MỘT SỐ KỸ THUẬT CƠ BẢN

SỬ DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP

HIỂN VI

 

NỘI DUNG

1.Một số ký thuật cơ bản sử dụng trong

kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp

hiển vi

1.1. Chuẩn bị nguyên liệu

1.1.1. Cố định nguyên liệu

1.1.2. Làm mềm nguyên liệu

1.1.3. Phương pháp ngâm mủn

1.2. Chuẩn bị và nghiên cứu tiêu bản hiển

vi

1.2.1. Lá

1.2.2. Hoa

1.2.3. Thân thảo

1.2.4. Vỏ

1.2.5. Quả, hạt

1.2.6. Rễ, củ và các cơ quan dưới đất

1.3. Các chất lỏng dùng để soi và làm sáng

1.4. Cách làm tiêu bản vi phẫu thực vật

2. Phân tích vi hoá dược liệu

2.1. Các phản ứng lên thành tế bào

2.1.1. Các phản ứng lên thành tế bào

cellulose

- Phản ứng với Kẽm clorua - Iốt

- Phản ứng hoà tan trong thuốc thử  

2.2. Các phản ứng lên cacbohydrat

2.2.1. Phản ứng xác định đường với

phenyl hydrazin

2.2.2. Xác định tinh bột

2.2.3. Phản ứng xác định Inulin

2.2.4. Phản ứng thử chất nhầy

- Phản ứng tủa trong cồn và nở trong

nước của chất nhầy

- Phản ứng nhuộm kép

- Xác định chất nhầy bằng mực tàu  

2.3. Phản ứng thử chất béo

2.4. Phản ứng xác định tinh dầu

2.5. Phản ứng xác định nhựa

- Phản ứng với đồng acetat

2.6. Phản ứng thử saponin

2.6.1. Xác định saponin theo tính chất phá

huyết

2.6.2. Phản ứng với antimon clorua

2.7. Phản ứng thử alcaloid

2.8. Phản ứng thử anthranoid

2.8.1. Phản ứng với kiềm

2.8.2. Quá trình vi thăng hoa

Sveize

2.1.2. Các phản ứng lên thành tế bào hoá

gỗ

- Phản ứng với Floroglucin và acid

hydrocloric

- Phản ứng với Pemanganat Kali

- Phản ứng với safranin

- Phản ứng với safranin và xanh anilin

- Phản ứng với anilin sulfat

- Phản ứng với paranitroanilin

2.1.3. Các phản ứng lên thành tế bào hoá

bần, cutin

- Phản ứng của KOH lên bần

- Phản ứng của H2SO4 lên cutin

- Nhuộm màu bần, cutin bằng thuốc

nhuộm   màu chất béo

2.9. Phản ứng thử coumarin

2.9.1. Quan sát huỳnh quang khi mở vòng

lacton

2.9.2. Quá trình vi thăng hoa

2.10. Phản ứng thử flavonoid

2.11. Phản ứng thử tanin

2.11.1. Phản ứng xác định tanin bằng

muối sắt

2.11.2. Xác định tanin bằng dung dịch

kalibicromat

2.11.3. Xác định tanin bằng dung dịch

amonimolipdat

3. Phân tích huỳnh quang

3.1. Khái niệm về huỳnh quang và phân

tích huỳnh quang

3.2. Dụng cụ để nghiên cứu huỳnh quang

3.3. Chuẩn bị tiêu bản để nghiên cứu

huỳnh quang    

1. Một số ký thuật cơ bản

1.1.  Chuẩn bị nguyên liệu

Nguyên liệu để nghiên cứu có thể ở dạng tươi hoặc khô, khi kiểm nghiệm dược liệu tùy

mục đích mà xử lý khác nhau. Nguyên liệu tươi ngay sau khi thu hái có thể dùng để làm

các lát cắt, đôi khi được cố định trong các dung dịch khác nhau. Nguyên liệu khô phải

làm mềm. Nghiên cứu đặc điểm các tổ chức, tế bào có thể tiến hành trên nguyên liệu đã

được ngâm mủn.  

1.1.1.  Cố định nguyên liệu

Mục đích của cố định trong kiểm nghiệm dược liệu là giữ lại trong mô, tế bào dược liệu

các cấu trúc, các hoạt chất cần thiết cho những quá trình nghiên cứu tiếp theo. Tùy thuộc

vào nguyên liệu, mục đích nghiên cứu mà tiến hành cố định trong các điều kiện khác

nhau:

- Nghiên cứu giải phẫu thực vật, tế bào học, cần quan sát các thành phần cấu trúc chứa

trong mô, tế bào, cần cố định bằng các chất định hình như Carnua, FAC, Navasin v.v...

- Nghiên cứu alcaloid thường cố định thực vật trong dung dịch acid picric hoặc dung dịch

các thuốc thử alcaloid.

- Xác định hesperidin trong vỏ cam, quít v.v... cần cố định nguyên liệu trong cồn.

- Nghiên cứu tanin trong dược liệu thường cố định trong dung dịch Kali cromat, chì

acetat v.v...

1.1.2. Làm mềm nguyên liệu

Các dược liệu khô, cứng khi làm tiêu bản cần làm mềm trước, có nhiều phương pháp làm

mềm: làm mềm lạnh, làm mềm trong buồng ẩm, làm mềm nóng v.v...

Làm mềm lạnh: Các phần cây: rễ, quả, hạt, các bộ phận dưới đất, thường tiến hành làm

mềm bằng cách cho vào hỗn hợp  Nước - Glycerin - Ethanol (1:1:1) mẫu được giữ cho

đến khi các mô thấm no chất lỏng, theo cách này mất nhiều thời gian (tùy thuộc vào độ

dày của mẫu và cấu trúc các mô mà ngâm vài ngày đến vài tuần) nhưng rất tốt bởi vì

không khí được giải phóng ra khỏi các mô và một phần được làm sáng.

Phương pháp làm mềm đơn giản thường được sử dụng nhất: Ngâm mẫu vào nước một

vài giờ sau khi mềm chuyển vào hỗn hợp Glycerin - Ethanol (1:1) hay  Nước - Glycerin -

Ethanol (1:1:1) giữ ở trong hỗn hợp 1 - 3 ngày. Trong hỗn hợp này mẫu có thể bảo quản

lâu dài. Khi cần mẫu chắc hơn bỏ vào hỗn hợp Glycerin - Ethanol (1:2) ngâm một thời

gian.

Làm mềm trong buồng ẩm: Có thể sử dụng bình hút ẩm kín. Cho nước vào bình và mẫu

vào bát nhỏ, thả nổi bát trong bình. Mẫu không tiếp xúc với nước mà chỉ bị ẩm bởi hơi

nước trong bình, phương pháp này tốn thời gian song là phương pháp tốt nhất vì nó đảm

bảo giữ được cấu trúc tế bào và các thành phần khác mà không bị rửa đi, thăng hoa,

trương phồng, nhầy hoá - là những hiện tượng thường xảy ra khi sử dụng các phương

pháp làm mềm khác. Với dược liệu mềm, mỏng, làm ẩm khoảng một ngày, dược liệu

cứng khoảng 2-3 ngày, để tránh mốc có thể xảy ra trong quá trình làm ẩm người ta thêm

vào nước một ít  phenol hoặc formaldehyd. Nhược điểm của phương pháp làm ẩm này là

trong dược liệu còn lại nhiều khí cần phải loại khi làm tiêu bản.

Làm mềm nóng: là phương pháp đơn giản và nhanh, cho những mẩu dược liệu dài 2-3 cm

vào nước, đun sôi. Vỏ thường đun khoảng 3-5 phút, các cơ quan khác tùy độ rắn và mức

độ hoá gỗ của mô mà đun sôi trong 10-30 phút. Quả và hạt có thể làm ẩm bằng hơi nước,

gói quả hay hạt vào vải màn, treo trong hơi nước đun sôi 15-30 phút hay hơn tùy thuộc

vào độ cứng của chúng. Lá và hoa không yêu cầu xử lý lâu, phức tạp, để làm mềm và tẩy

sáng đun chúng trong dung dịch cloral hydrat 66%. Sau khi đun lấy ra, rửa sạch bằng

nước và làm các lát cắt. Ðặc điểm của phương pháp làm mềm nóng là làm trương nở

thành tế bào và làm rửa trôi chất tế bào.  

1.1.3. Phương pháp ngâm mủn

Trong nghiên cứu thực vật nói chung và kiểm nghiệm vi học dược liệu nói riêng thường 

sử dụng phương pháp ngâm mủn. Ðó là phương pháp phân tách tế bào khác nhau nằm

trong cấu tạo của các loại mô. Bằng cách này màng gắn giữa các tế bào bị phá hủy, các tế

bào tách rời nhau mà không bị hư hại do vậy ta có thể nghiên cứu chi tiết cấu tạo của

từng tế bào một từ khắp mọi phía. Phương pháp ngâm mủn có ý nghĩa quan trọng trong

nghiên cứu giải phẫu thực vật đặc biệt trong kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp

soi bột.

Tùy từng loại dược liệu mà sử dụng các phương pháp ngâm mủn khác nhau, cơ sở của đa

số các phương pháp này là xử lý mô bằng acid mạnh, các acid sẽ thủy phân màng giữa

làm nhiệm vụ nối các tế bào với nhau, một số trường hợp ngâm mủn bằng kiềm. Ngày

nay người ta thường ngâm mủn bằng men pectinaza, khi dùng men quá trình thủy phân

xảy ra trong điều kiện ôn hoà hơn nên không làm hỏng tế bào. Với nguyên liệu cứng rắn

như gỗ có thể ngâm mủn bằng cách đun các mảnh nguyên liệu trong HNO3  10% khoảng

vài phút, khi đạt độ mủn rửa sạch bằng nước rồi đặt vào một giọt nước trên phiến kính,

dùng kim nhọn để tách rời các tế bào. Nếu nguyên liệu được xử lý tốt thì chỉ cần đậy lá

kính rồi ấn nhẹ lên lá kính là các tế bào tự tách rời nhau. Người ta đánh giá quá trình

ngâm mủn theo mức độ vụn nhỏ của mô khi ép dưới lá kính. Với nguyên liệu rắn có thể

dùng dung dịch ngâm mủn Schulze: cho những mẩu nguyên liệu nhỏ vào ống nghiệm có

chứa hỗn hợp 2 ml  HNO3 đậm đặc và 0,3 g Kali clorat đun đến khi tạo bọt (tiến hành nơi

thoáng gió hoặc trong tủ hốt) và để một vài phút cho đến khi mẩu nguyên liệu bị tẩy

trắng. Ðể nguội, lấy nguyên liệu ra, rửa sạch bằng nước rồi tiến hành tiếp tục như trên.

Với nguyên liệu rắn còn có thể ngâm mủn bằng hỗn hợp HNO3 10% và Kali dicromat

10% theo tỷ lệ 1:1 ngâm 24-48 giờ ở 600C (Hỗn hợp này có thể dùng để ngâm mủn

nguyên liệu mềm trong 24 giờ ở 300C). Với nguyên liệu mềm như lá cây, chồi, các loại

thân cỏ có thể ngâm mủn trong dung dịch acid cromic 1% trong nước một vài ngày, có

thể đun nhẹ để phản ứng nhanh hơn hoặc ngâm mủn bằng acid cromic 5% hoặc HCl 1N,

ngâm mẫu trong các dung dịch này ở 300C trong vài giờ, sau khi ngâm rửa sạch và tiến

hành như mô tả ở trên. Với nguyên liệu có chứa các ống tiết, ống nhựa mủ, túi nhựa và

tinh dầu v.v... sử dụng phương pháp ngâm mủn bằng kiềm sẽ tách các mô mà không làm

hỏng thành mỏng của các tế bào. Tiến hành cụ thể như sau: Ðun sôi nguyên liệu trong

NaOH 3-5% trong vòng 30 phút hoặc đun nóng trong dung dịch NH4OH 25% khoảng 40

phút.

Ðối với các mẫu cây thảo, còn tươi thường dùng phương pháp tách bằng enzym. Mô

được ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ với pectinaza 5% sau khi rửa để loại enzym tiến

hành tiếp tục như trên.

Thông thường trong các mô có chứa khí ngăn cản quá trình thâm nhập của các tác nhân

gây mủn vì vậy với các mẫu ngâm mủn bằng phương pháp không đun nóng cần phải đun

sôi trước trong nước để loại không khí hoặc tiến hành loại không khí trong điều kiện chân

không, cụ thể: thả những mẩu mô nhỏ (thường nhỏ hơn 0,5cm) vào nước chứa trong bình,

nối với bơm chân không, không khí trong bình được hút ra trong vòng 10-12 phút, lặp lại

vài lần.

 1.2.   Chuẩn bị và nghiên cứu tiêu bản hiển vi

Tiêu bản hiển vi thường được làm từ dược liệu đã được xử lí sơ bộ (1.1.). Cách làm tiêu

bản phụ thuộc vào các đặc điểm hình thái, trạng thái của nguyên liệu (nguyên vẹn, các

mảnh bị cắt rời, bột...) và mục đích nghiên cứu. Cơ sở của kiểm nghiệm hiển vi là giải

phẫu thực vật và hoá thực vật (dựa vào các đặc điểm thực vật cũng như dựa vào các phản

ứng vi hoá, mô hoá), trong quá trình kiểm nghiệm hiển vi cần có hiểu biết sâu sắc về cấu

tạo giải phẫu, các cơ quan của cây cũng như trạng thái tồn tại, tính chất hoạt chất của

dược liệu. Những kiến thức này có vai trò quan trọng trong việc xác định các đặc điểm,

các phản ứng đặc trưng của đối tượng nghiên cứu, cho phép phân biệt các cơ quan tương

tự của các dược liệu khác nhau. Sau đây là một số vấn đề cần lưu ý khi kiểm nghiệm

dược liệu từ các cơ quan khác nhau.

1.2.1. Lá

Lá mỏng có thể quan sát dưới kính hiển vi không cần cắt lát, thông thường để tẩy sáng

mô lá khô đun sôi lá trong dung dịch kiềm hoặc trong dung dịch cloral hydrat 30% trong

vòng 10-15 phút. Các lá nhỏ khi tẩy sáng lấy cả lá, lá to hoặc lá bị cắt nhỏ lấy các phần

khác nhau có chứa các yếu tố có thể dùng để chẩn đoán như mép lá, răng lá, gân chính,

bề mặt trên, dưới v.v... Lá hoặc các mẩu lá sau khi tẩy sáng rửa bằng nước, lên kính trong

glycerin hoặc dung dịch cloral hydrat. Lá dày cần phải làm các lát cắt ngang, một số lá có

thể dùng dao sắc để tách phần biểu bì ra khỏi thịt lá.

Ðể nghiên cứu bột lá dùng kim mũi mác lấy một lượng nhỏ bột cho lên phiến kính đã có

sẵn  2-3 giọt dung dịch cloral hydrat, nghiền bột cho thấm dung dịch, đặt phiến kính và

đun nóng 2-3 phút để làm trong các mô lá (có thể đun đến khi tạo bọt khí), sau khi để

nguội di nhẹ lên lá kính để tạo nên lớp bột mỏng, không chồng chéo lên nhau. Cần chú ý

làm sạch lá kính và đủ chất lỏng để soi. Lá có chứa nhiều chất diệp lục làm sáng trong

dung dịch như trên ít có hiệu quả. Trong trường hợp này có thể làm trong bột lá bằng

dung dịch NaOH 3%, khi đun nóng dung dịch nhanh chóng bay hơi vì vậy cần chú ý theo

dõi để tiêu bản không bị khô. Sau khi đun nóng cần thêm 1-2 giọt glycerin để ngăn cản sự

kết tinh của kiềm và làm cho tiêu bản lâu khô. Các yếu tố đặc trưng chủ yếu để kiểm

nghiệm lá là biểu bì, lông che chở, lông tiết, tuyến, tinh thể.

Biểu bì: Lá của các cây khác nhau đặc trưng bởi các dạng tế bào biểu bì xác định, ở một

số cây tế bào biểu bì có dạng uốn khúc nhiều hoặc ít, ở một số có nhiều góc, có khi tế bào

biểu bì bị kéo dài rõ rệt theo một hướng v.v... Kích thước của tế bào biểu bì là một trong

các yếu tố đặc trưng để xác định các cây. Tế bào biểu bì thường được bọc bởi một lớp

màng mỏng cấu tạo từ cutin, đa số trường hợp cutin có bề mặt nhẵn song đôi khi tạo

thành các nếp gấp thẳng hoặc lượn sóng, hay có những chỗ lồi dưới dạng u, mấu. Các đặc

điểm của lớp cutin bao phủ biểu bì cũng như chiều dày của nó đặc trưng cho một số loại

cây có ý nghĩa trong kiểm nghiệm dược liệu. Chiều dày của lớp cutin có thể quan sát rõ

khi nhuộm tiêu bản (lát cắt ngang) bằng dung dịch  Sudan III. Biểu bì lá có các lỗ khí,

dạng của lỗ khí, sự phân bố của chúng (ở một mặt, hai mặt lá) và đặc điểm của các tế bào

biểu bì bao quanh là những đặc điểm đặc trưng đối với mỗi dạng cây hoặc họ và là những

đặc điểm có ý nghĩa trong kiểm nghiệm. Dựa vào đặc tính phân bố của lỗ khí và các tế

bào biểu bì bao quanh người ta phân biệt ra nhiều kiểu:

- Kiểu lỗ khí không có tế bào kèm (Kim ngân)

- Kiểu hỗn bào: lỗ khí bao bọc bởi tế bào giống như tế bào biểu bì, không có tế bào phụ

(họ Hoàng liên)

- Kiểu song bào: lỗ khí bao bọc bởi hai tế bào phụ nằm song song với trục dọc của nó (họ

Cà phê)

- Kiểu trực bào: lỗ khí bao bọc bởi hai tế bào phụ nằm thẳng góc với trục dọc của lỗ khí

(họ Cẩm chướng).

- Kiểu dị bào: lỗ khí bao bọc bởi ba tế bào phụ một tế bào nhỏ hơn rõ rệt so với hai tế bào

kia (họ Cải) v.v...

Số lượng lỗ khí (số lỗ khí trên 1 mm2 biểu bì) và chỉ số lỗ khí (tỷ lệ lỗ khí và số tế bào

biểu bì trên một đơn vị diện tích) thường là những đại lượng cố định đối với một loài,

trong nhiều trường hợp chúng cho phép phân biệt các loài của cùng một chi.

 ở các lát cắt ngang phiến lá khi quan sát mô giậu có thể thấy một hàng hay hai hàng, có

thể chỉ có ở mặt trên hoặc cả hai mặt. Tỷ lệ mô giậu (số tế bào của mô giậu dưới mỗi tế

bào biểu bì) cũng có ý nghĩa đặc trưng cho các loài.

Lông: ở phần lớn thực vật tế bào biểu bì mọc dài ra tạo thành lông. Lông có thể có ở

nhiều phần của cây, chúng có thể tồn tại trong suốt đời sống của một cơ quan, hoặc chỉ

một thời gian. Lông thường hết sức khác nhau trong các họ cây, các nhóm cây nhỏ hơn

và ngay trong cùng một cây, đôi khi lại có sự khá đồng nhất về lông trong phạm vi một

nhóm cây. Lông có thể phân chia thành nhiều loại hình thái khác nhau, về mặt cấu trúc

lông có thể chia thành loại đơn bào và đa bào. Lông đơn bào có thể phân nhánh hay

không phân nhánh. Lông đa bào có thể bao gồm một dãy tế bào riêng lẻ hoặc phân nhánh.

Một số lông có các nhánh toả ra nhiều hướng trong một mặt phẳng (lông hình sao).

Thường một lông đa bào có thể phân chia thành phần chân (phần bám vào biểu bì) và

phần lồi trên bề mặt. Những tế bào quanh chân đôi khi về mặt hình thái khác hẳn với tế

bào biểu bì khác. Có kiểu lông hình khiên gồm một phiến tế bào hình đĩa, phần nhiều

được sinh ra trên một cán hoặc đính trực tiếp vào chân. Những lông đơn bào, đa bào và

hình khiên có thể là lông tiết. Một số lông đa bào đơn giản có thể bao gồm một chân và

một đầu đơn bào hoặc đa bào, các đầu thường tạo thành phần tiết của lông. Bề mặt lông

có thể nhẵn hay sần sùi tùy thuộc vào đặc điểm của lớp cutin bao bọc. Kích thước của

lông cũng rất khác nhau, ở một số cây lông có thể quan sát bằng mắt thường, có cây phải

dùng kính lúp, kính hiển vi. Sự đa dạng của lông là một trong những yếu tố quan trọng

nhất để phân biệt dược liệu. Người ta cũng đã sử dụng thành công việc phân loại các chi,

thậm chí các loài ở một số họ và trong việc nhận biết cây lai giữa các loài dựa vào kiểu

lông.

Các tuyến tiết, túi tiết, ống nhựa mủ: Trong lá nhiều cây có chứa tinh dầu, vị trí tinh dầu

có thể rất khác nhau, ở một số cây tinh dầu chứa trong các tuyến tiết nằm trên bề mặt biểu

bì (Bạc hà, Hương nhu) một số cây khác tinh dầu chứa trong các túi tiết (lá Bạch đàn).

Cấu tạo của túi tiết, tuyến tiết tinh dầu thường đặc trưng cho mỗi chi cây, có khi đặc

trưng cho toàn họ. Ví dụ họ Bạc hà có tinh dầu chứa trong các lông tiết hình bánh xe,

nhiều cây trong họ Cúc có tuyến tiết gồm hai hàng tế bào xếp thành 3-4 lớp. Một số cây

có các túi tiết, ống tiết đặc biệt chứa tinh dầu, nhựa, nhựa mủ. Ðặc điểm và phân bố của

tuyến tiết tinh dầu, các túi tiết, ống tiết với tinh dầu, nhựa, nhựa mủ trong đó là những

đặc điểm đặc trưng để phân biệt các nguyên liệu khác nhau khi kiểm nghiệm dược liệu.

Tinh thể: Trong cây thường gặp các tinh thể calci oxalat, đôi  khi có tinh thể của các chất

khác như calci sulfat, calci cacbonat, oxyt silic (SiO3). Dạng của các tinh thể rất khác

nhau và đặc trưng đối với mỗi loài cây, có khi đặc trưng cho chi thậm chí cho cả họ.

Calci oxalat thường gặp dưới dạng đơn hoặc kép, hình lăng trụ, hình kim, bó, cầu gai, cát

có khi tập trung thành khối, thông thường trong một cây calci oxalat thường ở một dạng

nào đó, có những cây calci oxalat ở 2-3 dạng.     Hình dạng các tinh thể cũng như vị trí

của chúng có ý nghĩa trong kiểm nghiệm dược liệu. Các tinh thể calci oxalat không hoà

tan trong nước và trong acid acetic mà hoà tan trong acid hydrocloric, acid nitric, acid

sulfuric. Khi tác dụng với acid sulfuric xảy ra quá trình hoà tan tinh thể và lại tạo nên tinh

thể calci sulfat, quá trình này xảy ra nhanh và có thể quan sát dưới kính hiển vi. Ðể quan

sát tinh thể calci oxalat trong các cơ quan có thể sử dụng các chất lỏng làm sáng tiêu bản

như  cloral hydrat, lactophenol.

Khi nghiên cứu tinh thể nên sử dụng kính hiển vi phân cực vì dưới kính hiển vi phân cực

thấy rất rõ các tinh thể, thậm chí có thể quan sát được những mảnh tinh thể rất nhỏ. Ðể

nghiên cứu tinh thể dưới kính hiển vi phân cực có thể làm các tiêu bản cố định không

nhuộm màu trong bôm Canađa. Trong lá một số cây có chứa nang thạch (đá túi) cũng là

đặc điểm đặc trưng khi kiểm nghiệm dược liệu.

Khi nghiên cứu lá đã nghiền nhỏ một số yếu tố có thể bị biến dạng song phần lớn vẫn giữ

nguyên dạng và các đặc điểm của chúng, đó là những yếu tố để xác định dược liệu khi

kiểm nghiệm.  

1.2.2. Hoa

Trước khi làm tiêu bản cần làm mềm hoa hoặc các bộ phận của hoa (1.1.2.), sau khi rửa

sạch bằng nước, đặt lên phiến kính trong một giọt chất lỏng để soi (nước, glycerin, dung

dịch cloral hydrat) dùng kim mũi mác làm cho phẳng, đậy lá kính, nung nóng để loại

không khí, nghiên cứu dưới kính hiển vi bề mặt các bộ phận của hoa. Các yếu tố có ý

nghĩa trong kiểm nghiệm vi học hoa là: hạt phấn, biểu bì trong, ngoài của cánh hoa, đài

hoa, lá bắc, tế bào của cuống hoa, lông, tinh thể calci oxalat, tuyến tiết tinh dầu...

Phân tích bột hoa cần chú ý tới các hạt phấn, các mảnh mô với tinh thể (nếu có), các

mảnh biểu bì cánh hoa, các yếu tố cơ giới của lá bắc, lông. Trong nhiều trường hợp hạt

phấn là yếu tố định hướng trong kiểm nghiệm.

1.2.3. Thân thảo

Xác định thân thảo chủ yếu theo lá, cần làm tiêu bản từ lá hoặc các mẩu lá (nếu dược liệu

bị cắt nhỏ). Khi nghiên cứu thân thảo không có lá làm tiêu bản biểu bì và lát cắt ngang

thân. Dược liệu phải được làm mềm (1.1.2.), làm tiêu bản, lên kính bằng nước, glycerin

hay dung dịch cloral hydrat quan sát bề mặt biểu bì và cấu trúc giải phẫu. Với các mẩu

thân bị cắt nhỏ có thể nghiên cứu bằng phương pháp ngâm mủn (2.1.3.) Làm tiêu bản từ

bột dược liệu thân thảo cũng tiến hành như bột từ lá, không nên lấy những mảnh thân lớn

vì khó làm sáng, hơn nữa những mảnh này ít có ý nghĩa trong kiểm nghiệm và gây khó

khăn khi làm tiêu bản. Xác định dược liệu thân thảo tiến hành như với lá vì vậy những

yếu tố có ý nghĩa trong kiểm nghiệm lá cũng có ý nghĩa trong kiểm nghiệm thân thảo.

Bột cây thân thảo được phân biệt ở chỗ ngoài những yếu tố, đặc điểm của lá còn gặp các

yếu tố, đặc điểm của thân, hoa, các bộ phận của quả. Với thân đặc điểm quan trọng nhất

là biểu bì và hình dạng tế bào biểu bì. Mảnh mạch của thân thường lớn và thẳng phân biệt

với mảnh mạch nhỏ, phân nhánh của lá. Trong bột dược liệu thân thảo thường gặp các

yếu tố từ hoa như hạt phấn, biểu bì cánh hoa, nhị, các yếu tố từ quả như tế bào biểu bì vỏ

quả, nếu quả chín có thể thấy các lớp vỏ hạt, các mảnh nội nhũ với dầu béo, các giọt dầu

béo.

1.2.4. Vỏ

Khi nghiên cứu vỏ thường làm các lát cắt ngang và dọc. Nguyên liệu sau khi xử lý (1.1.)

tiến hành làm các lát cắt, lên kính trong dung dịch cloral hydrat, nước hay glycerin, đậy

lá kính và đun nóng để làm sáng tiêu bản và loại không khí. Ðể làm rõ các cấu trúc hay

hoạt chất xử lý lát cắt bằng các thuốc thử tương ứng.

Khi nghiên cứu các lát vỏ cắt ngang dưới kính hiển vi cần chú ý tới độ dày và đặc điểm

cấu tạo của lớp bần,  chiều rộng của tia tủy, các yếu tố cơ giới như sợi, libe, tế bào mô

cứng, thể cứng, cấu tạo, phân bố và số lượng của chúng. Cấu tạo, kích thước của sợi, tế

bào mô cứng quan sát rõ hơn trên các lát cắt dọc. Trong vỏ một số cây có ống nhựa mủ

hay túi chứa tinh dầu có ý nghĩa trong kiểm nghiệm dược liệu.

Hầu như trong vỏ luôn có tinh thể calci oxalat chúng thường phân bố trong các mô mềm.

Tinh bột cũng thường có trong mô mềm vỏ nhưng không có ý nghĩa kiểm nghiệm vì hầu

như tất cả các hạt tinh bột gần tương tự nhau: nhỏ, hình tròn hoặc hình trái xoan. Các

phản ứng vi hoá để phát hiện hoạt chất cũng như phản ứng xác định sự hoá gỗ của các

yếu tố vỏ có vai trò lớn khi kiểm nghiệm.

1.2.5. Quả, hạt

Khi nghiên cứu quả, hạt dưới kính hiển vi người ta thường làm các lát cắt ngang. Ðể

nghiên cứu toàn diện cần làm và quan sát các lát cắt ngang qua các phần khác nhau của

quả, hạt và nghiên cứu chi tiết ở những lát cắt phần giữa vì ở đó các yếu tố cấu trúc được

thể hiện đầy đủ nhất. Ðể làm các lát cắt từ quả, hạt nhỏ cần cố định trong parafin và đặt

chúng cẩn thận đúng theo hướng xác định.

Vỏ quả có ý nghĩa quan trọng nhất trong kiểm nghiệm quả. ở một số quả vỏ quả có các

ống, túi tiết tinh dầu, số lượng và phân bố của chúng là những đặc trưng chủ yếu đối với

từng loại quả xác định.

Số lượng hạt, dạng hạt, phân bố của hạt trong quả, mô cơ giới của vỏ quả, lông biểu bì

quả cùng với các phản ứng vi hoá xác định chất béo, tinh dầu, các yếu tố hoá gỗ v.v...là

các vấn đề có ý nghĩa trong kiểm nghiệm quả, bột quả.

Khi nghiên cứu hạt dưới kính hiển vi cần chú ý tới cấu trúc chung của hạt (Ðặc điểm vỏ

hạt, độ lớn các mô dinh dưỡng, nội nhũ, dạng và vị trí của phôi, rễ mầm, các lá mầm)

hình dạng, kích thước tế bào vỏ hạt có ý nghĩa phân biệt. Cấu tạo nội nhũ và các mô của

phôi (trừ một vài dược liệu - Mã tiền, quả họ Cần) thường không khác nhau nhiều. Khi

nghiên cứu bột hạt đặc điểm của lớp vỏ hạt là đặc trưng quan trọng nhất.

1.2.6. Rễ, củ và các cơ quan dưới đất

Nghiên cứu hiển vi các cơ quan này tiến hành làm tiêu bản cũng như với các cơ quan

khác song vì tinh bột là yếu tố có ý nghĩa lớn trong xác định nguyên liệu nên khi làm

mềm (1.1.2.) cần sử dụng các phương pháp lạnh để giữ nguyên trạng thái của chúng.

Nghiên cứu đặc điểm phân bố các mô dẫn (bó mạch dẫn) cần làm lát cắt qua tất cả các

phần của rễ hay củ rễ và quan sát ở độ phóng đại nhỏ. Sau đó nghiên cứu chi tiết các cấu

trúc, thành phần các mô với độ phóng đại lớn. Số lượng các lát cắt không cần nhiều song

phải đại diện cho tất cả các phần có chứa các yếu tố khác nhau. Ðầu tiên thường nghiên

cứu các lát cắt không đun nóng để nhận xét sự có mặt của tinh bột, hình dạng và kích

thước của chúng, sau đó đun nóng tiêu bản để tẩy sáng và nghiên cứu các đặc điểm giải

phẫu. Thường sử dụng cloral hydrat làm chất lỏng lên kính, ít khi dùng glycerin và nước.

Ðể nghiên cứu cấu trúc hay các chất thường xử lý lát cắt bằng các thuốc thử tương ứng.

Nghiên cứu bột rễ và rễ củ thường bắt đầu với việc xác định các chất dinh dưỡng dự trữ,

lên kính bột dược liệu trong nước hay trong dung dịch Lugol (đối với tinh bột) hay trong

dung dịch Sudan III (đối với dầu béo). Ðể nghiên cứu những mảnh mô riêng biệt cần

quan sát trong dung dịch cloral hydrat sau khi đun nóng (làm sáng). Ðặc điểm cấu tạo,

phân bố của các mô dẫn (gỗ, libe), sự biến đổi của chúng trong quá trình phát triển cá thể

cùng với các đặc điểm giải phẫu khác (sợi, thể cứng, ống nhựa mủ, túi chứa tinh dầu,

nhựa, hạt tinh bột, tinh thể) có ý nghĩa quan trọng trong kiểm nghiệm. Kết quả các phản

ứng vi hoá định vị hoạt chất làm tăng thêm độ xác thực.

1.3. Các chất lỏng dùng để soi và làm sáng

Ðặc tính môi trường để soi đặc biệt là những chất làm sáng tiêu bản có ý nghĩa rất quan

trọng trong kỹ thuật vi học. Làm sáng tiêu bản tức là làm cho đối tượng nghiên cứu trở

nên sáng hơn, rõ ràng hơn bằng cách loại bỏ ảnh hưởng của các thành phần trong tế bào

cản trở sự quan sát. Các chất lỏng có thể làm sáng bằng tác dụng hoá học, dẫn tới phân

hủy, hoà tan, làm mất màu tất cả những thành phần ?thừa? trong tiêu bản nghiên cứu

hoặc bởi tác động vật lý vì có những chất trơ về mặt hoá học nhưng có hoạt tính quang

học, tạo ra những điều kiện xác định để ánh sáng xuyên qua tiêu bản làm cho các chi tiết

của đối tượng được quan sát tốt hơn. Các đối tượng quan sát được càng rõ khi sự khác

nhau về chỉ số khúc xạ ánh sáng của nó với môi trường soi càng lớn. Các cấu trúc thành

tế bào cellulose có chỉ số khúc xạ  n=1,52.  Chỉ số khúc xạ của glycerin  n=1,47, của

lactophenol  n=1,48. Khi các đối tượng có cấu trúc tế bào mỏng, trong lên kính bằng

nước (n=1,33) quan sát rõ hơn lên kính bằng glycerin và lactophenol. Nếu đối tượng ít

trong suốt cần sử dụng chất lỏng để soi có chỉ số khúc xạ lớn, loại đối tượng này lên kính

bằng glycerin và lactophenol sẽ trong suốt hơn khi lên kính bằng nước.

Ðể làm sáng tiêu bản sử dụng các chất lỏng khác nhau, tùy vào bản chất của đối tượng,

mật độ  (độ sít) của mô, các cấu trúc tế bào. Thông thường dùng nước, glycerin. cloral

hydrat, kiềm, nước oxy già để soi và làm sáng. Ta lần lượt xét từng chất:

- Nước: là chất lỏng trung tính thường sử dụng để lên kính vì nước không làm biến đổi

hình dạng, độ lớn của tế bào, cấu trúc và màu của mô. Các hạt tinh bột nhìn rõ trong môi

trường nước, hạt alơron bị phân hủy, dầu béo tập hợp lại thành giọt lớn, chất nhầy bị hoà

tan, các mô tối khó phân biệt.

- Glycerin: Khi dùng pha loãng với nước theo tỷ lệ 1:1 (glycerin không pha loãng hút

nước từ mô làm nhăn rúm mẫu và làm biến dạng chúng). Chỉ trường hợp khi nghiên cứu

các chất hoà tan trong nước (Ví dụ: chất nhầy) sử dụng glycerin không pha hoặc pha nó

với cồn theo tỷ lệ 1:1. Glycerin cũng là một chất lỏng trung tính nhưng so với nước nó có

ưu điểm là lâu khô và có tính chất làm sáng nhẹ, dưới tác dụng lâu dài của glycerin các

mô trở nên trong suốt hơn.

- Cloral hydrat: Sử dụng dưới dạng dung dịch đậm đặc trong nước để làm sáng các lát cắt

dày, bột dược liệu trên kính hiển vi. Cloral hydrat là một trong những chất làm sáng tốt

nhất, nó nhanh chóng thấm vào tế bào, loại bọt khí ra. Trong cloral hydrat các hạt tinh bột

trương ra, dầu béo và tinh dầu ban đầu tập hợp lại thành giọt lớn hơn, sau đó dần dần bị

hoà tan. Protein, clorofin và các chất khác bị phá hủy, các mô có màu thẫm sáng lên, các

tinh thể không bị biến đổi. Thông thường đun nóng các mẫu khi cho vào dung dịch cloral

hydrat, đôi khi đun đến sôi nhẹ để tăng cường tác dụng làm sáng và rút ngắn thời gian.

Nhược điểm của cloral hydrat là làm biến dạng các mô do thành tế bào trương phồng

mạnh.

- Kiềm:  sử dụng dung dịch trong nước, nồng độ kiềm và thời gian xử lý tùy vào đối

tượng nghiên cứu, thường sử dụng dung dịch 3-5% đôi khi 10-15%. Dung dịch NaOH là

chất làm sáng mạnh, trong dung dịch NaOH hạt tinh bột trương phồng và bị hồ hoá. Khi

tác dụng lâu dài hay đun nóng dược liệu trong kiềm chất béo bị xà phòng hoá, protein bị

hoà tan, các mô thẫm sáng ra. Trong dung dịch kiềm thành tế bào giãn nở, thay đổi hình

dạng, kích thước và dễ bị vỡ khi bị tác động. Có thể dùng KOH hoặc NH 4OH, NH4OH có

ưu điểm là ít làm giãn nở thành tế bào.

- H2O2: sử dụng dung dịch 3% để làm sáng, nồng độ cao hơn H2O2 làm mủn các mô dược

liệu.

1.4.  Cách làm tiêu bản vi phẫu thực vật

Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu có thể tiến hành làm tiêu bản dược liệu theo các quá

trình khác nhau, tài liệu này giới thiệu phương pháp làm tiêu bản vi phẫu thường sử dụng

phổ biến trong nghiên cứu thực vật.

Tiêu bản tạm thời: Khi nghiên cứu cấu tạo giải phẫu cần xác định nhanh, không giữ lại

mẫu có thể làm tiêu bản đơn giản như sau:

1. Dược liệu tươi hay khô đã ngâm mềm cắt ngang hoặc cắt dọc bằng lưỡi dao cạo hoặc

dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay, chọn các lát cắt mỏng.

2. Ngâm nước Javen hay dung dịch cloramin để tẩy các chất có chứa trong các tế bào,

thời gian ngâm tùy loại nguyên liệu, có thể rút ngắn thời gian bằng cách đun nóng.

3. Rửa nước: nếu vi phẫu có nhiều tinh bột cần tẩy thì sau khi rửa ngâm hoặc đun trong

cloral hydrat rồi rửa nước lần nữa.

4. Rửa bằng acid acetic.

5. Rửa bằng nước.

6. Nhuộm vi phẫu bằng lục iốt, lục metyl hoặc xanh metylen thời gian nhuộm tùy vào quá

trình bắt màu của đối tượng (thường khoảng 10 giây đến 1 phút).

7. Rửa cồn, nếu dùng xanh metylen thì chỉ cần rửa bằng nước.

8. Nhuộm đỏ son phèn, thời gian nhuộm tùy đối tượng (có thể từ khoảng 1 phút đến 1

giờ).

9. Rửa nước.

10. Ðặt vi phẫu vào một giọt glycerin trên phiến kính, đậy lá kính, soi trên kính hiển vi.

Tiêu bản cố định: Tiêu bản sau khi nhuộm xong đã rửa bằng nước (9) tiến hành tiếp tục

như sau:

10. Loại nước lần lượt bằng cồn 300, 500, 700, 950 và cồn tuyệt đối.

11. Lắc vi phẫu ba lần trong xylen.

12. Ðặt vi phẫu vào một giọt bôm canada trên phiến kính, đậy lá kính, để ở chỗ thoáng 2-

3 tuần.

Phần lớn ảnh vi phẫu trong tài liệu được chụp từ các tiêu bản cố định theo quy trình này.

Vẽ sơ đồ tổng quát vi phẫu Dược liệu

Phần này được giới thiệu khi học giải phẫu thực vật. Sơ đồ tổng quát vi phẫu một số dược

liệu thường dùng

Sơ đồ tổng quát vi phẫu: Lá vông nem, vỏ Hoàng nàn, lá Chè

Chụp ảnh vi phẫu dược liệu

2. Phân tích vi hoá dược liệu

Từ "phân tích vi hoá" dùng trong tài liệu này để chỉ phương pháp phân tích dựa vào các

phản ứng hoá học, quá trình vật lý quan sát kết quả dưới kính hiển vi. Phân tích vi hoá bổ

sung thêm tư liệu để định tính dược liệu, cho phép phát hiện các chất trực tiếp trong mô

và tế bào, cho khả năng xác định vị trí hoạt chất trong các mô của dược liệu.

Các lát cắt để tiến hành phản ứng vi hoá không được mỏng quá, phải có một vài lớp tế

bào chưa bị phá hủy khi cắt, có chứa các chất nghiên cứu. Có thể tiến hành phản ứng vi

hoá trên lát cắt tươi, khô hay lát cắt từ các dược liệu đã được ổn định bằng các phương

pháp đặc biệt.

Phản ứng vi hoá cho phép phát hiện các chất với số lượng nhỏ vì vậy phải đặc biệt chú ý

đến sự lẫn tạp có thể xảy ra trong quá trình tiến hành. Khi tiến hành phân tích vi hoá cần

tuân thủ các nguyên tắc sau:

- Phương pháp chỉ có ý nghĩa trong trường hợp phản ứng tiến hành là đặc trưng.

- Trong tất cả các trường hợp cần tiến hành song song với các mẫu đối chứng. Kết quả có

độ tin cậy cao khi tiến hành bằng những phương pháp có bản chất khác nhau thu được kết

luận như nhau.

- Cần tiến hành các phản ứng vi hoá với tác phong cẩn thận, tỉ mỉ, chính xác. Ngoài ra

cần chú ý tới các yếu tố có thể ảnh hưởng tới kết quả nghiên cứu. Ví dụ: Nhiều thuốc thử

không bền phải bảo quản ở những điều kiện đặc biệt hoặc dùng thuốc thử mới pha. Một

số phản ứng vi hoá yêu cầu tiến hành và quan sát kết quả rất nhanh khi các chất nghiên

cứu chưa bị phân tán hay các mô chưa bị phá hủy bởi tác dụng của thuốc thử.

- Nhiều dược liệu khi đưa vào sử dụng được chế biến bằng các phương pháp khác nhau:

ngâm nước, đun, tẩm cồn, giấm v. v... khi phân tích vi hoá dược liệu cần chú ý tới sự ảnh

hưởng của các quá trình này.

2.1. Các phản ứng lên thành tế bào

2.1.1.  Các phản ứng lên thành tế bào cellulose (không hoá gỗ)

Cellulose là chất chủ yếu của thành tế bào thực vật, phần non của cây thành tế bào cấu

tạo chỉ từ cellulose tinh khiết. Khi các tế bào già hơn thành tế bào thấm các chất hữu cơ,

các chất khoáng khác nhau. Cellulose gần như nguyên chất chỉ có ở các sợi bông, sợi

lanh và một vài loại sợi khác. Cellulose là một polisaccarit (C6H10O5) n phân tử lớn, không

hoà tan trong acid yếu và các dung môi khác, thành tế bào cellulose trong suốt, có tính

khúc xạ kép, chỉ số khúc xạ  n=1,52.

- Phản ứng với Kẽm clorua - Iốt

Phản ứng tiến hành trên phiến kính. Ðặt lát cắt vào một giọt nước cho giãn thẳng ra, thấm

nước bằng giấy thấm, nhỏ một giọt thuốc thử lên lát cắt, đậy lá kính, quan sát dưới kính

hiển vi. Thành tế bào cấu tạo từ cellulose tinh khiết (nguyên chất) sẽ có màu xanh tím

hoặc màu hoa cà (thành đã hoá gỗ hay hoá suberin thì có màu vàng nâu).

- Phản ứng hoà tan trong thuốc thử Sveize

Ðặt lát cắt vào một giọt thuốc thử trên phiến kính, đậy lá kính và quan sát dưới kính hiển

vi. Ban đầu thấy rõ các chi tiết cấu trúc thành tế bào, sau đó chúng trương phồng và hoà

tan dần dần, thành tế bào hoá gỗ, cutin không hoà tan trong thuốc thử này.

2.1.2. Các phản ứng lên thành tế bào hoá gỗ

- Phản ứng với floroglucin và acid hydrocloric

Ðặt lát cắt lên phiến kính trong dung dịch floroglucin 1% trong cồn. Hút thuốc thử bằng

giấy lọc, nhỏ lên lát cắt một giọt acid hydrocloric đặc qua 1-2 phút thêm một giọt

glycerin, đậy lá kính và quan sát ở kính hiển vi với độ phóng đại nhỏ, thành tế bào hoá gỗ

có màu tím đỏ tươi, độ đậm của màu xác định mức độ hoá gỗ.

- Phản ứng với Pemanganat Kali

Bỏ các lát cắt vào dung dịch KMnO4 1% trên mặt kính đồng hồ, sau 5 phút rửa bằng

nước và đặt vào acid hydrocloric 10% trong 2 phút, rửa sạch và chuyển lên phiến kính

trong một giọt dung dịch NH4OH đậy lá kính và quan sát, thành tế bào hoá gỗ nhuộm

màu đỏ.

Phản ứng với floroglucin và với pemanganat Kali dùng để phát hiện các thành phần khác

nhau cuả lignin (gỗ) (lignin F và lignin M) vì vậy kết quả thu được khi tiến hành hai phản

ứng này có khi không trùng khớp.

Thành tế bào hoá gỗ dễ nhuộm màu bằng các thuốc nhuộm, thường sử dụng safranin hay

kết hợp nó với các thuốc nhuộm khác nhuộm thành tế bào cellulose.

- Phản ứng với safranin

Các lát cắt cho vào lọ đậy kín có chứa safranin 1% trong cồn 500, ngâm trong 30 phút,

rửa bằng cồn 500 sau đó rửa bằng cồn acid hoá (100 ml cồn thêm 2 giọt HCl  đậm đặc) để

rửa màu ra khỏi các yếu tố không hoá gỗ  (5-10 giây) chuyển lên phiến kính, soi trong

một giọt glycerin, thành tế bào hoá gỗ nhuộm thành màu đỏ.

- Phản ứng với safranin và xanh anilin

Ngâm các lát cắt trong dung dịch safranin 1% trong cồn 500 trong 24 giờ, rửa bằng cồn

500 và chuyển vào dung dịch xanh anilin 1% trong cồn 2-3 phút, rửa bằng cồn 500 lại

chuyển vào cồn acid hoá vài giây, rửa bằng cồn có vết soda, sau đó lại rửa bằng cồn tinh

khiết và đặt vào một giọt glycerin, đậy lá kính, quan sát trên kính hiển vi: thành tế bào

hoá gỗ bắt màu đỏ, thành tế bào cellulose bắt màu xanh.

- Phản ứng với anilin sulfat

Ðặt lát cắt vào một giọt thuốc thử trên phiến kính, đậy lá kính, quan sát trên kính hiển vi,

thành tế bào hoá gỗ chuyển thành màu vàng.

- Phản ứng với paranitroanilin

Ðặt lát cắt vào một giọt dung dịch paranitroanilin 1% thành tế bào hoá gỗ nhanh chóng

nhuộm thành màu vàng cam, chuyển lát cắt vào một giọt glycerin và quan sát dưới kính

hiển vi.  

2.1.3. Phản ứng lên thành tế bào hoá bần, cutin

Thành tế bào hoá bần (suberin) và cutin không cho phản ứng đặc trưng của cellulose. Bần

và cutin trong thành phần của thành tế bào có thể thấy được khi nhuộm bằng các thuốc

nhuộm đặc hiệu hoặc bằng các thuốc nhuộm dùng để nhuộm chất béo.

- Phản ứng của KOH lên bần

Ðặt lát cắt trong KOH đậm đặc, thành tế bào hoá bần nhuộm thành màu vàng, khi hơ

nóng màu đậm lên phản ứng tiến hành trên phiến kính, nếu đun đến sôi các lát cắt trong

KOH từ thành tế bào xuất hiện các giọt màu vàng. Trong trường hợp thành tế bào đồng

thời hoá gỗ và hoá bần cần phải xử lý trước lát cắt bằng nước javen sau đó rửa bằng dung

dịch HCl 1% để loại lignin ra khỏi thành tế bào và tiến hành phản ứng lên bần. Phản ứng

này cũng xảy ra với cutin nhưng chậm hơn. Có thể phân biệt thành tế bào hoá gỗ và hoá

bần như sau: Xử lý các lát cắt trong vòng 2-3 giờ bằng nước javen sau đó cho lát cắt vào

thuốc thử kẽm clorua - iốt (2.1.1.1.) tiến hành trên phiến kính, quan sát dưới kính hiển vi

sẽ thấy thành tế bào hoá gỗ nhuộm thành màu hoa cà, bần thành màu vàng.

- Phản ứng của H2SO4 lên cutin

Ðặt lát cắt vào một giọt H2SO4 đậm đặc trên phiến kính, đậy lá kính và quan sát dưới kính

hiển vi, cutin và các lớp cutin ở lát cắt nhuộm thành màu vàng thẫm hoặc nâu.

- Nhuộm màu bần, cutin bằng thuốc nhuộm màu chất béo

Lát cắt đặt vào một giọt thuốc thử Sudan III đun nóng nhẹ để rút ngắn quá trình nhuộm

màu, thấm thuốc nhuộm bằng giấy lọc, cho lát cắt vào một giọt glycerin, đậy lá kính,

quan sát trên kính hiển vi: thành tế bào hoá bần và cutin nhuộm thành màu đỏ cam.

Có thể tiến hành phản ứng tương tự với dung dịch đỏ Sarlac 0,1-0,2% trong cồn 700. quá

trình nhuộm màu 20-30 phút nếu không hơ nóng hoặc nhanh hơn nếu hơ nóng nhẹ.

2.2. Các phản ứng lên cacbohydrat.

2.2.1. Phản ứng xác định đường với phenyl hydrazin

Thường tiến hành làm hai tiêu bản: trên phiến kính đặt các lát cắt vào thuốc thử, đậy lá

kính, tiêu bản thứ nhất để ở nhiệt độ phòng, tiêu bản thứ hai hơ nóng trên nồi cách thủy

trong vòng nửa giờ, sau đó làm lạnh, trong thời gian đun trên cách thủy khi có đường các

lát cắt và chất lỏng nhuộm thành màu vàng và khi làm lạnh tiêu bản quan sát thấy xuất

hiện tinh thể hình kim vàng của ozazon tập hợp lại thành bó, hình sao v.v... Tiêu bản để

lạnh không đun tạo thành tinh thể ozazon chậm (trong vòng vài giờ, thậm chí vài ngày)

và phần lớn tạo thành tinh thể dạng cầu. Phản ứng với phenylhydrazin có ưu điểm cho

phép xác định vị trí của đường vì  các tinh thể tạo thành chỉ trong các tế bào chứa đường,

hơn nữa phản ứng cho phép phân biệt các dạng đường có trong cây vì khi phản ứng ở

điều kiện thường và đun cách thủy 10 phút chỉ tạo thành tinh thể ozazon với các đường

đơn. Nếu trong tế bào có đường đôi (saccaroze) thì tinh thể ozazon chỉ được tạo thành khi

đun nóng lâu (khoảng 1-2 giờ) đường đôi bị thủy phân tạo thành đường đơn và tạo thành

ozazon với phenyl hydrazin.

2.2.2. Xác định tinh bột

Tinh bột quan sát rất rõ trong nước và glycerin, do có tính khúc xạ kép hạt tinh bột khi

quan sát dưới kíng hiển vi phân cực có hiện tượng chữ thập đen, nơi giao nhau của chữ

thập là trung tâm phân lớp (rốn) của hạt. Phản ứng với iốt là phản ứng màu duy nhất của

tinh bột. Tùy điều kiện cụ thể mà người ta sử dụng các dung dịch chứa iốt khác nhau. Ví

dụ: Mayer, Lugol, Iốt/  Cloralhydrat, Iốt/  acid lactic. Ðể phát hiện tinh bột khi nó có

lượng rất nhỏ, ví dụ : trong lục lạp, hạt phấn, túi phôi dùng dung dịch Iốt đậm đặc hơn

(khoảng 2g/100 ml). Dung dịch Iốt/  Cloralhydrat nhuộm tinh bột đồng thời với làm sáng

tiêu bản, tiện lợi để phát hiện tinh bột trong lục lạp của lá, có thể quan sát trực tiếp mà

không cần làm các lát cắt. Phản ứng được thấy rõ hơn nếu lá, lát cắt được xử lý trước

bằng cồn để chiết chất diệp lục. Iốt/acid lactic được dùng chủ yếu khi xác định tinh bột

của các dược liệu dưới dạng bột, thuốc thử vừa có tính chất làm sáng, vừa nhuộm tinh

bột. Một số chất có trong tế bào thực vật (tanin) làm chậm phản ứng iốt với tinh bột. Phản

ứng iốt với tinh bột là phản ứng thuận nghịch, tinh bột nhuộm màu bởi iốt bị mất màu

tương đối nhanh nhất là khi đun nóng. Hầu hết tinh bột bị nhuộm bởi iốt thành màu xanh,

song có một số cây có chứa tinh bột nhuộm với iốt thành màu đỏ hoặc đỏ tím gọi là "tinh

bột đỏ" mặc dù về mặt bản chất còn nhiều ý kiến chưa thống nhất song nó có ý nghĩa

quan trọng trong kiểm nghiệm dược liệu.

2.2.3. Phản ứng xác định Inulin

Inulin là hydratcacbon thuộc nhóm polisaccarit có tính chất gần giống tinh bột song hoà

tan trong dịch tế bào. Inulin có trong rễ nhiều cây thuộc họ Cúc, họ Hoa chuông... Khi cố

định nguyên liệu trong cồn Inulin tạo thành các tinh thể hình dạng kích thước khác nhau

tùy thuộc độ cồn và điều kiện kết tinh, trong nước nóng các tinh thể inulin bị hoà tan. Xác

định inulin trong dược liệu tiến hành như sau: Dược liệu tươi cắt thành mẩu, ngâm trong

cồn vài ngày, lấy ra, cắt lát, lên kính trong cồn hoặc glycerin, quan sát dưới kính hiển vi

sẽ thấy các tinh thể inulin có hình dạng và kích thước khác nhau. Tinh thể inulin có tính

khúc xạ kép, thấy rõ dưới kính hiển vi phân cực, nếu tinh thể inulin được tạo thành ở

dạng cầu (kết tinh chậm) thì dưới kính hiển vi phân cực sẽ thấy hiện tượng chữ thập đen

như hạt tinh bột. Khi thêm nước và đun nóng tinh thể inulin bị tan. Khi nghiền dược liệu

khô thành bột có thể dễ dàng quan sát dưới kính hiển vi các khối inulin có hình dạng,

kích thước khác nhau.

2.2.4. Phản ứng thử chất nhầy

- Phản ứng tủa trong cồn và nở trong nước của chất nhầy

Lát cắt dược liệu tươi cho vào cồn, đậy lá kính, quan sát dưới kính hiển vi. Chất nhầy

thấy được trong các tế bào dưới dạng hạt khúc xạ ánh sáng mạnh. Nếu thêm nước vào

một phía của lá kính và phía kia hút cồn bằng một mảnh giấy lọc có thể thấy chất nhầy

dần dần trương phồng trong nước. Thay nước bằng cồn quá trình xảy ra ngược lại.

- Phản ứng nhuộm kép

Lát cắt đặt vào dung dịch FeCl3 khoảng 20 phút sau đó chuyển vào dung dịch xanh

metylen  2-3 phút, rửa bằng nước, lên kính bằng glycerin, soi dưới kính hiển vi, các tế

bào có chứa chất nhầy bị nhuộm thành màu vàng, sợi thành màu xanh da trời, mạch gỗ

màu xanh lá cây.

- Xác định chất nhầy bằng mực tàu

Cho bột dược liệu vào một giọt mực tàu trên phiến kính, dùng kim mũi mác dầm cho bột

thấm đều mực tàu, đậy lá kính, quan sát dưới kính hiển vi. Trên vi trường có màu xám tối

(gần như đen) có những vết sáng của chất nhầy (vì chất nhầy không thấm mực tàu).  

 2.3. Phản ứng thử chất béo

Chất béo chứa trong dược liệu là chất dự trữ, thường chứa trong cây với tỷ lệ lớn. Khi

nghiên cứu dược liệu chứa chất béo sử dụng dược liệu tươi không cố định hoặc các dược

liệu khô.

Chất béo dễ bị nhuộm màu bởi các thuốc nhuộm khác nhau. Phương pháp nhuộm đơn

giản nhất là dùng Sudan III. Ðặt lát cắt vào dung dịch nhuộm, đậy lá kính và hơ nóng nhẹ

để làm nhanh quá trình nhuộm, đem quan sát dưới kính hiển vi. Nhuộm bằng Sudan III

có thể tiến hành theo cách khác: Ngâm lát cắt vào dung dịch nhuộm một ngày đêm sau đó

rửa bằng cồn 500, đặt lát cắt lên phiến kính trong glycerin và quan sát dưới kính hiển vi.

Sudan III nhuộm chất béo thành màu đỏ cam, các phản ứng nhuộm màu bằng các thuốc

nhuộm khác tiến hành tương tự song các phản ứng nhuộm màu chất béo không đặc trưng

vì chúng nhuộm cả tinh dầu, nhựa, cutin, suberin. Nhuộm màu chất béo bằng thuốc

nhuộm huỳnh quang là phương pháp có độ nhạy cao và cho khả năng xác đinh vị trí của

chất béo trong mô, tế bào chính xác hơn là sử dụng Sudan III. Thuốc nhuộm huỳnh quang

thích hợp nhất là 3,4-benzpyrene, focfin 3R và đỏ trung tính, các thuốc nhuộm này được

chất béo hấp thu mạnh. Ðể thu được kết quả có độ tin cậy cao cần tiến hành phản ứng xà

phòng hoá: lát cắt dược liệu được đặt vào dung dịch KOH 15% trong nước và đun nóng

nhẹ sau một thời gian các tinh thể hình kim (muối của các acid béo) được tạo thành, đem

quan sát trên kính hiển vi (phản ứng xà phòng hoá theo Rozentaler). Phản ứng có thể thực

hiện theo cách khác: trên phiến kính đặt một giọt dung dịch KOH 15% và một giọt

NH4OH 20% đặt lát cắt vào hỗn hợp, đậy lá kính lên, mép lá kính viền bao quanh bằng

parafin nóng chảy để chống khô, qua 1-2 ngày xung quanh dầu tạo thành các tinh thể 

(muối của các acid béo) quan sát ở kính hiển vi thường và kính hiển vi phân cực.

2.4. Phản ứng xác định tinh dầu

Tinh dầu là một hỗn hợp phức tạp của các chất. Trong cây chúng định vị ở các túi có

dạng khác nhau hay trong các tế bào đặc biệt. Có thể nhận ra tinh dầu ở trong tiêu bản

không cần sử dụng thuốc nhuộm, chúng có dạng hạt, khúc xạ ánh sáng mạnh, khi quan

sát giọt tinh dầu có thể có màu vàng nhạt, vàng sẫm, xanh vàng hay nâu đỏ. Ðể nhuộm

tinh dầu sử dụng thuốc nhuộm như là nhuộm chất béo, nhựa (Sudan III) để phân biệt tinh

dầu với chất béo, nhựa sử dụng dung dịch xanh metyl trong nước (0,1 g xanh metyl/ 500

ml nước) các mẫu cắt đặt vào thuốc thử sau vài phút rửa, đặt vào nước hoặc glycerin, đậy

lá kính, soi dưới kính hiển vi tinh dầu được nhuộm thành màu xanh. Dùng thuốc nhuộm

xanh indophenol cũng cho kết quả tương tự. Có thể phân biệt tinh dầu với chất béo, nhựa

dựa trên tính chất bay hơi, hoà tan của chúng: các mẫu đem đun sôi trong nước tinh dầu

bay hơi, chất béo không bay hơi cho phản ứng với thuốc nhuộm.

2.5. Phản ứng xác định nhựa

Nhựa có chứa trong cây ở các túi đặc biệt, các ống nhựa, đôi khi kết hợp với tinh dầu. Ðể

xác định nhựa thường sử dụng phản ứng nhuộm màu song các phản ứng này không đặc

trưng.

- Phản ứng với đồng acetat

Cho các mẩu dược liệu vào đồng acetat bão hoà, sau vài ngày lấy ra, cắt lát, lên kính

trong một giọt glycerin và quan sát dưới kính hiển vi. Nhựa được nhuộm thành màu lục

ngọc bích.

Một số thuốc nhuộm khác như Sudan III, xanh metyl v.v... nhuộm màu nhựa song cũng

nhuộm nhiều thành phần khác trong cây (chất béo, tinh dầu, cutin).

2.6.  Phản ứng thử saponin

Phát hiện saponin bằng phương pháp vi hoá không hoàn toàn chắc chắn vì không có phản

ứng đặc trưng nào có thể tiến hành trên mô thực vật. Phản ứng tin cậy hơn cả là dựa vào

tính chất phá huyết của saponin.

2.6.1. Xác định saponin theo tính chất phá huyết

Lát cắt dược liệu tươi đặt lên một mẩu gelatin huyết đậy lá kính và để 30-40 phút. Khi có

saponin trong dược liệu xung quanh lát cắt tạo thành vùng đỏ, trong, gọi là "vùng tan

huyết"

Ðiều chế gelatin huyết: cho 2-3 giọt huyền phù hồng cầu hay máu loại fibrin trong dung

dịch NaCl đẳng trương vào 2-3 ml dung dịch gelatin 6-8% sau khi gelatin đông kết dưới

dạng lớp mỏng (dày 2-3 mm) cắt thành mẩu nhỏ, gelatin huyết sau khi điều chế phải

dùng ngay.

2.6.2. Phản ứng với antimon clorua

Lát cắt dược liệu tươi xử lý 2-3 phút bằng hơi amoniac và cố định trong aceton, sau vài

phút lấy ra, aceton bay hơi. Ðặt lên phiến kính, nhỏ vào lát cắt một giọt dung dịch

antimon clorua bão hoà trong cloroform, hơ nóng nhẹ, cho một giọt dầu vaselin vào lát

cắt, đậy lá kính và quan sát dưới kính hiển vi. Saponin dưới tác dụng của antimon clorua

cho màu đỏ điều đến đỏ tím và nhìn rõ dưới dạng hạt, cục vón trong lớp vách của chất

nguyên sinh.

2.7. Phản ứng thử alcaloid

Trong cây các alcaloid tồn tại dưới dạng hoà tan trong dịch tế bào. Trong cây khô chúng

bị hấp thu, vón vào các thành phần cấu trúc khác của tế bào. Ðể nghiên cứu alcaloid

thường dùng dược liệu khô hoặc dược liệu tươi vừa thu hái. Tránh cho dược liệu tươi vào

nước vì trong điều kiên này alcaloid dễ bị phân hủy. Ðể giữ alcaloid có thể xử lý dược

liệu tươi bằng cồn đun sôi để phá hủy men.

Có thể phát hiện alcaloid bằng thuốc thử tạo tủa hay tạo màu. Cần song song tiến hành

phản ứng thử với các tiêu bản đối chứng đã rửa alcaloid bằng cồn acid hoá. Thông

thường đặt các lát cắt vào lọ nút kín 5-7 ngày với dung dịch tartric 5% trong cồn, 2-3

ngày thay dung môi mới một lần.

Phản ứng tủa alcaloid: khi tiến hành phản ứng tủa có thể sử dụng bất kỳ thuốc thử tạo tủa

với alcaloid. Ví dụ: Dragendorff, Mayer, muối Reinecke v.v... Kết quả tốt nhất thường

thu được khi sử dụng dung dịch acid picric, acid này tạo tinh thể picrat với nhiều alcaloid.

Phản ứng tủa alcaloid tiến hành trên phiến kính: đặt lát cắt cây tươi vào một giọt thuốc

thử, đậy lá kính, quan sát kết quả phản ứng dưới kính hiển vi, so sánh với kết quả đối

chứng.

Có thể tiến hành phản ứng theo cách khác: Ngâm các mẩu dược liệu vào một trong các

thuốc thử trên 1-2 tuần sau đó cắt lát, lên kính trong một giọt glycerin, so sánh kết quả

thu được với tiêu bản đối chứng.

Bằng phản ứng tạo tủa có thể xác định được vị trí của các alcaloid trong các mô của cây.

Với dược liệu khô và bột dược liệu phát hiện alcaloid như sau: đặt bột dược liệu nghiên

cứu lên phiến kính, thêm 1-2 giọt acid acetic 5%, đậy lá kính, hơ nóng nhẹ. Sau 1-2 phút

đặt một lá kính thứ hai bên cạnh để kéo chất lỏng sang, cất lá kính thứ nhất và lau sạch

bột, cho một giọt thuốc thử alcaloid (Dragendorff, Mayer, muối Reinecke) bên cạnh lá

kính, thuốc thử thấm vào dưới lá kính, phản ứng với dịch chiết, quan sát kết quả phản

ứng dưới kính hiển vi.

Một số alcaloid trong dược liệu có thể tiến hành xác định bằng các phản ứng màu đặc

hiệu hoặc quá trình vi thăng hoa (2.8.2.).  

2.8. Phản ứng thử anthranoid

2.8.1. Phản ứng với kiềm

Lát cắt dược liệu đặt lên một giọt NaOH 5% hay NH4OH trên phiến kính, thêm một giọt

glycerin, đậy lá kính và quan sát dưới kính hiển vi. Mô có chứa anthranoid nhuộm thành

màu đỏ hay đỏ tím, màu đỏ dần dần phân tán trên toàn bộ lát cắt. Màu rực rỡ chỉ tạo nên

với dẫn chất của anthraquinon, dẫn chất của anthron và anthranon với kiềm nhuộm thành

màu vàng. Trong trường hợp này màu có thể tăng lên bằng cách xử lý sơ bộ lát cắt bằng

H2O2.

2.8.2. Quá trình vi thăng hoa

Cho một lượng nhỏ bột dược liệu chứa anthranoid vào một nắp kim loại, đậy bằng một

phiến kính, phía trên để giấy lọc hoặc bông thấm nước làm lạnh, đun trên bếp điện (qua

lưới amian) luôn thay bông, giấy lọc để quá trình làm lạnh tốt. Anthranoid thăng hoa và

ngưng tụ ở bề mặt dưới của phiến kính. Thay phiến kính một số lần để lượng anthranoid

thăng hoa ở mỗi phiến kính không nhiều quá. Dưới kính hiển vi quan sát thấy các tinh

thể, với các dược liệu khác nhau thường cho các tinh thể có hình dạng và kích thước khác

nhau, trong một số trường hợp có thể dựa vào hình dáng, cách sắp xếp các tinh thể để xác

định dược liệu. Trong dung dịch KOH/ cồn các tinh thể anthranoid hoà tan, thường cho

màu đỏ.

Quá trình vi thăng hoa có thể tiến hành để phát hiện acid benzoic, một số hoạt chất thuộc

nhóm coumarin, alcaloid, dẫn chất terpen và những chất có khả năng thăng hoa khác có

mặt trong dược liệu.

2.9. Phản ứng thử coumarin

Trong cây coumarin có thể ở dạng tự do hoặc dạng kết hợp glycosid. Xác định coumarin

trong dược liệu thường dựa vào phản ứng mở vòng lacton, quá trình vi thăng hoa.

2.9.1. Quan sát huỳnh quang khi mở vòng lacton

Khi mở vòng lacton của coumarin bằng kiềm thì coumarin tạo thành dẫn chất hydroxy

cinamic ở dạng cis (acid cumarinic) chất này dưới tác dụng của tia tử ngoại (kính hiển vi

huỳnh quang) thì chuyển thành dạng trans (o. cumaric acid) có huỳnh quang sáng hơn.

Cách tiến hành: đặt lát cắt dược liệu lên phiến kính, nhỏ lên một giọt NaOH 5%, sấy nhẹ.

Quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại nhỏ, che một nửa lát cắt bằng mảnh kim loại.

Sử dụng phương pháp huỳnh quang phản xạ, quan sát lát cắt trong vài phút, cất mảnh kim

loại sẽ thấy phần bị che có huỳnh quang yếu hơn phần không bị che, khi tiếp tục quan sát

thêm một thời gian sẽ thấy huỳnh quang ở phần bị che dần dần sáng lên.

2.9.2. Quá trình vi thăng hoa (xem 2.8.2.)

Sau khi vi thăng hoa cho coumarin tác dụng với KI sẽ tạo thành các tinh thể

Iodocoumarin màu nâu sẫm hoặc tím. Quan sát các tinh thể Iodocoumarin này dưới kính

hiển vi huỳnh quang.

2.10. Phản ứng thử flavonoid

Số lượng flavonoid rất lớn, chúng có tính chất rất khác nhau, không có phản ứng chung

để phát hiện chúng trong tế bào thực vật. Chỉ có thể tiến hành phân tích vi hoá flavonoid

trong một số trường hợp cụ thể.

Xác định hesperidin: Hesperidin thuộc nhóm flavanon có ở nhiều loại cây, trong tế bào

sống chất này tồn tại ở dạng hoà tan trong dịch tế bào, khi ngâm dược liệu chứa chất này

vào cồn tuyệt đối hesperidin kết tinh trong tế bào dưới dạng hình kim hay khối hình cầu

hầu như không hoà tan trong nước, khó tan trong nước nóng, điều này phân biệt các tinh

thể hesperidin với inulin. Tinh thể hesperidin không hoà tan trong benzen, cloroform, ete.

Hesperidin có thể phát hiện bằng amoniac hoặc kiềm loãng. Trong các dung dịch này

chúng dễ tan và nhuộm dung dịch thành màu vàng.

2.11. Phản ứng thử tanin

Trong thực vật tanin tồn tại dưới dạng hoà tan trong dịch tế bào, một phần bị hấp thu bởi

keo tế bào. Trong dược liệu khô tanin tạo thành các hạt vô định hình màu vàng nâu.

2.11.1. Phản ứng xác định tanin bằng muối sắt

Xác định tanin bằng FeCl3 hoặc phèn sắt amoni  FeNH4(SO4)2 dưới dạng dung dịch 1%

trong nước. Mô có chứa tanin nhuộm thành màu xanh đen hay xanh lá cây đen với muối

sắt. Sắc thái màu không ổn định vì trong tế bào có các acid hữu cơ có thể biến đổi màu

xanh lam thành xanh lá. Phản ứng tiến hành trên phiến kính: cho lát cắt vào một giọt

thuốc thử, đậy lá kính và quan sát màu tiêu bản dưới kính hiển vi, màu nhanh chóng lan

ra (phân tán) toàn bộ lát cắt.

2.11.2. Xác định tanin bằng dung dịch Kalibicromat

Ðây là phản ứng thường dùng để định vị tanin trong mô cây. Dùng dung dịch Kali

bicromat trong nước 5-10%. Ngâm dược liệu vào thuốc thử vài ngày sau đó cắt lát. Trong

tế bào có chứa tanin tạo thành tủa mịn màu xám và đỏ nâu, màu đỏ nâu được tạo thành

khi để lát cắt một thời gian. Sự tạo thành tủa bị ngăn cản bởi các acid hữu cơ có trong cây

(acid oxalic, acid citric, acid malic, acid tartric) khi có các acid này chỉ thu được màu

vàng nâu đồng nhất.

2.11.3. Xác định tanin bằng dung dịch Amonimolipdat <(NH4)2MoO4> (Phản ứng

Gardiner hay Viceling)

Ðặt lát cắt vào một giọt dung dịch thuốc thử, đậy lá kính, quan sát dưới kính hiển vi.

Dưới tác dụng của thuốc thử trong tế bào có chứa tanin xuất hiện tủa vàng hoặc đỏ. Khi

kiềm hoá (thêm NH4OH) thuốc thử thâm nhập vào tế bào nhanh hơn. Phản ứng tương đối

nhạy. Nhược điểm của phản ứng là tủa dễ tan trong acid loãng và trong nước, thuốc thử

không bền vững khi bảo quản.

 3. Phân tích huỳnh quang

3.1. Khái niệm về huỳnh quang và phân tích huỳnh quang

Một số chất khi dùng các tia sáng có bước  sóng ngắn chiếu vào chúng sẽ phát sáng với

bước sóng dài hơn, nếu hiện tượng phát sáng đó chấm dứt ngay sau khi nguồn sáng kích

ứng thôi tác dụng thì gọi là sự phát huỳnh quang.

Nhiều cây thuốc có chứa hoạt chất có tính chất phát huỳnh quang thuộc các nhóm khác

nhau: coumarin, alcaloid, flavonoid v.v... vì vậy phương pháp phân tích huỳnh quang có

ý nghĩa rất lớn khi nghiên cứu dược liệu. Người ta sử dụng một số loại đèn phát ra chùm

tia có bước sóng ở vùng cực tím và các kính lọc để tạo ra chùm tia kích ứng có bước sóng

thích hợp.

ánh sáng huỳnh quang có bước sóng lớn hơn bước sóng của ánh sáng gây nên huỳnh

quang (ánh sáng kích ứng). Huỳnh quang được tạo nên bởi tia cực tím có bước sóng λ

=365 nm nằm ở phần thấy được của phổ ánh sáng có thể có màu từ tím đến đỏ. Khi kích

thích huỳnh quang bằng tia tím xanh λ=400 nm có thể tạo ra huỳnh quang từ xanh lá đến

đỏ.

Ðộ sáng huỳnh quang (cường độ huỳnh quang) phụ thuộc vào nhiều yếu tố:

- Chiều dày của lớp huỳnh quang, khi chiều dày càng lớn thì độ sáng càng lớn, độ sáng

huỳnh quang của dung dịch trong ống nghiệm lớn nhất khi quan sát dọc theo trục ống. Ðộ

sáng lớn nhất của tinh thể phát huỳnh quang nhìn thấy được khi quan sát theo chiều dọc

từ đầu đến cuối tinh thể.

- Nồng độ của dung dịch huỳnh quang: Khi nồng độ của các chất tạo huỳnh quang nhỏ

(10-4-10-5 g/ ml) cường độ huỳnh quang của các dung dịch tăng lên tỷ lệ với sự tăng của

nồng độ chất huỳnh quang. Khi nồng độ cao hơn sự tăng huỳnh quang chậm hơn so với

tăng nồng độ chất huỳnh quang và tới một mức nào đó cường độ huỳnh quang không

tăng mà còn giảm.

Quá trình phát huỳnh quang cũng bị ảnh hưởng (làm yếu đi) bởi sự thay đổi (tăng) nhiệt

độ hoặc sự có mặt của các chất lạ. KI là chất có tác dụng làm giảm huỳnh quang điển

hình, các muối của halogen khác và một số chất hữu cơ như phenol, hydroquinol,

rezocin, anilin, acid picric v.v... cũng có tác dụng làm giảm huỳnh quang. Cường độ và

phổ huỳnh quang của các chất biến đổi rõ rệt khi có những biến đổi nhỏ trong cấu trúc

phân tử của chúng (phân ly, dime hoá, liên kết với dung môi v.v...) vì vậy cần chú ý tới

ảnh hưởng của pH môi trường, bản chất của dung môi v.v...

Các phương pháp, kỹ thuật phân tích dựa trên hiện tượng huỳnh quang, gọi là phân tích

huỳnh quang được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như sinh học, y học, nông

nghiệp và các ngành kinh tế quốc dân khác.

Trong nghiên cứu dược liệu phân tích huỳnh quang được chia thành hai phần: Phân tích

huỳnh quang sơ bộ và phương pháp hiển vi huỳnh quang.

3.2. Dụng cụ để nghiên cứu huỳnh quang

Ðể tạo ra nguồn sáng kích ứng người ta thường sử dụng đèn thủy ngân cao áp kết hợp với

bộ lọc hoặc các đèn có bức xạ với bước sóng xác định. Các đèn này được bố trí trong các

hệ thống có cấu tạo phù hợp với mục đích sử dụng. Khi nghiên cứu huỳnh quang sơ bộ

nguồn sáng thường đặt trong một buồng, buồng này có thể đưa vào các bản sắc kí, dược

liệu bẻ gẫy để quan sát sự phát huỳnh quang của chúng.

Phân tích huỳnh quang trong một số trường hợp có thể sơ bộ đánh giá chất lượng nguyên

liệu khi chất có hoạt tính sinh học trong chúng có tính chất phát huỳnh quang (alcaloid,

flavonoid, coumarin...). Khi đó sự biến đổi tính chất huỳnh quang của nguyên liệu phản

ánh sự biến đổi hàm lượng hay cấu trúc của các hoạt chất trong chúng.

Bên cạnh quan sát huỳnh quang của bản thân nguyên liệu (huỳnh  quang sơ cấp) có thể

quan sát huỳnh quang được tạo thành khi phản ứng của hoạt chất nguyên liệu với thuốc 

thử. Ví dụ: Khi quan sát flavonoid thường xử lý bằng hơi amoniac, dung dịch kiềm để

tăng huỳnh quang của chúng, trong trường hợp này các thuốc thử không chỉ làm thay đổi

cường độ mà cả phổ của huỳnh quang. Khi phân tích huỳnh quang sơ bộ có thể dùng các

nguồn sáng kích ứng có bước sóng gần vùng cực tím sẽ thu được huỳnh quang có nhiều

màu sắc. Nguồn sáng kích ứng có bước sóng trong vùng xanh tím cho huỳnh quang có

cường độ lớn song dải phổ hẹp.

Ðể nghiên cứu sự phát huỳnh quang của các chất ở các mô, tế bào thực vật sử dụng kính

hiển vi huỳnh quang.

3.3.  Chuẩn bị tiêu bản để nghiên cứu huỳnh quang

Tiêu bản để quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang có thể làm từ nguyên liệu tươi hoặc

khô. Nguyên liệu đã cố định trong hỗn hợp cồn - glycerin hay các chất cố định khác

không dùng để làm tiêu bản quan sát huỳnh quang vì các chất huỳnh quang bị rửa trôi.

Trường hợp các chất huỳnh quang hoà tan không đáng kể trong chất cố định nhưng

chúng bị phân tán làm thay đổi vị trí ở trong mô, dễ dẫn tới các kết luận sai.

Ðể nghiên cứu dưới kính hiển vi huỳnh quang từ dược liệu người ta làm các lát cắt, một

số trường hợp sử dụng bột dược liệu khô vì trong bột luôn gặp các mẩu mô theo tiết diện

ngang hoặc dọc.

Khi làm tiêu bản để nghiên cứu dưới kính hiển vi huỳnh quang cần chú ý rằng phương

pháp này có độ nhạy rất cao, nguyên liệu cũng như phiến kính, lá kính cần phải sạch,

thuốc thử không bị lẫn tạp, các lát cắt cần phải làm hết sức cẩn thận.

Làm tiêu bản từ cây tươi, cắt tay bằng lưỡi dao cạo, không cần thiết phải mỏng. dùng

giấy lọc thấm dịch tế bào từ các lát cắt, mỗi lần trước khi cắt lát mới cần làm sạch dao để

các chất trong dịch tế bào hay trong các túi chứa không dính vào dao giây ra các mô và tế

bào khác.

Lựa chọn chất lỏng để soi phụ thuộc vào thành phần hoá học của đối tượng. Chất lỏng

phải không được hoà tan các chất huỳnh quang. Nếu chất lỏng soi hoà tan chất huỳnh

quang thì chất lỏng sẽ phát huỳnh quang ảnh hưởng tới việc quan sát huỳnh quang ở tiêu

bản. Sau một thời gian vi phẫu ngâm trong chất lỏng quan sát, một số chất phát huỳnh

quang bị phân tán, để khắc phục người ta bỏ lá kính ra, lấy vi phẫu rửa qua nước hoặc

nước-glycerin sau đó lại lên kính trong một giọt chất lỏng mới để quan sát. Dung dịch

cloralhydrat sử dụng rộng rãi làm dung dịch soi trong kỹ thuật hiển vi không dùng trong

các trường hợp này vì nó có tính chất làm tắt huỳnh quang. Ðể làm dung dịch soi thường

sử dụng nước cất, glycerin, dầu vaselin, để làm tiêu bản cố định dùng xiro đường, dung

dịch 5% polivinylancol. Cần phải kiểm tra trước để đảm bảo trong dịch soi không có mặt

các chất phát huỳnh quang. Các đối tượng phát huỳnh quang sáng rõ nhất trong không

khí vì vậy có thể nghiên cứu chúng không dùng dịch soi, để hạn chế quá trình khô của lát

cắt dùng parafin lỏng để bọc quanh mép lá kính. Các lát cắt dược liệu khô cho kết quả tốt

khi nghiên cứu dưới kính hiển vi huỳnh quang. Dược liệu khô bảo quản tương đối tốt cấu

trúc, chỉ có các mô được tạo thành từ các tế bào có thành cellulose rất mỏng là dễ bị biến

dạng khi khô vì mất nước. Khi sấy thường không xảy ra sự thay đổi vị trí các chất có hoạt

tính sinh học. Trở ngại lớn nhất khi làm lát cắt từ dược liệu khô là độ bền cơ học của

chúng, để nghiên cứu dưới kính hiển vi huỳnh quang phải làm các lát cắt dày của vỏ, rễ,

rễ củ, thân (dày 2-4 mm) những lát cắt mỏng hơn thường dễ bị vụn và gẫy. Các lát cắt

khô tốt nhất làm bằng cách cưa, khi cưa bụi sẽ bám chặt vào bề mặt, bịt các tế bào và các

khoang. Cần phải làm sạch bụi bằng dao cạo sao cho mô và tế bào vẫn giữ được hình

dạng của chúng. Gắn lát cắt vào phiến kính bằng parafin nung chảy. Quan sát không cần

chất lỏng thuận lợi khi sử dụng kính hiển vi huỳnh quang phản xạ. Các lát cắt dày thuận

tiện để tiến hành các phản ứng hoá học.

Các lát cắt mỏng hơn từ dược liệu khô có thể thu được sau khi làm mềm nó trong buồng

ẩm, song các lát cắt mỏng thường dễ vỡ vì vậy nên quan sát dưới kính hiển vi trong nước,

glycerin hay các dung môi thích hợp khác.

Kỹ thuật nghiên cứu các tiêu bản dưới kính hiển vi huỳnh quang về cơ bản không khác

với phương pháp nghiên cứu sử dụng kính hiển vi thường. Khi nghiên cứu các chất

huỳnh quang tự nhiên cần sử dụng các chất chuẩn, các tiêu bản đối chứng đã được loại

rửa chất huỳnh quang bằng các dung môi khác nhau.