BAB IITINJAUAN PUSTAKA

1. Tinjauan Makanan dan Minuman

Makanan dan minuman adalah semua bahan baik dalam bentuk alamiah maupun dalam bentuk buatan yang dimakan manusia kecuali air dan obat-obatan, karena itu makanan merupakan satu-satunya sumber energi bagi manusia 1. Sebaliknya makanan juga dapat menjadi media penyebaran penyakit. Dengan demikian penanganan makanan harus mendapat perhatian yang cukup. Untuk itu, produksi dan peredaran makanan di Indonesia telah diatur dalam Peraturan Menteri Kesehatan No. 329/MenKes/XII/1976 2. Bab II Pasal 2 peraturan ini menyebutkan bahwa makanan yang diproduksi dan diedarkan di wilayah Indonesia harus memenuhi syarat-syarat keselamatan, kesehatan, standar mutu, atau persyaratan yang ditetapkan oleh Menteri untuk tiap jenis makanan.

Susu sari kedelaiKomposisi susu sari kedelai hampir sama dengan susu sapi. Karena itu susu kedelai dapat digunakan sebagai pengganti susu sapi. Susu ini baik dikonsumsi oleh mereka yang alergi susu sapi, yaitu orang-orang yang tidak punya atau kurang enzim laktase dalam saluran pencernaannya, sehingga tidak mampu mencerna laktosa dalam susu sapi. Laktosa susu sapi yang lolos ke usus besar akan dicerna oleh jasad renik yang ada di sana. Akibatnya, orang yang tidak toleran terhadap laktosa akan menderita diare tiap kali minum susu sapi. Umumnya, mereka orang dewasa yang tidak minum susu pada waktu masih kecil. Karenanya, penderita kebanyakan berasal dari kawasan Asia, Afrika, Amerika Latin, dan negara-negara berkembang (Koswara 2006). Menurut Dwidjoseputra (1990) susu kedelai merupakan bahan makanan sempurna yang di dalamnya mengandung nilai gizi yang tinggi sehingga baik untuk dikonsumsi manusia. Tetapi dengan nilai gizi yang tinggi tersebut susu kedelai merupakan media yang baik untuk pertumbuhan berbagai macam mikroorganisme, baik mikroorganisme yang menguntungkan maupun mikroorganisme yang dapat membahayakan manusia. Macam dan jumlah bakteri akan berbeda dari kelompok susu yang berbeda. Menurut SNI 01-3830-1995, jumlah cemaran bakteri total sekitar 1 X 106 CFU/ml. Di samping bakterinya yang rendah, air susu harus bebas dari berbagai kotoran, mempunyai bau yang normal, serta bebas dari spora serta mikroorganisme yang dapat menyebabkan penyakit (Hadiwiyoto, 1994).Dari pengertian tersebut dapat dikatakan bahwa tidak ada air susu kedelai yang benar-benar bersih dari kontaminasi mikroorganisme setelah proses pembuatannya, tetapi air susu kedelai yang terdapat di dalam kemasan yang hiegenis dan dikemas secara vacum masih dapat dikatakan steril atau bebas bakteri. Kontaminasi mikroorganisme di dalam air susu kedelai dapat diperoleh dari penggunaan alat-alat pemprosesan yang kotor, kotoran di sekitar wadah pengolahan dan dapat juga berasal dari bahan baku yang tidak hiegenes serta debu atau faktor lain yang menyebabkan terjadinya kontaminasi terhadap air susu kedelai tersebut.Berbagai mikrobia tumbuh dan berkembang dengan baik pada susu kedelai. Dua kelompok utama mikrobia tersebut adalah bakteri dan fungi. Bakteri merupakan mikrobia bersel satu dengan ukuran 0,4-1,5 m dan mempunyai berbagai macam bentuk mulai berbentuk bulat, panjang dan spiral (Widodo, 2003). Bakteri tersebar luas di lingkungan baik di udara, air dan tanah, dalam usus binatang, dalam lapisan yang lembab pada mulut, hidung atau tenggorokan, pada permukaan tubuh atau tumbuhan (Gaman dan Sherrington,1994).Kelompok bakteri yang sering mengkontaminasi pangan termasuk susu kedelai adalah Pseudomonodaceae, Bacillaceae, Enterobacteriaceae, Lactobacillaceae dan Sreptococcaceae, sertaMicrococcaceae.1.EnterobacteraceaeGolongan bakteri Enterobacteraceae merupakan sekelompok besar dari bakteri Gram negatif, tidak berspora, berbentuk batang kecil. Beberapa genus Enterobacteriaceae penting bagi kesehatan masyarakat karena menimbulkan wabah keracunan pangan dan penyakit infeksi yang ditularkan melalui makanan yang cukup serius. 2. PseudomonasPseudomonas adalah bakteri aerob tetapi dapat mempergunakan nitrat dan arginin sebagai elektron dan tumbuh sebagai anaerob yang berbentuk batang, Gram negatif, bergerak dengan flagel polar, satu atau lebih, ukuran 0,8-1,2m. Beberapa galur memproduksi pigmen larut air, tumbuh baik pada 37C-42C ( Jawetz dkk., 2001 ). Bakteri Pseudomonas biasanya terdapat dalam air susu mentah yang belum dipasteurisasi (Volk dan Wheeler, 1993). Selain itu juga sebagai sumber kontaminasi pada proses pembuatan susu kedelai secara langsung oleh manusia (Supardi dan Sukamto, 1999).Pseudomonas terdapat dalam flora usus normal dan kulit manusia dalam jumlah kecil. Bakteri ini dapat menyebabkan infeksi pada orang yang mempunyai ketahanan tubuh yang menurun, yaitu penderita luka bakar, orang yang sakit berat atau dengan penyakit metabolik atau orang yang sebelumnya memakai alat-alat bantu kedokteran seperti kateter ( pada penderita infeksi saluran kemih ) dan respirator ( pada pendrita pneumonia ) (Anonim,1994).3. MicrococcaceaeSpesies dari famili ini adalah Gram positif, tidak berspora, bersifat katalase positif yang dapat tersusun secara tunggal, berpasangan, atau kelompok kecil. Dua genus yang penting dalam bahan pangan adalah Micrococcus dan Staphylococccus. Kelompok Staphylococci yang terpenting organisme ini mampu memproduksi suatu enterotoksin yang cukup berbahaya yang menyebabkan terjadinya peristiwa keracunan makanan (Buckle dkk., 1987).Staphylococcus merupakan bakteri Gram positif berbentuk bulat biasanya tersusun dalam bentuk kluster (menggerombol) yang tidak teratur seperti anggur. Staphylococcus bertambah dengan cepat pada beberapa tipe media dengan aktif melakukan metabolisme, melakukan fermentasi karbohidrat dan menghasilkan bermacam-macam pigmen dari warna putih hingga kuning gelap. Staphylococcus cepat menjadi resisten terhadap beberapa antimikroba ( Jawetz dkk., 2001 ).Staphylococcus tumbuh dengan baik pada berbagai media bakteriologi di bawah suasana aerobik atau mikroaerofilik. Tumbuh dengan cepat pada temperatur 20C-35C. Koloni pada media padat berbentuk bulat, lambat dan mengkilat ( Jawetz dkk., 2001). Staphylococcus aureus sering ditemukan sebagai kuman flora normal pada kulit dan selaput lendir manusia. Dapat menjadi penyebab infeksi baik pada manusia maupun hewan. Beberapa jenis bakteri ini dapat membuat enterotoksin yang dapat menyebabkan keracunan makanan. Bakteri Staphylococcus aureus juga merupakan salah satu penyebab penyakit Mastitis.

2. Metode MPNPerhitungan jumlah mikroba dapat dilakukan dengan perhitungan langsung maupun tidak langsung. Perhitungan secara langsung dapat mengetahuibeberapa jumlah mikroorganisme pada suatu bahan pada suatu saat tertentu tanpa memberikan perlakuan terlebih dahulu, sedangkan jumlah organisme yang diketahui dari cara tidak langsung terlebih dahulu harus memberikan perlakuan tertentu sebelum dilakukan perhitungan. Perhitungan secara langsung, dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu :perhitungan pada cawan petri (total plate count/TPC), perhitungan melaluipengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Dwidjoseputro, 1994).Metode perhitungan MPN memiliki prinsip kerja dengan menggunakan larutan sebagai media pertumbuhan atau disebut sebagai media cair (broth) yang ditempatkan dalam tabung reaksi. Hasil perhitungannya dilakukan dengan melihat jumlah tabung yang positif gas. Umumnya setiap pengenceran digunakan 3-5 buah tabung. Lebih banyak tabung yang digunakan menunjukan ketelitian yang lebih tinggi. Standar analisa air untuk mengetahui adanya bakteri coliform ada 3 melalui tahapan uji yaitu:1. Uji duga (Presumtive Test)Bertujuan untuk menduga adanya bakteri coli yang mempunyai sifat mampu memfermentasikan laktosa dengan menghasilkan gas. Bakteri coli yang diduga meliputi semua bakteri gram negatif tdak membentuk spora, selnya membentuk sel pendek, bersifat fakultatif anaerob, membentuk gas dalam waktu 24 jam dari laktosa pada temperatur 37 derajat Celsius. Apabila terbentuk gas dalam waktu 24 jam kedua (48 jam) uji dinyatakan meragukan. Sedangkan apabila gas tidak terbentuk dalam waktu 48 jam uji dinyatakan negatif. Apabila hasil uji duga negatif, maka uji-uji berikutnya tidak perlu dilakukan karena dalam hal ini berarti pula tidak ada bakteri coli dalam contoh.Untuk analisis air, dalam uji penduga di gunakan lactose broth, sedangkan untuk contoh lainya yang banyak mengandung bakteri asam laktat, misalnya susu, di gunakan brilliant green lactose bile broth (BGLBB). Bakteri asam laktat dapat memfermentasi laktosa dan membentuk gas, hingga dapat mengakibatkan pembacaan uji positif yang salah. BGLBB merupakan medium selektif yang mengandung asam bile sehingga dapat menghambat bakteri gram positif termasuk Coliform. Inkubasi di lakukan pada suhu 35oC selama 24-48 jam dan tabung di nyatakan positif bila terebentuk gas sebanyak 10 % atau lebih dari volume di dalam tabung Durham.tabuung yang tidak menunjukan terbentuknya gas di perpanjang lagi inkubasinya hingga 48 jam. Jika tetap tidak terbentuk gas, di hitung sebagai tabuung negatif. Jumlah tabuung yang positif di hitung pad masing-masing seri. MPN penduga dapat di hitung dengan melihat table MPN 7 tabung.2. Uji Penetapan (Comfirmed Test)Bertujuan untuk menegaskan hasil positif dari test perkiraan media yang secara umum digunakan adalah Brilliant Green Laktosa Bile Bronth (BGLBB 2%) atau bisa juga menggunakan media selektif dan diferensial untuk bakteri coli sperti misal Endo Agar (EA). Pembacaan dilakukan dengan melihat 24-48 jam dengan melihat tabung-tabung yang positif. Test ini merupakan test yang minimal harus dikerjakan untuk pemeriksaan bakteriologis air. Terbentuknya gas dalam lactose broth atau dalam BGLBB tidak selalu menunjukan bakteri coli karena mikroba lainya mugkin juga ada yang dapat memfermentasikan laktosa dengan membentuk gas, misalnya bakteri asam laktat dan beberapa kahmir tertentu. Oleh karena itu perlu di lakukan uji penguat pada agar EMB.Dengan Menggunakan jaarum ose, contoh dari tabung MPN yang menunjukan uji penduga positif (terbentuk gas) masing-masing di inokulasikan pada agar cawan EMB dengan cara goresan kuadran. Semua tabung di inkubasikan pada suhu 35oC selam 24 jam. Jumlah cawan EMB pada masing-masing pengenceran yang menunjukan adanya pertumbhan Coliform, baik fekal maupun non fekal, dihitung, dan MPN penguat dapat di hitung dari table MPN 7.3. Uji Lengkap ( Completed Test)Dari pertumbuhan koloni pada agar cawan EMB, di pilih masing-masing satu koloni yang mewakili Coliform fekal dan satu koloni yang mewakili Coliform non fekal. Uji lengkap di lakukan untuk melihat apakah isolat yang di ambil benar merupakan bakteri Coliform. Dari masing-masing koloni tersebut di buat perwarnaan gram, dan sisanya masing-masing di larutkan ke dalam 3 ml larutan pngencer steril. Dari suspensi bakteri tersebut masing di inokulasikan menggunakan jarum ose ke dalam tabung berisi lakose broth dan tabung Durham, dan di goreskan pada agar miring nutrien agar. Tabung di inkubasikan pada suhu 35oC selam 24 jam, dan di amati pertumbuhan dan pembentukan gas di dalam lactose broth. Koloni yang menunjukan reaksi pewarnaan gram negatif berbentuk batang, dan membentuk gas di dalam lactose broth mereupakan uji lengkap adanya koloni ColiformBertujuan untuk mendapatkan hasil yang betul-betul lengkap dan memperkuat hasil uji sebelumnya. Biasanya dengan membuat isolasi/ piaraan murni dengan coloni yang tumbuh pada test penetapan. Uji ulang juga dimaksudkan untuk uji ulang apakah jasad renik yang diduga Coliform pada uji duga memang benar. Dalam uji lengkap dapat diamati morfologi dan fisiologi dari bakteri yang diduga coiform. Apabila semua kriteria dipenuhi dapat ditarik kesimpulan bahwa contoh air mengandung bakteri coliform.Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk koloni (colony forming unit) dalam sampel. Namun, pada umumnya nilai MPN juda diartikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri. Satuan yang digunakan, umumnya per 100 mL atau per gram. Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi (Lim, 1998).Menurut Plummer (1987), ada beberapa cara yang dapat digunakan untuk menghitung atau mengukur jumlah jasad renik di dalam suatu suspensi atau bahan, yang dapat dibedakan atas beberapa kelompok yaitu:a. Perhitungan jumlah sel1. Hitungan mikroskopik2. Hitungan cawan3. MPN (Most Probable Number)b. Perhitungan massa sel secara langsung1. Volumetrik2. Gravimetrik3. Kekeruhan (turbidimetri)c. Perhitungan massa sel secara tidak langsung1. Analisis komponen sel2. Analisis produk katabolisme3. Analisis konsumsi nutrientMetode MPN biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam contoh yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh berbentuk padat dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1:10 dari contoh tersebut. Metode MPN digunakan medium cair di dalam tabung reaksi, dimana perhitungannya dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif yaitu yang ditumbuhi oleh jasad renik setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas di dalam tabung kecil (tabung Durham) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik pembentuk gas (Fardiaz, 1993).Ada 3 ragam yang biasanya dipakai pada pemeriksaan MPN yaitu :1. Ragam 511- 5 tabung yang berisi LB double x 10 ml- 1 tabung yang berisi LB single x 1 ml- 1 tabung yang berisi LB single x 0,1 ml2. Ragam 555- 5 tabung yang berisi LB double x 10 ml- 5 tabung yang berisi LB single x 1 ml- 5 tabung yang berisi LB single x 0,1 ml3. Ragam 333- 3 tabung yang berisi LB double x 10 ml- 3 tabung yang berisi LB single x 1 ml- 3 tabung yang berisi LB single x 0,1 ml3. Ragam 333

3. Coliform dan ColitinjaBakteri coliform merupakan golongan mikroorganisme yang lazim digunakan sebagai indikator, di mana bakteri ini dapat menjadi sinyal untuk menentukan suatu sumber air telah terkontaminasi oleh patogen atau tidak. Berdasarkan penelitian, bakteri Coliform ini menghasilkan zat etionin yang dapat menyebabkan kanker. Selain itu, bakteri pembusuk ini juga memproduksi bermacam-macam racun seperti indol dan skatol yang dapat menimbulkan penyakit bila jumlahnya berlebih di dalam tubuh (Pracoyo, 2006).Beberapa patogen yang telah dikenal sejak beberapa dekade lalu adalah giardia lamblia (giardiasis), cryptosporidium (cryptosporidiosis), hepatitis A (penyakit terkait hati), dan helminthes (cacing parasit). Bakteri Coliform dapat digunakan sebagai indikator karena densitasnya berbanding lurus dengan tingkat pencemaran air. Bakteri ini dapat mendeteksi patogen pada air seperti virus, protozoa, dan parasit. Selain itu, bakteri ini juga memiliki daya tahan yang lebih tinggi daripada patogen serta lebih mudah diisolasi dan ditumbuhkan (Doyle, 2006).Ciri-ciri bakteri coliform antara lain bersifat aerob atau anaerob fakultatif, termasuk ke dalam bakteri gram negatif, tidak membentuk spora, dan dapat memfermentasi laktosa untuk menghasilkan asam dan gas pada suhu 35C-37C. Contoh bakteri coliform antara lain Escherichia coli, Salmonella spp., Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, dan lain-lain (Hajna, 1943).Adanya bakteri coliform di dalam makanan atau minuman menunjukan kemungkinan adanya mikroorganisme yang bersifat enteropatogenik dan atau toksigenik yang berbahaya bagi kesehatan. Bakteri coliform dapat di bedakan menjadi dua golongan yaitu ;1. Bakteri coliform golongan fekal misalnya Escherichia coli2. Bakteri coliform golongan non fekal.misalnya Enterobakter aerogenesE. coli merupakan bakteri yang berasal dari kotoran hewan maupun manusia sedangkan E.aerogenes Biasanya di temukan pada hewan atau tanaman-tanaman yang telah mati (Nengsih, 2010). Coliform fekal (kadang-kadang coliform feses atau fecl coliform) adalah, bakteri fakultatif-anaerob berbentuk batang, gram negatif, dan non-sporulasi. Coliform fekal mampu tumbuh dan menghasilkan asam dan gas dari laktosa dalam waktu 48 jam di 44 0,5 C. Fekal Coliform, seperti bakteri lainnya, biasanya dapat dihambat pertumbuhannya dengan air mendidih atau dengan memperlakukan dengan klorin. Mencuci bersih dengan sabun setelah kontak dengan air yang tercemar juga dapat membantu mencegah infeksi. Sarung tangan harus selalu dipakai ketika melakukan tes coliform fecal. Rekomendasi EPA dan untuk suplai air rumah tangga, untuk pengobatan, jumlah Coliform fekal kurang dari 2000 colonies/100 mL, dan untuk Standar air minum kurang dari 1 koloni / 100 ml (Anonim1, 2010).Bakteri coliform dalam air minum dikategorikan menjadi tiga golongan, yaitu coliform total, fecal coliform, dan E. coli. Masing-masing memiliki tingkat risiko yang berbeda. Coliform total kemungkinan bersumber dari lingkungan dan tidak mungkin berasal dari pencemaran tinja. Sementara itu, fecal coliform dan E. coli terindikasi kuat diakibatkan oleh pencemaran tinja, keduanya memiliki risiko lebih besar menjadi patogen di dalam air. Bakteri fecal coliform atau E. coli yang mencemari air memiliki risiko yang langsung dapat dirasakan oleh manusia yang mengonsumsinya. Kondisi seperti ini mengharuskan pemerintah bertindak melalui penyuluhan kesehatan, investigasi, dan memberikan solusi untuk mencegah penyebaran penyakit yang ditularkan melalui air (Anonim2, 2010).Bakteri Colitinja merupakan air yang mengandung colitinja berarti air tersebut tercemar tinja. Tinja dari penderita sangat potensial menularkan penyakit yang berhubungan dengan air.

DAFTAR PUSTAKAAnonim1. 2010.Bakteri Koliform Fekal(Fecal Coliform). http://www.bangkoyoy.com/2010/10/bakteri-koliform-fekal-fecal-coliform.html. Diakses pada 23 September 2013.

Anonim2. 2010. Bakteri Koliform yang Bersifat Anaerob. http://1sthumanwinner.wordpress.com/2010/12/16/bakteri-koliform-yang-bersifat-anaerob/. Diakses pada 23 September 2013.

Buckle,K.A., R.A Edwards,G.H. Fleet,dan M.Woottoon, 1985, Ilmu Pangan, UI-Press, Jakarta.

Dwidjoseputro, D.1994, Dasar-Dasar Mikrobiologi, Djambatan, Jakarta.

Doyle, M.P., Erickson, M.C. 2006. Closing The Door On The Fecal Coliform Assay. Microbe 1, hal. 162-163.

Hajna, A.A., Perry, C.A. 1943. Comparative Study Of Presumptive And Confirmative Media For Bacteria Of The Coliform Group And For Fecal Streptococci. Am J Publ Hlth 33, hal. 550-556.

Lim, D, 1998, Microbiology 2nd edition, United States of America, McGraw Hill. Pakadang, S., 2010., Buku Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi, Jurusan Farmasi Politeknik Kesehatan Depkes Makassar, Makassar.

Plummer, D. T., 1987, An Introduction to Practical Biochemistry, Tata Mc-Graw Hill Publishing Company LTD, Bombay- New Delhi.

Pracoyo, N.E. 2006. Penelitian Bakteriologik Air Minum Isi Ulang di Daerah Jabotabek. Cermin Dunia Kedokteran 152, hal. 37-40.

BAB IIIMETODOLOGI PERCOBAAN

Hari, Tanggal:Kamis, 17 September 2013 Pukul:11.30 14.50 Tempat:Laboratorium Bakteriologi Analis Kesehatan Poltekkes Denpasar Alat:1. Tabung reaksi dan rak tabung2. Inkubator3. Ose4. Lampu spiritus5. Pipet ukur 1 mL dan 10 mL6. Gelas beaker7. Botol Semprot8. Ball pipet

Bahan:1. Sampel susu kedelai2. Sampel kue dadar3. Kapas berlemak4. Benang pulung 5. Aluminium foil

Media / Reagensia1. Media Lactose Broth Single Strength (LBSS)2. Media Lactose Broth Double Strength (LBDS)3. Brilliant Green Lactose Bile Broth 4. Aquades steril

Cara Kerja:A. Uji Penduga (Presumtive Test) Sampel cair 1. Disiapkan alat dan bahan.2. Diaseptiskan tangan , alat, dan tempat kerja.3. Sampel susu kedelai dipipet sebanyak 10 mL , dilarutkan dengan aquades steril sebanyak 90 mL4. Disiapkan lima buah tabung yang masing-masing berisi media LBDS sebanyak 10 ml (tabung 1a sampai 5a) . Juga disiapkan 2 tabung yang berisi 10 ml media LBSS (tabung 1b dan 2b)5. Dengan pipet steril di inokulasikan masing-masing: 10 ml sampel ke dalam tabung 1a sampai 5a 1 ml sampel ke dalam tabung 1b 0,1 ml sampel ke dalam tabung 2b6. Tabung-tabung digoyangkan perlahan agar sampel air menyebar ke seluruh bagian media kemudian di inkubasikan pada suhu 35-37oC selama 24-48 jam.7. Setelah diinkubasi amati masing-masing tabung untuk melihat ada tidaknya gas dalam tabung durham. Adanya gas dalam tabung menunjukkan presumtif positif.

B. Uji penduga (Presumtive test) sampe padat.1. Disiapkan alat dan bahan.2. Diaseptiskan tangan , alat, dan tempat kerja.3. Sampel kue dadar ditimbang sebanyak 10 g , digerus dan kemudian dilarutkan dengan aquades steril sebanyak 90 mL.4. Disiapkan lima buah tabung yang masing-masing berisi media LBDS sebanyak 10 ml (tabung 1a sampai 5a) . Juga disiapkan 2 tabung yang berisi 10 ml media LBSS (tabung 1b dan 2b)8. Dengan pipet steril di inokulasikan masing-masing: 10 ml sampel ke dalam tabung 1a sampai 5a 1 ml sampel ke dalam tabung 1b 0,1 ml sampel ke dalam tabung 2b9. Tabung-tabung digoyangkan perlahan agar sampel air menyebar ke seluruh bagian media kemudian di inkubasikan pada suhu 35-37oC selama 24-48 jam.10. Setelah diinkubasi amati masing-masing tabung untuk melihat ada tidaknya gas dalam tabung durham. Adanya gas dalam tabung menunjukkan presumtif positif.

C. Uji penegasan (Confirmative test) sampel padat dan cair1. Uji penegasan adalah uji lanjutan terhadap tabung-tabung positif yang diduga mengandung bakteri coliform.2. Dari tiap-tiap tabung yang presumtive dipindahkan 1-2 ose ke dalam tabung confirmative yang berisi 10 ml BGLB dalam 2 seri.3. Satu seri tabung BGLB di inkubasi pada suhu 37oC untuk memastikan coliform.4. Satu seri tabung lain di inkibasikan pada suhu 44oC untuk memastikan adanya colitinja5. Pembacaan (dicocokan dengan tabel MPN 511) dilakukan setelah 24-48 jam dengan melihat jumlah tabung BGLB yang menunjukkan positif gas.