Upload
vothuan
View
217
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Montagens gênicas especiaisMontagens gênicas especiais
estratégias de clonagem de genesestratégias de clonagem de genes
Isolamento do material Isolamento do material genéticogenético
Protocolo padrãoProtocolo padrão
uso do uso do CsCl CsCl –– 8M8M
Protocolo da lise alcalinaProtocolo da lise alcalinapreserva moléculas de preserva moléculas de plasmideos plasmideos por estarem por estarem superenrroladassuperenrroladas
comparação dos comparação dos protocolosprotocolos
ultracentrifugaçãoultracentrifugaçãolise alcalinalise alcalina
UltracentrifugaçãoUltracentrifugação
obtenção de uma obtenção de uma preparação preparação plasmidial plasmidial pelo protocolo do pelo protocolo do CsClCsCl
Transformação genética de Transformação genética de bactériasbactérias
linhagens receptoraslinhagens receptoras
mutantes não produtores das mutantes não produtores das enzimas de restrição e enzimas de restrição e metilaçãometilação
exemplos mais usados:exemplos mais usados:E. E. colicoli DH5DH5ααE. E. colicoli DH10BDH10B
Indução de competênciaIndução de competência
tratamentos feitos para aumentar a tratamentos feitos para aumentar a eficiência de transformaçãoeficiência de transformação
soluções de íons (CaClsoluções de íons (CaCl22))coquetel de íons coquetel de íons (CaCl(CaCl22, MnSO, MnSO44, COCl, COCl22, etc), etc)
choque térmicochoque térmicocéls céls mantidas a 0º mantidas a 0º →→ 4242ººC por 90C por 90””
Recombinação genética por Recombinação genética por transduçãotransdução
emprega vetores emprega vetores fágicosfágicosexemplos mais usados:exemplos mais usados:
fago M13fago M13fago fago λλfago fago φφ X 174X 174etcetc
vantagens no transporte do material vantagens no transporte do material genéticogenéticodesvantagens relativas ao tamanho dos desvantagens relativas ao tamanho dos insertosinsertos
Particularidade de colônias de bactériasParticularidade de colônias de bactérias
significado de 1 clone
conjunto de células genéticamente indênticas
transferência de material genético de géis para membranas
hibridização molecular
com sondas radioativas
Detalhamento do uso de Detalhamento do uso de sondas molecularessondas moleculares
pareamento de pareamento de nucleotideos nucleotideos entre entre as moléculas das as moléculas das sondas e as do DNA sondas e as do DNA em estudoem estudo
Construção de bibliotecas de Construção de bibliotecas de genesgenes
escolha do tecido em que se expresse o escolha do tecido em que se expresse o gene de interessegene de interesseextração do extração do mRNAmRNAcópia em DNA (cópia em DNA (cDNAcDNA))inserção em um vetorinserção em um vetortransformação de bactériastransformação de bactériasestoque de clones bacterianosestoque de clones bacterianosanálise por análise por seqüenciamento seqüenciamento dos clonesdos clonescrescimento e isolamento do gene de crescimento e isolamento do gene de interesseinteresse