é t é présentée au cours des conférences P.SIC antér ieures .

Pour des raisons génétiques , démontrées par a i 1 leurs expérimetïtä.le"emt, ce ca fé i e r hybride ne peut ê t r e reproduit de façon conforme que par voie végétative. Toute mu1 t ip l i ca t ion par graines conduit, â un éclatement génétique, débouchant al ors sur des popul a t i ons t r è s hétéroqènes e t non expl oi tab1 es au pl an économi que.

AU t e m e de sa sélect ion, tou t café ie r adul te , t ê t e de clone nouvellement select ion- née ne fourn i t qu'un nombre rédui t de boutures orthotropes u t i l i s ab le s pour l a reproduction végétatiQe. A ï 'heure ac tue l le , i l fau t donc un temps considerable en t re l e moment oii l a t ê t e de clone Arabusta e s t sélectionnée e t celui oil l e taux de mult ipl icat ion en con- di t ion horticole aura a t t e i n t u n niveau suf f i san t p o u r que ce nouveau clone puisse passer en grande culture.

En conséquence, toute technique q u i "met t ra d'auomenter, des l e début, l e taux de multiolication conforme d ' u n café ie r t ê t e de clone e t accélérer a ins i 1 ' i n s t a l -

iour l ' amé1 ioration la t ion des jardins de bo is de bou tu r i génétique de .ces plantes.

Les recherches que nous avons entrepr de multiplication végétative i n v i t ro ce t t e préoccupation.

le, presente un i n t é r ê t réel

ses , en vue de l a mise au po de l 'hrabusta e t autres café

Ces recherches ont é t é or ientees dans deux directions : . La premiere or ientat ion comporte 1 'induction de bourgeons

néoformés, s u i v i d ' u n bouturare i n v i t ro .

n t d 'une technique e r s répondent â

e t de t i ges

. La deuxième or ientat ion comprend 1 'obtention d'embryons sorat iques e t l e développement de ceux-ci en p l antules orqanisées .

Le matériel végétal u t i l i s é pour ces recherches comprenait : - l es clones sélectionnés, cu l t ivés en se r r e â Vontpellier, en Côte d ' Ivo i r e - Les plantules cul t ivées en tubes, en conditions s t é r i l e s , sur Aaar e t sur

Vermi cul i t e .

I BOUTURAGE DIRECT IN VITRO I En raison au dimorphisme végétatif des caféiers cul t ivés , les boutures chloroDhyl1 iert nes des ramifications orthotropes sont l e s seules u t i l i s ab le s au plan prat ique.

Les bourgeons orthotropes de ces boutures t r è s f r ag i l e s sont cependant bien protéqés par l e s szipules. Plusieurs ten ta t ives de cul ture i n v i t ro de noeuds de ces t i ges orthotropes ont é t é f a i t e s dans l e b u t de promouvoir l e développement des bourgeons orthotropes restes l a t en t s , e t d'obtenir des t i ges orthotropes débarrassées de t o u t qerme, u t i1 isables en bouturage i n v i t ro . Ces essa is ont é t é f a i t s sur substracts divers (Agar, Vermiculite, p o n t de papier f i l t r e ) . Des essa is de cul ture de bourgeons isolés ont éoalement é t é f a i t s .

Dans tous l e s cas, l e s résu l ta t s ont ë t é décevants, sur n i l i eu Pgar on a s s i s t e dans l e s quelques jours q u i suivent l a mise en place des explants 2 une pul lulat ion de bactéries q u i conduit â une mort plus ou moins rapide des explants.

L'emploi, de produits anti-oxydants (Cystéine, DIEC4, DTT) Dour conhattre l ' a c t i o n

e t de bactéricides pour détruire l e s bactér ies , n 'ont pas amélioré de façon sa t i s f a i san te l e s résu l ta t s - des phénols (toujours abondants chez l e s Canephora e t Arabusta) ; d 'an t ib io t iques 1,

L'obtention i n v i t ro de t iges iï p a r t i r de bourgeons orthotropes déjà ex is tan ts , s'ëtan-c révélée d i f f i c i l e e t d'une ren tab i l i t é insuff isante , les recherches furent a lors orientées vers 1 ' induction de t i ?e s néoformées, ã p a r t i r de frasments d 'entre- noeuds débarrassës de leurs s t ipu les e t donc p l u s f ac i l e s à désinfecter que l e s fragments de noeuds.

I INDUCTION DE BOURGEONS NEOFORFIES I,/ Les explants consti tués de fraqments a'entre-noeud orthotrope jeune de 1 cm de long sont placés verticalement dans l e milieu, 1 ' ex t réo i té radical plongeant dans l e m i 1 ieu.

La désinfection des explants e s t f a i t e par trempage (30 minutes) dans une solution à 10 % d'hypochlorite de Ca (220") additionnée de quelques, gouttes de Tween 80, ;j rinçages ã l ' e au s t é r i l e .

'

Ouatre milieux minéraux de base o n t é t é expérimentés : deux comorenant l e s macro- éléments de NJRASHIGE e t SKOOG, deux autres basés sur l e s élëments de milieux N 30 K e t N 45 K de MARGARA.

Dans tous l e s cas, l e pl-l a ê t é a jus t é à 5,s avant addition de l 'Agar, l e s milieux o n t é t é autoc7avCs 8 115" pendant 20 minutes.

Pour combattre l e s bruni ssements q u i apparaissent aux extrérni t é s des exp 1 ants e t q u i sont dûs ã l 'oxydation des phénols, on a u t i l i s é des actions combinées de f ro id , obscuri té e t anti-oxydants (20-30 9 de Cysteine dans les n i l ieux de cu l ture) .

DIECA : Diethyl d i th io Carbamate D.T.T. : Dithiothrei tol '

MILIEUX N 30K e t N 45K de J . PARGARA (1978) Ql/l

CONSTI.TUA.NTE N 30K N 45K

rw 4 MQ 3 480 720

Ca (NO 3)2 4 H20 590 944

K MO 3 1313 1818

Mg SO4 7 H20 246 246

K H ~ po4 136 136

K C1 74,5 372,5

COMPOSITIDM MINERALE (en meq/l ) des VILIEUX DE YUPN!IGE et MARGARA

Dénomination N N03- H2p04- s04- . cl- K+ Ca++ ~ g + + N H ~ + + d u milieu TOTAL

3 20,62 MS 60,05 39,43 1,25 3 6 20,06 6 N 30 K 30 24 1 2 1 15 5 2 B N 45 K 45 36 1 2 5 24 8 2 9

573

Par rapport au milieu MS, l e s milieux 30 K e t 45 K de MARGP.RP., s o n t carac té r i sés par :

. une teneur en azote to ta l plus f a ib l e . un rapport NH4/M égal à 1/5 donc plus f a i b l e que YS (1/3) . un rapport K/ca égal 3 , également plus f a i b l e que )our MS.

MILIEU DE I?UF!ESHIGE e t SKOPG (1962)

574

COb!STITUANTS

NH4 NO3

K ~ 0 3

Ca c12 2 H ~ O

Mg SO4 7 H20

WH^ PO^ H 3 Bo

Mn SOA 4 H20

Zn so4 7 H ~ Q

KI

Ma2 rio04 2 H ~ O

cu 'io4 5 +JO

Co C l p O H20

Fe SO4 7 H20

Na2 E D T A 2 H2@

1650

1900

440

370

170

63 2

22,3

8,6

0,83

0,25

0,025

O , 025

2JY8

37,3

~

mol /1 ~ ~~

20,O m mol

18,8 m mol

2,99 m mol

1,50 m mol

1,25 m mol

1OP /1\ mol

100 )( mol

2923 kmol

5,O ,q mol

1,03 ,&mol

f l , l O O Nmol

0,105 H MO1

100 ,q mol

100 mol

Pendant toute l a durée des expériences, les explants recevaient un éclairement de 4000 l u x , suivant u n régime 1 2 h / n u i t e t 12 h/jour, l es températures des s a l l e s de cul tu re o n t é t é de 26" 2 1" pour une e t 28" i 1" ?our 1 'autre .

Dans ces conditions, on a t e s t é successivement 1 'action :

. du Saccharose

. des Macro-éléments Minéraux

. des Auxines (A. I .A . - A.I.R. - .\.N.A.)

. des Cytokinines (Kinétine, Adénine, E.A.P. , I . P . A . ) . de divers const i tuants organiques (glycine, Glutamine, Ext ra i t de Malt) Le complexe vitaminique de MDKEL, l e plus souvent u t i l i s é a quelquefois é t a i t remplacé par un mélange de Inosi tol (100 mg/l) e t de Thiamine ( 4 mg/l).

Les contrbles sont effectués au'bout de 6 semaines e t on note l e nombre d'explants ayant fourni au moins 1 bourgeon, l e nombre e t l e développement des bourgeons par explant.

Les résu l ta t s 'bb tenus ont é t é groupés dans les tableaux I ã V..

Les bourgeons néoformés i n en cul ture des explants, l e s t i ges issues de bourgeons néoformés a t te ignent un développement suf f i san t pour ê t r e prélevées e t découpées en boutures. Ces boutures s o n t mises , en conditions aseptiques , successivement :

.

v i t ro s e développent rapidement e t 2-3 mois après l a mise

1) sur milieu d' induction de racines 2 ) sur milieu de développement des racines

e t enfin, sur terreau en conditions ordinaires de cul ture oil l a bouture enracinée se

développe en plantule.

Le milieu de base d ' induction de racines e s t composé de l a solution d'ëléments minéraux de MURASHIGE e t SKOOG, diluée de moitié, e t additionnée de Vitamines de MOREL, de Kinétine 1,0 mg/l de Saccharose 10 g/1 e t d ' ü n e Aux ine .

575

MILIEUX Nombre

i n i t i a 1 Expl an t s

Expl a n t s v ivan t s

Expl ants avec bourgeons

MS/2

MS

24

24

45 K

30 K

MSj2

MS

TOTAL

24

24

24

24

96

C

Tableau 1

NEOFORMATION DE BOURGEONS CHEZ LES CAFEIRS CULTIVES. ACTION COMPAREE DE QL'ATRE MILIEUX (MP.CR@-ELEMENTS) SUR LE TAUX DE

Milieux de base : (micro) MS, Fe E D T A., Vitamine de MOREL - E x t r a i t de Malt 400 mg/l P A P 1,O mg/l- Saccha rose 30 g/l

I Taux de

néoformati o en % .

O r i g i n e génétique

13 I 1 7 , 7

24 I 8 33,3

18 I 4 22,2

MS 1 24 23 1 7

~

30,4

20 I

78 I 25,8 TOTAL

30 K

13 I 2 15 ,4 + 24 55,@

50,O

16 I 4 25,O

39,7 TOTAL I 96 73 I 29

31,8 L I B E R

: 1 .

C

20,B

23 I 4 17,3

23 I 5 21,7

TOTAL I 96 92 1. 21 23,O \

5

A

R 'A

E U S T A

40,ö

63,6 + 23 10

54,5

4 4 , 4

50,5 87 I 44

576

t;om b re Expl a n t s Taux de néoformati on MILIEUX -i n i t i a i Explants avec

explants v i v a n t s bourgeons en %

45 K 96 68 18 26,4

30 K 96 9@ 38 42,2

,- -

MSIz ?G 87 32 36,7

MS 96 85 26 30,5

ACTION DE LA TENEUR EN SACCHAROSE SUR LA WEOFORMATInPl DE BOUP,GEOP¡S chez 1 ' ARARUSTA

t * ,

TRAITEMENT Rombre Taux d e Nombre Nonibre

i n ï t i a 1 explan ts exp lan t s avec néoformat ion ecpl a n t s v i van ts bourgeons en %

Milieu de ßase : Macro N 30 I< ms FE E D T A \/i tami nes de MOREL G lyc ine 2 mo/l Ext ra i t d e Malt 400 mg/l B A P 1,0 mg/l

MB + SAC 30 g i l

MB + SAC 50 g l 1

MB + SAC 100 g/1

577

48 38. 14 36,8

48 3 6 30 83,3

48 24 5 20,8

Tableau I I I

ACTION DE DIVERSES CYTOKINIrlES ET AUXINES

de bourgeons chez 1 'ARABUSTA Uti l isées séparément e t en combinaison sur l e s néoformations

Nombre Expl ants

expi snts vivants bourgeons Expl ants avec TRAITEMENTS in i t i al

MB + BAP 24 i8 8 1,O mg/l

1,O mg/l

MB t KIN 24 14 3 I,@ mg/l

MB + AIß 24 15 3 1,O mg/l

HB t AIA 24 20 6 1,O mgil

riB + BAP 1,O mg/l + A I B 1,o mg/l

MB + IP!. 24 14 8

2 24 19

I

Taux de néoformati on

en %

44,4 ~

57, l

21,4

20 ,o

30,O

10,5

Milieu de base : Macro N 30 K Micro MS F e E D T A Vitamines de MOREL Glycine 2,Q mg/l Extrai t de Malt 400 mg/l Saccharose 30 m i l

578

Tableau IV

ACTION DE DIFFERENTES CONCENTRATIONS DE B A P EN PRESENCE de Macro-Eléments divers , sur l a Néoformation de bourqeons chez 1 'ARABUSTA

M B 1 = WS ms Fe E l'! T A Vitamine de Morel Glycine 2,O Ext. Malt400 Sacc. 30

MB2 = 30 K m s 'Fe E D T A Vitamine de Forel Glycine 2,O E x t . Malt400 Sacc. 30

NB3 = 45 K ms Fe E U T P. Vitamine de Florel Glycine 2,r! Ext . Malt40@ - Sacc .3@

579

Tableau V

TRAITEMENTS

ACTION DE SUBSTANCES ORGANIQUES DIVERSES sur l a Néoformation de bourgeons chez 1'ARAßUSTA

!-lilieu de base

!li3 t extrai t de Malt 400 mg/l

tiB t Gly- cine ilmgil

MBtextrai t de Malt i000 mgil

-

MB t G1 uta- m i ne 100mg/l

MB t Ade- nine 40mg/l

Nombre ~

i n i t i a1 Explants expi ants vivants

48

48

32

38

48 I 2'2

Milieu de Base : Macro N 30 K Micro blS Fe E D T A Vitamines de MOREL Saccharose 30 411 B A P 1,O mg/l

Expl ants ' avec

hourqeons

14

26

8

22

16

32

Taux de néoformati on

en %

43,7

68,4

21 ,o

84,6

72,7

88,8

Trois Auxines de rhizogï%Gse A.I.A., P.I.B. e t A.N.A. o n t ë t é essayées 2 des concentrations var iant en t re 0 , l ma/l e t 5 mg/l. On constate, p o u r toutes ses Auxines e t en par t icu l ie r p o u r 1'A.N.A. que, au-delà de 2 mg/ l , i l y a apparit ion de sipnes évidents de toxic i té s e t raduisant par une diminution du taux d'enracinement, dnublée de tumëfaction exaq8rée des racines. L 'A.FI .A. , comparativement aux deux autres auxines A . I . A . e t /!.I.ß. conduit 2 des racines plus tuméfiées, de coloration ivo i re e t dont l'ëmission e s t toujoitrs précédée par l a formation d ' u n cal plus ou moins développé.

Les rësul t a t s les p l u s satisfaisants,en ce q u i cnncerne l e taux d'enracinement, l'abondance e t l ' .aspect des racines ont étéobtenusavec u n mélange de A.N.A. e t A.T.B. dans l a proportinn de :

.

' . A.T.P.. 1.5 mg/l . A . I . B . , 0,5 mg/l

Dès que les boutures ont ëmis des racines de quelques millimëtres de long, e l l e s sont a lors t ransfërëes sur milieu d e d6veloppement des rsc'ines d o n t l a com9osition iden- tique ã c e l l e du milieu d'induction de racines mais o0 les auxines 'de rhizogénèse prëcédentes ont é t ë supprimées. Le subs t rac t du milieu de dëvelopoement racinaire peut ê t r e de l'Agar ou mieux encore de l a Vermiculite.

Au b o u t de 8-10 semaines de sëjour sur milieu de développement rac ina i re l e s boutures a lors sont t ransfërées su r terreau ordinaire où e l l e s poursuivent leur développement en plantule. Quelques mois apri% ce t r ans fe r t en conditions ordinaires de cu l ture , l a jeune plan- t u l e a acquis un développement suf f i san t pour affronter ies aléas d'une mise en plein champ.

I1 e s t ã remarquer que l a souche d 'or igine q u i a fourni l e s premigres tiges neofor- mées, peut continuer à fourn i r de nouvelles t iges pendant u n temps pratiquement i l l i m i t ë à condition de renouveier de temps à a.utre l e milieu de cul ture . . Aprës chaque prélèvement de t i ges , de nouvelles autres apparaissent, i l s e forme a lors une vér i tab le souche q u i rappelle ce1 les des jardins de production de bois de bou tu - rage.

Les donnëes qu.i précédent démontrent l a poss ib i l i t C d 'obtenir chez 1 'P.rabusta des bourgeons nëoformés i n v i t ro . Ces expériences ont étë rëa l i sées sur t iqes orthotropes, mais i l e s t vraisemblable que d 'au t res organes , f e u i l l e , pëdoncule f lo ra l e , nnurront éqalement ê t r e u t i l i s e s pour obtenir des bourcleons néoforr?.és, e t accro î t re d 'autant !e coef f ic ien t de m u l t i - p'lication o f f e r t par ce t t e technique.

Ces techniques d ' induction de bourgeons i n v i t r o pourront éqalement ê t r e u t i l i s ées lors des doublements chromosomiques.

Les po ten t i a l i t é s de néoformation de bourgeons chez l e G. coffei, var ient selon les esp,ëces, ëlevéeschez 1 'Arabica e t 1 'hybride P.rabusta, c e t t e apti tude ä l a néoformation e s t p lu tô t f a i b l e chez l e s caféiers du groupe des l i beroides, aiissi toutes recherches basées sur 1 'obtention i n v i t r o de t ioes orthotrones 2. o a r t i r de houraeons préexis- tan ts prësentent également un réel i n t é ré t .

EMBRY OG EN ES E SO MAT I Q U E

La deuxième voie examinee dans l a recherche d'une technique de nul t ip1 ica t ion végé- t a t i v e i n v i t ro des café ie rs , f û t c e l l e de 1'EMBRYOGENESE SOMATIQUE.

581

Contrairement 2 'la neoformation q u i n ' ava i t jamais f n l t 1 'ob je t de recherches chez l e G . coffea, l'embryogénèse somatique chez ces végétaux e s t connu depuis 1970.

Nos recherches sur 1 'embryogênèse somatique ant é t @ effectuées principalement chez l 'hybride Arabusta, mais aussi chez l e C. canenhora. I c i , l e s explants sont consti tuës p a r des fragments de 1 cm de lonp, d'entrenoeud- orthotrope jeune e t chlorophyllien de clones connus deArabusta, t an tô t e n t i e r s , t an tô t fendus par l e milieu e t placés horizontalement dans l e milieu de cul ture .

Le milieu de base, pour ces recherches sur i 'embryosénëse somatique é t a i t const i tué par l a solution minérale de MURASHIGE e t SKOOG, additionnée des vitamines de MOREL. Quatre auxines, A.I.A., A.I.B., A . N . A . , 2 D.D., deux cytokinines : Kinétine e t Benzyl-Adenine ont é t e tes tées B des concentrations var iant en t re 0,@5 mq/l e t 2 mg/l. Les explants o n t pendant toute l a durée de l ' e x ~ é r i e n c e @ t é vaintenus 2 u n éc la i re - ment de 4000 l u x suivant u n régime de 12 h/nuit e t 1 2 h/jour, l a température des sa l l e s de cul ture é tan t de 26" 1" e t 28"+ 1" .

Dans le processus diobte.ntion de plantules de café ie rs par embryogénese somatique, nous avons distingue trois phases :

6 semaines, sur u n milieu consti tué par :

' b

1) une phase d'induction de ca l , cel le-ci s e deroule ä l a lumi@re, pendant 4 2

. Milieu de base *MS ' I

. l .

"; . Saccharose 30-41) g/1 . Auxine (0,5 2 1 mg/l)

2 ) Une phase de différenciat ion des embryoïdes, cel le-ci s e dëroule 2 l a lumière, sur u n milieu composé de :

. Milieu de base MS en t i e r ou di lué de moitië

. Saccharose 20 g/1

. B.A.P. 1 mg/l sa durée e s t de 8-10 semaines.

, r I

3) La 3e phase est ce1 l e de dével opnement des embryons en o1 antules . Sa durée e s t d'environ 10 semaines. Le milieu de déveloDpement des embryons est composé de l a solution des eléments minéraux de MURP,SHIFE e t SKnOG, diluée de moitié e t addition- née de :

. Vitamines de MDREL . A.I.A. @,5 i g / l

. Kinétine 0,1 mg/l

. Saccharose 10 mg/l

Cette troisieme phase peut Ptre précédée par un passage en milieu l iqu ide , aqi té . Ce q u i accélère l a dissociation e t le dëvelopoement des embryons au moment de l eu r repiquage sur milieu sol ide de développement. A u cours de ce t t e phase 3, l'embryon somatique-qui comportait une zone rac ina i re surmontée de deux pe t i t e s f eu i i l e s cotylédonnaires, s e développe, les f e u i l l e s cotylëdonnaires s ' é la rg issent e t s ' é t a l e n t , l a zone racinaire d i f fé renc ie une ou plusieurs racines piv6tantes e t on distingue dans l a plantule a insi const i tuée :

- Les f eu i l l e s cotylédonnaires - La zone hypocotyl a i re -.La ou l e s racines pivotantes

flu bout de 8 ã i 2 semaines en phase 3, l e s embryons somatiques a t te ianent un développement su f f i s an t pour &re repiqués sur terreau en condition ordinaire de cul ture-. A ce s tade l a plantule somatique rappelle parfaitement une n l a n t u l e séxuée, mais dont l a par t ie ' hypocotylaire s e r a i t anormalevent courte.

€n pnase d ' induct ion, les explants produisent des cals dont les vi tesses de crois- sance, s t ruc ture e t po ten t ia l i tés embryogënes var ient selon l e s auxines u t i l i s ées e t tes niveaux de concentration de ce l les -c i . L'acide Naphtalique Acétique ( A . N . A . ) conduit B des ca ls translucides, hyoerhydriques ã croissance rapide, mais dont les-täúx de survie sont toujours fa ib les . Ces cals prennent une coloration g r i sâ t r e q u i évolue rapidement vers l e marron. En présence de 2.4.D., e t aux concentrations 0 , l mg/l l e s cals deviennent t r è s rapidement f r i ab le s e t cotonneux. L'A.1.A. e t 1'A.I.B. conduisent 3 des ca l s dont l e s vi tesses de prol i férat ion sont infér ieures ã ce l l e s des cals développés sur A.N.A. ou 2.4.D. Ces ca l s issus de milieu ã base de A.I.A. ou A.I.R. sont t an tô t qranuleux avec de nomareuses protubérances, t an tô t f r i ab le s e t d ' u n blanc presque araenté. Pour l e s concentrations d'A.1.A. ou d'A.1.B. supérieures d 7 mq/l i l y a apDarition de racines dans 50 % des explants mis en culture. Les poten t ia l i tés embryogénèse de ces cals sont variables selon les auxines u t i l i s ées (tableaux VI1 e t VIII) .

.

Parmi l e s quatre auxines tes tées en phase d' induction, c 'est 1 'A.I.A. qui donne l e s meilleurs r é su l t a t s tan t par l e taux d'embryogénëse , que par l a régular i té de développement des embryons.

Cette super ior i té de 1 'A.I.A. se manifeste dans ¡e développement morphologique des embryons. Les embryons issus d'explants i n d u i t s en phase 1 sur 1'A.I.A. sont tou- jours b i e n consti tués avec zone racinaire e t zone cotylédonnaire, bien proportion- nées.

Les embryons i ssus d 'explants i n d u i t s sur A.N.P.. ont quelquefois un dgveloppement disproportionné, avec zone racinaire tres importante tandis que l e s cotylédons ont disparu ou sont réduits ã de simples protubérances.

Les premieres manifestations d ' u n processus d'embryoq6nëse somatique on t g6néralement eu l i e u au bout de. 3-4 mois de mise en cul ture pour l e s exolants i s sus d'hypocotyle de jeunes plantules , e t au bout de 5-6 mois pour l e s explants i s sus de t i ges ortho- tropes de café ie r adul te . I1 s ' a g i t a lo r s de protubérance de formes alobulaires , d'une coloration t r è s blanche, contrastant fortement avec l a coloration marron des ca ls d 'oû e l l e s émergent.

Dans cer ta ins cas, 7es premiëres Fanifestat ions d ' embryogenèse somatique peuvent ê t r e t r è s précoces e t s e produire au bout de 8 semaines de mise en cu l ture . Ces cas précoces sont toujours associés à un processus de neoformation antérieur.

.

p I " y

I d

Tableau VI1

TAUX D'EVRRYOGENESE SONATIQUE CHEZ L'RRAßUSTA, sur' Mi 1 ieu de base blB9 additionné de d i f f e ren te s AUXINES

L

- I

TOTAL TRA I TEMEFITS Taux embryo- qenese en %

Explants LJombre avec explants embryons Expl ants

avec embryons

. Explants ' Taux %

MB2 + 24 D 1-1-05 16,6

Mß2 + 24 D n,ni 72 4 - 5,5 O

1

24 o Mß2 + 24 D 055

n

o MP2 + ANA 0,5

24 l o Mß2 + ANA

MB2 + APIA

1 3 0

2.0

72 i 1,4 O

24 l ï + 24

MB2 + AIB 0 ,5 29, l

MB2 + BIB 130

2û,8 72 12 16,6

O y 24

72

#B2 I AIA 0.5 29,i

25,O 21 23,l

MB2 + AIA 250

33,3

Milieu de Base : MS ms Fe E D T A Vitamine de MOREL Cysteine 20 m g f i , Kinétine 0 , l mg/l Saccharose 30g/1

584

Tableau VITI

TP.UX D ' EE?ßRYOGENESE SOMATIQUE CHEZ L'NIABUSTA sur Nilieu de base MB4 additionné de différentes Auxines e t

sur Explants prëalablement i n d u i t s en néoformation

l I I Expl ants Taux

en %

a ~ e c d'embryo- TRAITEMENTS Nombre explants embryons --genese

TOTAL

Exnl ants Explants I avec 1 Taux '%

mt? ryo n s

72 _,

69

MB4 t AIB 24 8 33,3 290

0,005

n,o1

031

MB4 + 24 D 11 47,8 23

FIB4 + 24 D 4 20 ,O 60 2"

MB4 t 24 D 4 23,s 17

Eli i ieu de Base : MS, micro Heller Inosi tol 1PO mgí1 i(inetine 1,0 mq/l

27 37,s

2 2,9

- Thiamine 4 mg/l - Cystëine 20 mg/l - Saccharose 30 q/ï

585

Les embryoïdes apparai.ssenx donc sur cals de colorat ion, de s t ruc ture e t de dévelop- pebent divers , sur cal qrisâtt-e sponnieux, sur cal compa.ct e t marron, sur cal f r i a b l e e t légèrement chlorophyllien, sur cal spongieux f r i a b l e S haute fréquence embryonique. De nombreux cas d'embryoi'des ont é t ë observés sur cal d 'explants prëalablement i n - duits en néoformation. Ces embryoïdes apparaissent à l a base des explants, quelque- fois au sein mPme du milieu de cul ture .

Laissés sur milieu de différenciat ion F, base de B.A.P., l e s premiers embryons formés donnent naissance directement 3 de nouveaux embryons f i 1 s , ceux-ci apparaissent toujours au niveau de la zone racinaire . Ce processus d'auto-mu1 tip1 icat ion conduit rapidement 3 un nombre impressionnant d'embryons somatiques à p a r t i r d ' u n même explant

En régle générale, l'embryogénëse somatique e s t souvent l i é e d u n processus de v i e i l - lissement des ca l s doublé d'une d i m i n u t i o n e t d ' u n a r r ê t de l a synthèse auxinique. Ce schema se retrouve également dans cer ta ins cas d'embryooénkse somatique chez l'Arabusta, ce sont l e s cas d'embryogénGse sur cals marrons, vieux e t d 'aspect plus ou moins nécrotiques.

quelques cas de cals spongieux, t r e s fortement embryoaënes , correspondant aÜx types HSFE de SONDAEL ont é t é trouvés i c i aussi . Ces types 2 haute po ten t i a l i t é embryo- géngtique sont moins fréquents que l e s autres ca ls embryoaënes, e t leur d&lai d 'ap- par i t ion e s t beaucoup plus long.

Chez 1 'Arabusta, 1 'embryogénëse somatique apparaî t comme un ohénomhe par t i cul i6rement f ac i l e 3 déclencher. I l e s t souvent l i é au tissu de cal en voie de viei l l issement ou au t i s s u de cal préalablement indui t en néoformation. Pans ce cas , l'embryogénëse anoarai t, comme compéti t i ve du processus de rhi zogénèse.

1 blSCUSSIOPJ ET CONCLUSION

Comparativement aux techniques de bouturaoe i n v i t ro (tí p a r t i r de t i ges issues l e bourgeons néoformés ou préexistants) 1'embryogénEse somatique o f f r e un cnef f ic ien t de mu1 t ip l i ca t ion beaucoup plus élevé. Ici , 1 'embryogénèse somatique a é t é obtenue 3 p a r t i r de fragments de t i g e , mais i I ex i s te toute une sé r i e d'organes, f eu i l l e s , pédoncules f loraux, ovaires, étamines q u i pourront ê t r e u t i l i s é s comme sciure d'embryon somatique e t augmenter encore l e coeff ic ient de multiplication o f f e r t par ce procédé.

En cul ture de t i s sus , l e passage oar cal indifférencié conduit assez souvent 2 des modifications p lus ou moins importantes du ciénome de dénart , cel les-ci sont oé+- ralement fonction des substances de croissance incoroorées au milieu de culture e t de l a durëe de l a ohase : cal indifférencié .

Dans l a perspective d'une u t i l i s a t ion des embryons somatiques Pour une reproduction conforme, une embryoqénêse précoce obtenue sur un milieu â base d'A.1.A. devra i t o f f r i r davantage de garantie de conformité qu'une embryooénèse retardée en présence de milieux 3 base d'A.N.B. ou de 2.4.D.

Dans l e cas contraire o ì ~ ce t t e embryOQ&n&S€! s_omatique e s t envisaaée comme moyen d'élargissement de l a base aénétique, pour 1 a recherche de génotypes nouveaux, (var iants r e s i s t an t s aux maladies ou d f a i b l e teneur en caféine) une prolongation de l a phase cal indifférencié e s t souhaitable.

Bien q u ' i l n ' ex is te pas de l ia i sons évidentes entre : embryoaénëse somatique e t androgénëse ou gynogënëse iln v i t r o , i1 e s t vraisemblable qu'une connaissance approfondie de 1'embryogénEse somatique chez l e s café ie rs , pourra a ider R 1 'obtentinr, d'haploïdes chez ces végëtaux par cul ture i n v i t r o de ieur qamëtophyte mâle ou feme1 1 e .

'

586

t '

La inul t ip1 ica t ion véqétative i n v i t ro des cafgiers cul t ivës (par embryoggnese soma- t ique ou bouturase) permettra :

- d 'accé lérer l a diffusion de clones nouvellement sélectionnés, - d ' i n s t a l l e r e t de mult ipl ier des micro-collections de génotypes sélectionnés

- de f a c i l i t e r l e s échanges de matérlel végëtai , tout en supprimant les risques e t é v i t e r a insi l e s risques de per te de matériel véqétal de valeur,

d ' introduct ion de maladies ou d ' insec tes , .

A pTusieurs égards donc, Ta mult ipl icat ion végétative i n v i t ro des café ie rs consti tue d 'ores e t déjã un moyen u t i l e e t eff icace pour l'amélioration génétique de ces plantes.

CAPOT ( J . )

HERMAN (E .B . ) HAAS (G-J.)

PIARGARA (J . )

MURASHIGE ( T ) '

SKOOG (F . )

MURASHIGE ( T )

MOPIACO (L. C. ) SONDAHL (M.R.) CARVALHO (A. )

SHARP (W.R.) CROCOMO ( O . J :)

B I B L I O G R A P H I E

- L'amélioration du caféier en Côte d ' Ivoire . Les hybrides "Arabusta" Café - Cacao - Thé (Par i s ) , vol. XVI, no 1, janv.-mars 1972, p. 3-17

- Clonal propaqation o f C. arabica L . from ca l lus cul ture Hortscience (St Joseph, Mich.), voi. 10, n o 6, déc.1975, U. 588-589

- La inultipiication vBnétative de l a betterave (Beta vulgaris L) en culture i n v i t ro . C . P . k a d . Sci. (Paris) t. 285 s é r i e II, 1977, p. 1041-1044

- I;. revised medium f o r rapid growth on bio-assays w i t h tobacco t i s sue cul tures . Physiol . Plantar (Copenhague), 15, 1962, p . 473-497

- P1 ant propagation throuqh t i ssue cul tures. Ann. Rev. Plant Physiol. (Palo Alto) , 25, 1974, p. 135-166

- 4ppiications of t i s sue cul ture i n the imrovement of coffee. In Plant Cell Tissue and Organ Culture. '

J . Reinert e t Y.P. J . Bajaj, Springer Verlag (Berl in) , 1977, p. .109-129

587

SONDAHL (t1.R.) SHP.RP (I!. R. )

588

STARITSKY ( G . )

- 3 i n h frequency induction of somatic embryos i n cultured 1 eaf exol ants o t Coffea arabica. Z . Pf 1 anzenahysiol ( S t u t t g a r t ) , vol. 81-5, 1577, p . 395-408

- Fmbryoid formation i n call16 ciilture t i s sue PF coffee. Acta Dot . Neeri. (Leiden) , vo l . 19, n o 4 , 1970, D. 509-514

DWLIN (P.) .- Multiplication végétative i n v i t ro de 1'Arabusta. IXe Colloque Scientifique Inter- n a t i o n a l sur l e Café, Londres, 16-20 juin 1980. ASIC (Paris) , 1931, 18 p., 8 tabl., 8 réf .

Le C. arabica e t l e C.icanephora sont l e s deux espèces les plus importantes parmi l e s café-

Dans l e but d'associer les caractéristiques' d ' int8r8t de chacune de ces esp&ces, un hybride i e r s cultivés. '

tétraplolide (C. d Ivoire.

La reproduction des génotypes de valeur de cet hybride interspécifique ne peut ì%re obtenue que par voie végétative.

Des recherches SUT l a multiplication végétative i n v i t ro de 1'Arabusta ont dté entrepsises, dans l e but d'accé1érer l a diffusion des clones de valeur Arabusta nouvellement sdlectionnés.

Ces recherches ont ét6 orientées dans plusieurs directions : bouturage i n vitm de t iges issues de bourgeons orthotmpes préexistants ou néofonnés, induction d'embryogenèse somatique.

Eh raison des diff icul tés (d&infection, oxydation ...) d'obtention de tiges ?i par t i r de bourgeons déjà eds tan ts , une technique d'induction de bourgeons néoformés sur fragments d'entre- noeuds orthotropes a é t 6 mise au point.

Des embryons somatiques, capables de se développer en plantules, ont d t6 obtenus par des voies f o r t différentes.

Comparativement au bouturage i n v i t r o , l'embryogenèse somatique offre un coefficient de mul- t iplication considérablement important.

I1 importe, pour décider du choix de l a meilleure méthode, de t e s t e r l e degré de conformité des caféiers issus de chacun de ces procédés.

x C. canephora) mieux connu sous l e nom d'Arabusta a é té crée en Cbte

DUBLIN (P.) .- Vegetative multiplication of Arabusta i n vi t ro . IF Colloque Scientifique Interna- t ional sur l e Café, Londres, 16-20 juin 1980. A S I C (Paris) , 1931, 18 p., 8 tabl., 8 réf.

- - C. arabica and C. canephora are the most important species of the cultivated coffee trees. With the a i m of combining the characterist ics of importance of each o f these species, a te-

traploid hybrid (C. arabica x C. canephora), bet ter known under i t s name of Arabusta, has been created i n Ivory Coast.

The reproduction of valuable genotypes of this interspecif lc hybrid can o n l y be achieved by vegetative multiplication.

Research on the i n v i t m vegetative multiplication of Arabusta has been undertaken with the object of distributing newly-brea Arabusta clones of value.

This research was oriented i n several directions : i n v i t ro pmpagation by cuttings of stems derived from preexis t ing o r newly-formed orthotropic buds, induction of somatic embryogenesis.

Because of diff icul t ies (disinfection, oxidation) i n obtaining stems f r o m already existing buds, a technique of induction of newly-formed buds on orthotropic internode fragments has been develope d.

Somatic embryos, capable o f developing into plantlets, have been obtained by very different means.

By comparison with i n v i t r o Ktting.propagation, somatic embryogenesis gives a v e q high multiplication coefficient.

To choose the best method, the degree o f conformity of the coffee t rees derived from each of these procedures must be tested.

CUSERS (J.B.M.).- Multiplication clonale de Coffea arabica L. par culture de noeu'ds. IXe Collo- que Scientifique International sur l e Café, Londres, 16-20 juin 190. ASIC (Paris), lwl, 8 p., 6 fig., 6 tabl., 10 réf.

La multiplication clonale i n v i t r o & i c e à l'augmentation de l a formation de bourgeons axi l la i res a ét6 réalisée sur milieu LS modifié avec un génotype du Coffea arabica. Des noeuds provenant aussi bien de pousses orthotropes que de pousses plagiotropes se sont rkvélés aptes 8. Qtre des explants primaires . Les noeuds des deux origines se sont déve1oppés en pousses axil- laires ayant un aspect orthotrope. L'AB 10 m g / l a Qté l e meilleur traitement cytokinique pour

816

r

NEUVI~ME COLLO

i i I

Londres, 16-20 juin 1980 f

E I/: i,

1

i j

Association Scientifique Internationale du Café (ASIC)

42, rue Scheffer, 75016 Paris

I

r