Morfología del desarrollo larval de Phyllocnistis citrella ... · en formación. Los resultados obtenidos aportan datos sobre el desarrollo de P. citrella en campo y permitirán

G. V. Vaca, A. A. Michel: Morfología del desarrollo de Phyllocnistis citrel la148

Vaca, Gloria V.; Adriana A. MichelInstituto de Morfología Animal, Área Zoología, Fundación Miguel Lillo. Miguel Lillo 251, (4000) San Miguelde Tucumán, Argentina. Correo electrónico: [email protected]; [email protected]

Recibido: 11/03/16 – Aceptado: 22/10/16

Morfología del desarrollo larval de Phyllocnistiscitrella (Lepidoptera: Gracillariidae) en cultivos decitrus de Tucumán

Resumen — Phyllocnistis citrella es un microlepidóptero que afecta áreas citrícolas delNOA. Sus larvas se alimentan de hojas tiernas formando galerías que disminuyen el crecimien-to de la planta y favorecen el desarrollo de enfermedades bacterianas, afectando la produc-ción. Considerando la importancia económica de la actividad citrícola en Tucumán y los dañosocasionados por esta plaga, el objetivo es analizar mediante un estudio histomorfológico eldesarrollo larval de P. citrella y su efecto en el cultivo, aportando datos para el Manejo Inte-grado de Plagas. Las larvas se obtuvieron de una quinta de limonero mantenida sin aplicaciónde insecticidas para control del minador. Se fijaron en Boüin y conservaron en alcohol n-bu-tílico. Se coloreó con Hematoxilina-Eosina. En base al comportamiento alimenticio, la morfo-logía cefálica y longitud del cuerpo se establecen tres estadios. En el segundo estadio las ca-racterísticas celulo-tisulares y la presencia de bacterias simbiontes en la luz del intestino in-dicarían plena funcionalidad del sistema, esto sumado al desarrollo de las fibras muscularesesqueléticas abdominales le permitirían alimentarse vorazmente de la hoja, disminuyendo sucapacidad fotosintética. Durante el desarrollo larval se observa incremento del cuerpo grasocon características citológicas que infieren síntesis lipídica. A partir del tercer estadio lasglándulas sericígenas producen abundante secreción acidófila. En el segundo estadio se dife-rencian testículos unifoliculares y genitalias del macho y en el tercero los ovarios con ovariolasen formación. Los resultados obtenidos aportan datos sobre el desarrollo de P. citrella encampo y permitirán evaluar en futuros estudios el efecto de los métodos utilizados para elcontrol del minador sobre el desarrollo normal de la especie.

Palabras claves: Minador de los citricos.

Abstract — “Morphology of larval development of Phyllocnistis citrella (Lepidoptera,Gracillariidae) in citrus growing of Tucuman”. Phyllocnistis citrella is a serious pest in citrusgrowing of the NOA region. During larval development it feeds on young leaves producinggalleries, and constraining trees growth which in turn increases the susceptibility to bacterialdiseases, affecting the production. Due to the economic importance of the citric industry inTucumán and the damage caused by this pest, in the present work, we perform a study onhistological larval development of P. citrella and its effect on the crop, providing information forintegrated pests management programs. The larvae were collected in a lemon growing freefrom pesticides control of leafminer. They were fixed in Bouin’s solution, preserved in n-butilicalcohol and the tissues were stained with Hematoxylin-Eosin. Based on the feeding behaviour,the cephalic morphology and body length of the larvae, three stages were established. In thesecond stage the cellular-tissue features and the presence of symbiotic bacteria in the intes-tinal lumen would indicate full system activity that together with development of abdominalskeletal muscles would allow the pest to voraciously eat the leaves causing reduction in pho-tosynthesis. During larval development increase of the fat body and histological feature thatallow us to infer lipids synthesis. In the third stage the silk glands produced abundant acidophilsecretion. Testes with single follicle and genitalia in second stage and ovaries with growingovarioles in third stage were differentiated. These results will assess the effect of controlmethods in the normal development of this species.

Keywords: Citrus leafminer.

Acta zoológica li l loana 60 (2): 148–169, 2016 148


INTRODUCCIÓN

Phyllocnistis citrella «el minador de lahoja de los cítricos» fue descripto por prime-ra vez en la India por Stainton en 1856 yposteriormente se amplía su área de distri-bución a zonas de Asia, Australia, África ydiversas islas del pacifico. En América seregistra su presencia por primera vez enmayo de 1993 en la región de la Florida, en1995 en Venezuela y en 1996 se lo ubica enBrasil. Este microlepidóptero invade Argen-tina en 1995 y se dispersa rápidamente afec-tando las áreas citrícolas del Norte del país.En la provincia de Tucumán está presentetodo el año, afectando especialmente lasbrotaciones de verano y otoño (Garijo y Gar-cía, 1994; Robles-González et al., 2005;Casmuz et al., 2007).

P. citrella afecta a las especies del géneroCitrus y a todas las variedades de híbridos yplantas relacionadas con la familia Ruta-ceae. Durante su estado larval se alimentadel contenido de las células epidérmicas delas hojas recién formadas de los brotes nue-vos, formando una mina serpenteante (Sán-chez et al., 2002). Esta actividad ocasionaun deterioro del brote joven causando unadisminución en el vigor vegetativo del árbol,y por consiguiente en la futura producción(Garijo y García, 1994). Asimismo, estedaño directo puede contribuir a la penetra-ción y desarrollo de cáncer de los cítricosocasionado por la bacteria Xanthonomasaxonopodis pv citri (Chagas et al., 2001).

Entre los países productores de cítricos,la República Argentina es el octavo produc-tor de cítricos y primer productor de limón,y exporta frutas cítricas frescas, jugos y acei-tes esenciales desde 1970. El desarrollo delos cultivos de citrus en el país se extiende en2 regiones: el Noroeste (NOA), donde se pro-ducen naranjas, pomelos y limones (princi-palmente en la provincia de Tucumán), y elNoreste (NEA), donde predominan los culti-vos de naranjas y mandarinas (Fuente: Fede-ración Argentina de Citrus, http://www.federcitrus.org/fruta.asp/).

Entre las provincias productoras de li-món, Tucumán concentra actualmente alre-

dedor del 88% de la producción y el 86% dela superficie total de Argentina destinada alcultivo de limón, lo que posiciona a la pro-vincia como el centro productor más impor-tante de este cítrico. Más del 70% de la pro-ducción se destina a la industria, para laelaboración de jugos concentrados, cascaradeshidratada y aceites esenciales. El resto secomercializa como fruta fresca para cubrirlas demandas del mercado interno y externo(Paredes et al., 2011).

Para la comercialización del limón y delos cítricos en general, la fruta debe cumplircon ciertos parámetros de calidad sanitaria yfitosanitaria que el mercado establece. Lasprincipales plagas y enfermedades cuarente-narias que afectan la producción de cítricosargentinos son la cancrosis y mancha negra(Ghezán et al., 2010). Si bien P. citrella noes considerado un insecto vector de la bacte-ria responsable de la cancrosis, las galeríasexcavadas por las larvas generan nuevospuntos de entradas para la misma, aumen-tando la incidencia y severidad de esta enfer-medad (SINAVEF, 2012).

Los estudios realizados en P. citrella, sibien son escasos, la mayoría comprendendiversos aspectos de su biología, ciclo devida, reproducción, ecología y control deplaga (Garijo y García, 1994; Castillo-Carri-llo y Cornejo-Hidalgo, 1995; Rodríguez yCermeli, 1997; Margaix et al., 1998; Vargaset al., 1998; Sánchez et al., 2002). Las ca-racterísticas del desarrollo larval estableci-das por diferentes autores, se determinaronconsiderando principalmente la ubicaciónde la larva en la hoja y la relación entre laregión cefálica con el resto del cuerpo larval(Sánchez et al., 2002; Baeza Nahed, 2008;Asplanato, 2009).

El adulto de P. citrella es de color blancoy brillo nacarado de 4mm de longitud, lasalas son plumosa con franjas oscuras en dis-posición longitudinal y transversal y unamancha negra en su margen (Garijo y Gar-cía, 1994).

Los adultos, presentes todo el año en elcultivo, son más activos durante el crepúscu-lo y el alba y copulan por la noche. La hem-bra deposita los huevos 24 horas después de


la copula, poniendo mas de 50 huevos du-rante su vida y hasta 20 por noche. En condi-ciones de cría la primera cópula se realiza alas 9 o 10 horas de emergencia del imago yla primera puesta a los 4 u 8 días del ima-go, pudiendo poner más de 70 huevos duran-te quince días. En condiciones controladasde temperatura la fecundidad media es de31 huevos por hembra a 20º C y 70 a 25ºC.Las hembras presentan una vida mas prolon-gada que los machos. Los adultos del mina-dor pueden soportar por tiempo prolongadolas bajas temperaturas del invierno, sin nece-sidad de realizar puesta, de modo que cuan-do las temperaturas les sean favorables yexistan brotes receptivos puedan reanudarsu ciclo (Beattie, 1992 citado por Margaix etal., 1998; Garijo y Garcia, 1994; Margaix etal., 1998; Beattie y Hardy, 2004).

Los huevos de P. citrella son de aspectolenticular y se localizan en las proximidadesde las nervaduras de las hojas. La larva ensu primer estadio es translúcida y posterior-mente durante el segundo, el tercero y el es-tadio de prepupa es amarilla. Durante estaúltima fase el insecto no consume alimentoy está abocado a construir una cámara pu-pal con fibras de seda. La pupa es de tipoobtecta, de forma muy delgada, marrónamarillenta tornándose más oscura con eltiempo (Sánchez et al., 2002).

En condiciones de campo el tiempo de de-sarrollo de la fase de huevo es de 10 días, delperiodo larval es de 12 días y de la fase depupa es de 16 días; mientras que en condicio-nes controladas, a una temperatura 27, 6ºC ya una humedad relativa de 61,3%, el tiempode desarrollo de la fase de huevo es de 2 días,del periodo larval es de 4 días y de la fase depupa es de 6 días. La duración del ciclo devida es muy variable. Dependiendo de la tem-peratura, oscila entre 13 y 52 días y duranteel invierno, con el descenso de la temperatu-ra, la duración del ciclo puede prolongarsehasta 98 días (Garijo y García, 1994; Sánchezet al., 2002; Goane, 2009).

Teniendo en cuenta la importancia econó-mica que tiene la actividad citrícola en laprovincia de Tucumán y los daños ocasiona-dos por esta importante plaga del cultivo de

citrus en la región, el presente trabajo tienecomo objetivo realizar un estudio histomor-fológico del desarrollo larval de Phyllocnistiscitrella y su efecto en el cultivo, con el fin deaportar datos para la aplicación de métodosde control de la especie que se enmarquendentro de un programa de Manejo Integradodel Cultivo dirigido a mejorar la capacidadcompetitiva del sector.

MATERIAL Y MÉTODOS

El material de estudio se obtuvo a partirde hojas colectadas de una quinta de limone-ro, Citrus limón (L), ubicada en calle Cons-titución 1625 (26º44’39.2"S, 65º14’17.5"W),Departamento Tafi Viejo, Provincia de Tucu-mán, Argentina, durante los meses de marzoy mayo del 2014; periodo en el cual se regis-traron valores de temperaturas favorablespara el desarrollo de huevos y larvas. Dichaquinta se mantuvo siempre solo bajo condi-ciones de poda y limpieza de senderos, sinaplicaciones de insecticidas para control delminador (Fig. 1).

Los muestreos se realizaron cada diezdías y la toma de muestras se hizo de la si-guiente manera: se seleccionaron 10 árbolesal azar en distintos puntos del área demuestreo, ubicados tanto en el centro comoen los bordes de la quinta; de cada árbol setomó un brote tierno, extraído del dosel me-dio de la copa. Las muestras se colocaron enbolsa plásticas y se trasladaron al laborato-rio para la identificación y separación deejemplares de diferentes estadios para el pro-cesamiento con técnicas histológica de rutina(Figs. 2 y 3).

Para la diferenciación y separación delos estadios larvales se analizó bajo lupatanto el haz como el envés de cada hoja. Delas hojas observadas se colectó un total de 87ejemplares en los diferentes estadios de desa-rrollo larval (Figs. 4, 5 y 6). Para el estudiohistomorfológico se tomaron 23 muestras detres ejemplares cada una.

Las larvas se fijaron en Boüin (soluciónacuosa saturada de ácido pícrico, formolpuro y ácido acético 70:25:5) durante 24horas. Se deshidrataron en una batería as-


LAMINA 1. Fig. 1. Zona de muestreo, quinta de limoneros, Constitución 1625, Tafí Viejo,Tucumán, Argentina (26º44’39.2"S, 65º14’17.5"W). Fig. 2. Brotes tiernos de Citrus limón(L) con galerías y larvas en estadio LI y LII de Phyllocnistis citrella. Fig. 3. Larva LII de Phy-llocnistis citrella extraída de galería. Figs. 4, 5 y 6. Vista dorsal de larvas en estadio LI, LIIy LIII de Phyllocnistis citrella.


cendente de etanol y se conservaron en alco-hol 70º las destinadas para el estudio de lamorfología externa y en alcohol n-butílicolas destinadas para el estudio histomorfoló-gico. Para dicho estudio, debido al tamañoreducido de las muestras, se realizó un méto-do de doble inclusión en agar-paraplast y serealizaron cortes seriados de 6 µm de espe-sor con orientación sagital y frontal. Loscortes se colorearon con Hematoxilina deErlich-Eosina.

Las observaciones de morfología externase realizaron bajo microscopia esteroscópicasimple marca Leica EZ4. Las observacionescelulo-tisulares se realizaron en un microsco-pio fotónico trinocular de alta resoluciónmarca Leica DM2000 y los resultados obteni-dos se ilustraron con microfotografías toma-das con una cámara digital incorporada almicroscopio marca Leica ICC 5 HD, y lasimágenes analizadas con el programa LeicaV 4,7. Las medidas promedio de longitudtotal y del ancho de la región cefálica y to-rácica de larvas como así también de lasgónadas de ambos sexos en los diferentesestadios se determinaron por la observaciónde cinco (5) ejemplares para cada estadiorealizadas con un microscopio ZEIZZ Lab.A1 utilizando el programa ZEIZZ 2012 (blueedition) con medidas estandarizadas paradiferentes aumentos 5x y 40x (optover 1.0X,cámara Adapter 1.0X). Los preparados histo-lógicos se incorporaron a la Colección dePreparados Histológicos del Instituto deMorfología Animal (FML).

RESULTADOS

En base a observaciones realizadas sobreel comportamiento alimenticio y los cam-bios en la morfología cefálica y longitud delcuerpo durante el desarrollo postembriona-rio de Phyllocnistis citrella en campo se esta-blecen tres estadios larvales. Mediante el es-tudio histomorfológico se analizaron losprocesos de morfogénesis y las variacionesanatomo-histológicas de órganos y sistemasdurante el desarrollo larval de la especie.

ESTADIO LARVAL I (LI)Durante el primer estadio las larvas LI

de P. citrella se ubican cercanas a la nerva-dura central de las hojas, en galerías rectilí-neas que corren paralelas a la misma. Lalarva del primer estadio es transparente decolor verde claro, aplanada dorso-ventral-mente y mide en promedio 0,72 ± 0,02 mmde longitud. En estas larvas se identificanclaramente tres regiones: la región cefáli-ca de forma globosa es más ancha que elresto del cuerpo, siendo el ancho de la cabe-za de 0,16 ± 0,04 mm y del protórax 0,12± 0,02 mm. La región torácica constitui-da por tres segmentos y la región abdomi-nal con diez segmentos claramente diferen-ciados. Durante este estadio en la región ce-fálica se observan estructuras larvales comoel labro de aspecto lobular y un par de ante-nas cortas (Fig. 4).

Las larvas del primer estadio presentanun tegumento constituido por una cutículaelástica, flexible y translucida, en la cual sediferencia una delgada epicutícula colorámbar y una gruesa procutícula fuertementeacidófila; la cutícula se apoya sobre unadelgada epidermis constituida por célulascúbicas bajas fuertemente basófilas.

En la región cefálica se observa unimportante desarrollo de las fibras muscula-res estriadas intensamente acidófilia asocia-das a las piezas bucales y las antenas (Fig.7). El límite entre la región cefálica y toráci-ca está marcado por un delgado surco tegu-mentario de aspecto granular y color ámbar.En la región del tórax se observan dorsal-mente los discos imaginales de las alas ante-riores y posteriores, mientras que en posiciónventral en los segmentos pro, meso y meta-tóracicos se observan los discos imaginalesde las patas. Estos discos se presentan comoun leve engrosamiento epitelial de célulascilíndricas con citoplasma basófilo y un nú-cleo en posición central con cromatina con-densada intensamente basófilo (Fig. 8).

Tanto en la región torácica como abdo-minal de estas larvas se observa cuerpograso parietal con una marcada disposiciónsegmentaria y organizado en capas bien de-limitadas (Fig. 9). El mismo está constituido


LAMINA 2. Fig. 7. Corte frontal de ejemplar en estadio LI. En la región cefálica (RC) se des-taca el desarrollo de los ganglios cefálicos (GC) en posición media dorsal, grandes fibras mus-culares (M) en la zona anterior y posterior de la misma y la región media de la glándulasericígena (GSM) próxima a su desembocadura en la hipofaringe. En los ganglios cefálicos sediferencian la zona de cuerpos neuronales (cn) y del neuropilo (n). Entre región cefálica ytorácica (RT) se observa el surco tegumentario (ST) que separa ambas regiones. En la regiónabdominal (RA) se observa el intestino medio (IM) y la región distal de la glándula sericígena(GSD). Coloración: H-E. Escala: 1 cm = 39 µm. Fig. 8. Corte sagital de ejemplar en estadioLI. En la región cefálica (RC) se observa la desembocadura del intestino anterior a través dela faringe (F) rodeado de grandes haces musculares (M). En la región torácica (RT) se obser-van tres pares de ganglios torácicos (GT) y los discos imaginales de las patas (DIP). Colora-ción: H-E. Escala: 1 cm = 79 µm. Fig. 9. Corte sagital de la región abdominal de una larva


por trofocitos con citoplasmas levementebasófilo y núcleos redondeados, en posicióncentral. Asimismo, en estas regiones se ob-servan delgadas fibras musculares esque-léticas de estriación oblicua que corren pa-ralelas al tubo digestivo (Fig. 11).

En el primer estadio larval de P. citrella elsistema traqueal se encuentra en una eta-pa inicial de su diferenciación, observándosesolamente con gran aumento en la región to-rácica pequeñas traqueolas que rodean losdiscos imaginales de alas y patas, y pequeñosespiráculos en la membrana intersegmenta-ria de algunos segmentos abdominales.

En estas larvas el sistema nerviosoestá constituido por un par de ganglios cere-brales y tres pares de ganglios torácicos fu-sionados en la línea media, en los cuales sevisualizan claramente la capa de cuerposneuronales en la periferia y el neuropilo enposición central constituido por una masa defibras nerviosas levemente acidófilas (Figs. 7y 8). En larvas que se encuentran al final delprimer estadio se puede observar en la re-gión abdominal la presencia de pequeñasmasas ganglionares que formarán la cadenaganglionar ventral.

A partir del primer estadio y durantetodo el desarrollo larval el tubo digestivoes recto y largo, con la abertura bucal yanal claramente visibles y constituido portres regiones: el intestino anterior es untubo corto, visible a la altura del ganglio del

mesotórax, formado por un epitelio simplede células aplanadas, recubierto por una in-tina cuticular delgada; el intestino medioes largo y de paredes plegadas, abarca desdeel primer al octavo segmento abdominal,constituido por un epitelio simple donde seobservan varios tipos celulares: a) célulascolumnares con microvellosidades apicallargas que forman un borde estriado, cito-plasma granular levemente basófilo y núcleoesférico de posición central, estas células es-tarían implicadas en la secreción de enzimasy en la absorción de nutrientes, b) célulasen copa cuya membrana apical con microve-llosidades se invagina formando una cáma-ra, poseen escaso citoplasma y núcleo en po-sición basal, tendrían función secretora y detransporte de iones a través de la pared intes-tinal y c) células regenerativas o de reempla-zo, son pequeñas y se las observan en grupopocos numerosos ubicadas en la base delepitelio, serían las responsables de reempla-zar las células que se pierden durante la di-gestión (Fig. 9); el intestino posteriorcuyo comienzo está marcado por la inserciónde los tubos de Malpighi, presenta diferentesregiones, el píloro revestido por un epiteliosimple de células aplanadas, el ilion y el co-lon que forman una cámara revestida de epi-telio simple con células de núcleos grandes ypoco citoplasma plegado en la región delcolon y, el recto también revestido por unepitelio simple de células aplanadas, con un

en estadio LI. Se observa el cuerpo graso parietal (CGP) con disposición segmentaria. En elepitelio que constituye la pared del intestino medio (IM) se destacan células columnares (ccl),células en copa (cco) y células regenerativas (cr). En posición latero-ventral paralelo al tubodigestivo se observan las regiones secretoras media (GSM) y distal (GSD) de las glándulassericígena. Coloración: H-E. Escala: 1 cm = 20 µm. Fig. 10. Corte frontal de la región ab-dominal de una larval en estadio LI. Se observa región secretora distal (GSD) de la glándulasericígena a ambos lados del intestino medio (IM). Coloración: H-E. Escala 1 cm = 20 µm.Fig. 11. Corte sagital de la región posterior del abdomen de una larval en estadio LI. Sedestaca zona de inserción ( ) de los túbulos de Malpighi (TM) entre el intestino medio (IM) yposterior (IP). Entre el tubo digestivo y el cuerpo graso parietal se observan grandes fibrasmusculares abdominales (M) y la región distal de la glándula sericígena (GSD). Coloración: H-E. Escala: 1 cm = 20 µm. Fig. 12. Corte sagital región abdominal entre el quinto y séptimosegmento de una larva en estadio LI. En posición dorsal a ambos lados del intestino medio(IM) se observan los esbozos gonadales indiferenciados (EGI) y la región distal de los túbulosde Malpighi (TM). En el intestino medio (IM) se destaca la luz (L) con escaso contenido leve-mente acidófilo y bacterias simbiontes (BS). Coloración: H-E. Escala: 1 cm = 20 µm.


delgado recubrimiento cuticular sobre lamembrana apical del epitelio (Fig. 11). Enla luz del intestino medio se observa escasocontenido levemente acidófilo y bacteriassimbiontes (Fig. 12).

A partir del primer estadio larval de P. ci-trella, se identifican seis túbulos de Mal-pighi, los cuales están organizados en tresramas a cada lado del tubo digestivo, cuyoextremo proximal parte de un tallo comúnque nace entre la unión del intestino medio yposterior (Fig. 11). Dichos túbulos se identifi-can como tubos largos y delgados que alcan-zan la región torácica y cuyo extremo distaldesemboca en la última región del intestinoposterior el recto, formando el sistema cripto-nefridial. Cada túbulo está formado por unacapa de células epiteliales gruesas. Estas cé-lulas presentan un citoplasma levemente ba-sófilo, una membrana apical con borde es-triado levemente acidófilo y un núcleo esféricode posición central (Figs. 12 y 16).

La glándula sericígena presente des-de el primer estadio larval, glándula serosade secreción continua, está constituida porun par de tubos glandulares largos y sinuo-sos, que corren latero-ventralmente a lo lar-go del tubo digestivo (Fig. 10). El extremoproximal de los tubos glandulares se une for-mando un conducto común cuyas paredesestán constituidas por un epitelio cúbico conun delgado recubrimiento cuticular sobre lamembrana apical de sus células epiteliales;dicho conducto abre al exterior a través deun pequeño conducto cilíndrico llamado es-pinerete que desemboca ventralmente en lahipofaringe (Fig. 7).

Morfológica y fisiológicamente en estasglándulas se pueden distinguir tres regiones:la región distal y media de función secretoray la región proximal que corresponde al con-ducto secretor. La región distal de mayor lon-gitud y diámetro, está constituida por unepitelio simple ligeramente plegado con cé-lulas cilíndricas bajas, citoplasma granularintensamente basófilo y grandes núcleos pur-puras de forma ramificada ubicado en posi-ción basal; las características citológicas delepitelio en esta región de la glándula indica-rían activa síntesis proteica y sería la res-

ponsable de la síntesis de fibrina (Fig. 9 y10). La región media es de menor diámetroy está formada por un epitelio cilíndrico sim-ple cuyas células secretoras presentan cito-plasma granular levemente basófilo con unnúcleo grande basófilo; esta región sería laresponsable de la síntesis y almacenamientode sericina, además de acumular en su luzla fibrina producida por la región distal(Figs. 7 y 9). El paso de la región media a ladistal está marcado por un pequeño grupocelular con características citológicas distin-tas a los epitelios que forman dichas regio-nes. Este complejo celular se compone decélulas cúbicas con citoplasma basófilo ynúcleo de posición central. La región proxi-mal de la glándula es un conducto de peque-ño calibre, formado por un epitelio de célu-las aplanadas en cuya membrana apical seobserva un delgado recubrimiento cuticular(Fig. 7). En la luz de la región distal y me-dia se observa escaso contenido secretoriolevemente acidófilo (Figs. 9 y 10).

En el primer estadio larval de P. citrellase observa un par de esbozos gonadalesindiferenciados, ubicados entre el quinto yséptimo segmento abdominal, en posicióndorsal al tubo digestivo. El esbozo gonadaltiene forma de huso con el extremo distal demayor diámetro y está constituido por unamasa de células germinales dispuestas enforma irregular rodeado externamente poruna delgada capa de células mesodérmicasque se prolonga en el extremo proximal enun delgado cordón celular. En este estadioel esbozo gonadal mide en promedio 25,18µm de longitud (Fig. 12).

ESTADIO LARVAL II (LII)Durante el segundo estadio larval de P.

citrella se observa un cambio en la direcciónde las galerías generadas por las larvas LII,las cuales se alejan de la nervadura principalde la hoja y son de mayor longitud y profun-didad, aumentando la superficie expuesta ylos daños causados por las mismas.

La larva LII es de color amarillo claro yaplanada dorso-ventralmente, mide en pro-medio 1,27± 0,01 mm de longitud. El an-cho de la región cefálica es similar al del


tórax (en promedio ancho de la cabeza0,15± 0,01 mm y del protórax 0,16 ± 0,02mm). En la base de las antenas y de las pie-zas bucales larvales se observa un engrosa-miento epidérmico a partir del cual se for-marán los discos imaginales que darán ori-gen a las antenas y las piezas bucales deladulto.

Asimismo, en la región torácica se ob-serva una intensa actividad mitótica en losdiscos imaginales de las alas y patas, que haproducido un importante engrosamiento delos cordones epiteliales y el consecuente ini-cio de los procesos de invaginación y forma-ción de la cavidad peripodial en los mismos(Fig. 13).

En larvas del segundo estadio se observaun aumento del cuerpo graso en la regiónabdominal, en el cual los trofocitos adoptanforma irregular, con numerosas vacuolascitoplasmáticas y núcleo de forma irregular,otorgando al mismo un aspecto esponjoso.Estos cambios en la morfología del cuerpograso indicarían una activa síntesis y alma-cenamiento de lípidos en el citoplasma delas células (Fig. 16).

En relación al sistema traqueal, enlarvas del segundo estadio se identifican ex-ternamente desde el primer al noveno seg-mento abdominal un par de espiráculos porsegmento, constituidos por un epitelio de cé-lulas bajas levemente basófilas con una del-gada epicutícula sobre la membrana apicaldel mismo y externamente en contacto conla membrana basal una delgada capa de fi-bras musculares. Los espiráculos se conti-núan internamente con tráqueas de gran diá-metro y a nivel de los segmentos meso y me-tatorácicos, asociadas a los discos imagina-les de las alas, se observan tráqueas de pe-queño calibre.

Asimismo, en los segmentos abdominalesde estas larvas se observa claramente la ca-dena ganglionar ventral con un par de gan-glios en cada segmento fusionados en la lí-nea media y unidos entre sí por delgadoscordones nerviosos. Por otra parte, en la re-gión abdominal de larvas del segundo esta-dio se observa un importante desarrollo delas fibras musculares esqueléticas de es-

triación oblicua fuertemente acidófilas, dis-puestas entre el intestino medio y el cuerpograso parietal, y apodemas interseg-mentarios como puntos de inserción deestas fibras.

A nivel del tubo digestivo se observancambios en las células columnares del in-testino medio, las cuales muestran uncitoplasma basal granular basófilo que indi-ca un gran desarrollo del retículo endoplas-mático rugoso, el citoplasma apical cargadode grandes vesículas levemente basófilas yalrededor del núcleo se observa un haloblanco que representa la imagen negativadel Golgi; estos cambios probablemente indi-carían activa síntesis y almacenamiento deenzimas digestivas. Asimismo, en esta re-gión del intestino se observa un incrementoen el número y tamaño relativo de las célu-las en copa. Por otra parte, estas larvas pre-sentan un incremento en el contenido acidó-filo y de la flora bacteriana en la luz del in-testino medio y por primera vez se observanbacterias simbiontes en la luz del intestinoposterior (Fig. 14).

En el segundo estadio larval se observaun aumento del diámetro de la glándulasericígena. La región distal secretora es demayor longitud y ocupa gran parte de la ca-vidad abdominal, con un diámetro mayorque el resto de la glándula. Durante este es-tadio adquiere importancia, por su marcadaacidofilia, la íntima cuticular que recubre elepitelio de la región media. En esta regiónlas células secretoras presentan un citoplas-ma granular levemente basófilo y un núcleointensamente basófilo en posición central,mientras que en las células epiteliales secre-toras de la región distal que presentan igua-les características citoplasmáticas, el núcleose vuelve ramificado presentando un haloblanco alrededor del mismo, lo que pondríaen evidencia un importante desarrollo delretículo endoplasmático rugoso y del com-plejo de Golgi. El lumen de la región distalpresenta escaso material secretorio levemen-te acidófilo. Estas características citológicasindicarían una activa síntesis proteica en laregión distal de las glándulas sericígenas(Figs. 14 y 15).


LAMINA 3. Fig. 13. Corte sagital de región torácica de una larva en estadio LII. Se desta-can ventralmente los discos imaginales de las patas (DIP) y dorsalmente los discos imaginalesde las alas (DIA). En las Fig. A y B se observa con mayor aumento las figuras mitóticas(mi) en las células epiteliales de discos imaginales de alas y patas. Coloración: H-E. EscalasFig. 13: 1cm = 39 µm y Figs. A y B 1 cm = 12 µm. Fig. 14. Corte sagital de región ab-dominal de larva en estadio LII. Se destaca en el intestino medio (IM) las células columnares(ccl) con citoplasma vacuolar basófilo y largas microvellosidades acidófilas y las células encopa (cco) con un depósito de secreción intensamente acidófilo. Se observan las diferentesregiones secretoras de la glándula sericígena (GS), destacándose el complejo celular (COT)ubicado entre las regiones secretoras media (GSM) y distal (GSD) de la glándula. En la regióndistal de la glándula sericígena se destaca además el núcleo ramificado (n). Coloración: H-E.Escala: 1 cm = 20 µm. Fig. 15. Corte sagital de región abdominal de larva macho en esta-dio LII. Se observa un testículo (T) dorsal al intestino medio (IM) que se prolonga en su ex-tremo proximal en el esbozo del conducto eferente (CE). En el folículo testicular se identificaen el extremo distal el Germario (G) con espermatogonias primarias (ep) y la Zona de Creci-miento con espermatogonias secundarias (es) agrupadas en cistos por células capsulares(cc). En las células epiteliales de la región secretora distal (GSD) de la glándula sericígena sedestacan los núcleos ramificados (n). Coloración: H-E. Escala: 1 cm = 20 µm. Fig. 16.Corte sagital del extremo posterior de la región abdominal de larva macho en estadio LII. Seobserva placa genital (PG), el esbozo del conducto eyaculador común (CY) y su bifurcación enlos conductos eyaculadores pares (CYP). Limitado por cuerpo graso parietal se observa elextremo distal de un túbulo de Malpighi (TM), la región distal de la glándula sericígena (GSD)y la hemolinfa (H). Coloración: H-E. Escala: 1 cm = 39 µm.


En las larvas LII se observan importantescambios en el desarrollo del aparato re-productor, ya que se produce la diferencia-ción sexual de la gónada y se diferencian es-tructuras del aparato reproductor que permi-ten identificar el sexo en la larva. En larvasmachos se identifican los testículos, los es-bozos de los conductos eferentes, la porcióngonádica de los conductos deferentes y losesbozos de las glándulas accesorias y de lasdiferentes estructuras que formaran la geni-talia externa del macho (Figs. 15 y 16).

En estas larvas el testículo está consti-tuido por un solo folículo que en promediomide 73,79 ± 0,02 µm de longitud y en élse identifica claramente en la región distalel Germario con espermatogonias primariasdispuestas irregularmente en activa divisióny en la región media y proximal la Zona deCrecimiento con espermatogonias secunda-rias agrupadas en cistos limitados por célu-las capsulares (Fig. 15). Externamente el tes-tículo está recubierto por una delgada vainade células mesodérmicas que se prolonga enel extremo proximal formando un corto cor-dón que corresponde al esbozo del conduc-to eferente y la porción extragonádica delconducto deferente. Asimismo, en la re-gión posterior del abdomen, ventralmente enel noveno segmento abdominal, se observauna invaginación ectodérmica media ventralque corresponde a la cavidad genital delmacho revestida por una gruesa epidermis enactiva división. La cavidad genital se prolon-ga interiormente en un corto conducto quecorresponde al esbozo del conducto eya-culador común, el cual en su extremo dis-tal se bifurca en dos cortas ramas que corres-ponden a los conductos eyaculadorespares (Fig. 16).

ESTADIO LARVAL III (LIII)Durante el tercer estadio las larvas de P.

citrella generan galerías excavadas en lashojas de los citrus, de recorrido sinuoso ydirigido hacia el borde de la hoja, lo quepermite un fácil reconocimiento de las mis-mas. Las larvas LIII son de coloración ama-rillo verdoso y el cuerpo comienza a adquiriruna ligera forma cilíndrica, alcanzando una

longitud promedio de 3,89± 0,01 mm. Du-rante este estadio se observa una notable re-ducción de la región cefálica en relación alresto del cuerpo, siendo el ancho de la cabe-za en promedio de 0,08 ± 0,01 mm y delprotórax de 0,14± 0,04 mm.

En estas larvas la región cefálica ad-quiere forma aguzada y se observa una im-portante actividad mitótica en las célulasepiteliales de los discos imaginales de lasantenas y del aparato bucal, las cuales pro-liferan e invaden el interior de dichas es-tructuras (Fig. 17).

En la región torácica los cordones epi-teliales de los discos imaginales de las patas,cuyas células se observan también en activadivisión mitótica, se disponen formando cír-culos concéntricos que darán origen a lossegmentos de dicho apéndice. Mientras quelos cordones epiteliales que forman los esbo-zos alares, ubicados dorsalmente y en activaproliferación celular, adquieren forma alar-gada (Fig. 17). Por otra parte, en la regiónabdominal de larvas del tercer estadio seobserva un incremento de grandes haces defibras musculares esqueléticas de estria-ción oblicua intensamente acidófilas que seinsertan en grandes apodemas interseg-mentarios (Figs. 17 y 22).

En estas larvas se observa un importantedesarrollo del cuerpo graso parietal yen los trofocitos, de gran tamaño, se observaun incremento en número y tamaño de lasvacuolas citoplasmáticas que le dan un as-pecto esponjoso, lo que indicaría una activasíntesis y almacenamiento de lípidos. El nú-cleo de estas células, de forma irregular ytamaño reducido, presenta un macronucléolopurpura en posición central. Asimismo, enlarvas del tercer estadio se diferencia elcuerpo graso visceral constituido porpequeñas masas de trofocitos, con citoplas-ma basófilo cargado de vacuolas, que sedistribuyen en forma irregular en la cavidadabdominal, principalmente alrededor de lasgónadas y el tubo digestivo (Fig. 18).

Por otra parte, es importante desatacarque en larvas del tercer estadio la hemol-infa de la cavidad abdominal, en intimocontacto con el cuerpo graso visceral que


LAMINA 4. Fig. 17. Corte frontal de la región anterior de una larva en estadio LIII. En la re-gión cefálica (RC) se observan discos imaginales de las piezas bucales (DIB) y el extremoproximal de los tubos glandulares de la glándula sericígena (GSP) que se unen al conductosecretor (CS) que abre ventralmente en esta región. En la región torácica (RT) se observanlos discos imaginales de las patas (DIP) y los ganglios torácicos ventrales (GT). Coloración: H-E. Escala: 1 cm = 39 µm. Fig. 18. Corte sagital de la región abdominal de una larva estadioestadio LIII. Se destaca el cuerpo graso visceral (CGV) próximo al intestino medio (IM) cons-tituido por trofocitos de citoplasma vacuolar (tf). En esta región la hemolinfa (H) se observacargada de grandes vesículas acidófilas. Coloración: H-E. Escala: 1 cm = 20 µm. Fig. 19.Corte sagital de la región abdominal de larva en estadio LIII. Se observa el cuerpo graso pa-rietal (CGP) en contacto con la epidermis, constituido por trofocitos (tf) con citoplasma car-gado de grandes vacuolas lipidias que forman una masa de contorno irregular. Se destacaademás la presencia de grandes enocitos (en) próximos al cuerpo graso con citoplasma va-


rodea a las gónadas y la porción secretorade las glándulas sericígenas, está cargadade pequeñas vesículas intensamente acidófi-las; lo que indicaría un elevado contenidode sustancias proteicas en la composición dela misma (Fig. 18). Asimismo, inmersos enla hemolinfa y próximos al cuerpo graso pa-rietal se observan numerosos enocitos soli-tarios de gran tamaño, cuyo citoplasma pe-rinuclear es granular basófilo y el resto aci-dófilo con grandes vacuolas. El núcleo de es-tas células es esférico purpura en posicióncentral y en algunos casos rodeado de unhalo blanco en la zona perinuclear (Fig.19).

A partir de este estadio en el sistematraqueal se identifican, tanto a nivel del tó-rax como del abdomen, traqueolas que sepresentan como finas ramificaciones tubula-res constituidas por un delgado epitelio decélulas basófilas. Estas ramificaciones se ob-servan próximas a las fibras musculares, alintestino medio y a las regiones secretorasde las glándulas sericígenas (Fig. 20).

En larvas del tercer estadio, a nivel delsistema nervioso se observa un aumentode tamaño de las masas ganglionares y li-gera separación de los lóbulos ganglionaresde la región cefálica y torácica (Fig. 17).

En larvas LIII se observan cambios a ni-vel del tubo digestivo, ya que el intestinomedio presenta un epitelio de menor espesor

que en los estadios anteriores y su luz estácargada de un contenido acidófilo de mayorintensidad que en estadios anteriores. Asi-mismo, se observan variaciones en las carac-terísticas citológicas de las células que locomponen: las células columnares presentanun aumento en el número y longitud de lasmicrovellosidades, las cuales están recubier-tas por un grueso glucocalix que le confiereuna intensa acidofilia a la membrana apicaldel epitelio en esta región, el citoplasmabasófilo está cargado de vacuolas y el núcleose ubica en posición basal; mientras que enlas células en copa se observa un importantedepósito de material de secreción acidófiloen el citoplasma apical y el núcleo de menortamaño en posición basal (Fig. 22).

En el tercer estadio larval se observa unimportante aumento de espesor de las pare-des de los túbulos de Malpighi, las célu-las epiteliales son cilíndricas, con citoplas-ma vacuolado levemente basófilo, un nú-cleo grande y esférico de posición central ylargas microvellosidades en la membranaapical del epitelio que forman un ribete encepillo intensamente acidófilo (Fig. 21).

En larvas fijadas al comienzo de este es-tadio las glándulas sericígenas conser-van las características histológicas presentesen el estadio anterior. Mientras que en unaetapa más avanzada del tercer estadio larvalde P. citrella el epitelio de la región distal de

cuolar intensamente basófilo y la abertura de una tráquea (TR) a través del espiráculos (E).Coloración: H-E. Escala: 1 cm = 20 µm. Fig. 20. Corte sagital de la región media abdominalde una larva en estadio LIII. Se observa el extremo secretor distal de la glándula sericígena(GSD) cuya luz está cargada de secreción con dos componentes intensamente acidófilos, sedestaca además la hemolinfa (H) cargada de vesículas acidófilas y segmentos de finas tra-queólas (TRQ). Coloración: H-E. Escala: 1 cm = 39 µm. Fig. 21. Corte sagital de la regiónabdominal de una larva macho en estadio LIII. Se observa un par de testículos (T) a amboslados del intestino medio (IM). En el folículo testicular se identifica el Germario (G) y la Zonade Crecimiento (ZC) y en su extremo distal los esbozos de los conductos eferentes (CE). Seobserva además el extremo distal de los túbulos de Malpighi (TM) próximos al intestino medio(IM). Coloración: H-E. Escala: 1 cm = 39 µm. Fig. 22. Corte frontal de región abdominal deuna larva hembra en estadio LIII. Dorsalmente a ambos lados del intestino medio (IM) se des-taca un par de ovarios (O) en los que se observan los esbozos de ovariolas (EOV) y externa-mente al ovario una delgada capa de células mesodérmicas que se prolongan en el extremoproximal formando el esbozo del oviducto lateral (EOL). Rodeando al tubo digestivo se obser-van haces de fibras musculares (M) y grandes tráqueas (TR). Coloración: H-E. Escala 1 cm= 39 µm.


la glándula es intensamente basófilo, con lí-mites celulares poco claros y presenta nume-rosas vacuolas ubicadas en la región apicalde las células, observándose abundante se-creción acidófila acumulada en la luz deesta región. En larvas fijadas al final del ter-cer estadio se observa un importante adelga-zamiento del epitelio glandular de la regióndistal de la glándula y abundante secreciónacidófila acumulada en la luz de la misma.La secreción acumulada en la luz de la re-gión distal presenta dos componentes: a) uncomponente periférico, en contacto directocon la membrana apical del epitelio, consti-tuido por una secreción homogénea intensa-mente acidófila; b) un componente centralde secreción levemente acidófila. Mientrasque en la región proximal y media de laglándula solo se observa un notable incre-mento en el diámetro y en la luz de ambasregiones escasa secreción levemente acidófi-la. En larvas del tercer estadio se observa undelgado revestimiento cuticular por encimade la membrana apical del epitelio que re-viste la luz de la región proximal o conductosecretor y la región media secretora de laglándula sericígena (Figs. 17 y 20).

En relación al aparato reproductor,durante el tercer estadio en larvas machono se observan cambios significativos en eldesarrollo de la espermatogénesis, ya que lagónada masculina conserva las característi-cas citológicas observadas en el segundo es-tadio larval; sin embargo, en los testículosde estas larvas se observa una activa divisiónde las espermatogonias secundarias y comoconsecuencia de esto un crecimiento en lon-gitud del folículo que alcanza en promediolos 117,96 ± 0,02 µm de longitud (Fig. 21).Por otra parte, en este estadio en larvashembras se observa un par de ovarios deforma alargada que miden en promedio32,67 ± 0,02 µm de longitud; estos se ubi-can en posición dorsal al intestino medio,entre el quinto y sexto segmento abdominal.Cada ovario está constituido por un grupode pequeñas ovogonias, de citoplasma claroy núcleo grande con cromatina condensada,rodeadas por una delgada capa de célulasmesodérmicas que se prolonga en el extremo

proximal de cada ovario en un largo cordónde tejido conectivo que corresponde a la por-ción extragonádica de los oviductos late-rales. En larvas fijadas en una etapa másavanzada del tercer estadio se observa quelos ovarios están compartimentalizados enpequeñas ovariolas en formación, limita-das por una delgada capa de célulasmesodérmicas; identificándose claramentecuatro ovariolas en diferente grado de desa-rrollo constituidas por ovogonias, la mayo-ría de las cuales se encuentran en interfase yprofase mitótica y un número reducido delas mismas en metafase y anafase (Fig. 22).

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

En este trabajo se aportan datos para unmejor conocimiento del desarrollo larval dePhyllocnistis citrella en campo sin aplicaciónde métodos de control para la especie. Losresultados obtenidos permitirán evaluar enposteriores investigaciones el efecto produci-do por los métodos utilizados para el con-trol del minador sobre el desarrollo normalde la especie.

En referencia al número de estadios lar-vales de P. citrella, en base a las observacio-nes realizadas sobre el comportamiento ali-menticio de las larvas visible a través de laepidermis de las hojas y en particular sobrelos cambios en la morfología externa e inter-na de la región cefálica como así también delos procesos de morfogénesis y las variacio-nes anatomo-histológicas de órganos y siste-mas observadas durante el desarrollo larval,coincidimos con Sánchez et al. (2002) enque P. citrella durante el desarrollo postem-brionario pasa por tres estadios larvales. Larelación existente entre el ancho de las regio-nes cefálica y torácica en los diferentes esta-dios larvales y los cambios histomorfológi-cos observados en la región cefálica durantelos mismos permiten diferenciar y separarclaramente para esta especie la etapa larvalen tres estadios.

Sin embargo, Garijo y García (1994) yVargas et al. (1998) mencionan para estaespecie cuatro estadios larvales, incluyendola prepupa. Teniendo en cuenta que según


Chapman (1969), Leftwich (1976), Gillot(1980), Wigglesworth (1984), Monteresino yManfrini de Brewer (2001) la prepupa es unestadio de quietud entre el final del periodolarval y la pupa propiamente dicha duranteel cual el insecto no se alimenta, en base anuestras observaciones consideramos que enP. citrella la prepupa es la etapa inicial delestadio de pupa, estadio en el cual como enotros insectos holometábolos se dan los pro-cesos de la metamorfosis.

En relación al desarrollo del sistemamuscular, en P. citrella las fibras muscularesesqueléticas abdominales se desarrollan gra-dualmente durante los diferentes estadioslarvales, lo cual se ve reforzado a partir delsegundo estadio larval por el desarrollo deapodemas intersegmentarios que fortalecenla unión de los músculos con la cutícula;permitiéndole a la larva mayor agilidad ydesplazamiento en el interior de la mina.

En cuanto al desarrollo del tubo digesti-vo, a partir del primer estadio larval presen-ta abertura bucal y anal claramente visiblesy está constituido por un intestino anterior,medio y posterior bien diferenciados, conun contenido acidófilo en la luz de estas re-giones que aumenta progresivamente a lolargo del desarrollo larval.

Al igual que en otras larvas de lepidópte-ros como lo mencionan Srivastava (1959)para Leucinodes orbonalis y Correia et al.(2009) para Spodoptera frugiperda, el epite-lio del intestino medio de Phyllocnistis citrellaestá constituido por tres tipos de células: co-lumnares, en copa y regenerativas. En refe-rencia al tipo de secreción de las células co-lumnares, Santos (1984 citado por Cavalcan-te y Cruz-Landim, 1999) menciona para laespecie de Lepidoptera Cassava hornworm,secreción de tipo apocrina para estas células.Las características morfológicas observadasen las células columnares del intestino mediode P. citrella durante el desarrollo larval su-gieren secreción de tipo merocrina.

Teniendo en cuenta que según Cavalcantey Cruz-Landim (1999) y Correia et al.(2009) el epitelio del intestino medio tienecomo función primordial la digestión y ab-sorción de nutrientes como así también la

producción y secreción de enzimas digesti-vas, los cambios en la morfología de las cé-lulas epiteliales del intestino medio y el au-mento en número de las mismas observadosdurante el desarrollo larval de P. citrella enel campo, indicarían que el aparato digesti-vo de esta especie alcanza su máxima fun-cionalidad durante el segundo estadio lar-val; ya que las características citológicas delepitelio del intestino medio observadas apartir del segundo estadio sugieren actividadde absorción de nutrientes por parte de lascélulas columnares y de secreción de mucuspara la protección epitelial y enzimas para elmantenimiento del equilibrio químico delproceso digestivo por las células en copa.Asimismo, las bacterias simbiontes observa-das tanto en la luz del intestino medio comodel posterior contribuirían a una mayor efi-ciencia de las enzimas digestivas segregadaspor las células epiteliales responsables de ladegradación de proteínas y polisacáridos ypor ende de los procesos digestivos antesmencionados; lo cual se ve corroborado porel aumento en la cantidad y acidofília delcontenido de la luz del mismo. Este aumentode eficiencia de los procesos digestivos poracción de bacterias simbiontes en el intestinoobservado durante el desarrollo larval de P.citrella también fue mencionado por Pilon etal. (2013) en sus estudios realizados sobre laactividad proteolítica de las bacterias intes-tinales de Anticarsia gemmatalis.

Estas modificaciones en el tubo digestivosumado a una mayor capacidad de desplaza-miento de las larvas en el interior de lasminas indicado por el desarrollo de las fi-bras musculares esqueléticas abdominales lepermitiría a la larva de P. citrella alimentar-se vorazmente del mesofilo de las hojas apartir del segundo estadio larval, lo que seevidencia por un aumento en la longitud dela galería excavada; lo cual produce reduc-ción en la superficie foliar y por ende oca-siona disminución de la capacidad fotosinté-tica de la hoja y en la productividad de laplanta. Estos resultados coincidirían con lasobservaciones de Asplanato (2009) para estaespecie, quien sostiene que la larva de P. ci-trella se alimenta de las células epidérmicas


desplazándose por movimientos laterales yhacia delante de la región cefálica y el con-tenido de las células destruidas es consumi-do por la larva a través de una activa suc-ción. Los excrementos del insecto se acumu-lan en forma de una línea visible en el cen-tro de la mina, primero son blanquecinos yluego se oscurecen. A partir del segundo es-tadio larvario la mina se ensancha, adquierela forma sinuosa característica y puede lle-gar a ocupar gran parte del limbo.

Durante el desarrollo larval de P. citrellase pueden diferenciar dos tipos de cuerpograso: 1) un cuerpo graso parietal claramen-te visible a partir del primer estadio larvalcon una ubicación bien definida entre laepidermis y las fibras musculares abdomina-les, 2) un cuerpo graso visceral que se dife-rencia a partir del tercer estadio larval enforma de pequeñas masas que rodean en for-ma aislada al tubo digestivo. Ambos tipos decuerpo graso incrementan gradualmente du-rante el desarrollo larval y este aumento vaacompañado de un aumento de tamaño delos trofocitos y de una progresiva vacuoliza-ción del citoplasma que indicaría una activasíntesis y almacenamiento de lípidos, comolo demuestran las variaciones celulo-tisula-res observadas a lo largo de los diferentesestadios larvales de la especie.

Esta clara identificación de dos tipos decuerpo graso y la variación en la diferencia-ción de los mismos durante el desarrollo lar-val de P. citrella, coinciden con lo observadopara otras especies de Lepidóptera como lomencionan Haunerland y Shirk (1995) alanalizar el desarrollo del cuerpo graso deHelicoverpa zea y Carvalho et al. (2013) enel análisis realizado sobre la histología yultraestructura del cuerpo graso en el cuartoestadio larval de Anticarsia gemmatalis. Asi-mismo, el incremento gradual de ambos ti-pos de cuerpo graso acompañado de unaactiva síntesis y almacenamiento de lípidostambién fue observado por Marques-Silva etal. (2003) para la especie Thyrinteina arno-bia arnobia y por Carvahlo et al. (2013)para Anticarsia gemmatalis; mientras queSnodgrass (1935) también menciona que enalgunos insectos en el periodo inicial del

desarrollo postembrionario los trofocitos al-macenan material graso en su citoplasma enforma de glóbulos de grasa y en células ma-duras los glóbulos de grasa se vuelven másgrandes y ocupan la mayor parte de la célu-la y los núcleos a menudo se deforman porla presión de los mismos. Estos resultadosnos permiten concluir que durante la faselarval, periodo de intenso crecimiento, en P.citrella al igual que otros insectos holometá-bolos, el cuerpo graso sintetiza y almacenareservas, en preparación para la fase depupa, periodo en la cual el insecto no se ali-menta y donde ocurre un gran consumo deenergía. Sin embargo, aunque coincidimoscon Cruz-Landim (1983) en que el aumentodel cuerpo graso durante el desarrollo larvales debido a un aumento en tamaño de lostrofocitos, nuestras observaciones indicaríanque durante el desarrollo larval de P. citrellaen el cuerpo graso se sintetizan y almacenansolo lípidos. Asimismo, considerando que enlarvas del tercer estadio de esta especie lahemolinfa está cargada de vesículas con unalto contenido de sustancias proteicas, pode-mos inferir que en P. citrella la síntesis y al-macenamiento de proteínas y glucógeno enel cuerpo graso se produce posteriormenteen el estadio de prepupa y no durante el de-sarrollo larval como lo menciona dicha au-tora para el himenóptero Melipona quadri-fasciata anthidioides.

Las diferencias observadas en la compo-sición de los productos que se sintetizan yalmacenan en el cuerpo graso de Phyllocnis-tis citrella con especies de otros grupos deinsectos, nos sugiere la necesidad de realizarposteriores estudios con técnicas histoquími-cas para determinar la composición químicade las reservas almacenadas en el cuerpograso durante el desarrollo postembrionariodel minador, porque el mismo tiene influen-cia directa en el desarrollo de la especie enel cultivo.

En Phyllocnistis citrella durante el tercerestadio larval, etapa final del desarrollo enla cual la larva aún se alimenta vorazmentede la hoja, se observa un importante aumen-to de componentes proteico en la hemolinfa.Estas observaciones coincidirían con los con-


ceptos establecidos por Chapman (1969),quien sostiene que en Lepidoptera e Hyme-noptera al final del desarrollo larval la con-centración de proteínas y aminoácidos en lahemolinfa es mayor que en otros grupos deinsectos. Asimismo, considerando las carac-terísticas celulo-tisulares observadas en elcuerpo graso en los diferentes estadios larva-les de P. citrella, coincidimos con Locke yCollins (1968), Chapman (1969), Cruz-Lan-dim (1983) y Lakshmi Devi y Yellamma(2013) en que las proteínas y aminoácidosalmacenados en la hemolinfa al final deldesarrollo larval podrían ser utilizadas porlos trofocitos del cuerpo graso para la sínte-sis de nuevas proteínas en respuesta a losrequerimientos metabólicos del insecto parala metamorfosis.

Numerosos autores han estudiado en in-sectos el origen, función y relación de losenocitos con otros tejidos principalmente laepidermis y el cuerpo graso, entre estos po-demos citar a Chapman (1969) quien sostie-ne que los «oenocitos» son células que per-manecen cercanas a su punto de origen cer-ca de la epidermis y Snodgrass (1935) yRoma et al. (2010) quienes mencionan queestas células se ubican debajo de la epider-mis aisladas o en pequeños grupos cercanosa espiráculos y tráqueas; Martins y Ramalho-Ortigão (2012) al igual que los anterioresautores sostienen que los enocitos son célu-las de origen ectodérmico y que usualmentese las encuentra asociadas a la epidermis oal cuerpo graso o a ambos tejidos depen-diendo de la especie y del estado de desarro-llo de la misma. En relación a la función delos enocitos, los autores antes mencionadosconcuerdan en que no está bien definida sufunción pero todos sugieren que estas célu-las en insectos inmaduros están asociadascon los ciclos de muda y probablemente re-lacionadas con la secreción de lípidos o li-poproteínas de la epicutícula y en la síntesisde precursores de la cera.

Durante el desarrollo larval de Phylloc-nistis citrella, los enocitos de esta especie seubican próximos a la epidermis y en íntimarelación con el cuerpo graso parietal, pre-sentando en el tercer estadio larval caracte-

rísticas citológicas que indicarían que la fun-ción de los mismos durante el desarrollo lar-val estaría relacionada con la secreción delípidos o lipoproteínas que participarían enla formación de la epicutícula y en la sínte-sis de precursores de la cera en estadios pos-teriores de su desarrollo. Teniendo en cuentaque la función de estas células aún no hasido claramente definida, se cree que es ne-cesario realizar en el futuro estudios con téc-nicas histoquímicas que permitan determi-nar claramente la función de los enocitosdurante el desarrollo postembrionario en P.citrella.

En relación al número, estructura y dis-posición de los túbulos de Malpighi y su re-lación con la formación del sistema criptone-fridial observados a partir del primer estadiolarval de P. citrella, nuestros resultados coin-ciden con lo mencionado por Snodgrass(1935) y Chapman (1969) quienes mencio-nan igual características para esta condicióndel sistema criptonefridial en larvas de Lepi-doptera y Coleóptera, como así también lomenciona Srivastava (1959) en su estudiosobre la morfología del canal alimenticio delarva de Leucinodes orbonalis (Lepidoptera,Pyraustidae) y Srivastava y Khare (1966) alestudiar el desarrollo de los túbulos de Mal-pighi y estructuras asociadas en Philosamiaricini (Lepidoptera, Saturnidae).

Las características histomorfológicas de-terminadas para las diferentes regiones delas glándulas sericígenas a partir del primerestadio larval de P. citrella coinciden con lasobservadas por Tanaka (1911), Takahashi etal. (1990), Barsagade y Tembhare (2000) yMarchi et al. (2009) para otras especies deLepidoptera. Sin embargo, el estudio histoló-gico de la glándula sericígena de P. citrellarealizado en el presente trabajo revela que elpaso de la región secretora media a la distalde la glándula en esta especie está marcadopor la presencia de un pequeño grupo celu-lar con características citológicas distintas alos epitelios que conforman dichas regiones.Estos resultados no fueron mencionados conanterioridad por otros autores ni para Lepi-dóptera ni para otros grupos de insectos.

Asimismo, durante los diferentes estadios


larvales de P. citrella los epitelios de la regiónsecretora de las glándulas sericígenas mani-fiestan cambios morfológicos que sugierensíntesis proteicas, alcanzando la glándula sumayor desarrollo durante el tercer estadiolarval. Estos resultados coinciden con los deTanaka (1911), Tashiro et al. (1968) y Bar-sagade y Tembhare (2000) quienes analiza-ron la estructura, el desarrollo, la actividadsecretora de la glándula y la naturaleza quí-mica de la seda producida por Bombyx moriy Antheraea mylitta. Por otra parte, coincidi-mos con Lakshmi Devi y Yellamma (2013) enque el aumento de componentes proteicos enla hemolinfa observados en el tercer estadiolarval de P. citrella estaría relacionado conlas necesidad de proteínas y aminoácidos delcuerpo graso para la síntesis de nuevas pro-teínas en respuesta a los requerimientos meta-bólicos del insecto para la metamorfosis ypor las glándulas sericígenas para la síntesisdel material proteico que compone el hilo deseda que formará el capullo durante los esta-dios de prepupa y pupa.

En referencia al tipo de secreción queproducen las regiones secretoras de la glán-dula sericígena, coincidimos con Tanaka(1911), Tashiro et al. (1968), Barsagade yTembhare (2000) y Valantina Sangamithiraiet al. (2014) en que dicha secreción es prin-cipalmente proteica; sin embargo, los dife-rentes grados de acidofilia observados en lasecreción acumulada en la luz de región dis-tal de la glándula en el tercer estadio larvalP. citrella, nos sugiere que la composiciónquímica de la misma varía durante el desa-rrollo larval de la especie por lo que consi-deramos es necesario realizar en el futuroestudios histoquímicos que permitan deter-minar la composición química del materialsecretado por la misma en los diferentes es-tadios larvales de la especie.

En relación al desarrollo del aparato re-productor, los estudios realizados hasta elmomento en diferentes especies de Lepidop-tera, muestran considerables variaciones enrelación a la ubicación, morfología y tiem-pos de desarrollo de los diferentes órganosque forman el sistema reproductor del ma-cho y de la hembra en estos insectos.

Según las observaciones realizadas porDrecktrah (1966) y Jones (1973) en Ostrinianubilalis, y las de Beckemeyer y Shirk(2004) en Plodia interpunctella, las caracte-rísticas morfológicas observadas en el esbo-zo gonadal al comienzo del desarrollo lar-val de estas especies no permiten diferenciarestructuralmente la gónada masculina de lafemenina. En relación a la diferenciaciónsexual de la gónada en P. citrella, las obser-vaciones realizadas durante el desarrollolarval indicarían que en esta especie duranteel primer estadio larval los esbozos gonada-les permanecen indiferenciados, son pares yse ubican dorsal al intestino medio. Mientrasque a partir del segundo estadio larval seproduce la diferenciación sexual de la góna-da y se diferencian estructuras del aparatoreproductor masculino que permiten identifi-car el sexo en la larva.

Por otra parte, Drecktrah (1966) sostieneque en Ostrinia nubilalis los testículos seidentifican a los dos días de larva, ubicadosen el quinto segmento abdominal, compues-tos por cuatro folículos; mientras que Bilhaet al. (2012) en base solo al análisis anató-mico realizado en larvas del primer estadiode Diatraea saccharalis identifica testículospares, con aspecto de riñones, ubicados en elquinto segmento abdominal. En P. citrella apartir del segundo estadio se identifica elsexo en la larva, ya que en larvas macho sediferencian un par de testículos unifolicula-res que abarcan desde el quinto y al séptimosegmento abdominal, los esbozos de los con-ductos eferentes, la porción gonádica de losconductos deferentes y los esbozos de lasglándulas accesorias y de las diferentes es-tructuras que formarán la genitalia externadel macho.

Con respecto al proceso de espermatoge-nesis, Numata y Hidaka (1980) en Papilioxuthus y Chaudhury y Raun (1966) en Ostri-nia nubilalis observaron testículos con esper-matogonias y espermatocitos primarios re-cién a partir del tercer estadio larval y elinicio de la espermiogenesis a partir delcuarto estadio larval; mientras que Manogen(2002) en su estudio sobre espermiogenesisen Spodoptera muritia observó la presencia


de espermatogonias recién a partir del quin-to estadio larval, espermatocitos en el sextoestadio larval y espermátidas a partir delprimer o tercer día del estadio de prepupa.Considerando que P. citrella tiene un desa-rrollo larval más corto que incluye solo tresestadios, los resultados obtenidos muestranque en esta especie a partir del segundo esta-dio y hasta el final del desarrollo larval en elfolículo testicular solo se encuentran célulasde la línea germinal al comienzo del proce-so de espermatogénesis; ya que en el folículose identifican claramente las regiones delGermario con espermatogonias primarias yla Zona de Crecimiento con espermatogo-nias secundarias.

En relación al desarrollo de la gónadafemenina, los estudios realizados por Dreck-trah (1966) en Ostrinia nubilalis demuestranque en esta especie al tercer día de larva seobservan pequeños ovarios, ubicados en elquinto segmento abdominal, pero en ellos noidentifican ovariolas. Suludere (1986) encambio en Agrotis ípsilon observa ovarioscon cuatro ovariolas sin estructuras bien de-finidas en el último estadio larval de estaespecie. Sin embargo, Mandelbaum (1975citado por Telfer, 2009) menciona cuatropequeños brotes precursores de las ovariolasen ovarios del primer estadio larval de Hya-lophora cecropia y Beckemeyer y Shirk(2004) señalan en Plodia interpunctella lapresencia de ovariolas con un elevado nivelde organización estructural en el segundoestadio larval. En P. citrella la gónada feme-nina se identifica en el tercer estadio larval yestá constituida por un par de ovarios deigual ubicación que los testículos pero de untamaño considerablemente menor y en lar-vas hembras de mayor tamaño que se en-cuentran al final del tercer estadio se identi-fican claramente cuatro pequeñas ovariolasen formación.

En relación al desarrollo de las restantesestructuras del aparato reproductor y en par-ticular aquellas que permiten identificar pre-cozmente el sexo en la larva, autores comoMetha (1933) quién estudió el desarrollo dela genitalia del macho y los conductos efe-rentes en varias especies de Lepidóptera, ta-

les como Pieris rapae, Hepialus lupulinus,Earias fabia y Bombyx mori y Jones (1973)que realiza estudios similares en Ostrinianubilalis, mencionan que la formación de lainvaginación ectodérmica o cavidad genitalque dará origen al esbozo del conducto eya-culador común, se diferencia en los primerosestadios larvales en el noveno segmento ab-dominal y que la diferenciación de los con-ductos eyaculadores pares y glándulas acce-sorias del macho se produce durante el desa-rrollo larval y se continua y completa duran-te el periodo de pupa. Por otra parte, segúnJones (1973) y Sendi et al. (1993) quienesrealizaron estudios postembrionarios sobreel desarrollo del aparato reproductor de lahembra en Ostrinia nubilalis y Papilio demo-leus respectivamente, sostienen que la forma-ción del oviducto común se inicia durante elestado de larva y se continua y completadurante el estado de pupa. Sin embargo,para Joubert (1978) quien realizó estudiossimilares en Dalaca rufescens el desarrollode los órganos internos del aparato repro-ductor de la hembra se diferencia en esta-dios tempranos de la pupa.

Los resultados obtenidos en este trabajoindican que en Phyllocnistis citrella la inva-ginación ectodérmica ventral que da origena la cavidad genital y el esbozo conductoeyaculador común en larvas macho es visi-ble a partir del segundo estadio larval y semantiene sin cambios morfológicos signifi-cativos hasta el final del desarrollo larval dela especie. Sin embargo, mediante el análisishistológico del aparato reproductor realiza-do para los diferentes estadios durante eldesarrollo larval de esta especie no se identi-ficaron estructuras morfológicas que indi-quen el inicio de formación del oviducto co-mún y bursa copulatrix, las cuales permiti-rían identificar el sexo en larvas hembras.

Con estos resultados podemos concluirque durante el desarrollo larval de P. citrellaen campo, la gónada permanece indiferen-ciada durante el primer estadio larval y apartir del segundo estadio se diferencia lagónada masculina y las estructuras asocia-das al aparato reproductor del macho quepermiten la identificación temprana del sexo


en la larva. Asimismo, los resultados obte-nidos indicarían que las etapas más impor-tantes en el proceso de diferenciación delaparato reproductor de la hembra se produ-cen durante los estadios de prepupa y pupa,por lo que teniendo en cuenta los anteceden-tes sobre el tema y la gran variación en di-ferentes especies de Lepidoptera, considera-mos importante continuar en el futuro conestudios histológicos e histoquímicos durantela metamorfosis de P. citrella, con el fin deaportar datos complementarios sobre el pro-ceso de diferenciación de los diferentes ór-ganos que intervienen en la génesis y trans-ferencia de las gametas del macho y la hem-bra de esta especie. Por otra parte, conside-ramos es importante complementar los re-sultados obtenidos en este trabajo con poste-riores estudios histomorfológicos durante losestadios de prepupa y pupa en campo de laespecie, con el fin de analizar los procesosde histólisis e histogénesis que se producenen órganos y sistemas durante la metamor-fosis para formar las estructuras definitivasdel adulto en ambos sexo.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos al Sr. José Rodríguez porpermitirnos realizar los muestreos en suquinta de limones en la Dpto. Tafí Viejo (Tu-cumán, Argentina) y al Sr. Franco J. PucciAlcaide, técnico del Instituto de MorfologíaAnimal, por la captura de imágenes y edi-ción de microfotografías para la ilustraciónde los resultados obtenidos. Se agradece alos revisores de este trabajo por las observa-ciones y sugerencias realizadas que permitie-ron mejorar la calidad del mismo. Este tra-bajo se realizó en su totalidad con fondos dela Fundación Miguel Lillo.

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Morfología del desarrollo larval de Phyllocnistis citrella ... · en formación. Los resultados obtenidos aportan datos sobre el desarrollo de P. citrella en campo y permitirán