MSc. Romeu Moreira dos Santos - Unesp · 2017-06-16 · • Testes de ligação primária • Mensura diretamente a ligação do Ag x Ac • Testes de ligação secundária • Mensura

2015

MSc. Romeu Moreira dos Santos

2017

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INTRODUÇÃO

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

• Antígeno e Anticorpo

• Anticorpos: formas secretadas dos receptores de antígenos das células B.

• Por serem produzidos em grande quantidade em resposta ao antígeno, os

anticorpos podem ser estudados através de testes imunológicos

• Corpo humano: dois trilhões (2 x 1012)

• Antígenos são as moléculas reconhecidas pela resposta imune, enquanto os

epítopos são sítios nos antígenos aos quais os receptores das cél. B ou

anticorpos se ligam.



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INTRODUÇÃO


• INTERAÇÃO: Antígeno X Anticorpo

• É uma associação bi-molecular semelhante à interação de enzimas com

seus substratos ou de hormônios com seus receptores, com uma distinção

bem evidente o Ac não provoca nenhuma alteração química irreversível na

molécula de Ag, podendo, portanto, o produto formado (Ag-Ac) se

dissociar nos seus 2 componentes; isto é, Ag e Ac livres na solução.

AgAc(Imunocomplexos)

Ag+Ac



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INTRODUÇÃO


• INTERAÇÃO: Antígeno X Anticorpo

• Interação não-covalente reversível



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INTRODUÇÃO


• As respostas imunes são úteis de dois modos para diagnosticar uma

doença:

• Inicialmente Acs específicos podem ser utilizados para detectar ou

identificar um Ag de interesse.

• Ou por meio de detecção de Acs específicos no soro, é possível determinar

se um animal foi previamente exposto a um agente infeccioso.

• A mensuração das interações Ag x Ac com o propósito de diagnóstico é

denominada SOROLOGIA.



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INTRODUÇÃO


• As técnicas sorológicas podem ser classificadas em três grandes

categorias:

• Testes de ligação primária

• Mensura diretamente a ligação do Ag x Ac

• Testes de ligação secundária

• Mensura os resultados da interação Ag x Ac in vitro.

• Testes terciários

• Compreende os testes in vivo, que mensuram o real efeito protetor dos Acs em um

animal.



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REAGENTES UTILIZADOS EM TESES SOROLÓGICOS


• Soro

• Antiglobulinas

• Anticorpos monoclonais

• Anticorpos policlonais



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TESTES DE LIGAÇÃO PRIMÁRIA


• Testes que detectam diretamente o Ag ou Ac de interesse.

• Permitem o reconhecimento do Ag pelo Ac e os complexos imunes

formados são, então, mensurados.

• Para mensuração desta reação, um dos reagentes deve estar

quimicamente marcado



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PRINCIPAIS TESTES DE LIGAÇÃO PRIMÁRIA


• Ensaios de imunofluorescência

• Ensaios imunoenzimáticos

• Imunohistoquímica

• Dispositivos descartáveis para imunoensaios rápidos com

partículas coloidais marcadas



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ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)


Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a

uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV,

emite luz no espectro visível.

A reação é feita em lâminas de microscopia e a observação em um

microscópio com luz UV (microscópio de fluorescência)

Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína –

FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Tipos:

direta, indireta ou sanduíche.



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Teste direto - pesquisa de antígenos (células ou tecidos)

Teste indireto - pesquisa de anticorpos

Referência para sorodiagnóstico de várias doenças.

• Vírus, bactérias e protozoários



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Teste direto - pesquisa de antígenos

• Ex. – Raiva



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Teste indireto - pesquisa de anticorpos e eventualmente de antígenos



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Vantagens: limiar de detecção; específica; reprodutível; simples execução;

determinação de classes e subclasses de anticorpos

Desvantagens: microscópio de fluorescência; diminuição da fluorescência

sob irradiação; subjetividade na leitura; ausência de automação.

Fluorocromo Excitação (nm) Emissão (nm) Cor

Fluoresceína 495 525 Verde

Rodamina 552 570 Vermelho

Vermelho Texas 596 620 Vermelho

Ficoeritrina 480, 545, 565 578 Laranja



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ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS


Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima (ELISA) Um dos mais importantes imunoensaios empregados na medicina

Utillizado para detectar e mensurar tanto Acs como Ags.



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Método direto – Ags

Método indireto – Acs

Sandwich e Competitivo –Ags e Acs



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ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS INDIRETOS - ETAPAS


–Revista a superfície das cavidades de uma microplaca apropiada com Ags do agente

infeccioso que você está interessado em detectar Acs específicos.

–Adicione as amostras de soro de indivíduos a serem testados, se houver anticorpos

na amostra, eles vão se ligar aos Ags adsorvidos à superfície plástica

–Lave as cavidades da microplaca a fim de remover todos os anticorpos que não

forem específicos para o Ag em questão

–Adicione um outro tipo de Ac anti-Ig da espécie que você está pesquisando se as

amostras de soro têm ou não que deve ter sido previamente marcado com uma

enzima

–Adicione o substrato específico para a enzima e deixe a reação de degradação

enzimática prosseguir e conferir cor às cavidades da microplaca

–A intensidade da cor (DO) deve ser mensurada em leitor-fotômetro, sendo que as

leituras são proporcionais aos níveis dos Acs presentes nas amostras originais de

soro contra o Ag em questão.



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ELISA INDIRETO

Lavagens

Antígeno

Fonte de proteínas

estranhas ao sistema

LavagensLavagens

Soro anti

Conjugado anti

Lavagens




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•Sandwich-ELISA (S-ELISA) / Duplo Ac-ELISA

–As amostras são adicionadas às cavidades de uma microplaca previamente

revestidas com Acs de captura específicos para Ag que se deseja detector

–As cavidades da microplaca são lavadas p/ remover o excesso de substâncias

ou Ags que não se ligaram especificamente aos Acs de captura

–Uma preparação de Ac secundário conjugado com uma enzima apropriada é

adicionada

–O substrato enzimático é então adicionada e haverá, no caso de presença de Ag

na amostra uma mudança de cor, que pode ser mensurada em leitor-fotômetro

apropriado. A intensidade de DO é proporcional à quantidade de Ag presente na

amostra.



LOGOELISA DIRETO COM ANTICORPO DE CAPTURA

Lavagens

Antígeno

Fonte de proteínas

estranhas ao sistema

LavagensLavagensLavagens

Conjugadoanti

Soro anti




LOGOELISA




LOGOELISA




LOGOIMUNOHISTOQUÍMICA

Detecção e localização de antígenos celulares/teciduais.

Anticorpos conjugados com enzimas conversão de substrato incolor

em produto colorido (deposição pode ser observada diretamente ao

microscópio óptico).

Enzimas mais utilizadas: Peroxidase; Fosfatase Alcalina, -Galactosidase

e Glicose Oxidase.

Método direto Acs primários conjugados (antígenos).

Método indireto Acs secundários conjugados (antígenos ou anticorpos).

Desvantagens: atividade enzimática endógena, armazenamento

inadequado dos conjugados.




LOGOIMUNOHISTOQUÍMICA




LOGOImunocromatografia


• O sistema é realizado em uma matriz constituída de membrana de

nitrocelulose ou de náilon coberta por acetato transparente para facilitar a

visualização do teste. O antígeno ou o anticorpo é fixado na membrana na

forma de linhas ou pontos e o restante da membrana é bloqueado com

proteína inerte como nos testes imunoenzimáticos (ELISA).















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PRINCIPAIS TESTES DE LIGAÇÃO SECUNDÁRIA


• Testes de ligação secundária

• Mensura os resultados da interação Ag x Ac in vitro.

• Imunodifusão

• Aglutinação

• Fixação de Complemento



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IMUNODIFUSÃO

Técnica de Imunodifusão

• Termo utilizado para designar testes sorológicos realizados em meio

gelificado, no qual os reagentes só se misturam por difusão

• Dupla difusão em gel de ágar

• Reação de precipitação entre o Ag e o Ac específico em meio gelificado,

onde ambos os reagentes se difundem um contra o outro, formando uma

linha ou arco de precipitação na área de reação

• Essa técnica permite avaliar com relativa facilidade os "componentes

antigênicos" encontrados em misturas complexas



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IMUNODIFUSÃO


• Permite também revelar se duas ou mais substâncias são imunologicamente

idênticas ou independentes

• Essa prova geralmente é feita sobre lâminas de microscopia ou placas de

Petri, revestida com uma camada de gel de ágar de 0,6 a 1,5% em solução

fisiológica ou tamponada



LOGO40 µL

soro

40 µL

antígeno




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40 µL

soro

40 µL

antígeno




LOGO40 µL

soro

40 µL

antígeno

Antígeno e Anticorpo encontrando-se

em proporções ótimas




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TESTE DE AGLUTINAÇÃO


Testes de Aglutinação: – simples,mais sensíveis!

baratos, um pouco

Teste qualitativo ou quantitativo

Existem Vários Tipos:

a)

b)

c)

d)

Hemaglutinação de Eritrócitos

Aglutinação Bacteriana

Aglutinação Passiva

Inibição da Aglutinação (Inib. Hemaglutinação –HI)



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AGLUTINAÇÃO / HEMAGLUTINAÇÃO


Definição: testes que tem como seu ponto final a aglutinação de um

antígeno de natureza particulado (cels. procarióticas ou eucarióticas).

- Acs: aglutinina/hemaglutinina, principalmente do isótipo IgM* e IgG

Teste de aglutinação qualitativa

- podem ser pesquisados Ag ou Ac (via de regra, é o Ag)

Ex. tipagem dos grupos sanguíneos



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Células ou partículas insolúveis + Ac = aglutinação

Ex. tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)



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Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível

(Aglomeração dos eritrócitos na placa teste)



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FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO

TESTES SOROLÓGICOS SECUNDÁRIOS

Formação de imunocomplexos em soluções

Pode ser monitorizada pela capacidade desses complexos de fixar e

consumir as proteínas do complemento

Fácil e de baixo custo

Utilizados para a detecção de respostas imunológicas contra agentes

infecciosos (Ex. histoplasmose e coccidioidomicose)



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FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO

TESTES SOROLÓGICOS SECUNDÁRIOS



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VANTAGENS DO IMUNODIAGNÓSTICO


• Rapidez

• Simplicidade

• Possibilidade de automação

• Armazenamento de material biológico

• Baixo custo operacional

• Oferta de kits comerciais padronizados



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APLICAÇÕES DO IMUNODIAGNÓSTICO


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Diagnóstico presuntivo e diferencialDiferenciação de fases da doença

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DiagnósticoDiagnóstico

Diagnóstico

dede

de

alergiasdoenças autoimunes

imunodeficiências congênitas

– Seleção de doadores de sangue

– Seleção de doadores de órgãos para enxertos– Dosagens hormonais

- Prognóstico da doença

10 –Avaliação da eficácia da terapêutica instituída11 –Avaliação da imunidade específica (vacinação)

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– Pesquisa de antígenos em células ou tecidos– Pesquisas epidemiológicas

- Pesquisa básica e aplicada



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Obrigado!

REGULAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE

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