Métodos y tamaños de muestra para el monitoreo de OGMs...Binomial con probabilidad de éxito igual a la frecuencia de individuos transgénicos en la población = π = 1-Q. •El

Métodos y tamaños de muestra para el monitoreo de OGMs:

Análisis del muestreo por lotes

Octavio Martínez de la Vega

Langebio – Cinvestav Irapuato

Junio 2012

Objetivo

• Revisar las bases del muestreo de materiales vegetales para la detección y cuantificación de organismos genéticamente modificados (OGM) – en particular plantas.

• Dar una guía sobre los tamaños y procedimientos de muestreo que optimicen el costo beneficio.

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Back to Basics • Supuestos:

– Los marcadores de modificación genética (promotores, terminadores y otros elementos introducidos por ingeniería genética) se heredan como elementos Mendelianos dominantes.

– Pueden ser detectados por PCR utilizando iniciadores específicos.

– Se encuentran en equilibrio (de Hardy-Weinberg)

• Las poblaciones son infinitas (grandes, pues)

• Son “selectivamente neutros”

• No hay mutación relevante

• No hay migración 09/07/2012 3 CIBIOGEM Junio 2012

Frecuencias Génicas

• T ( p ) – elemento transgénico, dominante

• t ( 1-p) – “Alelo” silvestre (no transgénico)

• Genotipos (frecuencia en la población) asumiendo equilibio:

TT ( p2 ), Tt ( 2p(1-p) ), tt ( (1-p)2 )









La probabilidad de un Falso Positivo

• Denotemos por “+” el evento de obtener una prueba (por ejemplo de PCR) positiva.

• Definamos algunas probabilidades condicionales:

• P*“+”|T_] = Probabilidad de obtener una prueba positiva dado que se aplicó a una muestra transgénica.

• P*“-”|tt] = Probabilidad de obtener un resultado negativo dado que se aplica a una muestra no transgénica.

• P[ tt ] = (1-p)2 = Q

• P[ tt | “+”+ = Probabilidad de falso positivo 09/07/2012 10 CIBIOGEM Junio 2012


• Usando el teorema de Bayes tenemos:

• P[ tt | “+” + = (P* “+”| tt ] P[ tt +) / P*“+”+

• Y podemos calcular:

• P*“+”+ = P*“+”| T_+P[T_+ + P*“+”| tt ]P[ tt ]

• Calculemos con:

• P*“+”| T_+ = 0.99, P*“+”| tt ] = 0.01,

• P[T_] = 0.01 y P[ tt ] = 0.99

• P*“+”+ = (0.99*0.01)+(0.01*0.99) = 0.0198 y

• P[ tt | “+” + = (0.99*0.01)/0.0198 = 0.5 !!!

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• Para simplificar un poco supongamos:

• a = P*“+”| T_+ = P* “-” | tt ]

(Esta es la probabilidad de “acierto” de la prueba y deberá ser alta).

• Obtenemos:

• P[ tt | “+” + = *(1-a)Q] / [a(1-Q) + (1-a)Q]

• Veamos una gráfica de esta función para valores relativamente altos de Q (proporción de individuos no-transgénicos)

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Conclusiones sobre falsos positivos

• Aún con pruebas MUY confiables (a ≤ 1/1,000,000) es necesario ser precavidos o tener un esquema de confirmación independiente, pues la probabilidad de falsos positivos es (relativamente) alta cuando tenemos “pocos” transgénicos (Q muy cerca de 1)

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Objetivos del muestreo

• Determinar la presencia / ausencia de transgénicos (Detección)

• Si existe, estimar la frecuencia (alélica) de los transgénicos (Cuantificación)

Costo / Beneficio; Costo:

• Total = Colecta + Extracción + PCR

• Usualmente los costos son: Colecta (fijo); Extracción < PCR

(La reacción de PCR es entre 2 y 4 veces más cara que la extracción de DNA; para poner un número específico consideremos 3 veces más cara la PCR que la extracción)

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Optimizar

• Con una cantidad fija de recursos maximizar la cantidad de información obtenida

• Esta es función de:

– Q (frecuencia de no-transgénicos; p frecuencia de T_)

– a (probabilidad de “acierto” de la prueba ≈1)

– Costos: Colecta, Extracción, PCR.

• Podemos maximizar la información con un esquema de muestreo por lotes

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Teoría del muestreo por lotes • Definamos un lote como un conjunto de k plantas

individuales tomadas al azar de la población.

• Definamos como N el número total de muestras individuales (plantas) que se analizarán y como L el número de lotes de manera que: N = Lk.

• Consideremos tres esquemas de muestreo:

– Individual (se colectan N muestras, se extraen y analizan individualmente)

– Por lotes: Se colectan N muestras en L lotes de k individuos

• A) Se extraen individualmente y se hace PCR del lote (LotA).

• B) Se extraen por lote y se hace PCR del lote (LotB)

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Teoría del muestreo por lotes • Costos por N individuos monitoreados

considerando N = Lk y tomando como unidad el costo de extracción de una muestra: C(Ind) = N (Extracción + PCR) = N(1 + 3) = 4N

C(Lot_A) = N (Extracción) + L (PCR) = N + 3L

C(Lot_B) = L (Extracción + PCR) = 4L

• Para fines de detección exclusivamente lo más económico es hacer un solo lote de N individuos!

• Sin embargo, un límite superior SEGURO para el tamaño de los lotes es k=10 individuos (20 gametos); entonces L = N/10

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Teoría del muestreo por lotes • Costos por N individuos monitoreados

considerando N = kL = 10L y tomando como unidad el costo de extracción de una muestra: C(Ind) = 4N; C(Lot_A) = 13N/10; C(Lot_B) = 4N/10

• Consideremos un presupuesto total T entonces con cada esquema podremos muestrear:

• NInd = T/4; NLotA = 10T/13; NLotB = 10T/4

• Ahora podemos comparar estos esquemas de muestreo en términos de probabilidad de detección y ganancia de información para distintos valores de Q (p)

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Teoría del muestreo por lotes

• NOTA: Diferencia entre LotA y LotB (Se colectan N muestras en L lotes de k individuos)

LotA - Se extraen individualmente y se hace PCR del lote.

LotB - Se extraen por lote y se hace PCR del lote

• La única diferencia entre estos esquemas es que LotA garantiza la equimolaridad (misma concentración de ADN) de cada muestra. Si esas muestras (extraídas individualmente) se guardan, se puede regresar a ellas para confirmar un potencial positivo)

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Teoría del muestreo por lotes • Detección: Diremos que se detectaron

transgénicos si al menos una de las muestras es positiva. Denotaremos esto como D=1 y si no hay detección escribimos D=0.

• Es razonable suponer que el número de pruebas positivas sigue una distribución Binomial con probabilidad de “éxito” igual a la frecuencia de individuos transgénicos en la población = π = 1-Q.

• El número de pruebas individuales que se realizan depende del esquema de muestreo y para fines de comparación utilizaremos el presupuesto total T.

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Teoría del muestreo por lotes

• En general tenemos:

P[D=1|π] = 1 – (1-π)N

• en donde π es la proporción de individuos transgénicos y N es el número de individuos muestreados.

• Con T fija (para comparación) obtenemos:

• P[D=1 | π, Ind] = 1 – (1-π)T/4

• P[D=1 | π, LotA] = 1 – (1-π)10T/13

• P[D=1 | π, LotB] = 1 – (1-π)10T/4

• Veamos… 09/07/2012 24 CIBIOGEM Junio 2012

Probabilidad de Detección con π=1/100

0.99

09/07/2012 25 CIBIOGEM Junio 2012

Probabilidad de Detección con π=1/1000

0.99

09/07/2012 26 CIBIOGEM Junio 2012

Probabilidad de Detección con π=1/10,000

0.99

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Costos de Detección

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Teoría del muestreo por lotes Nota al margen (probabilidad de falso positivo en

toda la prueba) • Si Q = 1; π=0 (no transgénicos) entonces la

probabilidad de falso positivo en TODO el muestreo es

P[D=1|Q=1] = 1 – (error)N • En donde • error = P*“+”| tt ] = 1 - P*“+”| T_+ = 1 – a (como antes, “a” es la probabilidad de acierto de la

prueba) • Notemos que P[D=1|Q=1+ tiende “lentamente” a

1 cuando N tiende a infinito. Por ejemplo con error=1/1e6 y N=1000 tenemos

P[D=1|Q=1] ≈ 0.01 09/07/2012 29 CIBIOGEM Junio 2012

Conclusiones sobre detección

• En todas las situaciones los muestreos por lotes tienen un menor costo que los muestreos de plantas individuales

• Desafortunadamente la verdadera proporción de transgénicos (π) es desconocida, sin embargo es fácil calcular la probabilidad de falso negativo:

P[π>0 | D=0]

(para cada esquema de muestreo y cada valor de π) 09/07/2012 30 CIBIOGEM Junio 2012

Estimación de π (Cuantificación) • Al muestrear por lotes (LotA o LotB) perdemos

cierta cantidad de información sobre la verdadera proporción de transgénicos en la población.

• Asumamos el caso en donde solo una “muestra” (planta individual o lote) es positiva, entonces nuestro estimador de π es:

• Est(π|Ind) = 1 / N (estima p2 + 2p(1-p))

• Est(π|LotA) = Est(π|LotB) = [1/N, k/N] = [1/N, 10/N]

• Es decir, al muestrear por lotes obtenemos un intervalo que es “menos preciso” que el estimador en el muestreo individual.

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Estimación de π (Cuantificación) • Llamemos X al número de muestras positivas;

XInd = Número de plantas, XLot = Número de lotes. En ambos casos X tiene una distribución binomial, β, con distintos parámetros:

• XInd ~ β(π, N) ; XLot ~ β( f(π), N/k )

• f(π) = P[ Un lote sea positivo]

= P[ Al menos una planta positiva en el lote]

= 1 – P[ No plantas positivas en el lote]

= 1 – (1-π)k

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Estimación de π (Cuantificación) • En el primer caso (XInd), XInd/N es un estimador

de máxima verosimilitud para π.

• En el segundo caso (XLot), Y = Xlot/L proporciona un estimador de máxima verosimilitud para

1-(1-π)k

• Despejando el valor de π de la ecuación anterior obtenemos

Est(π)Lot = 1 – exp[ log(1-Y) / k ] (Note que si ponemos k=1 éste estimador es idéntico al

primero)

– ¿cuánto perdemos de información?

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Conclusiones de cuantificación

• Al utilizar lotes perdemos una cierta cantidad de información (precisión) sobre el verdadero valor de la frecuencia de transgénicos (π)

• Sin embargo, si el DNA individual de las plantas se guarda (esquema LotA), es posible regresar a esas muestras (solo para los lotes positivos) y “rescatar” la información precisa sobre π.

• Esto mismo es posible si se guardan las muestras (tejido) de las plantas individuales (esquema LotB).

• En cualquiera de los casos, el esquema por lotes resulta más económico que el individual.

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Nota

• Esta presentación se elaboró con fines demostrativos. Se preparará, si se considera relevante, un paquete de programas en R (software estadístico gratuito) que implemente los cálculos de una manera sistemática y bien documentada.

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Agradecimientos • Estos esquemas se han desarrollado como parte

del proyecto de genotipificación de maíz mexicano, con financiamiento de CIBIOGEM.

• El proyecto es liderado por la Dra. June Simpson (Cinvestav Irapuato) y participan entre otros investigadores el Dr. Humberto Reyes-Valdés (UAAAN) y la Dra. Corina Hayano (Cinvestav Irapuato).

• La determinación del tamaño de lote (k=10) para optimizar muestreos de microsatélites fue desarrollada, principalmente, por el Dr. Humberto Reyes-Valdés (manuscrito en preparación).

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(algunas) Referencias

09/07/2012 38 CIBIOGEM Junio 2012

09/07/2012 CIBIOGEM Junio 2012 39

Documents

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